manual técnicos laboratorio by glpalo

Complejo Asistencial de Soria

Laboratorio de Bioquímica Clínica

Manual para Técnicos de Laboratorio

Luis Rabadán del Alcázar

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LA DIRECCIÓN MPAÑÍA]

Enero 2014

Complejo Asistencial de Soria. Laboratorio de Bioquímica Clínica

Índice de capítulos Pág

Capítulo

(pdf+1)

Introducción. Objeto y campo de aplicación del manual

Capítulo 1. Organización del laboratorio

Introducción

1.1. Ubicación

1.2. Campo de actividad

1.3. Clientes y proveedores

1.4.

Política de calidad

1.5.

Misión, visión y valores

1.6.

Sugerencias y reclamaciones

1.7.

Consultoría

1.8.

Contactar

1.9.

Equipo humano

1.10. Estructura organizativa

1.11. Areas del laboratorio clínico

1.12. Organización y distribución de las áreas del laboratorio

1.13. Personal. Responsabilidades y tareas. Organigrama

1.14. Organización de las actividades

1.15. Relación con los usuarios

1.16. Gestión económica

1.17. Procedimientos de compras

1.18. Gestión de almacenes

1.19. Gestión y control del gasto

1.20. Laboratorios externos de referencia

Capítulo 2. Sistema Informático del Laboratorio

Introducción

2.1. Componentes básicos de los ordenadores

2.2. Redes locales

2.3. Internet, intranet y extranet

2.4. Sistemas informáticos del laboratorio

2.5. Sistemas expertos

2.6. Estadísticas de actividad

Capítulo 3. Procesos y procedimientos del laboratorio

Definición de proceso

3.1. La gestión por procesos en el laboratorio clínico

3.2. Procesos y procedimientos

3.3. El diagrama de flujo o flujograma

3.4. La ficha del proceso

3.5. Tipos de procesos en el laboratorio clínico

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Complejo Asistencial de Soria. Laboratorio de Bioquímica Clínica

3.6. El mapa de procesos

3.7. Registros y trazabilidad

3.8. La mejora de los procesos

3.9. Los indicadores

3.10. Procedimientos normalizados de trabajo y generales. Documentos de trabajo

Capítulo 4. Material, reactivos y equipos básicos. Preparación de disoluciones

Introducción

4.1. Material de vidrio

4.2. Material de plástico

4.3. Recipientes para preparar disoluciones

4.4. Utensilios para medir el volumen

4.5. Sustancias químicas, materiales de referencia y equipos de reactivos

4.6. Agua para el laboratorio clínico

4.7. Pipetas semiautomáticas y automáticas

4.8. Dispensadores

4.9. Diluidores

4.10. Balanzas

4.11. Baños

4.12. Centrífugas

4.13. Microscopios

4.14. Preparación de disoluciones

4.15. Diluciones

4.16. Disoluciones de concentración expresada en unidades físicas

4.17. Disoluciones de concentración expresada en unidades químicas

4.18. Disoluciones amortiguadoras

Capítulo 5. Metrología. Magnitudes. Unidades. Sistemas y especímenes. Resultados

Definición de metrología

5.1. Tipos de magnitud

5.2. Unidad (de medida)

5.3. El sistema internacional de unidades

5.4. Valor y resultado

5.5. Sistema biológico

5.6. Componente

5.7. Magnitud bioquímica

5.8. Nomanclatura sistemática

5.9. Proceso de medida

5.10. Escalas de medición

5.11. Sistemas, especímenes y muestras

5.12. Resultados y unidades

Capítulo 6. Las pruebas y la petición analítica

Definiciones

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Complejo Asistencial de Soria. Laboratorio de Bioquímica Clínica

6.1. Formulario de petición analítica

6.2. Catálogo y clasificación de las pruebas

6.3 Gestión de la demanda analítica

104

6.4. Descripción, indicaciones e interpretación de los resultados de las pruebas

104

6.5. Características, analíticas, diagnósticas y metrológicas de las pruebas

105

Capítulo 7. Los factores preanalíticos

106

7.1. La fase pranalítica

107

7.2. La importancia de la fase preanalítica

107

7.3. Influencia de la edad, el género, la raza y la gestación

107

7.4. Hábitos variables

109

7.5. Café, tabaco, estimulantes y drogas adictivas

111

7.6. Cuándo se debe hacer el exámen de laboratorio clínico

112

7.7. Toma de muestras durante la terapia de infusión intravenosa

114

7.8. Las intervenciones quirúrgicas

114

7.9. Impacto de la secuencia de procedimientos diagnósticos y terapéuticos

115

7.10. Efectos de la postura y el torniquete

116

7.11. Factores preanalíticos que pueden afectar a los resultados

118

7.12. Preparación del paciente

119

7.13. Información y recomendaciones preanalíticas para el paciente

119

Capítulo 8. Los especímenes, las muestras y los aditivos

120

8.1. Espécimen y muestra

121

8.2. Suero y plasma

121

8.3. Factores que influyen en la calidad de los especímenes y las muestras

122

8.4. Tipos de muestra

123

8.5. Contenedores y aditivos

124

8.6. Aditivos para la toma de muestras de sangre

126

8.7. Contenedores y aditivos para la recogida de muestras de orina

127

Capítulo 9. Toma e identificación de las muestras

130

9.1. Toma de muestras de sangre

131

9.2. Recogida de muestras de orina

133

9.3. Recogida de muestras de heces

135

9.4. Toma de muestras de líquidos biológicos

136

9.5. Recogida de muestras de semen

136

9.6. Identificación de las muestras

137

Capítulo 10. Transporte de las muestras

139

10.1. Tipos de muestras a transportar

140

10.2. Sistema de transporte

140

10.3. Tiempo de transporte

140

10.4. Temperatura de transporte

141

10.5. Contenedores. Seguridad biológica

141

10.6. Acondicionamiento de las muestras

141

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10.7. Sistemas de control de tiempo y temperatura

143

10.8. Perfiles estándar para el transporte de muestras

144

10.9. Buenas prácticas en el transporte de sangre venosa

144

10.10. Buenas prácticas en el transporte de orina

145

Capítulo 11. Estabilidad y conservación de las muestras

146

11.1. Estabilidad de una muestra

147

11.2. Conservación. Causas de alteraciones de la calidad de las muestras

147

11.3. Recomendaciones y reglas para la conservación de las muestras

147

11.4. Conservación de muestras de sangre y gasometría

148

11.5. Conservación de muestras de orina de una micción

149

11.6. Refrigeración de la orina de 24 h durante la recogida

149

11.7. Conservación de otras muestras biológicas

150

11.8. Muestras para laboratorios externos de referencia

150

11.9. Muestras con contenido legal. Cadena de custodia

150

Capítulo 12. Recepción, preparación y almacenamiento de las muestras

152

12.1. Recepción y requisitos de aceptación de peticiones y muestras

153

12.2. Motivos de rechazo

154

12.3. Preparación de las muestras. Centrifugación

155

12.4. Manipulación y distribución de las muestras

156

12.5. Almacenamiento de las muestras

156

12.6. Automatización de la preparación de especímenes

157

Capítulo 13. Métodos analíticos

158

Introducción

159

13.1. Procedimiento, método y técnica de medida

159

13.2. Descripción del método analítico

159

13.3. Tipos de métodos analíticos

160

13.4. Necesidad de la evaluación del método analítico

160

13.5. Características de los métodos analíticos

160

13.6. Criterios de selección de los métodos analíticos

163

13.7. Evaluación del método analítico

164

13.8. Comparación de métodos

168

13.9. Implantación de nuevos métodos analíticos

169

Capítulo 14. Técnicas analíticas

172

14.1. Clasificación

173

14.2. Técnicas espectroscópicas. Radiación electromagnética

175

14.3. Espectroscopia de absorción molecular

176

14.4. Medida de sustratos por métodos absorción molecular

179

14.5. Medida de actividades enzimáticas por métodos de absorción molecular

180

14.6. Espectroscopia atómica

181

14.7. Espectroscopia de fluorescencia

183

14.8. Espectroscopia de luminiscencia

184

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Complejo Asistencial de Soria. Laboratorio de Bioquímica Clínica

14.9. Espectroscopia de dispersión. Turbidimetría y nefelometría

185

14.10. Espectroscopia de reflectancia

187

14.11. Técnicas electroquímicas: potenciometría, amperometría, conductometría y biosensores.

188

14.12. Técnicas inmunoquímicas: aglutinación, inmunoprecipitación inmunoturbidimetría e inmunonefelometría.

190

14.13. Inmunoanálisis con reactivos marcados: competitivos, no competitivos, radioinmunoanálisis, enzimoinmunoanálisis, fluoroinmunoanálisis, luminoinmunoanálisis, partículoinmunoanálisis, inmunoanálisis mediados por avidina-biotina, inmunofluorescencia, inmunoanálisis en línea o tira e inmunocromatografía

194

14.14. Osmometría

200

14.15. Técnicas para medir la concentración de número: cámaras de recuento, citometría de flujo y citoquímica de flujo

201

14.16. Técnicas de separación: centrifugación, cromatografía y electroforesis

205

14.17. Microscopía

210

14.18. Técnicas de diagnóstico molecular: aislamiento y cuantificación de los ácidos nucleicos, técnicas de separación del ADN, enzimas utilizadas en el diagnóstico molecular, técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa, método del ADN de cadena ramificada, sondas de ácidos nucleicos, marcaje de las sondas da ácidos nucleicos, hibridación de ácidos nucleicos, secuenciación de ADN, diagnóstico de las enfermedades genéticas y micromatrices de ADN

211

14.19. Técnicas de citogenética: cromosomas, cultivo celular, cariotipo, hibridación fluorescente in situ, anomalías cromosómicas y aplicaciones clínicas de la citogenética

228

14.20. Técnicas proteómicas: proteómica clínica, preparación de las muestras para los análisis proteómicos, muestras de tejidos, de plasma/suero, de orina, muestras de líquido cefalorraquídeo, métodos de separación de proteínas, electroforesis bidimensional, separaciones multidimensionales, espectrometría de masas, identificación de las proteínas, micromatrices proteínicas, proteómica del plasma sanguíneo, la orina, proteómica del LCR

235

Capítulo 15. La fase analítica

241

Definiciones

242

15.1. Analizadores automáticos

242

15.2. Modelos de automatización

245

15.3. Instrucciones para el uso de los analizadores

246

15.4. El agua para el laboratorio clínico

247

15.5. Los reactivos

249

15.6. Los materiales de calibración

253

15.7. Los materiales de control

255

15.8. Serie analítica

256

15.9. Límite inferior de detección - sensibilidad analítica

257

15.10. Intervalo de medida - Linealidad

257

15.11. Interferencias

257

15.12. Alarmas y avisos

260

15.13. Resultados aberrantes o absurdos

261

15.14. Diluciones, factor de dilución, comprobaciones y repeticiones

261

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15.15. Procedimiento analítico alternativo

261

15.16. POCT (Point Of Care Testing)

261

Capítulo 16. Garantía y Sistemas de gestión de la calidad. Certificación. Acreditación

264

Terminología

265

16.1. Variabilidad extraanalítica

265

16.2. Variabilidad analítica aleatoria

270

16.3. Soluciones de control de calidad

272

16.4. Datos estadísticos básicos para control de calidad

273

16.5. Gráficas de control de calidad

282

16.6. Reglas de control de procesos estadísticos

284

16.7. Indicadores de calidad analítica. Control de calidad interno y externo

286

16.8. Aplicaciones del control interno de la calidad. Planes de mejora

288

16.9. Especificaciones-objetivos de calidad analítica

290

16.10. Control de calidad pre y post analítico. Indicadores

297

16.11. Sistemas de gestión de la calidad. Certificación. Acreditación. Mejora continua

298

Capítulo 17. La fase postanalítica

305

Terminología

306

17.1. Validación técnica

306

17.2. Validación facultativa o clínica

308

17.3. Disponibilidad de resultados

309

17.4. Informe de resultados

310

17.5. Comunicación urgente de resultados críticos o alarmantes

310

17.6. Comentarios interpretativos de los resultados

312

Capítulo 18. Interpretación de los resultados. Valor semiológico

313

18.1. Valores de referencia

314

18.2. Variabilidad

316

18.3. Valor de referencia de un cambio

320

18.4. Prevalencia e incidencia

321

18.5. Capacidad discriminante

321

18.6. Sensibilidad y especificidad diagnóstica

322

18.7. Valor predictivo positivo y negativo

323

18.8. Eficiencia diagnóstica

323

18.9. Análisis de los datos

323

18.10. Dicotomización. Curvas de rendimiento diagnóstico ROC

324

18.11. Cociente o razón de verosimilitud

326

18.12. Magnitud apropiada

327

18.13. Poder diagnóstico

327

18.14. El resultado inesperado

328

Capítulo 19. Errores e incidencias en el laboratorio

329

Introducción

330

19.1. Definición de error en el laboratorio

330

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19.2. Términos y definiciones

330

19.3. Clasificación de los errores

331

19.4. Errores en la fase preanalítica

332

19.5. Errores en la fase analítica

334

19.6. Errores en la fase postanalítica

336

19.7. Conclusiones y recomendaciones

337

19.8. Incidencias. Definición y registro

338

19.9. Incidencias relacionadas con la petición analítica

338

19.10. Incidencias relacionadas con la preparación del paciente

339

19.11. Incidencias relacionadas con la toma de la muestra

339

19.12. Incidencias relacionadas con el transporte de la muestra

339

19.13. Incidencias relacionadas con la calidad de la muestra y los contenedores

340

19.14. Incidencias relacionadas con la fase analítica

341

19.15. Incidencias relacionadas con la validación de resultados

341

19.16. Incidencias relacionadas con la comunicación urgente de resultados críticos

342

19.17. Incidencias relacionadas con el informe de resultados

342

Capítulo 20. La seguridad del paciente en el laboratorio

343

Introducción

344

20.1. Objeto y campo de aplicación

344

20.2. Terminología básica

344

20.3. Seguridad del paciente en el proceso de laboratorio clínico

346

20.4. Cultura de seguridad del paciente

348

20.5. El papel del laboratorio clínico en la seguridad del paciente

349

20.6. El mapa de riesgos en los procesos del laboratorio

350

20.7. Análisis modal de fallos y efectos

354

20.8. Identificación de riesgos en el laboratorio

358

Capítulo 21. Seguridad en el laboratorio clínico. Prevención de riesgos laborales

360

Introducción

361

21.1. Consideraciones generales sobre seguridad

361

21.2. Programa de seguridad

361

21.3. Equipos de seguridad

361

21.4. Materiales y riesgos químicos

362

21.5. Agentes y riesgos biológicos

362

21.6. Riesgos eléctricos

364

21.7. Riesgos de incendio

364

21.8. Tratamiento y eliminación de residuos

364

21.9. Guía de prevención de riesgos biológicos

371

Anexo I. La protección de datos de carácter personal

379

Anexo II. Evaluación de competencias

381

Anexo III. Términos y definiciones

388

Bibliografía y direcciones web. Certificados de calidad del laboratorio

402

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Complejo Asistencial de Soria. Laboratorio de Bioquímica Clínica

Introducción. Objeto y campo de aplicación del manual El Objeto de este Manual para Técnicos de Laboratorio es facilitar la comprensión de la organización, funcionamiento y gestión de un laboratorio de bioquímica clínica. Se pretende que la incorporación al trabajo del técnico tenga una base de conocimientos teóricos previos que le permita identificar en cualquier momento en que fase del proceso del laboratorio se encuentra, el contenido de cada una de ellas y que comprenda la secuencia de acontecimientos que se suceden de principio a fin. Inicialmente se describe el laboratorio de bioquímica, su ubicación y campo de actividad, su organigrama y áreas de organización. Se define el mapa de procesos del laboratorio, los procedimientos, los documentos habituales de trabajo, el sistema informático del laboratorio y el material, reactivos, equipos básicos y la prepaeración de disoluciones. En la fase preanalítica o premetrológica (antes de la medición) el objeto es que conozca los sistemas biológicos, los especímenes, las magnitudes y unidades con las que va a trabajar, el catálogo de pruebas del laboratorio, la petición de analítica, las condiciones previas a la toma de las muestras y los diferentes tipos de muestras que procesa el laboratorio, su transporte, estabilidad y conservación. En la fase analítica o metrológica (la medición) el objeto es describir los sistemas, técnicas y métodos analíticos, los reactivos, soluciones de calibración y control, las características analíticas de las pruebas, las alarmas o avisos que puedan surgir en los analizadores, los resultados absurdos que puedan aparecer, las diluciones y comprobaciones de resultados, así como las pruebas en la cabecera del paciente. En la fase postanalítica o postmetrológica (después de la medición) el objeto es definir y diferenciar lo que es la validación técnica y la validación facultativa de los resultados, la disponibilidad y el informe de resultados, los valores de referencia, los resultados críticos y su comunicación, así como los comentarios interpretativos, la variabilidad y la interpretación de los resultados. Se incluye un capítulo cuyo objeto es aplicar conocimientos relacionados con el control de calidad de los procesos, la certificación y acreditación del laboratorio, el error en el laboratorio, la gestión de incidencias y la seguridad del paciente. Se incluyen conocimientos básicos sobre la gestión y los costes del laboratorio, la gestión de la demanda, los indicadores y la actividad derivada a laboratorios externos de referencia. También se encuentran conocimientos relacionados con los recursos humanos cuyo objeto es conocer las funciones, actividades y competencias del personal, la definición de puestos de trabajo, la organización de grupos de trabajo y la acreditación de competencias profesionales. Finalmente se dedican capítulos aparte para el conocimiento de la protección de datos de carácter personal, la seguridad en el laboratorio, la prevención de riesgos laborales, la gestión de los residuos y un listado de términos y definiciones que faciliten la comprensión del manual.

El campo de aplicación de este manual es el personal Técnico de Laboratorio que va a desempeñar su trabajo sobre todo en un Laboratorio de Bioquímica Clínica, aunque la información que se describe en la mayoría de los capítulos es de interés general para cualquier área del laboratorio clínico.

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Complejo Asistencial de Soria. Laboratorio de Bioquímica Clínica

Capítulo 1. Organización del laboratorio

Introducción 1.1. Ubicación 1.2. Campo de actividad 1.3. Clientes y proveedores 1.4. Política de calidad 1.5. Misión, visión y valores 1.6. Sugerencias y reclamaciones 1.7. Consultoría 1.8. Contactar 1.9. Equipo humano 1.10. Estructura organizativa 1.11. Areas del laboratorio clínico 1.12. Organización y distribución de las áreas del laboratorio 1.13. Personal. Responsabilidades y tareas. Organigrama 1.14. Organización de las actividades 1.15. Relación con los usuarios 1.16. Gestión económica 1.17. Procedimientos de compras 1.18. Gestión de almacenes 1.19. Gestión y control del gasto 1.20. Laboratorios externos de referencia

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Complejo Asistencial de Soria. Laboratorio de Bioquímica Clínica

INTRODUCCIÓN___________________________________________________________________ El término laboratorio clínico designa los lugares donde se realizan las determinaciones analíticas en muestras biológicas humanas cuya finalidad es el diagnóstico, seguimiento o control del tratamiento de las enfermedades, e incluye áreas de bioquímica, hematología, microbiología e inmunología. En este capítulo se presentan las principales características de los laboratorios clínicos, en cuanto a su organización, su estructura, el personal que trabaja en ellos y la gestión económica. En la caracterización o identificación del laboratorio se pretende contestar a las siguientes preguntas: ¿Dónde está ubicado el laboratorio?. ¿Qué hace?. ¿Cuál es su campo de actividad, sus clientes y proveedores?. ¿Cuál es su política de calidad: misión, visión y valores?. ¿Cómo contactar, reclamar, hacer sugerencias o consultar?. ¿Cómo está organizado el laboratorio?. ¿Cómo es su gestión?.

1.1. UBICACIÓN___________________________________________________________________ El Laboratorio de Bioquímica Clínica del Complejo Asistencial de Soria está ubicado en la planta 1 del Hospital Santa Bárbara.

1.2. CAMPO DE ACTIVIDAD___________________________________________________________________ La actividad asistencial del Laboratorio de Bioquímica Clínica consiste en la elaboración de informes de laboratorio clínico y otras informaciones bioquímico-clínicas que faciliten la prevención, diagnóstico, estadiaje, pronóstico, seguimiento, monitorización y control del tratamiento de enfermedades. El laboratorio dispone de un catálogo de prestaciones en el que se describen las magnitudes bioquímicas que determina, su clasificación bioquímico-fisiológica, indicaciones e interpretación, el tipo de muestra necesario, el acceso, formulario de petición, perfiles y protocolos, así como el carácter ordinario o urgente de la determinación y la demora en la entrega de resultados. El laboratorio puede modificar, ampliando o restringiendo, las pruebas bioquímicas de las peticiones de acuerdo con los protocolos de actuación establecidos. Así mismo estudiará, a propuesta de sus clientes, la posibilidad de ampliar su catálogo de prestaciones. El área de salud a la que dá cobertura es la totalidad de la provincia de Soria.

1.3. CLIENTES Y PROVEEDORES_________________________________________________________ Identificación de los clientes del Servicio: ¿para quién trabaja el Servicio?. El cliente es la persona que recibe un producto o servicio (elementos de salida). Es el destinatario de un producto proporcionado por un proveedor. El Laboratorio de Bioquímica Clínica se debe diseñar para satisfacer las necesidades de los pacientes (clientes externos) y de todo el personal clínico facultativo (cliente interno o usuario) responsable de la asistencia sanitaria, así como de entidades que requieran sus servicios. Identificación de los proveedores del Servicio: ¿quién trabaja para el Servicio?. El proveedor es el que proporciona los elementos de entrada (un producto o un servicio) de un proceso. En el caso del Laboratorio de Bioquímica los proveedores son las empresas suministradoras de materiales, reactivos y equipos analíticos.

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1.4. POLÍTICA DE CALIDAD____________________________________________________________ El Laboratorio de Bioquímica garantiza la calidad de los informes de resultados mediante la aplicación de una estricta política de calidad que afecta tanto a la estructura organizativa como a los procesos, los procedimientos y los recursos. El laboratorio se compromete a satisfacer las necesidades de sus clientes y para ello aplica los siguientes criterios de calidad: •

Los procedimientos de trabajo se han seleccionado teniendo en cuenta las recomendaciones publicadas por las organizaciones científicas nacionales e internacionales. Los requisitos metrológicos de los procedimientos de medida están establecidos según las recomendaciones científicas nacionales e internacionales. El plazo de entrega de los resultados del laboratorio está establecido teniendo en cuenta las necesidades de los clientes. Las actividades relacionadas con la garantía de la calidad de los resultados se realizan según las recomendaciones de las organizaciones científicas nacionales e internacionales. El Laboratorio de Bioquímica Clínica dispone de un sistema de gestión de la calidad conforme con la Norma UNE-EN ISO 9001:2008 para laboratorios clínicos y ha obtenido la certificación ISO 9001:2008 (núm. ES-1571/2007).

• • • •

Enfoque al cliente. La dirección del laboratorio se fija como objetivo la calidad de sus servicios y el aumento del grado de satisfacción de sus clientes, y por ello creará los mecanismos necesarios para prevenir problemas, corregir defectos, obtener mejoras constantes y establecerá anualmente unos objetivos de calidad para toda la organización.

1.5. MISIÓN, VISIÓN Y VALORES_______________________________________________________ La Misión (a qué nos dedicamos) del LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA es la determinación de resultados de magnitudes biológicas en especimenes biológicos con el fin de contribuir a la prevención, diagnóstico, estadiaje, pronóstico, seguimiento, monitorización, tratamiento y conocimiento de las enfermedades . La Visión (en qué nos queremos convertir) del LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA es llegar a ser un laboratorio de referencia en nuestra comunidad de Castilla y León en cuanto a la calidad y al servicio ofrecido a nuestros clientes (facultativos, pacientes y entidades). Nuestros Valores (qué es lo importante para nosotros) son: • • • • • • • • •

El compromiso de cumplir todos los requisitos de nuestros clientes y de la legislación aplicable. La implantación de la mejora continua para conseguir la eficacia del sistema de gestión de la calidad. La formación, la sensibilización y motivación de nuestro personal. La optimización de los recursos tecnológicos para garantizar la calidad de los resultados. La adecuación de las prestaciones del laboratorio según los avances científicos y clínicos. La elaboración de protocolos y guías de uso clínico que optimicen el uso racional del laboratorio. La promoción de las iniciativas de innovación y mejora propuestas por el personal. El trabajo en un entorno seguro y agradable para las personas y con respeto al medio ambiente. El cumplimiento de las normas éticas de nuestra profesión.

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• •

La incorporación de nuevas tecnologías. La seguridad del paciente

1.6. SUGERENCIAS Y RECLAMACIONES___________________________________________________ Las sugerencias y reclamaciones serán atendidas en primera instancia por el personal del área administrativa que, si fuera preciso, pondrán al solicitante en contacto con el facultativo encargado correspondiente. El Laboratorio de Bioquímica Clínica tiene a disposición de sus clientes un número de teléfono para reclamaciones.

1.7. CONSULTORÍA_________________________________________________________________ El Laboratorio pondrá a disposición de los facultativos clínicos la información necesaria para facilitar la consultoría, telefónica o vía correo electrónico, de los solicitantes con los facultativos responsables de las diferentes áreas analíticas del laboratorio. Esto se hará mediante la creación y difusión de un documento en el que figure: • • • •

Área analítica del laboratorio Nombre del facultativo responsable del área Teléfono de contacto Dirección de correo electrónico

También se podrá consultar información a través de la weblab y de documentación depositada en otros formatos electrónicos como la petición electrónica o la historia clínica electrónica.

1.8. CONTACTAR___________________________________________________________________ Dirección de correo Laboratorio de Análisis Clínicos-Bioquímica Complejo Asistencial de Soria Hospital Santa Bárbara Paseo de Santa Bárbara s/n 42005. Soria Directorio telefónico: Centralita Extensiones: (laboratorio, toma de muestras, secretaría) Móvil facultativo de guardia laboratorio Número de Fax

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1.9. EQUIPO HUMANO______________________________________________________________ El equipo humano del Servicio de Análisis Clínicos estará compuesto por profesionales que tendrán definidas sus funciones y actividades y asignadas sus correspondientes tareas con la distribución de grupos de trabajo y diferentes turnos de mañana, tarde y noche. El equipo estará compuesto por: -

Dirección clínica-Jefe del Laboratorio Facultativos especialistas Supervisora área de enfermería Personal de enfermería Técnicos de laboratorio Auxiliares de Enfermería Personal administrativo

Entre el personal facultativo se designará el Coordinador de Calidad y el Resposable de Preanalítica. La supervisora del laboratorio será la Coordinadora de Toma de Muestras.

1.10. ESTRUCTURA ORGANIZATIVA_________________________________________________________ Los laboratorios clínicos se encuentran en centros asistenciales, como los hospitales, o externos para la atención de los pacientes ambulatorios. No existe un solo patrón de organización para los laboratorios clínicos y su estructura depende fundamentalmente del tamaño y de si son hospitalarios o externos. Las tendencias actuales sobre los laboratorios clínicos se dirigen hacia laboratorios grandes con una capacidad elevada de procesamiento de especímenes y una gran diversidad de determinaciones analíticas. En estos laboratorios son menores los costes por prueba y es posible una organización mejor, con tiempos de respuesta más cortos. Tradicionalmente, los laboratorios clínicos se han organizado, bien en su conjunto, bien en sus diferentes áreas, de acuerdo con dos planteamientos distintos: tomando como base los procedimientos o las exploraciones funcionales. La automatización cada vez mayor de estos laboratorios ha llevado a organizarlos en áreas fundamentalmente instrumentales, de forma que los especímenes se repartan en el menor número posible de alícuotas para las determinaciones solicitadas. Los laboratorios clínicos siguen dos diseños estructurales básicos: el modular y el abierto. Un laboratorio modular resalta los departamentos con salas separadas para cada uno de ellos. En cambio, en un diseño de laboratorio abierto, muchos de los departamentos están unidos, sin separaciones. Los avances tecnológicos han hecho que puedan realizarse, en un mismo sistema analítico, muchas determinaciones diferentes con técnicas distintas, o que puedan conectarse dos o más sistemas analíticos, de forma que compartan los tubos de los especímenes, creándose lo que se ha llamado islas de automatización o células de trabajo (work cells). Con estos diseños, se intenta concentrar aún más los sistemas automáticos. Las últimas tendencias de los laboratorios clínicos son los laboratorios centrales o nucleares (core). Son laboratorios muy automatizados y mecanizados, en los que se realiza la mayoría de las pruebas analíticas habituales de mayor demanda. Junto a este laboratorio central se organizan pequeños laboratorios, más o menos independientes, para las pruebas de menor volumen o la atención de áreas específicas. Los laboratorios centrales permiten reducir el número de tubos y simplificar su tráfico por los sistemas de análisis. Además, este tipo de laboratorios facilita la conexión al sistema informático e integra más fácilmente las fases preanalítica y postanalítica. En los hospitales debe existir, además, un laboratorio que garantice la asistencia las 24 h del día. Este es el denominado laboratorio de urgencias o de atención continuada. Los avances en las técnicas y la

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instrumentación han permitido que se realicen en estos laboratorios en el momento actual una amplia variedad de pruebas. Un área fundamental en todos los laboratorios clínicos es el área administrativa. Esta debe estar situada a la entrada del laboratorio clínico para facilitar la comunicación con las personas ajenas al laboratorio clínico que consultan con él. Asimismo, debe estar cerca de las áreas de trabajo, aunque fuera de ellas. Es también importante que el área administrativa se encuentre cerca del área de recepción de muestra, ya que de aquí ha de recibir los impresos de petición de análisis.

1.11. AREAS DEL LABORATORIO CLÍNICO____________________________________________________ Los laboratorios clínicos realizan determinaciones de bioquímica, hematología, microbiología e inmunología, de forma que estas son las cuatro áreas principales de un laboratorio clínico. Estas áreas pueden estar agrupadas bajo una dirección única o estar separadas en servicios independientes, cada uno de ellos dirigido por una persona distinta. BIOQUÍMICA CLÍNICA Las principales áreas o secciones instrumentales suelen ser las de bioquímica automatizada, inmunoanálisis automatizado, proteínas, orina, técnicas manuales y técnicas moleculares. - Área de bioquímica automatizada. En esta área se agrupan los analizadores automáticos para la bioquímica. En el mercado hay una gran variedad de aparatos, con una capacidad de procesado de especímenes muy grande. La dotación de analizadores automáticos para esta sección depende fundamentalmente del número de especímenes que se procese. Asimismo, la conexión entre los analizadores para formar las células de trabajo dependerá del número de estos sistemas. - Área de inmunoanálisis automatizado. Esta área agrupa los analizadores que emplean las técnicas de inmunoanálisis. La dotación instrumental para inmunoanálisis depende básicamente de la carga de trabajo. En la actualidad, se comercializan analizadores automáticos para inmunoanálisis con una gran capacidad de trabajo. Las áreas de bioquímica automatizada e inmunoanálisis automatizados se encuentran unidas en los laboratorios de bioquímica clínica con grandes cargas de trabajo. - Área de proteínas. En ella se determinan las proteínas específicas, habitualmente mediante nefelómetros automáticos. Asimismo, aquí se realizan las separaciones de proteínas mediante electroforesis y otras separaciones electroforéticas, como las de ísoenzimas. - Área de orinas. En esta área se llevan a cabo los análisis sistemáticos que constan de dos partes: las determinaciones fisicoquímicas y el examen microscópico del sedimento urinario. Las primeras se realizan mediante la tecnología de la química seca. Pueden emplearse lectores o analizadores automáticos. El segundo suele hacerse de forma manual por observación microscópica, aunque ya se dispone de analizadores automáticos para efectuarlo. - Área de técnicas manuales. Concentra todas las técnicas sin automatizar, además de cromatógrafos líquidos, espectrómetros de absorción atómica, etc. - Área de técnicas moleculares. Aquí se encuentran los aparatos y analizadores necesarios para las pruebas moleculares.

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HEMATOLOGÍA Las principales áreas o secciones instrumentales referentes a la hematología son las de recuento/morfología, coagulación, citometría de flujo, citogenética, técnicas moleculares y técnicas especiales. - Área de recuento/morfología. En ella están los analizadores hematológicos mediante los que se efectúan los recuentos celulares sanguíneos de eritrocitos, leucocitos y plaquetas, así como la fórmula leucocitaria. En esta área deben instalarse los sistemas de realización automática de extensiones y los microscopios para observar la morfología de las células sanguíneas. En la actualidad, en el mercado hay muchos analizadores hematológicos, desde los modelos sencillos hasta los más complejos que obtienen un número elevado de parámetros. - Área de coagulación. Realiza todas las pruebas de valoración de la hemostasia. Está dotada de analizadores automáticos de coagulación, cuyos números y capacidades dependen del número de especímenes que se procese diariamente. - Área de citometría de flujo. Esta técnica se ha convertido en los últimos años en una herramienta fundamental en los estudios de las alteraciones leucocitarias y de inmunofenotipado celular. El número y tipo de citómetros de flujo dependerá del volumen de trabajo del laboratorio. - Área de citogenética. Agrupa la instrumentación para las técnicas y métodos citogenéticos que estudian los cromosomas y tratan de detectar sus alteraciones y correlacionarlas con las enfermedades. - Área de técnicas moleculares. Como en el laboratorio de bioquímica clínica, en esta sección se agrupan los equipos para los estudios que empleen los métodos moleculares. - Área de técnicas especiales. En ella se llevan a cabo determinaciones relacionadas con las alteraciones erítrocitarias, como las pruebas de fragilidad osmótica, de autohemólisis y de deficiencias enzimáticas, y los estudios de hemoglobinas anormales. También los estudios con técnicas citoquímicas.

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Las áreas o secciones principales relativas a la microbiología son las de bacteriología, micobacterias, micología, parasitología, virología, serología y microbiología molecular. - Área de bacteriología. En ella se realiza la identificación de las bacterias empleando la observación directa, el cultivo y las pruebas bioquímicas. Esta área se encuentra cada vez más automatizada, existiendo en el mercado diversos modelos de analizadores automáticos para microbiología. - Área de micobacterias. Esta área se dedica principalmente a la detección del complejo Mycobacterium tuberculosis que produce la tuberculosis humana. También identifica otras micobacterias no tuberculosas. - Área de micología. Dedicada al estudio e identificación de los hongos que causan enfermedades humanas. - Área de parasitología. Aquí se estudian los parásitos, principalmente los protozoos, helmintos y artrópodos que causan enfermedades al hombre. - Área de virología. En esta área se detectan y analizan los virus que producen enfermedades humanas.

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- Área de serología. Aquí se realizan las denominadas pruebas serológicas, que son aquellas determinaciones de antígenos o anticuerpos realizadas en suero, empleando técnicas inmunológicas. - Área de microbiología molecular. Esta área está dedicada a la aplicación de los métodos de la biología molecular para la detección e identificación de los microorganismos patógenos. Los laboratorios de microbiología clínica deben disponer además de un área de toma de muestras, un área de limpieza de material y esterilización y un área de preparación de medios.

INMUNOLOGÍA CLÍNICA En este caso, las áreas principales son las dedicadas a los HLA (Human Leukocyte Antigens; antígenos leucocitarios humanos), la autoinmunidad y la inmunología celular. - Área de HLA. Esta área está dedicada al análisis y tipificación de los antígenos HLA, tanto para los trasplantes como para los estudios de asociación de estos antígenos con las enfermedades. - Área de autoinmunidad. Dedicada al análisis de autoanticuerpos para el diagnóstico y seguimiento de las enfermedades autoinmunitarias. Utiliza fundamentalmente técnicas de inmunofluorescencia indirecta, inmunotransferencia e inmunoanálisis. - Área de inmunología celular. Área dedicada al estudio de las células del sistema inmunológíco en relación con las enfermedades. Como en los otros laboratorios, las pruebas que hay que realizar y la instrumentación dependen fundamentalmente del número de determinaciones que se soliciten. También en este sector es un objetivo importante automatizar al máximo las determinaciones.

1.12. ORGANIZACIÓN Y DISTRIBUCIÓN DE LAS ÁREAS DEL LABORATORIO__________________________ Las áreas de organización las clasificaremos en tres tipos:

Por especialidad Estructurales y de distribución Funcionales

POR ESPECIALIDAD: Aquí encontraremos, por una parte el Laboratorio de Rutina o General del que se desglosan sus diferentes áreas primarias, el Laboratorio de Bioquímica y el Laboratorio de Microbiología, diferenciados por sus características de funcionamiento, y las áreas de gestión de muestras y la administrativa, y por otra parte encontramos el Laboratorio de Urgencias. Cada uno de ellos se desglosa en las correspondientes áreas analíticas o de gestión de muestras y documentación. En el caso del Laboratorio de Urgencias se aprecia el componente Bioquímico y Microbiológico así como las pruebas a la cabecera del paciente (POCT) de control remoto por parte del laboratorio de Bioquímica.

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Laboratorio de Análisis Clínicos

Laboratorio de Urgencias

Laboratorio de Rutina

Laboratorio de Bioquímica Área de Bioquímica General Área de Orinas y Líquidos Biológicos Área de Proteínas Específicas

Laboratorio de Microbiología

Gestión de Muestras

Área Administrativa

Área de Bacteriología general

Toma de muestras

Gestión de peticiones y resultados

Área de Micobacterias

Área de Inmunidad y Alergia

Área de Hongos

Área de HormonasFertilidad

Área de Serología

Área de Oncobiología

Recepción y clasificación de muestras

Urgencias Bioquímica

Urgencias Microbiología

POCT Point Of Care Test

Preparación y acondicionamiento de muestras

Almacenamiento y archivo de muestras Área de Biología Molecular

Área de Metabolismo y Vitaminas Área de Cribado Prenatal Área de Fármacos y Toxicología

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AREAS ESTRUCTURALES Y DE DISTRIBUCIÓN: Comprende las áreas comunes a ambos laboratorios y las áreas específicas de trabajo de cada laboratorio desde el punto de vista de la distribución del espacio.

AREAS ESTRUCTURALES Y DE DISTRIBUCIÓN ÁREAS COMUNES Sala de espera de pacientes Sala de extracciones - Toma de muestras Sala de pruebas especiales - recuperación Recepción y clasificación de muestras Preparación y acondicionamiento de muestras Archivo de muestras - seroteca Almacén – cámara fría Lavadero y estación de tratamiento de agua Aseos Ducha de seguridad Vertedero – área sucia Secretaría - Archivo Despacho director-jefe del laboratorio Despacho facultativos especialistas Despacho enfermera supervisora Sala de reuniones Sala de estar del personal Aula docente ÁREAS ESPECÍFICAS DE LABORATORIOS LABORATORIO DE BIOQUÍMICA Core Lab - Sistemas modulares analíticos

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Laboratorio de Microbiología - Cultivos

Urianálisis

Área de Micobacterias – Seg. biológica

Laboratorio de proteínas específicas Laboratorio de inmuno-alergia

Área de Parasitología Área de Micología

Laboratorio de técnicas especiales

Área de microsopia

Area de microscopía Laboratorio de urgencias

Laboratorio de Serología Laboratorio de Biología Molecular

POCT (Point of Care Testing – Control remoto)

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AREAS FUNCIONALES: Comprende las diferentes áreas de funcionamiento de los laboratorios desde el punto de vista de la clasificación organizativa de los procesos y las especialidades: preanalítica, analíticas específicas, postanalítica y control de calidad.

ÁREAS FUNCIONALES LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Preanalítica - muestras

Preanalítica – Recepción de muestras - toma de muestras

Bioquímica general sangre

Consulta

Bioquímica general orina

Cultivos - Hemocultivos

Urianalisis y sedimento urinario

Esterilización, preparación de medios de cultivos y autoclave

Proteínas específicas

Lavado de material

Autoinmunidad

Almacén

Alergia

Bacteriología

Hormonas

Micobacterias

Marcadores tumorales

Microscopía de fluorescencia

Marcadores óseos

Parásitos

Metabolismo y vitaminas

Hongos

Fármacos y toxicología

Serología infecciosa

Cribado prenatal

Biología Molecular - PCR

Fertilidad

Postanalítica

Líquidos biológicos-heces

Control de calidad

Inseminación artificial Pruebas dinámicas Marcadores cardiacos Equilibrio ácido-base-gasometría-oximetría Postanalítica Control de calidad

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1.13. PERSONAL Y ORGANIGRAMA__________________________________________________________ Un personal competente es esencial para el buen funcionamiento del laboratorio clínico y para proporcionar resultados de calidad. Todas las personas que trabajan en el laboratorio deben estar cualificadas, tener experiencia y estar motivadas. El personal que trabaja en los laboratorios clínicos se divide en facultativo, técnico y administrativo. El número de personas de cada grupo, sus títulos y las descripciones de los trabajos varían de acuerdo con el tamaño del laboratorio y la amplitud de los servicios que proporcione. En todo caso, es de suma importancia que la plantilla esté equilibrada para que no haya tensiones laborales entre sus miembros. PERSONAL FACULTATIVO Está compuesto por titulados superiores (médicos, farmacéuticos, químicos, biólogos y bioquímicos), que participan en la actividad diaria de la atención al paciente proporcionando e interpretando la información del laboratorio para ayudar a resolver los problemas diagnósticos y el seguimiento de los tratamientos. El personal facultativo está jerarquizado; su estructura más común en los laboratorios clínicos es: jefe de servicio, jefe de sección y adjunto o facultativo especialista de área (FEA). - Jefe de servicio. Dirige el laboratorio y es el encargado de su organización. Asimismo, se comunica con la gerencia, la dirección médica y la dirección administrativa del hospital. La tarea principal del director del laboratorio es integrar, coordinar y gestionar sus recursos, como el personal, la instrumentación, el espacio y el presupuesto. - Jefes de sección. Se ocupan de organizar y dirigir cada una de las secciones en que esté estructurado el laboratorio. Los jefes de sección reciben del jefe de servicio las instrucciones básicas y los objetivos que se piden a su sección. - Facultativos especialistas. Se encargan de realizar el trabajo en cada sección. Dirigen el trabajo del personal técnico y se ocupan de adecuar las prestaciones analíticas de los métodos, de poner a punto nuevos métodos, de que los médicos entiendan la relevancia de los resultados de las pruebas y de que se use apropiadamente la información generada por el laboratorio. PERSONAL TÉCNICO Los profesionales encargados de la realización práctica de las pruebas de laboratorio son los técnicos especialistas de laboratorio (TEL). Están capacitados para recoger, procesar y almacenar la sangre y los especímenes de los pacientes, realizar las pruebas del laboratorio clínico, reconocer un problema, identificar las causas directas (técnicas, instrumentales o fisiológicas), realizar las correcciones utilizando las estrategias prefijadas, utilizar y comprobar los procedimientos de control de la calidad y seguir las precauciones de seguridad adecuadas. El técnico conoce técnicas e instrumentos específicos y es capaz de reconocer los factores que afectan directamente a los procedimientos y los resultados. También analiza los programas de control de la calidad, dentro de parámetros predeterminados. El personal técnico está a las órdenes de un supervisor, que controla el funcionamiento diario del laboratorio. Dicho supervisor se ocupa de gestionar el trabajo del personal. Para ello debe distribuir el trabajo de cada uno, en función de la carga, y asignar los tiempos. Asimismo, se encarga de gestionar los almacenes y la instrumentación. PERSONAL ADMINISTRATIVO Sus miembros atienden el manejo de los datos que genera el laboratorio clínico. En la actualidad, este trabajo se realiza a través del sistema informático de gestión del laboratorio. Los administrativos introducen las peticiones analíticas y los datos de los impresos de solicitud, elaboran las hojas de trabajo, editan los informes y se encargan, asimismo, de la estadística del laboratorio. Atienden también las consultas y reclamaciones que se realicen al laboratorio clínico

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RESPONSABILIDADES Y TAREAS Facultativo de laboratorio: - Colabora con la confección, planificación y evaluación de los objetivos anuales. - Evalúa el funcionamiento de la unidad. - Informa a su inmediato superior del funcionamiento de la unidad. - Impulsa la creación de protocolos y normas, que permiten el adecuado funcionamiento de la Unidad. - Contactos con los distintos laboratorios comerciales. - Acude a todas las reuniones que por razón de su cargo está obligado. - Convoca reuniones periódicas con el personal de su unidad. - Comunicación y coordinación con todos los Centros del Área de Salud. - Controla que se realizan todas las actividades relativas al mantenimiento, tanto preventivo como correctivo de los equipos. - Controla y supervisa el trabajo del personal de enfermería y técnicos. - Participa en la atención continuada prestada por el laboratorio. - Gestiona la implantación de nuevas técnicas y equipos. - Realiza la validación facultativa-clínica de los resultados analíticos. - Ofrece información a los facultativos solicitantes y responde a consultas técnicas. - Realiza la redacción y el seguimiento de los procedimientos normalizados de trabajo. - Realiza actividad docente mediante la formación del personal del laboratorio, del hospital y de otros colectivos. - Interviene en la labor investigadora del laboratorio. - Cumple en todo momento la normativa de seguridad del laboratorio. - Respeta la confidencialidad de toda la información recibida y generada en el laboratorio. - Colabora en la implantación y seguimiento del sistema de gestión de calidad implantado. - Realiza actividades de formación continuada. - Validación de los controles de calidad analíticos. - Supervisa, implementa y mejora la adecuación del sistema informático del laboratorio. Técnicos y personal de enfermería de Laboratorio: - Toma de muestras (enfermería). - Identificación de peticiones y de muestras - Manejo de los aparatos correspondientes a los distintos grupos de trabajo. - Puesta en marcha y parada de los analizadores - Preparación de reactivos, soluciones de calibración y de control - Carga de material fungible a los equipos - Calibración de los equipos - Controles de calidad de los equipos - Manipulación de las muestras - Alicuotación de muestras - Acondicionamiento de muestras para laboratorios externos de referencia - Procesado de las muestras en los analizadores - Diluciones, repeticiones y comprobaciones de resultados cuando existan valores fuera del rango normal o cualquier tipo de alarma. - Realización de técnicas manuales - Obtención de resultados de las técnicas analíticas que realiza bajo la dirección y supervisión facultativa. - Validación técnica de los resultados. - Conservación de las muestras - Mantenimiento y limpieza de equipos la buena conservación de los mismos. - Colabora con facultativo responsable de su grupo de trabajo - Manejo del sistema informático del Laboratorio .Introducción de peticiones y resultados en el Laboratorio

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de Urgencias. Manejo del Sistema Informático de Gestión de Muestras (PSM) Gestiona los reactivos de sus técnicas analíticas y comunica a la Supervisora las necesidades existentes. Colaboración en el manejo de nuevas técnicas. Colaboración en docencia. Pone en conocimiento de sus superiores cualquier anomalía o deficiencia que observe en el desarrollo de la existencia en la dotación del Servicio. Colabora en la implantación de los requisitos del sistema de gestión de calidad (registros de incidencias, mantenimiento, lotes, controles de calidad, etc). Cumple en todo momento la normativa de seguridad del laboratorio. Respeta la confidencialidad de toda la información recibida y generada en el laboratorio.

Auxiliar de enfermería (en laboratorios donde exista este personal) - Transporte de muestras al laboratorio desde consultas externas - Identificación de las muestras - Recepción de muestras - Codificación de contenedores de muestras y formularios de petición de consultas y plantas - Recepción de contenedores de muestras de centros periféricos - Comprobar correspondencia de formulario de petición y muestras recibidas - Centrifugación de las muestras - Clasificación y distribución de las muestras - Acondicionar las muestras de orina - Medición de los volúmenes de orina - Administración de aditivos y conservantes - Limpieza y reposición de laboratorios, almacenes y frigoríficos - Colocación del almacén general y colaboración en la recogida de los reactivos. - Archivo y conservación de muestras - Eliminación de muestras - Colabora con personal de enfermería en la gestión de peticiones y muestras - Colabora con personal de enfermería en la recepción de material y reactivos - Eliminar y reponer ropa - Manejo del Sistema Informático de Gestión de Muestras (PSM) - Anotación diaria de temperaturas de frigoríficos y congeladores - Registros de incidencias observadas - Colabora en la implantación de los requisitos del sistema de gestión de calidad (registros de incidencias, mantenimiento, lotes, temperaturas, etc). - Cumple en todo momento la normativa de seguridad del laboratorio. - Respeta la confidencialidad de toda la información recibida y generada en el laboratorio. Administrativo: - Atención telefónica, fax, correo electrónico, correspondencia, escritos, ..... - Realiza la entrada de datos de los formularios de petición al sistema informático. - Impresión de listas de trabajo. - Registro de resultados en el sistema informático. - Registrar las incidencias relacionadas con los formularios de petición. - Envío de los informes de resultados. - Gestión de preinformes, copias de informes y reclamaciones de resultados. - Archivo de los documentos y registros. - Colabora en la implantación de los requisitos del sistema de gestión de calidad. - Cumple en todo momento la normativa de seguridad del laboratorio. - Respeta la confidencialidad de toda la información recibida y generada en el laboratorio.

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ORGANIGRAMA Organización jerárquica del laboratorio. Incluye la interrelación entre las diferentes categorías profesionales del equipo humano del laboratorio, su relación con la dirección del laboratorio, la del centro y la gerencia, así como la de los puestos de coordinador de calidad, responsable de preanalítica y coordinadora de toma de muestras. Gerencia Integrada de Soria

Subdirección Médica Servicios Centrales

Dirección de Enfermería

Dirección de Gestión

Jefe del Laboratorio Supervisora del Laboratorio

Coordinador de Calidad Responsable de Preanalítica

(coordinadora toma de muestras)

Facultativos Especialistas

Diplomadas Enfermería

Auxiliares administrativos

Técnicos de Laboratorio Auxiliares de Enfermería

1.14. ORGANIZACIÓN DE LAS ACTIVIDADES_____________________________________________________ Las actividades de los laboratorios clínicos pueden dividirse en tres fases: preanalítica analítica postanalítica La fase preanalítíca abarca desde la solicitud de las pruebas hasta la realización del análisis. Incluye las fases de obtención de los especímenes, su transporte, procesamiento y distribución al lugar de análisis. La fase analítica comprende todas las etapas de la determinación analítica. La fase postanalítica incluye la validación clínica del resultado y la emisión del informe. En la figura siguiente se muestra la ruta desde el paciente al laboratorio clínico y la comunicación de los resultados al médico.

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GRUPOS Y PUESTOS DE TRABAJO El director del laboratorio organizará los grupos y puestos de trabajo necesarios siguiendo criterios de equidad en el reparto de las cargas de trabajo, según las funciones-actividades que correspondan al personal y sus responsabilidades y tareas. ENVÍO DE LOS ESPECÍMENES Los laboratorios clínicos hospitalarios procesan especímenes de dos procedencias básicas: pacientes hospitalizados y pacientes ambulatorios. En los pacientes hospitalizados, los especímenes extraídos se envían al laboratorio clínico por tubo neumático o en carritos de extracción. En los pacientes ambulatorios, los especímenes suelen extraerse en los centros periféricos, desde donde se envían al laboratorio hospitalario o al laboratorio externo en los contenedores adecuados. Cada laboratorio organiza el sistema de recogida de los centros periféricos, de acuerdo con el número de centros que atienda y la distancia a que estén. En cualquier caso, los traslados deben realizarse en las condiciones precisas para que no afecten de manera adversa a los especímenes y los movimientos se produzcan de la forma más fluida posible. IDENTIFICACIÓN DE LOS ESPECÍMENES La identificación de los especímenes es un proceso muy importante, una actividad humana que depende de la fiabilidad del personal que los obtiene o recoge. Como no es posible marcar el propio espécimen, el identificador o marca debe ir en su contenedor. Los procedimientos más utilizados para identificar los especímenes son las etiquetas marcadas de forma manual y las etiquetas con código de barras.

- Método manual Es un método de identificación que ya casi no se utiliza en los laboratorios clínicos. En los recipientes que contienen los especímenes se pega una etiqueta donde se escribe el nombre del paciente y una clave de acceso al laboratorio, que se incorpora al mismo tiempo al impreso de petición. La clave de acceso se usa en todos los

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procesos analíticos que se realicen con el espécimen, e identifica en todo momento al paciente. El método manual de identificación de los especímenes tiene muchos inconvenientes; entre los más importantes están los que se derivan de las transcripciones. -Etiquetas con código de barras En la actualidad, el uso de estas etiquetas es el método mejor para identificar los especímenes. La etiqueta de código de barras la pueden leer el sistema informático del laboratorio y los analizadores automáticos, de modo que se conecta directamente el recipiente que contiene el espécimen con el sistema de procesado de datos y con los sistemas analíticos, y no hacen falta las transcripciones. RECEPCIÓN, PROCESAMIENTO Y DISTRIBUCIÓN DE LOS ESPECÍMENES El área de recepción, procesamiento y distribución de los especímenes es de gran importancia en los laboratorios clínicos, por lo que su organización y funcionamiento deben realizarse de forma adecuada. -Recepción La recepción debe estar situada cerca de la entrada del laboratorio y disponer de amplias mesetas para la recogida y manipulación de los especímenes. En la zona de recepción se depositan los contenedores donde se han transportado los especímenes y los correspondientes impresos de petición. Se sacan los especímenes que se colocan en gradillas, se comprueba que coinciden los especímenes con las peticiones y se señala cualquier incidencia. Los impresos de petición se llevan al área administrativa, donde se introducen las peticiones en el sistema informático del laboratorio. -Procesamiento Los especímenes se trasladan desde la zona de recepción hasta las centrífugas para separar el suero o el plasma (en los especímenes de sangre) o los sobrenadantes de otros líquidos biológicos, y aquí se realiza el proceso de fraccionamiento en alícuotas, de acuerdo con las determinaciones solicitadas. Debe disponerse de centrífugas de gran capacidad y de centrífugas refrigeradas. El número de estas máquinas dependerá del número de especímenes que se procesen, pero hay que señalar que son instrumentos fundamentales para el funcionamiento de los laboratorios clínicos, por lo que debe haber la cantidad suficiente para garantizar en todo momento su función. Los tubos que contengan sangre u otros líquidos biológicos, potencialmente infecciosos, deben centrifugarse siempre tapados para impedir la formación de aerosoles, ya que estos conllevan el riesgo de transmitir enfermedades infecciosas. -Manipulación y distribución El proceso de distribución de los especímenes debe estar muy bien organizado, pues de otra manera puede requerir mucho personal y ser origen de gran número de errores. Un aspecto importante del procesamiento de los especímenes es su manipulación, que incluye la separación de los tapones de los tubos y el alicuotado para las secciones del laboratorio. En todo momento, la manipulación de los tubos y los tapones ha de hacerse obligatoriamente con guantes de goma. Cuando el alicuotado y la distribución de los especímenes se realicen de forma manual, será fundamental hacerlo con gran cuidado, pues pueden cometerse errores e intercambiar especímenes o mezclarlos. Es muy importante identificar bien los contenedores secundarios y usar pipetas desechables, una por cada paciente o espécimen. ASOCIACIONES -Asociación entre los especímenes extraídos a un paciente y su identificación Generalmente, se lleva a cabo en el momento de la extracción, bien en la cabecera del enfermo si está hospitalizado, bien en la sala de extracciones si el paciente es ambulatorio. Por su parte, el proceso que asocia el espécimen y los resultados tiene lugar en el laboratorio. Las determinaciones que requieren extraer el espécimen del tubo original, como el plasma o el suero, y llevarlo a otros contenedores producen identificaciones secundarias que deben llevar la misma información que la original. En la actualidad, la mayoría de los

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analizadores automáticos pueden aspirar el espécimen del tubo original de extracción (tubo primario), por lo que no hace falta sacar el espécimen del contenedor original ni generar identificaciones secundarias en otros recipientes. Los tubos de vacío para suero contienen un gel de silicona que, cuando se centrifuga, establece una barrera entre las células y el suero, de forma que no es necesario separar este. Para no manipular los tubos de extracción, se obtienen sendos tubos de contenido menor para los analizadores automáticos, y se les marca con su etiqueta de código de barras. También es posible utilizar un solo tubo para varios analizadores. -Asociación de los pacientes con los resultados Esta asociación implica muchas posibilidades de error, sobre todo cuando se utilizan sistemas de identificación manual en los contenedores. Los errores más graves se producen cuando se coloca incorrectamente el espécimen respecto a la lista de trabajo, y cuando se alteran o trasponen números en los resultados o los especímenes. El uso del código de barras, que conecta directamente el espécimen con los resultados, evita estos errores. ALMACENAMIENTO Cuando no se vayan a procesar los especímenes inmediatamente, deben almacenarse en un refrigerador o un congelador, según el tiempo que hayan de conservarse y las determinaciones solicitadas. Es importante que el laboratorio disponga de un banco de especímenes congelados en el que almacenar una alícuota de los especímenes, de forma que puedan realizarse repeticiones o determinaciones de magnitudes adicionales. Cuando haya un banco de especímenes congelados, debe llevarse un catálogo en el que se señalen las determinaciones analíticas que pueden realizarse de acuerdo con la duración del almacenamiento. HOJAS DE TRABAJO Una vez trasladadas las peticiones que acompañan a los especímenes al área de procesamiento de datos del laboratorio clínico, se preparan las hojas de trabajo para distribuir los especímenes en las áreas o secciones. En ellas se señala la identificación del espécimen, su colocación en la secuencia de trabajo y las determinaciones solicitadas. El personal del área de distribución reparte los especímenes de acuerdo con las hojas de trabajo para cada sección. El uso de etiquetas con código de barras y la conexión directa del ordenador central del laboratorio con los analizadores automáticos han simplificado mucho la realización de las hojas de trabajo y en muchas ocasiones no es necesario elaborarlas. En estos casos, no hay que mantener una secuencia estricta entre los tubos y los especímenes, ya que cuando el analizador automático lee la etiqueta de código de barras pregunta al ordenador central las determinaciones que debe hacer y le comunica los resultados que se obtengan. DISTRIBUCIÓN DE LOS ESPECÍMENES Para cada área analítica del laboratorio, la distribución puede hacerse de diversas formas. En la actualidad, debido a la gran capacidad de procesamiento de los analizadores automáticos, suelen prepararse pocas alícuotas de los especímenes. Cada área instrumental recibe los tubos y las hojas de trabajo correspondientes. El personal del área, de acuerdo con estas hojas, distribuye los especímenes por los distintos analizadores. Varios comités nacionales e internacionales están intentando definir estándares, tanto para los contenedores de los especímenes como para los tubos de extracción de vacío o sus transportadores. Se han establecido especificaciones para los contenedores que se utilizan para las aplicaciones del laboratorio automatizadas, bien como contenedores primarios de extracción o como contenedores secundarios preparados para los sistemas automáticos. Los tamaños aprobados son 13 x 75, 13 x 100, 16 x 75 y 16 x 100 mm. En dichos sistemas se utilizan transportadores capaces de llevar uno o varios contenedores. Estos transportadores deben poder trasladar los cuatro tubos de diferentes dimensiones de forma intercambiable, autocentrar el contenedor y permitir la lectura de los códigos de barras de los tubos. Se ha propuesto utilizar transportadores de chico contenedores, en los que pueda leerse fácilmente los códigos de barras.

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1.15. RELACIÓN CON LOS USUARIOS_____________________________________________________ Los principales medios de relacionarse con los usuarios del laboratorio son los impresos de solicitud de pruebas, los informes de resultados y las consultas al laboratorio clínico. IMPRESOS DE PETICIÓN DE PRUEBAS Los impresos de petición deben contener esta información: • Datos de identificación del paciente (nombre y apellidos, número de la Seguridad Social, número de historia clínica, médico y servicio solicitante, y fecha de la petición). • Características y datos clínicos del paciente (edad, sexo, diagnóstico de presunción y medicación). • Pruebas solicitadas. La estructura, la organización y el diseño de los impresos de petición de pruebas de laboratorio influyen mucho en las peticiones que realizan los médicos. En general, no se aprecia la importancia del impreso de solicitud como vehículo de comunicación entre el laboratorio y los médicos. Asimismo, un impreso bien diseñado puede influir mucho en la utilización de las pruebas y reducir su uso innecesario. Los impresos de petición de pruebas de laboratorio que se emplean son muy variados, y cada laboratorio clínico establece el más adecuado a su organización laboral. De forma simple, los impresos de solicitud pueden clasificarse en dos grandes grupos: - Impresos convencionales. Su modelo más simple es un impreso en blanco donde el médico solicitante escribe las determinaciones que desea que se hagan al paciente. Otros modelos contienen impresas las pruebas más habituales, que suelen agruparse por perfiles diagnósticos o según la estructura instrumental o funcional del laboratorio. El principal inconveniente de estos métodos es que, cuando el laboratorio dispone de un sistema informático, deben teclearse las pruebas manualmente, con el consiguiente riesgo de errores. - Impresos de lectura por máquinas. Los principales son los de código de barras. La ventaja más importante de estos modelos es que la introducción de las peticiones en el sistema informático del laboratorio es muy rápida y carece de errores. En algunos centros se realiza la petición de forma electrónica, en la que el médico solicita directamente las pruebas en la pantalla del ordenador en la consulta o en los controles de las salas de hospitalización, y con conexión en red con el sistema informático del laboratorio. INFORMES DE RESULTADOS Los resultados que proporcionan los laboratorios clínicos pueden ser numéricos o alfabéticos. Los informes de resultados deben ser informativos, claros, bien estructurados y de fácil manejo, y carecer de errores. Los primeros informes normalmente consistían sólo en resultados numéricos que se acompañaban de signos para mostrar los valores patológicos. En la actualidad, además de los valores numéricos contienen diversas ayudas interpretativas, como los valores de referencia, un texto libre o textos codificados. Los informes acumulados presentan los resultados de un paciente obtenidos en días distintos. Son muy útiles para seguir la evolución del mismo. También pueden producirse informes acumulados de diversos tipos, de acuerdo con las necesidades de los médicos solicitantes. Los informes suelen enviarse mediante métodos electrónicos a través de las redes de intranet, extranet o internet. Actualmente, se tiende a que los solicitantes de determinaciones analíticas tengan acceso al archivo histórico del laboratorio (weblab) para poder consultarlo cuando sea necesario. Para ello, debe dotarse de claves de acceso, de forma que sólo pueda acceder a los resultados el personal autorizado.

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CONSULTAS AL LABORATORIO CLÍNICO Las consultas al laboratorio son la forma tradicional de resolver los problemas clínicos que van más allá de la competencia del médico solicitante. La mayoría de las consultas son comunicaciones informales, frecuentemente por teléfono, e iniciadas la mayor parte de las veces por el laboratorio. En cualquier caso, para comunicarse personalmente de modo eficaz con los médicos, el facultativo del laboratorio debe tener conocimientos de medicina (interna, pediatría, cardiología, nefrología, etc.). En muchas áreas del laboratorio clínico, la comunicación entre los médicos solicitantes y los facultativos es fundamental para interpretar adecuadamente los resultados. Cabe citar, como ejemplos, las pruebas de autoanticuerpos en el estudio de las enfermedades autoinmunitarias, las de los HLA en los estudios de su asociación con determinadas afecciones, las pruebas de marcadores genéticos en el cáncer, etc.

