Principios y Técnicas de Banco de Sangre U.G.C. del Laboratorio de Análisis Clínicos Banco de Sangre
TECNICAS DE BANCO DE SANGRE
1. Técnica de Prueba en Tubo Para la Determinación del Grupo Hemático ABO OBJETO Determinar el grupo ABO en tubo
DESARROLLO 1. Depositar una gota de anti-A, anti-B, y anti-AB, en tres tubos limpios y convenientemente rotulados. 2. Añadir una gota de hematíes problema diluidos en suero salino al 2-5% a cada tubo. 3- Mezclar suavemente agitando el contenido de los tubos centrifugar durante 25 segundos 2340 rpm ó bien 60 segundos a 1000 rpm (programa 2 de Centrífuga BS-05 con adaptador) 3. Retirar de la centrífuga y resuspender suavemente el sedimento de los hematíes. 4. Examinar la presencia o ausencia de aglutinación y anotar los resultados. INTERPRETACIÓN •
La presencia de aglutinación o hemólisis indicará que la reacción es positiva, mientras que una suspensión uniforme de hematíes se considerará como resultado negativo. Las discrepancias entre los resultados del grupo ABO hemático y sérico deben resolverse antes de clasificar el grupo ABO del donante o paciente.
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2. Procedimiento de Determinación del Grupo ABO en Placa. OBJETO Realizar el tipaje AB0 en placa o porta. DESARROLLO 1. Identificar el porta o la placa con el nombre y apellidos del paciente (o número de la unidad a tipar) 2. Colocar una gota de Reactivo Comercial Anti-A, Anti-B, y Anti-AB. 3. Añadir una gota de sangre junto a cada gota de los reactivo y mezclarlo en un área aproximada de 2 cm de diámetro (puede utilizarse para ello palillos higiénicos). 4. Se recomienda hacer la lectura de la posible aglutinación después de 30 a 60 segundos.
INTERPRETACIÓN La presencia de aglutinación indica la especificidad AB0.
3. Técnica de Prueba en Tubo para la Determinación del Grupo Sérico ABO OBJETO Determinar la presencia o ausencia de anti-A y anti-B en el plasma o suero del paciente. DESARROLLO Utilizaremos hematíes reactivo A1, A2 y B de origen comercial. 1. Colocar una gota de hematíes reactivo en cada uno de los tubos limpios y rotulados. (A1, A2, B )
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2. Añadir dos gotas de suero problema a cada tubo. 5. Agitar suavemente y centrifugar durante 25 segundos 2340 rpm o bien 60 segundos a 1000 rpm (programa 2 de Centrífuga BS-05 con adaptador ) 3. Examinar los tubos en busca de hemólisis. Resuspender suavemente el sedimento de hematíes y observar la presencia o ausencia de aglutinación. Anotar resultados.
INTERPRETACIÓN •
La presencia de aglutinación o hemólisis indicará que la reacción es positiva, mientras que una suspensión uniforme de hematíes se considerará como resultado negativo. Las discrepancias entre los resultados del grupo ABO hemático y sérico deben resolverse antes de clasificar el grupo ABO del donante o paciente
4. Procedimiento de Determinación del Factor Rh en Tubo OBJETO Determinar la presencia o ausencia del antígeno D. DESARROLLO 1-Colocar una gota de reactivo anti-D en un tubo limpio y rotulado. 2-Colocar una gota de reactivo control en un segundo tubo. 3-Añadir una gota de hematíes suspendidos al 2-5% en salino en cada uno de los dos tubos. 4-Mezclar suavemente por agitación y centrifugar durante 25 segundos 2340 rpm o bien 60 segundos a 1000 rpm (programa 2 de Centrífuga BS-05 con adaptador) 5-Resuspender suavemente el sedimento de hematíes y observar la presencia o ausencia de aglutinación.
