Le curve di legame per l’ ossigeno della Mioglobina e della Emoglobina by Gianluigi Filippelli

Le curve di legame per lâ&#x20AC;&#x2122; ossigeno della Mioglobina e della Emoglobina . Sergio Barocci La matematica viene da sempre considerata un valido strumento specialmente nel campo della chimica, della fisica e della biologia allo scopo di quantificare e razionalizzare ipotesi formulate sulla base di osservazioni sperimentali. In questo modo, fenomeni reali presentati attraverso funzioni, equazioni, logaritmi ecc., relazionati sulla base di nozioni chimiche, fisiche o biologiche , possono essere presentati con utili modelli matematici. Nel ventesimo secolo , la maggior parte delle connessioni o delle interazioni tra la matematica e la chimica ma in particolar modo tra la matematica e la biochimica sono state affrontate da molti ricercatori per risolvere alcuni concetti in maniera tale che determinate interpretazioni e/o la soluzione di processi biologici potesse avvenire con configurazioni , strutture e/o modelli. Alcuni esempi di queste interazioni sono rappresentate dallo studio della combinazione reversibile tra proteine (P) (enzima, recettore, trasportatore) e ligandi (L) (substrato, ormone, molecole) come base della funzione di molte proteine; interazioni in genere governate da un equilibrio chimico mediante la legge dellâ&#x20AC;&#x2122;azione di massa :

P+L

[P-L]

[P] [L] Kd = -----------

Ka = -----------[P] [L]

[P-L]

Ka = costante di associazione e Kd = costante di dissociazione dove Kd = 1/ Ka Significato della Kd di un complesso binario [P] [L] Kd = ---------[P-L] 1

Da questa relazione si possono dedurre le seguenti definizioni: [Ptot] = [P] + [P-L] [Ltot] = [L] + [P-L] L’equazione P + L

può essere anche riscritta nella forma: [P-L] / [P] = [L] / K

Combinando l’equazione [Ptot] = [P] + [P-L] con l’equazione [P-L] / [P] = [L] / K si ricava : [P-L]

[L]

Y = ----------------- = -----------------[Ptot]

Kd + [L]

Y= frazione di saturazione in funzione della concentrazione di ligando libero Kd = “concentrazione di semisaturazione”di L libero. La frazione di saturazione Y di P (frazione di P complessata ) varia al variare di [L], per effetto della legge dell’azione di massa. La rappresentazione grafica dell’ultima equazione è un’iperbole equilatera che presenta [L] in ascissa, la frazione di proteina combinata () in ordinata, l’inizio nell’origine degli assi e asintoto = 1. Più la Kd è bassa, più l’interazione proteina-ligando forte La stechiometria del complesso tra proteina e legante è molto variabile nelle proteine come si può individuare nelle reazioni della mioglobina (Mb) e dell’emoglobina (Hb) con le molecole di ossigeno: Mb + O2 <=> MbO2 Hb + 4 O2 <=> HbO2 + 3 O2 <=> Hb(O2)2 + 2 O2 <=> Hb(O2)3 + O <=> Hb(O2)4 Le molecole che trasportano l’ossigeno L’ossigeno riveste un ruolo fondamentale nei meccanismi chimici che sottostanno alla vita aerobica. Infatti, il passaggio dalla vita anaerobica alla vita aerobica rappresenta una delle tappe più importanti dell’evoluzione, perché ha reso disponibile una grande riserva di energia. L’energia che si estrae dal glucosio è circa diciotto volte più elevata in presenza di ossigeno che in sua assenza. ( CH2O6)6 + 6O2

6CO2 + 6H2O + Energia

L’evoluzione ha quindi dovuto affinare nei vertebrati dei meccanismi in grado di rifornire costantemente le cellule di ossigeno o O2 e al tempo stesso di liberarle dalla anidride carbonica o CO2. Uno di questi meccanismi è rappresentato dal sistema circolatorio che porta di continuo ossigeno alle cellule e l’altro è invece da alcune molecole che trasportano l’ossigeno permettendo così di superare la limitazione imposta dalla bassa solubilità dell’O2 in acqua (circa 10-4M). Questi trasportatori di ossigeno nei vertebrati sono rappresentati da due proteine globulari : l’emoglobina e la mioglobina. Tali proteine possono essere in soluzione (in alcuni invertebrati) oppure 2