1.16. GESTIÓN ECONÓMICA________________________________________________________________ La gestión económica del laboratorio clínico es un tema fundamental, ya que la demanda de pruebas ha crecido de forma muy importante en los últimos años, con el consiguiente incremento de los costes en estos laboratorios. En nuestro país, la mayoría de los laboratorios clínicos son de gestión pública y las consideraciones económicas están sujetas a los presupuestos de los organismos gestores de las diferentes comunidades autónomas. Es difícil, pues, realizar una gestión económica análoga a la de una empresa privada. En cualquier caso, es importante conocer el análisis de costos aplicados a la gestión del laboratorio clínico. CAPÍTULOS DE GASTO Los distintos gastos de los laboratorios clínicos se dividen en capítulos; los más importantes son los siguientes: Capítulo 1: gastos de personal. Capítulo 2: gastos de bienes corrientes y servicios. Capítulo 3: gastos financieros. CLASIFICACIÓN DE LOS COSTES Los costes pueden clasificarse de acuerdo con el volumen de actividad o producción en: fijos y variables. Los costes fijos son los que se producen de forma independiente del volumen de pruebas y son constantes a lo largo del tiempo. El ejemplo más característico de este tipo de costes son los salarios. Los costes variables, generalmente, aumentan o disminuyen de forma lineal con la producción. El ejemplo más característico de este tipo de costes son los reactivos. De acuerdo con los objetivos del coste y los criterios de imputación, los costes se dividen en: directos e indirectos. Los costes directos son los asociados directamente con la producción y derivan de la adquisición de los materiales y el trabajo necesario para medir una magnitud determinada. Los costes indirectos son los no asociados con la producción. En su mayor parte suelen ser costes fijos. ANÁLISIS DE COSTES El análisis de costes permite comparar la eficacia de los laboratorios y es una herramienta de gran importancia para mejorar la utilización de los laboratorios por los servicios clínicos. Los principales costes del laboratorio clínico proceden del personal, los reactivos y el mantenimiento de las instalaciones. El análisis de costes hace posible la toma de decisiones entre otras cosas sobre la introducción de nuevas pruebas, la modificación de los métodos empleados para algunas de ellas, la eliminación de pruebas, el cambio de equipos analíticos y la utilización de laboratorios externos para algunas pruebas.

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1.17. PROCEDIMIENTOS DE COMPRAS___________________________________________________________ En los laboratorios clínicos de centros públicos las compras de materiales están reguladas por la Ley 30/2007, de 30 de octubre, de Contratos del Sector Público (BOE 31 de octubre de 2007). Los laboratorios clínicos privados realizan sus compras directamente eligiendo las ofertas más adecuadas para ellos. En el sector público, la adquisición del material de laboratorio puede realizarse mediante un procedimiento abierto, uno restringido o uno negociado. El procedimiento abierto suele realizarse como concurso público en el que cualquier empresa puede presentar una proposición u oferta. El procedimiento restringido es aquel en el que se seleccionan las empresas que pueden presentar las ofertas. Finalmente, en el procedimiento negociado se adjudica la compra a una empresa que se elige de forma justificada, bien porque sea la única que dispone del material que se desea o alguna otra circunstancia. En los concursos públicos, el laboratorio clínico suele proponer los materiales que necesita, junto con un cálculo de los precios unitarios. Además, deben señalarse los principales criterios de valoración de las ofertas. El servicio de compras del centro se encarga de elaborar el pliego de condiciones técnicas y económicas y la tramitación del concurso. El laboratorio debe evaluar las ofertas presentadas y emitir un informe técnico de acuerdo con los criterios de valoración publicados previamente. El servicio de compras, con esta valoración y teniendo en cuenta la oferta económica, elabora el informe económico y finalmente, considerando ambas valoraciones, realiza la adjudicación a la mejor propuesta.

1.18. GESTIÓN DE ALMACENES___________________________________________________________________ Los laboratorios clínicos emplean dos clases principales de materiales. Por un lado, los destinados a la extracción, que generalmente se encuentran en el almacén general del centro y que este distribuye a los usuarios en las plantas de hospitalización y los centros de salud donde se realizan extracciones. Por otro lado, se encuentran los materiales propios del laboratorio, que son fundamentalmente los reactivos para las determinaciones analíticas. Estos habitualmente se almacenan en el propio laboratorio. El sistema informático de laboratorio debe disponer de un programa de gestión de almacenes. Los reactivos deben estar identificados mediante código de barras. Debe disponerse de un stock suficiente de forma que se establezca un programa de reposición de acuerdo con las entradas y salidas. Las reposiciones pueden ser de tres tipos: - Reposición periódica o programada. Se fija un calendario de fechas y de cantidades para entregar. Es útil para productos de gran consumo y demanda regular; por ejemplo, el material de extracción de los laboratorios. - Reposición por pedido. Se genera un pedido cuando las existencias alcanzan una cantidad predeterminada (stock mínimo). Se emplea para consumos pequeños y de difícil previsión. - Reposición de productos de caducidad corta. Se hace ajustando el plazo de entrega a las fechas de caducidad. Se emplea para reactivos de radioinmunoanálisis o medios de cultivo.

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1.19. GESTIÓN Y CONTROL DEL GASTO_______________________________________________________ El laboratorio tiene un sistema informatizado de control del gasto en donde figuran: Base de datos de artículos: - Artículo - Referencia del hospital - Referencia del proveedor - Proveedor - Centro de coste asignado del laboratorio (áreas analíticas) - Analizador asignado - Prueba asignada - Precio Listado de pedidos realizados por fechas con la misma información anterior Cuadro de mando de gestión del gasto: - Evolución comparativa por meses y años del gasto (coste de reactivos) / actividad (número de determinaciones). - Evolución del gasto-actividad por centros de coste del laboratorio (año anterior/año presente). - Evolución mensual del presupuesto asignado a los centros de coste. - Evolución del gasto por analizadores. - Evolución del gasto por proveedotres. - Valoración del inventario anual de reactivos (a dos de enero de cada año). Todo esto permite la gestión y el control del gasto y además, contrastar esta información con la del área de suministros del hospital con objeto de detectar en reuniones periódicas posibles desviaciones del gasto/actividad y el cumplimiento de objetivos económicos por parte del laboratorio.

1.20. LABORATORIOS EXTERNOS DE REFERENCIA______________________________________________ Las determinaciones que el laboratorio no puede realizar, por falta de aparataje o por baja demanda, son remitidas a laboratorios externos subcontratados con quien tiene establecido un sistema de recogida y transporte de muestras, así como, un programa informático de gestión de peticiones y de envío de resultados al sistema informático del laboratorio SIL. El laboratorio tiene definido un procedimiento de derivación a laboratorios externos en el que entre otras consideraciones se especifican los criterios para la evaluación inicial de los laboratorios externos de titularidad privada que son: - Laboratorios de reconocido prestigio dentro del área de los análisis clínicos (certificación de calidad según normas ISO). - Catálogo de prestaciones que contenga al menos: denominación de la magnitud, recomendaciones preanalíticas, tipo y volumen de muestra necesario, condiciones de conservación y transporte, método analítico, demora de resultados y valores de referencia. Se valorará información adicional. - Integración de su programa de gestión en el Sistema Informático del Laboratorio. - Gran capacidad de gestión de muestras (recogida y transporte) y rapidez en la disponibilidad de resultados. - Comunicación de resultados provisionales o parciales y urgente de valores críticos. - Disponibilidad de contenedores de muestras para el adecuado transporte de las mismas. - Gestión de muestras no conformes. - Gestión de peticiones y resultados on-line. - Fácil acceso telefónico y vía correo electrónico. Página web. - Consultoría de pruebas, muestras e interpretación. - Coste por determinación.

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El sistema de gestión de la calidad del laboratorio establece un periodo de evaluación de seis meses, en el que se considerarán aspectos relacionados con la calidad de la gestión de la actividad externalizada, referenciada a los conceptos anteriormente mencionados. Los criterios de reevaluación semestral de los laboratorios externos serán los siguientes: - Tiempo de recogida de muestras en el día que se solicite sus servicios (se valoraran negativamente las demoras sobre el tiempo previsto). - Gestión de muestras no conformes. - Demoras en la disponibilidad prevista de resultados - Interpretación de los resultados. Los laboratorios externos de referencia de titularidad pública son los concertados por la administración (SACYL) y por lo tanto, al no ser seleccionados por el propio laboratorio, solamente se valorará el catálogo de pruebas, la gestión de las peticiones, el envío de muestras y la disponibilidad de los resultados.

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Capítulo 2. Sistema Informático del Laboratorio

Introducción 2.1. Componentes básicos de los ordenadores 2.2. Redes locales 2.3. Internet, intranet y extranet 2.4. Sistemas informáticos del laboratorio 2.5. Sistemas expertos 2.6. Estadísticas de actividad

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INTRODUCCIÓN________________________________________________________________________ En el mundo actual, los ordenadores son parte fundamental del trabajo. Los laboratorios clínicos no son una excepción, y los ordenadores ocupan un lugar muy importante en la organización y ejecución del trabajo en estos lugares. Las aplicaciones en el campo de los laboratorios clínicos son muchas: las principales son el control del funcionamiento de los instrumentos analíticos, la calidad y los sistemas informáticos de laboratorio. En este capítluo se considera esta última aplicación; antes se darán unas nociones generales sobre los ordenadores y su funcionamiento.

2.1. COMPONENTES BÁSICOS DE LOS ORDENADORES_________________________________________ Los ordenadores poseen dos componentes conceptuales principales: la máquina física, o hardware, y las instrucciones y datos que se utilizan para la operación de la máquina, o software. Estos dos componentes son análogos a la división del trabajo analítico en instrumentación y métodos. El hardware consta de tres elementos fundamentales: la CPU (unidad central de procesamiento), los lugares de almacenamiento de datos (memorias) y los sistemas de entrada/salida de datos (periféricos). Estas partes están interconectadas mediante buses. UNIDAD CENTRAL DE PROCESAMIENTO La CPU es la pieza maestra del ordenador, donde se procesa la información bajo el control del programa. En la actualidad las CPU están construidas en un único circuito integrado denominado microprocesador. MEMORIAS Las memorias son los lugares donde se almacenan los programas y donde se registran y conservan los datos intermedios. Hay dos clases de memorias: las ROM (Read Only Memory: memoria sólo de lectura) y las RAM (Random Access Memory: memoria de acceso aleatorio). La memoria ROM está incorporada al sistema y almacena los datos permanentemente, de forma que no puede borrarse y se mantiene cuando se interrumpe la corriente eléctrica. Se utiliza fundamentalmente para almacenar los sistemas operativos. Las memorias RAM pueden grabarse y borrarse cuantas veces se desee. Se utilizan para almacenar momentáneamente los datos que se procesan y se borran cuando se interrumpe la corriente eléctrica. En un ordenador personal, la ROM contiene un programa especializado denominado BIOS, que dirige la carga del sistema operativo del ordenador desde el disco duro a la RAM siempre que se enciende el ordenador. La unidad de almacenamiento es el byte, que es una secuencia de ocho bits. Un bit es un dígito binario (0 ó 1). Un kilobyte (Kb) es 210 bytes (1.024 bytes), un megabyte (Mb) equivale a 1.048.576 bytes y un gigabyte (Gb) son 1.073.741.824 bytes. DISPOSITIVOS DE ENTRADA/SALIDA DE DATOS Los dos dispositivos principales de entrada de datos son el teclado y el ratón y los dos dispositivos principales de salida de datos son el monitor y la impresora. Otros dispositivos de entrada y salida de datos son los discos duros, los discos ópticos y las memorias USB. SISTEMA OPERATIVO El sistema operativo es el conjunto de programas que dirigen constantemente el trabajo del ordenador y sin los que este no puede funcionar. El sistema operativo puede estar incluido en la memoria central en forma de memoria ROM o puede introducirse en un disco. Este sistema contiene los programas que permiten acceder a los periféricos, transferir datos entre los dispositivos del ordenador y controlar los tiempos de acceso de estos al

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procesador. Asimismo, en los sistemas de tiempo compartido, regula el acceso de cada usuario al sistema. En la actualidad el sistema operativo más empleado es Windows, en sus diversos formatos (7, Vista, XP, 2000), que permite la multitarea, esto es, realizar varias tareas independientes al mismo tiempo.

2.2. REDES LOCALES__________________________________________________________________ Una red de área local, red local o LAN (del inglés Local Área Network) es un dispositivo de interconexión de varios ordenadores y periféricos. Su principal objetivo es compartir recursos e intercambiar datos y aplicaciones. Los sistemas de redes locales más utilizados son los llamados cliente/servidor. Este término describe una interacción específica entre dos ordenadores en red. El servidor tiene la base de datos a partir de la cual el cliente obtiene y procesa los datos para su uso. Un programa servidor puede atender a muchos clientes. Cuando uno de estos actualice los datos, generalmente lo hará también con los del servidor. La estructura cliente /servidor es la más utilizada en los sistemas informáticos de laboratorio.

2. 3. INTERNET, INTRANET Y EXTRANET________________________________________________________ Internet es un conjunto descentralizado de redes de comunicación interconectadas que utilizan la familia de protocolos TCP/IP. Internet proporciona un gran número de servicios, como la World Wide Web (www), el correo electrónico, la transmisión de archivos y las transmisiones de imagen y sonido en línea. La Web es un conjunto de protocolos que permiten de forma sencilla la consulta remota de archivos de hipertexto. Como utilidad de la Web se encuentran los buscadores, que son sistemas que presentan los archivos almacenados en servidores web sobre un tema que se ha solicitado, lo cual permite el acceso a la información de una forma simple. El correo electrónico es otro servicio fundamental de Internet. Permite enviar y recibir mensajes utilizando los medios electrónicos de comunicación. Asimismo, permite adjuntar ficheros con información a estos mensajes electrónicos. Una intranet es una red privada de ordenadores que utilizan la tecnología y los protocolos de Internet para compartir información o programas. Suele emplearse por empresas u organismos para el trabajo corporativo. Una extranet es parte de la intranet de una organización que se extiende a usuarios fuera de ella. Las extranet suelen tener un acceso restringido. Es un medio muy utilizado por las empresas para comunicarse con sus proveedores, socios, clientes, etc.

2.4. SISTEMAS INFORMÁTICOS DE LABORATORIO__________________________________________________ Los sistemas informáticos de laboratorio (SIL) son aplicaciones o conjuntos de programas diseñados para tratar los datos producidos en los laboratorios clínicos. En el mercado se dispone de diversos SIL distribuidos principalmente por las casas comerciales de equipos y reactivos. Cada uno de ellos tiene sus propias características. En lo que sigue utilizaremos el Programa Omega (Roche Diagnostics) para señalar las principales características de estos programas. Los SIL suelen tener diversos módulos interconectados que gestionan desde el control del flujo de las muestras hasta la conexión con otras redes de información sanitaria. Los principales módulos de Omega 3000 son: • PSM. • General. • Urgencias. • Microbiología. • Dosis. • Weblab. • Omnium.

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• TQM. • e-DAI A continuación se describen las principales características de estos módulos. PSM Es la unidad de gestión de las muestras, del control de la calidad y de la validación técnica. Permite la entrada continua de las muestras y pueden programarse diversos parámetros como el tipo de muestra, el destino, la realización de alícuotas, las repeticiones y el archivo de las muestras. El módulo gestiona también el control de la calidad empleando el sistema de multirreglas de Westgard. Los valores de los controles se obtienen por medio de las conexiones con los diferentes analizadores. El sistema muestra en diversas pantallas informativas el estado general del control de la calidad y los detalles de cada uno de los valores, las reglas incumplidas y los gráficos de evolución. El PSM tiene también un sistema de validación técnica de los resultados con criterios de visualización que personaliza cada usuario. MÓDULO GENERAL Este módulo gestiona los laboratorios de bioquímica y hematología. Las principales características de este módulo son la gestión de procesos y la capacidad de parametrización. Con relación a los procesos, estos comprenden: • Entrada de peticiones. • Fase analítica. • Resultados. • Validación diagnóstica. • Consultas. • Impresión. • Estadísticas. • Trazabilidad. -Entrada de peticiones La entrada de peticiones puede hacerse de diferentes formas, bien mediante la incorporación de los datos desde los peticionarios de atención especializada y atención primaria (petición electrónica) o bien manualmente en el laboratorio o por medio de lectores automáticos de tarjetas de marcas ópticas o escáneres de digitalización. -Fase analítica La fase analítica se gestiona mediante el módulo PSM con sus funcionalidades asociadas a la gestión de los flujos de muestras, las conexiones en línea y la validación técnica. -Resultados Una vez realizadas las determinaciones deben asentarse los resultados de las pruebas, cuya introducción puede ser automática o manual. La comunicación de resultados desde los aparatos conectados con el sistema informático de laboratorio se hace de manera automática. La introducción a través de la pantalla puede hacerse por parámetro, lo que permite introducir los datos por columnas, y por paciente, lo que permite introducirlos por filas. Se dispone de diversos formatos para la presentación de los resultados; entre otros, numéricos, alfanuméricos, textos codificados, textos libres y diversas combinaciones de ellos. -Validación diagnóstica Una vez asentados los resultados, hay que proceder a su validación. Cuando la petición tiene todos los resultados y estos están dentro de los márgenes de validación programados, la petición queda validada automáticamente. Cuando algún resultado está fuera de los márgenes de validación, la petición aparece en pantalla para solicitar la validación manual del personal facultativo. Para ello hay múltiples accesos a diversos

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niveles y filtros personalizabas para el acceso a las peticiones a validar. Asimismo, la presentación de los resultados puede programarse de forma que aparezcan alarmas, valores de referencia, últimos resultados históricos, etc. -Consultas Puede accederse a la información de los pacientes mediante búsquedas simples por nombre, raíz, número de historia, etc. -Impresión Después de validar los resultados, se pasa a editar los informes. Puede configurarse y seleccionarse la impresión. Asimismo, pueden integrarse los informes en los diversos sistemas de información de la red asistencial distribuyendo la información en diferentes formatos y localizaciones. Puede realizarse la impresión automática sin necesidad de órdenes, la impresión remota en impresoras de red hospitalaria, combinar la impresión automática y remota y la preparación del informe en formato fichero que puede enviarse por correo electrónico. -Estadísticas El programa dispone de utilidades estadísticas de actividad del laboratorio, lo que permite llevar una contabilidad analítica y presupuestaria. Con la primera puede obtenerse no sólo el coste real por parámetro, sino también la distribución del gasto sobre las unidades de demanda. Por otro lado, la contabilidad presupuestaria puede controlar la repercusión diaria del gasto real realizado en el presupuesto asignado, lo que permitirá modular el primero para alcanzar los objetivos planteados en el segundo. Asimismo, el SIL tiene que realizar una estadística asistencia! y epidemiológica que haga posible evaluar día a día y parámetro a parámetro la demanda analítica y la distribución de los valores obtenidos. Finalmente, debe efectuar un control de los peticionarios que permita conocer exactamente la distribución por unidades de demanda del trabajo realizado, el coste de producción de este y las determinaciones normales y patológicas y, en consecuencia, actuar conteniendo o estimulando y, en todo caso, demostrando un completo control y conocimiento de la finalidad del trabajo. -Trazabilidad El sistema permite la trazabilidad de las acciones realizadas en los diferentes procesos del laboratorio clínico. Puede obtenerse la hora de registro de la petición y la persona que la ha registrado, la hora de validación de cada parámetro y la persona que lo ha validado, la hora de edición y reedición de informes, la impresora de edición, la hora de recepción de la muestra, la hora de entrada y de salida en analizadores y posición y la hora de archivo y posición. MODULO DE URGENCIAS El núcleo fundamental de este módulo es una pantalla que presenta en tiempo real las peticiones activas. Tiene automatizados procesos que en los programas de los laboratorios generales suelen hacerse de forma manual, como la impresión automática y remota, el cierre automático al final del día, la validación automática y un tratamiento específico de las gasometrías. MÓDULO DE MICROBIOLOGÍA El laboratorio de microbiología presenta unas características especiales, por lo que los SIL suelen tener un módulo específico. Mediante este programa específico son posibles las acciones siguientes: • Identificar el soporte estudiado. • Siembras que deben realizarse. • Aislados identificados. • Pruebas de identificación. • Resiembras. • Antibiogramas. • Introducción de resultados a todos los niveles. • Visualización completa de la trazabilidad de las acciones realizadas.

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El sistema se ha diseñado para que aparezca en una pantalla la mayor información posible. Tras escanear el código de barras del paciente aparecen muestras, localización, pruebas, medios, aislados, pruebas identificativas, información histórica del paciente, antibiogramas solicitados y resistencias de antibióticos. La información aparece en cuatro zonas diferenciadas: demográfica, áreas de trabajo, información histórica y antibiogramas. MÓDULO DE DOSIS Permite la gestión de los pacientes en tratamiento con anticoagulantes orales. Dispone de utilidades completas en: • Gestión de peticiones. • Fichas de pacientes. • Validación y filtros de acceso. • Asignación y distribución de dosis. • Citaciones. • Informes con diseños gráficos. • Envío automatizado vía fax. MÓDULO WEBLAB Módulo que permite el acceso remoto mediante la Web a la base de datos Omega con funcionalidades de consulta e impresión de informes. Hay filtros de acceso para los usuarios. MODULO OMNIUM Módulo para la explotación estadística de la información. MÓDULO TQM Módulo que permite la implantación de un modelo de calidad global con inclusión de gestión documental, incidencias, auditorías e indicadores de calidad. MÓDULO E-DAI Se trata de un integrador de área de varios sistemas Omega. Permite conectar varios laboratorios y varios centros para el intercambio de la información.

2.5. SISTEMAS EXPERTOS_______________________________________________________________ Las investigaciones sobre el diagnóstico médico asistido por ordenador comenzaron en los años sesenta con gran esperanza de poder reducir los problemas clínicos a formalismos matemáticos. La mayor parte del trabajo inicial se centró en aplicar cartas de flujo, álgebra de Boole, emparejamiento de patrones y análisis de decisión del problema diagnóstico. Sin embargo, estas técnicas tuvieron poco éxito, por lo que en la década de 1970 el interés derivó hacia la inteligencia artificial, y especialmente las aplicaciones del ordenador que implican el procesado de información simbólica. Los programas informáticos que intentan ayudar a tomar una decisión reciben el nombre de sistemas expertos. Estos sistemas son programas de ordenador que tratan de emular el razonamiento de un experto en un determinado campo del conocimiento. No dependen de suposiciones estadísticas o de datos sobre grandes poblaciones y pueden modificar su base de conocimientos para mejorar su funcionamiento. En lugar de conocer las reglas de un ámbito determinado del saber e ir probándolas todas, los sistemas expertos caminan hacia la solución del problema siguiendo una andadura lógica que imita la forma de actuar del ser humano. Dichos sistemas constan de una base de conocimientos que contiene información de tipo general y un sistema inferente (deductivo) que recibe los datos del usuario y aplica la base de conocimientos para proporcionar las respuestas. La base de conocimientos está formada por hechos, como los que pueden verse en los libros de texto, y opiniones y conocimientos heurísticos, derivados de la experiencia adquirida durante años de trabajo en un

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campo concreto del saber. Como para el experto es difícil hacer explícita esta información, le ayuda a ello un ingeniero del conocimiento que sabe representarlo en un ordenador y construir un programa que razone de acuerdo con la base de conocimientos proporcionada por aquel. Ahora bien, no hay que confundir una base de conocimientos con una base de datos. La primera contiene información de tipo general, mientras que la segunda se compone de datos concretos. EXPERTOS BASADOS EN REGLAS Estos sistemas se fundamentan en que el conocimiento del experto consiste en un gran número de reglas independientes, específicas de cada situación. Los ordenadores pueden imitar el razonamiento del experto hilando estas reglas en cadenas de deducción. En estos sistemas la base de conocimientos está formada por un conjunto de sentencias condicionales o reglas. EXPERTOS CON REDES SEMÁNTICAS Estos sistemas comparan los datos introducidos inicialmente con patrones almacenados en su base de conocimientos y establecen una hipótesis. Con ella, interrogan sobre el caso, y con la información obtenida pueden rechazarla y establecer otra, o sugerir un diagnóstico. Los patrones, denominados nodos o marcos, están interconectados por ligazones que representan relaciones y dependencias. Estas redes de nodos y marcos son excelentes para representar estructuras jerárquicas de conocimientos. DÓNDE COLOCAR LOS SISTEMAS EXPERTOS La mayoría de los sistemas expertos actuales funcionan aislados, de forma que los usuarios han de introducir los datos. Sin embargo, en un laboratorio clínico tiene poco sentido un sistema experto si no se integra, de alguna manera, en el sistema informático del laboratorio. Es absurdo introducir los datos de forma manual en el sistema experto cuando se encuentran almacenados en el sistema informático del laboratorio. Sin embargo, no es fácil integrar aquel sistema en este. Se han propuesto unos estándares internacionales para transferir los datos que se espera que se introduzcan en los sistemas expertos que se comercialicen en el futuro. SISTEMAS DE VALIDACIÓN DE LOS RESULTADOS Una de las tareas que consume más tiempo en los laboratorios de bioquímica clínica es validar los resultados y firmar los informes correspondientes. Se entiende por validación el proceso mediante el que el responsable de la sección o servicio revisa los resultados y los traslada al fichero de pacientes para luego editar el informe. Se han sugerido sistemas de validación automática y de firma electrónica. Uno de ellos, VALAB, se basa en los cambios entre determinaciones repetidas., comparar componentes relacionados fisiológicamente, y la ubicación hospitalaria, la edad y el sexo del enfermo.

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2.6. ESTADÍSTICAS DE ACTIVIDAD___________________________________________________________

Número de Pacientes Atención Especializada Atención Primaria Urgencias Número de Peticiones Atención Especializada Atención Primaria Urgencias Número de Toma de muestras Toma de muestras periféricas Toma de muestras consulta extracciones hospital Toma de muestras plantas hospital Número de Muestras Atención Especializada + Atención Primaria Urgencias Número de Determinaciones Atención Especializada Atención Primaria Urgencias Determinaciones / petición Atención Especializada Atención Primaria Urgencias Número de Resultados informados Atención Especializada Urgencias Número de Incidencias registradas Atención Especializada + Atención Primaria Urgencias Demora resultados (minutos) Atención Especializada + Atención Primaria Lab. de Urgencias Laboratorios Externos Determinaciones Lab. Externos de Referencia Actividad derivada a Lab. Ext. (‰ det)

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Capítulo 3. Procesos y procedimientos del laboratorio

Definición de proceso 3.1. La gestión por procesos en el laboratorio clínico 3.2. Procesos y procedimientos 3.3. El diagrama de flujo o flujograma 3.4. La ficha del proceso 3.5. Tipos de procesos en el laboratorio clínico 3.6. El mapa de procesos 3.7. Registros y trazabilidad 3.8. La mejora de los procesos 3.9. Los indicadores 3.10. Procedimientos normalizados de trabajo y generales

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DEFINICIÓN DE PROCESO_____________________________________________________________ Un proceso es una secuencia de actividades orientadas a generar un valor añadido sobre una ENTRADA para conseguir un resultado, y una SALIDA que a su vez satisfaga los requerimientos del cliente. Conjunto de actividades mutuamente relacionadas o que interactúan, las cuales transforman elementos de entrada (insumos) en elementos de salida (resultados). Conjunto de actividades (tareas) que producen un resultado. Es lo que hace el laboratorio. Conjunto de actividades mutuamente relacionadas o que interactúan, las cuales transforman elementos de entrada en resultados.

3.1. LA GESTIÓN POR PROCESOS EN EL LABORATORIO CLÍNICO___________________________________ La gestión por procesos percibe la organización como un sistema interrelacionado de procesos que contribuyen conjuntamente a incrementar la satisfacción del cliente. Supone una visión alternativa a la tradicional caracterizada por estructuras organizativas de corte jerárquico-funcional y que en buena medida dificulta la orientación de las empresas hacia el cliente. Una gestión por procesos estructurada, con los recursos y coordinación adecuados, permite optimizar de forma significativa la utilización de los recursos y mejorar la calidad asistencial. La mala gestión y la mala calidad cuesta dinero a las organizaciones y nos debemos basar en el «principio de medición» para demostrar que hacemos bien las cosas; dime cómo mides y te diré quién eres: • Lo que no se mide, no se puede mejorar. • Lo que se mide y se comunica, mejora. • Todo se puede medir. • Todo se puede mejorar. Razones para adoptar una gestión por procesos:

Facilidad en la coordinación entre estamentos y servicios. Las causas de ineficiencias se detectan y pueden eliminarse. Sistematiza las actividades de los procesos, proporcionando estabilidad a los mismos. Utiliza el conocimiento de la opinión de los clientes, sus necesidades y expectativas como base para enfocar los servicios. Establece indicadores para medir y evaluar periódicamente la calidad del trabajo realizado. Se aplican los ciclos de mejora contínua a todas las actividades de la organización. Un proceso comprende una serie de ACTIVIDADES realizadas por diferentes departamentos, que añaden valor y que ofrecen un servicio a su cliente. Este CLIENTE podrá ser tanto un cliente interno (otra unidad dentro del laboratorio), como un cliente externo (facultativo clínico, paciente). La gestión por procesos aporta una visión y unas herramientas con las que se puede mejorar y rediseñar el flujo de trabajo para hacerlo más eficiente y adaptado a las necesidades de los clientes. No hay que olvidar que los procesos los realizan personas y los productos los reciben personas, y por tanto hay que tener en cuenta en todo momento las relaciones entre proveedores y clientes. En la gestión por procesos el significado más acertado para el concepto calidad es: lo que el cliente espera recibir por lo que está dispuesto a pagar en función del valor percibido. Desde este punto de vista, la

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calidad equivale a orientación del laboratorio clínico hacia el cliente, por lo que la gestión por procesos se presenta como un sistema de gestión de la calidad apuntando hacia la calidad total. La norma ISO 9001:2008. Sistemas de Gestión de la Calidad. Requisitos, está basada en los siguientes principios: • • • • •

Ciclo de Deming o de mejora = PDCA (Plan-Do-Check-Act) - (Planificar-Hacer y aplicar-Controlar y verificar-Rectificar y mejorar). Enfoque al cliente: requisitos y satisfacción. Enfoque por procesos. Mejora basada en datos cuantitativos: cultura de la medición. Análisis de los datos de los controles: indicadores de la calidad cuantitativos.

Esta norma promueve la adopción de un enfoque basado en procesos cuando se desarrolla, implanta y mejora la eficacia del sistema de gestión de la calidad, para aumentar la satisfacción del cliente mediante el cumplimiento de sus REQUISITOS. Para que el Laboratorio de Análisis Clínicos funcione de manera eficaz, tiene que identificar y gestionar numerosas actividades relacionadas entre sí. La aplicación de un sistema de procesos dentro del laboratorio, junto con la identificación e interacciones de estos procesos, así como su gestión, puede denominarse como «enfoque basado en procesos». Los objetivos de la gestión por procesos son los que se detallan a continuación: — Identificar los procesos que se desarrollan en el Laboratorio Clínico. — Sistematizar las actividades de los procesos, aplicando la metodología de la práctica basada en la evidencia a las actividades científico-técnicas. — Adecuar los servicios que se prestan a las necesidades / expectativas de los clientes. — Medir efectividad y eficiencia de los procesos. — Aplicar la mejora continua a todas las actividades. Pero el principal objetivo de la gestión por procesos es aumentar los resultados del Laboratorio Clínico a través de conseguir niveles superiores de satisfacción de sus clientes. La gestión por procesos se comprende con facilidad por su aplastante lógica, pero se asimila con dificultad por cambios paradigmáticos que contiene. Entre los beneficios de la gestión por procesos se encuentran; — Incremento de la satisfacción de los clientes. — Procesos más ágiles y libres de defectos. — Reducción de costes. — Incremento de la satisfacción de los empleados. La gestión por procesos permite: — Definir y acotar las actividades. — Delimitar y fijar las responsabilidades. — Planificar y normalizar las actividades. — Definir los objetivos en cada actividad. — Prever las posibles causas de error y prevenirlas. — Medir la calidad de ejecución previa a la calidad del producto o servicio. — Crear la necesidad de satisfacer al cliente interno, facilitando y fomentando el trabajo en equipo y el servicio a los clientes y usuarios externos. — Implicar a todo el personal, fomentando la organización transversal, una mayor delegación y la mejora de los resultados finales.

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— Óptimamente correlacionados entre sí y con los sucesos, permite mejorar la eficacia y disminuir los costes (eficiencia). Los principales factores para la identificación y selección de los procesos son: — Influencia en la satisfacción del cliente. — Los efectos en la calidad del producto/servicio. — Influencia en Factores Clave de Éxito [FCE). — Influencia en la misión y estrategia. — Cumplimiento de requisitos legales o reglamentarios. — Los riesgos económicos de insatisfacción. — Utilización intensiva de recursos. Una organización puede recurrir a diferentes herramientas de gestión que permiten llevar a cabo la identificación de los procesos que componen la estructura,, pudiendo aplicar técnicas de «Brainstorming», dinámicas de equipos de trabajo, etc. Una vez efectuada la identificación y la selección de los procesos, surge la necesidad de definir y reflejar esta estructura de forma que facilite la determinación e interpretación de las interrelaciones existentes entre los mismos. La identificación de un proceso se logra determinando cuáles son las tareas elementales que lo constituyen. La definición del proceso se hace mediante el análisis de cada una de estas tareas elementales. En cada una de las tareas elementales de un proceso se debe considerar:

¿QUIÉN?: Definición de las responsabilidades y personal implicado. ¿QUÉ?: Definición de la tarea elemental. ¿DONDE?: Lugar de realización. ¿CUÁNDO?: Momento, fecha. ¿CUANTO?: Frecuencia con la que se hace. ¿POR QUÉ?: Justificación del trabajo. ¿COMO?: Manera de realizar la tarea elemental.

3.2. PROCESOS Y PROCEDIMIENTOS_________________________________________________________ Un proceso se define como «Un conjunto de actividades mutuamente relacionadas o que interaccionan, las cuales transforman elementos de entrada en resultados». Al poder ejercer un control continuo sobre los procesos individuales y sus vínculos dentro del sistema de procesos (incluyendo su combinación e interacción), se pueden conocer los resultados que obtienen cada uno de los procesos y cómo los mismos contribuyen al logro de los objetivos generales de la organización. Un proceso supone una transformación

TRANSFORMACIÓN

Requisitos de clientes

Procesos

Satisfacción de clientes

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Un proceso es el conjunto de actuaciones, decisiones, actividades y tareas que se encadenan de forma secuencial y ordenada para conseguir un resultado que satisfaga plenamente los requerimientos del cliente al que va dirigido. Tiene capacidad para transformar unas entradas («inputs») en salidas («outputs»); entre estos dos momentos se realizan una serie de actividades coordinadas que logran un valor añadido apreciable por el cliente al que va dirigido.

Entradas

Proceso

Salidas

Dependiendo del nivel de complejidad, un procedimiento puede desglosarse en uno o varios subprocesos. Estos son partes bien definidas de un proceso. Su identificación puede ser útil para aislar los problemas que puedan presentarse y posibilitar diferentes tratamientos dentro de un mismo proceso. Un proceso puede estar contenido: -

Dentro de un área funcional del Laboratorio Clínico, o Puede abarcar varias áreas/unidades del Laboratorio Clínico.

Un proceso no es lo mismo que un procedimiento. Un procedimiento o protocolo es el «conjunto de reglas e instrucciones que determinan la manera de proceder o de obrar para conseguir un resultado». Un procedimiento es la forma específica de llevar a cabo una actividad. Un procedimiento no nos brinda la certeza de una buena gestión de esas actividades descritas, mientras que el proceso nos va a medir hasta que punto estamos cumpliendo de un modo objetivo con lo descrito en esos procedimientos.

Un proceso define qué es lo que se hace, y un procedimiento, cómo hacerlo

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3.3. EL DIAGRAMA DE FLUJO O FLUJOGRAMA_____________________________________________ Un proceso se visualiza normalmente en forma de diagrama, que describe en forma gráfica el modo en que las personas desempeñan su trabajo. Estos diagramas pueden aplicarse a cualquier serie de actividades que se repitan y que puedan medirse, independientemente de la longitud de su ciclo o de su complejidad, aunque para que sea realmente útil debe permitir cierta sencillez y flexibilidad. Los símbolos más frecuentes para realizar el diagrama de flujo son los siguientes:

Símbolos empleados en la elaboración de flujogramas o diagramas de flujo

Inicio o fin de un proceso

Se utiliza para representar el origen de una entrada o el destino de una salida. Se emplea para expresar el comienzo o el fin de un conjunto de actividades.

Actividad

Se emplea para representar una actividad, si bien también puede llegar a representar un conjunto de actividades.

Decisión

Representa una decisión. Las salidas suelen tener al menos dos flechas (opciones).

Representa el flujo de productos, información, ….. y la secuencia en que se ejecutan las actividades.

Documento

Base de datos

Representa un documento. Se suelen utilizar para indicar expresamente la existencia de un documento relevante.

Representa a una base de datos y se suele utilizar para indicar la introducción o registro de datos en una base de datos (habitualmente informática).

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El flujograma o diagrama de flujo es una descripción de las actividades de manera gráfica y vincula cada actividad con el responsable de llevarla a cabo. Facilita la interpretación de las actividades en su conjunto, debido a que permite una recepción visual del flujo y la secuencia de las mismas, incluyendo las entradas y salidas necesarias para el proceso y los límites del mismo.

FLUJOGRAMA DE GESTIÓN DE PROCESOS EN EL LABORATORIO CLÍNICO Petición analítica

¿Correcto?

SÍ

Alta en Sistema Informático del Laboratorio

Codificación

Almacén

SÍ

Clasificación, tratamiento y distribución de muestras

Necesidad de almacenamiento

Toma de muestra, transporte y recepción

Identificación de alícuotas y conservación

SÍ

Necesidad de alícuotas Fase Preanalítica

Analizadores. Calibración y control de calidad. Realización de pruebas

Fase Analítica Obtención de resultados y validación técnica

Laboratorios externos

¿Correcto?

SÍ

Validación clínica o facultativa

Revisión de procesos y toma de decisiones

¿Correcto?

SÍ

Emisión de informe de resultados Fase Postanalítica

3.4. LA FICHA DEL PROCESO___________________________________________________________ La ficha del proceso es uno de los documentos fundamentales a la hora de gestionar un proceso; un modelo de ficha que se puede utilizar es el que se presenta a continuación: Información incluida en la Ficha de Proceso Misión u objeto: Es el propósito del proceso. Hay que preguntarse ¿cuál es la razón de ser del proceso? ¿Para qué existe el proceso?. La misión u objeto debe inspirar los indicadores y la tipología de resultados que interesa conocer. Propietario del proceso: Es la función a la que se le asigna la responsabilidad del proceso y, en concreto, de que éste obtenga los resultados esperados (objetivos). Es necesario que tenga capacidad de actuación y debe liderar el proceso para implicar y movilizar a los actores que intervienen.

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Límites del proceso: los límites del proceso están marcados por las entradas y las salidas, así como por los proveedores (quienes dan las entradas) y los clientes (quienes reciben las salidas). Esto permite reforzar las interrelaciones con el resto de procesos, y es necesario asegurarse de la coherencia con lo definido en la diagrama de propio mapa de procesos. La exhaustividad en la definición de las entradas y salidas dependerá de la importancia de conocer los requisitos para su cumplimiento. Alcance del proceso: Aunque debería estar definido por el propio diagrama de proceso, el alcance pretende establecer la primera actividad (inicio) y la última actividad (fin) del proceso, para tener noción de la extensión de las actividades en la propia ficha. Indicadores del proceso: Son los marcadores que permiten hacer una medición y seguimiento de cómo el proceso se orienta hacia el cumplimiento de su misión u objeto. Estos indicadores van a permitir conocer la evolución y las tendencias del proceso, así como planificar los valores deseados para los mismos. Variables de control: Se refieren a aquellos parámetros sobre los que se tiene capacidad de actuación dentro del ámbito del proceso (es decir, que el propietario o los actores del proceso pueden modificar) y que pueden alterar el funcionamiento o comportamiento del proceso, y por tanto de los indicadores establecidos. Permiten conocer a priori dónde se puede «tocar» en el proceso para controlarlo. Inspecciones: Se refieren a las inspecciones sistemáticas que se hacen en el ámbito del proceso con fines de contro del mismo. Pueden ser inspecciones finales o inspecciones en el propio proceso. Documentos y/o registros: Se pueden referenciar en la ficha del proceso aquellos documentos o registros vinculados al proceso. En concreto, los registros permiten evidenciar la conformidad del proceso de los productos con los requisitos. Recursos: Se pueden también reflejar en la ficha (aunque la organización puede optar en describirlo en otro soporte) los recursos humanos, la infraestructura y el ambiente de trabajo necesario para ejecutar el proceso.

Ficha de proceso Proceso (subproceso):

Código:

Misión: Procesos relacionados: Gestor (responsable o propietario):

Documentos asociados:

Límites del alcance:

Inicio: Contiene: Termina:

Entradas: Proveedores/Origen: Salidas: Clientes/Receptores: Sistema de seguimiento y medición: Recursos: -Humanos: -Equipos e infraestructura: Variables de control:

Indicadores:

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3.5. TIPOS DE PROCESOS EN EL LABORATORIO CLÍNICO_______________________________________ PROCESOS CLAVES U OPERATIVOS. De realización del producto o servicio. Son los que están en contacto directo con el cliente (Facultativo o Médico Clínico y los pacientes). Son los procesos operativos necesarios para la realización del servicio, a partir de los cuales el Facultativo o Médico Clínico y los pacientes percibirán y valorarán la calidad. Van a involucrar a un alto porcentaje de recursos del Laboratorio Clínico, son la razón de ser del Laboratorio Clínico y definen las actividades del mismo. Son el núcleo de la actividad del laboratorio. Algunos procesos operativos: — Preanalítico — Analítico — Postanalítico — Calibración — Control de calidad. PROCESOS ESTRATÉGICOS. De gestión. Tienen como finalidad el desarrollo de la misión, visión y valores del Laboratorio Clínico. Establecen, revisan y actualizan la política y estrategia. Definen la razón de existir del laboratorio. Lo que interesa conseguir. Algunos procesos estratégicos: — Revisión por la dirección — Gestión para la planificación y mejora continua — Atención al cliente — Diseño y desarrollo — Gestión de recursos humanos — Gestión de infraestructuras — Gestión del ambiente de trabajo PROCESOS DE SOPORTE O APOYO. Necesarios para la realización de los procesos estratégicos y clave. Dan apoyo a los procesos clave del Laboratorio Clínico. Son los responsables de proveer al Laboratorio Clínico de todos los recursos necesarios en cuanto a personas, equipos, etc., para poder generar el valor añadido deseado por los clientes (Facultativos o Médicos Clínicos). Hacen posible la eficiencia y efectividad de los procesos clave y estratégicos. Algunos procesos de soporte: — Facturación — Mantenimiento — Aprovisionamiento — Gestión de la documentación — Prevención y seguridad Según la fase cronológica del proceso general del laboratorio clínico los podemos clasificar en: PROCESOS PREANALÍTICOS. Fase preanalítica o premetrológica: Procesos que comienzan cronológicamente a partir de la petición del médico clínico e incluyen la petición de los análisis, la preparación del paciente, la toma de la muestra primaria y el transporte al laboratorio y terminan cuando comienza la fase analítica. PROCESOS ANALÍTICOS. Fase analítica o metrológica: Procesos directamente relacionados con la medida de una magnitud biológica. Incluyen el mantenimiento y calibración de equipos, los reactivos, la calibración, el control de calidad analítico y el análisis de las muestras. PROCESOS POSTANALÍTICOS. Fase postanalítica o postmetrológica: Procesos que siguen al análisis que incluyen la revisión y validación de los resultados, la elaboración del informe del laboratorio y su interpretación, autorización para entrega y transmisión de resultados, y el almacenamiento de las muestras.

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3.6. EL MAPA DE PROCESOS__________________________________________________ La manera más representativa de reflejar los procesos identificados y sus interrelaciones es precisamente a través de un mapa de procesos. Un mapa de procesos «es un conjunto de procesos óptimamente interrelacíonados necesarios para alcanzar los fines de una organización». «La agrupación de los procesos permite establecer analogías entre los mismos, al tiempo que facilita la interrelación y la interpretación del mapa en su conjunto». El mapa de procesos es una aproximación gráfica que define el Laboratorio Clínico como sistema de procesos interrelacionados. Ayuda a comprender mejor el Laboratorio, posibilita la mejora de la coordinación entre los diferentes elementos clave e introducir de una forma sistemática la gestión de procesos. Distingue los procesos estratégicos, clave y de soporte y da la oportunidad de seleccionar los procesos sobre los que actuar. El mapa de procesos impulsa al Laboratorio Clínico a poseer una visión más allá de sus límites geográficos y funcionales mostrando cómo sus actividades están relacionadas con los clientes, proveedores y grupos de interés. Debe incluir de manera particular los procesos identificados y seleccionados. Las agrupaciones permiten una mayor representatividad de los mapas de procesos, y además facilita la interpretación de la secuencia e interacción entre los mismos. Las agrupaciones serían macro-procesos que incluyen dentro de sí otros procesos. Uno de estos procesos se puede desplegar en otros procesos (subprocesos o procesos de 2.° nivel). Si fuese necesario se pueden emplear mapas de procesos «en cascada», en soportes diferentes pero vinculados entre sí.

PROCESOS ESTRATÉGICOS Organización del laboratorio

Política y objetivos de calidad

Planificación del sistema de calidad

Control documentos y registros

Definición cartera de servicios

Auditorías ACC. C. y P. mejora

PROCESOS CLAVE O DE REALIZACIÓN DE SERVICIOS PROCESOS ANALÍTICOS

PROCESOS PREANALÍTICOS

C L I E N T E

Petición analítica Peticiones

Control de calidad analítico

Toma de muestra Transporte Muestras

Análisis en equipos

Recepción Preparación Distribución

Muestras derivadas

Validación de los procesos

PROCESOS POSTANALÍTICOS R e s u l t a d o s

Elaboración del informe Validación del informe Firma y emisión Distribución

C L I E N T E

Ayuda a la interpretación

PROCESOS DE APOYO Gestión de personal

Gestión y mantenimiento de equipos

Salud y seguridad

Compras y almacén

Sistema de información

Análisis de datos

Gestión de archivo

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Laboratorio de Bioquímica Clínica - PROCESOS Cliente Cliente Paciente-Facultativo Paciente-Facultativo

Catálogo de pruebas Formulario de petición

Condiciones preanalíticas (preparación del paciente)

Petición analítica

Consultoría y asesoramiento Clasif. y distribución de las muestras

Recepción de muestras y peticiones

Registro de peticiones en el S.I.L.

Validación facultativa clínica

Toma de muestras

Transporte de muestras

Toma de muestras

Muestras para Laboratorios Externos

Manipulación de muestras

Informe de resultados

Transporte de muestras

Registro de peticiones Laboratorios Externos

Puesta en marcha de analizadores

Preparación de reactivos

Calibración de analizadores

Control de calidad analítico

Validación técnica

Diluciones, repeticiones, comprobaciones, …….

Revisión de resultados

Análisis de muestras

Registro de resultados en el S.I.L.

Resultados de Laboratorios Externos

Archivo de datos y de muestras

Preanalíticos ext. Preanalíticos int. Analíticos Postanalíticos Lab. Externos

Laboratorio de Bioquímica Clínica

Procesos: función - tiempo - actividad Función Tiempo

Cliente Paciente-Facultativo

Petición analítica Preparación del paciente

Enfermera

Auxiliar

Técnico

Administrativa

Consultoría y asesoramiento

Toma de muestras

Transporte y recepción de muestras

Registro de peticiones en el S.I.L.

Clasificación y distribución de las muestras

Registro de peticiones Laboratorios Externos

Muestras para Laboratorios Externos

Preparación de equipos calibración

Control de calidad

Análisis de muestras Validación técnica de resultados

Manipulación de muestras

Muestras para Laboratorios Externos

Registro de resultados en el S.I.L.

T10

Resultados de Laboratorios Externos

T11

Facultativo del Laboratorio

Archivo de muestras

Validación facultativa clínica

Informe de resultados

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3.7. REGISTROS Y TRAZABILIDAD______________________________________________ El laboratorio define los puestos de trabajo del personal, las tareas que conllevan y las rotaciones y sustituciones previstas con objeto de lograr la trazabilidad de los especímenes y los documentos a lo largo del todo el proceso analítico. Registro: anotación o apunte que proporciona evidencia objetiva de actividades realizadas o de resultados obtenidos y por lo tanto variable, que generalmente se hace en un impreso. Trazabilidad: capacidad para reconstruir, mediante registros, la historia de los procesos aplicados para llegar al resultado final. Metrológica: propiedad del resultado de una medición, o del valor de un patrón, que permite relacionado con referencias declaradas, generalmente patrones nacionales o internacionales, a través de una cadena ininterrumpida de comparaciones todas ellas con incertidumbres declaradas. En el laboratorio debe existir un sistema fiable y controlado de identificación de los productos que interveinen en el proceso. De esta manera se garantiza la identificación única de los productos y de su estado durante el proceso analítico. El sistema asegura la trazabilidad del proceso del laboratorio, ya que permite recuperar los datos de todos los procedimientos.

1. Muestra + Petición

2. Solución de la incidencia

2. Revisión

SÍ 3. Etiqueta identificación

6. Mantenimiento de equipos

• • • • • •

4. Introducción datos: Nº Identificación-Fecha Nombre y apellidos Nº historia clínica Fecha nacimiento Orientación diagnóstica Pruebas solicitadas

5. Realización prueb. analíticas

Copias seguridad

7. Reactivos - Controles - Calibraciones • •

9. Validac. resultados: Técnica Facultativa

8. Introducción resultados

9. Emisión informe de resultados

11. Archivo petición y muestras

Copias seguridad

9. Validación final

10. Impresión y envío informe de resultados

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Trazabilidad del proceso del laboratorio

1. El facultativo realiza la petición en los formatos establecidos y se toma la muestra. 2. Se revisa la petición y las muestras y en caso de incidencia, se anota en el registro de incidencias y se intenta solucionar telefónicamente. 3. Si la petición y los tubos no vienen con número de identificación, se procede a identificarlos con un número y un código de barras. La identificación única para cada paciente está garantizada con el control de las etiquetas utilizadas, de manera que no se puede utilizar dos veces la misma numeración. 4. Se introducen los datos de la petición al sistema informático del laboratorio: número de identificación y fecha, nombre y apellidos del paciente, número de C.I.P, fecha de nacimiento, peticionario, origen de la petición, orientación diagnóstica y pruebas solicitadas. 5. Se editan las listas de trabajo necesarias elaboradas por el sistema informático. 6. Las muestras se distribuyen a la zona de análisis y se realizan las pruebas analíticas solicitadas. Se realizan copias de seguridad de los resultados obtenidos en los autoanalizadores con una frecuencia diaria o semanal. 7. Existe un registro de todos los mantenimientos realizados en los instrumentos analíticos y auxiliares. 8. También quedan registrados en los analizadores las calibraciones/controles de las diferentes técnicas realizadas por el personal del laboratorio. Hay un registro de cambios de lotes. 9. Los resultados obtenidos son enviados directamente por el analizador al sistema informático, o se introducen manualmente en el sistema por el personal del laboratorio. Se realizan copias de seguridad de la información con una frecuencia diaria. 10. El personal técnico realiza la primera revisión de los resultados de las calibraciones y controles, según los grupos de trabajo establecidos. Se dispone de un cuaderno de registro de trabajo diario donde anotan los facultativos las actuaciones que consideren necesarias. Posteriormente, el personal facultativo se encarga de llevar a cabo la validación facultativa y la validación final del informe, según los grupos de trabajo establecidos. El registro de estas actividades puede ser informático o con la firma en la hoja de resultados. 11. Se envían los informes de resultados al cliente. Se registra la impresión de los resultados a nivel informático. Existen registros de incidencias postanalíticas. La petición y las muestras se guardan en los correspondientes archivos, desde los cuales pueden recuperarse durante el tiempo establecido. 12. Se archivan tanto las muestras como las peticiones y los informes.

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3.8. LA MEJORA DE PROCESOS_________________________________________________ Los datos recopilados del seguimiento y la medición de los procesos deben ser analizados con el fin de conocer las características y la evolución de los procesos. De este análisis de datos se debe obtener la información relevante para conocer: 1. Que procesos no alcanzan los resultados planificados 2. Donde existen oportunidades de mejora Cuando un proceso no alcanza sus objetivos, la organización deberá establecer las correcciones y acciones correctivas para asegurar que las salidas del proceso sean conformes, lo que implica actuar sobre las variables de control para que el proceso alcance los resultados planificados. Cuando en un proceso se aplica el ciclo de mejora continua (PDCA – Planificar-Hacer-Controlar-Recificar), se adoptan una serie de acciones que permiten ejecutar el proceso de forma que la capacidad del mismo, y por tanto su eficacia, aumente. A través de la verificación de las acciones adoptadas (etapa C del ciclo) se puede conocer si las mismas han servido para mejorar el proceso o no. En el caso de que las acciones sean eficaces, la última fase del ciclo de mejora debe materializarse en una nueva «forma estabilizada» de ejecutar el proceso, actualizándolo mediante la incorporación de dichas acciones al propio proceso. El ciclo no es más que una forma de estructurar el control del proceso y de entender el bucle de control. A la forma con la que se ejecuta el proceso se le puede denominar como el estándar del proceso. Con el proceso actualizado, su ejecución debe seguir SDCA que permita la ejecución, el control y, en general, la gestión del proceso.

Metodología para mejorar los procesos Ciclo Plan-Do-Check-Act Implantar la gestión por procesos Identificar los requerimientos del cliente Analizar el proceso actual Identificar áreas de problemas Buscar las causas Determinar las soluciones Implantar las soluciones Seguimiento Consolidación de las mejoras Continuación de la mejora

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3.9. LOS INDICADORES_______________________________________________________________ Indicador: «Datos o conjunto de datos que ayudan a medir objetivamente la evolución de un proceso o de una actividad». Los indicadores constituyen un instrumento que permite recoger de manera adecuada y representativa la información relevante respecto a la ejecución y los resultados de uno ó varios procesos, de forma que se pueda determinar la capacidad y eficacia de los mismos, así como la eficiencia. En función de los valores que adopte un indicador y de la evolución de los mismos a lo argo del tiempo, el laboratorio podrá estar en condiciones de actuar o no sobre el proceso (en concreto sobre las variables de control que permiten cambiar el comportamiento del proceso), según convenga. «Un indicador es un soporte de información (habitualmente expresión numérica) que representa una magnitud, de manera que a través del análisis del mismo se permite la toma de decisiones sobre los parámetros de actuación (variables de control) asociados». Existen diferentes tipos de indicadores, en función del criterio que se considere. Podemos hablar de: -

Según el nivel o tipo de proceso: Estratégicos, operativos o de apoyo. Según el tipo de objetivo: Financiero, atención al cliente. Según su finalidad: De control, de mejora. Según su interrelación: Causa-efecto.

En cuanto a las características de los indicadores: • • • • • • • • •

Referirse a procesos importantes o críticos Representar el objetivo a medir mediante una relación directa Ser cuantificables Ser rentables (relación coste/beneficio bajo) Ser estable en el tiempo para poder seguir su evolución Ser fiable Ser fácil de mantener y utilizar No interferir con otros indicadores Facilitar información en tiempo real

Los indicadores deben estar relacionados con objetivos del sistema de la calidad; por ello, se debe considerar en primer lugar las características de los objetivos: • • • • • •

Ser medibles, se tiene que conocer el grado de consecución de un objetivo Ser alcanzables, tienen que ser realistas Estar coordinados Presentar retos Involucrar a todo el personal implicado en el sistema de la calidad Poder llevarse a cabo en planes de actuación o planes de la calidad.

Importancia de los indicadores Importancia de los indicadores Si no se definen y calculan los indicadores, no se pueden medir. Si no se pueden medir, no se pueden controlar los procesos. Si no se pueden controlar los procesos, no se pueden mejorar.

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PROCESO / ÁREA

INDICADOR

Relación con clientes

Nivel de satisfacción del cliente

Relación con clientes

Reclamaciones

OBTENCIÓN DE DATOS INCIDENCIA

OBJETO Evaluar la información relativa a la percepción del cliente con respecto al cumplimiento de sus requisitos por parte del laboratorio. Evaluar la conformidad del cliente con respecto al cumplimiento de sus requisitos por parte del laboratorio.

Encuesta de opinión-satisfacción.

Reclamaciones escritas

Participación en eventos (sesiones, Relaciones externas congresos, cursos, poster, (sociedades científicas) ponencias, publicaciones)

Evaluar la actividad científica del personal facultativo del laboratorio.

Cartera de Servicios

Nuevas magnitudes

Actualizar el catálogo del laboratorio

Cartera de Servicios

Magnitudes obsoletas

Actualizar el catálogo del laboratorio

Mejora contínua

Informes de calidad realizados

Evaluar el funcionamiento del sistema de mejora contínua de la calidad

Errores de petición: cumplimentación y registro

Conocer el nivel de cumplimentación y registro adecuado de las peticiones.

Errores de petición: identificación

(A) Número de peticiones con Conocer los errores en la identificación incidencias asociadas a la de identificación de pacientes. (B) Número de pacientes total de peticiones

Preanalítica. Documentación. Petición. SEGURIDAD DEL PACIENTE Preanalítica. Documentación. Petición. SEGURIDAD DEL PACIENTE Preanalítica. Documentación. Toma de muestra. SEGURIDAD DEL PACIENTE Preanalítica. Toma, recepción, procesado, almacenamiento y conservación de la muestra. SEGURIDAD DEL PACIENTE Preanalítica. Logística. Transporte de muestras desde centros periféricos. SEGURIDAD DEL PACIENTE Preanalítica. Laboratorios externos. SEGURIDAD DEL PACIENTE Analítica Control de Calidad Interno (CCI). SEGURIDAD DEL PACIENTE Analítica Control de Calidad Interno (CCI). SEGURIDAD DEL PACIENTE Analítica Control de Calidad Interno (CCI). SEGURIDAD DEL PACIENTE Analítica Control de Calidad Interno (CCI). SEGURIDAD DEL PACIENTE Analítica Control de Calidad Interno (CCI). SEGURIDAD DEL PACIENTE Analítica Control de Calidad Interno (CCI). SEGURIDAD DEL PACIENTE

Fichas de actividades formativas y fichas individuales de formación.

ALGORITMO DE CÁLCULO Valoración de respuestas: de 2 a 10 puntos y si / no. Registro Total actividades anuales

(A) Número de parámetros nuevos incorporados. (B) Número de parámetros totales del catalogo. (A) Número de parámetros obsoletos eliminados del catalogo. (B) Número de parámetros totales del catalogo. (A) Informes realizados. (B) Número de incidencias que precisan apertura de informe de calidad

A x 100 / B

(A) Número de peticiones con errores de cumplimentación y/o registro. (B) Número total de peticiones

A x 100 / B

Conocer el nivel de cumplimentación (A) Instrucciones incumplidas en Instrucciones incumplidas pacientes por parte de los pacientes de las pacientes. (B) Número total de condiciones preanalíticas establecidas. peticiones

A x 100 / B

Adecuación de muestra

Conocer el % de peticiones con incidencias de muestra que impiden realizar las determinaciones

(A) Número de muestras con incidencias en toma o procesado. (B) Número total de muestras

A x 100 / B

Adecuación del transporte

Valorar la calidad del transporte de muestras desde los centros de extracción periféricos

(A) Número de envíos recibidos fuera de plazo, o con incidencias en transporte o temperatura en circuitos externos periféricos. (B) Número total de envíos

A x 100 / B

Adecuación de muestra y envío

(A) Número de muestras con Valorar la calidad del envío de muestras incidencias. (B) Número total de a laboratorios externos de referencia muestras enviados a laboratorios externos

A x 100 / B

Fiabilidad de resultados CCI. Laboratorio General

Conocer el error aleatorio (imprecisión) de los procedimientos de medida CCI (A) Resultados fuera de control del Laboratorio General según imprecisión. (B) Resultados totales especificaciones de calidad analítica.

A x 100 / B

Fiabilidad de resultados CCI. Laboratorio General

Conocer el error sistemático (sesgoveracidad) de los procedimientos de medida CCI del Laboratorio General según especificaciones de calidad analítica.

(A) Resultados fuera de control sesgoveracidad. (B) Resultados totales

A x 100 / B

Fiabilidad de resultados CCI. Laboratorio General

Conocer el error total analítico de los procedimientos de medida CCI del Laboratorio General según especificaciones de calidad analítica.

(A) Resultados fuera de control error total analítico. (B) Resultados totales

A x 100 / B

Fiabilidad de resultados CCI. Laboratorio de Urgencias

Conocer el error aleatorio (imprecisión) de los procedimientos de medida CCI (A) Resultados fuera de control del Laboratorio de Urgencias según imprecisión. (B) Resultados totales especificaciones de calidad analítica.

A x 100 / B

Fiabilidad de resultados CCI. Laboratorio de Urgencias

Conocer el error sistemático (sesgoveracidad) de los procedimientos de medida CCI del Laboratorio de Urgencias según especificaciones de calidad analítica.

(A) Resultados fuera de control sesgoveracidad. (B) Resultados totales

A x 100 / B

Fiabilidad de resultados CCI. Laboratorio de Urgencias

Conocer el error total analítico de los procedimientos de medida CCI del Laboratorio de Urgencias según especificaciones de calidad analítica.

(A) Resultados fuera de control error total analítico. (B) Resultados totales

A x 100 / B

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PROCESO / ÁREA

INDICADOR

OBJETO Conocer la inexactitud (desviación porcentual e índice de desviación estandar respecto a la media de consenso) de los procedimientos de medida CCE del Laboratorio General Conocer la inexactitud (desviación porcentual e índice de desviación estandar respecto a la media de consenso) de los procedimientos de medida CCE del Laboratorio de Urgencias

OBTENCIÓN DE DATOS INCIDENCIA

ALGORITMO DE CÁLCULO

(A) Número de resultados calificados como revisables (> 2s). (B) Número de resultados totales enviados.

A x 100 / B

(A) Número de resultados calificados como revisables (> 2s). (B) Número de resultados totales enviados.

A x 100 / B

Analítica Control de Calidad Externo (CCE). SEGURIDAD DEL PACIENTE

Fiabilidad de resultados CCE. Laboratorio General

Analítica Control de Calidad Externo (CCE). SEGURIDAD DEL PACIENTE

Fiabilidad de resultados CCE. Laboratorio de Urgencias

Analítica Control de Calidad Externo (CCE). SEGURIDAD DEL PACIENTE

Fiabilidad de resultados CCE. Laboratorio General y de Urgencias

Conocer el porcentaje de resultados fuera de los límites de las Especificaciones de Calidad Analítica según variación biológica (ECAvb). CCE

(A) Número de resultados fuera de los límites de especificación. (B) Número total de resultados enviados.

A x 100 / B

Analítica Funcionamiento de equipos. SEGURIDAD DEL PACIENTE

Paradas de equipos

Conocer la fiabilidad instrumental

Número de paradas de equipos >24 h por avería

Total paradas

Analítica. Validación técnica de resultados. SEGURIDAD DEL PACIENTE

Validación técnica

Asegurar la fiabilidad de los resultados analíticos obtenidos.

(A) Número de incidencias detectadas en validación técnica. (B) Número total de peticiones

A x 100 / B

Postanalítica. Validación facultativaclínica de resultados. SEGURIDAD DEL PACIENTE

Validación facultativa-clínica

Asegurar la fiabilidad de los resultados analíticos obtenidos.

(A) Número de incidencias registradas en validación facultativa-clínica. (B) Número total de peticiones

A x 100 / B

Postanalítica. Aportación de valor. SEGURIDAD DEL PACIENTE

Aportación de valor añadido

Conocer el nivel de valor añadido

(A) Número pruebas añadidas por facult. lab. (B) Número de comentarios no codificados añadidos por el facult. lab. (C) Número de peticiones

A+B/C

Informes: Incidencias total

Conocer la calidad de la gestión de informes analíticos de resultados.

(A) Número de informes con incidencias. (B) Número total de informes de resultados

A x 100 / B

Informes: Disponibilidad de resultados rutina

Conocer las incidencias en la entrega de resultados del Laboratorio General

(A) Número de determinaciones con incidencias por demora en laboratorio general. (B) Número total de determinaciones laboratorio general

A x 1000 / B

Informes: Disponibilidad de resultados urgencias

Conocer las incidencias en la entrega de resultados del Laboratorio de Urgencias

(A) Número de determinaciones con incidencias por demora en laboratorio de urgencias. (B) Número total de determinaciones laboratorio de urgencias

A x 1000 / B

Informes: Tiempo de respuesta analíticas urgentes

(A) Hora disponibilidad de resultado. Conocer la disponibilidad de resultados (B) Hora recepción de muestra en en el Laboratorio de Urgencias laboratorio de urgencias

Postanalítica Informe de resultados Fiabilidad documental. SEGURIDAD DEL PACIENTE Postanalítica Informe de resultados Tiempo de respuesta. SEGURIDAD DEL PACIENTE Postanalítica Informe de resultados Tiempo de respuesta. SEGURIDAD DEL PACIENTE Postanalítica Informe de resultados Tiempo de respuesta. SEGURIDAD DEL PACIENTE Postanalítica Informe de resultados Interpretación urgente. SEGURIDAD DEL PACIENTE

Comunicación urgente de resultados Conocer el nivel de comunicación de críticos resultados críticos

(A) Número de comunicaciones urgentes de valores críticos. (B) Número de peticiones con valor/es crítico/s.