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INTERPRETACION •
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La aglutinación en el tubo de anti-D junto con un resultado negativo en el tubo control, indica un resultado positivo de la prueba. Si hay aglutinación en el tubo control no debe interpretarse la prueba con anti-D como positiva sin nuevos análisis. La ausencia de aglutinación tanto en el tubo de anti-D como en el tubo control indica un resultado negativo de la prueba.
NOTA: Para la determinación de otros antígenos del sistema Rh (C, E, c, e), se seguirán las instrucciones del fabricante, pudiendo requerir incubación a 37ºC, o a temperatura ambiente.
5. Procedimiento de Determinación del Factor Rh en Portaobjetos/Placa. OBJETO Determinar la presencia del antígeno D (Rh). DESARROLLO 1. Colocar una gota de antisuero anti-D en un porta o placa limpio y rotulado, junto a una gota de sangre del paciente. 2. Colocar una gota de reactivo control (o en su defecto suero fisiológico) junto a otra gota de sangre del paciente, en un segundo porta o en la placa. 3. Hacer las mezclas correspondientes con un palillo limpio formando un círculo de 2-3 cm de diámetro. 4. Colocar los portaobjetos sobre el visor y bascular suave y constantemente para observar la presencia de aglutinación. El máximo de observación es de dos minutos, superado ese tiempo se puede producir un fenómeno de rouleaux, que puede interpretarse erróneamente como aglutinación. 5. Anotar los resultados.
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INTERPRETACION La aglutinación con anti-D (siendo negativo el control) se interpretará como positivo. Es importante no confundir la desecación de los bordes de la mezcla con aglutinación. La aglutinación en el control anula la prueba, haciendo necesarias otras comprobaciones.
6. Técnica de Determinación del Antígeno Du Método en Tubo OBJETIVO Determinación de la presencia de antígeno D cuando la reacción de aglutinación directa es negativa. El término Du se utiliza para designar a un antígeno D de expresión débil. Existen diversos tipos de Du, llamados de "alto grado", de "bajo grado", y D mosaico. Los hematíes clasificados como Du de bajo grado poseen el antígeno D expresado tan débilmente que requieren de una técnica de antiglobulina indirecta para ponerlos en evidencia. No todos los anti-D reactivos son adecuados para la determinación del Du. El prospecto del fabricante indicará si el antisuero puede utilizarse o no para la prueba del Du.
DESARROLLO 1-Colocar una gota de reactivo anti-D en un tubo limpio y rotulado. 2-Colocar una gota de reactivo control en un segundo tubo. 3-Añadir una gota de hematíes suspendidos al 2-5% en salino en cada uno de los dos tubos. 4-Mezclar suavemente por agitación y centrifugar durante 25 segundos 2340 rpm o bien 60 segundos a 1000 rpm (programa 2 de Centrífuga BS-05 con adaptador) 5-Resuspender suavemente el sedimento de hematíes y observar la presencia o ausencia de aglutinación.
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6-Si el resultado es negativo, introducir el tubo en el baño a 37ºC durante 30 minutos. 7- Lavar tres veces con solución salina, decantando completamente el sobrenadante tras el último lavado. 8-Añadir 2 gotas de antiglobulina humana (suero de Coombs), centrifugar y leer. Anotar los resultados.
INTERPRETACIÓN •
• •
La presencia de un resultado positivo en el tubo con anti-D y negativo en el control (o PAD negativa), indican un resultado POSITIVO. La sangre se tipará como D POSITIVO. El reactivo Pelikloon utilizado detecta todas las variantes del D incluido el DVI. Un resultado negativo en ambos tubos indica que la muestra es D NEGATIVO. En caso de ser positiva la reacción en el tubo control no puede interpretarse adecuadamente la prueba Du. Consultarlo con el Hematólogo.
