Técnicas de cultivo In Vitro by Fredy López Fernández

04 de Junio del 2018

GENETICA FORESTAL

Alfredo Lรณpez Fernรกndez. Instituto Tecnolรณgico Superior de la Sierra Norte de Puebla 04 de Junio del 2018

TECNICAS DE CULTIVO IN VITRO

CONTENIDO Objetivos del Cultivo In Vitro: ............................................................................................................................. 3 Introducción ....................................................................................................................................................... 4 Justificación ....................................................................................................................................................... 0 Definición........................................................................................................................................................... 1 Tipos De Cultivo In Vitro .................................................................................................................................... 2 Cultivo de Meristemos .......................................................................................................... 3 Método de saneamiento ............................................................................................................................. 3 Tamaño de los meristemos ........................................................................................................................ 4 Aislamiento y siembra de los meristemos ................................................................................................... 4 Ventajas ..................................................................................................................................................... 5 Limitaciones ............................................................................................................................................... 5 Cultivo de yemas (Micropropagacion) .................................................................................. 6 Generalidades sobre los métodos .............................................................................................................. 6 Fases del proceso de micropropagación. ................................................................................................... 7 Preparación de la planta madre .................................................................................................................. 7 Desinfección del material vegetal ............................................................................................................... 7 Introducción del material in vitro ................................................................................................................. 7 Multiplicación de los brotes......................................................................................................................... 7 Elección de un medio de enraizamiento de los explantos ........................................................................... 8 Aclimatación de los explantos enraizados .................................................................................................. 8 Cultivo de protoplastos (Morfogénesis directa) ..................................................................... 9 Cultivo de anteras .............................................................................................................. 10 Ventajas de los haploides ......................................................................................................................... 10 Fines de los haploides diploidizado .......................................................................................................... 10 Cultivo de embriones.......................................................................................................... 11 Cultivo de óvulos ...................................................................................................................................... 12 Polinización y fecundación in vitro ............................................................................................................ 12 Conclusiones ................................................................................................................................................... 13 Lecturas Consultadas ...................................................................................................................................... 13

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ILUSTRACIONES

Ilustración 1. Ejemplo de cultivo In Vitro ............................................................................................................ 0 Ilustración 2. Diferenciación celular ................................................................................................................... 1 Ilustración 3. Medio nutritivo .............................................................................................................................. 1 Ilustración 4. Necesidades nutricionales y hormonales ...................................................................................... 1 Ilustración 5. Tipos de cultivo In Vitro ................................................................................................................ 2 Ilustración 6. Cultivo de meristemos .................................................................................................................. 3 Ilustración 7. Tipos de micropropagacion .......................................................................................................... 6 Ilustración 8. Regeneración a partir de callos .................................................................................................... 9 Ilustración 9. Cultivo de embriones cigoticos ................................................................................................... 11

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Objetivos del Cultivo In Vitro: Producción de gran número de plantas. Obtención de plantas en cualquier época del año. Almacenamiento de plantas en poco espacio. Producción de plantas libres de contaminación, enfermedades y plagas. Herramienta para el fitomejoramiento: plantas mejoradas. Propagación de especies de difícil propagación por otros métodos, o en vías de extinción. Clonación de individuos "élite", con desempeño agronómico destacado. Obtención de plantas libres de virus. Producción de semillas sintéticas. Conservación de germoplasma: material de un conjunto de individuos que representa la variabilidad genética de una población vegetal. Obtención de metabolitos secundarios. Producción de nuevos híbridos. Mejora genética de plantas. Germinación de semillas. Producción de haploides y dobles haploides. Estudios fisiológicos diversos.

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Introducción dificultad de reproducir las condiciones naturales en condiciones de laboratorio, se debe añadir en este caso la dificultad de suministrar al explante todo aquello que antes obtenía del sistema completo. En resumen, el cultivo in vitro de plantas es una técnica que exige un control específico del ambiente, tanto físico como químico, en el que se sitúa al explante. Conviene, por tanto, conocer cuáles son los principales factores que conforman dicho y que deberán ser controlados.

expresión cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de un frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas tiene dos características fundamentales: la asepsia (ausencia de gérmenes, etc), y el control de los factores que afectan el crecimiento. El avance alcanzado por las ciencias biológicas ha permitido en los últimos años el estudio detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular, y en condiciones de laboratorio es posible actualmente reproducir todos los factores que puedan incidir en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Este principio general se aplica también al cultivo in vitro de plantas.