A-B

A x 100 / B

Postanalítica Informe de resultados Laboratorios externos. SEGURIDAD DEL PACIENTE

Resultados laboratorios externos

(A) Número de resultados reclamados. Evaluar la gestión de los resultados de (B) Número pruebas enviadas a los laboratorios externos de referencia laboratorios externos

Suministros. Pedidos

Producto no conforme. Reclamaciones a proveedor o departamento de suministros.

Conocer nivel de incidencias en el suministro de material y reactivos

Número de incidencias

Número

Suministros. Almacenamiento

Material caducado.

Adecuación de la conservación y uso de material y reactivos.

Número de unidades de material consumible caducado y no agotado

Número

Equipos auxiliares

Temperatura fuera de rango de neveras y congeladores.

Controlar la calidad de la conservación de reactivos, material de calibración y control y de muestras. Evaluar el funcionamiento del Sistema Informático del Laboratorio (S.I.L.) y del departamento de informática. Evaluar el funcionamiento del Servicio de Mantenimiento-Electromedicina Conocer el nivel de formación continuada del personal facultativo del laboratorio

(A) Número de registros de temperatiura fuera de rango. (B) Número total de registros (A) Númerode incidencias de S.I.L. que producen parada del sistema (>1 h). (B) Número de días

Sistema Informático del Incidencias en S.I.L. Laboratorio (S.I.L.) Mantenimiento. Electromedicina

Mantenimiento de equipos e instalaciones.

Formación continuada

Horas de formación continuada

Actividad derivada a Laboratorios Externos

Número de pruebas derivadas

Conocer el nivel de autonomia del laboratorio

A x 100 / B

Número de reclamaciones al Servicio

Número

Número de horas de formación / Número personal facultativo

Número

(A) Número de determinaciones remitidas a Laboratorios Externos de Referencia. (B) Número total de determinaciones.

A x 100 / B

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3.10. PROCEDIMIENTOS NORMALIZADOS DE TRABAJO Y GENERALES. DOCUMENTOS DE TRABAJO______ Es un documento que describe las actividades para ejecutar las diferentes técnicas del laboratorio. Como lo hace el laboratorio. Se refiere generalmente a la identificación los equipos, al método operativo, las tareas de mantenimiento y las características analíticas de las magnitudes que determinan los equipos. Los procedimientos generales describen el funcionamiento de áreas del laboratorio y la gestión de la calidad. Apartados de un PNT Equipo Código del laboratorio Número de serie Fecha de instalación Ubicación Tipo de adquisición Contrato de mantenimiento Fabricante / Distribuidor Servicio técnico Técnico de aplicaciones Delegado Comercial Area analítica del laboratorio a la que está asignado Técnica analítica empleada Magnitudes analizadas Objeto Método operativo Mantenimiento (intervención, frecuencia y responsable) Documentación de referencia Registros asociados (registro, código impreso, lugar de archivo, responsable del archivo, tiempo de archivo) Ficha de magnitudes (magnitud, técnica, método, sistema analítico, tipo de muestra, reactivo, soluciones de calibración, control de calidad, especificaciones de calidad analítica, características analíticas, limitaciones e interferencias, procedimiento alternativo y última revisión).

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PNT

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PNT (continuación)

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Procedimiento General

Procedimiento General (continuación)

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Documentos de trabajo

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Procedimientos del Laboratorio de Bioquímica PNT

Procedimientos Generales

Analizador Cobas c711

Procedimiento de control de la documentación

Analizador Modular E

Procedimiento de control de los registros

Analizador Cobas e411-urg

Procedimiento de planificación estratégica de la calidad

Analizador Cobas e411-rut

Procedimiento de recursos humanos y formación

Analizador Cobas Integra 400 plus

Procedimiento de instrumental y mantenimiento

Analizador Urisys 2400

Procedimiento de desarrollo de nuevos proyectos

Analizador Cobas u411

Procedimiento de gestión de reactivos, material y compras

Analizador UF 1000i

Procedimiento de acciones correctivas y preventivas

Analizador ABL 835 flex

Procedimiento de control de dispositivos de medición

Analizador ABL 90 flex

Procedimiento de identificación y trazabilidad

Nefelómetro BN ProSpec

Procedimiento de área administrativa

Analizador Hydrasys

Procedimiento de preanalítica

Analizador Hyrys 2

Procedimiento de bioquímica general

Analizador HA-8160

Procedimiento de proteínas específicas

Analizador XT-4000i

Procedimiento de inmunidad

Analizador AP16 IF-BLOT

Procedimiento de alergia

Analizador ImmunoCAP 250

Procedimiento de hormonas

Osmómetro

Procedimiento de oncología

Analizador Triage Meter Pro

Procedimiento de cribado prenatal

Analizador Architect

Procedimiento de metabolismo

Analizador OC SENSORμ

Procedimiento de monitorización de fármacos y toxicología

Analizador RapidPoint 400

Procedimiento de urgencias

Test de gestación

Procedimiento de orinas

Sangre oculta en heces

Procedimiento de postanalítica

Pruebas serológicas de microbiología urgencias

Procedimiento de evaluación de satisfacción del cliente

Micropipetas automáticas

Procedimiento de auditorías internas

Centrífugas

Procedimiento de garantía de la calidad en el laboratorio

Microscopios

Procedimiento de control de producto no conforme

Termómetros digitales

Procedimiento de notificación urgente de valores críticos

Cámaras de recuento celular

Procedimiento de derivación a laboratorios externos

Dispositivo para el control de transporte de especímenes

Procedimiento de análisis de heces

Incubador de CO2

Procedimiento de análisis de semen

Placa Termostática

Procedimiento de sobrecarga oral de glucosa

Capacitación Espermática

Procedimiento de líquidos biológicos

Toma de muestras

Procedimiento de estudio de crioglobulinas

Sistema informático del laboratorio OMEGA v4

Procedimiento de control de transporte de especímenes

Gestor de sistemas de proceso de muestras PSM

Procedimiento de capacitación espermática

Programa de control de calidad analítico Unity Real Time 2

Procedimiento de análisis automatizado de semen SCA Procedimiento de índices séricos

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Capítulo 4. Material, reactivos y equipos básicos. Preparación de disoluciones.

Introducción 4.1. Material de vidrio 4.2. Material de plástico 4.3. Recipientes para preparar disoluciones 4.4. Utensilios para medir el volumen 4.5. Sustancias químicas, materiales de referencia y equipos de reactivos 4.6. Agua para el laboratorio clínico 4.7. Pipetas semiautomáticas y automáticas 4.8. Dispensadores 4.9. Diluidores 4.10. Balanzas 4.11. Baños 4.12. Centrífugas 4.13. Microscopios 4.14. Preparación de disoluciones 4.15. Diluciones 4.16. Disoluciones de concentración expresada en unidades físicas 4.17. Disoluciones de concentración expresada en unidades químicas 4.18. Disoluciones amortiguadoras

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INTRODUCCIÓN___________________________________________________________________ Los laboratorios clínicos emplean muchos utensilios y dispositivos para almacenar las disoluciones y los reactivos, y para producir reacciones. El material de vidrio, muy utilizado en el pasado, se ha sustituido, en gran parte, por material de plástico desechable. El equipamiento básico de un laboratorio clínico incluye pipetas de pistón, dispensadores, diluidores, centrífugas, balanzas, baños y microscopios. En este capítulo se describen los materiales, reactivos y equipos básicos que utilizan los laboratorios clínicos.

4.1. MATERIAL DE VIDRIO____________________________________________________________ Debido a su fácil limpieza, su inercia química y su transparencia, el vidrio ha sido el material fundamental para fabricar contenedores y recipientes para la preparación de disoluciones para el laboratorio. Generalmente, el material de vidrio del laboratorio es de borosilicato, que soporta altas temperaturas, aunque también existe otro tipo de vidrio que, a causa de su fragilidad, no puede calentarse y se utiliza para recipientes de almacenaje de productos o disoluciones. Estos últimos vidrios son algo más gruesos y presentan un color verdoso a la transparencia. El material de vidrio para bioquímica clínica debe lavarse con detergentes, aclararse con agua y pasarse luego por agua destilada. Para el lavado, hay lavadores automáticos programables, semejantes a los lavavajillas. Los recipientes deben colocarse con la boca hacia abajo, en las cubetas adecuadas, y el aclarado final ha de hacerse con agua desionizada. Terminado el lavado, el material se lleva a una estufa para secarlo. Cuando haya de usarse en determinadas técnicas, como la absorción atómica, el material requerirá tratamientos especiales. Asimismo, el material que se emplea en el laboratorio de hematología debe lavarse con sumo cuidado, extremándose la eliminación del detergente, que puede lisar los eritrocitos. También el material nuevo para el laboratorio de microbiología debe lavarse bien, y esterilizarse antes de utilizarlo. Conviene tratar el material de vidrio con lisol al 3%, y pasarlo por autoclave.

4.2. MATERIAL DE PLÁSTICO__________________________________________________________ Desde hace ya bastantes años, muchos de los utensilios utilizados en los laboratorios clínicos se construyen con este material. Los utensilios de plástico pueden ser de uso múltiple o de un solo uso. Hay muchos tipos de plástico, cada uno de ellos con sus características de resistencia química y propiedades físicas específicas. El polietileno y el polipropileno son plásticos que se emplean para la mayoría de los dispositivos desechables. El segundo tiene la ventaja de que resiste mayores temperaturas y puede esterilizarse. Por su parte, el primero es permeable al vapor de agua y aun en las botellas herméticamente cerradas puede producirse evaporación, lo que hace que aumente la concentración de los reactivos y calibradores. El teflón es casi químicamente inerte y resiste un amplio margen de temperaturas; el policarbonato es muy claro, por lo que suele utilizarse para recipientes graduados; y el cloruro de polivinilo es blando y flexible, y se usa para tubos de conducción. Cuando se empleen utensilios de plástico, debe tenerse en cuenta el tipo de plástico del que están construidos para no estropearlos, ya que muchos plásticos son atacados por disolventes orgánicos y ácidos o bases fuertes. También conviene señalar que muchos plásticos no soportan temperaturas elevadas, principalmente el calor seco, sin deformarse o descomponerse. Los utensilios de polietileno, polipropileno, policarbonato y teflón pueden lavarse en lavavajillas. Hay que evitar los detergentes abrasivos y los oxidantes fuertes.

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4.3. RECIPIENTES PARA PREPARAR DISOLUCIONES___________________________________________________ Los principales recipientes que se utilizan en los laboratorios clínicos para preparar disoluciones son los vasos y los erlenmeyers. VASOS Son recipientes cilíndricos (fig. A) no calibrados, cuyos volúmenes más corrientes son 50, 100, 500, 1.000, 2.000 y 5.000 mL. Los vasos de laboratorio suelen fabricarse con vidrios que soporten altas temperaturas, por lo que, para calentar su contenido, pueden ponerse en contacto con llamas de mecheros o placas de calefacción. También hay en el mercado vasos de plástico, pero suelen utilizarse menos. ERLENMEYERS Son recipientes no calibrados de forma cónica para reducir la evaporación de las sustancias contenidas (fig. B). Los volúmenes más corrientes y el material de construcción son los mismos que los de los vasos.

4.4. UTENSILIOS PARA MEDIR EL VOLUMEN_______________________________________________ Los principales utensilios para medir el volumen son los matraces aforados, las probetas, las buretas y las pipetas. MATRACES AFORADOS Son recipientes (fig. C) que, cuando están llenos hasta la marca indicadora, contienen a la temperatura indicada un volumen exacto. Se utilizan para preparar disoluciones de una concentración dada. Los volúmenes más frecuentes son 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 y 1.000 mL, y se construyen con materiales análogos a los de los vasos y los erlenmeyers. Los matraces aforados han de llenarse hasta la señal, de modo que el menisco producido por el líquido tangente queda en la parte superior de la marca indicadora (ver fig.). Como se utilizan estos matraces para preparar disoluciones, una vez producido el enrase, deben invertirse varias veces para completar el proceso de mezclado. PROBETAS Las probetas (fig. D) son recipientes cilíndricos estrechos y graduados, que se emplean para medir volúmenes, generalmente superiores a los 25 mL. Las más utilizadas en los laboratorios tienen volúmenes que van desde 10 mL hasta varios litros. La graduación se realiza con subdivisiones de cien porciones del volumen total. Hay que señalar que, en las probetas, las apreciaciones del volumen no son muy exactas y han de leerse con el menisco que produce el líquido tangente por la parte superior de la marca del volumen deseado. BURETAS Las buretas (fig. E) son tubos largos, graduados y con una llave de paso en uno de los extremos, y se emplean para dispensar con exactitud volúmenes de líquido a un contenedor. PIPETAS Las pipetas (ver fig.) son instrumentos que se utilizan para suministrar pequeños volúmenes de líquido, inferiores a 20 mL, y exactos. Hay dos tipos de pipetas: las volumétricas y las graduadas. Las primeras suministran un volumen fijo de líquido, mientras que las graduadas pueden suministrar volúmenes variables. Las pipetas que más se usan en los laboratorios son las de dispensación. Las pipetas de soplado deben vaciarse totalmente soplando por el extremo sobre su contenido. Existen también pipetas de doble enrase, en las que el volumen que quiere dispensarse queda contenido entre dos marcas en el vidrio. Cuando se utilizan las pipetas, la regla de oro es no aspirar nada a la boca. Las pipetas se sujetan con los dedos pulgar, medio y anular. Su llenado se realiza aspirando con la boca, hasta superar la marca del volumen que quiere dispensarse; entonces se tapa la abertura superior con el dedo índice, que se afloja o libera para

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dejar que fluya el líquido hasta la marca. Alcanzada esta, se vuelve a apretar el dedo índice, se lleva la pipeta al recipiente y se separa el citado dedo de la abertura superior, dejando que caiga el líquido. Antes de utilizar una pipeta conviene lavarla con pequeñas porciones de la disolución que va a dispensarse para asegurar que se elimina cualquier residuo que quede en ella.

Recipientes que se utilizan en los laboratorios

Pipetas

Forma de observar el menisco que producen los líquidos cuando se enrasan los matraces aforados, las pipetas y las probetas.

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4.5. SUSTANCIAS QUÍMICAS, MATERIALES DE REFERENCIA Y EQUIPOS DE REACTIVOS_______________ SUSTANCIAS QUÍMICAS Las sustancias químicas que se emplean en los laboratorios clínicos pueden tener diferentes grados de pureza. Los solutos y disolventes que han de usarse para las técnicas de análisis deben ser de grado reactivo. Algunas técnicas analíticas, como la cromatografía de gases, la cromatografía líquida de alta resolución, la fluorimetría y la absorción atómica, requieren reactivos con un alto grado de pureza. Existe un amplio abanico de denominaciones para este tipo de reactivos y deben consultarse los catálogos de las casas suministradoras. MATERIALES DE REFERENCIA Los materiales de referencia son sustancias que poseen propiedades físicas y químicas establecidas para que puedan utilizarse como calibradores, para verificar un método de medición o para asignar valores. Materiales de referencia primarios Son sustancias químicas muy puras, que pueden pesarse o medirse directamente y proporcionar una disolución cuya concentración se conozca con exactitud. La International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) ha propuesto un grado de pureza del 99,98% para los materiales de referencia primarios. Materiales de referencia secundarios Son aquellos cuyos valores se han asignado mediante un proceso formal de transferencia de valor a partir de un material de referencia primario. Se utilizan para asignar valores a los materiales de referencia terciarios. Materiales de referencia certificados Son aquellos cuyo valor se ha certificado mediante un procedimiento técnicamente válido. EQUIPOS DE REACTIVOS Un kit o equipo de reactivos es un conjunto de dos o más reactivos que se emplean para determinar una sustancia y se suministran juntos en un envase con las instrucciones del procedimiento. Los kits de reactivos pueden utilizarse para hacer determinaciones manuales o con un instrumento o analizador automático en particular. Inicialmente, los equipos de reactivos se fabricaban para su uso general en el laboratorio y se adaptaban fácilmente a cualquier sistema analítico, tanto manual como automático. Sin embargo, en los últimos años, las empresas que fabrican reactivos para los laboratorios clínicos están sacando al mercado equipos de reactivos cada vez más cerrados, de forma que sólo puedan usarse con un sistema específico, por lo que modificar los equipos comerciales es cada vez más difícil. No obstante, estos equipos tienen ventajas, especialmente que las técnicas requieren una intervención cada vez menor de los operadores, lo que hace que disminuyan los errores. Entre sus inconvenientes está que estos equipos generalmente son más caros.

4.6. AGUA PARA EL LABORATORIO CLÍNICO_______________________________________________ En los laboratorios, la sustancia química que más se usa es el agua. Esta se utiliza para preparar la mayoría de los reactivos y de las disoluciones que se emplean en los laboratorios clínicos. Es muy difícil obtener, y más difícil aún conservar, agua totalmente pura, ya que absorbe CO2 e iones metálicos procedentes del aire y de los recipientes que la contienen. La forma más corriente de expresar la pureza del agua es indicar su resistividad específica, que es la resistencia que tiene cuando se coloca en un recipiente cúbico de 1 cm de lado, y se expresa en megaohmios (MΩ) por centímetro. Cuanto menor sea la cantidad de sustancias ionizables, menor será la conductividad y, por tanto,

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mayor la resistividad. Se emplea el término agua de grado reactivo, seguido de la concreción del tipo (de I a III). De esta forma se define las especificaciones del agua, con independencia del método de preparación. Los principales métodos para obtener agua de buena calidad son: • Destilación. Es una técnica física para purificar el agua que la convierte en vapor que luego se condensa, a la vez que se retienen las sustancias no volátiles contenidas en el agua original —como las impurezas inorgánicas y orgánicas y los microorganismos— que, de esta forma, se eliminan. En cambio, la destilación no consigue el mismo resultado con las impurezas volátiles, como el CO2, el cloro, el amoníaco y algunos compuestos orgánicos. • Desionización. Se logra al pasar agua a través de resinas de intercambio iónico. Los cambiadores pueden ser de aniones o de cationes, pero nunca de ambos simultáneamente. Al pasar el agua por la columna que contiene las resinas cambiadoras, las impurezas iónicas contaminantes se cambian por los iones H+ y OH-, localizados en la superficie de las resinas, que quedan retenidas en la columna. Las resinas cambiadoras pueden utilizarse en unidades separadas que cambien aniones o cationes, o en unidades mixtas que contengan una mezcla de resinas cambiadoras aniónicas y catiónicas. Con el uso, las resinas van perdiendo su capacidad de intercambio, pero pueden regenerarse tratándolas con ácidos o bases. • Osmosis inversa. Es un proceso por el que se fuerza el agua a pasar a través de una membrana semipermeable que actúa como un filtro molecular. La membrana elimina entre el 95 y el 99% de la materia orgánica, las bacterias y las demás materias particuladas, y entre el 90 y el 97% de todos los minerales ionizados o disueltos. Sin embargo, elimina menos las impurezas gaseosas. Aunque el proceso no es adecuado para producir agua de grado reactivo para el laboratorio, puede emplearse como método preliminar de purificación. • Oxidación ultravioleta. La radiación ultravioleta de 254 nm elimina muchas bacterias y rompe muchos compuestos orgánicos ionizantes que posteriormente pueden eliminarse por desionización. En general, ningún proceso de purificación de agua proporciona por sí solo agua que cumpla las rígidas especificaciones del agua de grado reactivo de tipo I. Por esto, se emplean diversas combinaciones de los procesos de purificación. Los sistemas más utilizados en los laboratorios clínicos para obtener agua de calidad combinan la desionización y la destilación, de forma que se eliminen tanto los iones como las sustancias orgánicas no volátiles. El agua de tipo III (resistividad de 0,1 MΩ/cm) se emplea para lavar el material de vidrio y para algunos procesos cualitativos. El agua de tipo II (resistividad de 1 MΩ/cm) se usa para la mayoría de las pruebas de laboratorio; y el agua de tipo I (resistividad de 10 MΩ/cm), para métodos como la absorción atómica.

4.7. PIPETAS SEMIAUTOMÁTICAS Y AUTOMÁTICAS_________________________________________ Las pipetas semiautomáticas se cargan y descargan merced a la acción del dedo pulgar sobre un pistón, en cuyo extremo opuesto se coloca una punta de plástico desechable o un capilar. Las automáticas son iguales, pero la carga y descarga se consigue con un motor incorporado a la pipeta. El volumen que puede aspirarse y dispensarse puede ser fijo o variable, dependiendo del tipo de pipeta. Los volúmenes de las pipetas están comprendidos entre 0,5 y 10 µl. Con estas pipetas se evita la succión de los líquidos biológicos y el consiguiente riesgo de contagio de enfermedades, y de disolventes orgánicos u otros líquidos que produzcan vapores tóxicos o sean venenosos. En la figura se muestra una pipeta semiautomática de pistón y se presentan las tres posiciones que puede adoptar el émbolo: la normal de reposo, la intermedia de aspiración y la de presión a fondo de dispensación. Estas pipetas se cargan apretando el émbolo hasta la posición intermedia y luego se afloja la presión para llenar la punta. Para descargarlas, se aprieta el émbolo hasta el fondo. Algunas tienen acoplado un dispositivo para expulsar la punta de plástico una vez utilizada. Existen también pipetas multicanal que permiten dispensar simultáneamente diversas muestras.

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Pipeta de pistón y émbolo con sus tres posiciones: normal de reposo, intermedia y de presión a fondo.

4.8. DISPENSADORES_______________________________________________________________ Son sistemas que proporcionan repetidamente un volumen seleccionado. Los dispensadores se usan sobre todo para añadir reactivos a lotes de especímenes reaccionantes. Hay en el mercado diferentes modelos con una amplia gama de volúmenes de uso. Los más empleados suelen dispensar entre 0,1 y 15 mL, con una precisión de alrededor del 1%. Algunos poseen cabezas que permiten acoplarlos a cualquier boca de contenedor. En la figura se muestra de forma esquemática un dispensador y un detalle de la cabeza con el émbolo.

Dispensador y detalle de la cabeza con el émbolo, donde se muestran el selector de décimas de mililitro y el selector de mililitros.

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4.9. DILUIDORES___________________________________________________________________ Son sistemas que producen diluciones de especímenes y de reactivos en las proporciones elegidas con un sistema de impulsión automático o manual. De forma general, los diluidores constan de dos sistemas de impulsión ajustables: en uno se selecciona el volumen del espécimen y en el otro el del diluyente. Los sistemas que hay a la venta poseen una gran precisión y son muy útiles en el laboratorio. En la figura se muestra un diluidor automático.

Diluidor automático

4.10. BALANZAS___________________________________________________________________ La masa es una propiedad invariable de la materia, y el peso es una función de la masa en que influye la fuerza de la gravedad, de forma que peso = masa x gravedad. Las balanzas son sistemas de análisis que se usan para medir la masa, en los que se compara la masa desconocida con una masa conocida; a esta comparación se denomina pesada. En la práctica, los términos masa y peso se usan de forma sinónima. Existe una gran variedad de balanzas que pueden tener uno o dos platillos: • Balanzas de dos platillos. Poseen un fiel con dos brazos de igual longitud. Para la pesada se van añadiendo pesas a uno de los platillos hasta compensar el peso del objeto colocado en el otro. • Balanzas de un platillo. Tienen los dos brazos de diferente longitud. El objeto que hay que pesar se coloca en el platillo unido al brazo corto, y se van aplicando fuerzas al otro brazo, de forma mecánica o electrónica., hasta restablecer el fiel en su posición nula. En la figura se muestra una balanza de este tipo.

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Las balanzas que más se utilizan en los laboratorios son las electrónicas de un solo platillo. El espécimen que quiere pesarse se coloca en el platillo, que se desplaza hacia abajo con una fuerza igual al producto de la masa del espécimen por la aceleración de la gravedad. La balanza detecta este movimiento hacia abajo y genera una fuerza contraria que equilibra la anterior por medio de un sistema electromagnético. La corriente necesaria para producir esta fuerza es proporcional a la masa del espécimen. Las balanzas analíticas características pesan hasta 200 g y tienen una sensibilidad de unos 10 µg. Algunas microbalanzas pueden pesar un máximo de 5 g, con una sensibilidad de 0,1 µg. Para pesos grandes se utilizan balanzas de un solo platillo, con tara automática, denominadas granatarios. Suelen pesar hasta 1 o 2 Kg y tienen una sensibilidad de 0,1 mg. Las balanzas deben colocarse en lugares protegidos de las corrientes de aire, el calor y los humos corrosivos. Es fundamental situarlas en soportes sólidos para evitar al máximo las vibraciones. Suelen ponerse sobre bloques que asientan en los cimientos del edificio. Disponen de un sistema de nivelación, generalmente de burbuja, que debe comprobarse siempre antes de realizar las pesadas. Asimismo, en las microbalanzas con compartimento de pesada cerrado, debe pesarse siempre con las puertas cerradas, y la adición del producto que se pese debe hacerse con la balanza en la posición de descanso.

4.11. BAÑOS______________________________________________________________________ Los baños (ver fig.) son recipientes que contienen un líquido cuya temperatura puede ajustarse. Los más corrientes son los de agua y se utilizan para incubar a una temperatura ajustable menor de 100 °C. En los laboratorios clínicos, la temperatura de incubación más habitual es de 37 °C. Los baños suelen disponer de sistemas de agitación para mantener la temperatura uniforme en todo el recipiente. De acuerdo con la calidad de los baños, los niveles de variación de la temperatura de medida van desde ± 1 °C hasta ± 0,1 °C. Hay baños especiales que llevan como líquido aceites pesados, que se usan para calentar a temperaturas altas. Asimismo, hay bloques metálicos termostatizados, con temperatura ajustable y orificios de diferentes tamaños, para colocar los tubos o recipientes que contengan las mezclas que se quieran incubar.

Baño de agua

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4.12. CENTRÍFUGAS_________________________________________________________________ La centrifugación es una técnica de separación que se basa en el movimiento de las partículas impulsadas por una fuerza denominada centrífuga, que tiende a desplazarlas lejos del centro de rotación. Esta técnica separa las partículas de un espécimen, de acuerdo, fundamentalmente, con su masa y su forma. No obstante, la fuerza centrífuga que actúa sobre una partícula depende también de la velocidad y del radio de giro, que es la distancia desde el centro de rotación hasta el extremo del recipiente donde está contenido el espécimen que se centrifuga. Con el fin de reproducir las condiciones de centrifugación, la aceleración centrífuga suele expresarse como una aceleración relativa, o sea, múltiplos de la aceleración de la gravedad - g -. De esta forma, en cualquier centrífuga pueden reproducirse con exactitud las condiciones de centrifugación. Las centrífugas más sencillas consisten en un motor eléctrico que lleva unido un vástago que soporta el cabezal o rotor donde se colocan los recipientes con los especímenes. Hay dos tipos principales de rotores: • Rotores horizontales. Bajo la acción de la fuerza centrífuga los tubos giran libremente y se colocan en posición horizontal, de forma que la separación se produce paralela al eje de rotación. • Rotores angulares. Los tubos están fijos y la separación se produce con un componente doble: hacia la pared lateral y hacia el fondo del tubo En la figura se muestra una centrífuga. Estos aparatos tienen un reóstato, por medio del cual se controla la velocidad de giro. Asimismo, la mayoría de las centrífugas disponen de sistemas de frenado que entran en funcionamiento cuando cesa la acción del motor que mueve el vástago con el cabezal. En algunos sistemas se invierte la polaridad de este motor para que genere una fuerza eléctrica de sentido opuesto al de giro y, de esta manera, se produzca el frenado.

Las centrífugas más completas poseen sistemas de control de la temperatura para ajustaría de acuerdo con lo que se centrifugue. Este tipo de centrífugas se denominan, de forma general, refrigeradas, ya que, normalmente, lo que se desea son temperaturas bajas para conservar en buenas condiciones el espécimen, pues el rozamiento de la centrifugación produce calor. Las centrífugas con velocidades de giro elevadas (ultracentrífugas) llevan sistemas de vacío del compartimento donde se aloja el rotor, a fin de evitar el rozamiento.

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4.13. MICROSCOPIOS________________________________________________________________ Los microscopios ópticos son sistemas de lentes que se utilizan para ampliar los objetos. En los laboratorios, estos microscopios se emplean para observar células, microorganismos y cristales en una gran variedad de medios biológicos. COMPONENTES DE UN MICROSCOPIO Todos los microscopios tienen una estructura con un brazo y una base (ver fíg. ). A esta estructura se unen las demás partes. La plataforma donde se coloca lo que quiere observarse se denomina platina y puede moverse mediante un botón. En la base de la mayoría de los microscopios hay una fuente de luz. Su lámpara posee un regulador de voltaje para variar la intensidad de la luz. Casi todos los microscopios disponen de algún sistema para reducir la intensidad.

Los botones de ajuste grueso y ajuste fino, situados de forma concéntrica a los lados del microscopio, se emplean para enfocar los objetos que se observan. En los microscopios binoculares pueden cambiarse la distancia entre los oculares y realizarse ajustes para las dioptrías de cada ojo. De esta forma pueden observarse imágenes nítidas con ambos ojos. El sistema óptico de los microscopios consta de un objetivo, un ocular y un condensador . Objetivo Los objetivos son sistemas de lentes de aumento que se clasifican según su distancia focal, que es la que hay entre el frente de la lente y el objeto cuando la primera está enfocada. Los objetivos más corrientes son los de 10x, 20x, 40x y 100x de ampliación. La apertura numérica de un objetivo determina su poder de resolución. La apertura numérica es igual a: A = n sen α donde n = índice de refracción del medio; α = la mitad del ángulo de apertura del objetivo.

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De acuerdo con su empleo, los objetivos se clasifican en: • Secos. Se utilizan directamente, de forma que lo único que se interpone entre el objetivo y el espécimen es el aire. • De inmersión. Necesitan un líquido entre el objetivo y el espécimen. Se utilizan diversos aceites, de los que el más empleado es el aceite de cedro, que posee un índice de refracción igual al del cristal. • Acromáticos. Utilizan lentes que eliminan la aberración cromática. Esta distorsión se debe a que la luz blanca es separada por las lentes en sus componentes, por lo que el contorno de las imágenes da unas franjas coloreadas. • Apocromáticos. Usan lentes que eliminan la aberración esférica. Esta se produce por ser la refracción de la luz mayor en los bordes de la lente que en el centro, lo que distorsiona la imagen. Ocular Los oculares son lentes que amplifican más la imagen formada por el objetivo. Su ampliación es constante, de modo que cuanto mayor sea la distancia entre el objetivo y el ocular (longitud óptica del tubo), mayor será la amplificación del objetivo: • Los oculares más usados son los de Huygens, que constan de dos lentes simples (planoconvexas), la más baja de las cuales recoge la imagen y la enfoca débilmente sobre el plano del diafragma fijo. Este tipo de oculares no corrigen perfectamente los colores ni el aplanamiento del campo. • Los oculares de Ramsden se componen de dos o tres lentes. • Los oculares compensadores son oculares muy corregidos para reducir las aberraciones cromática y de esfericidad del objetivo. Los primeros microscopios que se construyeron eran monoculares, pero en la actualidad la mayoría de los que usan los laboratorios son binoculares, lo que requiere un sistema de prismas que desdoblen los rayos luminosos. Condensador Los condensadores, que están debajo de la platina, concentran la luz sobre el objeto situado en la platina del microscopio. Suelen construirse con dos lentes (condensador de Abbe), que han de estar bien corregidas, como las de los objetivos, y deben poseer la misma apertura numérica que los objetivos con los que vayan a usarse. Los condensadores pueden moverse hacia arriba y hacia abajo mediante un botón situado debajo de la platina. Por lo general, llevan acoplado un diafragma, para controlar el cono de luz que pasa a través del objeto, y unos filtros. RESOLUCIÓN La capacidad de amplificación de un microscopio viene dada por su poder de resolución, que es la distancia entre dos puntos separados que pueden distinguirse como tales. El poder de resolución se relaciona con la longitud de onda de la luz empleada y la apertura numérica, mediante la expresión: d = λ / 2A La resolución óptima de los mejores microscopios con objetivos de inmersión es de unos 0,2 µm. Para conseguir el máximo poder de resolución de un sistema de lentes deben tenerse en cuenta los factores siguientes: • Hay que colocar un filtro azul sobre la fuente de luz, ya que las longitudes de onda cortas de la luz azul proporcionan la resolución máxima. • El condensador debe situarse en la posición más alta, donde permite entrar la máxima cantidad de luz al objetivo. • El diafragma no ha de centrarse demasiado pues, aunque el centrado mejore el contraste, reduce la apertura numérica. • Debe utilizarse aceite de inmersión entre el soporte del espécimen y el objetivo de 100x.

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CONTRASTE Por desgracia, la mayoría de los especímenes biológicos, las células y sus componentes son transparentes, de forma que no existe contraste o diferencia de intensidad con el medio y se observan mal con el microscopio. La solución más inmediata a este problema es teñir los especímenes que se vayan a observar, aplicando compuestos coloreados que se fijen o reaccionen con determinados componentes de las células. Se han utilizado también otros métodos para producir contraste y obtener una información cuantitativa de la observación microscópica. Entre ellos están la microscopía de campo oscuro, la de contraste de fase y la de fluorescencia. Microscopía de campo oscuro La microscopía de campo oscuro produce el contraste por la observación de los especímenes sobre un fondo oscuro. Los objetos se iluminan por medio de rayos de luz oblicuos que no atraviesan el objetivo. Esto se consigue colocando un diafragma de estrella en la ranura de filtros del condensador. Este dispositivo tiene un disco opaco en el centro que bloquea los rayos de luz centrales. Si se sustituye el disco opaco por discos de celuloide de color, se obtienen fondos de color azul, rojo, etc. Con la iluminación de campo oscuro que use un disco opaco deben considerarse los puntos siguientes: • La técnica ha de limitarse al estudio de estructuras grandes que puedan verse fácilmente con una ampliación baja, ya que con este método es difícil conseguir una buena resolución con los objetivos de mayor amplificación. • Hay que abrir el diafragma y utilizar la mayor cantidad de luz posible. • Debe centrarse el disco opaco de la forma más precisa. • Se ha de mover el condensador hacia arriba y hacia abajo para conseguir los mejores efectos. Microscopía de contraste de fase La microscopía de contraste de fase se basa en la conversión de pequeñas diferencias del índice de refracción, que presenta el objeto que se observa, en diferencias de brillo. El microscopio de contraste de fase se distingue del microscopio óptico de campo brillante en que tiene otro tipo de diafragma y una placa de fase. El diafragma consta de un disco anular que sólo permite pasar un cono hueco de rayos de luz a través del condensador hacia el objeto. La placa de fase es un disco óptico especial situado en el plano focal posterior del objetivo. Posee un anillo de fase sobre ella que avanza o retarda los rayos de luz directos un cuarto de longitud de onda. Microscopía de fluorescencia La microscopía de fluorescencia aprovecha los fenómenos de fluorescencia para producir el contraste. Los componentes fundamentales de un microscopio de fluorescencia son; la fuente de luz, el filtro de calor, el filtro de excitación, el condensador y el filtro de barrera: • La fuente de luz es una lámpara de arco de vapor de mercurio. • Los rayos generados por esta lámpara producen una cantidad de calor considerable, y para eliminarlos se usa un filtro que absorbe calor (filtro de calor) y deja pasar los rayos ultravioleta y la mayoría del espectro visible. • Una vez enfriada tras pasar por el filtro de calor, la luz atraviesa el filtro de excitación, que absorbe todas las longitudes de onda excepto las cortas, necesarias para excitar el fluorocromo situado en el objeto que va a observarse. Este filtro es muy oscuro y está diseñado para dejar pasar sólo los rayos verde, azul, violeta y ultravioleta. • Asimismo, se emplea un condensador de campo oscuro para conseguir el mejor contraste de un objeto fluorescente en el campo microscópico. Debe tenerse en cuenta que la fluorescencia débil de un objeto en un campo brillante sería difícil de ver. De este modo, el fondo oscuro producido por el condensador de campo oscuro proporciona el contraste deseado. Otra ventaja de este tipo de condensador es que desvía la mayoría de los rayos ultravioleta, lo que protege los ojos del observador. Para conseguirlo, la apertura numérica del objetivo será siempre 0,05 menor que la del condensador. • El filtro de barrera se encuentra entre el objetivo y el ocular, y elimina el resto de la luz de excitación, de forma que sólo se observe la fluorescencia.

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4.14. PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES__________________________________________________ Una disolución es una mezcla homogénea de una o varias sustancias que se denominan solutos, dispersadas de forma molecular en una cantidad suficiente de un medio disolvente. Con frecuencia deben prepararse en el laboratorio clínico disoluciones y reactivos. Asimismo, en muchas ocasiones hay que diluir los especímenes o los reactivos. En los apartados siguientes se describe de forma práctica cómo se realizan las diluciones y cómo se preparan disoluciones, de concentración expresada en diferentes unidades físicas y químicas. También se describe la preparación de disoluciones amortiguadoras.

4.15. DILUCIONES__________________________________________________________________ La dilución de especímenes y reactivos se realiza muy a menudo en los laboratorios. Expresa la relación de una disolución en un volumen total. Así, por ejemplo, una dilución 1:5 contiene un volumen de una disolución original en un volumen total de 5. La fórmula: V x c = V´ x c' (donde V = volumen de la disolución concentrada; c = concentración de la disolución concentrada; V´ = volumen de la disolución diluida; c' = concentración de la disolución diluida) es la más utilizada para preparar diluciones. Por ejemplo, para diluir un espécimen de suero 1:10, se toma un volumen del espécimen (0,1 mL, 1 mL, etc.) y se añaden 9 volúmenes del diluyente (0,9 mL, 9 mL, etc. ).

4.16. DISOLUCIONES DE CONCENTRACIÓN EXPRESADA EN UNIDADES FÍSICAS_____________________ Las unidades físicas que expresan la concentración de las disoluciones se basan en magnitudes físicas como la masa y el volumen. Son las unidades clásicas para expresar la concentración, que se recomienda sustituir por las unidades químicas. A continuación se relacionan las más utilizadas. PORCENTAJE EN PESO El porcentaje en peso expresa la cantidad de soluto presente en 100 g de disolución. Para preparar las disoluciones cuya concentración se exprese así, se pesa el soluto y el disolvente en un equivalente a 100. Por ejemplo, se mezclan 5 g de sulfato de cobre y 95 g de agua y de este modo se obtiene una disolución de sulfato de cobre del 5% (peso/peso). PORCENTAJE EN VOLUMEN Indica la cantidad de soluto en 100 mL de una disolución y se utiliza cuando el soluto y el disolvente sean líquidos. Por ejemplo, una disolución alcohólica del 40% contiene 40 volúmenes de alcohol en 100 volúmenes de disolución. Para preparar un litro de esta disolución se toman 400 mL de etanol absoluto y se ponen en un matraz aforado de 1000 mL (1 L) , que se enrasa con agua destilada. PESO DE SOLUTO POR UNIDAD DE VOLUMEN DE DISOLUCIÓN La expresión que se utiliza más frecuentemente son los gramos por litro (g/L). En los laboratorios clínicos se emplea con frecuencia la expresión miligramo por 100 mL o decilitro (mg/dL). Por ejemplo, una disolución de cloruro sódico de 9 g/L contiene 9 g de cloruro sódico en 1 L de disolución; para preparar 1 L de esta disolución se pesan 9 g de NaCl, se colocan en un matraz aforado de 1 L y se añade agua destilada hasta la marca de enrase.

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PARTES POR MILLÓN (PPM) Son cocientes de masa de gramos de soluto en un millón de gramos de espécimen. Por ejemplo, una disolución que contenga 320 ppm de Cr tendrá 320 µg/mL

4.17. DISOLUCIONES DE CONCENTRACIÓN EXPRESADA EN UNIDADES QUÍMICAS___________________ Las unidades químicas que expresan la concentración de las disoluciones se basan en las magnitudes químicas cantidad de sustancia y equivalente-gramo. El uso de estas magnitudes se fundamenta en que las sustancias reaccionan entre ellas mol a mol o equivalente a equivalente. MOLARIDAD Una disolución molar (M) es la que contiene un mol de soluto en un litro de disolución. Un mol de una sustancia es su peso molecular en gramos. Así, una disolución 1 M de NaCl (peso molecular de 58,5) contiene 58,5 g de NaCl en 1 L de disolución. Si se desea obtener 250 mL de una disolución 0,2 M de NaCl, deberán pesarse: (58,5 x 0,2) / (1.000/250) = 2,925 g de NaCl, deberán colocarse en un matraz aforado de 250 mL y añadir agua destilada hasta la marca de enrase. Cuando se quiera preparar una disolución de concentración molar a partir de un líquido, habrá que tener en cuenta la densidad y la riqueza en peso del producto de partida. Por ejemplo, se va a preparar 500 mL de ácido sulfúrico 2 M a partir de ácido sulfúrico concentrado comercial de una densidad de 1,80 g/mL y una riqueza en peso del 98%. En primer lugar, debe calcularse la concentración molar del ácido sulfúrico concentrado. De acuerdo con la riqueza en peso, en cada 100 g de ácido sulfúrico concentrado hay 98 g puros; por otro lado, y de acuerdo con la densidad, 1 L (1.000 mL) pesa 1.800 g. Se tiene entonces 100/98 = 1.800/x y x = 98 x 1.800 / 100 = 1.764 g/L y la disolución contiene 1.764 g/L. Como el peso molecular del ácido sulfúrico es 98, la molaridad del ácido sulfúrico concentrado es 1.764/98 = 18 M. Para preparar los 500 mL de ácido sulfúrico 2M a partir del concentrado (18 M), se aplica la fórmula de dilución: V x 18 = 500 x 2, y V = (500 x 2) / 18 = 27,8 mL Se toman 27,8 mL del ácido sulfúrico comercial concentrado (18 M) y se llevan a un matraz aforado de 500 mL, que se enrasa con agua hasta la marca. ¡Cuidado, al principio nunca debe añadirse agua sobre ácido sulfúrico concentrado, sino siempre ácido sulfúrico sobre agua!. Así, en este caso se pondría agua destilada en el matraz aforado, por ejemplo unos 400 mL, y luego se añadiría el ácido sulfúrico concentrado. Una vez añadido todo el ácido, se enrasaría en 500 mL con agua destilada. NORMALIDAD Una disolución normal (N) es la que contiene un equivalente-gramo de un soluto en 1L de disolución. El equivalente-gramo de una sustancia es igual a su peso molecular dividido por su valencia, expresado en gramos. Cuando la valencia de una sustancia sea 1, sus disoluciones poseerán la misma molaridad y normalidad. Por ejemplo, una disolución de ácido clorhídrico 1 M es también 1 N. Sin embargo, en el ácido sulfúrico, que tiene valencia 2, una disolución 1 M es 2 N. La molaridad y la normalidad están relacionadas por esta fórmula: N = Mxv

donde v = valencia de la sustancia.

Una disolución que contenga 55 g/L de cloruro cálcico de peso molecular 111 y valencia 2 será 1 N. Si se quisiera preparar 500 mL de una disolución 0,3 N de dicho cloruro, habría de pesarse: (0,3 x 55) / (1.000/500) = 8,25 g de cloruro calcico, llevarlos a un matraz aforado de 500 mL y añadir agua destilada hasta la marca de enrase.

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Cuando se trata de líquidos, como ya se vio en el caso de la molaridad, debe considerarse la riqueza en peso y la densidad. Por ejemplo, para preparar 500 mL de ácido sulfúrico 0,25 N a partir de ácido sulfúrico comercial concentrado de densidad 1,8 g/mL y riqueza en peso del 98% —que, como ya se ha dicho, es 18 M—, se debe calcular primero la concentración normal, que será 18 x 2 = 36 N. Aplicando la fórmula de la dilución: 500 x 0,25 = V x 36, V = 500 x 0,25/36 = 3,47 mL. Se toman 3,47 mL de ácido sulfúrico concentrado (36 N), se colocan en un matraz aforado de 500 mL que contenga agua destilada hasta aproximadamente la mitad —recuérdese que al principio no debe añadirse agua sobre ácido sulfúrico concentrado, sino siempre el ácido sulfúrico concentrado sobre el agua— y se lleva hasta el enrase con más agua destilada.

4.18. DISOLUCIONES AMORTIGUADORAS________________________________________________ Las disoluciones amortiguadoras o buffer son sistemas que admiten pequeñas adiciones de ácidos o bases, sin que se altere el pH de la disolución. Los amortiguadores están formados por una disolución de un ácido o de una base débil y un exceso de su base o de su ácido conjugado, respectivamente. Consideremos una disolución de un ácido débil con una constante de equilibrio Ka: AH ↔ A- + H+ Ka = [ A- ] x [ H+ ] / [ AH ] Despejando [ H+ ] tenemos: [ H+ ] = Ka x [ AH ] / [ A- ] Tomando logaritmos decimales: log [ H+ ] = log Ka + log ([ AH ] / [ A- ]) Y cambiando el signo: - log [ H+ ] = - log Ka - log ([ AH ] / [ A- ]) pH = p Ka + log ([ A- ] / [ AH ]) Es la ecuación de Henderson-Hasselbalch, que relaciona las concentraciones de las especies acida y básica de un ácido o una base débil con el pH de la disolución. Un amortiguador característico es el ácido acético/acetato. A continuación se explica la forma de preparar 1L de un amortiguador de acetato sódico 0,1 M de pH 5. El pKa del ácido acético es 4,75, su peso molecular 60 y el del acetato sódico 82. De acuerdo con la ecuación de Henderson-Hasselbalch: 5 = 4,75 + log [acetato] / [acético] log [acetato] / [acético] = 5 - 4,75 = 0,25 [acetato] / [acético] = antilog 0,25 [acetato] / [acético] = 1,78 Por lo tanto, 1,78 es la relación entre las concentraciones de acetato sódico y de ácido acético, de forma que las concentraciones que den esta relación producirán un amortiguador de pH 5. Como la concentración del amortiguador solicitada es 0,1 M, tenemos un sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas: [acetato] + [acético] = 0,1 [acetato] / [acético] = 1,78 [acetato] = 1,78 [acético] 1,78 [acético] + [acetato] = 0,1 2,78 [acético] = 0,1 [acético] = 0,1 / 2,78 = 0,036 [acético] = 0,036 mol/L x Pm = 0,036 mol/L x 60 g/mol = 2,16 g/L [acetato] = 1,78 x 0,036 mol/L = 0,0641 mol/L x 82 g/mol = 5,26 g/L Se pesan 2,16 g de ácido acético y 5,26 g de acetato sódico, y se llevan a un matraz aforado de 1L, al que se añade agua destilada hasta enrasarlo. Los amortiguadores que más se emplean en los laboratorios clínicos son los de acetato, carbonato/bicarbonato, fosfato, tris y veronal.

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Capítulo 5. Conceptos metrológicos. Magnitudes. Unidades. Sistemas y especímenes. Resultados

Definición de metrología 5.1. Tipos de magnitud 5.2. Unidad (de medida) 5.3. El sistema internacional de unidades 5.4. Valor y resultado 5.5. Sistema biológico 5.6. Componente 5.7. Magnitud bioquímica 5.8. Nomanclatura sistemática 5.9. Proceso de medida 5.10. Escalas de medición 5.11. Sistemas, especímenes y muestras 5.12. Resultados y unidades

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DEFINICIÓN DE METROLOGÍA______________________________________________________________ La metrología es el conjunto de conocimientos relativos a las medidas. Abarca tanto los aspectos teóricos como los prácticos, independientemente del grado de exactitud de las mediciones y del ámbito de la ciencia o de la tecnología donde se producen.

5.1. TIPOS DE MAGNITUD____________________________________________________________ El tipo de magnitud es el concepto abstracto de una propiedad común a numerosos fenómenos. El volumen, la concentración catalitica y el contenido de sustancia son algunos ejemplos de tales propiedades. Por convención, algunos de esos tipos de magnitud se consideran independientes los unos de los otros y se los denomina básicos; los demás tipos de magnitudes se considera que son funciones de los básicos y se los denomina derivados. En la tabla se exponen los tipos de magnitud básicos y los principales tipos de magnitud derivados desde el punto de vista bioquimico-clinico. En bioquimica clinica son útiles varios tipos de magnitud que no pertenecen a los básicos ni a los derivados; reciben el nombre de arbitrarios. Son ejemplos de tipos de magnitud arbitrarios la concentración de sustancia arbitraria (expresada en unidades internacionales por litro) y algunas características como el aspecto o el color, a los que corresponden valores pertenecientes a escalas nominales. TIPOS DE MAGNITUD BÁSICOS Y DERIVADOS Tipos de Magnitud

Abreviatura

Unidad

Magnitudes básicas Longitud

long.

Masa

Cantidad de sustancia

sust.

mol

Tiempo

tiempo

s, d

Magnitudes derivadas Actividad catalítica

act.cat.

kat

Caudal de masa

caudal masa

kg/s, kg/d, kg/h

Caudal de número (de entidades)

caudal núm.

1/s, 1/d, 1/h

Caudal de sustancia

caudal sust.

mol/s, mol/d, mol/h

Caudal de volumen

caudal vol.

L/s, L/d

Concentración (de actividad) catalítica

c.cat.

kat/L

Concentración de masa

c.masa

kg/L

Concentración de número (de entidades)

c.núm.

1/L

Concentración de sustancia

c.sust.

mol/L

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Magnitudes derivadas Contenido (de actividad) catalítico/a

cont.cat.

kat/kg

Contenido de sustancia

cont.sust.

mol/kg

Densidad relativa

dens. rel.

Fracción de masa

fr.masa

Fracción de número (de entidades)

fr.núm.

Fracción de saturación

fr.sat.

Fracción de sustancia

fr.sust.

Fracción de volumen

fr.vol.

Número (de entidades)

núm.

Osmolalidad

mol/kg

Tensión de gas (presión parcial)

tensión

Volumen

vol.

Magnitudes arbitrarias Concentración catalítica arbitraria

c.car.arb.

arb.u./L

Concentración de sustancia arbitraria

c.sust.arb.

arb.u./L, int.u./L

5.2. UNIDAD (DE MEDIDA)____________________________________________________________ Las magnitudes se expresan en unidades de medida. Los resultados de las mediciones se expresan con un número y una unidad. La unidad identifica la dimensión de la propiedad medida, mientras que el número indica las veces que contiene la propiedad. Las unidades del sistema métrico son las más utilizadas en los laboratorios clínicos. Inicialmente, tenían como referencia la longitud, la masa y el tiempo. El primer sistema absoluto se denominó CGS y tenía como unidades básicas el centímetro, el gramo y el segundo. Posteriormente, se empleó el sistema MKS, que se basaba en el metro, el kilogramo y el segundo. En 1960, el Comité Internacional de Pesas y Medidas aceptó el Sistema Internacional de Unidades (SI). Este sistema tiene dos clases de unidades: básicas y derivadas. UNIDADES BÁSICAS Corresponden a ocho magnitudes físicas fundamentales, de dimensiones independientes, que son la longitud, la masa, el tiempo, la temperatura, la cantidad de sustancia, la corriente eléctrica, la intensidad de luz y la actividad catalítica (ver tabla): 1. La unidad de longitud es el metro, que se define como la longitud igual a 1.650.763,73 veces la longitud de onda en el vacío de la radiación correspondiente a la transición entre los niveles 2p10 y 5d5 del átomo de kriptón 86. 2. La unidad de masa es el kilogramo, igual a la masa del prototipo internacional de la Oficina Internacional de Pesas y Medidas. 3. La unidad de tiempo es el segundo, que se define como la duración de 9.192.631,770 veces el período de la radiación correspondiente a la transición entre los niveles hiperfinos del estado basal del átomo de cesio 133.

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4. La unidad de temperatura termodinámica es el Kelvin, que se define como la fracción 1/273,16 del punto triple del agua. La unidad grado Celsius equivale exactamente al Kelvin. 5. La unidad de cantidad de sustancia es el mol, que se define como la cantidad de sustancia de un sistema que contiene tantas entidades elementales como átomos hay en 0,012 kg de carbono 12. Cuando se utiliza el mol deben especificarse las entidades elementales, que pueden ser átomos, moléculas, iones, electrones u otras partículas. 6. La unidad de intensidad de corriente eléctrica es el amperio, que se define como la corriente que, mantenida en dos conductores paralelos rectos, de longitud infinita y sección circular insignificante, y colocados con un metro de separación, producen entre ellos una fuerza igual a 2x10 -7 N/m. 7. La unidad de intensidad de luz es la candela, que se define como la intensidad luminosa en dirección perpendicular de una superficie de 1/600.000 m2 de un cuerpo negro, a la temperatura del platino helado, bajo una presión de 101.325 N/m2. 8. Como unidad de actividad catalítica se define el katal (mol/s), que es la cantidad catalítica de cualquier catalizador, incluidas las enzimas, que cataliza una velocidad de reacción de un mol por segundo. Existe una relación constante entre la Unidad Internacional (1 mol/min) y el katal (1 mol/s), de forma que, para transformar un valor de unidades internacionales a nmol/s, se multiplica por 16,67.

Unidades básicas del Sistema Internacional (SI) La aplicación de las unidades SI proporciona algunas veces valores muy grandes o muy pequeños cuyo uso es engorroso. Para evitarlo se utilizan múltiplos o submúltiplos. Las unidades del SI pueden ir precedidas de un prefijo indicador del factor por el que están multiplicadas; los nombres y símbolos de los prefijos se encuentran en la siguiente tabla.

Múltiplos y submúltiplos del Sistema Internacional de Unidades

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UNIDADES DERIVADAS Se forman con dos o más unidades básicas, algunas de las cuales reciben nombres especiales. Hay también unidades no encuadradas en el SI que se utilizan con unidades de este sistema. Las principales, corresponden al tiempo (minuto, hora y día) y al volumen (litro y decilitro). Estas unidades se utilizan con profusión en los laboratorios clínicos. En España, la mayoría de estos todavía utiliza las unidades convencionales para expresar los resuJtados. Para transformar estos valores en unidades SI, basta multiplicar por un factor de conversión.

Magnitudes y unidades básicas y derivadas

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5.3. EL SISTEMA INTERNACIONAL DE UNIDADES, SI__________________________________________ El sistema internacional de unidades, conocido por las siglas SI, es el sistema coherente de unidades adoptado y recomendado por la Conferencia General de Pesos y Medidas. Dicho sistema es una versión ampliada del sistema Giorgi o MKS, inventado por el fisico e ingeniero italiano Giovanni Giorgi a partir del sistema métrico decimal que se creó en Francia a finales del siglo XVIII. En el año 1977 la 30ª Asamblea Mundial de la Salud aprobó el uso del SI en las ciencias de la salud. En la tabla anterior se exponen las unidades del SI correspondientes a los tipos de magnitud básicos y a los derivados con más interés bioquimico-clínico. Listado de algunas magnitudes bioquímicas de uso habitual en el laboratorio, unidades convencionales (U.C.), unidades del Sistema Internacional (U.S.I.) y factores de conversión. Para pasar de U.C. a U.S.I. se debe multiplicar (X) por el factor correspondiente. Para pasar de U.S.I. a U.C. se puede multiplicar (X) por el factor correspondiente, o dividir por el factor utlizado para pasar de U.C. a U.S.I. Unid. factor factor Unid. Unid. S.I. Conv. X X Conv. Albúmina g/dL 10 g/L 0,10 g/dL Bilirrubina mg/dL 17,1 μmol/L 0,0585 mg/dL Calcio mg/dL 0,250 mmol/L 4,01 mg/dL Cianocobalamina (vit B12) pg/mL 0,738 pmol/L 1,36 pg/mL Colesterol mg/dL 0,0259 mmol/L 38,66 mg/dL Creatinina mg/dL 88,4 μmol/L 0,0113 mg/dL Estradiol pg/mL 3,67 pmol/L 0,273 pg/mL Folato ng/mL 2,266 nmol/L 0,441 ng/mL Fosfato mg/dL 0,323 mmol/L 3,097 mg/dL Glucosa mg/dL 0,0555 mmol/L 18,02 mg/dL Hemoglobina g/dL 0,621 mmol/L 1,61 g/dL Inmunoglobulina G mg/dL 0,01 g/L 100 mg/dL Magnesio mg/dL 0,411 mmol/L 2,431 mg/dL Proteínas Totales g/dL 10 g/L 0,10 g/dL Testosterona ng/mL 3,47 nmol/L 0,288 ng/mL Tiroxina libre (FT4) ng/dL 12,872 pmol/L 0,077688 ng/dL Triglicéridos mg/dL 0,0113 mmol/L 88,5 mg/dL Urato mg/dL 59,5 μmol/L 0,0168 mg/dL Urea mg/dL 0,167 mmol/L 6,006 mg/dL FACTORES DE CONVERSIÓN PARA UNIDADES ENZIMÁTICAS Unidad Factor X Unidad U/L (conv.) 0,0167 μkat/L μkat/L (S.I.) 60 U/L FACTORES DE CONVERSIÓN PARA UNIDADES DE GASES mmHg 0,133 kPa kPa 7,502 mmHg MAGNITUD

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5.4. VALOR Y RESULTADO_____________________________________________________________ El valor es la característica, numérica o no numérica, de una magnitud. Las características numéricas, llamadas cuantías, se expresan como el producto de un número y de una unidad de medida, mientras que las características no numéricas se expresan con una palabra, una letra o cualquier otro símbolo. Son ejemplos de valores: 2,3 mmol/L, 2 g, > 100 μkat/L, turbio (el aspecto), característico (el olor), etc. El valor atribuido a una propiedad particular mediante su observación, o a una magnitud particular mediante su medición, se denomina resultado.

5.5. SISTEMA BIOLÓGICO_____________________________________________________________ Los sistemas son conjuntos de elementos interdependientes. Cuando los elementos interdependientes son entidades biológicas, el sistema se llama sistema biológico, como en el caso de un conjunto de tejidos o de aparatos de idéntica naturaleza, o de un conjunto de órganos que realizan la misma función o bien se complementan en un determinado proceso orgánico. Son ejemplos de sistemas biológicos: una persona, el sistema digestivo, la hipófisis, la sangre, los leucocitos (considerados individual o conjuntamente), la orina emitida durante un día, etc. A veces importa destacar que un sistema determinado forma parte de un sistema mayor llamado supersistema, como por ejemplo las proteinas (sistema) que forman parte de un determinado tejido (supersistema). En la tabla siguiente se presentan los sistemas biológicos más estudiados desde el punto de vista bioquímico-clínico, y los códigos correspondientes para escribirlos de forma abreviada, si es necesario.

PRINCIPALES SISTEMAS BIOLÓGICOS DE INTERÉS BIOQUÍMICO-CLÍNICO sistema cálculo urinario eritrocitos espermatozoides heces gas glándula tiroides glándulas paratiroides glándulas suprarrenales glomérulos hemoglobina hipófisis hipotálamo intestino leucocitos líquido amniótico líquido ascítico líquido cefalorraquídeo

símbolo CUr Ers Spz Fae Gas Thy Pth Adr Glo Hb Hph Hpt Int Lks LAm LAs LCR

sistema líquido pericárdico líquido pleural líquido sinovial orina ovarios paciente páncreas plasma plasma seminal proteina riñón saliva sangre semen suero sudor túbulos renales

símbolo LPe LPl LSi Uri Ova Pac Pan Pla PSe Prt Ren Slv San Sem Srm Sud Tub

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Otros símbolos que pueden acompañar algunos sistemas en la descripción de magnitudes biológicas

arterial antes de la administración capilar día en ayunas después de la administración por vía oral postprandial venosa

a a.a. c d i p.a. p.o. p.p. v

5.6. COMPONENTE__________________________________________________________________ Los componentes son los elementos interdependientes de un sistema. Un componente puede ser tanto una entidad fisica como un proceso. Así, son ejemplos de componentes: la hemoglobina (Fe) (de la sangre), la fosfatasa alcalina (del plasma), el líquido filtrado (por los glomérulos), la secreción de cortisol (por las glándulas suprarrenales) o la tolerancia a la glucosa (por un paciente).

5.7. MAGNITUD BIOQUÍMICA__________________________________________________________ Las magnitudes son propiedades medibles de los sistemas. Cuando el sistema es un sistema biológico y la propiedad considerada cae dentro del ámbito de la bioquímica, la magnitud se denomina magnitud bioquímica. Para el estudio bioquímico-clínico de un paciente es interesante medir, según los casos, magnitudes relacionadas con alguna de las entidades físicas que componen un sistema (como la concentración de sustancia de colesterol en suero) o magnitudes relacionadas con alguno de los procesos que se producen en un sistema (como la secreción hipofisaria de tirotropina tras administrar TRH). Sin embargo, aún no se han descrito métodos para medir rutinariamente in vivo las magnitudes relacionadas con procesos bioquímicos de interés clínico. En estos casos, como aproximación al conocimiento del valor de dichas magnitudes, se miden magnitudes relacionadas con las sustancias que intervienen en el proceso; así, la secreción hipofisaria de tirotropina se calcula determinando la concentración de tirotropina en suero antes, y un tiempo después, de administrar TRH. Hay magnitudes bioquímicas que se miden porque el conocimiento de su valor tiene interés per se, como por ejemplo la concentración sérica de ion sodio; hay otras que se miden porque el conocimiento de su valor, aunque no tenga interés per se, revela alguna alteración orgánica, como por ejemplo la concentración catalítica de alanina-aminotransferasa en suero.

5.8. NOMENCLATURA SISTEMÁTICA_____________________________________________________ Para que una magnitud bioquímica esté perfectamente caracterizada, hay que describir el sistema, el componente considerado dentro del sistema (aunque en algunos casos no se considere ninguno en particular y, por lo tanto, no haga falta describirlo) y el tipo de magnitud estudiado.