concentrate in cellule specializzate come gli eritrociti dei vertebrati o ancora in cellule che richiedono grossi apporti di O2 come le cellule muscolari . Nei vertebrati la proteina trasportatrice di O2 nel sangue è l’emoglobina che gioca anche un ruolo importante nel trasporto di CO2 e di ioni H+ (protoni) . Il suo legame con l ’O2 è regolato oltre che da H+ e CO2 anche da fosfato inorganico. Questi regolatori sono capaci di modificare profondamente le proprietà di legame dell’O2 come l’emoglobina che può occupare anche siti disposti nella proteina in posizioni lontane da quelle specifiche per l’O2. Queste interazioni tra siti diversi sono presenti e operanti in molte proteine prendono il nome di interazioni allosteriche. L’emoglobina viene , quindi, definita per queste proprietà, una proteina allosterica La mioglobina o Mb è invece localizzata nei muscoli e la sua funzione è quella di fungere da riserva di O2 (forma di immagazzinamento) e di facilitare il movimento di O2 nel muscolo.Nei muscoli dei mammiferi acquatici la concentrazione di Mb è ~10 volte superiore a quella dei mammiferi terrestri. Mioglobina (Mb) e Emoglobina (Hb) costituiscono i più importanti membri della superfamiglia delle globine , proteine tra loro omologhe (e strutturalmente simili). Sono state anche tra le prime proteine di cui è stata definita anche la struttura tridimensionale. Ma quali requisiti devono avere queste molecole trasportatrici di O2 ? 1.

una sostanza deputata al trasporto di O2 deve: a) legarlo e rilasciarlo in modo opportuno b) impedire che reagisca con altre sostanze

Le proteine non hanno in genere gruppi funzionali adatti a fungere da siti di legame per l’O2 Alcuni ioni di metalli di transizione nei loro stati di ossidazione più bassi (Cu+, Fe ++ ) legano fortemente l’O2 ma sono soggetti a venirne ossidati. Le proteine trasportatrici di ossigeno sono proteine coniugate contenenti Fe eminico (gruppo eme) laddove lo ione ferroso dell’eme (Fe++) lega l’O2 mentre la componente proteica crea un ambiente idrofobico in cui il Fe++ non può essere ossidato a Fe+++. Mioglobina (Mb) e Emoglobina (Hb) rappresentano i più importanti membri della superfamiglia delle globine, proteine tra loro omologhe (e strutturalmente simili). Sono state anche tra le prime proteine da cui è stata definita anche la struttura tridimensionale (Fig 1 e Fig 2)

Figura 1 . Struttura tridimensionale della mioglobina I chiarimenti sulla struttura tridimensionale rispettivamente della mioglobina e dell’emoglobina sono dovuti a J. Kendrew e a M. Perutz (Fig.3) L’emoglobina e la mioglobina si differenziano significativamente per le loro funzioni La mioglobina o Mb è una proteina monomerica capace di legare o liberare O2 a seconda della sua concentrazione nel citoplasma delle cellule muscolari; essa presenta una catena polipeptidica costituita da 153 aminoacidi e un sito di legame per l’ossigeno al contrario dell’emoglobina che è invece costituita da quattro catene globiniche ognuna contenente un sito di legame per l’O2 ed a due a due uguali. La struttura della Mioglobina fu studiata ai raggi X dal muscolo scheletrico di capodoglio in quanto particolarmente stabile per la formazione di ottimi cristalli. Il muscolo scheletrico di mammiferi marini come balene, delfini e foche è infatti ricco in mioglobina per la sua funzione di riserva di ossigeno durante le immersioni.

Figura 2. Struttura tridimensionale dell’emoglobina

John Kendrew ( 1917 – 1997)

Max Perutz (1914 – 2002)

Figura 3 John Kendrew biochimico e cristallografo inglese, insignito del Premio Nobel per la chimica nel 1962 insieme a Max Perutz biologo austriaco naturalizzato britannico, 4