La micropropagación o propagación clonal, es una de las aplicaciones más generalizadas del cultivo in vitro, a través de la micropropagación, a partir de un fragmento (explante) de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme, con plantas genéticamente idénticas, denominadas clones. La propagación vegetativa se ha venido utilizando ampliamente en el campo forestal en programas de mejoramiento genético, aplicándose en PFC´s masivas de especies como Eucalipto, Pino, Teca, entre otras de interés. Sin embargo, en algunas especies leñosas por las características biológicas y por su capacidad morfogénica, se ve limitado esta propagación vegetativa por métodos tradicionales, además de problemas provenientes del cambio de las fases adulta a juvenil que hacen difícil la propagación de árboles adultos. Para lograr la propagación vegetativa se ha de disponer de una vía de regeneración de plantas a partir de células, tejidos o porciones de la planta donante que sea fiable, reproducible, aplicable a distintos genotipos, y altamente productiva. También se requiere que genere material fiel al donante sin variabilidad intraclonal y fundamentalmente para el sector forestal, que sea susceptible de automatización para reducir los costos de producción.

Haberlandt, un científico alemán, postuló a principios del siglo pasado que las plantas eran capaces de reproducir su crecimiento a partir de células aisladas, originando la hipótesis de la totipotencia celular en plantas. Sin embargo, este investigador no pudo demostrar en forma práctica su hipótesis, debido a que la mayoría de los componentes complejos que integran los medios de cultivo actuales todavía no habían sido descubiertos. Sería recién en la década del ´50 cuando se determina la importancia del balance hormonal en las plantas, con el descubrimiento de las hormonas vegetales más usadas en la actualidad. Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el ambiente de la planta en la naturaleza es técnicamente muy complejo. Por esa razón se realiza una simplificación de la realidad escogiendo aquellos factores que se puedan mantener controlados. Cuando no se realiza el estudio con todo el ser vivo sino con solamente una parte del mismo, se utiliza el término explante para indicar la parte del órgano ó tejido vegetal que se cultiva in vitro. A la 4

Justificación

Aunque actualmente se cuenta con una literatura detallada de técnicas de cultivos vegetales in vitro, existen especies en las cuales el establecimiento, multiplicación y/o enraizamiento de los cultivos es dificultoso y se requiere una intensa tarea experimental para lograr su micropropagación o para obtener callos o suspensiones capaces de producir los metabolitos deseados. Los medios nutritivos para el cultivo de células y tejidos vegetales son, en general, menos complejos que los de cultivos microbianos y son formulados en forma más o menos empírica. Si bien se desarrollan periódicamente nuevas fórmulas comerciales, no existe hasta el presente un diseño racional que tenga en cuenta la composición centesimal de la célula vegetal y el conjunto de condiciones que controlan el crecimiento y la diferenciación. No obstante, normalmente se puede utilizar un medio sencillo y complementarlo con diferentes componentes y reguladores de crecimiento para llegar empíricamente a la fórmula que le brinde al tejido las mejores condiciones para su crecimiento y producción. Se han descripto un gran número de medios nutritivos para el cultivo de vegetales in vitro.

Ilustración 1. Ejemplo de cultivo In Vitro

Estos medios de cultivo constan de sales minerales, vitaminas, aminoácidos, azúcares y reguladores de crecimiento. La composición mineral se define en forma precisa en cada uno de los medios y está dada tanto por los macro elementos (N, P, K, S, Mg y Ca) como por los micro elementos (B, Mn, Zn, Cu, Ni, Co, Mo, Al, I y Fe). Estos nutrientes deben estar en una concentración tal que permita el adecuado crecimiento celular.

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Definición

CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES. Conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento y/o crecimiento de células o tejidos en un medio nutritivo y en condiciones ambientales controladas. Los tejidos vegetales pueden cultivarse in vitro ya que la célula vegetal es totipotente, esto significa que la célula retiene toda la información para regenerar una planta completa, también a la diferenciación celular, que genera que la célula adquiere propiedades diferentes a las de la célula que la originó.

