ANÁLISIS DE RESULTADOS
Al evaluar la tasa de crecimiento de la Spirulina sp., en dos medios nutritivos, S1 y S2 utilizando el medio estándar Zarrouk (no modificado y modificado), durante un período de tiempo de 15 días, se pudo observar que la cianobacteria se adaptó a las condiciones operacionales y de crecimiento establecidas por ambos medios, incrementando su tasa de crecimiento paulatinamente con el tiempo, un comportamiento semejante al encontrado por Becker (Becker, 1982). La evaluación de la cinética de crecimiento de la Spirulina sp., se dio de acuerdo al seguimiento del pH, la temperatura y los medios nutritivos S1 y S2. Esta cianobacteria se puede cultivar en biorreactores de sistemas acuosos, abiertos o cerrados, naturales o artificiales, en los que el medio de cultivo contiene sales de bicarbonato de sodio y nitratos que contribuyen a la alcalinidad del medio, uno de los factores pH En ambos medios (S1 y S2), la Spirulina, demostró capacidad de crecer bajo un intervalo amplio de valores de pH, desde del rango 9,02 – 10,22 incrementando directamente la producción de biomasa, este se constituye un factor limitante en el proceso, de acuerdo a los hallazgos establecidos por Pelizer (Pelizer, 2002). Esto explica porque el crecimiento de la Spirulina, se ve favorecida por la alcalinidad relativamente alta, sin exceder los rangos permitidos, siendo estas dos variables directamente proporcionales con respecto al tiempo, donde a medida que aumenta la biomasa aumenta el pH (Tiboni, 1985). El medio químico debe ser rico en carbonatos, nitratos y sales (Pedraza, 2015). Se ha establecido que el intervalo óptimo del pH para la Spirulina sp., oscila entre 8,5
y 10,5 favoreciendo la preservación de la viabilidad de las células en un medio como el Zarrouk y protegiendo al cultivo de la contaminación por otros microorganismos (Monaselidze, 2002) , (Garcia, 2015).
El crecimiento fotosintético de la cianobacteria provoca cambios en el pH del medio, por la liberación de grupos de OH - , si este se encuentra como mínimo en un pH 9, permite que los nutrientes tengan mayor
disponibilidad, además
aumenta la solubilidad de CO2 y la distribución relativa de las formas inorgánicas de carbono (Douskova, 2009), . Rodríguez y Triana (2006) evaluaron cultivos de Spirulina sp., en un rango de pH de 8,2- 10,2 a escala de laboratorio, donde se determinó la cinética de crecimiento en cada uno de los tratamientos y se estableció que el pH 9,0 favorecía la mejor adaptación de la Spirulina sp., para un desarrollo rápido con la mejor tasa de productividad, con el fin de minimizar los costos de producción (Rodríguez, 2006). En el día 15 se presenta un incremento del pH del medio de cultivo S1, de 10,22 estos coinciden con los valores de tolerancia de la cianobacteria. Se observa precipitación de sales en el medio, que de acuerdo a su composición son de la clase de carbonatos, fosfatos y sulfatos, presentándose floculación de la Spirulina sp., según los hallazgos de Becker (1982), la causa del aumento del
pH de
valores por encima de 10, se debe principalmente al agotamiento de los aniones NO3-, de CO2 del medio y de la excreción de iones OH -, reduciendo la actividad fotosintética del cultivo (Rodríguez, 2006) , (Ola, 2013).
Temperatura La temperatura de ambos cultivos se mantuvo en los rangos permitidos, oscilando en el medio nutritivo S1 desde 29 – 29,55 °C, en el S2 en un rango de 27,4 – 29,1
°C. La temperatura de crecimiento óptima de la Spirulina sp., se ha reportado entre 25-35 °C, con una densidad máxima de células en los 30 °C (Muñoz, 2006). La respiración disminuye la masa de la Spirulina (la "biomasa") sobre todo cuando la temperatura está elevada. Desde este punto de vista las noches frescas son buenas, pero la Spirulina no puede soportar una fuerte iluminación al frío (debajo de 15°C). Aunque la iluminación es un factor esencial, el pleno sol no es ideal para la Spirulina una media sombra es preferible (Garcia, 2015). En estudios adelantados por Muñoz (2006), comprobó que la Spirulina sp., en cuanto a su temperatura es un factor determinante, por que regula la respuesta celular, morfológica y fisiológica de las cianobacterias. A Temperaturas altas en general aceleran la tasa metabólica de las cianobacterias, mientras que a temperaturas bajas conducen a la inhibición del crecimiento de las mismas. Además de afectar a las reacciones celulares, la temperatura también afecta a la naturaleza del metabolismo, los requerimientos nutricionales y la composición de la biomasa, si bien dentro de los rangos óptimos tiene poca influencia sobre la concentración final de biomasa, así como sobre la producción y la composición bioquímica (Muñoz, 2006) . Los sistemas de cultivo implementados eran abiertos por lo tanto un incremento de temperatura se compensaba con la evaporación del agua, regulándose de este modo la temperatura máxima, además no había una exposición directa a la luz natural (Garnier, 2004). Oxitop La cinética de crecimiento de Spirulina sp., fue comparada bajo condiciones de medio de cultivo S1 y S2, el uso de agitación magnética, sin aireación, frasco oscuro y un periodo de tiempo de 6 días. En el proceso se evidencio igual producción de biomasa con respecto al tiempo para ambos cultivos, mostrando curvas semejantes.