7. Técnica de Resolución de Discrepancias ABO OBJETO Determinar el grupo ABO cuando no concuerdan el grupo hemático con el grupo sérico. DESARROLLO Se produce una discrepancia cuando los resultados del grupo hemático y sérico no concuerdan. La interpretación del grupo ABO debe retrasarse hasta que se resuelva la discrepancia. 1. Los primeros pasos a seguir son: 2. Repetir el grupo hemático y sérico en tubo con los hematíes lavados. 3. Analizar los hematíes del paciente lavados frente a anti-A, B y anti- A1. 4. Analizar el suero frente a hematíes A1, A2, B comerciales también lavados5. Aumentar la relación suero/hematíes (por ejemplo 3 gotas de suero y 1 gota de hematíes en la prueba grupo sérico y 2 gotas de reactivo comercial anti A, B, A1 y
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1 gota de hematíes problema en grupo hemático )e incubar 30 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar y leer. 6. Avisar con los resultados a Hematólogo de Guardia.
8. Técnica de Detección de Anticuerpos Irregulares Método en Tubo OBJETO Demostrar la presencia o ausencia de anticuerpos frente a antígenos de grupo hemático distinto al ABO (anticuerpos irregulares). Los únicos anticuerpos de grupo que se suelen poseer son los anti-A y anti-B. Los demás anticuerpos de grupo no relacionados con el sistema ABO, se les conoce como anticuerpos irregulares. Para detectar estos anticuerpos se enfrenta el suero a estudiar a una serie de hematíes de grupo O que poseen la mayoría de antígenos frente a los cuales estos anticuerpos son específicos. DESARROLLO 1. Etiquetar tres tubos “I”, “II” y “III” 2. Añadir 2-3 gotas de suero problema a cada tubo. 3. Agitar los hematíes comerciales "I”, "II" y “III” inmediatamente antes de su uso. 4. Añadir una gota de hematíes I al tubo I, una gota de hematíes II al tubo II y otra de hematíes III al tubo III. mezclar por agitación 5. Centrifugar inmediatamente durante 25 segundos 2340 rpm (posición HIGH en Centrifuga BS-06) o bien 60 segundos a 1000 rpm (programa 2 de Centrífuga BS05 con adaptador ) 6. Resuspender el botón de hematíes suavemente y anotar como positivo si existe aglutinación. 7. Añadir dos gotas de albúmina al 22% a cada tubo, mezclar e incubar durante 30 minutos a 37ºC. 8. Centrifugar, leer y anotar resultados (igual a pasos 5 y 6).
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9. Lavar tres veces con solución salina, decantando completamente el sobrenadante tras el último lavado. 10. Añadir 2 gotas de antiglobulina humana (suero de Coombs), centrifugar y leer. Anotar los resultados. 11. A los resultados negativos añadirles una gota de hematíes Coombs control (hematíes recubiertos de IgG), centrifugar y leer. Debe obtenerse aglutinación, en caso contrario se invalidan los resultados.
INTERPRETACIÓN La presencia de aglutinación o hemólisis frente a cualquiera de las tres células comerciales se considera como prueba positiva. Una prueba de detección de anticuerpos irregulares positiva indica la presencia de anticuerpos dirigidos frente a antígenos de grupo sanguíneo no ABO, y requiere su identificación.
9. Técnica de Prueba Cruzada en Tubo OBJETO La principal significación de la prueba cruzada radica en el control final de la compatibilidad ABO entre el donante y el receptor, así como la ausencia de anticuerpos irregulares que pudiera tener el receptor frente a los hematíes del donante.
DESARROLLO 1. Preparar hematíes del donante lavados y diluirlos al 4–5 % en salino. 2. Rotular un tubo con el número de la unidad de concentrado de hematíes, que se va a cruzar. 3. Colocar una gota de los hematíes del donante.
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4. Añadir 2 o 3 gotas de suero del receptor. 5. Agregar 2 gotas de albúmina al 30 % 6. Centrifugar a 3400 rpm durante 1 minuto y valorar si se produce aglutinación o hemólisis. 7. Incubar a 37º C durante 45 minutos. (Si Urgente incubar en 15 min.) 8. Lavar 3 veces los hematíes con suero fisiológico y decantar el sobrenadante 9. Añadir 2 gotas de “Anti-Human”, y centrifugar durante 25 segundos 2340 rpm (posición HIGH en Centrifuga BS-06)o bien 60 segundos a 1000 rpm (programa 2 de Centrífuga BS-05 con adaptador ) 10. A continuación hacer una lectura de aglutinación o hemólisis. En los resultados negativos hay que añadir una gota de hematíes control Coombs (Ortho Coombs control), centrifugar durante 25 segundos 2340 rpm (posición HIGH en Centrifuga BS-06) o bien 60 segundos a 1000 rpm (programa 2 de Centrífuga BS-05 con adaptador) y comprobar que se produce aglutinación. En caso contrario se invalida la prueba.