Ilustración 2. Diferenciación celular

Medio nutritivo. Las porciones del vegetal que se cultivan in vitro: “explantos”; No son autotróficos.

Ilustración 3. Medio nutritivo

Ilustración 4. Necesidades nutricionales y hormonales

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Tipos De Cultivo In Vitro     

Cultivo de meristemos Cultivo de yemas Cultivo de protoplastos Cultivo de anteras Cultivo de embriones

Ilustración 5. Tipos de cultivo In Vitro

La Multiplicación en plantas se puede dar por Semillas (Reproducción sexual o Progenie con distinto genotipo) y por Reproducción Vegetativa por bulbos, esquejes, estacas, tubérculos (Reproducción asexual, Progenie con idéntico genotipo, o Descendencia uniforme); pero una desventaja es que de las dos maneras se transmiten enfermedades, por lo que el cultivo In Vitro es la parte de la biotecnología, que asegura la reproducción vegetal sana y con ganancia genética por medio de selección artificial.

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Cultivo de Meristemos

Ilustración 6. Cultivo de meristemos

Es la técnica de cultivo que consiste en aislar asépticamente la región meristemática con 1-3 de los primordios foliares más jóvenes e implantarla en un medio de cultivo estéril, con el propósito de inducir la diferenciación de células y tejidos en plantas completas, mediante la utilización de medios de cultivos adecuados. En multitud de especies cuyo método de propagación habitual es de tipo vegetativo e incluso en algunas cuya propagación es por semilla, se encuentran problemas de contaminación por diversos microorganismos, que los métodos tradicionales de desinfección utilizados por los propagadores y viveristas no consiguen erradicar, ni siquiera mediante tratamientos químicos agresivos, esto conlleva una serie de pérdidas económicas por pérdidas de producción, de calidad de fruto y hasta de cosechas completas. Incluso utilizando técnicas de cultivo in vitro es a veces imposible eliminar a determinados organismos patógenos, como virus, micoplasmas, bacterias y hongos endógenos, algunos de los cuales se transmiten incluso vía semillas, y ante los cuales muchas veces son ineficaces los antibióticos, bactericidas y antivíricos añadidos a los medios de cultivo. Método de saneamiento La técnica de cultivo in vitro de meristemos, como método de saneamiento, se fundamenta en la distribución no uniforme de los microorganismos (virus, bacterias, micoplasmas) en los tejidos de las plantas infectadas, y su disminución progresiva hacia el ápice del tallo. Por tanto, son mayores las posibilidades que las células del meristemo apical se encuentren libres de microorganismos, a diferencia de los tejidos más organizados de las plantas. Algunos estudios han demostrado la presencia de partículas virales en las células del meristemo ápical; sin embargo plantas obtenidas a partir del cultivo de meristemos resultaron libres de virus. La obtención de plantas libres de patógenos, por medio del cultivo de meristemos, hace suponer que las zonas meristemáticas tienen propiedades o características especiales, en relación con el resto de los tejidos, para mantenerse libre de virus. Este hecho supone la existencia de otros factores, los cuales probablemente operan en el momento del cultivo in vitro y son responsables de la inactivación del virus en las nuevas plantas. Una interrupción temporal de la organización normal 3