En cuanto los procesos de adaptación de la Spirulina sp., se observa que el medio de cultivo S2 fue más corta esta fase en comparación con el medio de cultivo S1, según Walter y col., 2011; Monteiro y col., 2010, esto que implico que al haber más producción de biomasa en menos tiempo de cultivo, incrementa la eficiencia del proceso lo que conlleva que el mismo sea más rentable (Monteiro, 2010 ); (Walter, 2011 ).
Zeng y col., (2001) hallaron que la concentración de un 1% de CO 2 en los sistemas de cultivo ayudan a incrementar la concentración de biomasa de Spirulina y estabilizar el pH (Rojas, 2012). Algunos autores (Chen & Zhang, 1997; Andrade & Costa, 2007) han encontrado que en los primeros días de cultivo de Spirulina sp., se presenta una fase heterotrófica dominante, que a medida en que los nutrientes son consumidos, disminuye, dominando la fase fotoautrófica en una segunda etapa. No obstante Dhiab ., (2010) ha demostrado que los nutrientes en el medio son consumidos los tres primeros días, considerándose esta fase como autótrofa, caracterizada por una alta tasa de fotosíntesis neta, la cual se ve reducida al disminuir las fuentes orgánicas o inorgánicas de carbono (Rojas, 2012).
Medios nutritivos S1 y S2
Al evaluar los medios nutritivos S1 y S2, las ratas de crecimiento presentan tendencias muy similares, ambos favorecieron el desarrollo de la Spirulina sp., desde su aporte en nutrientes, los cuales fundamentaban su composición en el medio estándar Zarrouk, como lo sustentan Raoof y col., (2006) los cuales determinaron el efecto benéfico del NaCl y el NaNO 3 en el crecimiento de la
cianobacteria Spirulina platensis, cultivada en medio Zarrouks, y obtuvieron un incremento de 87 % en la producción de biomasa comparado con los medios que no tenían este aporte de nutrientes (Raoof, 2006). La concentración de sales inorgánicas disueltas en los medios, puede potencialmente afectar al crecimiento de las microalgas en función de su actividad osmótica (Abalde, 1995).
Matriz experimental La cinética de crecimiento de la Spirulina sp., fue evaluada bajo diferentes condiciones operacionales como: agitación (145 – 165 rpm), aireación, sustrato (medio Zarrouk, modificado y no modificado), luz (natural y blanca), y ciclos de luz 12/12 y 24/24 respectivamente, con niveles de los parámetros: alto (con) y bajo (sin), en 8 tratamientos durante un lapso de tiempo de 24 días. Se medió la densidad óptica de cada tratamiento donde se tomaron 3 mL de muestra y se determinó su absorbancia a una longitud de onda de 400-700 nm, por espectrofotometría UV- Vis En el tratamiento # 1, donde se consideraron condiciones operacionales como: sin agitación, sin aireación, S2 y sin iluminación, se observó un comportamiento atípico de la Spirulina sp., donde la biomasa se precipito en el día 5, mezclándose con el contenido de sales del medio. Esto se debe como consecuencia a que el tratamiento presenta los niveles de parámetros bajos, no aseguraba condiciones básicas, las cuales afectan directamente el crecimiento de la cianobacteria. Según Habib y col, la producción de biomasa de Spirulina depende de muchos factores, los más importantes son la disponibilidad de nutrientes, la temperatura y la luz. Estos factores influyen en el crecimiento y la composición de la Spirulina, lo
que puede causar cambios en el metabolismo, el cual modifica de forma considerable los componentes principales de la biomasa (Habib, 2009). El tratamiento # 2, donde se consideraron condiciones operacionales como: con agitación, sin aireación, S2 y sin luz, se observa que la rata de crecimiento de la Spirulina sp., conforme al tiempo es limitada por factores tan importantes como la luz, siendo esta indispensable para el crecimiento de la Spirulina sp., y en el proceso fotosintético, según Yang et al. (2000) encontraron que la producción de ATP en la primera fase de cultivos mixotróficos, está dada principalmente por la luz (Yang, 2000.) En cuanto el nivel de suplementación de aire a través del burbujeo, Se reporta que la Spirulina produce alto valor de biomasa cuando el medio es burbujeado con aire, que cuando no es aireado (Pandey & Tiwari, 2010) y en este sentido la aireación es un parámetro muy importante. El tratamiento # 3, donde las condiciones operacionales fueron: sin agitación, con aireación, S2 y sin luz, considerando que el crecimiento de la Spirulina es proporcional a la intensidad de la luz recibida, la fotolimitación de este tratamiento pudo haber provocado el poco aumento de la biomasa. Según García (2015) la iluminación