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1. El sistema es el medio en que se encuentra el componente. Los principales sistemas que emplean los laboratorios clínicos son la sangre, el suero, el plasma, la orina y otros líquidos biológicos. 2. El componente es lo que se mide. 3. El tipo de magnitud es la propiedad que se mide. La Federación Internacional de Química Clínica y la Unión Internacional de Química Pura recomiendan realizar la descripción sistemática de una magnitud bioquímica según el siguiente modelo:

Sistema ‒ Componente; tipo de magnitud

que en algunos casos se puede simplificar suprimiendo el componente: Sistema ‒ Tipo de magnitud como en los ejemplos siguientes: Paciente (día) ‒ Orina; volumen = Orina (día) ‒ Volumen Sangre (arteríal) ‒ Plasma; pH = Plasma (arterial) ‒ pH No obstante, es recomendable emplear las formas de la izquierda de las igualdades con el objeto de uniformar la descripción de las magnitudes. En este sistema está admitido escribir de forma abreviada, mediante los códigos o símbolos admitidos, tanto el sistema como el tipo de magnitud; el componente, en cambio, deberá escribirse siempre sin abreviar. La nomenclatura de los componentes sigue las recomendaciones de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUP AC), de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB) y, en el caso de los fármacos, de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Las magnitudes más empleadas en los laboratorios clínicos son: concentración de sustancia, concentración de sustancia arbitraria, concentración de masa, concentración catalítica y concentración de número. Ejemplo de nomenclatura de magnitudes bioquímicas Magnitud Bioquímica

unidad SI

Srm‒Glucosa; concentración de sustancia

mmol/L

Srm‒Apolipoproteina B; concentración de masa

g/L

Srm‒Aspartato-aminotransferasa; concentración catalítica

µkat/L

Srm‒Inmunoglobulina G; concentración de masa

g/L

Srm‒Ión sodio; concentración de sustancia

mmol/L

Srm‒Tirotropina; concentración de sustancia

mUI/L

Srm‒Digoxina; concentración de sustancia

nmol/L

Pla‒Amonio; concentración de sustancia

mmol/L

Pla‒Lactato; concentración de sustancia

mmol/L

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Magnitud Bioquímica

unidad SI

aPla‒Dióxido de carbono; tensión (37ºC)

kPa

Pla(aSan)‒Ión hidrógeno; pH (37ºC);

Uri‒Metilcetona; concentración de sustancia arbitraria (0, 1, 2, 3, 4, 5) u. arb. Uri‒Leucocitos; c.arb. (<10, 10-20, 21-50, >50)

Pac(Uri)(día)‒Excreción de creatinina; caudal sust.

mmol/d

Uri‒Coriogonadotropina; concentración de sustancia arbitraria Pac‒Tolerancia a la glucosa; prop.arb. (tras la ingesta de 50 g de glucosa p.o.) expresado por: Pla‒Glucosa; c.sust. (a los 60 min)

UI/L mmol/L

Prefijos y sufijos Los prefijos más usados habitualmente son: – Hiper…. (superioridad, exceso, aumento) – Hipo…. (inferioridad, defecto, disminución) Los sufijos más utilizados son: – …..emia (relativo a la sangre) – …..uria (relativo a la orina) Ejemplos: • Hiperglucemia (aumento de la concentración de glucosa en sangre) • Hipocalcemia (disminución de la concentración de calcio en suero) • Glucosuria (glucosa en orina) • Fosfaturia (fosfato en orina)

5.9. PROCESO DE MEDIDA____________________________________________________________ A continuación se describen los principales términos relacionados con el proceso de medida de una magnitud: 1. Un análisis es un proceso que proporciona información física o química sobre los constituyentes de un espécimen. Los análisis pueden ser cualitativos o cuantitativos. En los primeros se identifica la presencia de una sustancia en un espécimen. Los cuantitativos son aquellos en los que se determina la cantidad de una sustancia dada en un espécimen. 2. Una medida es la determinación experimental de las propiedades físicas o químicas de una sustancia. 3. Una técnica es cualquier principio físico o químico que puede utilizarse para estudiar una sustancia. Entre las que se usan en los laboratorios clínicos están las espectroscópicas, las electroquímicas, las cromatográficas/ las electroforáticas y las microscópicas. 4. Un método es la aplicación de una técnica para determinar una sustancia específica en una determinada matriz. Por ejemplo, la medición de colesterol en suero puede realizarse mediante un método espectroscópico de punto final, y las catecolaminas en la orina pueden determinarse por otro de cromatografía líquida de alta eficacia. 5. Un procedimiento es un conjunto escrito de instrucciones que detalla la aplicación de un método. Este no conduce necesariamente a un único procedimiento, ya que puede realizarse de diversas maneras. 6. Finalmente, un protocolo es un conjunto de instrucciones escritas estrictas que concretan el procedimiento que debe seguirse.

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La medición (o determinación) es el conjunto de operaciones mediante las cuales se asigna un valor a una magnitud. El procedimiento que se utiliza para realizar la medición determina el conjunto de valores que se puede obtener para aquella magnitud. Los valores de este conjunto se llaman valores posibles (desde el punto de vista metrológico, puesto que pueden no serlo desde el punto de vista biológico), y el conjunto se llama escala de medición. Así, al medir la concentración de sustancia de glucosa en orina con unas tiras reactivas concretas, los valores posibles son ≤ 2, 3, 5, 15 y > 30 mmol/L, mientras que si se mide mediante un método espectrométrico los valores posibles son los correspondientes a todos los números racionales comprendidos dentro del intervalo analítico del método empleado (el número de cifras significativas depende de la imprecisión).

5.10. ESCALAS DE MEDICIÓN___________________________________________________________ El valor asignado a una magnitud mediante una medición puede pertenecer a cuatro tipos de escala: Escala nominal La escala nominal es un conjunto de valores, cada uno de los cuales sólo tiene un nombre o símbolo. Los valores son independientes de la cuantía de la magnitud observada. Ejemplos de magnitudes cuyos valores pertenecen a escalas nominales son: - Paciente - Semen; aspecto (característico; otro). - Paciente - Cálculo urinario; tipo (cistina, fosfato de amonio y magnesio (n), carbonato de calcio (n), oxalato de calcio(n)). Escala ordinal La escala ordinal es un conjunto de valores, cada uno de los cuales se representa con números o palabras o con combinaciones de números y palabras. Los valores están ordenados respecto a la cuantía de la magnitud observada. Ejemplos de magnitudes cuyos valores pertenecen a escalas ordinales son: - Orina - Glucosa; concentración de sustancia (≤2, 3, 5, 15, > 30 mmol/L). - Heces - Hemoglobina (Fe); contenido de sustancia arbitrario (0,1). Escala de intervalos o de diferencias La escala de intervalos o de diferencias es un conjunto de valores, cada uno de los cuales es el producto de un número por una unidad, ordenados de acuerdo con su cuantía. Las diferencias entre los valores son iguales a las diferencias entre las cuantías de las magnitudes observadas. En esta escala el cero es arbitrario. A esta escala pertenecen los grados Celsius de temperatura, pero le corresponden muy pocas magnitudes bioquímicas; el único caso destacable es: - Plasma (arterial) - Base (grupos enlazados de H+); diferencia de concentración de sustancia (tradicionalmente conocida como exceso de base). Escala racional La escala racional es un conjunto de valores, cada uno de los cuales es el producto de un número por una unidad, ordenados por orden de cuantia. A las razones entre los números de la escala, les corresponden las mismas razones entre las cuantías de las magnitudes observadas. En esta escala el cero es absoluto. Los valores de la inmensa mayoría de magnitudes bioquímicas pertenecen a esta escala.

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5.11. SISTEMAS, ESPECÍMENES Y MUESTRAS______________________________________________ Los sistemas biológicos son conjuntos de entidades biológicas interdependientes. Los sistemas biológicos que presentan interés bioquímico-clínico son aquellos en los que se producen cambios bioquímicos medibles relacionados con procesos patológicos. De algunos de esos sistemas se estudian los componentes moleculares (como en el caso del suero o de la orina), mientras que de otros normalmente se estudian los procesos moleculares (como en el caso de los órganos). En casi todos los casos hay que estudiar dichos procesos indirectamente, recurriendo a algún componente molecular de otro sistema. A algunos sistemas, como la orina o la saliva, se puede acceder directamente con facilidad, a otros se accede con métodos mínimamente cruentos (sangre, líquido cefalorraquídeo), mientras que existen otros a los que sólo se puede acceder con métodos cruentos, tales como biopsias (músculo esquelético, hígado, etc.). Por otra parte, las mediciones de las magnitudes bioquímicas por regla general no se realizan tomando la totalidad del sistema en estudio, sino que sólo se toma una porción, llamada espécimen, representativa del mismo. Espécimen: La IUPAC define espécimen como una porción de material original especialmente seleccionada, procedente de un sistema dinámico y de la cual se asume que es representativa del material original en el momento de obtenerla. (La IUPAC recomienda que no se utilice el término muestra como sinónimo de espécimen). Al espécimen también se le puede denominar muestra primaria. Muestra: Procede de una manipulación del espécimen que lo convierte en muestra (ej: centrifugación). Se refiere a la muestra tal y como se va a analizar. EJEMPLO: Un volumen de suero tomado de un volumen mayor del mismo. Los sistemas (y los supersistemas) son, desde el punto de vista del muestreo, los materiales (o poblaciones) originales de los que se ha de seleccionar una porción para su estudio. A veces el espécimen tomado directamente del paciente coincide con el sistema; así, para medir la magnitud Sangre - Hemoglobina (Fe); concentración de sustancia, el espécimen que se necesita es la sangre (en rigor, la coincidencia no es total, ya que a la sangre se le añade un anticoagulante); otras veces el espécimen coincide con el supersistema, como ocurre con la sangre para la medición de (Sangre) hemoglobina - Glicohemoglobina; fracción de sustancia; y otras veces el sistema corresponde a un espécimen obtenido in vitro a partir del espécimen obtenido directamente del paciente, como en el caso del suero o del plasma seminal, entre otros. Los sistemas más estudiados desde el punto de vista bioquímico-clínico son: suero, plasma, sangre, orina (emisión de primera hora de la mañana), orina (de 24 h), semen, heces, cálculo urinario. En general, suero y plasma se pueden considerar equivalentes, ya que, salvo los que sólo se puede determinar en el plasma porque se alteran durante la coagulación (fundamentalmente los factores de la coagulación), la mayor parte de los componentes químicos de la sangre se puede determinar indistintamente en plasma o suero sin que se observen diferencias estadística o clínicamente significativas. Por este motivo, la elección entre plasma o suero depende de consideraciones de tipo analítico o de la rapidez con que se necesita medir la magnitud considerada; así, por ejemplo, el plasma se obtiene de forma mucho más rápida que el suero, pero su turbiedad dificulta la realización de algunos procedimientos analíticos.

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Debe tenerse en cuenta que pese al hecho de indicar en la descripción de una propiedad que el sistema es el plasma, puede ser que en el laboratorio se utilice suero para hacer la medición. El hecho de aludir casi siempre al plasma se debe a que, desde un punto de vista fisiopatológico, la información requerida debe hacer referencia a un sistema biológico natural, y no a uno artificial como es el suero. No obstante, hay algún caso en que debido a las diferencias entre el suero y el plasma (ejemplo: examen de las fracciones electroforéticas), sí que debe destacarse que se trata de suero. En la descripción de una propiedad, cuando en el apartado correspondiente al sistema aparece el término «sistema» quiere decir que el código adjudicado es aplicable a todas las propiedades que tengan el componente y el tipo de propiedad indicados, excepto a aquellas cuyo sistema ya ha sido especificado. La nomenclatura recomendada internacionalmente parte de conceptos metrológicos básicos, incluido el concepto de propiedad, y unas reglas sintácticas simples. La nomenclatura sistemática de cualquier propiedad biológica requiere la descripción del sistema en estudio (ejemplos: plasma, orina, hipófisis), del componente considerado (ejemplos: glucosa, leucocitos, excreción) y del tipo de propiedad (ejemplos: concentración de sustancia, concentración de número de entidades, caudal de sustancia) y, cuando es necesario, alguna especificación de cada uno de estos tres elementos. Fijando la ordenación de estos elementos más el resultado del exámen de laboratorio, se puede conseguir de forma abreviada, la descripción de la propiedad biológica y el resultado obtenido. La sintaxis recomendada internacionalmente incluye las reglas siguientes: 1) En primer lugar se escribe el nombre o el símbolo del sistema y, si hace falta, se añade, entre paréntesis y sin dejar ningún espacio, una especificación [ejemplo: Cls(MOs) "células de la médula ósea"]. 2) A continuación, pero sin dejar ningún espacio, se escribe una raya (‒) o dos guiones (- -). 3) A continuación y sin dejar ningún espacio, se escribe, siguiendo la nomenclatura internacional y utilizando mayúsculas para la primera letra, el nombre completo del componente; cuando es necesario se añade una especificación entre paréntesis y sin dejar ningún espacio [ejemplo: Tiroxina(libre)]. 4) A continuación, sin dejar ningún espacio, se escribe un punto y coma. 5) Tras el punto y coma, dejando un espacio, se escribe el nombre o la abreviatura del tipo de propiedad, añadiendo, entre paréntesis y sin dejar ningún espacio, las especificaciones necesarias, como por ejemplo el procedimiento de exámen [ejemplo: taxon(Gram)], el material de referencia respecto al cual el resultado es trazable [ejemplo: c.sust.arb.(IS 83/575)], o la escala de valores posibles, que siempre ha de acompañar el tipo de propiedad concentración arbitraria [ejemplos: c.arb.(inmunoquím.; 0 1), c.arb.(cultivo; negativo, positivo), c.arb.(microscopia; 0 1 2), c.arb.(microscopia; ausentes, escasos, abundantes)]. 6) A continuación se dejan uno o más espacios y se escribe el operador relacional correspondiente [ejemplos: = , ≤, >]. 7) Finalmente, se dejan uno o más espacios y se escribe el resultado del examen de laboratorio, y se añade, cuando el tipo de propiedad lo requiera, la unidad del Sistema Internacional de Unidades, o la unidad arbitraria, correspondiente; el signo decimal debe ser siempre una coma.

5.12. RESULTADOS Y UNIDADES_____________________________________________________________ Los resultados de los exámenes de laboratorio clínico pueden pertenecer a una escala nominal (por ejemplo el nombre de una especie bacteriana o de un grupo sanguíneo), a una escala ordinal (por ejemplo cualquier valor ordinal o semicuantitativo) y a una escala de razón o de diferencias (números racionales). El resultado de medida de una propiedad cuantitativa (magnitud) particular se expresa mediante un valor numérico que multiplica una unidad de medida. La descripción de este valor numérico debe seguir las normas internacionales para la escritura de los números, que se exponen a continuación:

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1) Los números se han de escribir en caracteres rectos (no en cursivas). Para facilitar la lectura de los números, los dígitos pueden separarse, mediante un pequeño espacio (nunca un punto o una coma) en grupos de tres, a contar desde el signo decimal en un sentido y el otro [ejemplo: 21 975 198,302 5]. 2) El signo decimal debe ser una coma (y no un punto) a la altura de la línea de base del número. 3) Si el valor absoluto de un número se inferior a 1, el signo decimal ha de ir precedido de un cero. 4) En algunas ocasiones, puede que convenga escribir un intervalo en lugar de un solo número. En estos casos se debe seleccionar el tipo de intervalo adecuado al tipo de resultado que se quiere expresar y emplear la notación internacional. Considerando que el valor numérico de la propiedad particular en cuestión sea x: ]a;b[ es un intervalo abierto: a < x < b [a;b] es un intervalo cerrado: a ≤ x ≤ b [a;b[ es un intervalo semiabierto por el límite superior: a ≤ x < b ]a;b] es un intervalo semiabierto por el límite inferior: a < x ≤ b

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Capítulo 6. Las pruebas y la petición analítica

Definiciones 6.1. Formulario de petición analítica 6.2. Catálogo y clasificación de las pruebas 6.3. Gestión de la demanda analítica 6.4. Descripción, indicaciones e interpretación de los resultados de las pruebas 6.5. Características, analíticas, diagnósticas y metrológicas de las pruebas

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DEFINICIONES_____________________________________________________________________ Prueba analítica. Es la unidad de trabajo del laboratorio. Cada uno de los productos incluidos en los catálogos de las especialidades del laboratorio clínico se considera una prueba analítica. Son necesarios varios procesos para poder producir el resultado final de una prueba. Petición analítica. Es el proceso por el cual un cliente autorizado solicita la medida de magnitudes bioquímicas mediante un formulario de petición en formato papel-manual o electrónico. Documento de solicitud de mediciones de laboratorio, que cumplimenta el médico y es remitido al laboratorio. Formulario de petición. Documento en el que figuran el conjunto de pruebas, perfiles y protocolos solicitados por el clínico para la evaluación analítica de un paciente que origina una o más muestras y un número de identificación en el laboratorio. Perfil analítico. Conjunto de propiedades analíticas, la medida de las cuales suministra la máxima información posible para una finalidad médica concreta y que posee una relación óptima entre el coste de las medidas y el beneficio diagnóstico. Conjunto de magnitudes biológicas agrupadas para que puedan ser solicitadas unitariamente al laboratorio. Protocolo analítico. Conjunto de actividades acordadas para la realización de magnitudes biológicas y asociadas a una o varias entidades clínicas determinadas. Conjunto de determinaciones analíticas de demostrada efectividad para el diagnóstico, seguimiento y terapéutica de episodios o procesos clínicos bien definidos. Conjunto de pautas explícitas y detalladas de todos los pasos implicados en el desarrollo de un estudio experimental.

6.1. FORMULARIO DE PETICIÓN ANALÍTICA_________________________________________________ Es el medio para solicitar al laboratorio clínico la medición de magnitudes biológicas. El contenido del formulario está normalizado, lo cual incide en la calidad de la fase preanalítica. Está elaborado en papel en formato ISO A4 y es revisado y actualizado periódicamente. También se puede realizar la petición de forma electrónica (informática) en los casos en los que se encuentre disponible dicha aplicación. En el formulario figuran: - Identificación del laboratorio: nombre, dirección, teléfono y fax. - Identificación del paciente: dos apellidos, nombre, fecha de nacimiento, edad, sexo y datos de identificación clínica (número de historia, de C.I.P., DNI, teléfono). Este espacio es el destinado para la inclusión de la etiqueta de identificación del paciente o T.A.I.R. Todo ello perfectamente legible. - Identificación del solicitante: nombre y/o número de colegiado, servicio, destino de los resultados, fecha de la petición y tipo de petición (ordinaria o urgente). - Identificación de la petición analítica: con un espacio destinado para las etiquetas de código de barras de la petición que deberá ser exactamente las mismas con las que se identifica/n el/los contenedor/es de la/s muestra/s. El S.I.L. (Sistema Informático del Laboratorio) añadirá a este número las cifras del mes y día. - Tipo de petición: ordinaria o urgente.

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- Datos de la toma de muestra: datos del extractor o tomador de la muestra, hora de la toma y comentarios a la toma de la muestra (espacio para consignar los datos, observaciones o incidencias que tengan lugar durante la obtención de los especímenes que puedan influenciar los resultados del análisis. También para anotaciones, bien dirigidas al paciente, o a los responsables de la obtención de especímenes. - Datos clínicos: datos de orientación diagnóstica y tratamiento, de administración de medicamentos u otro tipo de información que pueda ser relevante para el laboratorio. - Magnitudes biológicas: espacio destinado para la solicitud de las pruebas del laboratorio, bien por medio de perfiles analíticos o protocolos asistenciales, o bien de forma individual en cuyo caso y para orientar la petición se han clasificado las magnitudes según tipo de muestra y grupo bioquímico-fisiológico. Previamente a la denominación de la prueba figura el número de identificación del S.I.L. (Sistema Informático del Laboratorio) y el símbolo correspondiente al tipo de muestra necesario. Las escritas en rojo son aquellas que pueden ser solicitadas con carácter urgente. Hay un espacio «otras pruebas y datos complementarios», reservado para aquellas magnitudes que no figuren en el formulario de petición o para otros datos de interés. En el formulario de petición de Atención Primaria hay pruebas que necesitan «justificación clínica» la cual deberá ser aportada por el facultativo peticionario en el espacio correspondiente. - Otras informaciones: en la cara posterior del formulario figuran las pruebas que contienen los diversos perfiles y protocolos, así como los diferentes tipos de muestra, contenedor y aditivo necesarios con sus símbolos de identificación. Así mismo, figura información al paciente sobre la toma de especímenes y horario de los centros de recogida. También instrucciones para el uso correcto del formulario de petición, las condiciones de aceptación de las peticiones y las muestras, y los teléfonos de consulta. La petición electrónica se puede realizar con un programa informático que tiene un panel de petición exclusivo y relacionado con la historia clínica electrónica. La petición, tanto la realizada en formato papel como la electrónica, debe contener obligatoriamente: la información necesaria para la identificación del paciente, el médico peticionario, el servicio solicitante, datos clínicos u orientación diagnóstica y las pruebas solicitadas. El laboratorio tiene establecidos criterios de rechazo de peticiones motivadas sobre todo por la dificultad o imposibilidad de identificar al paciente. El Laboratorio Clínico se reserva la posibilidad de modificar el formulario de petición, suprimiendo aquellas propiedades biológicas solicitadas que se consideren improcedentes o no mensurables por razones técnicas y así lo hará constar en el informe de correspondiente. Asimismo el Laboratorio Clínico, de acuerdo con los protocolos establecidos y con la finalidad de ayudar a comprender el estado del paciente, puede realizar pruebas no solicitadas El Laboratorio Clínico ofrece a sus clientes la posibilidad de ampliar las pruebas solicitadas en el formulario de petición, siempre y cuando se disponga de muestra de calidad y con cantidad adecuada.

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6.2. CATÁLOGO Y CLASIFICACIÓN DE PRUEBAS_________________________________________________ Catálogo por clasificación fisiopatológica METABOLISMO DE GLUCIDOS: glucosa, glucosuria, cetonuria, osmolalidad, lactato, hemoglobina glicosilada, test de sobrecarga oral de glucosa (S.O.G.). METABOLISMO DE LÍPIDOS: colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL, triglicéridos, apolipoproteina B, quilomicrones, lipoproteína (a), homocisteina. METABOLISMO MINERAL: calcio, calcio iónico, calciuria, fosfato, fosfaturia, magnesio, PTH. EQUILIBRIO ACIDO-BASE. GASOMETRÍA-OXIMETRÍA: pH, pCO2, bicarbonato, CO2 total, exceso de bases, anion-gap, lactato, pO2, sat O2, ctO2, p50, hemoglobina total, FO2Hb, FCOHb, FMetHb, FHHb. EQUILIBRIO HIDROELECTROLÍTICO: sodio, sodio orina, potasio, potasio orina, cloruros, cloruros orina, osmolalidad, osmolalidad orina. PROTEINAS: proteinas totales, albúmina, prealbúmina, microalbuminuria, alfa 1 globulinas, alfa 1 microglobulina, alfa 1 glicoproteina ácida (orosomucoide), Alfa-1 antitripsina, alfa 2 globulinas, beta globulinas, gamma globulinas, inmunoglobulina G, inmunoglobulina G orina, inmunoglobulina G (LCR), inmunoglobulina A, inmunoglobulina M, inmunoglobulina E, cadenas ligeras kappa, cadenas ligeras kappa orina, cadenas ligeras lambda, cadenas ligeras lambda orina, complemento C3, complemento C4, proteina C reactiva (PCR), factor reumatoide (FR). AUTOINMUNIDAD: ver listado de autoanticuerpos en tabla de “autoinmunidad”. ALERGIA: Ig E total. IgE Específica a alergenos en tabla “alergia”. Triptasa. ESTADO NUTRICIONAL. VITAMINAS: proteinas totales, albúmina, prealbúmina, urea, creatinina, glucosa, sodio, potasio, osmolalidad, calcio, fosfatos, magnesio, vitamina B12, folatos, homocisteina. RESPIRATORIO: pH, pCO2, bicarbonato, CO2 total, exceso de bases, anion-gap, lactato, pO2, sat O2, ctO2, p50, hemoglobina total, FO2Hb, FCOHb, FMetHb, FHHb. Estudio bioquímico de líquido pleural. Alfa-1 antitripsina. CARDIO-VASCULAR: CK, mioglobina, troponina T, NT-proBNP, AST, ALT, LDH, urea, sodio, potasio, cloro, albúmina, PCR, anticuerpos anti cardiolipina G/M, anticuerpos anti beta 2 glicoproteina 1. HEPATO-BILIAR: glucosa, urea, colesterol, bilirrubina total, bilirrubina directa, AST, ALT, fosfatasa alcalina, fosfatasa alcalina isoenzimas, GGT, LDH, proteinas totales, albúmina, proteinograma, inmunoglobulinas, amonio, urobilinógeno, ANA, AMA, ASMA, anticuerpos anti LKM, anticuerpos anti nDNA. Estudio bioquímico de líquido peritoneal. PÁNCREAS: amilasa total, amilasa total orina, amilasa pancreática, amilasa pancreática orina, lipasa, bilirrubina, AST, ALT, fosfatasa alcalina GGT, glucosa, calcio, colesterol, triglicéridos. GASTRO-INTESTINAL: urea, colesterol, triglicéridos, proteinas totales, albúmina, alfa 1 glicoproteina ácida, fosfatasa alcalina, fosfatasa alcalina isoenzimas, sodio, potasio, cloruro, bicarbonato, sangre en heces, heces digestión, test d-xylosa, APCA, anticuerpos anti gliadina G/A, anticuerpos anti transglutaminasa. Estudio bioquímico de líquido peritoneal.

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RIÑON-VIAS URINARIAS: urea, creatinina, urato, proteinas totales, albúmina, sodio, potasio, cloruros, osmolalidad, calcio, fosfatos, (en suero y orina) PTH, magnesio, equilibrio ácido-base, hemoglobina, microalbuminuria, complemento C3, complemento C4, ANA, anticuerpos anti nDNA, orina estudio básico y sedimento. PRÓSTATA: PSA, PSA libre, fosfatasa ácida. MUSCULAR-NERVIOSO: CK, mioglobina, aldolasa, AST, LDH, calcio, calcio iónico, magnesio, lactato, acetilcolinesterasa, ANA, estudio bioquímico del L.C.R. OSTEO-ARTICULAR-COLÁGENO: calcio, calcio iónico, fosfatos, magnesio, fosfatasa alcalina, fosfatasa alcalina isoenzimas, fosfatasa ácida, urato, PCR, ASLO, factor reumatoide, complemento C3, complemento C4, PTH, osteocalcina, telopéptidos, ANA, antic. Anti nDNA, Cenp-B, Jo-1, RNP, Scl-70, Sm, SSA/Ro, SSB/La, anti histonas, anti ribosomal. Estudio bioquímico del líquido articular. Vitamina D. ENFERMEDADES INFECCIOSAS: Procalcitonina. PCR TIROIDES-PARATIROIDES: TSH, FT4, FT3, tiroglobulina, calcio, calcio iónico, fosfatos, magnesio, PTH, anticuerpos antitiroideos microsomales (ATA-tpo), anticuerpos antitiroideos tiroglobulina (ATA-tgb). SUPRARRENALES: ACTH, cortisol, sodio, potasio, cloro, osmolalidad, glucosa, DHEA-S. FERTILIDAD-GÓNADAS: FSH, LH, prolactina, estradiol, progesterona, testosterona, DHEA-S, seminograma. GESTACIÓN- PRENATAL: betaHCG, AFP, betaHCG libre, PAPP-A. ONCOLOGÍA: alfa fetoproteina (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígenos carbohidratados CA 15.3, CA19.9, CA 72.4, CA 125, antígeno asociado a carcinoma de células escamosas (SCC), enolasa neuronal específica (NSE), betaHCG, antígeno prostático específico (PSA), antígeno prostático específico libre (PSA libre), S100, citoqueratina 19 (CIFRA 21.1), beta 2 microglobulina, HE-4. MONITORIZACIÓN DE FÁRMACOS (TDM): digoxina, amikacina, tobramicina, vancomicina, fenobarbital, fenitoina, carbamacepina, ácido valproico, litio, paracetamol. DROGAS DE ABUSO: acetaminofeno (APAP), benzodiacepinas (BZO), barbitúricos (BAR), opiáceos (OPI), cocaina (COC), anfetaminas (AMP), metanfetaminas (mAMP), fenciclidina (PCP), tetrahidrocannabinol (THC), metadona (MDN), antidepresivos tricíclicos (TCA).

Catálogo por clasificación bioquímica (pág. siguiente)

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Metabolitos Bilirrubina conjugada o directa Bilirrubina total Creatinina Creatinina (orina) Glucosa Glucosa (líquido ascítico) Glucosa (líquido cefalorraquídeo) Glucosa (líquido pleural) Glucosa (líquido sinovial) Glucosa (orina) Urato Urato (orina) Urea Urea (orina) Lípidos y lipoproteínas Lípidos Colesterol HDL Colesterol LDL Colesterol total Triglicéridos Triglicéridos (líquidos biológicos) Lipoproteínas Apolipoproteína B Quilomicrones Enzimas Enzimas cardiacas-musculares Creatina-cinasa (CK) Enzimas hepáticas Alanina aminotransferasa (ALT) Aspartato aminotransferasa (AST) Colinesterasa (CHE) Fosfatasa alcalina (ALP) Fosfatasa alcalina (isoenzimas) Gamma glutamiltransferasa (GGT) Enzimas pancreáticas Amilasa pancreática Amilasa pancreática (líquido ascítico) Amilasa pancreática (líquido pleural) Amilasa pancreática (orina) Amilasa total Lipasa Lipasa (líquido duodenal) Otras enzimas Lactato deshidrogenasa (LDH) Lactato deshidrogenasa (líquido ascítico) Lactato deshidrogenasa (líquido pleural) Iones y minerales Amonio Calcio Calcio (orina) Calcio iónico Cloruro Cloruro (orina) Cloruro (sudor)

Fosfato inorgánico Fosfato inorgánico (orina) Ion Potasio Ion Potasio (orina) Ion Sodio Ion Sodio (orina) Magnesio Equilibrio ácido-base y oximetría Acido-base Anion-gap Base exceso (BE.b) Base exceso estándar (BE.ecf) Dióxido de carbono concentración total (ctCO2) Dióxido de carbono presión parcial (pCO2) Hidrogenocarbonato estándar (HCO-3 std) Hidrogenocarbonato real (HCO-3 real) Lactato pH pH (líquido biológico) pH (sangre de cordón) Oximetría Carboxihemoglobina (FCOHb) Hemoglobina deoxigenada fracción (FHHb) Hemoglobina fetal fracción (FHBF) Hemoglobina total (ctHb) Metahemoglobina (FmetHb) Oxígeno presión parcial (pO2) Oxígeno presión parcial con 50% sat. Hb (p50) Oxígeno saturación (sO2) Oxígeno total concentración (ctO2) Oxihemoglobina (FO2Hb) Marcadores cardiacos Mioglobina NT-proBNP Troponina T hs Monitorización de fármacos Antiepilépticos Carbamacepina (niveles de) Fenitoína (niveles de) Fenobarbital (niveles de) Valproato (niveles de) Antibióticos Amikacina (niveles de) Tobramicina (niveles de) Vancomicina (niveles de) Cardiacos Digoxina (niveles de) Psicotropos Ion Litio (niveles de) Drogas de abuso y toxicología Anfetaminas (orina) Antidepresivos tricíclicos (orina) Barbituratos (orina) Benzodiacepinas (orina)

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Cannabinoides (orina) Carboxihemoglobina Cocaína (orina) Fenciclidina (orina) Metadona (orina) Metanfetaminas (orina) Opiáceos (orina) Paracetamol (acetaminofeno) (orina) Vitaminas Folatos Vitamina B12 Vitamina D (25-hidroxivitamina D3) Marcadores de remodelado óseo De formación Fosfatasa alcalina Fosfatasa alcalina ósea Propéptido N terminal de procolágeno I (PINP) De resorción C-Telopéptido del colágeno tipo I (beta-CTx) Proteínas Albúmina Albúmina (líquido ascítico) Albúmina (líquido pleural) Albúmina (orina) Alfa-1-glicoproteina ácida (orosomucoide) Beta-2-microglobulina Cadenas ligeras Kappa Cadenas ligeras Kappa (orina) Cadenas ligeras Lambda Cadenas ligeras Lambda (orina) Cistatina C Complemento C3 Complemento C4 Factor reumatoideo (FR) Globulina transportadora de las hormonas sexuales (SHBG) Hemoglobina glicosilada HbA1c Inmunoglobulina A Inmunoglobulina E Inmunoglobulina G Inmunoglobulina M Prealbúmina Procalcitonina Proteína C reactiva (PCR) Proteínas bandas monoclonales Proteínas bandas monoclonales (orina) Proteinas bandas oligoclonales Proteinas bandas oligoclonales (orina) Proteína de Bence-Jones Proteínas totales Proteínas totales (líquido ascítico) Proteínas totales (líquido cefalorraquídeo) Proteínas totales (líquido pleural) Proteínas totales (líquido sinovial) Proteínas totales (orina)

Proteinograma Proteinograma (orina) Autoinmunidad Anticuerpos anti ácido desoxirribonucleico (anti-DNA) Anticuerpos anti antígenos hepáticos solubles (anti SLA / LP) Anticuerpos anti antígenos nucleares extraíbles (anti-ENA) Anticuerpos anti beta 2-glucoproteina I (anti β2-GPI) Anticuerpos anti cardiolipina G / M Anticuerpos anti celulas parietales gastricas (APCA) Anticuerpos anti centrómero (Cenp) Anticuerpos anti citoplasma de neutrófilos (ANCA) Anticuerpos anti estreptolisina O (ASLO) Anticuerpos anti gliadina G / A Anticuerpos anti gp 210 Anticuerpos anti histonas Anticuerpos anti Jo-1 Anticuerpos anti LC-1 Anticuerpos anti microsomas hepáticos y renales (anti-LKM) Anticuerpos anti mitocondriales (AMA) Anticuerpos anti musculo liso (ASMA) Anticuerpos anti neuronales Anticuerpos anti nucleares (ANA) Anticuerpos anti nucleosomas (ANuA) Anticuerpos anti antígeno de proliferación nuclear (PCNA) Anticuerpos anti péptido ciclico citrulinado (anti-CCP) Anticuerpos anti peroxidasa tiroidea (antiTPO) Anticuerpos anti PM-scl Anticuerpos anti proteínas P ribosómicas Anticuerpos anti RNP Anticuerpos anti Ro/SSA y La/SSB Anticuerpos anti Scl-70 Anticuerpos anti Sm Anticuerpos anti Sp100 Anticuerpos anti transglutaminasa tisular (anti-Ttg) Alergia Ig E específica alimentos Alfa-lactoalbúmina Alimentos screening (mezclas) Beta-lactoglobulina Caseína Clara de huevo Frutas (mezclas) Frutos secos (mezclas) Huevo

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Leche de vaca Ovoalbúmina Ovomucoide Pescados (mezclas) Yema de huevo Ig E específica fármacos Amoxicilina Ampicilina Penicilina G Penicilina V Ig E específica inhalantes Acaros / polvo de casa (mezclas) Alternaria Arizónica Caspa de gato Caspa de perro Ciprés Dermatophagoides farinae Dermatophagoides pteronyssinus Epitelios y proteínas (mezclas) Euroglyphus Grama mayor Inhalantes screening (mezclas) Llantén Mohos (mezclas) Olivo Parietaria Plátano de sombra Pólenes de árboles y arbustos (mezclas) Pólenes de gramíneas (mezclas) Pólenes de malezas (mezclas) Salsola Ig E específica ocupacionales Látex Ig E específica parásitos Anisakis Áscaris Echinococcus Ig E específica veneno insectos Abeja Avispas Otras pruebas alérgicas Triptasa Hormonas Hipófisis Folitropina (FSH) Lutropina (LH) Prolactina Ovario Estradiol Progesterona Paratiroides Paratirina (PTH) Placenta Coriogonadotropina (orina-test de gestación)

Coriogonadotropina subunidad beta (betaHCG) Suprarrenales Cortisol Dehidroepiandrosterona sulfato (DHEA) Testículo Testosterona Tiroides Tirotropina (TSH) Tiroxina libre (FT4) Triiodotironina libre (FT3) Pruebas dinámicas Hipotálamo/hipófisis/gónadas * LH/FSH tras GNRH Test de progesterona LH/FSH/Testosterona tras citrato de clomifeno B Testosterona estimulación con coriogonadotropina Testosterona tras estimulación con gonadotropina coriónica Hipotálamo/hipófisis/tiroides * Tirotropina tras TRH Prolactina tras TRH Páncreas Sobrecarga oral de glucosa con 100 g Sobrecarga oral de glucosa con 75 g Test de O´Sullivan (50 g) Suprarrenales * Cortisol tras estímulo prolongado con ACTH Tiroides * Tirotropina tras TRH TSH tras supresión con triiodotironina Marcadores tumorales Alfa-fetoproteína (AFP) Antígeno asociado a carcinomas escamosos (SCC) Antígeno carbohidrato CA125 Antígeno carbohidrato CA15.3 Antígeno carbohidrato CA19.9 Antígeno carbohidrato CA72.4 Antígeno carcinoembrionario (CEA) Antígeno prostático específico (PSA) Antígeno prostático específico libre (fPSA) Beta-2-microglobulina Citoqueratina 19 (CYFRA 21-1) Coriogonadotropina subunidad beta (betaHCG) Enolasa neuronal específica (NSE) HE-4 Proteína S-100 Diagnóstico prenatal Alfa-fetoproteina Coriogonadotropina subunidad beta libre Coriogonadotropina subunidad beta total

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Defectos del tubo neural estudio prenatal Proteína plasmática A asociada a embarazo (PAPP-A) Síndrome de Down estudio prenatal Orina Sedimento Bacterias Células epiteliales Cilindros (recuento) Cristales Hematíes (morfología) Hematíes (recuento) Hongos Leucocitos (recuento) Parásitos Urianálisis Bilirrubina Cuerpos cetónicos Densidad Glucosa Leucocitos Nitritos pH Proteínas Sangre Urobilinógeno Volumen diuresis Heces Digestión de principios inmediatos Sangre oculta Líquidos biológicos Líquido ascítico (LAs) Líquido cefalorraquídeo (LCR) Líquido de diálisis Líquido pleural (LPl) Líquido sinovial (Lsi) Albúmina Amilasa pancreática Exámen visual Glucosa Hematíes (recuento) Lactato deshidrogenasa (LDH) Leucocitos (recuento y fórmula leucocitaria) pH Proteínas Semen Espermiograma estudio fertilidad Espermatozoides concentración Espermatozoides morfología Espermatozoides movilidad pH Viscosidad Volumen Espermiograma postvasectomía Espermatozoides presencia

Estudio inseminación artificial Recuento de espermatozoides Recuperación de espermatozoides móviles (REM) Otros Aclaramiento de creatinina Estimación del filtrado gloreluar (EFM) Osmolalidad Osmolalidad (orina)

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6.3. GESTIÓN DE LA DEMANDA ANALÍTICA___________________________________________________ El constante incremento en la solicitud de pruebas de laboratorio y la progresiva restricción de recursos que afecta a los sistemas de salud, y en consecuencia a los laboratorios clínicos, hacen necesaria la gestión y adecuación de la demanda de pruebas de laboratorio solicitadas por parte de los médicos. Se pueden considerar tres posibles niveles de actuación que no son excluyentes. Es más, se recomienda que sean complementarios y que se definan e implanten de manera simultánea. 1. Actuaciones previas a la petición: • Acciones de información o educativas - Catálogos de prestaciones - Diseño de las peticiones (manuales o electrónicas) - Sesiones informativas - Boletines periódicos • Protocolos y guías clínicas • Perfiles de petición • Formato de la petición 2. Actuaciones en el momento de la petición: Con petición electrónica. Se las considera las más potentes. Pueden ser herramientas de dos tipos: informativo o limitante. 3. Actuaciones posteriores a la petición: • Rechazo de pruebas por solicitud inadecuada • Suspender la realización de una prueba hasta el contacto con el médico peticionario • Exigir una justificación expresa para la solicitud de determinadas pruebas • Pruebas reflejas y pruebas complementarias • Adecuar el tiempo de respuesta • Dar información periódica a los peticionarios sobre su demanda analítica • Imputar el presupuesto del laboratorio a los solicitantes Tanto si el nivel de actuación sobre la gestión de la demanda es previo o en el momento de realizar la petición, buena parte de las estrategias descritas van a requerir la definición de intervalos de tiempo mínimos entre mediciones consecutivas de una misma magnitud según criterios bioquímicos, de variabilidad biológica o acuerdos con los clínicos.

6.4. DESCRIPCIÓN, INDICACIONES E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LAS PRUEBAS__________ Documento elaborado por el laboratorio cuyo objeto es mejorar la interpretación de los informes de resultados del laboratorio así como las peticiones analíticas y el uso adecuado de las magnitudes bioquímicas. Magnitud: nomenclatura sistemática Sinónimos y abreviaturas Descripción bioquímica de la magnitud. Principales indicaciones clínicas Interpretación de los resultados. Variabilidad fisiológica. Ritmos biológicos Variabilidad iatrogénica y patológica. Preparación del paciente Toma de la muestra Técnica analítica Límites de referencia y valores críticos Variación biológica intra e interindividual Disponibilidad de resultados

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6.5. CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS, DIAGNÓSTICAS Y METROLÓGICAS DE LAS PRUEBAS_______________ Existen una serie de factores analíticos a considerar a la hora de valorar la calidad y la utilidad de los resultados de una prueba, como son: a) Características Analíticas de las pruebas: • inexactitud • imprecisión • intervalo analítico • límite de detección (sensibilidad analítica) • interferencias Algunas se estudiaran en el capítulo 15, dedicado a la fase analítica y otras en el capítulo 16, dedicado al control de calidad. b) Características Diagnósticas de las pruebas: • sensibilidad • especificidad • valor predictivo positivo y negativo • eficiencia • curva de rendimiento diagnóstico (curva ROC) • razón de verosimilitud Se estudiaran con detalle en el capítulo 18, destinado a la interpretación de resultados. El conocimiento de estos datos es fundamental para la adecuada utilización de las pruebas de laboratorio. c) Características metrológicas de las pruebas Características relacionadas con la fase premetrológica Instrucciones sobre la preparación del paciente Espécimen, recipiente de recogida y aditivos Condiciones de obtención y recogida Condiciones de conservación y transporte Criterios de rechazo de los especímenes Recipiente original Identificación por código de barras

Características relacionadas con la fase metrológica

Características relacionadas con la fase postmetrológica

Realiza la medición en su laboratorio?

Plazo de entrega de resultados

Sistema de medida

Conexión en línea de los sistemas de medida

Método de medida

Criterios de repetición

Certificación de los reactivos

Validación de resultados

Unidades de medida

Criterios de aviso urgente según el resultado

Límite de detección Intervalo de medida Límites de referencia Origen de los límites de referencia Trazabilidad de los calibradores Evaluación externa de la calidad Relación nº muestras / nº materiales de control Imprecisión interdiaria Imprecisión interdiaria Error sistemático

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Capítulo 7. Los factores preanalíticos

7.1. La fase pranalítica 7.2. La importancia de la fase preanalítica 7.3. Influencia de la edad, el género, la raza y la gestación 7.4. Hábitos variables 7.5. Café, tabaco, estimulantes y drogas adictivas 7.6. Cuándo se debe hacer el exámen de laboratorio clínico 7.7. Toma de muestras durante la terapia de infusión intravenosa 7.8. Las intervenciones quirúrgicas 7.9. Impacto de la secuencia de procedimientos diagnósticos y terapéuticos 7.10. Efectos de la postura y el torniquete 7.11. Factores preanalíticos que pueden afectar a los resultados 7.12. Preparación del paciente 7.13. Información y recomendaciones preanalíticas para el paciente

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7.1. LA FASE PREANALÍTICA____________________________________________________________ El proceso de elaboración de resultados por parte del laboratorio consta de tres fases: preanalítica, analítica y postanalítica. La fase preanalítica comprende el conjunto de procesos que se realizan desde la prescripción del análisis por parte del clínico hasta que la muestra llega al analizador en las condiciones idóneas para su procesamiento (elaboración de la petición analítica, preparación del paciente, toma de muestras, transporte, preparación y manipulación de las mismas). Una parte importante de la fase preanalítica se lleva a cabo fuera del laboratorio (consultas, formularios de petición, preparación de pacientes, centros de extracción, transporte, etc.), y otra es específica del laboratorio (recepción y ordenación de muestras, centrifugación, distribución, alicuotación, etc). Así pues, hay una serie de variables preanalíticas que es imprescindible controlar y tener en cuenta a la hora de valorar los resultados de una prueba.

7.2. LA IMPORTANCIA DE LA FASE PREANALÍTICA___________________________________________ La importancia de todos los pasos de la fase preanalítica, incluyen: la preparación del paciente, la toma de muestras, el transporte y el almacenamiento de las mismas. Se comentan las posibles variables preanalíticas con respecto a los mecanismos, efectos y acciones preventivas destinadas a impedir una mala interpretación de los resultados de laboratorio clínico. Al igual que in vivo los mecanismos de la enfermedad y las influencias biológicas pueden cambiar la concentración de los componentes en estudio, los cambios in vivo han de separarse, en los experimentados por la magnitud medida y los producidos por la interferencia del procedimiento utilizado para la medición de la misma. Estas definiciones son importantes, porque solamente estos últimos pueden evitarse por la utilización de un procedimiento de medida más específico. Las influencias intrínsecas tales como raza, género y edad pueden afectar las magnitudes bioquímicas y hematológicas. Estas variables son características individuales y, por tanto, no sujetas a cambios. Muy frecuentemente, los factores intrínsecos y externos son difíciles de distinguir

7.3. INFLUENCIA DE LA EDAD, EL GÉNERO, LA RAZA Y LA GESTACIÓN____________________________ Edad La edad puede afectar las concentraciones de ciertos componentes de la sangre y de la orina después del nacimiento, durante la adolescencia o en la vejez. La concentración de eritrocitos en la sangre y, por tanto, la concentración de hemoglobina son mucho más altos en los neonatos que en los adultos. Durante los primeros días siguientes al nacimiento, el incremento de la presión parcial de oxígeno arterial provoca la degradación de los eritrocitos. El aumento resultante en la concentración de hemoglobina en el plasma conduce a su vez a concentraciones elevadas de bilirrubina en el plasma. Dado que la función del hígado (aquí en particular, la glucuronización) no está totalmente establecida en los neonatos, se observan concentraciones de bilirrubina en el plasma aumentadas. Las concentraciones de urato en el plasma de los neonatos están en un intervalo parecido al de los adultos. Sin embargo, durante los días siguientes al nacimiento, se observa una disminución significativa. Otros ejemplos de magnitudes dependientes de la edad incluyen la concentración catalítica de fosfatasa alcalina en el plasma (que presenta picos durante la fase de crecimiento, reflejando la actividad osteoblástica del hueso) y las concentraciones de colesterol y colesterol de LDL en el plasma. Además de por la edad, las magnitudes citadas están influidas por el género. Estas diferencias de género cambian a su vez en función de la edad.

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Raza Los estadounidenses de raza negra de ambos géneros tienen significativamente disminuida la concentración de leucocitos en la sangre comparada con los de raza blanca. Esta diferencia se explica fácilmente por una reducción de la concentración de granulocitos. En contraste, la fracción de volumen de los eritrocitos y las concentraciones de hemoglobina y linfocitos son casi idénticas en ambos grupos. La concentración de monocitos en los de raza blanca excede la de los de raza negra. Se ha observado una diferencia importante en la actividad o concentración catalítica de creatina-cinasa en el plasma para ambos géneros entre personas negras y blancas. Esta diferencia no es debida a diferencias en la edad, la altura o la masa corporal. Se ha establecido una diferencia sustancial en la concentración catalítica de la α-amilasa en el plasma entre los antillanos y los nativos británicos. Basándonos en el valor umbral generalmente aceptado, el 50 % de antillanos tenían la concentración catalítica de la α-amilasa en el plasma elevada. Se han informado diferencias raciales significativas para concentraciones de cobalaminas (vitamina B-12) (1,35 veces más altas en personas de raza negra) y lipoproteína(a) en el suero (concentraciones 2 veces más altas en negros que en blancos). En este contexto, es notable, que ni la ateroesclerosis ni la mortalidad es más alta en personas de raza negra con una concentración de lipoproteína (a) en el plasma alta. Género Al igual que en muchos aspectos macroscópicos y patrones hormonales específicos del género, pueden encontrarse diferencias en las magnitudes bioquímicas y hematológicas. En pacientes mayores de 65 años desaparecen las diferencias, debidas al género, en las concentraciones de hierro en el suero. Otros ejemplos de diferencias debidas al género son las concentraciones de creatina-cinasa y creatininio en el plasma. Estas concentraciones dependen de la masa muscular que es, en general, mayor en los varones. Ciertas actividades atléticas que den como resultado un aumento de masa muscular pueden limar esta diferencia. Gestación Cuando se interpretan resultados de laboratorio en una paciente embarazada, es necesario tener en cuenta la semana gestacional en que fueron tomadas cada una de las muestras. En el transcurso de un embarazo normal, el volumen medio de plasma aumenta desde aproximadamente 2600 mL a 3900 mL, con un cambio relativamente pequeño en las 10 primeras semanas de gestación, y un subsiguiente aumento progresivo hasta la semana 35, momento en que los valores se estabilizan. Mecanismos que cambian los valores de algunas magnitudes biológicas en el plasma durante el embarazo: • Inducción: Srm–Fosfatasa alcalina; c. cat.; Pla-Factor VII de la coagulación; c. sust. arb. • Incremento de las proteínas de transporte en el plasma: Srm–Tiroxina; c. sust.; Srm–Triglicérido, c. sust. Srm–Cobre; c. sust. • Hemodilución: Srm–Proteína; c. masa; Srm–Albúmina; c. masa • Incremento del volumen corporal y del metabolismo: Pac(Uri)–Excreción de hidroxiprolina; caudal sust. (24 h); Glo–Depuración de creatininio; caudal sust. (24 h) • Deficiencias relativas a mayores requerimientos: Srm–Hierro; c. sust.; Srm–Ferritina; c. masa • Incremento de proteínas de fase aguda: San–Eritrosedimentación; long. El volumen de orina también puede aumentar fisiológicamente por encima de un 25 % en el tercer trimestre. Hay un aumento fisiológico del 50 % en la velocidad de filtración glomerular en el último trimestre. Los cambios conocidos que tienen lugar durante el embarazo en la producción hormonal y en las concentraciones de las hormonas de la fertilidad en el plasma van acompañados por cambios en la concentración de diversos componentes, p. ej. las hormonas tiroideas, metabolitos, electrólitos, proteínas (especialmente las proteínas de fase aguda) y algunos lípidos, enzimas y activadores e inhibidores de la coagulación o la fibrinolísis de reconocido valor diagnóstico. La eritrosedimentación se eleva hasta cinco veces.

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7.4. HÁBITOS VARIABLES_____________________________________________________________ La Dieta La dieta y la ingestión de líquidos son dos de los principales factores que influyen en varias magnitudes bioquímicas. Desde un punto de vista práctico, se debería distinguir entre efectos agudos y aquellos observados durante un período más largo. La pregunta crítica en la actividad diaria es, sí una comida normalizada afecta las magnitudes biológicas. Cambio en los valores de diferentes magnitudes tras una comida normalizada con un aporte energético de 3kJ (de menos a más): urato, proteína, albúmina, calcio, urea, ion sodio, colesterol, alaninaaminotransferasa, ion potasio, bilirrubina, fosfato, glucosa, aspartato-aminotransferasa y triglicérido cuya variación puede llegar hasta un 50 %. El alcance de las alteraciones inducidas por la alimentación en las magnitudes depende de la composición del alimento y del tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y la ingestión alimentaria. Por ejemplo, una dieta rica en grasas conduce a un aumento de la concentración de triglicérido en el suero. En contraste, se observan concentraciones elevadas de amoníaco, urea y urato durante una dieta rica en proteínas y nucleótidos. Los cambios que ocurren después de una ingestión normalizada de glucosa (75 g) son diagnósticamente útiles en la prueba de tolerancia a la glucosa. Por otra parte la desnutrición y el ayuno pueden alterar las magnitudes de manera clínicamente relevante. Las reducciones de las concentraciones de prealbúmina y proteína enlazante de retinol en el plasma son indicadores tempranos de una dieta pobre en proteínas. Alteraciones de magnitudes bioquímicas, inducidas por un ayuno de unas 48 h (de menos a más): glucagón, glicerol, piruvato, lactato, ácidos grasos libres, acetoacetato y β-hidroxibutarato cuyo incremento puede ser de hasta x30. La acidosis metabólica con una disminución del pH y de la concentración de hidrogenocarbonato en el plasma tiene como consecuencia un aumento en ácidos orgánicos, principalmente los cuerpos cetónicos (acetona, ácido acetoacético, ácido β-hidroxibutírico). El ayuno Los valores de las magnitudes inducidos por periodos de ayuno prolongado (4 semanas) son variables. Las concentraciones de proteína, colesterol, triglicérido, apolipoproteínas y urea en el plasma se reducen. En contraste, las concentraciones de creatininio y urato en el plasma se elevan. Este último, debido a la reducción de la depuración de urato como resultado de una cetonemia. Es evidente que los periodos de ayuno prolongado se asocian estrechamente con un gasto reducido de energía; de ahí, como resultado, se reducen las concentraciones de tiroxina en el plasma y, en mayor extensión, las de triiodotironina. Aparte de tales alteraciones, la excreción urinaria de diversos componentes se ve afectada, de igual manera, por periodos prolongados de ayuno. Se incrementa la excreción urinaria de amoníaco y creatininio mientras que se reduce la de urea, calcio ( II) y fosfato. Los cambios producidos en los valores de las magnitudes biológicas por largos periodos de ayuno son similares a los observados tras procedimientos quirúrgicos o en pacientes con un estado catabólico. A fin de eliminar las variaciones en los hábitos de bebida y excreción de agua, es mejor medir la excreción en 24 h de los diversos componentes urinarios que medir la concentración de esos componentes en una muestra de orina tomada en cualquier momento, aunque sea la de primera hora de la mañana. Los cambios pueden ser debidos a: incremento en la reabsorción del componente en estudio (triglicérido, glucosa, aminoácidos). un metabolismo intestinal o hepático de los metabolitos reabsorbidos (VLDL, urea, amoníaco). cambios reguladores debido a la privación o a la ingestión alimentaria (urato, γglutamiltransferasa, colinesterasa, tiroxina, proteína enlazante de retinol, cuerpos cetónicos). Recomendación: a fin de evitar una mala interpretación de los resultados de laboratorio, se recomienda como un procedimiento normalizado la toma de muestras después de 12 h de ayuno y de baja actividad o reposo.

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El Ejercicio Antes de considerar la influencia del ejercicio sobre las magnitudes bioquímicas, se tienen que distinguir dos tipos de ejercicio: El ejercicio estático o isométrico de duración breve e intensidad alta que utiliza la energía (ATP y fosfato de creatina) ya almacenada en el músculo. El ejercicio dinámico o isotónico de inferior intensidad y más larga duración (p.ej. correr, nadar, montar en bicicleta) que utiliza ATP producido por las rutas aerobia o anaerobia. Además, debería mencionarse el efecto del entrenamiento físico y la masa muscular. Los cambios agudos de los valores de algunas magnitudes durante el ejercicio son debidos a los cambios de volumen entre los compartimentos intravasculares e intersticiales, a la pérdida de volumen por el sudor y a cambios en las concentraciones hormonales (p. ej. incremento en las concentraciones de adrenalinio, noradrenalinio, glucagón, somatotropina, cortisol, corticotropina en el plasma y disminución de la concentración de insulina en el plasma). Estos cambios en las concentraciones de hormonas en el plasma pueden provocar el aumento de la concentración de leucocitos en la sangre a más de 25 x 109/L y de la concentración de glucosa en el plasma. Aumento de las concentraciones de diversos componentes del pasma después de una carrera de maratón (la sangre se extrajo un día antes y 45 min. después de la carrera); de menor a mayor incremento: ion potasio, ion sodio, fosfatasa alcalina, calcio, albúmina, glucosa, fosfato, urato, urea, bilirrubina, aspartatoaminotransferasa, piruvato-cinasa y creatina-cinasa cuyo incremento puede superar x4. La extensión del cambio depende de una variedad de factores individuales o ambientales (p. ej. grado de entrenamiento, temperatura del aire e ingesta de líquidos conteniendo electrolitos y glúcidos durante la carrera). Los cambios observados (p. ej. Incremento de la concentración de albúmina en el plasma) pueden en parte atribuirse al cambio de volumen anteriormente citado desde el compartimento intravascular al intersticial o a la pérdida de volumen por sudoración. El incremento de la concentración de urato en el plasma es una consecuencia de la reducción de su excreción urinaria debida al aumento de la concentración de lactato en el plasma. El aumento de la concentración de creatina-cinasa en el plasma debido a la hipoxia depende de la preparación física, con un alto grado de variabilidad individual. El individuo menos adaptado físicamente es el que presenta el aumento más pronunciado de concentración de creatina-cinasa en el plasma. El entrenamiento aumenta tanto el número como el tamaño de las mitocondrias, hecho que se asocia con un incremento de la capacidad del sistema enzimático oxidativo. Este efecto, a su vez, aumenta la capacidad del músculo para metabolizar glucosa, ácidos grasos y cuerpos cetónicos por rutas aerobias. Como consecuencia, aumenta la fracción catalítica de la creatinacinasa 2 mitocondrial a más del 8% del total de creatina-cinasa en el plasma sin evidencia de alteración de la función miocárdica. Los individuos bien entrenados tienen una fracción catalítica de creatina-cinasa 2 del músculo esquelético más alta que los no entrenados. Las concentraciones de otros componentes dependen asimismo de la masa muscular y de la condición de entrenamiento. Así, el creatininio en el plasma, el creatininio en la orina y la excreción urinaria de creatininio aumentan y la formación de lactato después del ejercicio disminuye en los atletas entrenados comparados con los atletas no entrenados. El ejercicio enérgico puede ocasionar que los eritrocitos u otras células sanguíneas sean excretados en la orina. Estos cambios inducidos por el ejercicio, sin embargo, desaparecen comúnmente al cabo de unos días. La altitud Las concentraciones de algunos componentes de la sangre exhiben cambios significativos debidos a altitud respecto a las observadas a nivel del mar. Se observan aumentos importantes con la altura, por ejemplo, para las concentraciones en el plasma de proteína C reactiva (hasta un 65 % a 3600 m) y α2-globulina (hasta un 43 % a 5400 m), la fracción de volumen de los eritrocitos de la sangre («hematocrito») y la concentración de hemoglobina en la sangre (hasta un 8 % a 1400 m) y la de urato en el plasma. La adaptación a la altura tarda semanas y la vuelta a los valores a nivel del mar tarda días. Se encuentra una disminución importante en los valores, al

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incrementar la altitud, en los casos de la excreción urinaria de estriol, creatininio, depuración de creatininio (hasta el 50 % a 4200 m), la osmolalidad del suero, y las concentraciones de renina y transferrina en el plasma.

7.5. CAFÉ, TABACO, ESTIMULANTES Y DROGAS ADICTIVAS____________________________________ Cafeína La cafeína se encuentra en muchos de los alimentos ingeridos diariamente. A pesar de su amplio uso, la influencia de la cafeína sobre diversas magnitudes biológicas no ha sido investigada en detalle. La cafeína inhibe la fosfodiesterasa y, por consiguiente, la degradación de AMP cíclico. El AMP cíclico a su vez promueve la glucogenolisis incrementando la concentración de glucosa en el plasma. Además, la concentración de glucosa en el plasma también se incrementa debido a la gluconeogénesis vía adrenalina. La activación de la triacilglicerol-lipasa lleva a incrementar hasta tres veces la concentración de ácidos grasos no esterificados en el plasma. La medición de la concentración de hormonas y fármacos unidos a la albúmina en el plasma está obstaculizada por el efecto de desplazamiento inducido por los ácidos grasos. Se ha encontrado que 3 h. después de la ingestión de 250 mg de cafeína las concentraciones de renina y de adrenalinio+noradrenalinio (catecolaminas) en el plasma están elevadas. Consecuentemente los estudios interesados en investigar estas magnitudes deberán tener en cuenta el consumo de cafeína. Efectos del tabaco El tabaco produce algunos cambios agudos y crónicos en las magnitudes biológicas, siendo los cambios crónicos más moderados. Incrementa las concentraciones de ácidos grasos, adrenalinio, glicerol, aldosterona y cortisol en el plasma. Estos cambios aparecen a la siguiente hora de haber fumado de 1 a 5 cigarrillos. El tabaquismo crónico afecta las concentraciones de leucocitos, lipoproteínas, algunas enzimas, hormonas, vitaminas, marcadores tumorales y metales pesados. El mecanismo subyacente bajo estos cambios no ha sido totalmente dilucidado. En el humo del tabaco se encuentran un gran número de componentes piridínicos, ácido cianhídrico y tiocianato. Ellos pueden ser los responsables de los cambios de las concentraciones citadas por efectos directos o indirectos. Se cree que el descenso de la concentración catalítica peptidil-dipeptidasa A o ECA («enzima convertidora de angiotensina») en el plasma de los fumadores es el resultado de la destrucción de las células del endotelio pulmonar con una subsiguiente reducción en la liberación de peptidil-dipeptidasa A a la circulación pulmonar o inhibición enzimática. La extensión de los cambios también depende de la cantidad, clase (cigarrillos, cigarros, pipas) y la técnica de fumar (con o sin inhalación). Además, los cambios inducidos por el tabaco están influenciados por la edad y el género. Las concentraciones de cotinina, tiocianato en el plasma y la fracción de carboxihemoglobina de la hemoglobina son usadas como marcadores para el seguimiento cuali y cuantitativo de los hábitos del tabaco. La cotinina tiene la ventaja de tener una mayor semivida (20-28 h) que la nicotina que es el componente del que deriva (12-15 min). Etanol El consumo de etanol dependiendo de su duración y extensión puede afectar a gran número de magnitudes biológicas. Estas alteraciones son utilizadas en parte, para el diagnóstico y la monitorización terapéutica. Dentro de los cambios relacionados con el etanol se deben considerar separadamente los efectos agudos y crónicos. Los efectos agudos (dentro de las 2-4 h siguientes) del consumo de etanol son, en el plasma disminución de la concentración de glucosa e incremento de la de lactato debido a la inhibición de la gluconeogénesis hepática. El etanol es metabolizado a acetaldehido y luego a acetato. Esto incrementa la formación en el plasma produciendo una acidosis metabólica. La concentración elevada de lactato reduce la excreción

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urinaria de urato. Consecuentemente después de la ingestión aguda de etanol, la concentración de urato en el plasma aumenta. Los efectos a largo plazo de la ingestión de etanol incluyen un aumento en la concentración catalítica de las enzimas hepáticas en el plasma. El incremento de la concentración catalítica de γ-glutamiltransferasa está causado por inducción enzimática. Las concentraciones catalíticas de glutamato-dehidrogenasa, aspartato-aminotransferasa y alanina-aminotransferasa en el plasma aumentan debido a un efecto tóxico directo sobre el hígado. El incremento de formas desializadas de proteínas en la sangre (esto es, transferrinas deficientes en glúcidos) es debido a una inhibición de la glicación enzimática durante el procesamiento postranslacional de estas proteínas en el hígado. En el alcoholismo crónico la concentración de triglicérido en el plasma aumenta debido a un descenso en la ruptura de los triglicéridos del plasma. El incremento del volumen entítico de los eritrocitos («volumen corpuscular medio») puede estar relacionado con un efecto tóxico directo sobre las células eritropoyéticas o con una deficiencia de folato. La diuresis aumentada también es un resultado del descenso en la liberación de vasopresina seguida por un incremento en la secreción de renina y aldosterona . Otras drogas adictivas Las drogas adictivas tales como anfetamina, morfina, heroína, cannabis y cocaína pueden influir en los resultados de las magnitudes biológicas. La morfina causa espasmos del esfínter de Oddi, elevando así las concentraciones de enzimas como la α-amilasa y triacilglicerol-lipasa. Efectos biológicos de algunas drogas adictivas sobre magnitudes biológicas: Anfetamina: - Incremento: ácidos grasos no esterificados Morfina: - Incremento: α-amilasa, triacilglicerol-lipasa, aspartato-aminotransferasa, alaninaaminotransferasa, bilirrubina, fosfatasa alcalina, gastrina, tirotropina y prolactina. - Descenso: insulina, noradrenalinio, neurotensina y polipéptido pancreático. Heroína: - Incremento: pCO2, tiroxina, colesterol, ión potasio (debido a rabdomiolísis grave). - Descenso: pCO2, albúmina. Cannabis: - Incremento: ión sodio, ión potasio, cloruro, urea, insulina. - Descenso: creatininio, glucosa, urato.

7.6. CUANDO SE DEBE HACER EL EXAMEN DE LABORATORIO CLÍNICO_____________________________ En la fase preanalítica deberían tenerse en cuenta los cambios ocasionados en las muestras debidos al factor tiempo. Tres son las cuestiones esenciales en este contexto: • ¿Cuándo se debería tomar una muestra? – Momento (hora) del día. – El tiempo transcurrido después de la última extracción. – El tiempo transcurrido desde la última comida. – El tiempo transcurrido después de la administración de medicación, etc. • ¿Cuándo necesito los resultados relacionados con la muestra que se toma ahora? • ¿Son comparables los resultados con los obtenidos en un momento diferente de los ritmos diarios, mensuales y anuales, bien, a partir del mismo paciente o bien, de una población de referencia?

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En aras de la claridad, podemos diferenciar entre el tiempo lineal, que viene del pasado al futuro, y el tiempo cíclico; ambos pueden influir los resultados de los exámenes de laboratorio clínico. Influencia cronobiológica:

Lineal (ej. edad). Cíclica: - Diaria (circadiana) - Estacional - Biológica (ej. ciclo menstrual)

La influencia del ritmo circadiano Hay determinados componentes plasmáticos cuya concentración tiende a fluctuar en el transcurso de un día con un máximo (hora del día), un mínimo (hora del día) y una amplitud (porcentaje de la media diaria). Así, la concentración de ion potasio es más baja por la tarde que por la mañana, mientras que la de cortisol aumenta durante el día y disminuye por la noche. El ritmo de cortisol puede ser el responsable de los resultados incorrectos que se obtuvieron para la prueba de tolerancia oral a la glucosa realizada por la tarde. Por esta razón, los intervalos de referencia se obtienen normalmente entre las 07:00 y las 09:00 de la mañana. El ritmo circadiano puede también estar influenciado por los ritmos individuales en lo que concierne a las comidas, ejercicio y sueño. Estas influencias no deben confundirse con los cambios circadianos reales. En algunos casos, también tienen que considerarse las influencias estacionales. Así, la concentración de triiodotironina en el plasma es un 20 % más baja en verano que en invierno, mientras que la de calcidiol es más alta en el verano.