rispettivamente per i loro studi effettuati sulla struttura delle proteine globulari quali la mioglobina e l’emoglobina per mezzo dell'utilizzo di tecniche di diffrazione dei raggi X. Analisi dell’emoglobina ai raggi X La delucidazione della struttura tridimensionale dell’emoglobina o Hb ad opera di Perutz cominciata nel 1936 viene considerata un lavoro monumentale : una fatica appassionante durata quasi venticinque anni. Il successo arrivò nel 1959 quando Perutz ottenne una immagine della densità ottica a bassa risoluzione dell’emoglobina di cavallo seguita alcuni anni dopo da mappe ad alta risoluzione dei due stati due stati quaternari dell’emoglobina umana ed equina (Ossi Emoglobina e Deossi - Emoglobina). La molecola dell’Hb è quasi sferica. Le quattro catene sono molto ravvicinate e disposte in forma tetraedrica. I gruppi eme (uno per subunità) sono localizzati in cavità vicine alla superficie della molecola. I quattro siti di legame per l’ossigeno sono abbastanza lontani tra di loro. La distanza tra i due atomi di Ferro più vicini è di 25 °A. Ogni catena  è in contatto con entrambe le catene  mentre esistono poche interazioni tra le due catene  o tra le due catene . La struttura tridimensionale delle subunità dell’Hb assomiglia a quella della mioglobina. Risulta quindi evidente che la struttura tridimensionale della Mb di capodoglio e delle catene  e  dell’Hb umana racchiude un grande significato biologico. Tale struttura denominata “ ripiegamento globinico” ( le otto eliche in ciacuna catena dell’Hb sono sovrapponibili a quelle della Mb) è comune a tutte le mioglobine ed emoglobine conosciute dei vertebrati. Il ripiegamento è un disegno fondamentale della natura per un trasportatore di ossigeno che consente di porre il gruppo eme in un ambiente che permette il legame reversibile dell’ossigeno. Gli aminoacidi all’interno dell’Hb variano considerevolmente e spesso un residuo non polare viene sostituito da un altro residuo non polare (alanina che sostituisce isoleucina). In questa maniera , il carattere non polare dell’interno della molecola non viene alterato. L’insieme di questi residui non polari è molto importante per legare il gruppo eme e anche per stabilizzare la struttura tridimensionale di ciascuna subunità. Invece, i residui aminoacidici localizzati sulla superficie della molecola sono molto variabili e alcuni hanno cariche nette positive o negative. L’ HbA1 è la forma maggiormente rappresentata di emoglobina nell’uomo (circa il 98%) ed è costituita da due catene globiniche α, di 141 residui aminoacidici ciascuno e due β costituite da 146 residui (α2β2). E’ anche presente l’HbA2 (circa il 3%) in cui le due catene β sono sostituite da due catene δ (α2δ2). Sia le quattro catene globiniche dell’emoglobina che quelle della mioglobina contengono un gruppo prostetico in grado di legare una molecola di O 2 (gruppo Eme). Il gruppo eme La capacità dell’emoglobina e della mioglobina di legare l’ossigeno dipende infatti, come già accennato in precedenza, dalla presenza di una struttura non polipeptidica chiamata gruppo eme (Fig 4) . Queste unità non polipeptidiche saldamente legate alle proteine vengono dette anche gruppi prostetici. Il gruppo eme è costituito da una parte organica e da un atomo di ferro. La parte organica prende il nome di protoporfirina IX ( è una porfirina) ed è costituita da quattro anelli pirrolici legati tra loro da ponti metilenici per formare un anello tetrapirrolico. All’anello tetrapirrolico sono legati quattro gruppi metilici, due vinilici e due propionici. Nel gruppo eme, l’atomo di ferro è centrale e presenta un numero di ossidazione 2+ . Esso è in grado di formare 5 o 5

6 legami di coordinazione. Quattro legami di coordinazione sono formati con i quattro atomi di azoto degli anelli pirrolici della protoporfirina e giacciono sullo stesso piano degli anelli pirrolici quando l’Hb è ossigenata, mentre quando l’O2 è assente il ferro si trova ad una distanza dal piano di 0.6 Å. Il quinto legame di coordinazione lo ione Fe++ lo forma con un atomo di azoto presente nell’anello imidazolico di un residuo di istidina (istidina prossimale o His F8) della catena polipeptidica. Il sesto legame può essere libero o impegnare il ferro con la molecola di ossigeno. Questi due ultimi legami sono perpendicolari al piano dell’anello tetrapirrolico dell’eme. Quando l’ossigeno è legato allo ione Fe++ si verrà a trovare in prossimità dell’anello imidazolico di un secondo residuo di istidina della catena polipeptidica (istidina distale o His E7).