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del tejido meristemático ocasiona la inhibición de la multiplicación de los virus, debido a la nodisponibilidad de enzimas claves. Para explicar la sanidad o limpieza del meristemo se han formulado varias hipótesis, una de ellas plantea, que debido a la ausencia de tejido vascular en la proximidad del meristemo apical y que las conexiones plasmodermáticas en las células de este tejido son muy pequeñas, por tanto los microorganismos se desplazan muy lentamente hacia esta zona. Esta característica morfológica, unida a la activa multiplicación celular que allí ocurre, puede explicar la baja concentración o la ausencia de patógenos en este tejido. Existe la hipótesis sobre la producción en las células meristemática, de sustancias inhibitorias de los microorganismos y que el efecto de las hormonas en el medio de cultivo, influyen en la inhibición de los virus mediante el cultivo de meristemos. Otra de las hipótesis se basa en la activa multiplicación celular en que se encuentra la zona meristemática, invirtiendo la totalidad de la maquinaria bioquímica celular para la formación de macromoléculas, membranas y otras estructuras de las células nuevas, dejando por tanto a los virus, parásitos obligados, en condiciones desventajosas para su propia multiplicación. Tamaño de los meristemos El tamaño óptimo del meristemo es entre 0.2-1mm, pero realmente el utilizado está en dependencia de los objetivos que se persigan con propagación comercial. Si el objetivo es la obtención de plantas libres de enfermedades sistémicas es necesario, la utilización de meristemos, pero si por el contrario solamente se requiere de la multiplicación y no hay peligro de diseminación de enfermedades o se parte de plantas sanas, se pueden utilizar ápices de mayor tamaño con un mayor porcentaje de regeneración. Aislamiento y siembra de los meristemos El reconocimiento de la zona meristemática varía entre especies, por tanto, se requiere de estudios preliminares que revelen su ubicación y manipulación adecuada, con el objetivo de facilitar su extracción. Existen meristemos muy fáciles de localizar, como son los expuestos, tal es el caso de la papa; en otros cultivos pueden estar más internamente protegidos y se necesita separar mayor cantidad de pequeñas hojas, para encontrar la zona meristemática. Este es el caso de bulbos, ya sean de ajo (Allium sativum L.), cebolla (Allium cepa L.) o en el caso de tubérculos o cormelos de (Xanthosoma sp.). La disección aséptica del meristemo es un proceso delicado y requiere de muchas horas de práctica; se realiza con el apoyo de un microscopio esterioscópico, desprendiendo los foliolos que rodean el punto de crecimiento, hasta que solo queda el ápice con algunos primordios foliares, para su posterior transferencia a medios de cultivo de establecimiento. La eficiencia del cultivo de meristemos, como método de saneamiento a patógenos, está determinada por los siguientes factores: Origen y edad del explante inicial; Tamaño del explante; Características genotípicas; Influencia del medio de cultivo

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Ventajas Los meristemos son genéticamente estables y resultan el tejido idóneo para la iniciación de programas de propagación in vitro. El cultivo de meristemos permite eliminar la contaminación de algunos virus por escape, puesto que los tejidos meristemáticos se mantienen sanos aun cuando el resto de las células están infestadas. Este método resulta efectivo para el control de bacterias y hongos contaminantes y patógenos. Los progresos alcanzados en su aplicación han hecho posible propagar gran número de especies de importancia económica, los resultados han sido particularmente atractivos porque se pueden obtener clones limpios de patógenos a partir de plantas sistémicamente infectadas. Limitaciones El éxito en el cultivo de meristemo es juzgado por el porcentaje de regeneración, tamaños pequeños (0.1-0.2mm) crecen lentamente disminuyendo la eficiencia del método. La resistencia de algunos genotipos al cultivo in vitro limita su extensión a diferentes variedades y especies. En la actualidad el cultivo de meristemos apicales constituye una alternativa en la erradicación de patógenos, aunque no siempre se logran los niveles de efectividad deseados; por esta razón es frecuentemente combinado con otros métodos de saneamiento que aumenten su eficiencia y generalización. En el Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales (INIVIT), es frecuentemente utilizado con éxito en la multiplicación in vitro de yuca, boniato y malanga, con el objetivo de obtener explantes libres de patógenos.

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Cultivo de yemas (Micropropagacion)

Ilustración 7. Tipos de micropropagacion

La Micropropagación es el conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar plantas asexualmente en forma rápida, eficiente y en grandes cantidades. La micropropagación se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas, tales como aquellas creadas por ingeniería genética, mutagénesis o mejora genética. Se utiliza también la micropropagación para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente. Generalidades sobre los métodos En la micropropagación, a partir de un fragmento (explanto) de una planta seleccionada (llamada planta madre), se obtiene una descendencia uniforme, con plantas genéticamente idénticas, denominadas clones. El explanto más usado para los procesos de propagación in vitro son las yemas vegetativas de las plantas. Los frascos que contienen las plantas se ubican en estanterías con luz artificial dentro de la cámara de crecimiento, donde se fija la temperatura en valores que oscilan entre los 21 y 23 °C, además de controlar la cantidad de horas de luz. Por su parte, el medio 6