Magnitudes biológicas que pueden cambiar durante el ciclo menstrual Las magnitudes biológicas también pueden presentar cambios estadísticamente significativos debido a los cambios biológicos que ocurren durante el ciclo menstrual. Así, la concentración de aldosterona en el plasma es dos veces más alta antes de la ovulación que en la fase folicular. Asimismo, la concentración de renina en el plasma puede mostrar un incremento preovulatorio. Incluso la concentración de colesterol en el plasma presenta una disminución importante durante la ovulación. En contraste, las concentraciones de fosfato y de hierro en el plasma disminuyen durante la menstruación.

¿Por qué se ha de tomar la muestra de sangre 12 h después de la última comida? La concentración de diversos metabolitos de los alimentos pueden aumentar en la sangre venosa o alterarse debido a efectos hormonales postabsortivos. Otras magnitudes pueden alterarse por la turbidez producida por la quilomicronemia presente en las muestras de sangre posprandial. Para eliminar estas variables, se recomienda un período de 12 h de ayuno antes de la extracción de sangre. El momento adecuado con respecto a procesos diagnósticos y terapéuticos Diversos procedimientos diagnósticos pueden influir en los resultados de laboratorio. Con el fin de impedir esto, el momento de la toma de muestra tiene que organizarse para que se realice antes de los procedimientos diagnósticos interferentes. Los fármacos que interfieran sé deberán administrar después de haber tomado la muestra de sangre.

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Por otra parte, en la monitorización farmacoterapéutica el momento exacto de la toma de muestra es esencial para la interpretación correcta de la misma.

Normas importantes para la elección del momento de la toma de muestra

• • • • • • •

Las muestras deberán tomarse entre las 07:00 y las 09:00 de la mañana. La toma de muestras deberá efectuarse 12 h después de la última comida. Las muestras deberían extraerse antes de que se realicen procedimientos diagnóstico y terapéuticos interferentes. En monitorización farmacoterapéutica, se considerará el pico después de la administración del fármaco y la fase de estado estacionario antes de la próxima dosis. Debe registrarse siempre la hora exacta de la toma de muestras en el documento apropiado. Una muestra tomada en el momento equivocado puede ser peor que no tomar ninguna muestra. Una muestra cuyos resultados llegan demasiado tarde es una muestra derrochada.

7.7. TOMA DE MUESTRAS DURANTE LA TERAPIA DE INFUSIÓN INTRAVENOSA______________________ ¿Resultados de laboratorio inverosímiles después de una intervención diagnóstica y terapéutica? Las siguientes medidas diagnósticas y terapéuticas pueden inducir efectos sobre los exámenes de laboratorio tanto in vivo (frecuente) como in vitro (menos común):

Intervenciones quirúrgicas Infusiones y transfusiones Punciones, inyecciones, biopsias, palpaciones, masajes de todo el cuerpo Endoscopía Diálisis Estrés físico (p. ej. ergometría, ejercicio, electroencefalograma) Pruebas funcionales (p. ej. prueba de tolerancia oral a la glucosa) Immunoescintigrafía Medios de contraste, fármacos Estrés mental Radiación ionizante

7.8. LAS INTERVENCIONES QUIRÚRGICAS_________________________________________________ Los cambios en las concentraciones catalíticas de enzimas en el plasma son frecuentemente tan grandes que su utilización como marcadores organoespecíficos no es posible. La elevación de la concentración de las proteínas de fase aguda (p. ej. proteína C reactiva, fibrinógeno) en el plasma al principio de la fase

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postoperatoria se acompaña de una disminución en la concentración de albúmina; esto no puede explicarse sólo por la hemodilución. En los primeros días del postoperatorio, son muy frecuentes las elevaciones transitorias de la concentración de urea en el plasma (hasta 10 mmol/L) y la disminución de la de colesterol, mientras que la de creatininio permanece en el intervalo de referencia. Esto puede ser debido a la metabolización de proteínas subsiguiente a la cirugía del tracto gastrointestinal, así como también a la hemorragia del lumen intestinal, p. ej. en el caso de una úlcera por estrés.

7.9. IMPACTO DE LA SECUENCIA DE PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Y TERAPEÚTICOS______________ Las infusiones y transfusiones La hemólisis y, por tanto, las concentraciones de ión potasio y de hemoglobina, así como también la concentración catalítica de lactato-deshidrogenasa en el plasma obtenido de la sangre conservada, aumenta con el tiempo de conservación del material transfundido. La contaminación de las muestras de laboratorio por soluciones de infusión intravenosa es la forma de interferencia preanalítica más común y frecuentemente más relevante en el hospital. La sangre nunca deberá extraerse de una zona próxima al lugar de infusión.

Infusiones / Transfusiones como factores interferentes o contaminantes de los exámenes de laboratorio clínico Infusión / Transfusión Dextrano

Gamma Globulina Electrolitos

Magnitud afectada Tiempo de trombina Factor von Willebrand Proteína plasmática Urea plasmática Anticuerpos eritrocíticos

Fructosa

Anticuerpos contra virus o bacterias Ión sodio, ión potasio, magnesio Glucosa plasmática Fosfato e ión potasio plasmát. α-Amilasa y bilirrubina plasm. Urato

Citrato (Transf. Sangre)

pH del plasma Pruebas de coagulación

Glucosa

Tendencia ↓ ↓ ↑ ↓

Comentarios, mecanismo 5 – 10 s más lento (turbidez, floculación, color verd). Seudoaglutinación Falso positivo

↑

Contaminación

↑ ↓ ↓

Contaminación Insulina Hasta un 15 % esp. en neonatos

↑

Efectos metabólicos

↓ ↓↑

Inhibición

Las muestras deberán extraerse en el brazo opuesto. Se debería permitir que transcurriera un período de tiempo seguro después de la terapia de infusión.

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Recomendaciones para programar el horario de extracción de sangre con respecto al tipo de infusiones intravenosas Tiempo mínimo (horas), para la Infusión intravenosa extracción de sangre después de finalizar la infusión Emulsión grasa intravenosa

Soluciones ricas en glúcidos

Hidrolizados de aminoácidos y proteínas

Electrolitos

Se recomienda que se informe al laboratorio de cuando y qué tipo de infusiones se efectuaron y cuando se tomaron las muestras de sangre. Extracciones desde catéteres Si las muestras han de ser tomadas desde catéteres de infusión intravenosa e intraarterial, la cánula debe enjuagarse con solución salina isotónica en cantidad proporcional al volumen del catéter. Los 5 mL primeros de sangre deberán desecharse antes de la recolección de la muestra de sangre. La toma de muestras para las pruebas de coagulación desde catéteres heparinizados es particularmente crítica. Para métodos sensibles a la heparina («tiempo de trombina», «tiempo de tromboplastina parcial»), se recomienda desechar una cantidad de sangre equivalente a dos veces el volumen del catéter; la primera sangre tomada después de esto debería usarse para exámenes no hemostáticos y la sangre citratada obtenida a continuación utilizarse únicamente para la medición de magnitudes insensibles a la heparina: «tiempo de protrombina», «tiempo de reptilasa», concentraciones de fibrinógeno (método Clauss), antitrombina y monómeros de fibrina en el plasma. Es importante que antes de transferir la sangre al tubo que contiene la solución de citrato de trisodio no haya una pausa larga durante la cual se permita a la sangre «reposar» en el catéter. Estrés mental La importancia del estrés mental sobre los resultados de laboratorio se subestima frecuentemente (la ansiedad ante la extracción de sangre, el estrés preoperatorio, etc.). Se ha observado un incremento en la secreción de aldosterona, angiotensina, catecolaminas, cortisol, prolactina, somatotropina, tirotropina, vasopresina y renina, y un incremento en las concentraciones de albúmina, fibrinógeno, glucosa, insulina, lactato y colesterol en el plasma (hasta 1,8 mmol/L bajo la tensión de un exámen estudiantil).

7.10. EFECTOS DE LA POSTURA Y EL TORNIQUETE___________________________________________ Postura Es un hecho bien conocido que la posición del cuerpo influye en las concentraciones de los componentes de la sangre. Este fenómeno está ocasionado por mecanismos diferentes. El primero, la presión de filtración efectiva (esto es, la diferencia entre la presión capilar y la presión osmótica coloidal en el plasma) aumenta en las extremidades más bajas cuando se cambia desde la postura horizontal a la vertical. Como consecuencia, el agua se mueve desde el compartimento intravascular al intersticial; reduciendo el volumen de plasma alrededor del 12 % en individuos normales. Las partículas sanguíneas con un diámetro de más de 4 nm son retenidas por las membranas y no pueden acompañar este cambio de volumen. Un cambio desde la posición vertical a la horizontal conduce a una

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disminución en la presión efectiva de filtración y como consecuencia el cambio de volumen se produce en la dirección contraria. Un cambio en el volumen plasmático conduce a un cambio aparente de concentración en las células, macromoléculas y pequeñas moléculas enlazadas a proteínas. Otros cambios son debidos a la alteración de la presión sanguínea que a su vez causa la secreción de componentes vasoactivos. Por tanto, las consecuencias metabólicas de los cambios reguladores debido a cambios posturales pueden alterar la composición del fluido corporal. La mayoría de los componentes de baja masa molar no muestran cambios en sus concentraciones aparentes cuando se cambia desde la posición vertical a la horizontal. A causa del enlace parcial a proteínas, las concentraciones de ión calcio y ligado se ven afectadas de manera diferente. Mientras que la concentración de ión calcio es independiente de la postura, la de calcio(II) aumenta en un 5-10 % cuando se cambia desde la posición horizontal a la vertical. Como podía esperarse a partir del mecanismo descrito, la concentración de la mayor parte de los componentes celulares y macromoleculares de la sangre aumenta entre un 5 y 15 % comparado con la posición horizontal. Estos efectos pueden pronunciarse más en pacientes con tendencia a presentar edema (insuficiencia cardiovascular, cirrosis hepática). La reducción en el volumen de plasma induce una disminución en la presión sanguínea que a su vez conduce a un aumento de la secreción de renina, aldosterona, noradrenalinio y adrenalinio. Una caída en la presión sanguínea ocasiona un incremento en la secreción de péptido natriurético atrial que conlleva un incremento en sus concentraciones plasmáticas. Un ejemplo de los cambios metabólicos ocasionados por la influencia de la postura es la excreción urinaria de calcio(II) que aumenta durante periodos prolongados de reposo en cama. El torniquete ¿Qué sucede cuando un torniquete se mantiene puesto durante la extracción de sangre? Un torniquete se aplica comúnmente para facilitar la localización de la vena apropiada para la venopunción. Usando una presión superior a la presión sistólica se mantiene la presión efectiva de filtración dentro de los capilares. Como consecuencia, el fluido y los componentes de baja masa molar se trasladan desde el espacio intravascular al intersticial. Las macromoléculas, los componentes unidos a proteínas y las células sanguíneas, no penetran la pared capilar por lo que su concentración aparentemente aumenta. Las alteraciones de componentes de baja masa molar observadas después de 6 min de constricción están en un intervalo de ±3 % y, por tanto, dentro del intervalo de imprecisión interserial. Sin embargo, se ha demostrado que esa constricción de los músculos del antebrazo ocasiona un aumento en la concentración de ion potasio en el plasma. Las diferencias en la concentración de este componente en muestras tomadas ordinariamente y aquellas tomadas sin ejercicio de una vena superficial en el brazo opuesto eran de hasta 0,8 mmol/L. Las diferencias eran todavía mucho más pronunciadas cuando la sangre se extrajo de una vena profunda y el ejercicio fue muy intenso durante la extracción. Por lo tanto, durante la venopunción para la medición de la concentración de ion potasio, debería evitarse el ejercicio y seleccionarse una vena superficial. Una venostasis de 2 min no cambió la concentración de lactato en el plasma (media +2,2 %), pero disminuyó significativamente la de piruvato (media -18 %). El alcance de los cambios en componentes de alta masa molar depende de la duración de la constricción. Los mayores efectos sobre los cambios de la concentración catalítica de lactato-deshidrogenasa y de la concentración de proteína en el suero, durante un tiempo de aplicación del torniquete de 15 minutos, se observaron dentro de los primeros 5 min, a partir de ahí, los cambios fueron poco importantes. Tiempos de constricción de 1 min seguidos de liberación del torniquete no tienen consecuencias sobre las concentraciones de los componentes del suero y los factores de coagulación del plasma.

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Recomendaciones:

- Cuando la extracción de sangre es en la fosa antecubital, insertar la aguja dentro del primer minuto después de la aplicación del torniquete. - Evite el ejercicio durante la extracción. - Libere el torniquete tan pronto como la sangre fluya dentro del primer tubo. - Use el otro brazo, cuando haya de repetirse el torniquete.

7.11. FACTORES PREANALÍTICOS QUE PUEDEN AFECTAR A LOS RESULTADOS______________________

Factores Preanalíticos que pueden afectar a los resultados

RAZA, SEXO, EDAD. GESTACIÓN. HABITOS VARIABLES: dieta, ayuno, ejercicio, altitud. CAFEÍNA, TABACO, ALCOHOL, OTRAS DROGAS DE ABUSO. RITMOS BIOLÓGICOS. HOSPITALIZACIÓN. MEDIDAS DIAGNÓSTICAS Y TERAPÉUTICAS POSTURA. TIEMPO DE APLICACIÓN DEL TORNIQUETE. FLEBOTOMIA. TIPO DE MUESTRA (SUERO O PLASMA). ADITIVOS (ANTICOAGULANTES, CONSERVANTES). CONTENEDOR DE MUESTRAS. IDENTIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS. CÓDIGO DE BARRAS. TEMPERATURA DE ALMACENAMIENTO Y MANIPULACIÓN. EXPOSICIÓN A LA LUZ. TRANSPORTE DE MUESTRAS AL LABORATORIO. TIEMPO Y TEMPERATURA. RECEPCIÓN DE LAS MUESTRAS EN EL LABORATORIO. ORDENACIÓN DE MUESTRAS EN EL LABORATORIO. PROCESOS DE CENTRIFUGACIÓN. PROCESO DE SELECCIÓN Y DETECCIÓN DE ERRORES PREANALÍTICOS. SUEROS ICTÉRICOS, LIPÉMICOS (TURBIDEZ), HEMOLIZADOS. CUMPLIMENTACIÓN INCORRECTA DEL FORMULARIO DE PETICIÓN.

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7.12. PREPARACIÓN DEL PACIENTE__________________________________________________________ Factores a considerar: a) Momento del día: existen componentes plasmáticos que tienden a fluctuar a lo largo del día, el potasio (10%) y el hierro (30%) más bajos por la tarde; el cortisol más alto por la tarde. Por lo tanto se recomienda la recogida de muestras de 7 - 9 de la mañana. b) Tiempo transcurrido desde la última extracción: existen parámetros cuya capacidad de variación inducidos por tratamiento no es instantánea (en anemia ferropénica la restauración de los depósitos de hierro se sitúa en tres meses, iniciándose las primeras respuestas a las tres semanas). c) Tiempo transcurrido desde la última comida: la concentración de diversos metabolitos de los alimentos puede aumentar después de su ingesta o bien alterarse debido a efectos hormonales postabsortivos. Otras magnitudes se alteran por turbidez de la muestra producida por los quilomicrones. Se recomienda un ayuno de 12 horas antes de la extracción. d) Tiempo transcurrido desde la última medicación: para evitar interferencias biológicas y analíticas, las extracciones deben realizarse antes de la ingesta de medicamentos. e) Sin actividad física extenuante los 3 días previos. f) Después de 5 minutos tumbado o sentado. g) Sin haber ingerido alcohol.

7.13. INFORMACIÓN Y RECOMENDACIONES PREANALÍTICAS PARA EL PACIENTE_____________________

Información y recomendaciones preanalíticas para el paciente

⇒ ⇒ ⇒ ⇒ ⇒ ⇒ ⇒ ⇒ ⇒ ⇒ ⇒ ⇒ ⇒

⇒ ⇒

PARA ANALISIS DE SANGRE: EN AYUNAS 12 HORAS. SI ESTA TOMANDO MEDICACION, CONSULTAR PREVIAMENTE CON SU MEDICO. INFORMARSE SOBRE EL HORARIO DE EXTRACCIONES. ES IMPRESCINDIBLE LA CITA PREVIA. ACUDIR A LA TOMA DE MUESTRAS CON EL IMPRESO DE PETICION ANALITICA. SEGUIR LAS NORMAS DE HIGIENE EN LA RECOGIDA DE MUESTRAS. GUARDAR EXACTAMENTE LOS TIEMPOS DE RECOGIDA DE MUESTRAS. CONSERVAR ADECUADAMENTE LAS MUESTRAS DURANTE LA RECOGIDA. AÑADIR, SI FUERA PRECISO, MANIPULANDOLO CON CUIDADO EL CONSERVANTE A LA ORINA. EL ADITIVO O CONSERVANTE SE LE DARA EN EL LABORATORIO. UTILIZAR SIEMPRE CONTENEDORES ESTERILES. ENTREGAR SIEMPRE TODA LA MUESTRA RECOGIDA. SI SE PIERDE O CONTAMINA PARTE DE LA MUESTRA, INICIAR DE NUEVO LA RECOGIDA IDENTIFICAR CORRECTAMENTE CON EL NOMBRE Y DOS APELLIDOS LOS CONTENEDORES DE MUESTRA. CERRAR BIEN LOS CONTENEDORES DE MUESTRAS. SEGUIR EN TODO MOMENTO LAS NORMAS ELABORADAS POR EL LABORATORIO.

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Capítulo 8. Los especímenes, las muestras y los aditivos

8.1. Espécimen y muestra 8.2. Suero y plasma 8.3. Factores que influyen en la calidad de los especímenes y las muestras 8.4. Tipos de muestra 8.5. Contenedores y aditivos 8.6. Aditivos para la toma de muestras de sangre 8.7. Contenedores y aditivos para la recogida de muestras de orina

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8.1. ESPÉCIMEN Y MUESTRA___________________________________________________________ Espécimen: es una parte representativa de un sistema biológico que cambia continuamente tomada de un individuo en un momento dado (sangre, orina, heces, líquidos biológicos). Se refiere a la muestra original, tal y como se extrae del paciente. Muestra primaria. Muestra: material biológico útil para análisis que el laboratorio toma directamente del paciente (espécimen) o que le es remitido para su análisis. Una o más partes tomadas de un sistema y previstas para proporcionar información sobre el mismo a menudo como base de decisión sobre el sistema o sus productos. Procede de una manipulación del espécimen que lo convierte en muestra (ej: centrifugación). Se refiere a la muestra tal y como se va a analizar. Ejemplo: Un volumen de suero tomado de un volumen mayor del mismo.

8.2. SUERO Y PLASMA_______________________________________________________________ El suero se obtiene a partir de la sangre por centrifugación después de la finalización del proceso de coagulación llevado a cabo por las plaquetas y los factores de la coagulación. Por definición, está desprovisto de factores de coagulación pero enriquecido con los componentes celulares y productos metabólicos de plaquetas. El plasma es el sobrenadante virtualmente libre de células obtenido tras la centrifugación de la sangre, cuya coagulación está inhibida por la adición de anticoagulantes inmediatamente después de la toma de la muestra. Los anticoagulantes inhiben la formación del coágulo mediante diversos mecanismos. Para algunos componentes, hay diferencias de relevancia diagnóstica entre los resultados obtenidos en suero y los obtenidos en el plasma. Se ha demostrado una correlación lineal entre la diferencia en la concentración de ion potasio y fosfato en el suero o en el plasma y la concentración de plaquetas en la sangre. Para algunos componentes que se encuentran en gran cantidad en las plaquetas puede suceder, que su concentración en el suero no se mida correctamente, p. ej. las concentraciones de fosfatasa ácida, γ-fosfopiruvato-hidratasa («enolasa específica neuronal»), dopamina y serotonina. Las diferencias, entre las concentraciones obtenidas en el suero y en el plasma, son debidas a las siguientes razones fisiológicas y técnicas:

El componente puede agotarse durante la coagulación: fibrinógeno, plaquetas, glucosa. El componente puede liberarse desde las células durante la coagulación: amonio, fosfato, ion potasio, lactato, lactatodeshidrogenasa. El anticoagulante puede interferir o contaminar el procedimiento de medida: γglutamiltransferasa, litio por espectrometría de emisión atómica de llama, cuando se calibra con litio. La metodología de la medición respectiva, incluyendo por ejemplo el tipo de instrumento de medida utilizado (medida monocromática o bicromática) puede ocasionar interferencias. El fibrinógeno puede interferir el procedimiento de medida (algunos procedimientos inmunoquímicos heterogéneos).

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¿Qué ventajas tiene el plasma sobre el suero? 1. Ahorro de tiempo. Se elimina la espera para que la sangre coagule. Se puede centrifugar inmediatamente. El período de centrifugación puede reducirse aumentando la velocidad de rotación. 2. Mayor rendimiento. De la sangre puede obtenerse un 15-20% más de plasma que de suero. 3. No hay virtualmente interferencias debidas a la coagulación subsiguiente. En suero puede producirse coagulación poscentrifugación. Esto no ocurre en el plasma. 4. Los resultados del plasma son más representativos del estado in vivo que los del suero. 5. Bajo riesgo de hemólisis y trombocitolisis. En personas sanas, la concentración de hemoglobina es unas 10 veces menor en el plasma que en el suero. En el plasma, las plaquetas permanecen intactas in vitro; por tanto, no liberan ion potasio, tal y como sucede en el suero. ¿Que desventajas tiene el plasma con respecto al suero? 1. Se altera la electroforesis de proteínas. El fibrinógeno aparece como un pico en la región de las γglobulinas y puede confundirse o enmascarar un gradiente. 2. Las interferencias. Los anticoagulantes pueden como potenciales agentes complejantes e inhibidores enzimáticos, producir interferencias según el método de medida. Cada nuevo procedimiento de medida deberá, probarse para diversos anticoagulantes, p. ej. interferencias frente a la heparina. 3. Las interferencias catiónicas. Cuando se usan heparinatos, el litio o el amonio pueden interferir con los procedimientos para medirlos. Los sistemas desechables para la extracción de sangre con aditivos facilitan y mejoran el procedimiento de toma de muestras y han supuesto una contribución global a la mejora del grado de normalización en la recolección de sangre venosa. Si se utilizan tubos con separador de suero o plasma, debería evitarse una nueva centrifugación posterior al almacenamiento de la muestra en el refrigerador, ya que esto conduciría a aumentos apreciables en las concentraciones de ion potasio, fosfato, lactato-deshidrogenasa y alanina-aminotransferasa. Cuando se obtiene suero, es necesario esperar hasta que la sangre haya coagulado completamente (30 min a temperatura ambiente); si no se hace así, puede producirse una poscoagulación, que puede ocasionar errores, así como también obstrucciones en los sistemas de analizadores.

8.3. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA CALIDAD DE LOS ESPECÍMENES Y LAS MUESTRAS________________ a) Identificación: el espécimen y la muestra no deben perder la identificación durante todo el proceso. Debe permitir ver el volumen de llenado y el contenido. Sin borrones ni tachaduras. Utilizar etiquetas de código de barras o rotular con rotulador permanente. b)

Tipo de muestra: obtención de las muestras adecuadas para las magnitudes bioquímicas solicitadas.

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8.4. TIPOS DE MUESTRA______________________________________________________________ El laboratorio procesa los siguientes tipos de muestra

Descripción

Símbolo

SUERO

Srm

PLASMA HEPARINA DE LITIO

Pla

PLASMA EDTA

Pla

PLASMA FLUORURO OXALATO

Pla

SANGRE TOTAL HEPARINIZADA

San

SANGRE TOTAL EDTA

San

SANGRE DE CORDÓN

San

POOL DE SUEROS

Srm

ORINA DE 1 MICCIÓN

Uri

ORINA DE 24 HORAS

Uri

ORINA DE 5 HORAS

Uri

ORINA DE 24 HORAS CON CONSERVANTE

Uri

HECES DE 1 DEPOSICIÓN

Fae

HECES DE 24 HORAS

Fae

LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO

LCR

LÍQUIDO PLEURAL

LPl

LÍQUIDO ASCÍTICO

LAs

LÍQUIDO SINOVIAL

LSi

SEMEN

Sem

SUDOR

Sud

LÍQUIDO AMNIÓTICO

LAm

OTROS LÍQUIDOS BIOLÓGICOS

---

CALCULO URINARIO

CUr

CALCULO BILIAR

CBi

OTRAS MUESTRAS

---

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8.5. CONTENEDORES Y ADITIVOS_______________________________________________________ Los tubos están codificados por color para indicar el tipo de aditivo que contienen y usan el código de color conforme a la norma ISO 6710, reconocida en todo el mundo.

Descripción

Vol. mL

Muestra

Aditivo

Tubo tapón amarillo

8,5

Suero

(SST) II gel-sílice

Tubo tapón azul

3,5

Suero

(SST) II gel-sílice

Tubo tapón verde claro

3,0

Plasma

(LH PST) II Heparina-Litio

Tubo tapón malva

3,0

Plasma o Sangre total Líquido sinovial

(K2E) EDTA potásico

Tubo tapón gris claro

4,0

Plasma o Sangre total

(FX) fluoruro-oxalato

Tubo tapón rojo *

8,5

Suero

(SST) II gel-sílice

Tubo tapón morado *

10,0

Plasma o Sangre total

(K2E) EDTA potásico

Tubo tapón verde oscuro *

4,0

Plasma o Sangre total

LH Heparina-Litio

Jeringa de gasometría

1,7

Sangre total anaeróbica

Heparina electrolíticamente balanceada

Capilar de gasometría

0,1

Sangre total anaeróbica

Heparina electrolíticamente balanceada

100

Orina de 1 micción. Semen

Sin aditivo

9,5

Orina de 1 micción

Sin aditivo

Contenedor color ámbar

3000

Orina de 24 horas

Sin aditivo (adicionable)

Vaso con cucharilla

100

Heces

Sin aditivo

Tubo vidrio estéril negro tapón de rosca

7,5

Líquidos Biológicos (salvo sinovial).

Sin aditivo (adicionable)

Vaso contenedor con/sin tubo Tubo tapón beige

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Tubos suero-plasma-sangre total

Jeringa extracción de gases-sangre total Tubo para micromuestra-pediátrica

Contenedores para orina

Contenedores para heces

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8.6. ADITIVOS PARA LA TOMA DE MUESTRAS DE SANGRE________________________________________ Para asegurar que no hay confusión por parte del flebotomista (extractor de sangre) en la identificación del tubo apropiado, los tapones de los tubos que contienen anticoagulante y aditivo están codificados por colores. Así, para los tubos que contienen anticoagulante, el código de color del tapón es violeta para el EDTA, verde para la heparina y azul para el citrato. Los inhibidores glicolíticos tales como fluoruro o iodoacetato solos o en combinación con anticoagulantes tales como la heparina o el EDTA se han codificado de color gris. Estos colores se han incluido en una norma ISO. Heparina La heparina, cuyo uso es muy útil en los tubos de recolección de sangre, actúa acelerando la inhibición del factor Xa por la antitrombina. A diferencia de las preparaciones de heparina de baja masa molar, la heparina convencional de masa molar alta utilizada en los tubos de recolección de sangre también posee actividad de antitrombina. Aunque para las mediciones bioquímicas en el plasma el anticoagulante más utilizado es la sal de litio de la heparina, también están disponibles comercialmente los tubos de extracción de sangre que contienen las sales de sodio o de amonio de la heparina. La heparina de amonio puede limitar la medición de la concentración de urea mediante los iones amonio. EDTA El EDTA de dipotasio (K2EDTA) funciona como un anticoagulante quelando el calcio. Es el anticoagulante de elección para la recolección de muestras de sangre destinadas a la medida de la concentración de las células de la sangre, así como para su clasificación según su tamaño. Citrato El citrato de trisodio también funciona como un anticoagulante por quelación del calcio. Es el anticoagulante estándar para la recolección de muestras destinadas a la realización de los exámenes globales de coagulación. Inhibidores de la glicólisis Tanto el fluoruro de sodio como el iodoacetato de litio se utilizan en los tubos de extracción de sangre para conservar la glucosa. El fluoruro inhibe la enzima fosfopiruvatohidratasa en la ruta de la glicólisis y por esto previene la degradación de la glucosa. En contraste con el fluoruro, el iodoacetato actúa sobre la gliceraldehido-3-fosfatodeshidrogenasa. Después de una disminución inicial de la glucosa durante las primeras 3 h de la extracción de la muestra (una pérdida media de 0,5 mmol/L en sujetos sanos), tanto el fluoruro como el iodoacetato son efectivos en la preservación de la glucosa durante 3 días al menos. Sin embargo, debería tenerse en cuenta que muestras de sangre con elevadas concentraciones de leucocitos, eritrocitos o plaquetas tienen un consumo de glucosa más rápido, antes de que los inhibidores tales como fluoruro o iodoacetato comiencen a ser efectivos. En los neonatos, debido particularmente a la elevada fracción de volumen de los eritrocitos en la sangre («hematocrito»), puede consumirse hasta un 68% de la glucosa en las muestras de sangre recolectadas sin inhibidores de la glicólisis y almacenadas a temperatura ambiente durante 5 h. Para superar este problema se han sugerido inhibidores que inhiban la primera enzima, la hexocinasa, de la ruta glicolítica. Un inhibidor tal como la manosa se utiliza en combinación con fluoruro para una mejor conservación de la glucosa. El laboratorio proporcionará los aditivos necesarios para la recogida de muestras para pruebas especiales que los precisen y comunicará las precauciones que se deberán adoptar en su manipulación.

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8.7. CONTENEDORES Y ADITIVOS PARA RECOGIDA DE MUESTRAS DE ORINA________________________ Tipos de contenedores de orina Para orina de una micción: Se emplearan contenedores estériles de un sólo uso, transparentes, de material plástico, cierre hermético, con un volumen de unos 100 – 150 mL y con tubo de plástico adicional de fondo cónico. Etiqueta para identificación.

Para orina de tiempo controlado (24 h): contenedores estériles de un solo uso, de material plástico, hedidura lateral para un fácil manejo, cierre hermético, obturador o junta inerte, cuerpo traslúcido, graduado en relieve cada 50 mL y con una capacidad de 3 litros. Para pruebas que precisen preservar la orina de la luz, será necesarios contenedores de color que impidan que penetre la luz en la orina.

Contenedores de orina

Serán suministrados a los pacientes los recipientes y sustancias conservantes adecuados y necesarios para recoger los especímenes de orina. Los recipientes deben reunir las condiciones de esterilidad, capacidad y opacidad que requieran las determinaciones solicitadas por el médico. Deberán tener la capacidad necesaria. Se deberá disponer de contenedores estériles para los cultivos y opacos con color topacio para la recogida de constituyentes sensibles a la luz. Se recomienda el empleo de contenedores con dispositivos de transferencia a tubos de recogida por sistema de vacío ya que presentan numerosas ventajas, entre las que destacan: • Facilitan la identificación positiva de la muestra suprimiendo errores de etiquetado. • Son más higiénicos: al manejarse alícuotas, se pueden colocar en gradillas impidiendo el derramamiento de las muestras y los consiguientes olores en las neveras de transporte. • Previenen la contaminación biológica al eliminar el destapado de los contenedores y el trasvase a los tubos por decantación. De esta forma se incrementa la seguridad del personal implicado en la manipulación evitando exposiciones accidentales a la orina y contagios potenciales. • Permiten una optimización del personal: al llegar al Laboratorio las alícuotas perfectamente identificadas y diferenciadas por los tipos de tubos, colores de los tapones, se agilizan los flujos de trabajo en el Laboratorio ya que en la mayoría de los casos las mismas alícuotas se podrán emplear como tubos primarios en los autoanalizadores. Si se considera conveniente, los recipientes se podrán entregar en las mismas consultas así como en los puntos de citación ajenos al Laboratorio pero siempre por personal entrenado que conozca y tenga en cuenta las exigencias concretas que pueden requerir algunas determinaciones en orina.

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Contenedores e Instrucciones para la recogida de orina Se recomienda el empleo de contenedores limpios, de boca ancha y con tapa de rosca de doble cierre de seguridad. Recomendamos el uso de contenedores con dispositivos de transferencia a tubos por sistema de vacío. Los recipientes de especímenes para cultivo microbiológico deberán ser obligatoriamente estériles. Los contenedores deberán ir acompañados de una hoja de instrucciones que permita una comprensión fácil por parte del paciente. Se debe dar todo tipo de facilidades al paciente, evitándole al máximo que tenga que manipular la orina. Son útiles los contenedores con dispositivos de transferencia a tubos de recogida por sistema de vacío; éstos presentan numerosas ventajas en cuanto a la facilidad de manejo ya que permiten el llenado de tantas alícuotas como sean necesarios de forma fácil, rápida e higiénica; evitando riesgos de derramamiento, contaminación, olores, exposiciones accidentales a la orina con el peligro de contagios, etc. Empleo de conservantes Se recomienda evitar al máximo el uso de los conservantes de orina salvo para las determinaciones que exijan su empleo, como son determinados metabolitos en orina de 24 horas. Siempre que las determinaciones solicitadas lo permitan, las alícuotas se acondicionarán en el laboratorio a posteriori. Contenedores para la recogida de orina de tiempo controlado Se recomienda el empleo de contenedores de plástico de boca ancha con capacidad para tres litros, enrasados con exactitud, con cierre de seguridad y dispositivo de transferencia a tubos de recogida de orina por sistema de vacío. Los requisitos de opacidad y color topacio deben cumplirse al menos cuando sean necesarios. Los recipientes y conservantes que proceda utilizar para la recogida de orina de 24 horas los debe proporcionar el centro sanitario de manera gratuita. Se recomienda que sea el personal que cita al paciente quien los entregue junto con unas instrucciones escritas y apoyo oral, asegurándose del correcto entendimiento por parte del paciente.

Los envases deben cumplir los siguientes requisitos: • Tener boca ancha, lo cual facilita el trasvase de la orina desde el orinal o recipiente de recogida. • Capacidad para contener tres litros de orina, de este modo la mayoría de las recolecciones de orina de 24 horas podrían realizarse en un único recipiente con la consiguiente ventaja de evitar recogidas incompletas, así como facilitar la homogeneización y en general la manipulación permitiendo un flujo de trabajo más ágil. • Poseer una escala de graduación exacta que facilite la medida del volumen. • Deben tener tapa de rosca con cierre de seguridad para evitar derramamientos durante la manipulación y el transporte. • En el caso de contener algún producto tóxico o corrosivo como conservante, se debe reflejar en una etiqueta con los símbolos internacionales adecuados. • Cuando el analito que se quiere cuantificar es sensible a la luz es preceptivo el empleo de recipientes opacos y de color topacio. • Se recomienda el uso de dispositivos de transferencia mediante vacío ya que facilitan la obtención de alícuotas de una forma limpia y segura para la persona que manipula las muestras.

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Empleo de conservantes para orina de tiempo controlado Las solicitudes con determinaciones en orina de 24 horas suelen presentar una gran complejidad, ya que algunos componentes de la orina son inestables y, para evitar el deterioro de los solutos a cuantificar, exigen la presencia de un estabilizador o conservante especial añadido al contenedor antes de iniciar la recolección de la orina. Como norma general, se debe evitar el empleo de conservantes y, siempre que existan varias alternativas, se optará por el menos peligroso para el paciente, de tal forma que si para la cuantificación de un determinado analito en orina de 24 horas se recomienda que se recoja sobre medio ácido, pero admite la posibilidad de recogerse sin conservante y acondicionar la muestra a posteriori en el laboratorio, se optará por este segundo procedimiento. Por otro lado, en aras de simplificar al máximo las condiciones de recogida de las orinas de 24 horas y el manejo de conservantes, se recomienda el empleo del menor número posible de sustancias estabilizantes en cada laboratorio, a pesar de que en algún caso esta simplificación implique un mayor riesgo para el paciente. Los contenedores que contengan sustancias peligrosas deberán estar etiquetados adecuadamente con los símbolos de peligrosidad internacionalmente reconocidos y se debe indicar al paciente tanto en la hoja de instrucciones como de forma oral los riesgos de estas sustancias y las medidas que debe adoptar para evitar accidentes.

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Capítulo 9. Toma e identificación de las muestras

9.1. Toma de muestras de sangre 9.2. Recogida de muestras de orina 9.3. Recogida de muestras de heces 9.4. Toma de muestras de líquidos biológicos 9.5. Recogida de muestras de semen 9.6. Identificación de las muestras

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Dentro del proceso preanalítico y una vez recibida la petición analítica, verificadas las condiciones preanalíticas y conocidos los contenedores necesarios, procederemos a la toma o recogida de la muestra.

9.1. TOMA DE MUESTRAS DE SANGRE___________________________________________________

PROCESOS

4. INSPECCIÓN Y SELECCIÓN DE LA ZONA DE PUNCIÓN

1. Identificación del paciente. 2. Preparación del equipo de extracción. 3. Preparación del paciente. 4. Inspección y selección de la zona de punción. 5. Desinfección de la zona de punción. 6. Identificación de la muestra.

1. IDENTIFICACIÓN DEL PACIENTE Confirme la información en el volante de solicitud y compruebe que los datos corresponden al paciente mediante una identificación positiva (preguntarle cómo se llama y que sea el paciente el que diga su nombre y apellidos). Informe al paciente del procedimiento de extracción de sangre y verifique las condiciones en las que acude a la extracción antes de la toma de muestra.

2. PREPARACIÓN DEL EQUIPO DE EXTRACCIÓN Prepare todo el equipo necesario y asegúrese de que haya un contenedor para objetos corto-punzantes a mano.

EXTRACCIÓN DE SANGRE VENOSA: SISTEMA DE EXTRACCIÓN POR VACÍO

5. DESINFECCIÓN DE LA ZONA DE PUNCIÓN Limpie la zona con alcohol realizando movimientos concéntricos, empezando por la zona de punción hasta el exterior, dibujando un círculo de unos 10 cm de diámetro. Una vez aplicado el desinfectante debe dejarse secar. El secado del desinfectante es importante por dos razones: 1. Los restos de alcohol pueden producir hemólisís. 2. Si no está bien seco le escocerá al paciente en el momento de la punción. No volver a tocar la zona desinfectada.

PREPARACIÓN Y MANIPULACIÓN DEL EQUIPO DE EXTRACCIÓN DE SANGRE En caso de que la aguja no venga premontada, enroscar la aguja de seguridad en el portatubos BD Vacutainer~. Retirar el dispositivo de seguridad y abrir el estuche de protección de la aguja justo en el momento previo a la extracción.

Material: -Guantes -Antiséptico: alcohol, povidona o clorhexidina -Algodón -Accesos venosos y portatubos -Tubos -Torniquete y compresor -Etiquetas de identificación de la muestra

3. PREPARACIÓN DEL PACIENTE Coloque al paciente de manera que pueda extender el brazo elegido hacia abajo. Solicite que apoye el brazo en el reposabrazos evitando que lo doble a nivel del codo, formando así una línea recta entre el hombro y la muñeca. A la hora de seleccionar el sitio de punción, las venas son más prominentes si el paciente cierra el puño. Por el contrario, no debe pedirse al paciente que lo abra y cierre (bombeo) ya que esto puede causar variaciones en la concentración de algunos analitos. El brazo elegido debe estar extendido hacia abajo para evitar por un lado el reflujo de sangre a la vía, y por otro lado la contaminación de los tubos ya que de esta forma el aditivo no tocará el tapón ni la aguja que lo perfora.

6. IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA La muestra se identificará una vez realizada la extracción de sangre, desechado de la aguja y homogeneización de la misma con el aditivo. Deberá identificarse correctamente, es decir: . Con información completa. . Sin borrones. . Sin perder la identificación durante todo el proceso. En caso de emplear códigos de barras, debe dejarse siempre una ventana visible en el tubo que permita observar las condiciones en las que se recibe la muestra en el laboratorio. Por ello, se recomienda aplicar las etiquetas encima de las etiquetas de fabricación del tubo, en el caso de que las tenga.

Una vez realizada la punción, introducir el primer tubo a utilizar en el portatubos y dejar que fluya la sangre hasta que se agote el vacío del tubo. De esta forma se garantiza que la relacíón aditivo/sangre sea la correcta para la obtención de unos buenos resultados analíticos.

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APLICACIÓN DEL TORNIQUETE El torniquete se utiliza para aumentar el llenado de las venas, lo cual hace que éstas sean más prominentes y más fáciles de canalizar. Coloque el torniquete unos 10 cm por encima de la zona donde se va a hacer la venopunción. Aplique el torniquete suavemente de forma que todavía pueda sentir el pulso. La duración de loa aplicación del torniquete no debe exceder de 1 minuto ya que se produce un éxtasis local con hemoconcentración. Puede incluso ocurrir la infiltración de sangre en los tejidos de alrededor si la presión es muy alta. Esto puede dar lugar a resultados erróneos: -Concentraciones elevadas de parámetros proteicos. -Hematocrito elevado. -Trombocitopenias. -Hemólisis. Por lo tanto, debe soltarse el torniquete cuando la sangre comience a fluir en el primer tubo.

SELECCIÓN DE LA ZONA DE PUNCIÓN Para obtener una muestra sanguínea, básicamente se pueden pinchar todas las venas superficiales de la fosa antecubital, antebrazo y dorso de la mano. Una norma básica, es que no se prefiera una zona potencial de punción antes de haber examinado perfectamente el brazo del paciente. Para la punción debe examinar las venas en el siguiente orden: -Fosa antecubital de ambos brazos (extracción normal) El sitio ideal para la mayoría de las venopunciones y el más facil de hallar es la vena mediana cubital - Dorso de ambas manos para venas delicadas o difíciles.

SELECCIÓN DE LA ZONA DE PUNCIÓN (continuación): Después de seleccionar la zona de punción adecuada, desinfectar cuidadosamente. Si la venopunción es difícil y debe realizar el palpado de la zona de nuevo, será necesariodesinfectar otra vez la zona de punción. Una vez finalizado el proceso de extracción debe activar el dispositivo de seguridad de la aguja o palomilla utilizada.

HEMOSTASIA Una vez que finaliza el proceso de extracción y se retira la aguja de la vena: Se debe presionar la zona de punción con un algodón durante 5 – 10 min para evitar la formación de hematoma y hasta que cese de salir sangre. El brazo debe mangtenerse hacia arriba.

PROBLEMAS EN LA EXTRACCIÓN

MANIPULACIÓN Y ORDEN DE LLENADO DE LOS TUBOS

Si la sangre no fluye después de la inserción del tubo en el portatubos, es que no ha pinchado en la vena.

Cuando termine de llenar el tubo, retírelo del portatuibos manteniendo la aguja insertada en la luz de la vena. Mezcle la sangre con el aditivo con cuidado, invirtiendo suavemente el tubo 180º inmediatamente después de llenarlo. El número de inversiones variará según el tipo de aditivo del tubo. Si fuese necesario introduzca el tubo siguiente. El orden correcto de extracción por vacío, para los tubos de sangre recomendado por las directrices CLSI es el siguiente:

En el caso de venas muy finas, que generalmente se colapsan cuando se utilizan métodos manuales de aspiración, puede suceder lo mismo al utilizar el sistema de vacío. Recomendaciones:

En el caso de venas extremadamente difícile, en las que no se puede extraer sangre ni de la fosa antecubital ni del dorso de la mano, se puede utilizar una punción femoral.

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9.2. RECOGIDA DE MUESTRAS DE ORINA__________________________________________________

Recogida de orina de una micción Por favor, lea atentamente estas instrucciones y, EN CASO DE DUDA, PREGUNTE, ya que si no realiza adecuadamente la recogida, el análisis puede dar lugar a resultados erróneos, lo que dificultaría su diagnóstico y tratamiento. Gracias por su colaboración.

1. El día de la cita, al levantarse por la mañana, lávese las manos y los genitales externos con jabón. Después, aclárese con abundante agua.

4. Tape y cierre el contenedor enroscando fuertemente la tapa.

2. Abra el contenedor de recogida, y coloque la tapa con la cánula mirando hacia arriba.

5. Antes de obtener una muestra de la orina, agitar suavemente el contenedor para homogeneizarla. Despegar el precinto adhesivo (sin tirarlo). Empujar el tubo sobre la cánula de transferencia. La orina irá llenando el tubo.

3. Comience a orinar sobre el váter y despreciando el primer chorro de orina, recoja en el contenedor la porción media de la micción.

6. Una vez que se ha llenado el tubo completamente, sacarlo y homogeneizar la orina invirtiendo el tubo de 8 a 10 veces suavemente.

7. Volver a colocar el precinto adhesivo protector sobre la cánula de transferencia. Identifique el tubo con sus datos personales y acuda sin demora a entregarlo en recepción de muestras.

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA

Recogida de orina de 24 horas Por favor, lea atentamente estas instrucciones y, EN CASO DE DUDA, PREGUNTE, ya que si no realiza adecuadamente la recogida, el análisis puede dar lugar a resultados erróneos, lo que dificultaría su diagnóstico y tratamiento. Gracias por su colaboración.

Tener a mano un contenedor de 3 litros de los especiales para la recogida de orina de 24 horas. No utilizar otro tipo de recipientes. No destapar el contenedor hasta el comienzo de la recogida.

A las 8:00 horas de la mañana del día anterior a entregar la muestra, orine en el váter. NO RECOJA ESTA ORINA.

A partir de este momento, y durante las 24 horas siguientes, todas las veces que tenga que orinar durante la mañana, tarde y noche ha de hacerlo o bien en un orinal (de plástico, bien limpio y aclarado con agua tras cada micción, sin emplear lejía o jabón) o mejor, directamente sobre el recipiente contenedor, procurando no derramar nada de orina. Si tiene que trasvasarlo al contenedor desde el orinal, ha de hacerlo con la ayuda de un embudo bien limpio y aclarado con agua.

Durante todo el tiempo de recogida, el contenedor con la orina ha de mantenerse bien cerrado y refrigerado en la nevera (no congelar).

A la mañana siguiente, cuando se levante a las 8:00 horas, orine por última vez y RECOJA ESTA ORINA.

Tape bien el contenedor, identifíquelo con sus datos y, antes de que pasen 2 horas desde la última micción, acuda a entregarlo en recepción de muestras.

Notas: Recoja toda la orina del periodo señalado, no pierda nada. Si no le cabe en el contenedor (más de 3 litros) deberá tomar otro, repartir entre ellos la orina ya recogida y seguir recogiendo la orina de 24 horas indistintamente en cualquiera de los dos contenedores. Mantenerlos cerrados y refrigerados. Entregar los dos en recepción de muestras. Si por error se pierde alguna micción durante las 24 horas o se contamina con heces, debe iniciarse de nuevo la recogida. Si durante el periodo de recogida es necesaria una defecación, se recogerá la orina previamente. Si la orina precisara aditivo o conservante, este se le dará previamente en el laboratorio y se le añadirá a la primera micción recogida. No es obligatorio que se inicie la recogida a las 8:00 horas, puede ser en cualquier otro momento, siempre que transcurran exactamente 24 horas entre la primera y la última micción. Este procedimiento hace incompatible la entrega en el mismo día de la orina de 24 horas junto con la primera de la mañana.

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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA

Recogida simultánea de orina de 24 horas y primera de la mañana Por favor, lea atentamente estas instrucciones y, EN CASO DE DUDA, PREGUNTE, ya que si no realiza adecuadamente la recogida, el análisis puede dar lugar a resultados erróneos, lo que dificultaría su diagnóstico y tratamiento. Gracias por su colaboración. 1.

Tener a mano un contenedor de 3 litros de los especiales para la recogida de orina de 24 horas. No utilizar otro tipo de recipientes. No destapar el contenedor hasta el comienzo de la recogida.

Justo antes de irse a la cama (por ejemplo a las 23:00 horas), dos días antes de entregar la muestra (por ejemplo, si tiene que entregar la muestra el miércoles por la mañana, comience el lunes por la noche la recogida), orine en el váter. NO RECOJA ESTA ORINA.

Durante todo el tiempo de recogida, el contenedor con la orina ha de mantenerse bien cerrado y refrigerado en la nevera (no congelar).

A la noche siguiente, cuando se acueste a las 23:00 horas, orine por última vez y RECOJA ESTA ORINA.

Tape bien el contenedor, y mantenga la orina refrigerada toda la noche.

A la mañana siguiente, el día de la entrega de la muestra, al levantarse de la cama recoja la orina de una micción siguiendo el procedimiento habitual de porción media de la primera orina de la mañana.

Antes de que pasen 2 horas desde la última micción, acuda a entregarlo en recepción de muestras.

Notas para orina de 24 horas: Recoja toda la orina del periodo señalado, no pierda nada. Si no le cabe en el contenedor (más de 3 litros) deberá tomar otro, repartir entre ellos la orina ya recogida y seguir recogiendo la orina de 24 horas indistintamente en cualquiera de los dos contenedores. Mantenerlos cerrados y refrigerados. Entregar los dos en recepción de muestras. Si por error se pierde alguna micción durante las 24 horas o se contamina con heces, debe iniciarse de nuevo la recogida. Si durante el periodo de recogida es necesaria una defecación, se recogerá la orina previamente. Si la orina precisara aditivo o conservante, este se le dará previamente en el laboratorio y se le añadirá a la primera micción recogida.

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA

Procedimiento para la toma de una muestra de la orina de 24 horas Por favor, lea atentamente estas instrucciones y, EN CASO DE DUDA, PREGUNTE, ya que si no realiza adecuadamente la recogida, el análisis puede dar lugar a resultados erróneos. Gracias por su colaboración.

Sólo abrir el contenedor en caso de tener que vaciarlo para su desechado

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9.3. RECOGIDA DE MUESTRAS DE HECES__________________________________________________ LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA

Recogida de heces para estudio de sangre oculta Por favor, lea atentamente estas instrucciones y, EN CASO DE DUDA, PREGUNTE, ya que si no realiza adecuadamente la recogida, el análisis puede dar lugar a resultados erróneos, lo que dificultaría su diagnóstico y tratamiento. Gracias por su colaboración.

• • •

Recoger 3 muestras de heces procedentes de 3 deposiciones diferentes. Cada una de las muestras se recogerá en contenedores individuales. El contenedor, provisto de cucharilla, se le facilitará al paciente en la consulta o centro de salud donde se haya realizado la petición del estudio.

• • •

Escriba su nombre y la fecha en la etiqueta de cada contenedor. Desenrosque la tapa y abra el contenedor. Recoja con la cucharita que tiene la tapa del contenedor una muestra de heces introduciéndola en 3 lugares diferentes de la misma muestra fecal. Si observa sangre en las heces, tome una muestra de esa zona. La

• •

Cierre el contenedor enroscando bien la tapa. Guarde el contenedor con la muestra recogida en un frigorífico (no

• •

Repita este proceso durante 3 días (es decir, los dos días siguientes). Una vez recogidas las 3 muestras, lleve los 3 contenedores de recogida a su centro de toma de muestras o al Laboratorio de Bioquímica.

cantidad que debe tomar es la que cabe en la cucharita, no más. congelar).

Recogida en dispositivo para envío al laboratorio y análisis directo sin manipulación de la muestra

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9.4. TOMA DE MUESTRAS DE LÍQUIDOS BIOLÓGICOS_________________________________________ Siempre en contenedores estériles. Tanto la preparación del paciente como la obtención de la muestra corresponde al médico solicitante. Líquido cefalorraquídeo (LCR): Se realizará la extracción sin ningún tipo de aditivo ni anticoagulante, y a ser posible, en 2 tubos de vidrio estériles, sin aditivo, tapón de color negro y marcados secuencialmente: Nº1- para estudio bioquímico y recuento y exámen diferencial de leucocitos Nº2- para exámen microbiológico Líquido pleural y ascítico : Bioquímica: - Un tubo de vidrio estéril, sin aditivos de tapón negro (excepcionalmente EDTA) - Una jeringa de gases en caso de que se solicite pH Microbiologia: un tubo de vidrio estéril, sin aditivos de tapón negro Líquido sinovial: Bioquímica: un tubo con aditivo EDTA Microbiologia: un tubo de vidrio estéril, sin aditivos de tapón negro

9.5. RECOGIDA DE MUESTRAS DE SEMEN_________________________________________________ Previamente a la recogida es necesario un tiempo de abstinencia sexual de 3 - 4 días, aunque se recomienda por ser más preciso que este periodo se exprese en horas. La muestra se obtiene por masturbación y se recoge directamente (no usar preservativo) en un contenedor estéril, se tapa, identifica y entrega urgentemente en el laboratorio antes de que pase 1 hora de la recogida. Se ha de recoger el eyaculado completo. Al entregar la muestra en el laboratorio el paciente deberá cumplimentar una encuesta relacionada con la calidad de la muestra que le proporcionará el personal del propio laboratorio. Procedimiento de recogida de semen para estudio de fertilidad 1. 2. 3. 4.

Mantener una abstinencia sexual de 3 a 5 días. Vaciar la vejiga antes de recoger el semen. Lavarse las manos y los genitales con jabón, aclarando muy bien con agua. Obtener el semen por masturbación, recogiendo LA TOTALIDAD de la muestra. No usar preservativos. 5. Recoger la muestra en un vaso contenedor estéril de plástico de boca ancha. 6. Proteger el semen de la luz, del frío y del calor intenso. Procurar transportarlo cerca del cuerpo o envolver el frasco en papel de aluminio para mantenerlo a la temperatura adecuada. 7. La muestra debe ser entregada en la consulta de extracciones del hospital antes de 30 minutos desde su recogida en horario de 08:00 a 09:30 h de la mañana. Procedimiento de recogida de semen para control postvasectomía 1. Mantener abstinencia sexual antes de la recogida de la muestra durante al menos 48 horas. 2. Dejar transcurrir entre la intervención de vasectomía y el análisis, 3-4 meses; y haber realizado al menos 24 eyaculaciones. 3. Vaciar la vejiga antes de recoger el semen. 4. Lavarse las manos y los genitales con jabón, aclarando muy bien con agua.

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5. Obtener el semen por masturbación, recogiendo LA TOTALIDAD de la muestra. No usar preservativos. 6. Recoger la muestra en un vaso contenedor estéril de plástico de boca ancha. 7. Proteger el semen de la luz, del frío y del calor intenso. Procurar transportarlo cerca del cuerpo o envolver el frasco en papel de aluminio para mantenerlo a la temperatura adecuada. 8. La muestra debe ser entregada en la consulta de extracciones del hospital preferentemente antes de 1 hora desde su recogida, en horario de 08:00 a 09:30 h de la mañana.

9.6. IDENTIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS__________________________________________________ Todas las personas involucradas en los procedimientos diagnósticos son conscientes del problema de la identificación de las muestras. La confusión en los nombres, peticiones, muestras o resultados de las pruebas de los pacientes puede tener serios efectos sobre el diagnóstico y tratamiento del paciente. La identificación de la muestra se hará mediante una numeración impresa en etiquetas de código de barras y cuando esto no sea posible, identificando el contenedor de la muestra con nombre y apellidos del paciente con un rotulador permanente de forma legible, sobre una etiqueta adhesiva o bien directamente sobre el contenedor de la muestra, nunca en los tapones.

«El número de identificación de la muestra (contenedor/es) será el mismo que identifica la petición (hoja de petición)» Las muestras podrán llegar al laboratorio identificadas con las etiquetas de código de barras que el laboratorio proporcionará a los centros de extracción, o procederse a su identificación en el propio laboratorio. Las muestras deberán siempre circular por el laboratorio correctamente identificadas (número de identificación de la muestra) y relacionadas con la hoja de petición analítica (número de petición), que además contiene los datos de identificación del paciente, origen y peticionario, a fin de asegurar la correspondencia de datos y la trazabilidad de todo el proceso. Si una petición tuviera varias muestras, se identificarán todos los contenedores de muestra con el mismo número. La identidad del paciente se vincula inequívocamente al recipiente de la muestra en el punto de extracción o recolección de la misma, siempre que la muestra primaria se mantenga a lo largo de todo el proceso analítico. Esto necesita separadores suero / plasma para mantener la muestra de trabajo (plasma

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o suero) en el tubo de muestra primario (sangre) y de esta forma ser identificado directamente por el lector del analizador. Si el lector no está disponible o se hacen alícuotas la muestra original, puede usarse un dispositivo que automáticamente defina las posiciones de cada muestreo en cada uno de los analizadores utilizados. Este tipo de identificación se llama identificación indirecta (por localización). Mientras que los mecanismos directos de identificación permiten identificar la muestra en cualquier momento y posición, la identificación indirecta por la posición puede hacerse únicamente con la ayuda de una lista numerada de posiciones o un sistema informático de laboratorio. Además, cualquier porción alícuota tiene el peligro inherente de una confusión entre muestras.

Requisitos mínimos y recomendaciones Como requisitos mínimos la muestra que llega al laboratorio deberá contener la siguiente información:

* Nombre y apellidos del paciente * Fecha de nacimiento o edad del paciente * Número de identificación de la muestra y de la petición * Origen de la petición (servicio peticionario) * Datos del médico peticionario. * Fecha y hora de la toma de la muestra (día, hora, min.).

Recomendaciónes:

* Cualquier muestra deberá identificarse inequívocamente antes de ser procesada. * Los procedimientos de identificación directa de muestras primarias deberían usarse preferentemente a la identificación indirecta y subdivisión de la muestra en alícuotas, para reducir los errores en la identificación. * Cualquier muestra cuya identidad y origen no esté suficientemente documentada deberá separarse a una forma estable (suero, plasma), guardarla en el refrigerador y completar la información omitida antes de procesarla.

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Capítulo 10. Transporte de las muestras

10.1. Tipos de muestras a transportar 10.2. Sistema de transporte 10.3. Tiempo de transporte 10.4. Temperatura de transporte 10.5. Contenedores. Seguridad biológica 10.6. Acondicionamiento de las muestras 10.7. Sistemas de control de tiempo y temperatura 10.8. Perfiles estándar para el transporte de muestras 10.9. Buenas prácticas en el transporte de sangre venosa 10.10. Buenas prácticas en el transporte de orina

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10.1. TIPOS DE MUESTRAS A TRANSPORTAR (ISO 15189/2004)____________________________________ - Productos Biológicos: materiales biológicos terminados para uso humano o veterinario, incluidos sueros y vacunas, productos para propósitos de estudio e investigación en productos humanos y veterinarios. - Muestras para diagnostico: Todos los materiales de origen humano o animal, incluidos esputos, sangre y sus componentes, tejidos y fluidos corporales, recogidos para propósitos de diagnóstico. - Sustancias infecciosas: materiales que contienen microorganismos vivos como bacterias, virus, parásitos, mohos o toxinas que pueden ser foco de enfermedades para el ser humano. Las muestras sanguíneas, venosas y/o arteriales, y las muestras de orina están clasificadas como muestras para diagnostico. Transporte de muestras para diagnóstico El transporte de muestras biológicas dedicadas al diagnóstico de laboratorio (muestras para diagnóstico), es una variable crucial, con un impacto en incremento para la calidad y la seguridad de la fase preanalítica. •

La adecuada gestión de esta actividad pertenece a varias directivas y estándares de referencia (p.e. ISO 15189, ADR Edición 2005, etc.)

•

Estas indicaciones resaltan la necesidad de considerar los siguientes puntos: 1.Tiempo de transporte 2.Temperatura de transporte 3.Modalidades de transporte 4.Documentación de los criterios de validación

10.2. SISTEMA DE TRANSPORTE_____________________________________________________________ Las muestras de los pacientes ingresados que no sean tomadas por el personal del laboratorio serán transportadas en los contenedores destinados a tal efecto por los celadores desde las plantas de hospitalización hasta el área de recepción de muestras del laboratorio o hasta el laboratorio de urgencias. Las tomadas por el personal del laboratorio, sean de pacientes ingresados o de la consulta de extracciones, lo serán en carros de transporte especiales que dispone el laboratorio. Las muestras recogidas en centros de extracción periféricos (atención primaria) serán transportados por carretera por vehículos de empresas de mensajería contratadas y deberán de poseer los permisos y certificaciones necesarias para esta actividad.

10.3. TIEMPO DE TRANSPORTE______________________________________________________________ El tiempo transcurrido desde la toma de la muestra y su procesamiento influye de una manera importante sobre los resultados analíticos, así pues el tiempo de transporte deberá ser muy reducido (menor de 2 horas). Las muestras que han de analizarse urgentemente se remitirán inmediatamente al laboratorio de urgencias, sobre todo las gasometrías. El transporte se recomienda que sea lo más rápido posible hasta el Laboratorio y cumpliendo los requerimientos específicos europeos en cuanto al embalaje y transporte de muestras clínicas.

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10.4. TEMPERATURA DE TRANSPORTE_______________________________________________________ La temperatura también es importante por la degradación y pérdida de actividad que sufren determinadas magnitudes bioquímicas. El transporte se hará refrigerado (2 - 8° C) o congelado si la muestra lo precisa.

10.5. CONTENEDORES. SEGURIDAD BIOLÓGICA________________________________________________ Cuando es necesario enviar sangre u otros fluidos corporales humanos a un laboratorio distante, como es el caso de las extracciones periféricas, en el transporte se deberán cumplir ciertas normas de seguridad: - El contenedor ha de estar homologado para el transporte de muestras biológicas - En el contenedor debe figurar bien visible un aviso de “muestras para diagnóstico”. - El recipiente contenedor debe ser resistente a la filtración, golpes, cambios de presión y otras condiciones que puedan incidir en la manipulación ordinaria que se realiza en el transporte y debe cerrar herméticamente. - Deberá ponerse un material absorbente en el fondo del contenedor con objeto de asegurar que se absorba cualquier derrame durante el transporte. - En su interior se depositará el material necesario para mantener refrigeradas las muestras durante el transporte. El embalaje estándar para las muestras diagnósticas consta de las siguientes partes (ADR 2005)

Embalaje interno: recipiente primario que contiene la muestra para diagnóstico Material absorbente Embalaje externo: este contenedor debe ser de un material robusto, a prueba de filtraciones, fácilmente desinfectado y capaz de preservar los recipientes primarios. Embalaje terciario: caja o bolsa especial capaz de contener el embalaje externo.

10.6. ACONDICIONAMIENTO DE LAS MUESTRAS_______________________________________________ - Las muestras deberán empaquetarse de tal manera que puedan resistir las condiciones ambientales (temperatura y presión) a que puedan ser sometidas durante el transporte. - Debe evitarse la exposición de las muestras al aire y a la luz directa con el fin de proteger a los componentes sensibles a la luz, como la bilirrubina, folatos o las porfirinas. - Se debe utilizar una bolsa impermeable para asegurar que los documentos que acompañen las muestras no sean dañados por cualquier filtración o derrame de la misma. - Para el envío de las muestras refrigeradas o congeladas son adecuados materiales aislantes tales como un recipiente de poliestireno. - Para la congelación puede utilizarse hielo seco. Evitar siempre que la descongelación del hielo pueda contaminar y diluir las muestras. -

El manejo de las muestras debe ser suave y evitar agitaciones bruscas para no provocar hemólisis.

- Mantener los tubos en posición vertical: optimiza la formación del coágulo en el fondo del tubo, minimiza la agitación y los riesgos de salpicaduras a la apertura.