Figura 4. Struttura del gruppo eme Quando l’eme non è legato a proteine, la reazione dell’ossigeno con uno dei due siti di coordinazione del ferro (perpendicolari al piano dell’anello porfirinico) genera l’ossidazione irreversibile del Fe++ a Fe+++. Quando l’eme è inserito in una proteina, questa reazione non avviene in quanto il gruppo eme è immerso in profondità nella struttura proteica e l’accessibilità ai siti di coordinazione è limitata. L’importanza dell’impedimento sterico presentato dall’ambiente in cui si trova il sito di legame dell’eme, sia nell’emoglobina che nella mioglobina, è dimostrata dall’affinità di queste due proteine per il monossido di carbonio o CO , che compete con l’ossigeno per tale sito. In soluzione acquosa l’affinità del CO per l’eme libero è circa 25.000 volte maggiore di quella dell’ossigeno, mentre l’affinità del CO nei confronti dell’eme legato alla proteina è solo 250 volte superiore a quella dell’ossigeno. Questo a causa dell’impedimento sterico determinato dall’istidina E7 (His E7) , che causa un’inclinazione nella conformazione del complesso globina-CO con conseguente riduzione dell’affinità di legame. Anche il monossido di azoto o NO, può coordinarsi al ferro dell’eme con una affinità in questo caso superiore anche a quella dell’ossigeno. Quando si lega l’ossigeno, le proprietà elettroniche del ferro si modificano. Questo spiega il diverso colore che ha il sangue venoso povero di ossigeno (rosso scuro) rispetto al sangue arterioso ricco di ossigeno (rosso brillante). Il gruppo eme si trova alloggiato all’interno di una tasca idrofobica formata dal ripiegamento di ciascuna catena polipeptidica all’interno del quale le catene laterali di circa 18 aminoacidi stabiliscono all’incirca una ottantina di interazioni non covalenti con gli atomi di carbonio 6

dell’eme. Le due catene di acido propionico sono invece stabilizzate dalla interazione con la catena laterale priva di carica di un residuo di istidina e con molecole d’acqua, entrambe presenti sulla superficie esterna della molecola. La diffrazione ai raggi X ha mostrato che le catene globiniche dell’emoglobina cosi come quelle della mioglobina si presentano costituite da numerose regioni ad α-elica interrotte per la presenza di residui di prolina, che permettono il ripiegamento della catena a cui si accompagna spesso una inversione della direzione della stessa catena. Questo tipo di andamento fa assumere a queste catene globiniche una struttura grossolanamente sferoidale (proteine globulari) . Le catene  sono caratterizzate da sette zone ad α-elica, mentre le β da otto. Esiste una notevole somiglianza tra la struttura della catena globinica della mioglobina e la subunità β dell’emoglobina. Queste si differenziano solo per la disposizione del residuo carbossilico e amminico terminale. Il posizionamento verso l’esterno di tali gruppi, nella catena β dell’emoglobina permetterà l’interazione tra le due catene beta. La funzione fisiologica della mioglobina e della emoglobina dipende dalla reversibilità del legame fra ossigeno e gruppo eme, processo il cui andamento è descritto dalle curve di saturazione con l’O 2 . La cinetica di legame O2 per Mb La solubilizzazione dei gas nei liquidi è governata dalla legge di Henry (Fig.5) : un gas che esercita una pressione sulla superficie di un liquido, può entrare in soluzione finché non avrà raggiunto in quel liquido la stessa pressione che esercita sopra di esso. A temperatura costante, la solubilità di un gas è direttamente proporzionale alla pressione che il gas esercita sulla soluzione. Quando viene raggiunto l'equilibrio, il liquido si definisce saturo di quel gas a quella pressione. Tale stato di equilibrio può permanenere fino a quando la pressione esterna del gas resterà inalterata, altrimenti, se essa aumenta, altro gas entrerà in soluzione. Se diminuisce, il liquido si troverà in una situazione di sovrasaturazione ed il gas si libererà tornando all'esterno fino a quando le pressioni saranno nuovamente equilibrate. L’espressione matematica della legge è la seguente : P = k C dove P è la pressione del gas sulla soluzione , C è la concentrazione del gas nella soluzione e k è una costante tipica di ciascun gas che correla la pressione del gas sulla soluzione e la sua concentrazione, ad esempio: aumentando la temperatura , che provoca un aumento dell'energia cinetica del gas, si procura una diminuzione della solubilità per l'effetto dell’ allontanamento delle molecole gassose dalla fase liquida.