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de cultivo se compone de una mezcla de sales minerales, vitaminas y reguladores de crecimiento, azúcar, agua y agar. La composición del medio depende de la especie vegetal y de la etapa del proceso de micropropagación. Fases del proceso de micropropagación. Dentro del proceso de micropropagación se pueden diferenciar varias fases o etapas: Preparación de la planta madre Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantos es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donante de yemas, durante un período que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades. Desinfección del material vegetal Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantos. Los explantos pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de raíces o semillas. Antes de extraer los explantos se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener tales condiciones, se trabaja en cabinas de flujo laminar para extraer los explantos a partir del material vegetal. Estos explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de cultivo para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluida durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada. Introducción del material in vitro Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro. Multiplicación de los brotes Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron las fases anteriores originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la bolsa de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división de las plantas. El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados. 7

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Elección de un medio de enraizamiento de los explantos Para enraizar los explantos se utilizan principalmente plantines individuales de un tamaño aproximado de 2 cm. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo de las auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea. Aclimatación de los explantos enraizados Los explantos recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantos o plantines enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la pérdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se plantarán en contenedores (almacigueras) cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada. La elección de un sustrato con buenas características físicas, es clave para el éxito de esta etapa. Para el trasplante, elegimos un sustrato suelto, poroso, con mezcla de arena turba, cáscara de arroz quemado, para permitir un desarrollo y crecimiento de raíces muy rápido. Las mezclas son diferentes y muy variadas de acuerdo a la especie con la que estamos trabajando. Luego de retirar cuidadosamente el agar de las raíces para evitar dañarlas, los plantines se enjuagan y se colocan en almacigueras con la mezcla de sustratos seleccionada y cubiertos con nylon. Todos los días se debe controlar el nivel de humedad en las almacigueras. Si es necesario, se aplica un riego con una pulverizadora manual, para mantener un ambiente húmedo a nivel del sustrato. A los 15 días del trasplante, se puede comenzar a levantar la cobertura de nylon en las horas de menor calor (temprano en la mañana o en la última hora de la tarde). Al comienzo las plantas se dejan media hora por día destapadas. A la semana siguiente se dejan destapadas durante una hora. Al mes del trasplante, se dejan tapadas durante la noche y si hay crecimiento de nuevas hojas, las plantas pueden permanecer destapadas. Las condiciones del cultivo in vitro, generan cambios en algunos aspectos anatómicos y fisiológicos de las plantas, por esta causa, durante la aclimatación, los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el estrés y tener mayor tasa de sobrevivencia

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Cultivo de protoplastos (Morfogénesis directa) La morfogenesis consiste en la formación de un primordio unipolar a partir de una yema y el desarrollo de ese primordio en brotes vegetativos que luego enraízan vía la formación y proliferación de meristemos radicales. Los brotes pueden formarse directamente del explanto (organogénesis directa) o indirectamente a partir de callos. La morfogenesis se desarrolla por inoculación de tejido meristemático estéril (yemas axilares o adventicias) en un medio suplementado con niveles óptimos de sales, de compuestos orgánicos y de reguladores de crecimiento. La calidad y cantidad de los componentes del medio dependerá de la especie y del explanto que se quiera cultivar in vitro dado que la inducción de un tipo específico de órgano involucra señales aún poco conocidas. Consiste en un conjunto de procedimientos asépticos de cultivo de órganos, tejidos o células que permitan la producción de poblaciones de plántulas idénticas a la planta original de la que se derivan. Los cultivos diferenciados son más estables genéticamente que los cultivos indiferenciados. A su vez, los cultivos de yemas axilares que provienen de meristemas preexistentes presentan menores índices de variación genética que el cultivo de yemas adventicias que se originan de nuevo a partir de tejidos somáticos con desarrollo directo o indirecto a través de la formación de callos.