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10.7. SISTEMAS DE CONTROL DE TIEMPO Y TEMPERATURA______________________________________ El laboratorio, mediante un sistema informatizado certificado y con trazabilidad, monitoriza el transporte de las muestras desde los centros de extracción periféricos al laboratorio y como son transportadas: 1.- Dentro de un período de tiempo adecuado a la naturaleza de los exámenes requeridos y de acuerdo a la disciplina del laboratorio. 2.- Dentro de un intervalo de temperatura especificadoen el manual de toma de muestras primarias y con los conservantes designados para asegurar la integridad de las muestras, y 3.- De forma que asegure la seguridad para el transportista, el público en general y el laboratorio de recepción, cumpliendo con los requisitos de la legislación nacional, regional o local. El sistema está compuesto por: . BD TempStick®: registrador de datos en miniatura capaz de registrar los tiempos y la temperatura en los intervalos que se hayan establecido previamente. (Transportado dentro de los contenedores). . BD Mission Starter: dispositivo de activación de la misión. Su uso es intuitivo y sencillo, por lo que no requiere una formación específica ni mantenimiento. Programado por el laboratorio (tiempo y temperatura) de acuerdo con el centro extractor. (Ubicado en el centro extractor periférico). . BD System Manager: dispositivo de decodificación de la misión. Además de la función de activación, permite leer, visualizar y validar los datos adquiridos por el BD TempStick® en el transcurso de la misión. Es posible conectarlo con el ordenador personal, es de fácil uso y se gestiona por el personal del laboratorio destinatario. Controla los envíos de todos los centros periféricos. Programado por el laboratorio. (Ubicado en el laboratorio receptor). Los retrasos y el historial de la temperatura deberán estar documentados, así como las medidas adoptadas en caso de alteración de las normas de transporte.

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10.8. PERFILES ESTANDAR PARA EL TRANSPORTE DE MUESTRAS (SEGÚN LA NCCLS)__________________ Temperatura ambiente: Mínimo: 22 °C Máximo: 25 °C Mínimo absoluto: 15 °C Máximo absoluto: 30 °C Tiempo máximo transp: 90 min Tiempo inicial descartado: 10 min Tiempo final descartado: 10 min Refrigerada: Mínimo: 2 °C Máximo: 8 °C Mínimo absoluto: 0 °C Máximo absoluto: 10 °C Tiempo máximo transp: 90 min Tiempo inicial descartado: 5 min Tiempo final descartado: 5 min

10.9. BUENAS PRÁCTICAS EN EL TRANSPORTE DE SANGRE VENOSA_____________________________

Transporte de sangre venosa

Tiempo: Max. 2h desde la extracción para sangre total (no centrifugada). Temperatura: entre 22 y 25ºC para la mayoría de parámetros. Evitar temperaturas superiores a 30°C ya que puede acelerar la degradación de algunos constituyentes de la sangre. Si no se transporta con embalaje adecuado, evitar el transporte por debajo de 0°C ya que puede provocar hemólisis. Presión: los cambios fuertes de presión pueden interferir en la integridad de la muestra. *Los contenedores deben ser capaces de soportar una presión de hasta 95 kPa. Homogeneización de las muestras: Los tubos de sangre deben mantenerse en posición vertical, con el tapón en el extremo superior, ya que ello facilita la formación completa del coágulo y reduce la agitación del contenido del tubo, por lo que reduce la formación de hemólisis. Exposición a la luz: es importante evitar la exposición a la luz para analitos fotosensibles.

NCCLS H18-A3 Vol. 24 No. 38 “PROCEDIMIENTO PARA LA MANIPULACIÓN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS SANGUÍNEAS”; Approved Guideline –3rd Edition”.

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10.10. BUENAS PRÁCTICAS EN EL TRANSPORTE DE ORINA_______________________________________

Transporte de orina

Tiempo: Max. 2h desde la recogida Temperatura: 15 - 25 °C para análisis físico-químicos. 2 - 8 °C si el análisis se demora más de dos horas desde la recogida, o en caso de test microscópico y/o urocultivo. Orina de 24h: requiere distintas temperaturas de almacenamiento en función de las determinaciones solicitadas. Exposición a la luz: la muestra de orina de 24h debe protegerse de la luz, artificial o natural a partir de una duración de tiempo.

NCCLS GP16-A3 Vol. 21 No. 1938 “URIANÁLISIS Y RECOLECCIÓN, TRANSPORTE, y PRESERVACIÓN DE LAS MUESTRAS DE ORINA”; Approved Guideline –2nd Edition”.

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Capítulo 11. Estabilidad y conservación de las muestras

11.1. Estabilidad de una muestra 11.2. Conservación. Causas de alteraciones de la calidad de las muestras 11.3. Recomendaciones y reglas para la conservación de las muestras 11.4. Conservación de muestras de sangre y gasometría 11.5. Conservación de muestras de orina de una micción 11.6. Refrigeración de la orina de 24 h durante la recogida 11.7. Conservación de otras muestras biológicas 11.8. Muestras para laboratorios externos de referencia 11.9. Muestras con contenido legal. Cadena de custodia

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11.1. ESTABILIDAD DE UNA MUESTRA____________________________________________________ La estabilidad metrológica de las propiedades físico-químicas de los componentes de especímenes biológicos humanos se define como, la capacidad de una muestra de retener el valor inicial de las magnitudes biológicas dentro de unos límites establecidos durante un determinado periodo de tiempo cuando ésta se conserva en condiciones definidas. Existen datos publicados por diferentes autores, de estabilidad de magnitudes (horas, días, semanas o meses) cuando las muestras (tubo primario, centrifugada o alícuota) son conservadas a temperatura ambiente, refrigerada (4 – 8 º C) y congelada (-20 / -70º C).

11.2. CONSERVACIÓN. CAUSAS DE ALTERACIONES DE LA CALIDAD DE LAS MUESTRAS_________________ Las causas más importantes que pueden ocasionar alteraciones en la calidad de la muestra, por alterar la estabilidad de los componentes son:

Metabolismo de las células sanguíneas. Evaporación o sublimación. Reacciones químicas. Descomposición microbiológica. Procesos osmóticos. Efecto de la luz. Difusión de gases.

11.3. RECOMENDACIONES Y REGLAS PARA LA CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS___________________ Recomendaciones: Las muestras se deben conservar a temperatura ambiente el menor tiempo posible. Un transporte rápido y corto tiempo de almacenamiento mejoran la fiabilidad de los resultados del laboratorio. Evite sacudir los recipientes de muestra (¡sistemas de distribución de tubo neumático!): riesgo de hemólisis. Las muestras se conservan, salvo excepciones, más tiempo almacenadas en frigorífico. Las muestras deberían almacenarse siempre en recipientes cerrados para prevenir la evaporación. Reducir al máximo el contacto de la muestra con el aire (aumento de la concentración de los componentes no volátiles). El problema de la evaporación también existe en los refrigeradores (condensación de humedad sobre los elementos de enfriamiento). Los problemas de almacenamiento se reducen si se usan sistemas de toma de muestras desechables. Los agentes de separación (geles separadores) mejoran los rendimientos de suero y plasma, y permiten que estos puedan mantenerse en los tubos originales encima de la sangre. Almacenar siempre verticalmente los recipientes de muestra que contienen sangre; el proceso de coagulación se acelera. Etiquete el material infeccioso y manéjelo con especial cuidado. Si la muestra no se va a procesar de inmediato, conservar en frigorífico refrigerada (2-6ºC) o congelada (-20ºC), evitando las congelaciones y descongelaciones repetidas. Algunos componentes no deben almacenarse congelados (lipoproteínas, células, sedimento de orina, urato en orina).

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Una descongelación adecuada homogeinizando la muestra por inversión del contenedor repetidas veces, evitando la formación de espuma. El almacenamiento de las muestras después de su exámen se debe realizar de tal manera que permita la confirmación de los resultados, la comprobación de la identidad de las muestras o la realización de exámenes adicionales. Reglas especiales y algunas recomendaciones más útiles 1. Evite el almacenamiento de la sangre. Las muestras de sangre deberían llegar al laboratorio dentro de los 45 min siguientes a su recolección, a fin de asegurar que la centrifugación y separación de la muestra se efectúa dentro de la primera hora. 2. Evite la glicólisis para mantener estables las concentraciones de glucosa y de lactato y el pH. La glicólisis puede evitarse por la adición de un inhibidor junto con un anticoagulante. 3. Evite el efecto de la luz de otra manera habrá una disminución en las concentraciones de bilirrubina, ascorbato, porfirinas, creatina-cinasa y folatos. 4. Reduzca el contacto con el aire tanto como sea posible. Si no se hace esto, la evaporación o la sublimación dará como resultado un aumento aparente en la concentración de todos los componentes no volátiles. Este es particularmente el caso cuando el volumen de la muestra es relativamente pequeño y el área de superficie es relativamente grande. 5. La sangre no debería almacenarse en el refrigerador. Cuando la orina se enfría, las sales pueden precipitar (fosfato de magnesio y calcio, urato). 6. Para ciertos componentes, las muestras no deberían congelarse. Esta congelación puede redundar en resultados erróneos para los siguientes componentes: lipoproteínas, células, sedimento de orina, urato en orina (precipitaciones). 7. Una descongelación adecuada. La homogeneización inadecuada de las muestras congeladas después de la descongelación es una fuente muy común de error. Durante la descongelación se producen gradientes de concentración que van desplazándose desde las soluciones concentradas que primero funden hacía las capas inferiores por las paredes del recipiente. Por tanto, después de la descongelación, la muestra deberá invertirse varias veces, evitando la formación de espuma. Con especial atención sobre los materiales no disueltos, disolviéndolos por calentamiento suave si fuera necesario 8. El almacenamiento de las muestras después de su examen se debe realizar de tal manera que permita la confirmación de los resultados, la comprobación de la identidad de las muestras o la realización de exámenes adicionales por razones médicas o legales.

11.4. CONSERVACIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE Y GASOMETRÍA_________________________________ A menos que se especifique otra indicación, motivada generalmente por las características de la magnitud a analizar, las muestras se pueden conservar a temperatura ambiente pero procurando que sea durante el menor tiempo posible. Lo ideal es la refrigeración hasta su procesamiento. Idealmente, la muestra destinada a la medición de pH, pO2, pCO2 debe procesarse inmediatamente tras su extracción. Cuando esto no es posible, deben contemplarse las siguientes recomendaciones generales, destinadas a paliar las desviaciones en los resultados debidas al proceso de conservación: Las muestras en jeringas de plástico destinadas a la medición de pH y gases en sangre deben medirse dentro de los 30 minutos tras su extracción. La conservación de la jeringa de plástico en agua–hielo producirá cambios en las presiones parciales de los gases sanguíneos (sobre todo en la pO2), debido a un aumento del gradiente entre la muestra y el aire exterior al producirse una disminución relativa del O2 en la muestra debido al enfriamiento (aumenta la solubilidad del O2 y aumenta la afinidad de la hemoglobina por el O2).

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Por lo tanto, si el análisis se realiza en un plazo de 30 minutos, es mejor la conservación de la muestra a temperatura ambiente.

11.5. CONSERVACIÓN DE MUESTRAS DE ORINA DE UNA MICCIÓN_________________________________ Idealmente, tanto para el sistemático como para el sedimento y el urocultivo, la muestra debe procesarse en las dos horas posteriores a la recogida para evitar el deterioro de elementos químicos o formes así como la aparición de artefactos tales como cristales o la multiplicación de bacterias. Cuando no sea posible cumplir los tiempos, se recomienda refrigerar la muestra y atemperarla antes de proceder a su análisis. En cuanto a la estabilidad de los diferentes analitos de la orina, es sabido que algunos parámetros químicos son especialmente inestables como la bilirrubina y el urobilinógeno ya que son fotosensibles y deben protegerse de la luz. Las bacterias, que a temperatura ambiente se multiplican constantemente, catabolizan la glucosa modificando el pH. Otros metabolitos tienden a formar cristales a pH fisiológico (calcio, oxalato, ácido úrico) o se descomponen si no se conservan adecuadamente (glucosa, urea, citrato). Los elementos formes presentes en la orina son relativamente estables, excepto en determinadas situaciones como orinas muy diluidas (densidad menor de 1010 u osmolalidad inferior a 300 mOsm/kg) o con pH alcalino (mayor de 7) en las que cilindros, eritrocitos, y leucocitos son especialmente susceptibles a la lisis. Se ha constatado que el parámetro que más se deteriora con el tiempo son los hematíes, lo que puede originar informes falsos con hematíes dismórficos o falsos negativos en hematuria si se produce la lisis total, pero el resto de elementos formes se mantienen aceptablemente conservados a temperatura ambiente durante más de 24 horas . Tradicionalmente, tanto para el sistemático de orina como para el sedimento urinario y el urocultivo, se ha recomendado que la muestra debe ser la primera orina de la mañana y que debe procesarse antes de que transcurran dos horas desde que la orina fue emitida. Estos dos requerimientos suelen excluirse mutuamente ya que es poco probable que un espécimen emitido y recogido por el paciente, en su casa, en el momento en que se levanta, pueda ser llevado, entregado, alicuotado, identificado, transportado, clasificado, distribuido y analizado en tan corto periodo de tiempo. Más aún cuando se trate de puntos de recogida de especímenes muy alejados del laboratorio matriz. Para la mayoría de los parámetros urinarios, basta con la refrigeración para aumentar la estabilidad de las muestras y, sólo en situaciones excepcionales, se requerirá el empleo de conservantes químicos o incluso la congelación.

11.6. REFRIGERACIÓN DE LA ORINA DE 24 HORAS DURANTE LA RECOGIDA__________________________ La mayoría de los metabolitos cuantificables en orina de tiempo controlado exigen el mantenimiento de la orina refrigerada durante las 24 horas que dura la recogida así como el tiempo posterior que transcurra hasta su entrega en el laboratorio. Es necesario concienciar tanto a los pacientes como a los sanitarios de la necesidad de refrigerar los especímenes de orina hasta su entrega en el laboratorio. Este requisito, en determinadas ocasiones, no se cumple ya que en el caso de los pacientes ambulatorios, algunos son reticentes a guardar este tipo de especímenes en la nevera, al lado de los alimentos, durante las 24 horas que dura la recogida. En el caso de los pacientes ingresados, el problema que se plantea es que las plantas de hospitalización de los hospitales habitualmente no tienen medios para conservar refrigerados este tipo de especímenes durante su recolección. Se deberían proponer e instaurar sistemas de recogida refrigerados de muestras de orina de tiempo controlado recurriendo, por ejemplo, al uso de recipientes termostatizados o con hielo.

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11.7. CONSERVACIÓN DE OTRAS MUESTRAS BIOLÓGICAS________________________________________ Las heces y líquidos biológicos se recomienda conservarlos refrigerados hasta su análisis. No se deben congelar nunca los líquidos biológicos pues invalidaría el recuento celular. Las muestras de semen conviene conservarlas protegidas del frío (cerca del cuerpo) y entregarlas al laboratorio preferiblemente en 30 minutos, o como mucho 1 hora después de la eyaculación. Una vez en el laboratorio, conservarlas en estufa a 37ºC hasta su exámen.

11.8. MUESTRAS PARA LABORATORIOS EXTERNOS DE REFERENCIA________________________________ Las muestras de aquellas pruebas que el laboratorio no puede determinar, bien por falta de instrumentación, o por requerir instalaciones especiales o por baja demanda, se remiten a laboratorios externos siguiendo un procedimiento de registro, almacenamiento, conservación y envío que se comenta con detalle en el capítulo 17, en actividad derivada-laboratorios externos de referencia.

11.9. MUESTRAS CON CONTENIDO LEGAL. CADENA DE CUSTODIA_________________________________ El concepto de cadena de custodia es esencial para mantener la validez del espécimen y también es esencial en el análisis de componentes cuya determinación tenga o pueda tener una incidencia legal (alcoholemia, drogas de abuso en orina, etc.). El objeto de la cadena de custodia es: -

Documentar lo que se ha realizado con la muestra Identificar a cada persona que ha estado implicada con la muestra Describir la función de cada una de las personas que intervienen en la manipulación de la muestra

La cadena de custodia se puede dividir en dos partes: • La cadena externa: desde que se obtiene el espécimen hasta que llega al laboratorio • La cadena interna: desde que el espécimen llega al laboratorio hasta que se emite el informe de resultados Se debe disponer de una información sobre el espécimen que comprenda: Quien se responsabiliza de la obtención del espécimen y quien lo envía al laboratorio La hora en que se envió. Quien lo transporta y en que condiciones Quien lo recibe en el laboratorio y que proceso de acuse de recibo se realiza Quien se hace cargo posteriormente de él y que proceso sigue Quien o quienes en el resto de la cadena de custodia lo usan, cómo lo usan y cuándo lo usan hasta que se termina el proceso. Los documentos relacionados con los especímenes no pueden separarse a lo largo de la cadena de custodia. Deben de estar documentados y registrados todos los pasos sucesivos que sufren los especímenes con objeto de poder describir la trazabilidad de los mismos.

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Las muestras con un contenido legal (alcoholemias, drogas de abuso, tóxicos, frotis vaginales, etc.) se conservarán adecuadamente hasta su envío al laboratorio de referencia establecido para este tipo de situaciones de carácter legal-judicial, según protocolos y comprobando debidamente la muestra (identificación, contenedor, estado, etc.), la documentación de la petición (demográficos, solicitantes, etc), y manteniendo siempre la cadena de custodia (recepción – conservación – envío) establecida.

Procedimiento de cadena de custodia para muestras de contenido legal Registro de entrada:

Fecha y hora de recepción de la muestra Nombre de quien entrega la muestra en el laboratorio Tipo de muestra Determinación solicitada Apellidos y nombre del paciente Documentación aportada Incidencias y observaciones si las hubiera Nombre del personal del laboratorio que recibe y guarda la muestra

Conservación de la muestra: temperatura ambiente, refrigerada o congelada Localización: lugar del laboratorio donde se encuentra depositada la muestra Condiciones de transporte: contenedor y temperatura Documentación: se enviará junto con las muestras Registro de salida: • • • •

Fecha y hora de entrega de la muestra Nombre del personal del laboratorio que realiza la entrega Empresa de transporte que recoge la muestra Nombre, apellidos y firma de quien la recoge

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Capítulo 12. Recepción, preparación y almacenamiento de las muestras

12.1. Recepción y requisitos de aceptación de peticiones y muestras 12.2. Motivos de rechazo 12.3. Preparación de las muestras. Centrifugación 12.4. Manipulación y distribución de las muestras 12.5. Almacenamiento de las muestras 12.6. Automatización de la preparación de especímenes

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12.1. RECEPCIÓN Y REQUISITOS DE ACEPTACIÓN DE PETICIONES Y MUESTRAS_______________________ El lugar y el horario de recepción de muestras será el establecido por el laboratorio. Las muestras se deberán entregar siempre a personal del laboratorio. Las peticiones se han de ajustar al catálogo de prestaciones del Laboratorio. Se solicitarán de la forma adecuada en el formulario de petición analítica (formato papel o electrónico) que contendrá obligatoriamente toda la información necesaria para la correcta identificación del paciente, del médico solicitante, de la petición y del origen de la petición, así como del espécimen o muestra y de los exámenes bioquímicos solicitados. Se hará constar si la petición se realiza de forma ordinaria o urgente. Las pruebas que no se determinen en este laboratorio y se han de remitir a laboratorios de referencia, se harán constar en el espacio destinado a otras pruebas y se cumplimentará el correspondiente impreso debidamente redactado en el que figuren nombre y apellidos del paciente, fecha de nacimiento, médico solicitante, servicio, datos clínicos y tratamiento si lo hubiera y la magnitud bioquímica solicitada. El laboratorio debe determinar, una vez recibida la muestra en el laboratorio, si ésta cumple con los requisitos mínimos imprescindibles para ser procesada. Los especímenes o las muestras remitidas al laboratorio han de estar correctamente identificadas, ser suficientes, adecuadas para la realización de las pruebas que se solicitan y vendrán siempre acompañadas del correspondiente formulario de petición o de la petición electrónica.. El Laboratorio se reserva la posibilidad de no procesar cualquier petición o muestra no conforme con los requisitos establecidos y se compromete a comunicar al solicitante cualquier incidencia relacionada con la identificación, manipulación o tratamiento de las muestras o de los formularios de petición analítica, así como de modificar la petición suprimiendo pruebas que se consideren improcedentes o no medibles por razones técnicas o añadiendo pruebas no solicitadas para, según protocolos, mejorar el estudio del paciente.

Requisitos de aceptación de las peticiones y de las muestras

Es motivo de rechazo, y por lo tanto el laboratorio no procesará petición alguna en la que no figure la correcta identificación del paciente, de la petición y de la muestra o aquellas en las que no se hayan cumplimentado debidamente los datos clínicos, según protocolos establecidos, necesarios para su procesamiento y evaluación de los resultados. El laboratorio registrará esta incidencia por el procedimiento que tenga establecido e informará de esta situación al peticionario. El laboratorio únicamente se responsabiliza de la conservación de las muestras a partir de su llegada al laboratorio.

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12.2. MOTIVOS DE RECHAZO_______________________________________________________________ Rechazo: cuando para una o varias de las determinaciones solicitadas no se puede entregar el resultado al clínico debido a causas imputables a errores preanalíticos.

MOTIVOS DE RECHAZO DE PETICIONES Petición sin demográficos de paciente o son ilegibles Petición sin identificar o mal etiquetada Otros (especificar)

MOTIVOS DE RECHAZO DE MUESTRAS DE SANGRE Muestra coagulada Muestra insuficiente Muestra hemolizada Muestra inadecuada Muestra insuficiente / anticoagulante Muestra contaminada Muestra sin identificar o mal identificada / sin etiquetar Transporte defectuoso Otros (especificar)

MOTIVOS DE RECHAZO DE MUESTRAS DE ORINA RECIENTE Y DE 24 HORAS Muestra no remitida cuando coexisten ambas muestras Muestra insuficiente Muestra con interferencias Muestra sin identificar o mal identificada / sin etiquetar Muestra con volumen incorrecto Recipiente inadecuado Transporte defectuoso Otros (especificar)

Para líquidos biológicos y heces se consideraran los mismos motivos de rechazo que figuran en este listado y que sean aplicables a estos tipos de muestras.

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12.3. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS. CENTRIFUGACIÓN______________________________________ La centrifugación de la sangre coagulada para obtener suero debería realizarse después de haberse asegurado de que la sangre ha coagulado. Normalmente, el tiempo de espera para que la sangre coagule es aproximadamente de 30 min. Sin embargo, los pacientes que están con una terapia anticoagulante, o aquellos con deficiencias en la coagulación tendrán una coagulación retrasada. La centrifugación de sangre coagulada para obtener suero o de sangre anticoagulada para obtener plasma se realiza típicamente entre 1000 y 1200 g durante 10 a 15 min. En las pruebas de coagulación, la sangre citratada debería centrifugarse a 2000 g durante 15 min. La aceleración centrífuga puede calcularse bien, por el uso de una ecuación empírica o bien, utilizando un nomograma para el cálculo de la fuerza centrífuga relativa que relaciona: el radio de rotación (cm), la aceleración centrífuga (g) y la velocidad (revoluciones por minuto). Con este nomograma se pueden, conociendo el radio de rotación de la centrífuga, convertir las unidades -g- de centrifugación en r.p.m. (revoluciones por minuto) y viceversa. La ecuación usada para calcular la aceleración centrífuga arot (g) es la que se indica a continuación:

arot = 1,118 x 10-5 r n2 Donde r es la media de la distancia radial desde el eje de rotación, en centímetros, y n es la velocidad de rotación en revoluciones por minuto (r.p.m.). 1,118 x 10-5 es una constante que tiene en cuenta la aceleración debida a la gravedad.

Nomograma para el cálculo de la fuerza centrífuga relativa Temperatura. La centrifugación se realiza comúnmente entre 20 y 22 °C. Sin embargo, para algunos componentes que son lábiles durante la centrifugación a temperatura ambiente, especialmente si durante la centrifugación aumenta la temperatura, las muestras deberían centrifugarse a temperatura refrigerada (4°C).

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Sin embargo, la refrigeración puede conducir a la filtración de ion potasio desde la célula, aumentado el valor de su concentración en el plasma. Las muestras no deberán volverse a centrifugar después de la obtención de suero o plasma. La alteración de la relación entre el agua plasmática y la celular puede afectar la concentración de los componentes, y así, introducir errores. Las muestras con una barrera de gel nunca deben volverse a centrifugar. El tiempo y la fuerza centrífuga aplicada al sedimento de sangre heparinizada debería ser tal que no deje plaquetas en la capa de plasma. Las plaquetas deben quedar bien sedimentadas en la capa de células. Un fracaso al conseguir la sedimentación completa de plaquetas producirá aumentos inadecuados en la concentración de ion potasio, lactato-deshidrogenasa, fosfatasa ácida y fosfato procedentes de las plaquetas remanentes en el plasma de la muestra. Por lo tanto, se debe establecer un control visual del plasma después de la centrifugación. Los tubos de micromuestra con o sin anticoagulantes pueden centrifugarse para obtener suero o plasma en una microcentrífuga con un adaptador que acepte estos tubos. La centrifugación de tales tubos de recolección de micromuestras se realiza a velocidades que van desde las 6000 a las 15000 g durante un mínimo de 90 s. Los programas preventivos de mantenimiento para las centrífugas deben incluir la comprobación periódica de las velocidades de centrifugación logradas a unas velocidades específicas ajustadas con un tacómetro.

12.4. MANIPULACIÓN Y DISTRIBUCIÓN DE LAS MUESTRAS_______________________________________ Después de la centrifugación, las muestras pueden transferirse directamente a los analizadores. Idealmente, la pipeta del analizador toma un volumen de la muestra taladrando el tapón cerrado después de que la muestra se ha homogeneizado. En la mayoría de los laboratorios, sin embargo, tienen que quitarse los tapones y distribuir las muestras. Para impedir la evaporación, esto debería hacerse poco tiempo antes de las mediciones. Las alícuotas (porción de una muestra que tiene su misma composición) de las muestras deben someterse a las mismas reglas que las muestras primarias con respecto a la identificación, condiciones de almacenamiento y aspectos de seguridad. Para evitar el contacto con la sangre que contiene materiales potencialmente infecciosos, la división de las muestras y la preparación de alícuotas deberá evitarse en la medida de lo posible. Esto se facilita con el uso de separadores en los tubos. Alternativamente, la distribución puede realizarse por dispositivos mecánicos (sistemas de automatización de preanalítica).

12.5. ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS__________________________________________________ Una vez procesados los especímenes de sangre, los tubos primarios son clasificados ordenadamente en gradillas por fecha, origen y número de identificación y se almacenan refrigerados (2º - 8º C) durante un periodo de 3 días por si fuera preciso la repetición, comprobación o ampliación de pruebas analíticas. Las orinas siguen el mismo proceso pero se conservan sólo 24 horas. Las alícuotas seran congeladas (-20º C) hasta su procesado en el laboratorio. Los especímenes que no puedan ser procesados en el día, se conservan en tubo primario refrigerados 24 horas. Las muestras para laboratorios de referencia se conservaran refrigeradas o congeladas hasta su envío.

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12.6. AUTOMATIZACIÓN DE LA PREPARACIÓN DE ESPECÍMENES________________________________ La preparación de los especímenes antes de realizar las determinaciones analíticas, es uno de los componentes operativos más importantes a los que se enfrentan los laboratorios clínicos. La automatización de la fase preanalítica permite minimizar errores. Los componentes principales de los sistemas mecanizados para manipular los especímenes antes de la realización de las determinaciones analíticas son: • Unidad de entrada de especímenes. • Centrífugas automáticas. • Destaponador de tubos. • Alicuotador. • Taponador o sellador de tubos. • Etiquetador. • Clasificador. Unidad de entrada de especímenes Según llegan los tubos al laboratorio se colocan en la unidad de entrada. Aquí se clasifican y se distribuyen de acuerdo con las determinaciones solicitadas y las condiciones del tubo. Los tubos pueden transportarse de uno en uno o utilizando dispositivos que permiten acomodar varios de ellos, normalmente cinco. Los sistemas difieren en cuanto al tamaño y tipo de tubos que aceptan. Algunos sistemas tienen transportadores de tubos que pueden aceptar cualquier tamaño de tubo, pero alguno de los otros componentes del sistema, como la centrífuga, el destaponador, el alicuotador y el taponador pueden no ser tan versátiles. Centrífugas automáticas Si hay que centrifugar el tubo para obtener el suero o el plasma, aquel se dirige hacia la centrífuga automática que va cargando mediante un brazo robotizado los tubos en el rotor y, cuando este se llena, se autoequilibra. La capacidad y funcionalidad de cada centrífuga difieren dependiendo del sistema. La capacidad, el tamaño de los tubos y el rendimiento del proceso varían de unos equipos a otros. Algunos rotores pueden acomodar todo tipo de tubos, mientras que otros no lo hacen. El mecanismo de equilibrado también difiere de unos sistemas a otros. Debe considerarse el número de centrífugas que pueden conectarse, especialmente en aquellos laboratorios con un volumen elevado de especímenes. Destaponador Una vez centrifugados los tubos, se extraen de la centrífuga y se llevan al destaponador, donde se quita el tapón. Alicuotador Si está programado el fraccionamiento en alícuotas, se trasladan los tubos al alicuotador, en el que se realiza la operación y se etiqueta el tubo. La mayoría de los alicuotadores pueden realizar la detección del coágulo y detectar el nivel. Algunos sistemas registran de forma óptica el volumen que queda en el tubo y avisan al operador si hay volumen suficiente para el alicuotado. Taponador o sellador de tubos El taponamiento de los tubos puede realizarse con tapones de plástico o con una lámina metálica de sellado por calor. Etiquetador Sistema que hace etiquetas para los tubos secundarios generados. Clasificador Módulo del sistema automático de la fase preanalítica mediante el cual se clasifican los tubos para su envío a las secciones del laboratorio adecuadas.

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Capítulo 13. Métodos analíticos

Introducción 13.1. Procedimiento, método y técnica de medida 13.2. Descripción del método analítico 13.3. Tipos de métodos analíticos 13.4. Necesidad de la evaluación del método analítico 13.5. Características de los métodos analíticos 13.6. Criterios de selección de los métodos analíticos 13.7. Evaluación del método analítico 13.8. Comparación de métodos 13.9. Implantación de nuevos métodos analíticos

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INTRODUCCIÓN____________________________________________________________________ Antes de implantar un método analítico hay que reflexionar sobre la existencia de esta necesidad y qué es lo que se pretende, es decir, que novedades aportará esta determinación en relación con las que ya se efectúan en el laboratorio. También hay que pensar en si la sensibilidad y la especificidad del nuevo método cumplen los requerimientos clínicos y si esta nueva determinación es lo suficientemente exacta y precisa para que sea aceptable clínicamente. Además de los aspectos clínicos y analíticos, deben tenerse en cuenta otros aspectos, como los efectos que puede tener el método analítico sobre la estructura del laboratorio, la disponibilidad de instrumental y de personal cualificado, así como la carga de trabajo que puede representar sobre las otras áreas del laboratorio, como por ejemplo, preanalítica, secretaría, almacén, etc.

13.1. PROCEDIMIENTO, MÉTODO Y TÉCNICA DE MEDIDA_____________________________________ El conjunto de actividades necesarias para realizar una medición es un proceso de medida. Los procesos de medida que tienen lugar en el laboratorio de bioquímica clínica son de naturaleza diversa y se fundamentan en la química analítica, la inmunología y la biología molecular. Un proceso de medida puede describirse con mayor o menor detalle. Cuando el proceso de medida se detalla lo suficiente como para poder realizar la medición se denomina procedimiento de medida, si dicho proceso se describe en términos genéricos recibe el nombre de método de medida, mientras que si sólo se indica la base científica en que se fundamenta la medición se llama principio de medida o técnica de medida. Los siguientes ejemplos ilustran estos conceptos: - La espectrometría de absorción molecular es un principio (o técnica) de medida. - La medición de la concentración de sustancia de glucosa por espectrometría de absorción molecular (visible), usando hexoquinasa y la reacción de Trinder, es un método de medida. - La medición de la concentración de sustancia de glucosa en suero con el analizador X y con el equipo de reactivos Y, siguiendo las instrucciones del fabricante , es un procedimiento de medida.

13.2. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO______________________________________________ Es el conjunto de instrucciones escritas que describen el procedimiento, los materiales y el equipamiento que se necesitan para obtener resultados. - Fundamento del método con referencias bibliográficas. - Características técnicas de los instrumentos y del material. - Lista de reactivos, con la composición, concentraciones y origen, así como el nombre comercial y la pureza. También se ha de indicar la concentración de los calibradores y el método utilizado para asignar los valores y los límites de tolerancia de los valores. - Condiciones del espécimen. Debe incluir: volumen, conservantes o anticoagulantes, condiciones de almacenamiento recomendadas y horario de extracción recomendado. - Descripción completa de todos los pasos del procedimiento analítico, indicando claramente los pasos críticos y tolerancias que se pueden permitir en las mediciones (tales como volumen, tiempo, temperatura, longitud de onda, etc.). - Procedimiento de calibración y método de cálculo de los resultados. - Intervalo analítico, es decir, el intervalo de concentración o de otra magnitud en el que se puede aplicar el método sin ninguna modificación. Para la mayoría de los métodos, la variación de volumen de la muestra implica modificaciones. La imprecisión y la inexactitud de los métodos analíticos aumentan considerablemente en los extremos del intervalo analítico, por eso hay que describir los procedimientos para tratar especímenes fuera de dicho intervalo.

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- Precauciones especiales de seguridad en la manipulación de especímenes, en la preparación de reactivos, en la eliminación de residuos y en los métodos apropiados para descontaminar, en el caso de que sean necesarias.

13.3. TIPOS DE MÉTODOS ANALÍTICOS____________________________________________________ Los métodos analíticos se pueden dividir en: - Métodos cualitativos. - Métodos semicuantitativos. - Métodos cuantitativos. En bioquímica clínica los métodos más numerosos son los cuantitativos que pueden clasificarse en cuatro tipos, según el grado de exactitud: • Método definitivo: es el método al que, tras una exhaustiva investigación, no se le encuentra ninguna causa de inexactitud conocida. El resultado que se obtiene con este método es el valor definitivo y corresponde a la mejor aproximación al valor verdadero. • Método de referencia: es el método que, tras una exhaustiva investigación, presenta una inexactitud despreciable en comparación con su imprecisión. El valor según el método de referencia es el que se deriva de un conjunto de resultados que se obtienen con el método de referencia. • Método de inexactitud conocida: es el método en el que se ha establecido la inexactitud, por ejemplo, comparándolo con un método de referencia. El resultado que se obtiene con estos métodos se llama valor asignado, y es preciso informar de sus límites de confianza. El grado de inexactitud puede depender de la concentración o de la presencia de sustancias que interfieren. Si los resultados se corrigen según la inexactitud, habrá que hacer constar y especificar el origen de la corrección. • Método de inexactitud desconocida: es el método cuya inexactitud no se conoce; el resultado que se obtiene es un valor asignado.

13.4. NECESIDAD DE LA EVALUACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO___________________________ Las razones por las que se pone a punto un método analítico pueden ser: Necesidad de mejorar la imprecisión de un método ya establecido en el laboratorio. Aumento del grado de automatización de un método ya existente. Cambio de método por razones económicas. Implantación de un nuevo parámetro en el laboratorio. Antes de empezar los análisis rutinarios de las muestras es preciso establecer la calidad del método en cuestión, lo que se hace evaluando el método en el entorno del propio laboratorio. El objetivo de las evaluaciones realizadas en el propio laboratorio consiste en comprobar que las características del método cumplen los requerimientos clínicos que se pretenden.

13.5. CARACTERÍSTICAS DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS____________________________________ Las características de los métodos analíticos se pueden agrupar en tres apartados: - Características de practicabilidad (rapidez, dificultad técnica, grado de dependencia, peligrosidad, etc.) - Características analíticas o de fiabilidad (especificidad, inexactitud, imprecisión y grado de detección). - Características económicas.

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Características de practicabilidad: Es el primer paso que se ha de dar, el cual permitirá decidir si el método se puede instaurar o no en el laboratorio. El estudio de la practicabilidad establecerá si la infraestructura del laboratorio puede asumir o no la realización de esta metódica, indicará si se dispone del instrumental apropiado o si se necesita comprar instrumental nuevo, cuánto espacio se requiere, el grado de especialización del personal, el tipo de muestra, la sobrecarga adicional para el laboratorio, la disponibilidad de patrones, controles y métodos de referencia, así como otras características no analíticas intrínsecas; por ejemplo, el riesgo que puede implicar. Como punto de partida para estudiar estas características se utilizará la bibliografía sobre el método. Características analíticas: - Imprecisión: se refiere a la repetición de resultados de mediciones repetidas. Se realiza experimentalmente procurando que las condiciones no varíen. Las recomendaciones publicadas aconsejan hacer entre 10 y 20 determinaciones. Cabe distinguir entre imprecisión intraserie, que corresponde a la variabilidad que se produce cuando el mismo material se analiza repetidamente en la misma serie analítica; e imprecisión interserie, que se obtiene analizando el mismo material en diferentes series analíticas. • La imprecisión intradía se calcula realizando las determinaciones analíticas en diferentes series en el mismo día. • La imprecisión interdía es la variabilidad que se presenta al realizar determinaciones repetidas en días diferentes. - Inexactitud: es la diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero. Se determina comparando los resultados obtenidos con dos métodos analíticos en las mismas muestras. Un método es el que se evalúa y el otro es el método de inexactitud conocida. Al comparar los resultados, la diferencia entre los dos métodos se denomina error y puede ser de diferentes tipos: El error sistemático es el que se produce siempre en la misma dirección. Puede ser error sistemático constante, en el que la magnitud del error es la misma en todas las concentraciones del parámetro de terminado; y error sistemático proporcional, en el que la magnitud del error es proporcional a la concentración del parámetro de terminado

Error analítico

Error constante y proporcional

El error aleatorio es el que varía de muestra en muestra y se debe a la presencia de interferencias en algunas muestras.

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La suma del error sistemático y del error aleatorio da el error total del método analítico, que es el causante de la diferencia entre el valor verdadero y el valor observado.

Error aleatorio y sistemático El error aleatorio se determina estadísticamente y se cuantifica con la desviación estándar con respecto a una media. El error constante se determina mediante estudios de interferencias, El error proporcional se cuantifica mediante experimentos de recuperación. El error sistemático se detecta comparando métodos analíticos. - Rango analítico: es el rango de concentraciones en el espécimen, gracias al cual el método da resultados válidos. Se establece mediante diluciones seriadas. Interesa que el rango analítico cubra la mayor parte de las muestras que se analizan. Se recomienda que cubra el 95% de las muestras sin necesidad de hacer diluciones. Intervalo de valores de una magnitud en el que el procedimiento de medida es aplicable sin modificaciones. También llamado Intervalo de medida o analítico. - Límite de detección: se define como la respuesta que se puede distinguir de un blanco (concentración 0) con una probabilidad preestablecida (suele ser del 95%). También denominado sensibilidad analítica. - Sensibilidad analítica: es la capacidad que tiene un método para detectar pequeñas cantidades del componente que se ha de medir. La sensibilidad está relacionada con la imprecisión; la imprecisión puede cambiar en función de la concentración con que se trabaje. Cuando se analizan concentraciones superiores al límite de detección, es preferible determinar la imprecisión en las concentraciones que interesan, las cuales suelen ser las que implican decisiones clínicas. Si las concentraciones son muy bajas, la sensibilidad se da en función del límite de detección. También se le puede denominar límite de detección. - Límite de dilución: límite superior del intervalo de medida. Por encima de este valor la muestra ha de ser diluida. - Límite de cuantificación: valor verdadero mínimo de la magnitud que puede estimarse con una imprecisión aceptable (habitualmente el 10%). Término alternativo aceptado: valor mínimo cuantificable. - Especificidad analítica: es la capacidad del método para determinar el componente que se quiere analizar. Está relacionada con la inexactitud. Un método que no presenta reacciones cruzadas tiene una gran especificidad. La especificidad puede perderse por interferencias del color, de la turbidez, etc. Diferenciar de la especificidad diagnóstica.

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- Interferencias: son los efectos de un componente, que por sí solo no da lectura, sobre la exactitud en la determinación de otro componente. La magnitud del efecto depende de la concentración o cantidad de material de interferencia, pero no necesariamente de un modo directamente proporcional. Desviación clínicamente significativa en la medida de la concentración de un constituyente, debida al efecto de otro componente o propiedad de la muestra. El efecto puede ser debido a la inespecificidad del sistema de medida, a la supresión de la reacción del indicador, a la inhibición del constituyente si se trata de una enzima o a cualquier causa de desviación dependiente de la muestra. Error sistemático producido por un interferente en un proceso analítico. Según que el error sea positivo o negativo, la interferencia se denomina positiva o negativa, respectivamente. - Recuperación: es la capacidad que tiene un método analítico de dar la medición correcta de una cantidad de un componente puro que se ha de analizar, el cual se ha añadido a las muestras que se procesan normalmente.

Características económicas El coste por prueba es uno de los aspectos que hoy en día tiene más peso específico debido a la fuerte presión que existe por controlar los gastos sanitarios. Por ello deberá evaluarse cuidadosamente sobre todo si la incorporación de un nuevo método analítico implica la adquisición de reactivos, patrones, calibradores, controles e instrumentos nuevos, así como la disponibilidad de recambios, los tiempos de respuesta en las reparaciones, sus costes, etc.

13.6. CRITERIOS DE SELECCIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS_________________________________ Los criterios de selección son los que permitirán tomar la decisión de aceptar o rechazar un método analítico, y deberán basarse en la capacidad del método para satisfacer los requerimientos clínicos según los cuales finalmente se tomarán decisiones. Estas decisiones afectarán directamente al enfermo, de forma que si el resultado contiene un error elevado puede conducir a falsas interpretaciones. Esos errores tendrán consecuencias más graves en los niveles de decisión clínica, ya que normalmente son los que permiten diferenciar entre la presencia y la ausencia de una determinada alteración. Conviene, pues, prestar especial atención a la evaluación en dichos niveles, los cuales, por ser los más críticos, han de tener prioridad al escoger concentraciones para estudiar las características de un método analítico. Sería deseable poder disponer de una tabla de errores aceptables para cada parámetro y para cada concentración de interés. Existen ciertas publicaciones donde se pretende reflejar unos límites que ayuden a tomar decisiones en cuanto a la aceptabilidad o no de los métodos; pero, desgraciadamente, no son exhaustivas, por lo que la decisión tendrá que basarse en la experiencia de los profesionales. Hay que tener en cuenta los siguientes aspectos: número de muestras, tiempo de respuesta, velocidad de análisis, tipo de espécimen, calibración automática, posibilidad de control, autodiagnóstico, espacio necesario, tipo de almacenamiento, disponibilidad del personal, tiempo de aprendizaje, coste por prueba y también el riesgo y la seguridad. Otros aspectos que tendrán que estudiarse son: características del método, especificidad, sensibilidad, tipo de patrones que se pueden emplear, efecto de la matriz, libertad de reactivos, temperatura de trabajo, tiempo de reacción, tiempo de medición y calidad de la medida.

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Las características analíticas del método deben cumplir una serie de requisitos que se han de fijar previamente, como el error permisible que vendrá dado por la aplicación médica de la prueba, la linealidad, la estabilidad de los reactivos, la capacidad del analizador para detectar el agotamiento del sustrato, el intervalo de referencia, la imprecisión y la inexactitud. A continuación deberán revisarse las publicaciones técnicas y profesionales para saber los métodos que existen y obtener información sobre sus características. También se puede solicitar información de profesionales más experimentados. Con toda esta información se buscarán los métodos más apropiados, en número no superior a tres, y se estudiarán las evaluaciones bibliográficas para ver en qué grado satisfacen las características que se desean. El paso siguiente es la evaluación de los métodos, que consiste en un proceso continuo durante el cual se acumula gradualmente la información sobre sus características. Algunos datos los habrá proporcionado el autor del método original, comprobándolos y completándolos otros bioquímicos que utilizan el mismo método. En cada etapa se produce información sobre las características del método, que debe recogerse y presentarse de forma normalizada para que sea útil a otros profesionales, ahorrándose de esta manera trabajo innecesario.

13.7. EVALUACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO_______________________________________________ La evaluación del método analítico comprende las siguientes fases: • • • • •

Fase Fase Fase Fase Fase

previa de evaluación de familiarización de evaluación del análisis de la evaluación de implantación en el laboratorio

Fase previa de la evaluación En esta primera fase hay que realizar un estudio de los posibles métodos que pueden encontrarse comercializados, efectuándose a continuación un estudio crítico con el fin de escoger de la selección un máximo de tres. Las características que se analizarán serán: el cumplimiento de los objetivos clínicos propuestos, si encajan en la organización del laboratorio, el coste, la larga caducidad y estabilidad de los reactivos, y la posibilidad de que el método quede rápidamente anticuado. El objetivo de esta fase consiste en definir la función, las características y otros factores que el laboratorio quiera lograr con el nuevo método, así como seleccionar el método que parezca cumplirlos mejor. Hay que tener en cuenta las características analíticas, si la implantación será en el laboratorio de rutina o en el de urgencias o en los dos, los aspectos metodológicos, los factores de personal y de suministro, las repercusiones en la estructura del laboratorio y los factores económicos. Fase de familiarización En esta fase se llevan a cabo las primeras determinaciones con el método escogido. Se intenta que el estudio del método se realice en las condiciones lo más parecidas posible a las futuras condiciones de trabajo, pensando en la sección y en el instrumento en que se hará. En esta fase no deben comprometerse las prestaciones teóricas del método y hay que disponer del personal necesario y apropiado, así como de material y tiempo para su realización.

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Esta fase debe permitir saber si el método tiene las características que de él se esperaban, si su realización es más difícil de lo que se pensaba, los posibles problemas en cuanto a ubicación, suministros, factores de seguridad y aspectos administrativos, si es aceptable para el personal o resulta de escasa practicabilidad. Se analizarán materiales de control con valores asignados o con especímenes de enfermos de los que se conocen los valores del constituyente objeto de la evaluación. La conclusión será la decisión de aceptar o no el método, pensando si existe la posibilidad de introducir modificaciones para mejorarlo. Fase de evaluación Esta fase sirve para conocer cuáles son las prestaciones reales que se pueden obtener en el laboratorio. Pueden presentarse dos situaciones: - Que el método esté muy difundido: las revistas científicas habrán publicado evaluaciones dignas de confianza, realizadas por laboratorios u organismos independientes. En este caso se hará una evaluación corta para verificar que el método se comporta en el laboratorio de forma similar a la de las evaluaciones publicadas. - Que el método no tenga una gran implantación y, por consiguiente, exista poca información o no existan evaluaciones completas. Entonces deberá realizarse una evaluación completa para conocer todas las posibles prestaciones del método. - EVALUACIÓN CORTA Se estudiará la inexactitud y la imprecisión intraserie a partir de especímenes analizados simultáneamente por un método de referencia o, en su defecto, por el mejor método posible, a partir de especímenes analizados en otro laboratorio de referencia. Interesa que las muestras de los enfermos cubran todo el intervalo y que haya muestras potencialmente ínterferentes (hemolizadas, ictéricas, lipémicas, etc.). El estudio de los resultados permitirá decidir si se puede poner en uso el nuevo método o si debe completarse la evaluación con un estudio más exhaustivo. - EVALUACIÓN LARGA (COMPLETA) Con esta evaluación se pretende determinar la inexactitud y la imprecisión entre diferentes series, determinar la linealidad del mismo, conocer la especificidad del método, las posibles interferencias y el limite de detección. Las series analíticas para el estudio se harán con material de control de calidad a tres niveles de concentración diferentes y con especímenes de enfermos de concentraciones conocidas. Se compararán con un método de referencia o alternativo. Se dispondrá de especímenes con concentraciones en los límites superior e inferior de la toma de decisiones clínicas, y si el constituyente no tiene límite inferior o superior de interés clínico, se considerará el límite de detección analítica o el límite de linealidad. Se aconseja utilizar o preparar los reactivos una sola vez para toda la evaluación. En el caso de ser inestables o de que su presentación fuera de pequeño volumen, deberán ser del mismo lote de fabricación y habrán de utilizarse también en otros laboratorios en el momento de la evaluación. Con los resultados obtenidos se realizarán una serie de cálculos que permitirán determinar si se han alcanzado los objetivos propuestos. Según el tipo de estudio que se esté desarrollando, es posible que sea necesario profundizar más en la evaluación para conocer características exclusivas del método que sean importantes en su utilización. También puede ocurrir que sea necesario modificar el protocolo de evaluación en el laboratorio porque el método que se quiere estudiar no se puede acoplar o porque no se incluye el estudio de una característica muy particular del método. - ESTUDIOS DE RECUPERACIÓN Es un complemento al estudio de inexactitud y debe realizarse en metodologías que puedan ocasionar pérdidas significativas del constituyente, por ejemplo en procesos de extracción o en análisis cromatográficos. Puede ocurrir que el diseño de esta parte de la evaluación sea difícil al no poder disponer del constituyente. Otro problema que surge es que estos experimentos necesitan la adición de materiales

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que puedan producir cambios en la matriz. Por ello los estudios de recuperación sólo pueden efectuarse si se sabe que los cambios que vayan a producirse en la matriz son mínimos. - ESTUDIOS DE INTERFERENCIAS Las interferencias pueden ser causa de inexactitudes en la lectura final. Se deben a sustancias presentes en las muestras que se analizan y pueden conducir a resultados bajos (sustancias inhibidoras) o a resultados altos (sustancias amplificadoras). Es conveniente consultar los estudios que se van publicando. Los estudios de los fundamentos físico-químicos del método analítico pueden indicar qué constituyentes son potencialmente interferentes. Sin embargo, es muy difícil, porque en los estudios hay que considerar como posible interferente cualquier droga, nutriente o constituyente, hasta que de forma experimental no se demuestre lo contrario. El estudio exhaustivo es muy largo, complicado y caro, por eso hay que tener en cuenta los medicamentos que se utilizan normalmente en la patología de base del enfermo a quien se aplicará el método. Los protocolos de evaluación recomiendan como mínimo el estudio de los posibles efectos interferentes de la bilirrubina, la hemoglobina y la lipemia. - LÍMITE DE DETECCIÓN Tal vez interese determinar cuál es la concentración más pequeña que se puede distinguir de un blanco (cero) con un límite de confianza preestablecido, lo cual se realiza analizando especímenes que no tengan este constituyente o, si ello no es posible, eliminando un reactivo fundamental o una parte crítica del proceso analítico. - OTROS ASPECTOS Hay que tener presente que la no validez de un método puede ser causada por el utillaje que se emplea en las determinaciones, por eso es preciso conocer su calidad y si los materiales que lo integran pueden afectar al método. También hay que tener en cuenta si la recogida, el transporte y el almacenamiento del espécimen, y también la preparación de los enfermos requieren alguna precaución especial. Fase del análisis de la evaluación El siguiente paso es el estudio de los resultados obtenidos con miras a rechazar o a aceptar el método. Esta decisión, tan importante algunas veces, puede resultar muy difícil si no se tiene una gran experiencia en el tema. En la bibliografía se describen algunos criterios que ayudan a tomar esta decisión: - IMPRECISIÓN Un criterio de aceptación es que la variabilidad sea menor o igual que la mitad de la variabilidad intraindividual, o bien que sea satisfactoria para los objetivos clínicos que se desean. Si la desviación estándar es superior, habrá que pensar en la posibilidad de introducir modificaciones que hagan disminuir la imprecisión. - COMPARACIÓN DE MÉTODOS Dicha comparación puede resultar difícil si el método que se toma como punto de comparación está lejos de ser un método de referencia. Se aceptará si el coeficiente de correlación es superior a 0,99, si la ordenada en el origen no es significativamente diferente de cero, si la pendiente no es significativamente diferente de uno y sí las pruebas estadísticas que comparan las medias indican que no hay diferencias. Si no se cumplen uno o varios de estos criterios, habrá que pensar en la posibilidad de introducir mejoras o habrá que estudiar la importancia del error desde un punto de vista analítico y de interpretación de resultados.

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- INEXACTITUD Si la diferencia entre los valores obtenidos y los deseables es inferior al error permitido, se aceptará el método. Si el error es superior, habrá que determinar si el problema radica en los materiales de control utilizados y no en las muestras de los enfermos (por ejemplo, turbidez por liofilización). Si la causa es otra, habrá que pensar en mejorar el método y, en caso de que no sea posible, verificar que se cumplan los objetivos clínicos. - RECUPERACIÓN Se acepta como válida una recuperación media entre 90 y 110%, siempre y cuando no haya ninguna determinación inferior al 85 % ni superior al 115%. Si no se cumple, se intentará mejorar el protocolo. - ESTUDIOS ESPECIALES Los resultados de los estudios especiales que se hayan realizado han de ser satisfactorios, de lo contrario habrán de introducirse las mejoras pertinentes siempre que no supongan un elevado coste económico. - LlNEALIDAD Debe cubrir el aspecto analítico más amplio requerido sin que haga falta realizar manipulaciones adicionales. - LÍMITE DE DETECCIÓN Debe ser el apropiado para el método. Para aceptar un método deben cumplirse los criterios anteriores, aunque es preciso definir perfectamente la linealidad, especificidad, interferencias y límite de detección para poder discernir las muestras que no son apropiadas para ser analizadas por dicho método. Antes de tomar la decisión definitiva, deben valorarse de nuevo los aspectos de preparación del personal, espacio físico y organización del laboratorio, a fín de aceptar el nuevo método, cambiar de método candidato o rechazarlo. Fase de instauración en el laboratorio Si la decisión final ha sido la de aceptar el método, a continuación viene la fase de instauración en la rutina del laboratorio. Hay que tener en cuenta los siguientes aspectos: - El espacio físico debe ser el adecuado en la sección correspondiente y las instalaciones las más correctas. - El personal debe tener la preparación necesaria y los conocimientos precisos sobre el fundamento y las características analíticas, y hay que disponer de un manual de instrucciones (PNT) de un resumen de las mismas, de descripciones de las dificultades más frecuentes y de indicaciones sobre la toma de decisiones en situaciones especiales. - Considerar la preparación de las listas de trabajo o las conexiones on line con el sistema informático del laboratorio. - Considerar el tiempo y la frecuencia de realización del método, plazo de entrega de resultados y volumen de las series analíticas. - Definir el intervalo de referencia, si es propio o no, y ponerlo en conocimiento de todos los implicados en el proceso y de los posibles usuarios. - Preparar un esquema de control de calidad, cantidades de almacén y material fungible, y conocer el tiempo de respuesta del suministrador. - Preparar protocolos de preparación del enfermo y solicitud de la determinación. - Inscribir el método en un programa de control de calidad externo y fijar la normativa de toma de decisiones en función de los informes que se reciban sobre los resultados emitidos. - Esquema de la rutina, su realización y puesta a punto de los reactivos, etc. - Por último, se deberá emitir un comunicado oficial a todos los usuarios anunciándoles la puesta en marcha del nuevo método; preparar un archivo para bibliografía, evaluaciones y protocolo interno del

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laboratorio; hacer un seguimiento de los resultados que se van generando e intercambiar impresiones con los clínicos sobre lo que aporta el nuevo método.

13.8. COMPARACIÓN DE MÉTODOS_____________________________________________________ La necesidad de comparar dos métodos, que se plantea en la evaluación de los métodos analíticos, también se plantea en otras ocasiones , como por ejemplo en la valoración de la intercambiabilidad de resultados y en la transferibilidad de valores de referencia. Cuando se evalúan las prestaciones de los métodos analíticos, se valoran una serie de propiedades conocidas genéricamente como criterios de fiabilidad: imprecisión, inexactitud, intervalo de linealidad, detectabilidad, sensibilidad y especificidad analítica. Se estudian así las posibles disparidades, desviaciones o errores que pueden producirse durante el proceso analítico. Dichos errores se deben a las fluctuaciones y a los cambios en las condiciones del sistema de medición, y afectan a los resultados de dos formas diferentes: aleatoria o sistemáticamente. El error de origen aleatorio se detecta mediante el estudio de la imprecisión analítica. Los procedimientos de control de calidad aseguran que la imprecisión analítica se mantenga constante por debajo de unos mínimos que no enmascaren cambios clínicos significativos. La mayor parte de los métodos analíticos presentan diferentes imprecisiones a diferentes valores de concentración; por ejemplo, cuanto mayor es la concentración de una sustancia, mayor es la varianza. En este caso se habla de heterocedasticidad. En el caso contrario, cuando la varianza es constante en todo el intervalo de mediciones, se habla de homocedasticidad. Ha de comprobarse esta propiedad antes de decidir el método estadístico que vaya a emplearse. En la evaluación de métodos analíticos interesa detectar la diferencia eventual entre el método evaluado y el método comparativo. Para ello se determina el constituyente mediante el método comparativo (X) y mediante el método que se ha de evaluar (Y) en n especímenes, por duplicado o de forma única si se conoce su imprecisión. Los resultados obtenidos son los elementos de un conjunto de parejas de valores observados (Xi, Yi), donde i = 1, 2,….., n. «Se recomienda el uso de libros de texto de estadística» Comparación de la imprecisión Se calcula la varianza de ambos procedimientos analíticos y se comparan utilizando la prueba F de Snedecor.

Comparación de la inexactitud -Métodos gráficos: gráfica de dispersión (abscisas método comparativo X; ordenadas método evaluado (Y). -

Métodos estadístico basados en datos aparejados:

t de Student (comprueba las medias de datos emparejados). T de Wilcoxon (prueba no paramétrica).

- Comparación de la inexactitud basada en la regresión: la regresión estudia la forma en que Y varía en función de X. Cuando la gráfica de los valores (Xi, Yi) sigue una línea recta, se habla de regresión lineal; en caso contrario, de regresión no lineal.

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El modelo lineal se describe asumiendo que para un determinado valor de X, Y sigue una distribución gaussiana de media: Y = a + bX (ecuación general de la línea recta) y de varianza s2. El estadístico –a- representa el valor de la ordenada en el origen y el estadístico –b- la pendiente de la recta de regresión. La identidad ideal será representada por la recta: Y = X es decir, cuando se cumplen simultáneamente; a = 0 y b = 1, o sea, cuando la recta intercepta la ordenada en el origen y forma un ángulo de 45º con los ejes de coordenadas. Cuando a≠0, ello implica la existencia de error sistemático constante; y cuando b≠1, ello implica la existencia de error sistemático proporcional. Cuando ambos son diferentes respectivamente de 0 y de 1, se habla de la existencia de error mixto o combinado. Los procedimientos de estimación o cálculo facilitan unos intervalos de confianza cuya amplitud depende del número de datos disponibles. Si los intervalos de confianza de a y de b contienen el 0 y el 1, se concluye que no existe respectivamente error proporcional o constante. Tipos de regresión:

Regresión lineal simple. La forma más corriente de calcular los parámetros de la línea recta: Y = α + βX es el llamado método de los mínimos cuadrados, hasta el punto de que suelen considerarse sinónimos. Consiste en seleccionar la línea recta cuya posición sea la más cercana a todos los puntos observados (X¡, Y¡). Para ello se minimiza la suma de los cuadrados de las distancias (verticales o en sentido de las ordenadas) entre los puntos y la línea. Se utiliza el cuadrado de las distancias para prevenir que la suma de cantidades positivas (por ejemplo entre puntos por encima de la línea) se anule con las cantidades negativas (por debajo de la línea de regresión). Regresión ortogonal. Método de Deming: admite que ambos métodos están sometidos a error aleatorio y por lo tanto se debe establecer la relación entre el error aleatorio de ambos métodos. Λ = varianza (imprecisión) método Y / varianza (imprecisión) método X Regresión no paramétrica: método de Passing-Bablok: método de elección; las únicas condiciones de aplicación para obtener una estimación no desviadas de la recta de regresión son que los resultados de ambos métodos analíticos se distribuyan de forma continua y que la relación entre ellos sea lineal. El tamaño óptimo de muestras es de 100 y han de ser representativas de todo el intervalo analítico del método en estudio.

13.9. IMPLANTACIÓN DE NUEVOS MÉTODOS ANALÍTICOS_____________________________________ Protocolo interno del laboratorio Al implantar un nuevo método analítico, hay que incluirlo en el manual interno del laboratorio, manual que tiene como fin primordial el mantener uniforme la calidad analítica de las determinaciones del laboratorio. En este manual, para cada parámetro, se hará constar lo siguiente: - La utilidad del parámetro: si la determinación del nuevo parámetro tiene valor diagnóstico, o si sirve para el control de un tratamiento terapéutico, o para evaluar el pronóstico de una enfermedad, o para detectar una enfermedad en personas aparentemente sanas. - La sensibilidad y especificidad diagnósticas y el valor predictivo. - Tipo demuestra que se requiere para el análisis: suero, plasma, orina, etc. Si se trata de plasma, deberá indicarse qué anticoagulante se debe emplear. - Tratamiento de la muestra, tipo y tiempo de centrifugación y normas de conservación (temperatura ambiental, nevera, congelador, protección de la luz, etc.). - Los requerimientos del enfermo antes y durante la obtención de la muestra (horas de ayuno, tipo y duración de la dieta previa, período de recogida: 24 horas o primera micción de la mañana; en el caso de orinas de 24 horas deben darse instrucciones de recogida, tipo de conservante, etc.). Si el constituyente

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tiene un ritmo circadiano o sirve para monitorizar un tratamiento deberá indicarse la hora en que se ha obtenido la muestra. - Fundamento del método, posibles interferencias por hemolisis, lipemia e ictericia. Reacciones cruzadas con metabolitos o interferencias producidas por fármacos (in vivo e in vitro). - Descripción detallada del material necesario: reactivos (indicando la calidad, preparación, estabilidad y conservación), instrumentación, material de calibración (preparación, estabilidad y conservación), material de control de calidad (características técnicas, condiciones de utilización, concentraciones deseadas, estabilidad y conservación). - Descripción detallada del protocolo de análisis (temperatura de trabajo, forma de medición, secuencia analítica, cálculos y expresión de resultados). También hay que hacer constar los aspectos de seguridad, la frecuencia y posición de los controles y los criterios de aceptación o rechazo de las series analíticas. Hay que indicar asimismo las instrucciones sobre la dilución de las muestras en caso de rebasar el límite de linealidad del método. Respecto a la expresión de resultados, deberá indicarse el número de cifras significativas, el tipo de unidades, la utilización de abreviaturas y la terminología. También deberá indicarse el grado de confidencialidad de los resultados, la forma de presentación, la verificación y el tiempo de respuesta del laboratorio, sin olvidarse de incluir un procedimiento de información rápida a los clínicos en casos de resultados considerados de pánico, alarmantes o críticos. Si se dispone de valores de referencia con criterios de partición, se informará de los valores de referencia correspondientes (ya sea por edad, sexo, actividad, ciclo menstrual, etc.), - Datos sobre las prestaciones analíticas del método obtenidos en la fase de evaluación; imprecisión (inter e intraseries), inexactitud, límite de linealidad, límite de detección, etc. Este manual de procedimientos internos del laboratorio se revisará cada vez que se introduzcan cambios en la metodología o en la instrumentación, o al menos una vez al año, haciendo constar la fecha de actualización. Información a los clínicos Hay que mantener informados a los clínicos sobre la introducción de nuevos métodos o cambios de métodos en el laboratorio. La comunicación con los clínicos puede ser formal o informal, oral o escrita, pero lo importante es tener una comunicación fluida no sólo con los clínicos, sino con todo el personal del hospital que tenga algún tipo de relación con el laboratorio (enfermeras, administrativas, etc.), porque con la colaboración mutua se obtendrá un aumento de la eficacia del laboratorio. Debe redactarse un manual de procedimientos e instrucciones de recogida de muestras, donde constará el horario de recogida del laboratorio y se indicarán las pruebas que necesitan condiciones especiales del paciente (dieta, ayuno, etc.), el tipo de tubo para cada constituyente, el anticoagulante que se ha de utilizar, las normas para el transporte y conservación de las muestras, y también un protocolo para manipular muestras de enfermos con riesgo de contagio, forma de identificarlas y pauta de actuación en caso de accidente, Dicha información irá dirigida a médicos y enfermeras responsables de la obtención de las muestras; en el caso de que la obtención de la muestra sea responsabilidad del paciente, se le darán instrucciones por escrito. Es aconsejable hacer un manual de bolsillo o en soporte informático -pdf- dirigido a todos los usuarios del laboratorio, en el que se incluya un listado de todos los parámetros que se determinan en el laboratorio, indicando valores de referencia, criterios de variabilidad más importantes (edad, sexo, ciclo menstrual, etc.), efecto de las drogas, interferencias producidas por lipemia o ictericia, etc., y la imprecisión analítica.