Figura 5 . William Henry (1775 – 1836) è stato un chimico inglese. Egli formulò nel 1803 una legge che regolava la solubilità dei gas nei liquidi. Ogni gas, così come viene specificato nella

legge delle

pressioni parziali di Dalton

(la pressione totale esercitata da una miscela ideale di gas ideali, è uguale alla somma delle pressioni parziali che sarebbero esercitate dai gas se fossero presenti da soli in un eguale volume. La pressione parziale P di un componente di una miscela di gas è la pressione che questo avrebbe qualora occupasse, da solo, il volume a disposizione dell'intera miscela), può entrare in soluzione o liberarsi indipendentemente da ciò che fanno gli altri gas presenti. Quindi, una definizione alternativa della costante di Henry è la seguente: P = kx , dove P è la pressione parziale del gas sopra la soluzione e x è la frazione molare del gas disciolto. Secondo questa definizione, a 298° K la costante di Henry assume i valori: O2 : k = 4,34×104 l·atm/mol ; CO2 : k = 1,64×103 l·atm/mol; H2 : k = 7,04×104 l·atm/mol. Il legame dell’O2 alla Mb o alla Hb può essere studiato con metodi spettroscopici (spettrofotometria UV -visibile) (Fig. 6)

Figura 6. Determinazione dell’emoglobina con metodi spettrofotometrici. Il colore della proteina e diverso a seconda del fatto che l’ossigeno sia o no legato al Fe++. Il legame di Mb all’O2 è un legame reversibile. Si tratta di una reazione all’equilibrio dove Mb + O2

MbO2 la cui costante di dissociazione o di equilibrio K è rappresentata da [Mb][O2]

-----------------[MbO2]

Dove [MbO2] = concentrazione della ossimioglobina e [Mb] = concentrazione della deossimioglobina e [O2] = concentrazione dell’ossigeno non legato. Tutte le concentrazioni sono espresse in moli/litro. La dissociazione dell’O2 da Mb può essere caratterizzata mediante la sua “saturazione frazionale Y O2 ” cioè la frazione di siti di ossigeno legato

[MbO2] YO2

[O2]

----------------------------

= -------------------------

[Mb] + [MbO2]

K + [O2]

cioè frazione di siti di legame di O2 occupati

Essendo O2 un gas la [O2] si può scrivere in funzione della pressione parziale pO2 o tensione di ossigeno. Quindi si avrà pO2 YO2

dove K può essere anche sostituito con il termine P50

= ----------------

K + pO2 pO2 L’equazione

YO2

= ------------------------

rappresenta graficamente una curva iperbolica (Fig. 7)

P50 + pO2

Figura 7. Curva di legame dell’O2 alla Mb. In ascisse la pO2 (pressione parziale di O2) e in ordinata la % di saturazione della Mb ( YO2) o la frazione dei siti di legame di una proteina quando viene occupata dal ligando. La Mb è per metà saturata dall’O2 ( YO2 = 0,5 : P50) alla pressione parziale pO2 di circa 1 Torr. La pO2 va da 100 torr dei distretti arteriosi ai 30 torr dei distretti venosi. In entrambe queste condizioni, la mioglobina che è nel muscolo si satura quasi completamente di O2 I punti essenziali del grafico sono : a) b) c) d) e) f)

a bassi valori di pO2 si lega poco O2 alla Mb all’aumentare dei valori di pO2 aumentano i siti occupati da O2 la pendenza della curva aumenta al diminuire di K quando K è uguale a pO2 si ha YO2 = 0,5 cioè la Mb è saturata al 50% da O2 operativamente la costante di dissociazione K può essere definita come: K = P50 la Mb ha una P50 molto bassa (circa 1 torr) e quindi un’ alta affinità per l’O2 9