Ilustración 8. Regeneración a partir de callos

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Cultivo de anteras Las anteras (órgano floral de las fanerógamas; se halla en la porción final de los estambres y contiene el polen en unas cavidades denominadas sacos polínicos.) contienen células sexuales masculinas haploides, el polen, los cuales cultivadas en un medio apropiado, pueden regenerar plantas también haploides. Aun cuando durante la evolución pudieron surgir especies haploides solamente entre organismos inferiores, puede ser conveniente durante varias etapas del proceso de mejora disponer de plantas haploides. Estas plantas, también llamadas haplontes, pueden ser obtenidas en diferentes especies, directamente a partir de las células del polen. Ventajas de los haploides Pueden manifestarse fenotípicamente alelos recesivos que en este estado no pueden ser encubiertos por los alelos dominantes, por esta razón las plantas haploides pueden constituir un material útil para realizar estudios genéticos y mutagénicos. Cuando son diploidizados, se obtienen individuos totalmente homocigóticos, eso brinda la posibilidad de la obtención de plantas homocigóticas en una sola generación, a diferencia de los métodos tradicionales de autofecundación o selección, que requieren mucho tiempo para ello y aun así es imposible alcanzar la homocigosis total. Constituyen un material que no induce poliploidía en experimentos de hibridación somática (fusión de protoplastos). Las dos primeras posibilidades son aprovechadas en la mejora práctica a partir de 1964, donde se desarrolló por primera vez embriones directamente a partir de anteras, sin la intervención del proceso de fecundación. Desde entonces el número de especies en las que se ha podido obtener haploides mediante el cultivo de anteras se ha ampliado a unas 200. Es posible la obtención de haploides a partir de gametos femeninos en los ovarios, pero como el número de los gametos masculinos en las anteras es considerablemente mayor, se prefieren las anteras como material básico para la obtención de haploides. Fines de los haploides diploidizado La producción de líneas estrictamente homocigóticas. La reducción considerable del proceso de obtención de dichas líneas. La utilización de los individuos diploidizados como progenitores en programas de cruzamiento. El más amplio empleo de los haploides lo constituye hasta el momento la obtención de líneas homocigóticas. Los híbridos heterocigóticos de la primera generación filial resultantes del cruzamiento de determinados progenitores segregan posteriormente en formas homocigóticas de forma espontánea en el caso de las plantas autógamas. Para el mejorador no es posible, aún en el caso de coeficientes de multiplicación muy altos, la obtención de poblaciones de más de un millón de individuos dentro de una generación, por lo cual se hace necesario racionalizar la vía para lograr una conveniente homocigotización para la creación de líneas altamente homocigóticas, como es el caso de la utilización de la haploidía. Con mucha menor frecuencia son utilizados hasta el momento los haploides para la obtención y selección de mutantes. 10

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Cultivo de embriones

Ilustración 9. Cultivo de embriones cigoticos

El cultivo de embriones es la excisión aséptica de un embrión inmaduro de un óvulo y su posterior cultivo in vitro en un medio nutritivo apropiado. Los embriones híbridos que resultan de cruzas entre especies con parentesco lejano suelen ser débiles e incapaces de sobrevivir a causa de la inadecuada nutrición por el endospermo. Dichos embriones pueden abortar o disminuir de volumen poco después de que se ha formado el cigoto y no llegan a formar semillas viables. Muchas veces, es posible salvar estos embriones inmaduros y lograr que crezcan, germinen y desarrollen en plántulas mediante técnicas de cultivo de embriones. El cultivo de embriones no es una técnica nueva. El cultivo de embriones aislados de rábano en medios nutritivos se dio a conocer en 1904 y el cultivo de embriones se utilizó en 1925 para salvar embriones híbridos después de realizar cruzas amplias en el lino. En los primeros estudios del cultivo de embriones, con frecuencia los embriones eran más o menos maduros cuando se aislaban de la semilla en desarrollo. Los embriones maduros o casi maduros son en gran parte autótrofos y tienen requerimientos nutricionales relativamente simples; son capaces de germinar y desarrollarse en plántulas en medios nutritivos simples. Los proembriones, embriones que están en las etapas iniciales de su desarrollo, tienen requerimientos nutricionales más complejos y no pueden desarrollarse de manera independiente. En la naturaleza, los embriones se desarrollan dentro de una cavidad ovular estéril y dependen de los metabolitos que les proporcionan los tejidos circundantes del endospermo. Un embrión que se desarrolla como un híbrido entre especies de parentesco lejano podría no ser nutrido de manera adecuada a causa de la incompatibilidad que existe entre él y el endospermo. Para salvar el embrión, el proembrión se aísla del óvulo pocos días después de haberse producido la fecundación y se transfiere a agar sólido o un medio líquido para su germinación y crecimiento posteriores. Conforme fue aumentando el conocimiento sobre la formulación de medios nutritivos y los requerimientos nutricionales de los proembriones, se hizo posible cultivar progresivamente embriones más jóvenes y más pequeño y 11