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También se harán constar las determinaciones urgentes y las normas para su solicitud. En caso de pruebas funcionales, se darán instrucciones para su realización. Es recomendable indicar el coste de cada determinación con el objeto de que los clínicos conozcan los aspectos económicos de sus solicitudes de análisis. Otro tipo de comunicación laboratorio-clínicos pueden ser las ediciones periódicas en forma de boletines, donde se comuniquen las novedades del laboratorio. También sirven para mejorar las comunicaciones clínicos-laboratorio las invitaciones a clínicos a las sesiones del laboratorio y que éstos participen en las sesiones clínicas del hospital.

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Capítulo 14. Técnicas analíticas

14.1. Clasificación 14.2. Técnicas espectroscópicas. Radiación electromagnética 14.3. Espectroscopia de absorción molecular 14.4. Medida de sustratos por métodos absorción molecular 14.5. Medida de actividades enzimáticas por métodos de absorción molecular 14.6. Espectroscopia atómica 14.7. Espectroscopia de fluorescencia 14.8. Espectroscopia de luminiscencia 14.9. Espectroscopia de dispersión. Turbidimetría y nefelometría 14.10. Espectroscopia de reflectancia 14.11. Técnicas electroquímicas: potenciometría, amperometría, conductometría y biosensores. 14.12. Técnicas inmunoquímicas: aglutinación, inmunoprecipitación, inmunoturbidimetría e inmunonefelometría. 14.13. Inmunoanálisis con reactivos marcados: competitivos, no competitivos, radioinmunoanálisis, enzimoinmunoanálisis, fluoroinmunoanálisis, luminoinmunoanálisis, partículoinmunoanálisis, inmunoanálisis mediados por avidinabiotina, inmunofluorescencia, inmunoanálisis en línea o tira e inmunocromatografía 14.14. Osmometría 14.15. Técnicas para medir la concentración de número: cámaras de recuento, citometría de flujo y citoquímica de flujo 14.16. Técnicas de separación: centrifugación, cromatografía y electroforesis 14.17. Microscopía 14.18. Técnicas de diagnóstico molecular: aislamiento y cuantificación de los ácidos nucleicos, técnicas de separación del ADN, enzimas utilizadas en el diagnóstico molecular, técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa, método del ADN de cadena ramificada, sondas de ácidos nucleicos, marcaje de las sondas da ácidos nucleicos, hibridación de ácidos nucleicos, secuenciación de ADN, diagnóstico de las enfermedades genéticas y micromatrices de ADN 14.19. Técnicas de citogenética: cromosomas, cultivo celular, cariotipo, hibridación fluorescente in situ, anomalías cromosómicas y aplicaciones clínicas de la citogenética 14.20. Técnicas proteómicas: proteómica clínica, preparación de las muestras para los análisis proteómicos, muestras de tejidos, muestras de plasma/suero, muestras de orina, muestras de líquido cefalorraquídeo, métodos de separación de proteínas, electroforesis bidimensional, separaciones multidimensionales, espectrometría de masas, identificación de las proteínas, micromatrices proteínicas, proteómica del plasma sanguíneo, proteómica de la orina, proteómica del líquido cefalorraquídeo

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14.1. CLASIFICACIÓN________________________________________________________________ También denominadas principios de medida, constituyen la base científica en la que se fundamenta la medición. Se clasifican así:

Técnicas de medida: –

–

– –

Técnicas espectrométricas: • Espectrometría de absorción molecular UV-VIS • Espectrometría de emisión y de absorción atómica • Espectrometría de luminiscencia molecular: – Fluorescencia - Fluorimetría – Quimioluminiscencia – Bioluminiscencia • Espectrometría de masas • Espectrometría de dispersión de la radiación: – Turbidimetría – Nefelometría • Espectrometría de reflectancia Técnicas electroquímicas: • Potenciometría • Amperometría • Conductometría • Biosensores Técnicas inmunoquímicas: • Aglutinación • Inmunoprecipitación • Inmunoturbidimetría e inmunonefelometría Inmunoanálisis con reactivos marcados: • Radioinmunoanálisis • Enzimoinmunoanálisis • Fluoroinmunoanálisis • Quimioluminoinmunoanálisis • Particuloinmunoanálisis Medida de la concentración catalítica de enzimas: • Métodos de punto final • Métodos cinéticos Osmometría Técnicas para medir la concentración de número: • Técnicas de microscopía óptica: cámaras de recuento • Técnicas conductimétricas: contadores celulares • Técnicas basadas en la medición de la dispersión de una radiación: – Citometría de flujo – Citoquímica de flujo

Técnicas de separación: –

–

Centrifugación: • Diferencial • En gradiente de densidad Cromatografía:

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Según proceso: frontal por elución o por desplazamiento. Según el estado físico de la fase móvil y estacionaria: en fase gaseosa (de gases) o en fase líquida (HPLC). • Según mecanismo de separación: de adsorción, de partición, de intercambio iónico, de exclusión o de afinidad. • Según el tipo de soporte cromatográfico: en columna o planar (en papel o en capa fina). Electroforesis: • En acetato de celulosa • En gel • Electroforesis capilar • Inmunoelectroforesis: inmunofijación, contrainmunoelectroforesis, transferencia western, inmunoelectroforesis cruzada, electroinmuoanálisis. • Isoelectroenfoque • Electroforesis bidimensional • •

–

Microscopía: – –

Técnicas de diagnóstico molecular: – – – – – – – – – – – – – – – – –

Aislamiento y cuantificación de los ácidos nucleicos Técnicas de separación del ADN Enzimas utilizadas en el diagnóstico molecular Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Reacción en cadena de la ligasa Método del ADN de cadena ramificada Sondas de ácidos nucleicos Marcaje de las sondas da ácidos nucleicos Hibridación de ácidos nucleicos Secuenciación de ADN Diagnóstico de las enfermedades genéticas Diagnóstico de enfermedades infecciosas Diagnóstico molecular de las neoplasias hematológicas Enfermedades oncológicas Análisis de identidad Micromatrices de ADN

Técnicas de citogenética: – – – – –

Óptica De fluorescencia

Cultivo celular Cariotipo Hibridación fluorescente in situ Anomalías cromosómicas Aplicaciones c línicas de la citogenética

Técnicas proteómicas.

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14.2. TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS. RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA_______________________________ Las regiones ultravioleta y visible del espectro electromagnético se emplean para el análisis cualitativo y cuantitativo de un gran número de sustancias en los medios biológicos. Las técnicas espectroscópicas utilizan la medida de los efectos que produce la interacción de las radiaciones electromagnéticas con la materia. Así, puede medirse la radiación absorbida, emitida, transmitida, dispersada o reflejada de acuerdo con los diferentes métodos. En este capítulo se describen las principales técnicas espectroscópicas y su aplicación en los laboratorios clínicos para la determinación cuantitativa de muchas sustancias en los medios biológicos, como sustratos, enzimas y metales. Radiación electromagnética La radiación electromagnética está compuesta de campos eléctricos y magnéticos oscilantes que se propagan por el espacio linealmente y con una velocidad constante. Asimismo, las radiaciones electromagnéticas son un conjunto de corpúsculos, los fotones, que llevan asociada una onda. La longitud de onda es la distancia entre los picos de onda y se expresa en nanómetros (nm; 1 nm = 10-9 m). La frecuencia de la onda es proporcional a la energía de la partícula. Se llama espectro electromagnético al conjunto de las radiaciones electromagnéticas, que se haya dividido en varias regiones de acuerdo con la longitud de onda. La relación entre la energía de la radiación y su frecuencia viene dada por la ecuación: E=hv donde E= energía; h = constante de Planck, y v = frecuencia. Por su parte, la frecuencia de la radiación está relacionada con la longitud de onda (λ), de acuerdo con la ecuación: v = c/λ y si se sustituye este valor en la ecuación de la energía se obtiene: E = h x c/λ lo que demuestra que la energía de una radiación electromagnética es inversamente proporcional a la longitud de onda, de forma que las radiaciones electromagnéticas de menor longitud de onda son las de mayor contenido energético.

En la figura se presenta la relación entre la longitud de onda, la energía y las diferentes regiones del espectro electromagnético.

Se denomina espectro electromagnético al conjunto de radiaciones electromagnéticas y se ha dividido en varias regiones, de acuerdo con la longitud de onda (λ) :

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– – – – –

Rayos X (1-100 nm). Ultravioleta (100-390 nm). Visible (390-700 nm). Infrarrojo (700-100 000 nm). Microondas (100 000-1000 000 nm).

La energía de una radiación electromagnética es inversamente proporciona] a la longitud de onda. De forma que las radiaciones electromagnéticas de menor longitud de onda (rayos X) son las de mayor contenido energético. Los análisis que emplean las radiaciones electromagnéticas pueden ser de absorción, emisión, transmisión y reflexión. Las principales radiaciones electromagnéticas que se utilizan en los laboratorios clínicos son las ultravioleta (340 nm) y las visibles (color; 390-700 nm). Las principales técnicas espectroscópicas que se utilizan en los laboratorios clínicos son la espectroscopia de absorción molecular para la determinación de sustratos y enzimas, la espectroscopia atómica para la medida de la concentración de metales, la espectroscopia de fluorescencia y la espectroscopia de luminiscencia para la medida de diversos compuestos químicos y actividades enzimáticas, y la espectroscopia de dispersión para determinar fundamentalmente proteínas específicas. En los apartados siguientes se detallan cada una de estas técnicas.

14.3. ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN MOLECULAR_________________________________________________ Las regiones del espectro electromagnético más utilizadas en el trabajo analítico de rutina en los laboratorios clínicos son la ultravioleta y la visible. El término luz se aplica a la región radiante con longitudes de onda visibles para el ojo humano y las longitudes de onda que la rodean. La absorción de luz por las moléculas biológicas depende de la estructura electrónica de los átomos de carbono que las componen. LEY DE LAMBERT-BEER La ley de Lambert-Beer establece que para disoluciones diluidas la cantidad de luz absorbida es directamente proporcional a la concentración de la sustancia. Puede escribirse: A = acl donde A es la absorbancia; a es la constante de proporcionalidad denominada absortividad; I el paso de la luz, y c la concentración del compuesto que absorbe. Cuando la concentración se expresa en mol/L, a se escribe con el símbolo €, sus unidades son L/mol x cm y se llama coeficiente de absorción molar. La ley de Lambert-Beer queda entonces así: A=€cl ESPECTROFOTOMETROS Los espectrofotómetros son los instrumentos que se utilizan para medir la absorción de luz por las disoluciones. Los principales componentes de un espectrofotómetro de un. solo haz son la fuente de luz, el sistema de selección de la longitud de onda, la cubeta para el espécimen, el detector de luz y el dispositivo de lectura.

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Los espectrofotómetros de doble haz dividen el rayo luminoso en dos haces, uno que pasa por la cubeta de referencia (blanco) y otro que pasa por la del espécimen. La señal que incide sobre el detector es la diferencia (espécimen-referencia). El rayo luminoso se divide por medio de un espejo giratorio que hace incidir el mismo haz, alternativamente, por la cubeta con la referencia y por la cubeta con el espécimen.

Acontinuación se describen las principales características de los elementos de los espectrofotómetros. Fuente de luz Las lámparas incandescentes y los láseres son los tipos de fuentes de luz que se emplean en los espectrofotómetros. La fuente de luz que más se ha utilizado para las medidas en la región visible del espectro (360-950 nm) ha sido la lámpara de wolframio. En la actualidad, se usan lámparas de halógenos que proporcionan energía radiante más intensa y son más duraderas. Para las medidas en la región ultravioleta (220-360 nm), se utilizan las lámparas de descarga de hidrógeno o de deuterio. Algunos de los espectrofotómetros más modernos emplean láseres. Sistema de selección de la longitud de onda La luz de la radiación emitida por las lámparas de los espectrofotómetros cubre el intervalo completo de longitudes de onda que es capaz de producir la lámpara. Sin embargo, la ley de Lambert-Beer se cumple para la luz monocromática. Inicialmente para aislar la longitud de onda adecuada se emplearon filtros. En la actualidad se utilizan monocromadores; los principales son los prismas y las rejillas de difracción. En los prismas y las rejillas, la radiación procedente de la lámpara se dispersa en un espectro, a partir del cual se aisla la longitud de onda deseada por medio de una rendija. Los prismas separan por refracción la radiación emitida por las fuentes de luz en un espectro continuo. La refracción tiene lugar debido a que la radiación de diferentes longitudes de onda viaja por diferentes rutas en el medio más denso del material del prisma. En cuanto a las rejillas de difracción, consisten en una placa metálica con un gran número de surcos equidistantes; las mejores rejillas de difracción contienen entre 1.000 y 2.000 surcos por milímetro. Cuando se ilumina la rejilla, cada surco da lugar a un pequeño espectro. Se forman, así, frentes de ondas que refuerzan las longitudes de onda en fase y eliminan las que no están en fase. El resultado neto es un espectro continuo lineal uniforme. Como se ha señalado antes, tanto en el caso de los prismas como en el de las rejillas de difracción, la selección de la longitud de onda deseada se hace con un colimador o rendija ajustable. Los sistemas de selección de longitud de onda se catalogan por su amplitud de banda o paso de banda, que es la anchura en nanómetros de la curva de transmitancia en el punto medio del pico . Los prismas permiten aislar una

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radiación de amplitud de banda de 0,5 a 1,5 nm. Las rejillas de difracción permiten aislar una energía radiante cuya amplitud de banda está, en el caso de las peores, entre 20 y 35 nm, y es en el de las mejores de 0,5 nm o menos. Generalmente, las buenas rejillas seleccionan mejor que los prismas la longitud de onda. Cubeta La cubeta es el recipiente donde se coloca la disolución para medir la absorbancia. Puede ser cuadrada, redonda o rectangular; se construye de vidrio, plástico o cuarzo, y suele tener un paso de 1 cm. Las cubetas de vidrio son útiles para las medidas entre 340 y 1.000 nm, y las cubetas de plástico, para las que están entre 310 y 1.000 nm. Para lecturas por debajo de 310 nm se precisan cubetas de cuarzo, ya que, por debajo de esa longitud de onda, el vidrio y el plástico absorben. Detector de luz El detector de luz de los espectrofotómetros convierte la que le llega en energía eléctrica. Los detectores más utilizados para medir la intensidad de la luz en las regiones ultravioleta y visible son los tubos fotomultiplicadores y los dispositivos de estado sólido. Los tubos fotomultiplicadores son tubos electrónicos que, además de detectar la señal luminosa, la amplifican. Estos sistemas se construyen, usando como cátodos metales sensibles a la luz, capaces de emitir electrones en proporción directa a la energía luminosa que les llegue. Los electrones producidos son dirigidos a una segunda superficie del mismo metal que produce más electrones, estos a otra y así sucesivamente. Cada electrón que llega al cátodo produce cascadas en el tubo fotomultiplicador. De esto resulta una corriente de electrones que puede ser hasta un millón de veces superior a la inicial. Los tubos fotomultiplicadores tienen de 10 a 15 superficies de amplificación o dinodos. Los principales dispositivos de estado sólido son los fotodiodos y los detectores de carga acoplada. Los fotodiodos están fabricados con materiales semiconductores fotosensibles como silicio, galio o arsénico. Estos materiales absorben luz con un intervalo de longitudes de onda característico. Se denomina matriz de fotodiodos (photodiode array) a un conjunto bidimensional de diodos, donde cada uno de ellos responde a una longitud de onda específica. Los detectores de carga acoplada están construidos con silicio y transforman de manera espontánea la luz recibida en una corriente eléctrica. Dispositivo de lectura La energía eléctrica procedente del detector se presenta mediante diversos dispositivos de lectura. En la actualidad, la mayoría de los espectrofotómetros son controlados por ordenador, con programas que permiten procesar las señales, realizar curvas de calibrado, almacenarlas y transformar los datos. INTERFERENCIAS EN LAS DETERMINACIONES ESPECTROSCÓPICAS Las interferencias en las medidas espectroscópicas son de dos tipos: estáticas y cinéticas. Las interferencias estáticas las producen sustancias presentes en el espécimen que no experimentan variación durante la reacción analítica. Los ejemplos más típicos de estas interferencias en los laboratorios clínicos son la ictericia, la lipemia y la hemólisis. Su corrección se realiza usando un blanco con el espécimen al que no se añade ninguna de las sustancias necesarias para la reacción. Otra forma de corregirlas utiliza la lectura a varias longitudes de onda. Las interferencias cinéticas se deben a sustancias presentes en el espécimen que reaccionan con algún componente de la mezcla de reacción. La importancia relativa de la contribución de esas sustancias depende del tiempo de reacción y de la concentración de las mismas. Cuando la sustancia reacciona más rápido que la que se analiza, su presencia puede corregirse con un análisis cinético; y si lo que interfiere reacciona a la misma velocidad que lo que se analiza, la corrección se hace realizando la determinación con la sustancia que hay que analizar y sin ella, y es una sustracción simple. LECTURAS A VARIAS LONGITUDES DE ONDA Como se ha señalado en el apartado anterior, las interferencias estáticas que se producen en algunas determinaciones pueden eliminarse leyendo a dos o más longitudes de onda. Cuando se emplean dos, se escoge la que más absorba la sustancia que se mide y otra que corresponda a un mínimo de absorbancia.

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14.4. MEDIDA DE SUSTRATOS POR MÉTODOS DE ABSORCIÓN MOLECULAR_____________________________ Como se ha señalado antes, la absorbancia de una disolución está relacionada con la concentración de las sustancias de acuerdo con la ley de Lambert-Beer: A = acl Para determinar la concentración de un compuesto en disolución se mide su absorbancia; si el compuesto absorbe, se transforma en otro que absorba por medio de su reacción con los reactivos adecuados o se hace que forme parte de una reacción en la que otra sustancia experimente un cambio de sus propiedades de absorción de luz. A veces es necesario ligar varias reacciones para obtener un compuesto que absorba. La reacción en la que se transforma la sustancia que quiere medirse se denomina reacción auxiliar, mientras que la reacción utilizada para la medida se denomina reacción indicadora. Ambas reacciones pueden ser simples reacciones químicas o reacciones catalizadas por enzimas. La medida de la concentración de sustancias en disolución por técnicas espectroscópicas de absorción molecular se realiza con dos tipos fundamentales de métodos: los de punto final y los de medida de la velocidad de reacción. MÉTODOS DE PUNTO FINAL En los métodos de punto final, se incuba la disolución reaccionante con el espécimen y con el patrón de concentración conocida, el tiempo necesario para que se complete la reacción o se alcance el equilibrio. El nombre de punto final no debe conducir a equívoco; es más correcto el de método de equilibrio, ya que muchas veces la reacción se produce de forma que puede hacerse la medida antes de alcanzar el punto final. Cuando se usan enzimas como reactivos para medir sustancias en los métodos de punto final, el sistema debe contener todos los componentes necesarios en exceso. La cantidad de enzimas que se añada debe ser suficiente para que la reacción se complete en un tiempo corto. Si el equilibrio de la reacción no fuera favorable, habría que utilizar unas condiciones que lo invirtiese o añadir a la mezcla de reacción otros reactivos o sistemas enzimáticos que fuercen la reacción en la dirección deseada. La concentración del espécimen en estos métodos viene dada por el producto del cociente entre las absorbancias del espécimen y del patrón por la concentración de este de acuerdo con la fórmula: Ce = K (Ae - Ab) donde K - cpat/Apat – Ab, o sea el factor de calibración; ce = concentración del espécimen; cpat = concentración del patrón; Ab = absorbancia del blanco de reactivos; Apat = absorbancia del patrón; Ae = absorbancia del espécimen. En los métodos de punto final, en lugar de utilizar un único estándar de concentración conocida puede obtenerse una curva patrón con varios estándares y luego extrapolar en esta los valores de absorbancia de las muestras problemas. Hay que tener en cuenta que nunca debe extrapolarse más allá de la región que se haya calibrado. Cuando el valor de la absorbancia supere la del mayor calibrador, se diluirá el espécimen y se medirá de nuevo. Es importante señalar que cuando se representan las curvas de calibración, a pesar de que la ley de Lambert-Beer implique que la absorbancia de la concentración cero es cero, no debe forzarse que la línea atraviese el cero. Hay que trazar la línea que mejor se ajuste a los puntos, bien visualmente o con métodos de regresión. MÉTODOS CINÉTICOS En los métodos cinéticos o de medida de la velocidad de reacción, se determina la variación de la absorbancia con el tiempo, que se relaciona con la concentración. Cuando se empleen métodos que utilicen enzimas hay que tener en cuenta que se requieren enzimas con constante de Michaelís (Km) elevadas. En los casos en los que la Km sea demasiado baja, su valor aparente puede aumentarse añadiendo un inhibidor competitivo. Las reacciones enzimáticas son muy sensibles a las condiciones de la reacción, como el pH y la temperatura, por lo que los métodos cinéticos para determinar la concentración de sustancias deben mantener las condiciones constantes. Esto se consigue con facilidad en los analizadores automáticos, que son sistemas muy adecuados para los análisis cinéticos. Los métodos cinéticos son mucho más rápidos y menos sensibles a las interferencias externas, como la turbidez y el color del espécimen, que los métodos de punto final.

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14.5. MEDIDA DE ACTIVIDADES ENZIMATICAS POR MÉTODOS DE ABSORCIÓN MOLECULAR_____________ Las enzimas pueden determinarse en los medios biológicos mediante métodos espectroscópicos de absorción molecular. La cantidad de una enzima en un medio biológico puede determinarse en términos de masa o en términos de actividad. En general, la cantidad de las enzimas en los líquidos biológicos es muy pequeña. Con fines comparativos, se aprovecha su propiedad esencial de catalizar reacciones químicas para medir la actividad y relacionarla con la cantidad. La medida de la cantidad de sustrato que desaparece o del producto que se forma durante un intervalo de tiempo proporciona una medición de la actividad de la enzima que cataliza la transformación. De este modo, la actividad catalítica puede utilizarse con fines comparativos como una medida de la concentración de la enzima. La medición de la actividad de una enzima siempre implica medidas de la velocidad de reacción. Las reacciones enzimáticas son muy sensibles a las condiciones de la reacción, por lo que las medidas de las actividades enzimáticas deben realizarse en condiciones bien definidas, para que los resultados puedan ser comparativos. Estas condiciones han de optimizarse en lo que se refiere al tipo de amortiguador y de concentración, el pH, los cofactores, los activadores, la(s) concentración(es) de sustrato(s) y la fracción volumétrica del espécimen en la mezcla de análisis. La medida de la actividad enzimática puede realizarse mediante dos tipos de métodos fundamentales: los de tiempo fijo y los de velocidad de reacción. MÉTODOS DE TIEMPO FIJO O FINAL En estos métodos se incuba la muestra que contiene la enzima con el sustrato durante un tiempo determinado y se mide la variación de la absorbancia. La cantidad de sustrato desaparecido o de producto formado es proporcional a la actividad enzimática. MÉTODOS DE SEGUIMIENTO CONTINUOS O CINÉTICOS Se mide la variación de la absorbancia continuamente. Estos métodos son mejores que los de tiempo fijo, ya que puede comprobarse mejor la linealidad de la reacción. La causa más habitual de desviación de la linealidad se produce cuando la cantidad de enzima es tan elevada que el sustrato se agota pronto tras comenzar la reacción. Se produce un descenso brusco de la velocidad de reacción. ACOPLAMIENTO DE REACCIONES Cuando ninguno de los sustratos o productos dé lugar a un cambio de absorbancia que pueda medirse, es posible ligar la reacción catalizada por la enzima a otra u otras que den lugar a un producto que absorba. Como en el caso de los sustratos, esta reacción recibe el nombre de auxiliar. UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La actividad de las enzimas se expresa en unidades presentes en un volumen determinado. En enzimología clínica, la actividad enzimática suele darse en términos de una unidad de volumen adecuada como dL o L. Inicialmente, la Unión Internacional de Bioquímica (UIB) propuso la Unidad Internacional (U) que es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol de sustrato por minuto (μmol/min). La concentración catalítica en los líquidos biológicos se expresa habitualmente en U/L. Posteriormente, la UIB ha recomendado que la actividad enzimática se exprese en moles por segundo (mol/s), que es unidad derivada del SI. Esta unidad ha recibido el nombre de katal y la concentración enzimática se expresa en términos de katales por litro (kat/L). Las dos unidades de concentración enzimática pueden interconvertirse de forma que 1 nkat/L = 0,06 U/L. En la actualidad, la mayoría de los laboratorios clínicos siguen empleando la Unidad Internacional (U) en lugar del katal.

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14.6. ESPECTROSCOPIA ATÓMICA________________________________________________________________ En contraste con las moléculas que producen espectros de bandas, los átomos producen espectros de líneas definidos con claridad. En general, y a diferencia de la espectroscopia molecular, las concentraciones de átomos no se miden directamente en la disolución, sino que hay que volatilizarlos, lo cual puede hacerse con una llama o electrotérmicamente en un horno. En este estado, los elementos emiten o absorben fácilmente radiación monocromática a la longitud de onda adecuada. La luz emitida o absorbida es proporcional al número de átomos. La emisión de luz se mide por espectroscopia de emisión atómica, y la absorción de luz, por espectroscopia de absorción atómica. ESPECTROSCOPIA DE EMISIÓN ATÓMICA La espectroscopia de emisión atómica mide la luz emitida por los átomos cuando reciben energía calorífica. Hay dos tipos de técnicas de espectroscopia de emisión atómica: la emisión por llama y la emisión por plasma. Espectroscopia de emisión atómica por llama La espectroscopia de emisión atómica por llama se denomina también fotometría de llama. Se basa en la emisión de luz característica por los átomos de muchos elementos metálicos cuando se les suministra energía con una llama. El sodio produce luz amarilla (589 nm); el calcio rojo amarillenta (622 nm); el litio roja (760 nm); y el potasio violeta (766 nm). En condiciones controladas, la intensidad de la luz de la longitud de onda característica producida por cada uno de los átomos es directamente proporcional al número de átomos de la muestra. Esta técnica se ha utilizado en los laboratorios clínicos durante mucho tiempo para la medida de sodio y potasio en los líquidos biológicos, pero en la actualidad ya no se emplea. Espectroscopia de emisión atómica por plasma Un plasma consta de un gas caliente, parcialmente ionizado, con una concentración abundante de cationes y electrones que lo hacen conductor. Los plasmas que se emplean en la emisión atómica se forman por la ionización de una corriente de argón, que produce iones de argón y electrones. Las altas temperaturas del plasma se deben al calentamiento resistivo que tiene lugar por obra del movimiento de los electrones y de los iones de argón. Como los plasmas operan a temperaturas mucho mayores que las llamas., proporcionan una atomización mejor y estados de excitación más intensamente poblados. Además de los átomos neutros, las temperaturas elevadas del plasma producen también iones de la sustancia. La espectroscopia de emisión atómica por plasma es muy adecuada para el análisis multielemental, ya que todos los átomos de un espécimen se excitan a la vez. Puede programarse un monocromador de barrido para que se mueva rápidamente a la longitud de onda de un átomo, se detenga y registre la intensidad de su emisión, luego vaya a la longitud de onda de otro y así sucesivamente. De esta forma, pueden analizarse tres o cuatro elementos por minuto. Otra posibilidad es utilizar un aparato con varios canales que permita medir simultáneamente muchos elementos.

ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA Principios generales La espectroscopia de absorción atómica mide la luz de una determinada longitud de onda absorbida por los átomos de un elemento. En su estado fundamental, los átomos en forma de vapor absorben luz de longitudes de onda muy estrechas y pasan entonces a estados de excitación. El elemento que quiere medirse se vaporiza por medio de una llama o un método electrotérmico (horno de grafito). La fuente de energía radiante son las lámparas de cátodo hueco, construidas con el mismo elemento que quiere medirse. Cuando se excitan los átomos de la lámpara producen un vapor que emite un rayo de luz monocromática de la misma longitud de onda que la que absorben los átomos de ese elemento. Cuando la luz procedente de la lámpara de cátodo hueco

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atraviesa la llama, parte de aquella es absorbida por los átomos vaporizados en su estado fundamental, lo que ocasiona un descenso de la intensidad del rayo de la lámpara. Componentes de un espectrómetro de absorción atómica Los componentes de un espectrómetro de absorción atómica son; lámpara de cátodo hueco, nebulizador, monocromador y detector.

La lámpara de cátodo hueco está construida con el metal del elemento que quiere medirse y es distinta para el análisis de cada metal. Las lámparas de cátodo hueco tienen dos propiedades fundamentales: una anchura de línea estrecha y una intensidad elevada a la longitud de onda correcta. Los espectrómetros de absorción atómica llevan también una lámpara suplementaria para corregir las interferencias de fondo. A diferencia de la espectroscopia de emisión atómica, la de absorción es un método para determinar un solo elemento. A lo sumo, los aparatos están diseñados para determinar unos pocos elementos sin cambiar las fuentes. Los quemadores electrotérmicos se emplean en la llamada absorción atómica sin llama. El más utilizado es el horno de grafito, que consiste en una cavidad de este mineral con dos electrodos que proporcionan la corriente eléctrica para el calentamiento. Por el interior de la cámara circula agua para enfriarla rápidamente después de la atomización. El espécimen se coloca en la cámara e, inicialmente, se produce un calentamiento de unos 1.500 °C para eliminar el disolvente y destruir la matriz (calcinación). Posteriormente, se eleva la temperatura hasta alcanzar unos 3.000 °C para producir la atomización. Elección del método de atomización La elección del método para atomizar está determinada, principalmente, por la concentración del elemento en el espécimen que se analice. Dada la mayor sensibilidad de la atomización electrotérmica, para la mayoría de los elementos sus límites de detección son significativamente menores. La mayor precisión del primer tipo de atomización la hace la más adecuada cuando la concentración del elemento es significativamente mayor que el límite de detección de la técnica para ese elemento. Además, la atomización con llama tiene menos interferencias y es más fácil de aplicar. En cambio, la atomización electrotérmica es más adecuada para los elementos cuya concentración esté por debajo del límite de detección de la atomización con llama. También es útil cuando el volumen del espécimen es limitado. La atomización por llama y la electrotérmica requieren que el espécimen esté en forma líquida o en disolución. Los especímenes sólidos (tejidos, pelos, uñas, etc.) deben prepararse disolviéndolos en los disolventes adecuados. Cuando el espécimen no sea soluble deberá digerirse utilizando HNO3, H2SO4 o HClO4. Los especímenes líquidos pueden analizarse directamente o bien diluirse o extraerse si la matriz es incompatible con el método de atomización. Para el suero se utiliza la extracción con un disolvente orgánico que contenga un agente quelante para concentrar el espécimen. Corrección de Zeeman Una forma de corrección de fondo en la espectroscopia de absorción atómica sin llama es la denominada de Zeeman. En ella, se aplica un campo magnético intenso que desdobla los niveles de energía atómica en dos componentes polarizados de forma paralela y perpendicular a dicho campo. El componente paralelo está en la

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línea de resonancia de la fuente, mientras que los dos componentes perpendiculares están desviados a diferentes longitudes de onda. Ambos componentes interaccionan de forma diferente con la luz polarizada. Se pone un polarizador entre la fuente y el atomizador y se hacen dos medidas de absorción a distintos ajustes del polarizador. Con un ajuste se mide las absorciones del elemento y de fondo, mientras que con otro sólo se mide la absorción de fondo. La diferencia entre las dos medidas de la absorción es la absorbancia corregida. La ventaja principal del método de corrección de Zeeman es que se emplea la misma fuente luminosa para medir la absorción total y la de fondo. Su desventaja principal es que el sistema es caro. Interferencias Las principales interferencias en las medidas de absorción atómica son tres: químicas, de ionización y de matriz. Las primeras las producen las sustancias que impiden que la llama disocie los átomos, por lo que estos no están libres y no se produce absorción. Las interferencias de ionización se originan cuando los átomos de la llama, además de disociarse, se excitan y emiten energía de la misma longitud de onda que se mide. Finalmente, las de matriz se refieren a los aumentos de la absorción de radiación que producen los disolventes orgánicos, a la formación de sólidos al evaporarse el disolvente en la llama y la formación de óxidos de metales. Aplicaciones La espectroscopia de absorción atómica se emplea para medir la concentración de metales en los líquidos biológicos. Los principales metales que se miden son: aluminio, arsénico, bario, cadmio, calcio, cobre, cromo, hierro, litio, magnesio, manganeso, mercurio, níquel, plata, platino, plomo, selenio y cinc. La puesta a punto de un método cuantitativo de absorción atómica requiere algunas consideraciones, entre ellas, elegir los métodos de atomización y de estándar, seleccionar la longitud de onda y la amplitud de la rendija, y preparar el espécimen para el análisis. La absorción atómica sigue la ley de Lambert-Beer, por lo que cabe esperar curvas de calibración lineales. Sin embargo, en la práctica, la mayoría de las curvas no son lineales o sólo lo son en un intervalo limitado de concentraciones. Cuando se pueda, deberán realizarse los análisis cuantitativos utilizando estándares externos. No obstante, como a menudo se producen interferencias de la matriz, sobre todo con la atomización electrotérmica, se suele emplear el método de adiciones de estándar. Varios metales son tóxicos cuando el ser humano se expone a grandes concentraciones de ellos. Entre estos metales están el aluminio, el arsénico, el cadmio, el cromo, el cobalto, el cobre, el hierro, el manganeso, el mercurio, el níquel, la plata, el platino, el plomo, el selenio, el silicio y el talio. Algunos de ellos son oligoelementos, pero en grandes cantidades producen toxicidad. Las principales técnicas para medir los metales tóxicos son la espectroscopia de absorción atómica (de llama o de atomización electrotérmica), la espectroscopia de emisión de plasma acoplado por inducción y la espectrometría de masas con plasma acoplado por inducción

14. 7. ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA__________________________________________________________ La absorción por algunas moléculas de luz ultravioleta o visible hace que un electrón de valencia pase de su estado basal a otro excitado. La emisión de luz al volver el electrón del estado excitado al basal se denomina fluorescencia. La energía de la luz emitida es menor que la de la absorbida y, por tanto, su longitud de onda, mayor. La diferencia entre estas dos longitudes de onda se denomina desviación de Stokes y, de forma general, los mejores resultados de las medidas de fluorescencia se obtienen con compuestos que tengan grandes diferencias entre la longitud de onda de excitación y de emisión. El tiempo que transcurre entre la absorción de la radiación electromagnética y la emisión de la fluorescencia es muy pequeño, de unos 10-8 s. Son muchos los compuestos que presentan el fenómeno de la fluorescencia. La mayoría de ellos son sustancias que tienen enlaces múltiples conjugados con electrones П deslocalizados. La fluorescencia se emite en todas las direcciones, puede cuantificarse y su medición es mucho más sensible que la de la absorción de la radiación.

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FLUORÍMETROS Las medidas de la fluorescencia se realizan con aparatos denominados fluorímetros , que constan de los siguientes componentes: fuente de luz de excitación, filtro o monocromador primario, cubeta para el espécimen, filtro o monocromador secundario, detector de luz y dispositivo de lectura.

La luz que procede de la lámpara de excitación se hace pasar por el filtro o monocromador primario, que selecciona la longitud de onda adecuada que incidirá sobre la cubeta con el espécimen. Parte de la luz se absorbe y, por obra del proceso de fluorescencia, se emite luz de mayor longitud de onda. A su vez, esta luz se hace pasar por el filtro o monocromador secundario, colocado perpendicularmente al primero para evitar que interfiera la luz de excitación. Finalmente, la luz llega al detector, donde se transforma en energía eléctrica. El retardo entre la absorción de la radiación electromagnética y la emisión de la fluorescencia se emplea en unos fluorímetros llamados de resolución de tiempo, que eliminan las interferencias y son, por tanto, más sensibles. Generalmente, la fuente de energía radiante de los fluorímetros (lámpara de excitación) es una lámpara de descarga de mercurio o de xenón, capaz de producir la suficiente energía para excitar los compuestos fluorescentes. Proporciona un espectro de energía radiante muy intenso (entre 250 y 800 nm). Los filtros o monocromadores utilizados para seleccionar las longitudes de onda primaria y secundaria son análogos a los de los espectrofotómetros. En cuanto a las cubetas, pueden tener forma cilíndrica o rectangular, caso este último en que las cuatro caras serán translúcidas. Los detectores son similares a los de los espectrofotómetros. APLICACIONES La espectroscopia de fluorescencia se aplica en los laboratorios clínicos para determinar diversos compuestos químicos y actividades enzimáticas en los medios biológicos.

14.8. ESPECTROSCOPIA DE LUMINISCENCIA_______________________________________________________ La luminiscencia es la emisión de luz fruto de una reacción química. Puede ser quimioluminiscencia, cuando los electrones pasan a un estado excitado como consecuencia de una reacción química y vuelven a su estado basal emitiendo luz, o bioluminiscencia, cuando la emisión de luz surge debido a una reacción catalizada por una enzima.

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La luminometría es la técnica que mide la luminiscencia. Para medirla se requieren aparatos sencillos, llamados lurninómetros, que constan de estos componentes: cámara de mezcla/cubeta, fotomultiplicador, amplificador y lector/registro. La cámara de mezcla/cubeta debe mantenerse a temperatura constante, ya que las reacciones que tienen lugar son muy sensibles a la temperatura, especialmente las catalizadas por enzimas. En los laboratorios clínicos, la luminometría se aplica, principalmente, en los sistemas de detección de los inmunoanálisis con reactivos marcados, por ejemplo, los enzimoinmunoanálisis que utilizan fosfatasa alcalina como enzima marcadora en la detección por quimioluminiscencia.

14.9. ESPECTROSCOPIA DE DISPERSIÓN. TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA_____________________________ DISPERSIÓN DE LA LUZ Cuando un rayo de luz choca con una partícula en suspensión, una parte de la luz se absorbe, otra se refleja y otra se dispersa. La dispersión de la luz por una partícula depende de su tamaño, su índice de refracción respecto al del líquido que la rodea y la longitud de onda de la luz. Cuando la longitud de onda es mucho mayor que el tamaño de la partícula (λ > 10 d), la luz se dispersa de forma simétrica alrededor de esta, de modo que la intensidad de la dispersión es mínima a 90° del rayo incidente. En cambio, cuando la longitud de onda de la luz incidente sea aproximadamente igual al tamaño de la partícula (λ = d), se dispersará más luz hacia delante que hacia atrás. Finalmente, cuando la longitud de onda sea mucho menor que el tamaño de la partícula (λ > 0,1 d), la mayoría de la luz se dispersará hacia delante. TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA La turbidimetría y la nefelometría son dos técnicas relacionadas entre sí que se emplean para medir la luz dispersada por una suspensión de partículas coloidales. En la turbidimetría, el detector se coloca en línea con la fuente de radiación y se mide el descenso de la luz transmitida a través de la disolución particulada a consecuencia de su dispersión por las partículas. La nefelometría, por su parte, mide la luz dispersada a diversos ángulos de la fuente de luz. El principal problema para aplicar estas dos técnicas a los sistemas biológicos es la presencia de moléculas endógenas que dispersan la luz. Además, los reactivos deben estar libres de polvo, ya que las partículas grandes de este dispersan mucho la luz y el fondo o dispersión blanco que resulta limita la sensibilidad de ambas técnicas. Estos problemas se han solucionado diseñando instrumentos muy sensibles y mejorando la calidad de los anticuerpos. INSTRUMENTACIÓN PARA LAS MEDIDAS TURBIDIMETRICAS Y NEFELOMÉTRICAS Medición turbidimétrica Las medidas turbidimétricas pueden realizarse con un espectrofotómetro. En consecuencia, la sensibilidad de la turbidimetría está limitada principalmente por la exactitud y la sensibilidad del aparato, ya que este método mide el descenso de una señal grande de luz. Para medir la turbidez puede utilizarse cualquier longitud de onda; las más empleadas son, para la inmunoprecipitación con concentraciones pequeñas de la sustancia que se mide, la de 340 nm; para las pruebas que emplean partículas, las de 500-700 nm, y para los análisis con grandes concentraciones de la sustancia que se mide, la de 800 nm. En la turbidimetría, la transmitancia medida (T) es el cociente entre la intensidad transmitida de la fuente de radiación (IT) y la intensidad transmitida por un blanco (Io): T = IT/I0

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La relación entre la transmitancia y la concentración de las partículas dispersadoras es semejante a la que da la ley de Beer: -log T = kbc donde c = concentración de las partículas dispersadoras en masa por unidad de volumen; b = longitud de paso; k = constante que depende de varios factores, entre ellos el tamaño y la forma de las partículas dispersadoras y la longitud de onda de la fuente de radiación. La relación exacta se establece con una curva de calibración utilizando varios estándares de concentración conocida. Nefelómetros Los nefelómetros son semejantes a los fluorímetros y se diferencian de ellos, principalmente, en que la longitud de onda de la emisión y la de la detección son la misma. Estos instrumentos están formados por los componentes que siguen: una fuente de luz, un filtro de selección de la longitud de onda de emisión, una cubeta para el espécimen, un filtro de selección de la longitud de onda de detección, un detector y un registro. Los componentes ópticos de los nefelómetros son similares a los de los espectrofotómetros. En algunos nefelómetros los detectores están situados a 90°, y en otros, a ángulos comprendidos entre 10 y 90°. Los aparatos que miden la dispersión de la luz para cuantificar las reacciones antí geno-anticuerpo deben detectar el exceso de antígeno. Las tres fases de la cinética de la formación de complejos inmunitarios por turbidimetría o nefelometría —exceso de anticuerpo, equivalencia y exceso de antígeno— se diferencian lo bastante para que el uso de algoritmos matemáticos con un ordenador permita detectar automáticamente el exceso de antígeno. En la nefelometría, la relación entre la intensidad de la radiación dispersada (Is), y la concentración de las partículas dispersadoras es: Is = ks Io c donde ks ~ constante empírica del sistema; Io = intensidad de la fuente de radiación incidente. El valor de ks se obtiene a partir de una curva de calibración usando diversos estándares de concentración conocida.

ELECCIÓN ENTRE TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA La elección entre estas dos técnicas depende de a qué se apliquen y de la instrumentación de que se disponga. En general, la turbidimetría suele utilizarse para grandes concentraciones de partículas que dispersan la luz y producen grandes descensos de la luz transmitida. En cambio, la nefelometría suele emplearse para pequeñas concentraciones de partículas dispersadoras de luz, que dan poca turbidez. Otro factor fundamental para elegir entre ambas técnicas es el tamaño de las partículas dispersadoras. La nefelometría es más adecuada para partículas pequeñas, mientras que en la turbidimetría el tamaño de las partículas importa menos.

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS ESPECÍFICAS La principal aplicación actual de la turbidimetría y la nefelometría en los laboratorios clínicos es la determinación de proteínas específicas con métodos inmunológicos. El tamaño de la mayoría de las proteínas solubles es de entre 1 y 20 nm, y el de los complejos antígeno-anticuerpo, de entre 50 y 100 nm. Los agregados que se forman tras la reacción antígeno-anticuerpo tienen tamaños de entre 300 y 1.000 nm. Como se ha señalado antes, la cantidad de luz dispersada depende del tamaño, de la cantidad y del índice de refracción de las especies dispersantes, por lo que un aumento de cualquiera de estas magnitudes aumenta la detectabilidad. Para lograr esto, se unen a los antígenos o los anticuerpos partículas de látex con un tamaño de entre 100 y 300 nm, de manera que los agregados que se formen tendrán tamaños mayores. Este tipo de métodos se llaman inmunoanálisis potenciados.

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14.10. ESPECTROSCOPÍA DE REFLECTANCIA_______________________________________________ La luz es una forma de energía radiante que se transmite como una onda electromagnética. De la interacción de la luz con la materia se derivan una serie de fenómenos diferentes: transmisión, absorción, reflexión, refracción, emisión, difusión, polarización y luminiscencia. Cada uno de ellos está regido por unas leyes propias que se han desarrollado, en parte, con la finalidad de utilizar el fenómeno lumínico tanto con un interés cualitativo como cuantitativo. La reflexión es un fenómeno óptico que se produce cuando un haz, o un rayo, de luz que se propaga en un medio material homogéneo e isotrópico, esto es que tiene las mismas propiedades en todas las direcciones, incide sobre la superficie de otro medio que posee propiedades físicas diferentes: una fracción del haz retorna al primer medio en forma de haz reflejado, mientras que otra fracción se transmite al segundo medio en forma de haz refractado. Además, el haz incidente (AO), el reflejado (OA) y el refractado (OB) inciden en un mismo plano, perpendicular a la superficie de separación entre ambos medios, llamado plano de incidencia. El haz incidente y el reflejado forman ángulos iguales (a) con el eje perpendicular (NN´)a la superficie de separación. Estas dos características conforman la ley de la reflexión óptica.

Reflexión óptica Un espejo, la piel, las hojas de los árboles y en definitiva cualquier objeto, son ejemplos de superficies en las que se produce este fenómeno óptico. La luz reflejada por cualquier objeto es la que captan los ojos y la reflexión es además el fenómeno óptico responsable del color de cualquier objeto. Una planta es verde porque refleja luz en las que predominan las longitudes de onda cercanas a la zona verde del espectro, ya que se absorbe la mayor parte de la fracción de luz correspondiente a las longitudes de onda de los otros colores. La reflectancia se define como el cociente entre la energía radiante reflejada especularmente por la superficie de un sistema y la energía radiante incidente. De esta forma, y en base a estas características, se puede establecer una relación entre los colores y las diferencias en el espectro de reflectancia de los objetos. Por lo tanto, la espectrometría de relectancia está basada en la potencia radiante de la radiación reflejada, que es detectada y registrada en función de la longitud de onda y cuantificada en relación con la potencia radiante de la radiación incidente. Para ello existen diferentes instrumentos cuya diferencia principal es su sistema óptico (Sistema óptico de reflexión simple y Sistema óptico de espejo anular elipsoidal.)

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Las aplicaciones bioquímicas de la espectrometría de reflectancia, dentro del campo de la bioquímica clínica, está estrechamente relacionada con las tiras reactivas utilizadas para la medición de diversas magnitudes urinarias. La estructura general de una tira reactiva es muy simple: sobre un soporte plástico, que sirve además de pantalla reflectora, se dispone un pequeño fragmento de una matriz celulósica impregnada con los reactivos en estado seco, al que en su conjunto se denomina zona reactiva. La reacción se inicia cuando se sumerge la tira en la orina. Por una parte, el agua de la orina permite la hidratación de los reactivos y, por otra, se incorpora el componente en estudio. Después de un cierto tiempo de incubación, se ilumina la zona reactiva, que absorbe la radiación correspondiente a la longitud del cromóforo y refleja otra fracción de la radiación cuya potencia radiante, respecto a la incidente, es la que se mide. También existen sistemas de medida que basándose en la espectrometría de reflectancia, permiten medir la concentración de sustancias, de masa o catalítica, de diversos componentes de la sangre, plasma, suero y otros líquidos biológicos.

14.11. TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS____________________________________________________ Las técnicas electroquímicas se basan en procesos de oxidación-reducción o redox, aquellos en los que se producen intercambios de electrones. Entre las técnicas electroquímicas más utilizadas en los laboratorios clínicos se encuentran los métodos potenciométricos, los amperométricos y los conductométricos. POTENCIOMETRÍA. Los métodos potenciométricos se basan en la medida de diferencias de potencial, que dependen de la actividad de los iones de la solución. Los métodos potenciométricos miden la actividad de los iones, que está relacionada con la concentración por un factor, denominado coeficiente de actividad. Los coeficientes de actividad, cuyo valor es en todos los casos menor de 1, dependen de la fuerza iónica de la solución. Las diferencias de potencial se miden por medio de electrodos. Los más utilizados en la actualidad son los electrodos metálicos y los electrodos selectivos a los iones (ISE). El potencial de membrana es aquel que se desarrolla a través de una membrana selectiva para un catión o anión determinado, cuando ésta se interpone entre dos soluciones de diferente actividad molal relativa. Una membrana selectiva para ciertos iones contiene “grupos químicos” que son capaces de enlazar selectivamente al ión para el cual la membrana es selectiva. Así, una membrana de vidrio selectiva de ión se une a la cara de la membrana en la que la actividad es mayor; para mantener la neutralidad, en la otra cara se libera el ión desde la membrana hasta la disolución. El resultado es una distribución asimétrica de carga a través de la membrana que genera un potencial denominado potencial de membrana. Aunque el resultado del proceso es el mismo que se daría si la membrana fuese permeable al ión, lo cierto es que no lo es. El electrodo con membrana selectiva de iones está constituido por tres unidades: el electrodo de referencia interno, la solución interna (contiene una concentración prefijada de del ión a medir) y la membrana. En los laboratorios clínicos la potenciometría se utiliza para la medida del pH, la presión de dióxido de carbono (pCO2) y electrolitos (Na+, K+, Cl-).

AMPEROMETRÍA. Los métodos amperométricos se basan en la medida de la intensidad de la corriente que pasa por una célula electroquímica, cuando se aplica un potencial constante entre los electrodos. En los laboratorios clínicos la amperometría se utiliza para la medida de la presión de oxígeno (pO2) mediante el denominado

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electrodo de Clark. Este consta de una célula electroquímica con un cátodo de platino y un ánodo de Ag/ClAg sumergido en una disolución de cloruro potásico y tampón fosfato. Este conjunto se encuentra separado del espécimen por una membrana de polipropileno, permeable a las moléculas de O2. El cátodo de platino tiene aplicada una corriente eléctrica de polarización que es el potencial del par O2/H2O. A este potencial específico, sólo se reducen las moléculas de O2, lo que crea una corriente de electrones proporcional a la cantidad de moléculas presentes. CONDUCTOMETRÍA. Es la técnica analítica basada en la relación lineal que existe entre la concentración de sustancia de un ión en solución y la conductividad eléctrica de esta solución. Dado que la conductividad eléctrica de las soluciones acuosas depende de la fuerza iónica del medio, la conductometría se utiliza para estimar la pureza del agua. BIOSENSORES Los biosensores son dispositivos que constan de un componente bioquímico o biológico como elemento de reconocimiento molecular, y un transductor que convierte la señal biológica en otra eléctrica que se puede cuantificar. El componente detector de la mayoría de los biosensores está inmovilizado en una membrana o dentro de un gel, de forma que el biocatalizador se mantenga en contacto íntimo con el transductor y pueda reutilizarse. La naturaleza de la interacción entre el sensor biológico y el transductor físico da lugar a los diferentes tipos de biosensores. Los principales transductores que se utilizan en estos son amperométricos, electrodos selectivos a los iones, transistores de efecto de campo, fotomultiplicadores o termistores. Tipos de biosensores Enzimáticos En ios biosensores enzimáticos se acopla una reacción enzimática con un electrodo amperométrico o potenciométrico. - Amperométricos En 1962 se describió un electrodo enzimático para glucosa que acoplaba un electrodo de pO2 con una reacción catalizada por la glucosa oxidasa. Se medía el descenso de la pO2, que es proporcional a la concentración de glucosa. La glucosa oxidasa puede inmovilizarse en la cara externa de la membrana permeable al oxígeno frente al cátodo de diversas formas. La más habitual es integrarla en un gel o unirla de forma covalente a la superficie del electrodo de oxígeno. Se han diseñado biosensores amperométricos para medir la acetilcolina con acetilcolinesterasa, el lactato con lactato oxidasa, el ácido úrico con uricasa y el etanol con alcohol oxidasa. El sustrato difunde hacia la capa enzimática, donde se deshidrogena y se forma peróxido de hidrógeno, que difunde hacia el ánodo y produce una corriente proporcional a la formación de peróxido de hidrógeno. - Potenciométricos Los primeros electrodos enzimáticos potenciométricos se basaban en el electrodo de pH o en los electrodos sensibles a los iones. Un ejemplo es el electrodo de urea, que se fundamenta en la hidrólisis de esta por la ureasa. La reacción enzimática produce amoníaco, que se hidroliza para dar NH4+, detectado luego por el electrodo. Los electrodos potenciométricos sensibles a los gases que incorporan enzimas se han diseñado para medir el amoníaco y el dióxido de carbono. Estos sensores se emplean con desaminasas y descarboxílasas, que producen sendos gases que pasan a través de la membrana permeable al gas del electrodo sensible a los gases. Inmunológicos Los biosensores inmunológicos o inmunosensores son dispositivos analíticos que detectan la unión de un antígeno a su anticuerpo específico, acoplando la reacción inmunoquímica a la superficie de un dispositivo

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transductor. Según el transductor que se utilice, los inmunosensores pueden ser de tres clases: ópticos, piezoeléctricos y electroquímicos. Además, de acuerdo con el formato de inmunoanálisis que se use, pueden ser directos, en los que la reacción inmunoquímica se determina directamente midiendo los cambios físicos que induce la formación del complejo, o indirectos, en los que se combina un marcaje detectable con el anticuerpo o el antígeno de interés.

14.12. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS___________________________________________________ Los inmunoanálisis son técnicas que utilizan las reacciones antígeno-anticuerpo para el análisis cualitativo y cuantitativo de un gran número de sustancias. En un inmunoanálisis típico se utiliza un anticuerpo como reactivo para detectar o cuantificar la sustancia de interés, el antígeno. Las técnicas de inmunoanálisis pueden realizarse con reactivos sin marcar y con reactivos marcados. Las principales técnicas con reactivos sin marcar son: – la aglutinación – la inmunoprecipitación – la inmunoturbidimetría – la inmunonefelometría TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN Cuando el antígeno está unido de forma natural a un corpúsculo, como las bacterias o las células sanguíneas, la reacción antígeno-anticuerpo produce directamente aglutinación. Con los antígenos solubles la aglutinación se consigue uniendo de forma covalente el antígeno a corpúsculos inertes. Las reacciones de aglutinación tienen lugar en dos fases. En la primera se produce la unión reversible entre el antígeno y el anticuerpo y, en la segunda, la aglutinación. El título de una prueba de aglutinación es la máxima dilución del suero que produce la reacción, de tal forma que cuanto más elevado es el título, mayor es la concentración de la sustancia que se determina en el suero. Los principales factores que influyen sobre las reacciones de aglutinación son la carga de las partículas, la concentración de electrolitos y la viscosidad, el tipo de anticuerpo, el número de determinantes antigénicos y la temperatura. Entre las técnicas que utilizan las reacciones de aglutinación empleadas en los laboratorios clínicos, se encuentran las técnicas de: – aglutinación directa – aglutinación indirecta – pruebas de antiglobulina – inhibición de la aglutinación – pruebas de fijación del complemento. — Reacciones de aglutinación directa Las reacciones de aglutinación directa son aquellas en las que el antígeno se encuentra sobre la superficie de corpúsculos naturales, como los microorganismos y los eritrocitos. Este tipo de pruebas se utilizan para la detección de anticuerpos en suero contra los antígenos de las membranas de las células (microorganismos o eritrocitos), y pueden realizarse en tubo o en placa; en las pruebas en placa se mezcla una suspensión de las células, se hace oscilar la placa durante unos minutos y se observa la aparición de aglutinación. Las pruebas de aglutinación directa se han empleado para el diagnóstico de infecciones bacterianas. Se detectan anticuerpos frente a Brucella, Salmonella (fiebre tifoidea) y Proteus. Los anticuerpos bacterianos

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pueden generar diferentes formas de aglutinación. Los anticuerpos frente a los antígenos del cuerpo bacteriano forman un entrecruzamiento de los microorganismos, resultando un precipitado granular compacto que se desarrolla lentamente, mientras que los anticuerpos frente a los flagelos producen un entrecruzamiento con ellos, que origina un aglutinado ligero y rápido. Las reacciones de aglutinación directa se emplean también en los bancos de sangre para la determinación de los grupos sanguíneos. Existen diversos métodos para detectar los anticuerpos que aglutinan los eritrocitos. Como antígeno se utilizan suspensiones sanguíneas al 2-4 % en suero salino o en su propio suero. En la prueba en placa se coloca una gota del suero junto con una gota de la suspensión celular. Se mezclan con una varilla y se rota la placa, observándose la presencia de aglutinación. En algunas pruebas, como el tipaje Rh, se utiliza sangre total y se realiza la reacción en placas calentadas a 40-50 °C sobre una caja iluminada. — Reacciones de aglutinación indirecta Las pruebas de aglutinación indirecta utilizan células tratadas o partículas inertes recubiertas de antígeno, que actúan como portadores pasivos, como los eritrocitos humanos, los de oveja o los de pavo, y las partículas inertes de látex o bentonita. Los antígenos se adsorben o acoplan de forma covalente a la superficie. Los polisacáridos y algunos antígenos proteicos, como la albúmina y los derivados de proteína purificada (PPD), se adsorben con facilidad sobre la superficie de las partículas, mientras que otros antígenos requieren el tratamiento previo de las partículas para poder adsorberse. El tratamiento de las células se hace incubándolas con ácido tánico o cloruro crómico, que modifican la superficie celular. Las pruebas de aglutinación indirecta se realizan generalmente en placa, de forma semejante a las pruebas de aglutinación directa descritas en el apartado anterior. La aglutinación indirecta se ha utilizado en los laboratorios clínicos para determinar el factor reumatoide (FR) y el VDRL, para el diagnóstico de la sífilis. — Pruebas de antiglobulina Las pruebas de antiglobulina son reacciones de aglutinación que permiten detectar anticuerpos incompletos de la clase IgG, incapaces de producir aglutinación, ni aun después de unirse a superficies particuladas. En las pruebas de antiglobulina, la aglutinación se consigue con la adición de un suero antiinmunoglobulina (reactivo de Coombs), que produce la formación de puentes entre las partículas que llevan el antígeno y el anticuerpo. Existen diversos tipos de reactivo de Coombs, que se obtienen inyectando suero humano o alguna de sus fracciones purificadas a animales. La inyección del suero humano completo produce un suero de Coombs, denominado de amplio espectro, mientras que la inyección de fracciones purificadas produce sueros de Coombs de especificidad limitada (anti-IgG, antiIgM, anti-IgA, anti-C3, anti-C3b y otros). Las pruebas de antiglobulina o pruebas de Coombs pueden ser directas o indirectas. Las directas detectan anticuerpos incompletos fijados a los eritrocitos, y las indirectas detectan anticuerpos presentes en el suero. Se utilizan en los bancos de sangre para comprobar la presencia de anticuerpo, tanto en los eritrocitos como en el suero. La prueba de Rose-Waaler para detectar la presencia de factor reumatoide es una prueba de antiglobulina, que utiliza eritrocitos de carnero sensibilizados con una dosis subaglutínante de IgG de conejo antieritrocitos de carnero. El factor reumatoide IgM se combina con la IgG fijada y produce aglutinación. — Pruebas de fijación del complemento Cada reacción de fijación del complemento requiere, además del suero portador de los anticuerpos, el antígeno, el complemento y un sistema indicador denominado lítíco. En estas pruebas, los anticuerpos y los antígenos son siempre específicos, mientras que el complemento y el sistema lítico son inespecíficos.

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Las pruebas de fijación del complemento se realizan en dos fases. En la primera fase se incuba el anticuerpo, el antígeno y una cantidad conocida de complemento. En la segunda fase, se determina la actividad del complemento residual de esta solución. El sistema indicador es una suspensión de eritrocitos de carnero que se han recubierto de hemolisina. Se adicionan los eritrocitos de carnero y el suero antieritrocitos de carnero. Cuando queda complemento libre activo, la adiccíón de los eritrocitos de carnero y del suero antieritrocitos de carnero produce hemólisis, lo que indica que no ha habido fijación del complemento y, por tanto, reacción antígeno-anticuerpo. El grado de hemolisis de las células indicadoras es inversamente proporcional a la cantidad de complemento fijado en la primera reacción. La primera reacción puede adaptarse para medir tanto antígenos como anticuerpos. Para detectar la concentración de antígeno se utiliza un volumen constante de anticuerpo y, para determinar la concentración de anticuerpo se usa una cantidad constante de antigeno. Las pruebas de fijación del complemento para determinar anticuerpos emplean, con frecuencia, antígenos que se han fijado a la superficie de eritrocitos. Se incuba el antigeno unido a los eritrocitos con el suero problema, se añade a continuación una cantidad conocida de complemento y se mide el grado de hemolisis. El complemento residual de la mezcla lisa las células indicadoras tratadas con hemolisina. La diferencia de actividad del complemento entre las dos reacciones, es inversamente proporcional a la concentración del anticuerpo presente en la mezcla original.

REACCIONES DE INMUNOPRECIPITACIÓN La reacción de precipitación antígeno-anticuerpo puede realizarse en medio líquido o en medio sólido, como un gel de agarosa, que impide la mezcla convectiva del antígeno y el anticuerpo, y asegura el establecimiento de gradientes de concentración entre los dos reactivos. Diversas técnicas de inmunoanálisis utilizan la precipitación para caracterizar y cuantificar antígenos y anticuerpos. La inmunodifusión simple, la doble inmunodifusión, la inmunodifusión radial, la inmunoelectroforesis, la inmunoelectroforesis bidimensional, la inmunoelectroforesis en contracorriente, la inmunofijación y la inmunotransferencia, utilizan la precipitación en geles. La inmunonefelometría y la inmunoturbidimetría emplean la precipitación en medio líquido. — Inmunodifusión simple En la inmunodifusión simple se hace que un antígeno en solución difunda dentro de un gel que contiene el anticuerpo. Para ello, se incorpora el anticuerpo a un gel de agar en un tubo, se añade encima la solución que contiene el antígeno y se incuba a temperatura ambiente, durante un tiempo, para que se produzca la difusión. Alcanzado el equilibrio, aparecen zonas de precipitación en el punto de equivalencia antígeno-anticuerpo. La distancia de la línea de precipitación, desde el punto de aplicación, es directamente proporcional a la concentración del antigeno, cuando se usa una cantidad determinada de anticuerpo en el agar. Se sustituyó por la inmunodifusión radial y en la actualidad, no se emplea. — Inmunodifusión doble Para realizar la prueba se colocan el antígeno y el anticuerpo en dos pequeños pocillos hechos sobre un soporte, como una placa de agar. Ambos difunden de forma radial en el gel, uno hacia el otro, produciéndose un gradiente de concentración. Cuando se ponen en contacto, aparece un arco de precipitación en el punto de equivalencia antígeno-anticuerpo. La forma del arco de precipitación y su posición dependen de la concentración y del tamaño del antígeno y del anticuerpo. Un espécimen que contenga varios antígenos da lugar a múltiples arcos de precipitación. — Inmunodifusion radial

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La inmunodifusion radial es un método de difusión pasiva en el que se establece un gradiente de concentración para el antígeno, y donde el anticuerpo se encuentra disperso de forma uniforme en la matriz del gel. Para realizarla, se deja que difunda el antígeno desde un pocillo dentro del gel hasta que se alcanza un exceso de antígeno y tiene lugar la precipitación. La interacción antígeno-anticuerpo se manifiesta por un anillo bien definido de precipitación, alrededor del pocillo del antígeno. — Inmunoelectroforesis Es una técnica que combina la especificidad de las reacciones de inmunoprecipitación con la separación de moléculas por electroforesis, en un medio de cribado molecular. Como en la inmunodifusión radial, se establece un único gradiente de concentración, pero aquí se aplica un campo eléctrico para llevar al antígeno desde el pocillo de aplicación en una suspensión homogénea del anticuerpo en el gel. Este procedimiento produce, de forma opuesta a la inmunodifusion radial, una migración unidireccional del antígeno, lo que proporciona una mayor sensibilidad. Otra ventaja añadida sobre la inmunodifusión es su mayor rapidez, ya que mientras que en las técnicas de inmunodifusion el antígeno y el anticuerpo se ponen en contacto y precipitan mediante procesos de difusión pasiva, en esta técnica se acelera la puesta en contacto, gracias a la migración electroforética. — Inmunoelectroforesis en contracorriente Se realiza en gel de agar, a un pH al que los anticuerpos tienen carga negativa y los antígenos carga positiva. Los antígenos migran en el gel hacia el polo negativo, mientras que los anticuerpos lo hacen hacia el polo positivo. Se utiliza para la detección de antígenos bacterianos en sangre, orina o líquido cefalorraquídeo, y para la detección de autoanticuerpos. — Electroinmunodifusión En la electroinmunodifusión se somete a los antígenos a una electroforesis en un gel que contiene el anticuerpo. Los antígenos se colocan en pocillos en el gel de agar que contiene el anticuerpo. El pH del gel es tal que los anticuerpos permanecen inmóviles mientras que los antígenos tienen carga negativa. Se forman precipitados en forma de cohetes (rocket), cuya altura es proporcional a la concentración de antígeno. — Inmunofijación La inmunofijación es una técnica inmunoquímica para identificar proteínas. En su desarrollo, en primer lugar, se realiza una electroforesis en gel de agarosa en una dimensión para separar las proteínas de la mezcla. Luego, se dispersa el anticuerpo directamente sobre el gel, lo que hace que precipite la proteína que quiere detectarse. El precipitado inmunitario queda atrapado en la matriz del gel y el resto de las proteínas que no han precipitado, pueden eliminarse lavando el gel. El gel puede teñirse para identificar las proteínas. La inmunofijación se utiliza mucho en la actualidad para identificar paraproteínas. — Inmunotransferencia En la inmunotransferencia las proteínas se separan mediante electroforesis en gel de almidón o gel de poliacrilamida y, posteriormente, se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o nailon donde se fijan por adsorción. Luego, se incuban con sondas de anticuerpo marcadas con isótopos radiactivos, enzimas o compuestos fluorescentes. La inmunotransferencia se utiliza para la detección de autoanticuerpos.