g) la Mb deve essere in grado di catturare, nel citoplasma di cellule metabolicamente molto attive, l’O2 proveniente dal torrente circolatorio (pO2 circa 30 torr) ed essere in grado di rilasciarlo ai mitocondri (pO2 <4 torr) h) alle pO2 fisiologiche nel sangue (100 torr arterie, 30 torr vene) la Mb è sempre saturata (quando pO2 = 100 torr ⇒ YO2 = 0.97; quando pO2 = 30 torr ⇒ YO2 = 0.89) i) in aggiunta, la Mb è molto efficace nel favorire il passaggio di O2 dai capillari alle cellule muscolari. Emoglobina Le subunità  e  dell’emoglobina hanno lo stesso disegno strutturale della mioglobina ma l’emoglobina è una molecola molto più complicata della mioglobina. Oltre all’O 2 l’Hb è in grado di trasportare anche H+ e CO2 . In aggiunta, le proprietà di legame con l’ossigeno nell’Hb sono controllate da interazioni tra siti lontani nella molecola. Queste proprietà rendono l’Hb una proteina allosterica mentre la Mb non lo è. Questa differenza può essere espressa in tre modi : a) il legame di O2 all’Hb favorisce il legame di altro O2 alla stessa molecola; ciò significa che l’O2 si lega in maniera cooperativa all’Hb mentre il legame dell’O2 alla Mb non è cooperativo (curva sigmoide). b) L’affinità dell’Hb per l’O2 dipende dal pH mentre nella Mb è indipendente dal pH .Anche la CO2 altera le proprietà di legame dell’O2 per l’Hb. Sia H+ che CO2 promuovono il rilascio di O2 legato. Viceversa, l’O2 promuove il rilascio di H+ e della CO2 legata (Effetto Bohr). c) L’affinità dell’Hb per l’O2 è inoltre regolata da composti organici con gruppi fosforici ( 2,3 bifosfoglicerato o BPG) (adattamento ad alte quote). Come risultato finale, è che l’Hb presenta un’affinità per l’O 2 più bassa della Mb. La saturazione definita come la frazione dei siti leganti ossigeno occupata da molecole di ossigeno in soluzione viene indicata con la lettera Y. Il valore di Y varia da 0 (tutti i siti sono vuoti) a 1 (tutti i siti sono occupati). La rappresentazione grafica in un asse cartesiano di Y (in ordinata) in funzione di pO2 o pressione parziale di O2 (in ascisse) viene chiamata curva di dissociazione dell’ossigeno. (Fig. 8). Se si disegna un grafico della curva di dissociazione dell’ossigeno al variare della pressione parziale dell’ossigeno (pO2) per la Mb e per l’Hb si noteranno tra queste due proteine delle sostanziali differenze (Fig. 8).

Figura 8. Curve di dissociazione dell’ossigeno della mioglobina e dell’emoglobina. La saturazione dei siti di legame per l’ossigeno viene analizzata in funzione della pO2 in equilibrio con la soluzione. Ad ogni valore di pO2 , la saturazione Y è maggiore per la mioglobina; ciò significa che la mioglobina ha una affinità maggiore di quella dell’emoglobina. Tale affinità per l’ossigeno può essere quantificata da un termine che prende il nome di P50 che esprime la pO 2 a cui il 50% dei siti sono occupati (Y = 0,5) . Per la Mb il valore di P50 è di circa 1 Torr mentre per l’Hb è circa 26 Torr. L’altra differenza è che la curva di dissociazione dell’ossigeno presenta un andamento iperbolico per la Mb (Ciò vuol dire che la mioglobina si lega reversibilmente a una sola molecola di ossigeno, per cui tra forma ossigenata e non ossigenata esiste un equilibrio semplice: Mb+O2↔MbO2) e sigmoide per l’Hb ( il che vuol dire che le subunità che la costituiscono cooperano tra loro nel legame con l’ossigeno. Il legame di una molecola di ossigeno a un gruppo eme fa aumentare l’affinità dell’emoglobina facilitando i legami di altre molecole di ossigeno con gli altri gruppi eme della stessa molecola. Questo effetto viene indicato come interazione emeeme). La curva sigmoide dell’emoglobina non corrisponde a nessuna curva ottenibile con l’equazione pO2 YO2 = ----------------pO2 + P50 Archibald Hill I primi tentativi di analizzare la curva di dissociazione sigmoide dell'ossigeno dall'emoglobina furono eseguiti da Archibald Hill.(Fig. 9) Egli nel 1913 scoprì che la curva di legame dell’ossigeno dell’emoglobina ottenuta sperimentalmente poteva essere espressa da una equazione derivata da un ipotetico equilibrio, ipotizzando che l’Hb potesse legare n molecole di O2 in una sola tappa (cooperatività infinita): Hb + nO2