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proporcionarles la alimentación necesaria para su crecimiento y germinación. Después de que las plántulas se han desarrollado, se transfieren a vermiculita o suelo estériles para que se desarrollen en plantas maduras. El cultivo de embriones se utiliza en ocasiones para superar las barreras que imponen la latencia o vida latente de las semillas en los cruzamientos interespecíficos. Durante la latencia, las semillas híbridas no germinan sino hasta que ha transcurrido algún tiempo después de la polinización del óvulo. Debido a que los embriones jóvenes normalmente no presentan latencia, los embriones híbridos pueden cultivarse y germinar poco después de la fecundación, evitándose así el problema de la vida latente. Cultivo de óvulos Algunas veces se cultivan óvulos fecundados para salvar embriones que resultan de cruzamientos masivos. Los óvulos que contienen embriones híbridos inmaduros se separan asépticamente poco después de haber sido fecundados y se cultivan en un medio nutritivo. Los óvulos pueden aislarse cuando el embrión está en una etapa más temprana de desarrollo que si el embrión mismo es aislado. Los embriones que se desarrollan dentro del óvulo tienen un ambiente químico y físico más favorable para su aislamiento y desarrollo que los embriones que se cultivan fuera de él. Polinización y fecundación in vitro La polinización y la fecundación in vitro consiste en cultivar óvulos no fecundados en un medio nutritivo en condiciones estériles. Los óvulos se polinizan espolvoreándolos con polen recién obtenido. Los tubos polínicos penetran en la pared del óvulo y la célula huevo es fecundada por un gameto del polen. Este procedimiento se ha utilizado para lograr la hibridación sexual entre especies en las que los tubos polínicos no crecen ni pueden penetrar en el óvulo normalmente después de la polinización.

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Conclusiones A través de la propagación in vitro se ha podido disponer de material vegetal en diversas especies para su evaluación rápida. En especies como papa y fresa, esta técnica es una de las más utilizadas; todos los años se introducen clones de interés, obtenidos a partir de cruzamientos controlados. La multiplicación in vitro, permite la obtención de material con condiciones de sanidad superiores a los obtenidos por vía convencional. Mientras que para las especies forestales, se necesitan medios de cultivo más complejos, la respuesta a las condiciones de cultivo resulta más lenta que en las especies herbáceas. A pesar de las dificultades que plantean, se ha desarrollado y adaptado esta técnica para su utilización en varias especies de interés forestal. En general existen múltiples técnicas de cultivo in vitro todas con el objetivo de mejorar los organismos vegetales, principalmente evitando la cruza endogámica y eliminando enfermedades hereditarias

Lecturas Consultadas Acosta C C. La Micropropagación En Especies Forestales. CienciActual.2012, 1, 22-44 Alicia Castillo. Propagación De Plantas Por Cultivo In Vitro: Una Biotecnología Que Nos Acompaña Hace Mucho Tiempo. Unidad de Biotecnología, INIA Las Brujas. García, Leyanis y J.C. Noa (1998). Obtención de plantas libres de patógenos. En: J.N. Pérez (ed.) Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. pp. 135-149. IBP, Santa Clara. López, R. (2002). Producción de plantas libres de virus y morfogénesis indirecta a partir de cultivo de meristemos de tres genotipos de quequisque (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott). Trabajo de Diploma. Universidad Nacional Agraria. Nicaragua. 40 p Castillo, A. 2004. Propagación de plantas por cultivo in vitro: una biotecnología que nos acompaña hace mucho tiempo. INIA, Uruguay. Poehlman, J.H., Sleper, D.A. 2003. Mejoramiento genético de las cosechas. Editorial Limusa S.A. de C.V. Allard, R. W.:Principios de la mejora genética de las plantas, Edición Revolucionaria, La Habana 1970. Cornide,M.T.: Genética vegetal y fitomejoramiento, Editorial científico técnica, La Habana,1980.