INTERPRETACIÓN La presencia de aglutinación o hemólisis se interpreta como prueba positiva e indica incompatibilidad ABO o presencia de anticuerpos irregulares en el suero del receptor frente a antígenos eritrocitarios del donante, con lo cual la transfusión de esa unidad no debe realizarse.
10. Técnica de Antiglobulina Directa Coombs Directo en Tubo OBJETO Esta técnica detecta si los hematíes están recubiertos de anticuerpos, o complemento. Se utiliza para demostrar el recubrimiento in vivo de los hematíes con globulinas, en particular IgG y C3d. Por tanto, los hematíes se lavan y se analizan directamente con antiglobulina humana.
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Muy importante: leer el prospecto que contiene la caja del reactivo y si hay discrepancia abrir una incidencia y comunicar a Hematólogo-. DESARROLLO 1. Introducir una gota de hematíes en suspensión salina al 2-5% en un tubo debidamente etiquetado. Los hematíes deben provenir de una muestra de sangre anticoagulada con EDTA para evitar la captación in vitro de complemento. 2. Lavar los hematíes 3-4 veces con solución salina. Decantar totalmente el sobrenadante del último lavado y añadir 2 gotas de antiglobulina humana poliespecífica color verde (o monoespecífico IgG ó C3d, ambos incoloros). 3. Mezclar, centrifugar durante 25 segundos 2340 rpm (posición HIGH en Centrifuga BS-06)o bien 60 segundos a 1000 rpm (programa 2 de Centrífuga BS05 con adaptador ) 4. Resuspender suavemente el botón de hematíes y observar la presencia o ausencia de aglutinación. 5. Los resultados aparentemente negativos deben incubarse durante 5 minutos a temperatura ambiente, centrifugarse y leerse nuevamente. (recomendado para conseguir la máxima sensibilidad para la detección del complemento.) 6. Añadir hematíes Coombs control (una gota) a los resultados negativos, centrifugar y leer, debe haber aglutinación. En caso negativo, se invalida el test. NOTA: Puede ser útil emplear un control negativo que se realiza, dispensando en un tubo una gota de la suspensión al 2-5% de eritrocitos al que se le añade 1 o 2 gotas de albúmina bovina al 6% en lugar del reactivo antiglobulina, este tubo sigue todos los pasos descritos en la técnica.
INTERPRETACIÓN • • •
Se considera positiva cuando se observa aglutinación después de la centrifugación inmediata o después de la centrifugación que sigue a la incubación a temperatura ambiente. Para determinar el tipo de globulina que reviste a los hematíes, deben utilizarse los reactivos monoespecíficos anti-C3d y anti-IgG. Un resultado positivo en el tubo control negativo o un resultado negativo en el paso seis invalida los resultados.
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11. Técnica de Interpretación de la Aglutinación OBJETO Valorar las reacciones de aglutinación de forma estándar.
DESARROLLO 1- METODO EN TUBO:
Intensidad
Puntuación
Aspecto
++++
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Un aglutinado único.
+++
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Reacción intensa. Algunos aglutinados grandes, fondo claro.
8
Muchos aglutinados de regular tamaño,
+
5
Aglutinados pequeños en un fondo turbio de hematíes sueltos.
+/-, w
2
Aglutinados muy pequeños; fondo turbio.
++ fondo claro.
eritrocitos libres.
0
No aglutinación ni hemólisis; todos los
PH
Hemólisis parcial.
H
Hemólisis completa; no quedan hematíes.
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