Hb(O2) 11

(pO2)n Dove Y = ------------------

pO2

che può essere arrangiata per dare ---------- = ----------

(pO2)n + (P50)n

1- Y

P50

Questa equazione stabilisce che il rapporto tra ossiemoglobina (Y) e deossiemoglobina (1 – Y) è uguale alla n potenza del rapporto tra pO2 e P50 . Facendo il logaritmo di entrambi i termini dell’equazione si avrà : Y log ----------- = n log pO2 - n log P50 1-Y L’ equazione che permette di comprendere il grado di saturazione dell’emoglobina in funzione della pressione parziale dell’ ossigeno (pO2) Il grafico di log [Y/ 1 – Y] in funzione di log pO2 rappresenta una retta e viene chiamato grafico di Hill (Fig. 10). La quantità n, cioè il coefficiente di Hill, è una misura della cooperatività del sistema. Quando: a. n = 1: il sistema non è cooperativo. Il binding del legante è semplice (comportamento iperbolico) b. n > 1: il binding presenta cooperatività positiva (curva sigmoide) c. n < 1: il binding presenta cooperatività negativa (curva a scalino) La cooperatività positiva (n>1) del legame dell’ossigeno nell’Hb deriva dalle modificazioni strutturali che il binding di una molecola di O2 ad un gruppo eme può indurre sull’affinità per l’O2 di un altro gruppo eme.

Quale è il significato biologico del legame cooperativo dell’ossigeno all’emoglobina ? Il legame cooperativo dell’ossigeno rende l’emoglobina un trasportore di ossigeno più efficiente rispetto ad un legame non cooperativo.

Figura 9. Il grafico di Hill

Figura 10. Archibald Vivian Hill (1886 – 1977) è stato un fisiologo britannico, insignito del Premio Nobel per la medicina nel 1922, insieme a Otto Meyerhof per i meccanismi di produzione del calore nei muscoli scheletrici. Fra i suoi primi lavori spiccano la caratterizzazione delle cinetiche enzimatiche, oggi note come equazioni di Michaelis-Menten, e lo sviluppo del coefficiente di Hill. La sua prima pubblicazione avvenuta nel 1909, ha infatti fornito le basi per la comprensione dei meccanismi allosterici e del legame cooperativo delle proteine. Effetto Bohr Mentre nella Mb non si hanno differenze nel legame dell’ossigeno in un largo range di pH così come per la CO2, nell ’Hb una acidità stimola il rilascio di ossigeno. Infatti, un abbassamento del valore del pH sposta la curva di dissociazione dell’ossigeno verso destra, riducendo in questo modo l’affinità dell’Hb per l’O2 . Anche concentrazioni crescenti di CO2 seppure a valori di pH costanti abbassano l’affinità per l’ossigeno. In tessuti metabolicamente attivi come il tessuto muscolare in contrazione, vengono prodotte grandi quantità di CO2 e acidi (H+). Quindi, la presenza di elevati livelli di CO2 e di ioni H+ nei capillari nel tessuto muscolare determina il rilascio di O 2 dall’Hb. La scoperta del meccanismo adatto a rifornire di grandi quantità i tessuti metabolicamente attivi come i muscoli , si deve a C. Bohr nel 1904 (Fig.11) 13

Figura 11. Christian Bohr (1855-1911) medico danese a cui si deve la descrizione del fenomeno ora chiamato effetto Bohr. L’effetto reciproco spiegato dieci anni dopo da J.S. Haldane (Fig.12) avviene nei capillari dei polmoni. L’elevata concentrazione di O2 nel tessuto polmonare induce il distacco di CO2 e di H+ dall’Hb esattamente come CO2 e H+ provocano il rilascio di O2 nei tessuti metabolicamente attivi. Le interconnessioni tra gli effetti causati da O2, H+ e CO2 sono noti come effetto Bohr.

Figura 12. John Scott Haldane (1860 – 1936) fisiologo britannico a cui si deve la scoperta dell’effetto Haldane , una proprietà dell’ emoglobina Adattamento ad alte quote L’affinità dell’Hb per l’O2 nei globuli rossi è più bassa di quella dell’emoglobina in soluzione. Si deve a due biochimici americani Reinhold Benesch e Ruth Benesh nel 1967 la scoperta del 2,3 bifosfoglicerato o BPG chiamato anche 2,3 difosfoglicerato o 2,3 DPG. Il 2,3 bifosfoglicerato e un sottoprodotto della glicolisi e si lega all’Hb provocando profonde modificazioni nella sua affinità per l’ossigeno. Questo composto organico contenente fosfato è presente nei globuli rossi umani alla stessa concentrazione molare dell’Hb. In assenza di BPG , il P50 dell’Hb è come quello della Mb ( circa 1 Torr) e in presenza di BP G , il P50 dell’Hb aumenta a 26 Torr. Pertanto il BPG è essenziale per poter scaricare ossigeno nei capillari tissutali.In poche parole, la sua presenza e un segnale di necessita di O2.Il BPG diminuisce l’affinità per l’ossigeno legandosi alla deossiemoglobina ma non alla ossiemoglobina.