es indispensable para el crecimiento de la Spirulina sp., (fotosíntesis), pero no se debe mantenerla 24 horas continuas por día. Durante la noche reacciones bioquímicas continúan produciéndose en la Spirulina como la síntesis de proteínas y la respiración (Garcia, 2015). Un parámetro importante en el diseño de un biorreactor es la penetración de la luz, que depende de la intensidad de la radiación incidente, la dispersión de la luz en la superficie del reactor y la atenuación en el medio de cultivo (Randmann, 2007). El tratamiento # 4, donde las condiciones operacionales fueron: con agitación, con aireación, S2 y sin luz, este tratamiento proporciona condiciones como agitación y la aireación, que favorecen el intercambio gaseoso, evitan la sedimentación de células, la formación de gradientes de condiciones ambientales
y de concentración de nutrientes, pero el factor luz fue determinante para el aumento de la tasa de crecimiento de la Spirulina sp. En este sentido el requerimiento de luz es uno de los más importantes parámetros a abordar; la cual debe ser proveída con adecuada intensidad, duración y longitud de onda, es determinante en varios aspectos fisiológicos relacionados con la aclimatación, tolerancia al stress, producción de pigmentos y crecimiento de las cianobacterias (Materassi, 1984). En el tratamiento # 5, presentaba condiciones como: sin aireación, sin agitación, con S1 y con luz natural , se observa un comportamiento atípico del sistema de cultivo, donde la biomasa se precipito y formo flóculos en el día 5. El sistema presentaba disponibilidad de luz, lo que sugiere que se iniciaron procesos de fotosíntesis por parte de la cianobacteria, como producto de esto se dio emisión de
gases que por falta de la recirculación y mezcla del cultivo
contribuyo a que aumentara la concentración de estos, además la poca disponibilidad de los nutrientes provocaron muerte celular. Según Tredici (2010), La mezcla es necesaria para prevenir la sedimentación de las células, evitar la estratificación térmica, distribuir los nutrientes, remover el oxígeno generado por la fotosíntesis y asegurar que las células experimenten adecuados períodos de luz y oscuridad. El tipo de mezcla y la dinámica de fluido del cultivo influyen en la irradiación promedio y régimen de luz al que las células están expuestas, factores clave que influyen en la productividad (Tredici, 2010). Tratamiento # 6: presentaba condiciones como: con agitación, sin aireación, S1 y con luz natural. Se observa inicialmente un proceso de adaptación de la Spirulina sp., en los primeros 5 días. La disminución de la intensidad lumínica de la luz solar y la inadecuada velocidad de agitación
Tratamiento # 7: presentaba condiciones como: sin agitación, con aireación, S1 y con luz blanca (lámpara fluorescente), con fotoperiodos 24/24. Este tratamiento
aseguro las condiciones operacionales básicas para un aumento progresivo de la tasa de crecimiento de la Spirulina sp., de acuerdo al tiempo del cultivo. El uso de aireación artificial y continua por bomba, favoreció el crecimiento de Spirulina sp., en comparación con los tratamientos que no la poseían, además evitaba el daño mecánico de la célula y la posible lisis celular. Se observa que la fase de adaptación de la Spirulina sp., transcurre en los primeros 5 días, acoplándose a las condiciones establecidas por el medio, e incrementando paulatinamente la biomasa conforme transcurre el tiempo, los cambios en la concentración de nutrientes causada por la adaptación de la Spirulina sp. , son tan bajos por lo tanto el crecimiento del cultivo aun no es significativo. A partir del día 12 hasta el día 16 hay un marcado incremento de biomasa de la cianobacteria, hasta llegar a ser lineal en un lapso de tiempo de 3 días La luz blanca artificial, aporto las condiciones para el proceso de la fotosíntesis, según Pumann (2005), en la Spirulina la fotosíntesis constituye el proceso bioenergético por excelencia, el cual aporta la principal y a veces única entrada de energía para desarrollar el resto de procesos fisiológicos de la célula. De hecho, la mayoría de cianobacterias son organismos fotoautótrofos estrictos, sin capacidad para crecer y proliferar en la oscuridad a expensas de la respiración a partir de una fuente orgánica de carbono. (Paumann, 2005). La lámpara fluorescente regulaba la temperatura del medio. En estudios adelantados por Muñoz (2006), estableció que en condiciones de temperatura adecuadas, las enzimas en las células de microalgas poseen mayor actividad (Muñoz, 2006).