Come passa l’emoglobina dalla struttura deossi a quella ossi mentre lega di seguito molecole di ossigeno ? E quale è il reale meccanismo allosterico dell’emoglobina ? Le proprietà allosteriche dell’emoglobina derivano da interazioni tra le subunità  e . Come avviene la transizione T (struttura tesa, rigida) – R (struttura rilassata)? Quando si lega all’ossigeno, i contatti tra le subunità 11 cambiano poco mentre un grande cambiamento si ha nei contatti tra le subunità 1 2. L’analisi della struttura ai raggi X ha rivelato due conformazioni per la emoglobina: lo stato R e quello T. Anche se l’ossigeno si lega ad ambedue gli stati si ha una considerevole più alta affinità per lo stato R. Quando l’ossigeno è assente sperimentalmente , lo stato T è più stabile e così lo stato T è lo stato predominante per la desossiemoglobina. T e R stanno per “teso” e “rilassato”, questo perché lo stato T è stabilizzato da un più grande numero di coppie ioniche nelle interfacce 12, 2 1. L’ossigeno, legandosi all’emoglobina nello stato T, provoca un cambiamento conformazionale e la porta nello stato R. Quando l’intera struttura subisce questo cambiamento, la struttura delle singole subunità cambia poco ma le coppie di subunità ab scivolano e ruotano, stringendo la tasca tra le subunità b. In questo processo alcune delle coppie ioniche che stabilizzano la forma T vengono rotte e se ne formano delle nuove. Lo stato desossigenato è detto T (tense) (Fig.13) : ha bassa affinità per l’O2 e il Fe+ + è spiazzato 0.6 Å in direzione prossimale. L’eme ha una forma a cupola. Lo stato ossigenato (Fig.14) è detto R (relaxed): ha alta affinità per l’O2 e il Fe++ giace nel piano dell’eme (che assume una forma planare)

Figura 13. Forma deossigenata

Figura 14. Forma ossigenata

Il BPG stabilizza la forma T ( deossigenata) legandosi a gruppi carichi positivamente nella cavità centrale dell’Hb. La CO2 un altro effettore allosterico si lega reversibilmente ai gruppi NH 2-terminali di tutte le quattro catene sotto forma di carbamato . Questa reazione produce H+ e contribuisce all’effetto Bohr. OCO2 + --NH2 ==== C—NH-- + H+ O 15

Gli ioni H+ si legano invece ad alcune coppie di siti che hanno un ambiente immediatamente circostante più negativo nella forma deossigenata che nella forma ossigenata della molecola Sono stati sviluppati due modelli limite : a) modello sequenziale nella forma più semplice sviluppata da D. Koshland Jr. e b) (Fig. 15) il modello concertato o MWC model (da J. Monod J. Wyman-J.P. Changeux model) (Fig.15) con nuove visioni delle interazioni allosteriche. Nel modello sequenziale semplice il legame del ligando induce un cambiamento conformazionale in una subunità. Questo produce cambiamenti simili nelle subunità adiacenti . Possono esistere quindi, un gran numero di conformazioni. Nel modello concertato dove viene conservata la simmetria, si assume che tutte le subunità in una particolare proteina devono essere o nella forma R o nella forma T. Il legame di un ligando aumenta la proporzione di molecole che si trovano nella forma a R. I due modelli non si escludono a vicenda In realtà, Il meccanismo allosterico dell’emoglobina è più complesso di quello proposto da ciascin modello.

Figura 15. Daniel E. Koshland, Jr. (30 marzo 1920 - 23 luglio 2007) biochimico statunitense e Jacques Lucien Monod ( 1910 – 1976) biologo francese, vincitore del Premio Nobel per la medicina nel 1965.per la teoria dell'operone

Bibliografia essenziale Kendrew J.C. “The three dimensional structure of a protein molecule” Sci.Amer 1961,205,96. Perutz M. “Hemoglobin structure and respiratory transport “ Sci Amer 1978, 239, 92. Monod J. Wyman J and Changeux J.P. “ On the nature of allosteric transitions . A plausible model”. J Mol Biol 1965, 12, 88.