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INMUNOTURBIDIMETRÍA E INMUNONEFELOMETRÍA Son técnicas muy adecuadas para medir la tasa de formación in vitro de complejos. Cuando un antígeno y un anticuerpo dirigido contra él se unen en solución forman rápidamente pequeños agregados, que confieren a la solución un aspecto turbio. Los agregados se asocian luego lentamente y forman una matriz mayor que finalmente da lugar a un precipitado. La reacción inicial entre el antígeno y el anticuerpo es rápida, mientras que la formación de los pequeños complejos capaces de dispersar la luz es lenta. La cantidad de luz dispersada depende del tamaño, la cantidad y el índice de refracción de las especies dispersantes. Los métodos de dispersión de luz para cuantificar las reacciones antígeno-anticuerpo deben proporcionar formas de detectar el exceso de antígeno. La cinética de la formación de complejos inmunitarios, medida por nefelometría o turbidimetría, es suficientemente diferente en las tres fases (exceso de anticuerpo, equivalencia, exceso de antígeno), que pueden desarrollarse algoritmos de ordenador para detectar automáticamente el exceso de antígeno. Las técnicas nefelométricas y turbidimétricas se emplean fundamentalmente para la determinación de proteínas específicas.

14.13. INMUNOANÁLISIS CON REACTIVOS MARCADOS______________________________________ Los inmunoanálisis con reactivos marcados se caracterizan por emplear moléculas denominadas indicadoras o trazadoras que, unidas al reactivo antígeno o anticuerpo, muestran que ha tenido lugar una reacción inmunitaria antígeno-anticuerpo. En sus diferentes modalidades, tienen una gran utilización en clínica, ya que permiten el análisis de mezclas complejas como los líquidos biológicos dada la alta especificidad de la reacción antígenoanticuerpo. Además, permiten detectar concentraciones muy bajas en las que los métodos químicos resultan ineficaces. Clases de inmunoanálisis con reactivos marcados: Los principales tipos de inmunoanálisis con reactivos marcados son el radioinmunoanálisis, el enzimoinmunoanálisis, el fluoroinmunoanálisis y el luminoinmunoanálisis. Los inmunoanálisis con reactivos marcados pueden ser de dos tipos: homogéneos y heterogéneos, de acuerdo con el efecto de la unión. Los inmunoanálisis homogéneos son aquellos en los que el compuesto marcado se comporta de forma diferente, según esté o no unido a su contrapuesto inmunitario. Este tipo de inmunoanálisis no requiere la separación física de las sustancias reaccionantes en dos fracciones, la ligada y la libre. Los inmunoanálisis heterogéneos son aquellos en los que el compuesto marcado se comporta de forma análoga, esté o no unido a su parte contraria en la reacción inmunológica y, por tanto, requieren la separación de las fracciones ligada y libre. Los principales métodos de separación de las fracciones ligada y libre son la adsorción, la precipitación, el uso de dos anticuerpos y los soportes sólidos. De acuerdo con la forma de unión, los inmunoanálisis pueden ser de dos tipos: competitivos (reactivo limitante) y no competitivos (exceso de reactivo, dos lugares, 194ándwich).

INMUNOANÁLISIS COMPETITIVOS Los inmunoanálisis competitivos son procedimientos basados en la unión reversible de dos ligandos, uno marcado y otro que se quiere determinar sin marcar, con su contrapuesto inmunitario (antígeno o anticuerpo), de forma que el ligando que se va a determinar compite con el marcado por la unión a un número de lugares disponibles. Hay dos modalidades: simultáneos y secuenciales.

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– En las pruebas de unión competitiva simultáneas, todos los reactivos se incuban juntos, sea Ag la sustancia que quiere medirse, Ag* la misma sustancia marcada y Ac un anticuerpo que reacciona específicamente con ellas. Si se incuba una mezcla de Ag y Ag* con una cantidad de Ac insuficiente para unirse a todas las moléculas de Ag y Ag* presentes, Ag y Ag* compiten por su unión a Ac, de forma que cuanto mayor sea la cantidad de Ag del espécimen, mayor será la cantidad de Ag* que quedará sin unir al Ac. Por tanto el mareaje unido es inversamente proporcional a la concentración de Ag en el espécimen. – En las pruebas de unión competitiva secuenciales, la sustancia del espécimen no marcada se incuba primero con un exceso de anticuerpo, permitiendo que la unión alcance el equilibrio. A continuación se añade una cantidad fija de la sustancia marcada y se permite de nuevo que se alcance el equilibrio. Tras el lavado, se determina el mareaje unido. Hay una relación inversa entre la concentración de sustancia no marcada del espécimen y el mareaje unido. INMUNOANÁLISIS NO COMPETITIVOS En los inmunoanálisis no competitivos tipo 195ándwich, un anticuerpo de captura se adsorbe pasivamente o se une de forma covalente sobre la superficie de una fase sólida. En la prueba se deja que el antígeno del espécimen reaccione con el anticuerpo unido a la fase sólida. A continuación, se añade un anticuerpo marcado, que reacciona con el antígeno unido, a través de un segundo epítopo diferente. Posteriormente, se determina el mareaje unido cuya concentración o actividad es directamente proporcional a la concentración del antígeno.

RADIOINMUNOANALISIS El radioinmunoanálisis utiliza compuestos radiactivos para el mareaje. Existen dos tipos fundamentales de métodos, el radioinmunoanálisis clásico (RÍA), que es un inmunoanálisis heterogéneo de tipo competitivo, y el análisis inmunorradiométrico (IRMA), que es un inmunoanálisis heterogéneo no competitivo. ENZIMOINMUNOANALISIS Los enzimoinmunoanálisis (EIA) utilizan las propiedades catalíticas de las enzimas para detectar y cuantificar las reacciones inmunológicas. Una sola molécula de enzima puede catalizar la conversión de millones de moléculas de sustrato en millones de moléculas de producto. Esta capacidad de amplificación hace posible detectar la presencia de una pequeña cantidad de enzima y, como consecuencia, de pequeñas cantidades de los complejos marcados formados. Los enzimoinmunoanálisis constan de dos etapas. En la primera etapa se produce la reacción entre el antígeno y el anticuerpo marcado. En la segunda etapa, se añade el sustrato y se determina la actividad enzimática de la enzima marcadora. — Enzimoinmunoanálisis homogéneos En los enzimoinmunoanálisis homogéneos, el hapteno-antígeno se acopla a la enzima y se utiliza la interacción anticuerpo-hapteno para inhibir o aumentar la actividad 195ándwich195i. De esta manera, no se requiere la separación de las fracciones ligada y libre. Se han propuesto un gran número de enzimoinmunoanálisis homogéneos. A continuación se describen los más empleados. • Técnica de inmunoanálisis mediada por enzima (EMIT): La técnica EMIT sólo puede utilizarse para la determinación de moléculas de bajo peso molecular y se ha aplicado para fármacos y hormonas de bajo peso molecular como la tiroxina. Se trata de una técnica competitiva. En ella, se marca con una enzima la sustancia que se desea determinar. Cuando la sustancia marcada se une a un anticuerpo específico contra ella, se produce la inhibición de la actividad de la enzima, al impedirse el acceso del sustrato al centro activo. Para realizar la prueba, se mezcla el

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espécimen que contiene la sustancia que quiere medirse con una cantidad fija de la sustancia marcada con la enzima, y una cantidad limitante de un anticuerpo específico contra la sustancia. Se produce la competencia entre la sustancia del espécimen y la marcada con la enzima por el anticuerpo, de forma que cuanto mayor sea la cantidad de sustancia presente en el espécimen, menos cantidad de la marcada con la enzima se une al anticuerpo y la actividad enzimática es mayor. Así, la actividad enzimática es directamente proporcional a la concentración de la sustancia que hay en el espécimen. • Inmunoanálisis donador con enzima clonada (CEDIA): La técnica CEDÍA se basa en el uso de la enzima β-galactosidasa, que se ha fraccionado mediante técnicas de DNA recombinante en dos fragmentos inactivos: un fragmento aceptor grande y un polipéptido donador más pequeño. Estos fragmentos son inactivos, pero pueden combinarse de manera espontánea para dar la enzima activa. La sustancia que quiere determinarse se liga covalentemente al polipéptido donador, de forma que no interfiera con la asociación espontánea con el fragmento aceptor para formar la enzima activa. La sustancia se sitúa en una posición del péptido donador, donde su unión con anticuerpos específicos inhibe la reasociación de los fragmentos de la enzima. La sustancia presente en el espécimen compite por un número limitado de lugares de unión del anticuerpo, haciendo más disponible para la complementación el conjugado sustancia-donador. Así, la cantidad de enzima formada, que se mide por la tasa de hidrólisis del sustrato cromogénico, es directamente proporcional a la cantidad de sustancia presente en el espécimen. Un inmunoanálisis CEDÍA típico se realiza en dos pasos. En el primer paso se añaden a la cubeta de reacción el espécimen y el reactivo 1 que contiene el aceptor enzimático y el anticuerpo. Se mezcla y se incuba a 37 °C. Durante esta incubación el ligando del espécimen se une a una cantidad limitada del anticuerpo presente. El aceptor enzimático no participa en la reacción. En el segundo paso, se añade el reactivo 2 que contiene el conjugado donador enzimático-ligando y el sustrato de la enzima. Se mezcla y se continúa la incubación. La cantidad de conjugado es aproximadamente igual al número de lugares de unión del anticuerpo. El conjugado puede unirse a los lugares de unión no ocupados del anticuerpo o reaccionar con un aceptor enzimático para formar la β-gaIactosidasa activa, dependiendo de la cantidad de sustancia presente en el espécimen. La cantidad de enzima formada se mide por la tasa de hidrólisis de sustrato, medida espectrométricamente al final del período de incubación. — Enzimoinmunoanálisis heterogéneos Los enzimoinmunoanálisis heterogéneos requieren la separación de las fracciones ligada y libre tras la reacción inmunitaria, antes de la determinación de la actividad enzimática, ya que la enzima se comporta de forma análoga en ambas fracciones. Los EIA heterogéneos son adecuados, tanto para compuestos de bajo peso molecular, como para sustancias de peso molecular elevado, como las proteínas. Las principales técnicas utilizadas para la separación de las fracciones ligada y libre en los enzimoinmunoanálisis heterogéneos, son la precipitación de la fracción unida por la adición de un exceso de un segundo anticuerpo, y los sistemas de fase sólida en los que el anticuerpo se liga a una matriz insoluble, como la pared de un tubo, una bola o una panícula magnética. El anticuerpo se une a la fase sólida por adsorción pasiva o acoplamiento covalente con bromuro de cianógeno. En la técnica de enzimoinmunoanálisis denominada ELISA (Enzyme linked immuno-sorbent assay: análisis inmunosorbente con la enzima ligada) uno de los componentes de la reacción se adsorbe de forma 196ándwich196ica sobre la superficie de una fase sólida, como una placa de microtitulación, una partícula magnética o una bola de plástico. Esta forma de unión facilita la separación de las fracciones ligada y libre. Los ELISA pueden ser competitivos o de tipo 196ándwich. En los competitivos, los anticuerpos contra la sustancia que se va a analizar ligados a la fase sólida, pueden unir tanto el antígeno del espécimen como el marcado con la enzima del reactivo. La concentración de anticuerpo anclado es baja, de forma que el antígeno del espécimen puede competir por los lugares de unión con el antígeno marcado del reactivo. Cuanto menor es la concentración de la sustancia a analizar en el espécimen, mayor es la cantidad de antígeno marcado con la enzima que se une. Tras la incubación, las sustancias no unidas se separan

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mediante lavado. La actividad enzimática es inversamente proporcional a la concentración de la sustancia que se analiza en el espécimen. El ELISA 197ándwich puede realizarse en un solo paso o en dos pasos. En el de un solo paso, se incuban juntos el espécimen con el segundo anticuerpo marcado con la enzima, mientras que en el de dos pasos, en el primero, se une la cantidad total de la sustancia en el espécimen al anticuerpo que se encuentra en exceso, y en el segundo paso, se añade el segundo anticuerpo marcado con la enzima, que se une a un segundo determinante antigénico en la sustancia que se analiza unida al primer anticuerpo. En ambos casos, se forma un 197ándwich y la actividad enzimática unida en el complejo antígeno-anticuerpo es directamente proporcional a la concentración de la sustancia que se cuantífica.

FLUOROINMUNOANALISIS Los fluoroinmunoanálisis (FIA) emplean los compuestos fluorescentes para el marcaje. Las principales características que deben poseer los compuestos fluorescentes para su uso en los fluoroinmunoanálisis son: – Poseer una intensidad de fluorescencia elevada. – Que sea posible diferenciar su fluorescencia de la de fondo, que producen los especímenes biológicos. – Que su unión al anlígeno o al anticuerpo no afecte de forma adversa a sus propiedades Los compuestos fluorescentes más utilizados como marcadores en los fluoroinmunoanálisis son los derivados de fluoresceína y rodamina. Además de los fluorímetros convencionales, pueden emplearse los fluorímetros denominados de resolución de tiempo (time-resolved). Tienen la ventaja de eliminar la dispersión de la luz de fondo y la fluorescencia de fondo, con lo que se incrementa la sensibilidad de detección. Los fluoroinmunoanálisis homogéneos no requieren la separación de las fracciones ligada y libre, una vez producida la reacción inmunológica. Existen varias técnicas de fluoroinmunoanálisis homogéneo, como el fluoroinmunoanálisis de polarización de fluorescencia (FPIA), el inmunoanálisis de fluorescencia con el sustrato marcado (SLFIA) y el inmunoanálisis de transferencia de la energía de fluorescencia (FETI). El fluoroinmunoanálisis heterogéneo requiere la separación de las fracciones ligada y libre de la reacción inmunológica, antes de la medida de la fluorescencia. Hay un gran número de fluoroinmunoanálisis heterogéneos para la determinación de muchas sustancias que utilizan diversos soportes sólidos para la separación. Entre los fíuoroinmunoanálisis heterogéneos más utilizados se encuentra el fluoroinmunoanálisis de disociación aumentada por lantánidos (DELFIA).

LUMINOINMUNOANALISIS La quimioluminiscencia implica la oxidación de un compuesto orgánico, como el luminol, el isoluminol, el pirogalol o los esteres de acridina por un oxidante, como el peróxido de hidrógeno, el hipoclorito o el oxígeno, de forma que se emite luz desde el producto excitado en la reacción de oxidación. Estas reacciones se producen en presencia de catalizadores como las enzimas, los iones metálicos o los complejos metálicos. En los años 80, se utilizaron en inmunoanálisis luciferasas y fotoproteínas de varias especies bioluminiscentes, como la luciérnaga, las bacterias marinas o los peces luminosos. El principal problema era la dificultad para preparar los conjugados, debido a la inactivación de la luciferasa. En los últimos años, han resurgido este tipo de marcadores, debido al progreso de la biología molecular de los organismos bioluminiscentes. Una ventaja importante de los mareajes bioluminiscentes es que el gen que expresa la proteína bioluminiscente puede fusionarse con otros genes, para producir proteínas de fusión que combinen dos especificidades diferentes. La preparación de conjugados por esta técnica genética

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soslaya muchos de los problemas que se encuentran en los procedimientos químicos convencionales de conjugación. Los compuestos luminiscentes más utilizados en los luminoinmunoanálisis son la lucigenína, los derivados de acridinio, el luminol, el isoluminol y el pirogalol. Estos compuestos se unen de forma covalente a sus ligandos (antígenos o anticuerpos). Se han creado proteínas de fusión luciferasa-proteína A, fusionando el gen de la luciferasa con el gen de la proteína A e insertando el gen resultante en E. coli. Las bacterias transformadas expresan una proteína de fusión de 91 kD que retiene la actividad enzimática de la luciferasa y la capacidad de unirse a la porción Fe de una inmunoglobulina, que es característica de la proteína A. Un tipo especial de inmunoanálisis de luminiscencia es el de la electroquimioluminíscencia (ECLIA), en el que la luminiscencia se genera por la oxidación de un compuesto marcador de tris (bipiridil) de rutenio (II) en la superficie de un electrodo en presencia de tripropilamida para formar especies de rutenio (II) excitadas, que vuelven a su estado basal emitiendo luz a 620 nm. Los formatos de inmunoanálisis homogéneos explotan la diferente accesibilidad del mareaje libre y unido a la superficie del electrodo, o el aumento de la señal electroquimioluminiscente del conjugado, unido a un inmunosorbente microparticulado. El marcador activado se puede unir fácilmente a los grupos amino de las proteínas, haptenos y ácidos nucleicos sin modificar propiedades de las moléculas. La emisión de luz producida a partir de la reacción quimioluminiscente tiene lugar cuando el marcador de rutenio es activado eléctricamente aplicando una diferencia de potencial a la mezcla de reacción donde se sitúa un electrodo. Mediante un imán las partículas cargadas con los complejos Ag-Ac se depositan en este electrodo. Luego se lava la fase sólida y se aplica una diferencia de potencial definida para activar la reacción de quimioluminiscente teniendo lugar la producción de luz. Un fotomultiplicador mide la emisión de luz generada por dicha reacción. Luego se retira el imán liberándose las partículas magnetizadas y levantándose la célula de medida.

PARTICULOINMUNOANÁLISIS El método inmunoquímico más simple es el que se basa en la reacción en medio líquido de un anticuerpo con su antígeno respectivo para formar un inmunocomplejo que en condiciones de concentración adecuadas puede precipitar. El principal inconveniente de estos métodos de inmunoprecipitación en fase líquida consiste en detectar el precipitado formado por el complejo antígeno-anticuerpo, para lo que se precisa poner en el medio de reacción una gran cantidad de moléculas de ambos reactantes, lo que limita la sensibilidad metrológica alcanzada por estos procedimientos. Sin embargo, si se aumenta el tamaño efectivo del antígeno o del anticuerpo reaccionante uniéndolo a un eritrocito o a una partícula inerte, se necesitan menores concentraciones de los reactantes para producir señales detectables y, por tanto, se consigue aumentar la detectabilidad de 50 a 1000 veces. La primera técnica inmunoquímica que se desarrolló fue la hemaglutinación, consistente en la detección de la aglutinación específica entre un antígeno o un anticuerpo unidos a eritrocitos para la medida de una de las partes de la reacción inmunoquímica: el anticuerpo o el antígeno, en los diferentes fluidos biológicos. La hemaglutinación ha sido muy utilizada en el laboratorio clínico y aunque aún se utiliza en ciertas circunstancias, es una técnica que ha sido superada por otras técnicas inmunoquímicas, principalmente por el radioinmunoanálisis y el enzimoinmunoanálisis. Con objeto de reducir la complejidad y la duración del proceso, se ha desarrollado la técnica denominada particuloinmunoanálisis, de la que se derivan diferentes métodos, unos homogéneos, que miden la aglutinación de las mismas como señal de la reacción específica antígeno-anticuerpo, que son una extensión de los métodos originales de hemaglutinación, y que constituyen los métodos de particuloinmunoanálisis propiamente dichos, y otros que emplean las partículas únicamente como

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soporte sólido para la separación rápida de las fracciones unida y no unida en sistemas de medida más complejos como el enzimoinmunoanálisis, el fluoroinmunoanálisis o los métodos basados en la inmunoquimioluminiscencia. Los métodos de particuloinmunoanálisis de aglutinación de partículas se pueden clasificar como métodos inmunoquímicos no isotópicos homogéneos, en los que el marcador lo constituye la propia partícula, que puede ser de naturaleza inorgánica coloidal (metal), orgánica inerte (polisacárido, látex, bentonita, liposomas) o de naturaleza celular (microorganismo, eritrocito). Las principales partículas que se utilizan en el particuloinmunoanálisis son las de látex. Son técnicas de particuloinmunoanálisis el Enzimo Inmuno Análisis de Micropartículas (MEIA) y la Interacción Cinética de Micropartículas en Solución (KIMS).

INMUNOANÁLISIS MEDIADOS POR AVIDINA-BIOTINA Una aplicación fundamental de la tecnología avidina-biotina es la potenciación de la señal y/o la velocidad de un inmunoanálisis. La constante de unión del complejo biotina-avidina es muy elevada, y la potenciación de la señal se debe a que pueden unirse a una molécula de anticuerpo muchas moléculas de biotina. De esta manera, pueden incorporarse en el paso final del sistema de detección muchos marcadores que contienen avidina. También, los cuatro lugares de unión de la biotina sobre la molécula de avidina permiten una potenciación mayor de la señal, al hacer que pueda usarse secuencialmente o acomplejarse con la avidina una sonda de detección biotinilada en una relación predeterminada. Otra posibilidad es utilizar el complejo avidina-biotina en el sistema de captura, por medio de un anticuerpo biotinilado unido a la proteína A de anclaje, inmovilizada sobre una matriz que contenga avidina. La estreptavidina, que tiene una afinidad por la biotina comparable a la de la avidina, está sustituyendo a esta última, que posee un gran número de cargas positivas. La estreptavidina es menos básica y no tiene restos de carbohidratos, lo que disminuye las reacciones no específicas con grupos ácidos o con lectinas. En los inmunoanálisis, los anticuerpos biotinilados reaccionan con el antígeno y luego se añade la avidina ligada a una sustancia emisora (marcador radiactivo, enzima o compuesto fluorescente o luminiscente).

INMUNOFLUORESCENCIA Es una prueba de diagnóstico que tiene dos variedades principales: a) Inmunofluorescencia directa (IF) aplicada fundamentalmente a la detección de antígenos en una muestra clínica y b) Inmunofluorescencia indirecta (IFI) aplicada a la detección de anticuerpos específicos en el suero del paciente frente a un determinado antígeno o a la detección de un antígeno en una muestra clínica. — Inmunofluorescencia directa: sobre un porta depositamos una muestra en la que buscamos la presencia de un determinado antígeno. Añadimos un suero específico del antígeno problema marcado con isotiocinato de fluoresceína (conjugado). Si el antígeno problema se encuentra presente en la muestra, se une el conjugado. En caso contrario el conjugado se elimina con un lavado del porta. — Inmunofluorescencia indirecta: sobre un porta que lleva pegado un antígeno conocido, añadimos el suero problema. Si éste contiene anticuerpos específicos, se unen al antígeno. Los anticuerpos del suero no específicos del antígeno del porta se eliminan mediante un lavado. Posteriormente se añade un suero anti-inmunoglobulina humana marcada con isotiocianato de fluoresceína (conjugado). El conjugado se une a los anticuerpos específicos o se elimina mediante lavado. La lectura de ambas modalidades de IF se hace con un microscopio de fluorescencia cuya luz excita al isotiocianato de fluoresceína haciendo que emita luz fluorescente de color verde. La observación de luz

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verde fluorescente tiñiendo un objeto del porta indica la presencia del antígeno en la muestra o de anticuerpos específicos en el suero, según el caso.

INMUNOANÁLISIS EN LÍNEA O TIRA (LIA) Se emplean tiras plastificadas que cada una de ellas tiene los anticuerpos purificados. Las tiras se ponen en presencia del suero y posteriormente se lavan para eliminar el exceso de este. En esta fase se fijan loas autoanticuerpos del suero al anticuerpo o anticuerpos para los que son específicos. Luego se añade el sustrato. La enzima cataliza la reacción enzimática transformando el sustrato en un producto coloreado. La reacción separa con una solución stop. Esto origina en la tiras de las muestras un patrón de bandas determinado. Las tiras de las muestras y la tira control positivo se escanean y por comparación de la intensidad de la banda del control positivo con la de la muestra para cada antígeno específico, se presentaran los resultados como positivos o negativos para dicho antígeno. Así se verifica el patrón de resultados como positivo o negativo para dicho antígeno.

INMUNOCROMATOGRAFÍA La muestra se pone en contacto con la zona del conjugado. Esta lleva impregnada un conjugado formado por un anticuerpo específico contra uno de los epítopos del antígeno a detectar y un reactivo de detección. Si la muestra contiene el antígeno a detectar, éste se unirá al conjugado formando un complejo y empezarán a migrar a través de la membrana de nitrocelulosa. Sino, migrarán el conjugado y la muestra sin unirse. La zona de captura está formada por un segundo anticuerpo específico contra otro epítopo del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la unión de antígeno y conjugado quedarán retenidos y la línea se coloreará (muestras positivas). Si la muestra no contenía el antígeno, el segundo anticuerpo no captura nada y la línea queda transparente (muestras negativas). La zona control está formada por el tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de detección. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unirá al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta línea es un control de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con líneas positivas y negativas.

14.14. OSMOMETRÍA_______________________________________________________________ La osmometría es una técnica que se utiliza para medir la concentración de sustancias, en general, en las disoluciones. Las propiedades coligativas de las disoluciones son las relacionadas con el número total de partículas de soluto por masa de disolvente. Las propiedades coligativas son la presión osmótica, la presión de vapor, el punto de fusión y el punto de ebullición. Se denomina ósmosis al flujo de agua a través de una membrana semipermeable desde una disolución diluida a otra concentrada. La osmometría es una técnica que se utiliza para medir la concentración de moléculas e iones, en general, en una disolución, no de determinados iones o moléculas en particular.

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La osmolalidad de una disolución es el número de moles de partículas por kilogramo de agua. El aumento de la osmolalidad de una disolución produce un aumento de la presión osmótica, un descenso del punto de congelación, un descenso de la presión de vapor y un aumento del punto de ebullición. La osmolalidad de una disolución puede determinarse midiendo cualquier propiedad coligativa. Se utilizan el descenso del punto de congelación y el descenso de la presión de vapor. Los osmómetros que emplean la medida del descenso del punto de congelación constan de un baño de enfriamiento para congelar el espécimen y un dispositivo que mide la temperatura a la que se produce la congelación. Cada mol de partículas disueltas por kilogramo, produce un descenso de 1,86 °C de la temperatura de congelación. De esta forma, la osmolalidad viene dada por la fórmula: Osmolalidad = disminución del punto de congelación / 1,86 ºC (El resultado que se obtiene en osmoles se multiplica por 1000 para dar miliosmoles, que es la unidad más empleada).

14.15. TÉCNICAS PARA MEDIR LA CONCENTRACIÓN DE NÚMERO______________________________ CÁMARAS DE RECUENTO Las cámaras de recuento se utilizan principalmente para la medición de la concentración de leucocitos, eritrocitos y plaquetas en sangre y en otros líquidos biológicos, y la de espermatozoides en semen. Cámara de Neubauer improved ( 0,1 mm3 ) Se utiliza para el recuento de espermatozoides en líquido seminal y de leucocitos y hematíes en líquidos biológicos a excepción del líquido cefalorraquídeo. Esta cámara posee una cuadrícula de 3x3 mm con una separación entre 2 líneas consecutivas de 0,25 mm. El cuadrado central está dividido en 25 cuadrados terciarios. Los recuentos de leucocitos se realizan en cada uno de los 4 cuadrados grandes de las esquinas; los de eritrocitos y plaquetas en, al menos, 10 cuadrados pequeños del cuadrado central. Acompaña a la cámara un cubreobjetos que se coloca sobre las plataformas laterales, dejando un espacio de 0,1 mm entre él y la plataforma central cuadriculada. Con la ayuda de un microscopio se calcula el número de células contenidas en un volumen conocido. La dilución previa y adecuada de la muestra mejora la visualización para el recuento celular.

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La parte central de la cámara está constituída por 25 cuadrados (0,2 mm) separados entre sí por líneas triples y cada uno de ellos se compone a su vez de 16 cuadrados pequeños separados por líneas simples. La superficie que tiene cada cuadrado pequeño en esta cámara es 0,0025 mm2 y la profundidad de la cámara 0,1 mm. El volumen de la cuadrícula central de la cámara es de 0,1 mm3 ó µL y se calcula de la siguiente forma: Volumen cámara= (Volumen cuadrado pequeño) x16x25 = [ 0,0025 (mm2)x 0.1 (mm) ]x16x25= 0.1 mm3 (Volumen = superficie x profundidad) La forma de calcular las - células / µL ó mm3 - que hay en la muestra es multiplicar por 10 el número de células contadas en una de las 9 retículas ó, contar varias, hacer la media y x 10. La cámara de Fush Rosenthal (3,2 mm3 ) Se utiliza para el recuento de leucocitos y hematíes en líquido cefalorraquídeo. La cámara consta de una cuadrícula de recuento con 16 cuadrados grandes de 1 mm2 (delimitados por líneas triples) que se subdividen a su vez en 16 cuadrados más pequeños (delimitados por líneas simples) con 0,25 mm de arista y una superficie de 0,0625 mm2. La profundidad de la cámara es 0,2 mm y su volumen (realizando el cálculo como anteriormente se ha hecho con la cámara de Neubauer) es de 3,2 mm3 ó µL. La forma de calcular las - células / µL ó mm3 - que hay en la muestra es dividir por 3,2 el número de células contadas en la cuadrícula de la cámara.

Cámara de Makler (0.010 mm3 /100 celdas) Esta cámara se utiliza específicamente para el recuento y observación de la motilidad de los espermatozoides en una muestra de semen. La cámara de recuento Makler se compone de dos partes. La sección inferior, que hace las veces de base, de aluminio con forma de anillo plano y con dos asas para su manejo. En la superficie superior del anillo metálico está fijado un disco de vidrio sobre el que se coloca el semen. Emergiendo de la superficie del disco de vidrio inferior se alzan cuatro pilares de cuarzo que se elevan exactamente 10 micrómetros por encima de la superficie del disco y sobre la que apoyará la segunda sección de la cámara.

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La segunda sección de la cámara de Makler forma la parte superior y es la que hará de cubreobjetos de la cámara. Este particular cubreobjetos se compone de un disco de vidrio montado dentro de un anillo de metal. En la superficie inferior del disco de vidrio se encuentra grabada una rejilla que mide 1 mm2 . Esta rejilla se divide en 100 celdas de 0,01 mm2 cada una. Por lo tanto, cuando colocamos el cubreobjetos sobre los cuatro pilares de la base, el espacio delimitado por estas dos superficies y que cubren la superficie 10 cuadrados pequeños proporciona un volumen de 0,001 mm3 (o 1 millonésima parte de un ml).

Uso de la cámara de recuento de makler. En primer lugar, es importante asegurarse de que la cámara está completamente limpia. Esto se puede realizar mediante lavado en agua destilada y por un secado cuidadoso con papel para lentes o tejido no abrasivo. Como esta cámara también se puede utilizar para evaluar la motilidad es importante que esté completamente seca. Mediante una pipeta automática, con posibilidad de depositar aproximadamente de 3-5 microlitros, se coloca una gota de semen en el disco inferior de vidrio de la base de la cámara. Es importante evitar la presencia de burbujas en el fluido seminal ya que esto reducirá el volumen de esperma en el que se contarán los espermatozoides. Colocamos la cubierta de vidrio, que hace las veces de cubreobjetos, sobre el semen. El peso del cubreobjetos permitirá que apoye sobre las cuatro patillas de la base. Para observar una correcta colocación hay que buscar la aparición de los anillos birrefringentes (anillos de Newton) que aparecen en cada uno de los pilares. La presencia de los anillos indica que hay un estrecho contacto entre los pilares y el vidrio que lo cubre y se asegurará la difusión óptima del semen con un espesor de 10 micras (0,01 mm).

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La cámara está ahora lista para ser transportada por sus asas a una pletina de microscopio y observada bajo una óptica de iluminación normal o de contraste de fases con un aumento mínimo de x200. Examinando el semen a través de la retícula, primero es importante asegurarse de que los espermatozoides se distribuyen uniformemente, una distribución desigual de los espermatozoides nos indicará que la muestra de semen no ha sido adecuadamente mezclada. El semen en esta retícula no está diluido y los espermatozoides conservan su movilidad en el interior de la cámara de contaje. Se cuenta, al menos 200 espermatozoides y se tiene en cuenta el número de celdas contadas. El número de espermatozoides por mililitro será el número de espermatozoides contados dividido por el número de filas (de 10 casillas cada fila). Procederemos a repetir el contaje con otra alícuota de la muestra expresando el resultado final como una media de los dos contajes siempre que la diferencia entre contajes no supere el 15%.

CITOMETRÍA DE FLUJO La citometría de flujo es una técnica que sirve para caracterizar y contar células según la determinación de alguna de sus características físicas tales como su tamaño y su arquitectura interna. El principio básico consiste en la señalización de las células individuales, que se encuentran disueltas en una disolución en una suspensión fluida, por un rayo láser y la posterior medición de la radiación dispersada frente a la célula en un ángulo próximo a 0º (difracción de pequeño ángulo que informa sobre el diámetro celular) y la radiación dispersada a 90º (difracción de ángulo amplio que lo hace sobre la arquitectura interna celular) mediante unos sensores o fotomultiplicadores que recogen la radiación emitida. Las señales procedentes de cada sensor son amplificadas y convertidas en señales digitales y enviadas a un analizador de datos con el fin de obtener una información más selectiva de las células en estudio, éstas pueden ser marcadas previamente con anticuerpos unidos a un fluorocromo y dirigidos a determinados antígenos celulares. La citometría de flujo comenzó a aplicarse en el campo de la investigación biomédica, pero, en los últimos años, ha adquirido una importancia relevante en el laboratorio clínico, ya que ofrece una serie de ventajas sobre otras técnicas convencionales. Entre las principales ventajas cabe destacar: su capacidad de valorar varias características físicas de una célula, la medición de varias magnitudes biológicas a la vez y la posibilidad de identificar mayor número de subpoblaciones celulares mediante la utilización de anticuerpos marcados con fluorocromos. Representación de datos: La información obtenida por técnicas de análisis de citometría de flujo se representa en forma distribuciones de frecuencia o histogramas de una o dos dimensiones. En los histogramas de una dimensión o parámetro se representa el número de células o partículas (en el eje de ordenadas) frente a la intensidad de fluorescencia de un parámetro (en el eje de abcisas). Las distribuciones de frecuencia de dos parámetros, también denominadas citogramas, representan en cada eje la intensidad de fluorescencia de un parámetro diferente. Las más comunes son las distribuciones de frecuencia de puntos (“dot plots”) donde cada punto representa a una partícula analizada, y la distribución de los puntos permite visualizar las contribuciones relativas de cada región de rangos de intensidad de fluorescencia. También se utilizan distribuciones de frecuencia o de densidad de dos dimensiones en los que la proporción de las células en cada región se definen por una escala de color o por gradientes de curvas de contorno. La utilización de representaciones en dos dimensiones permite establecer de manera visual cual es la correlación entre cualesquiera dos parámetros. Otra característica propia del análisis de datos de citometría de flujo es la utilización de ventanas de análisis (“gates”). El establecimiento de ventanas de análisis se utiliza tanto para seleccionar de manera específica la población de células o partículas de interés, normalmente en base a los parámetros de dispersión frontal y ortogonal de la luz, como para simplificar el análisis de poblaciones heterogéneas en las que se analizan simultáneamente un número elevado de parámetros.

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CITOQUÍMICA DE FLUJO Con la finalidad de discriminar un mayor número de poblaciones leucocitarias, algunos analizadores hematológicos basados en el principio de medición de la dispersión de una radiación incorporan reacciones citoquímicas; la unión de ambos métodos da origen a la denominada "técnica de citoquímica de flujo". Eslas reacciones citoquímicas se basan en la medición de la actividad de algunas enzimas (peroxidasa, lipasa) presentes en los leucocitos, mediante la adición de sustratos y de cromógenos, ya que las células se tiñen con mayor o menor intensidad dependiendo de su actividad enzimática. Este tipo de analizadores celulares también miden, simultáneamente, la dispersión (tamaño celular) y la absorción (actividad enzimática) de la luz, al tiempo que miden la concentración de número de las células. Durante el proceso, los eritrocitos se someten a un proceso de lisis, se separan los leucocitos en distintos canales, se fijan y se les incorpora el sustrato de la enzima y el cromógeno capaz de producir la reacción citoquímica específica. La peroxidasa es una enzima presente en los gránulos primarios de los leucocitos. Tras añadir el sustrato peróxido de hidrógeno y el cromógeno se desencadena la reacción citoquímica. La absorción de la luz en cada célula depende de la intensidad del color que ésta haya adquirido; así, los leucocitos que poseen mucha cantidad de peroxidasa (neutrófilos, eosinófilos y monocitos) adquieren más intensidad de color (absorben más luz) que aquellos que contienen poca o nada peroxidasa (linfocitos y blastos). Cada célula queda representada gráficamente mediante un diagrama punteado de dispersión en el que cada punto representa una célula en función de su tamaño (determinado por la dispersión de la radiación) y de la intensidad del color que la célula haya adquirido tras la adición del cromógeno (medido por la absorción de la radiación). El resultado final es el de un diagrama con, al menos, cinco poblaciones leucocitarias diferentes.

14.16. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN______________________________________________________ CENTRIFUGACIÓN Las técnicas de centrifugación se basan en el hecho de que una partícula situada en un medio de menor densidad tiende a sedimentar siguiendo una aceleración hasta que la fuerza de fricción ocasionada por el medio en que se encuentra sea igual a su peso. En el caso de una partícula sometida a un movimiento de rotación, la fuerza de aceleración que la mueve es la fuerza centrífuga. Sobre una partícula en suspensión en un medio líquido y sometida a centrifugación actúan pues, dos tipos de fuerza : – –

Fuerza centrífuga: Depende de la aceleración del movimiento rotatorio y de la masa de la partícula. Fuerza de fricción: se opone al movimiento de la partícula en el medio líquido.

La velocidad con que una partícula sedimentará está relacionado con su forma y tamaño y es inversamente proporcional a la viscosidad del medio. La aceleración centrífuga a que está sometido el sistema puede calcularse a partir del radio de giro y de la frecuencia rotacional. La aceleración centrífuga usualmente se expresa en términos de aceleración estándar de caída libre (gn) (aceleración estándar de la gravedad).

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Basándose en la distinta velocidad de sedimentación de cada partícula, las técnicas de centrifugación permiten separar tipos de partículas diferentes trabajando con distintas combinaciones de tiempo y aceleración. Para normalizar la velocidad de sedimentación de distintas partículas se ha definido el coeficiente de sedimentación, que es el cociente entre la velocidad con que una partícula en suspensión se deposita en el fondo del recipiente que la contiene y la aceleración a la que está sometida la suspensión. Este coeficiente se define en unas condiciones de viscosidad y densidad del medio controladas, y su unidad es s-1. Una práctica extendida, aunque no recomendada internacionalmente, es utilizar una unidad no perteneciente al Sistema Internacional de Unidades, denominada Svedberg (S): 1 s-1 = 1013 S. También se suelen añadir subíndices para indicar la temperatura y el medio, y superíndices para precisar la concentración.

CROMATOGRAFÍA La cromatografía es una técnica de separación que se fundamenta en la distribución de las sustancias en dos fases, una móvil y otra estacionaria. Puede clasificarse de acuerdo con la interacción de las sustancias que se separan, con la fase estacionaria en: adsorción, reparto, intercambio iónico, exclusión y afinidad. Con frecuencia, en algunos métodos cromatográficos de separación coexisten dos o más tipos de interacciones entre la fase móvil y la fase estacionaria. — Cromatografía de adsorción Esta técnica retiene los solutos por adsorción superficial en la que las principales interacciones entre las moléculas y los adsorbentes son las electrostáticas, los puentes de hidrógeno y las dispersivas. La forma más general de cromatografía de adsorción se realiza en una columna que se llena del adsorbente adecuado. Las sustancias que quieren separarse se colocan disueltas en la parte superior de la columna y al pasar por ésta van siendo retenidas por el adsorbente. La elución de las sustancias retenidas se realiza utilizando disolventes en los que sean solubles y que también interactúen con el adsorbente. Tras separar estas sustancias en las columnas, se cuantificaban por espectrometría o por fluorimetría. — Cromatografía de reparto La cromatografía de reparto consigue la separación de sustancias tomando como base su diferente distribución entre dos fases líquidas inmiscibles. La cromatografía de reparto puede realizarse en papel, capa fina o columna. — Cromatografía de intercambio iónico La cromatografía de cambio de ion separa las sustancias tomando como base las ínteracciones electrostáticas que se producen entre los grupos ionízables de los compuestos que quieren separarse, y los grupos cargados unidos a un soporte sólido. Los cambiadores iónicos son sustancias insolubles que contienen grupos cargados con iones móviles de signo contrarío, que neutralizan los grupos fijos. Estos iones móviles o contraiones pueden intercambiarse de manera reversible con otros iones de la misma carga. Los cambiadores pueden ser catiónicos si intercambian iones del medio con carga positiva, o aniónicos si intercambian iones negativos. Los grupos cargados de la matriz insoluble determinan el tipo y la fuerza del cambiador. Los grupos fenólicos, carboxílicos y sulfónicos se utilizan como cambiadores catiónicos, mientras que los grupos amino, alifáticos y aromáticos, se utilizan como cambiadores aniónicos. Los grupos sulfónicos y amino cuaternarios son cambiadores fuertes, mientras que los otros grupos

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mencionados lo son débiles. El mecanismo por el que se produce la separación en la cromatografía de cambio de ion es la unión reversible de los compuestos a los cambiadores. — Cromatografía de gases La cromatografía de gases es una técnica de reparto líquido-gas, que se realiza en una columna rellena de un sólido finamente dividido que actúa como soporte. La fase estacionaria está formada por un líquido no volátil que impregna el soporte, y la fase móvil es un gas inerte que fluye por la columna a velocidad constante. La separación por cromatografía de gases requiere que los solutos sean volátiles. Muchos compuestos de interés clínico no son volátiles, de forma que deben modificarse químicamente por un proceso denominado derivatización. Se suele aumentar la volatilidad transformando los grupos funcionales polares (hidroxilo, amino, cetona) en grupos no polares (trimetilsilil, monoxima). — Cromatografía de exclusión La cromatografía de exclusión, antes denominada filtración en geles, es una técnica que separa las moléculas en función de su tamaño y de su forma. La fase estacionaria es un gel, polímero anhidro muy hidrófilo, que se hincha cuando se sumerge en agua o en soluciones electrolíticas. Esta cromatografía se realiza en columna y la elución o salida de las sustancias es independiente del eluyente, o fase móvil utilizada, de su pH y de su fuerza iónica y sólo es función de la forma y del tamaño de las sustancias y de los poros del gel. — Cromatografía de afinidad La cromatografía de afinidad utiliza para la separación interacciones biológicas altamente específicas, como las interacciones enzima-sustrato, antígeno-anticuerpo y hormona-receptor. La técnica requiere que el compuesto que quiere separarse se una reversiblemente a un ligando específico, que se ancla a una matriz insoluble. Así, la fase estacionaria se prepara inmovilizando el ligando sobre el soporte sólido, bien directamente o empleando un brazo espaciador. Para realizar la cromatografía se añade la mezcla, que contiene la sustancia que se quiere separar, al ligando inmovilizado, generalmente contenido en una columna cromatográfica, aunque también puede encontrarse en disolución. El compuesto que se quiere separar se une al ligando y el resto de las sustancias se eliminan mediante lavado. La separación o elución de la sustancia que se quiere separar se consigue, alterando las condiciones experimentales por variación del pH o de la fuerza iónica, o pasando un ligando distinto al anclado en la columna por el que tenga mayor afinidad la sustancia. — Cromatografía líquida de alta resolución La cromatografía en columna puede utilizar los cinco tipos de interacción entre la fase móvil y la fase estacionaria que se han señalado previamente. La separación en columna se ha realizado hasta hace unos años utilizando el flujo gravitatorio como fuerza impulsora de la fase móvil, lo que lleva tiempos de separación largos. La construcción de sistemas impulsores de la fase móvil de presión elevada, así como la obtención de rellenos de las columnas de gran eficacia de actuación, ha permitido tiempos cortos de separación y una gran selectividad. La cromatografía que emplea estos métodos se denomina HPLC (high performance liquid chromatography: cromatografía líquida de alta eficacia).

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Componentes de un cromatógrafo de HPLC

La bomba de los cromatógrafos líquidos puede actuar de modo isocrático o de modo gradiente. En el modo isocrático, la composición de la fase móvil permanece constante durante todo el proceso, mientras que en el modo gradiente, la composición de la fase móvil va cambiando durante la cromatografía. Se utiliza un gran número de detectores diferentes a la salida de la columna. Los más empleados son los espectrómetros visible y ultravioleta, y los fluorímetros y detectores electroquímicos. En la cromatografía de reparto líquido-líquido, las superficies de un sólido se recubren con un líquido (fase estacionaria) inmiscible con el líquido que constituye la móvil. La separación se produce por la distribución relativa o reparto de los componentes entre la fase móvil y la fase estacionaria. Las fases líquidas estacionarias son generalmente polares, mientras que las fases móviles son no polares. Así, los líquidos estacionarios más usados son el agua y el etilenglicol, y las fases móviles más típicas, el hexano, el metanol y las mezclas hexano/isopropanol. Esta combinación de fase estacionaria polar y fase móvil no polar se denomina cromatografía líquida en fase normal. Cuando la fase estacionaria es no polar, como un hidrocarburo, y se utilizan como fase móvil sistemas acuosos, la cromatografía se denomina en fase inversa. El intercambio iónico, así como la exclusión, se usan también como base de separación en cromatografía líquida de alta eficacia. Las principales aplicaciones clínicas de la cromatografía líquida de alta eficacia son la separación de aminoácidos de suero y orina, la cuantificación de fármacos en suero y orina, la separación de catecolaminas en fluidos biológicos y la cuantificación de glicohemoglobina.

ELECTROFORESIS La electroforesis es el transporte de partículas cargadas en un campo eléctrico. Es una técnica de separación, en la que las partículas cargadas se separan por su velocidad de migración diferente. La electroforesis se utiliza para separar compuestos con carga neta, como aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos y ácidos nucleicos. Su principal aplicación clínica es la separación de las proteínas del suero (proteinograma), lipoproteínas del suero, isoenzimas y ácidos nucleicos.

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La movilidad electroforética de una molécula depende directamente de su carga e inversamente del coeficiente de fricción, que a su vez depende directamente del tamaño de la molécula, de su forma y de la viscosidad del medio. La migración de las partículas es dependiente del pH del medio en que se encuentran, ya que su carga neta depende del pH. El tampón en la electroforesis ejerce dos funciones: por un lado, lleva la carga eléctrica y, por otro, determina la carga neta de las moléculas que se separan y, de esta forma, la dirección de la migración electroforética. La fuerza iónica del tampón determina la anchura de la nube iónica que rodea las moléculas cargadas. Cuanto mayor es la fuerza iónica, más estrechas son las bandas de separación. Sin embargo, la fuerza iónica elevada produce un mayor calentamiento y la posible desnaturalización de las sustancias que van a separarse, de forma que hay que llegar a una solución de compromiso. Los principales soportes son: el papel, las membranas de acetato de celulosa y los geles de agarosa, almidón y poliacrilamida. Una vez separadas, las proteínas se visualizan sobre el soporte por medio de su tinción con diversos colorantes; los más habituales son el rojo Ponceau y el negro amido. Posteriormente, la densitometría determina el porcentaje de cada fracción o banda electroforética y, conocidas la concentración de proteínas totales del suero, la cantidad de cada una. Los densitómetros tienen un sistema de arrastre de los soportes teñidos que hace que estos pasen por una rendija de luz, que luego incide sobre un detector. La luz que llega a este produce una señal eléctrica que es recogida en la pluma de un registrador. Cuanto mayor es la intensidad de la banda, menor es la luz que llega al detector, y mayor la deflexión de la pluma del registrador, que dará un pico más alto. Por medio de integradores incluidos en los densitómetros, se mide el área de cada pico y se calcula el porcentaje de cada fracción. Los densitómetros pueden leer las bandas electroforéticas por transparencia o por reflexión. Asimismo, tienen filtros para leer bandas de diferentes coloraciones y leer la luz ultravioleta por sistemas de fluorescencia,

ELECTROFORESIS CAPILAR La electroforesis capilar es una técnica en la que la electroforesis de zona se realiza en capilares de 75 μm de diámetro interno y 25 cm de longitud. El tubo capilar se conecta a un detector en un extremo, y a una fuente de corriente a través de recipientes con un amortiguador. Las principales ventajas de que los capilares tengan un diámetro tan pequeño son que se logra una mayor disipación del calor, un menor volumen del espécimen y una anchura menor de las zonas de separación. La gran disipación del calor permite aplicar grandes voltajes, de unos 5.000 V, que mejoran la eficacia de la separación y reducen el tiempo de esta. APLICACIÓN DEL ESPÉCIMEN La aplicación del espécimen puede realizarse de dos formas: por inyección de alto voltaje o por inyección de presión. En la primera, con el voltaje desconectado, se cambia el recipiente del amortiguador en el electrodo positivo por otro que contiene el espécimen, y se introduce este aplicando brevemente el voltaje. A continuación, tras desconectar de nuevo el voltaje, se sustituye el recipiente del amortiguador, se aplica otra vez el voltaje y comienza la separación. En la inyección de presión, se separa el capilar del recipiente positivo del amortiguador y se inserta en el espécimen. Este se introduce en el capilar aplicando presión, y luego se lleva el capilar al recipiente positivo del amortiguador y se aplica el alto voltaje. DETECTORES Los detectores principales que se utilizan en la electroforesis capilar son los de absorción en el ultravioleta/visible (UV/vis), de fluorescencia, de conductividad, los amperométricos y los de espectrometría de masas. Siempre que se pueda, la detección se realiza en la columna, antes de que los solutos hayan eluido del tubo capilar y se produzca un ensanchamiento de las bandas. El detector UV/vis es el más utilizado. La pequeña longitud de

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paso del capilar produce señales pequeñas y para aumentar la longitud de paso se emplean varios procedimientos. Los límites de detección son de unos 10-7 M. Utilizando la fluorescencia se obtienen límites mejores, y con láseres puede llegarse a límites de hasta 10-16 M. TIPOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR Hay varias formas de electroforesis capilar y cada una tiene sus ventajas. La más simple es la de zona (Capillary zone electrophoresis; electroforesis capilar de zona, CZE). En la electroforesis capilar en gel (CGE), se llena el capilar con un gel polimérico. Dado que este es poroso, los solutos migran a través del gel a una velocidad que depende tanto de la movilidad electroforética como de su tamaño. Este método es útil para solutos con movilidades similares, como los fragmentos deADN. APLICACIONES En los laboratorios clínicos, la electroforesis capilar se aplica para separar proteínas en líquidos biológicos, principalmente en el suero. Los sistemas de electroforesis capilar también automatizan el proteinograma, pues emplean la toma del espécimen de forma automática y realizan a la vez diversas separaciones usando varias columnas.

14.17. MICROSCOPÍA________________________________________________________________ Más información en capítulo 4.13 Microscopia óptica Mediante la microscopía óptica se pueden distinguir objetos separados por una distancia igual o superior a 0,2 μm. El microscopio compuesto, el más usado en nuestros días, contiene varias lentes que aumentan la imagen de una muestra bajo estudio. El aumento total es el producto del aumento de cada una de las lentes. La principal propiedad de cualquier microscopio es el poder de resolución o capacidad para distinguir dos objetos ubicados muy cercanos entre sí. Los microscopios compuestos se utilizan para estudiar muestras delgadas, puesto que su profundidad de campo es muy limitada. Por lo general, se utilizan para examinar cultivos, preparaciones trituradas o una lámina muy fina del material que sea. Normalmente depende de la luz que atraviese la muestra desde abajo y usualmente son necesarias técnicas especiales para aumentar el contraste de la imagen. La resolución de los microscopios ópticos está restringida por un fenómeno llamado difracción que, dependiendo de la apertura numérica (AN o AN) del sistema óptico y la longitud de onda de la luz utilizada (λ), establece un límite definido (d) a la resolución óptica. Suponiendo que las aberraciones ópticas fueran despreciables, la resolución sería: Normalmente, se supone una λ de 550 nm, correspondiente a la luz verde. Si el medio es el aire, la AN práctica máxima es de 0,95, y en el caso de aceite de hasta 1,5. Ello implica que incluso el mejor microscopio óptico está limitado a una resolución de unos 0,2 micrómetros. Microscopía de Fluorescencia El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se

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deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos. Las moléculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda más larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada. Los colorantes fluorescentes utilizados para la tinción celular son detectados con ayuda del microscopio de fluorescencia. Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepción de que la luz incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra (reflejada y fluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo.

14.18. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR__________________________________________ INTRODUCCIÓN El análisis de los genes mediante diversas técnicas, que de forma general se llaman de diagnóstico molecular, permite diagnosticar con rapidez y precisión enfermedades hereditarias, infecciosas y neoplásicas. Estas técnicas se están incorporando de forma progresiva a los laboratorios clínicos, donde van a ocupar un puesto importante. En este capítulo se presentan las principales características de las técnicas de diagnóstico molecular y su aplicación en los laboratorios clínicos.

AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Aunque las técnicas de amplificación de los ácidos nucleicos han hecho posible la realización de los análisis moleculares empleando directamente los especímenes sin necesidad de aislar los ácidos nucleicos, algunas técnicas de diagnóstico molecular requieren el aislamiento de los ácidos nucleicos. Una vez hecho esto, a menudo es necesario saber la cantidad de ácido nucleico. A continuación se exponen estas técnicas de aislamiento y cuantificación. - Especímenes El ácido nucleico puede obtenerse a partir de homogeneizados de tejidos o a partir de células sanguíneas. Los especímenes de tejidos sólidos deben romperse antes de comenzar cualquier procedimiento de aislamiento del ADN. Normalmente, esto se realiza sometiendo el espécimen a fuerzas mecánicas que proporcionen células individuales disociadas con un mínimo de lisis. La rotura mecánica se consigue, generalmente, con un homogeneizador. Sin embargo, cuando se desea ADN de gran peso molecular, deben inhibirse las nucleasas manteniendo los especímenes de tejido a temperaturas muy bajas. Para ello, justo después de la escisión, se congela el espécimen en nitrógeno líquido y a continuación se realiza la rotura pulverizando el tejido en presencia de hielo seco con un mezclador eléctrico o un mortero y un pistón. Tras sublimar el hielo seco de la mezcla de polvo resultante, pueden resuspenderse las células para iniciar el procedimiento de aislamiento del ADN. Para los especímenes de sangre, se recoge sangre con etilendiaminotetraacetato (EDTA) como anticoagulante. Aunque los leucocitos nucleados son sólo una pequeña minoría del total de las células sanguíneas, pueden separarse fácilmente del plasma y de los glóbulos rojos mediante centrifugación. La capa resultante de leucocitos se separa y se resuspende en un tampón adecuado para aislar el ADN. El contenido de este ácido de las células humanas es de unos 5 pg, y a partir de 20 mL de sangre anticoagulada con EDTA pueden obtenerse entre 250 y 500 μg.

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El diagnóstico prenatal requiere ADN del feto o de tejidos derivados de este, como las vellosidades coriónicas. Los especímenes de biopsías de estas vellosidades deben diseccionarse para separar el tejido fetal del materno. En algunas ocasiones, se emplea líquido amniótico para el diagnóstico prenatal. En este caso, las células se aislan por centrifugación y se emplean para extraer el ADN. - Aislamiento del ADN Los métodos de extracción de ADN pueden ser de extracción en fase líquida o en fase sólida. En los métodos de extracción en fase líquida existen muchas variaciones en los detalles de los protocolos de aislamiento, pero todos requieren, como primer paso la lisis de las células y los núcleos. Con este fin, se incuba la suspensión celular con detergentes y/o enzimas líticas. El paso siguiente es disociar el ADN de las proteínas que lleva unidas. La mayoría de los protocolos utilizan una enzima proteolítica fuerte como la proteinasa K. Este paso también inactiva las nucleasas celulares que degradan el ADN. Las proteínas parcialmente degradadas se eliminan de la disolución mediante una extracción con fenol/cloroformo o una precipitación salina. El ADN genómico que permanece en solución se precipita por adición de etanol. El ADN en forma de grumos puede recogerse con una varilla de vidrio. Se seca y se redisuelve en un tampón acuoso adecuado y, de esta forma, es estable durante varios años. Los métodos de extracción de ADN en fase sólida utilizan membranas de sílice o partículas magnéticas. En ambos casos el ADN se une de forma reversible a estas fases sólidas. Hay extractores automáticos de ADN, capaces de preparar varios especímenes en unas pocas horas y que hacen mínima la intervención de los operadores. Homogeinización

Lisis celular (detergentes, enzimas)

Disociación / Proteolísis (proteinasa K)

Extracción (fenol, cloroformo)

Precipitación (etanol)

Redisolución (amortiguador, Tris-EDTA)

- Aislamiento del ARN celular total A diferencia del ADN, el ARN tiene una cadena sencilla y es relativamente inestable. Durante el aislamiento y almacenamiento del mismo debe tenerse mucho cuidado para impedir que lo degraden las ribonucleasas (RNasas). Para aislar el ARN, las células o los tejidos se homogeneizan en una solución que contenga inhibidores de las RNasas, como el agente caotrópico isotiocianato de guanidinio. Igual que en el caso del ADN, existen métodos en fase líquida y fase sólida. Para el paso siguiente existen muchos métodos que implican separar el ARN del ADN genómico. Como en el aislamiento del ADN, el ARN purificado se precipita con etanol durante el paso final de todos los procedimientos. Las disoluciones acuosas de ARN deben almacenarse congeladas. - Aislamiento del ARN mensajero Muchas aplicaciones no pueden realizarse con ARN total y debe aislarse ARN mensajero (ARNm). Para ello se aprovecha la circunstancia de que la mayoría de los ARNm tienen una cola de poli-A. Se pasa el ARN celular total

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por una columna que contiene poli-dT unido a una fase sólida. El ARNm se une al poli-dT y queda retenido en la fa se sólida, el resto de ARN se eluye y, posteriormente, se eluye también el ARNm. - Determinación de la concentración de ácido nucleico La cantidad total de ADN de un espécimen puede determinarse midiendo su absorbancia a 260 nm y a 280 nm con un espectrofotómetro. La absorbancia a 260 nm se emplea para calcular la concentración de ADN. Una disolución de 50 μg/mL proporciona una absorbancia de 1, por lo que la concentración de ADN en el espécimen en μg/mL es igual a 50 X A260. El cociente de absorbancias 260/280 se utiliza para calcular la pureza de la preparación. Un cociente inferior a 1,8 indica que hay impurezas. La cantidad de ARN en una disolución se mide también por espectrometría. A 260 nm, una solución de este ácido de 40 μg/mL presenta una absorbancia de 1, por lo que la concentración de ARN en el espécimen, en μg/mL, es igual a 40 X A 260.

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DEL ADN La electroforesis es la principal técnica para separar las moléculas de ADN. Como en cualquier fragmento dado de este ácido la carga por unidad de longitud es la misma, debido a los grupos fosfato, todos los especímenes de ADN deberían moverse hacia el ánodo con la misma movilidad. Sin embargo, en los geles se consigue la separación debido a la resistencia al movimiento de los especímenes producida por la matriz del gel. Las moléculas más grandes de ADN tienen mayor dificultad para pasar a través de los poros de este, mientras que las moléculas más pequeñas están menos impedidas. Consecuentemente, la movilidad de las moléculas durante la electroforesis en gel depende del tamaño, de forma que las menores se mueven más rápido. - Electroforesis en geles de agarosa y poliacrilamida Existen dos tipos de matrices de gel que se emplean para los análisis de ADN: la de agarosa y la de políacrilamida. Los poros de los geles de agarosa tienen un tamaño comprendido entre 100 y 300 nm3, mientras que los de los geles de poliacrilamida tienen menor tamaño. Para adecuarse al intervalo de tamaño de las moléculas que van a separarse, hay que elegir las concentraciones del gel. Los geles que contienen un 0,3% de agarosa separan las moléculas de ADN de doble cadena de entre 5 y 60 kb, mientras que los que tienen un 2% se utilizan para las moléculas de entre 0,1 y 3 kb. Sin embargo, muchos laboratorios usan como rutina geles del 0,8% que son adecuados para separar moléculas de ADN en el margen de 0,5 a 10 kb. Los geles de poliacrilamida se usan para separar fragmentos de ADN más pequeños, ya que tienen mayor poder de resolución. Los geles más utilizados son aquellos cuya concentración de acrilamida está entre el 5 y el 15%, pues proporcionan buenas separaciones en el margen de 100 a 1.000 pares de bases. Como los geles separan el ADN según el tamaño, su peso molecular puede determinarse a partir de su movilidad electroforétíca, utilizando estándares de peso molecular conocido. Los geles de agarosa para ADN se corren de forma horizontal totalmente sumergidos en el amortiguador, por lo que la electroforesis de ADN recibe a menudo el nombre de submarina. Los geles habituales tienen una longitud de unos 25 cm y 12 cm de ancho, y se corren a un voltaje de 1,5 V/cm durante una noche. Para los análisis rápidos que no necesitan una separación muy grande de las moléculas de ADN, pueden utilizarse minigeles, que tienen menos de 10 cm de longitud. De esta forma, podrá obtenerse la separación en 2 o 3 h. Los geles de acrilamida suelen emplearse de forma vertical. Una vez que ha corrido el sistema, el ADN separado en los geles deberá teñirse y visualizarse. El reactivo más empleado es el colorante fluorescente bromuro de etidio. - Electroforesis en gel con campos pulsantes Generalmente, la electroforesis en gel no permite separar moléculas muy grandes de ADN debido a que un campo eléctrico estacionario las extiende, de forma que se mueven a lo largo del gel con un movimiento serpenteante, a una velocidad independiente de su longitud. La electroforesis en geles con campos pulsantes (PFGE) permite separar las moléculas muy grandes de ADN. En la PFGE, la dirección del campo eléctrico cambia periódicamente, lo que obliga a las moléculas a reorientarse antes de continuar su movimiento serpenteante a

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través del gel. Como esta reorientación requiere más tiempo de las moléculas grandes, estas se mueven más lentamente.

ENZIMAS UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR Para los estudios moleculares en los que hay que analizar el ADN se utilizan diversas enzimas. Las más importantes son las endonucleasas de restricción, las ADN ligasas, las ADN polimerasas y la transcriptasa inversa. Las endonucleasas de restricción se utilizan para cortar trozos grandes de ADN en fragmentos más pequeños y para preparar los fragmentos que van a clonarse. Estas endonucleasas reconocen secuencias de ADN con una longitud de 4 a 6 nucleótidos, que rompen de una forma definida. Reconocen secuencias palindrómicas, es decir, que se leen igual en ambas direcciones cuya rotura produce extremos cohesivos o romos. Las polímerasas son esenciales en los procedimientos de amplificación de los ácidos nucleicos. Por su parte, la transcriptasa inversa se emplea para hacer copias de ADN complementario (ADNc) de moléculas de ARN para su clonación, preparar sondas y analizar ácidos nucleicos.

TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Las técnicas de amplificación son aquellas que incrementan la cantidad de la diana o la señal con el fin de conseguir límites de detección adecuados. En la amplificación de la diana se produce un número elevado de copias de la región de interés en el ADN mediante métodos in vitro. En la amplificación de la señal, la cantidad de la diana permanece constante y se incrementa la señal por diversos métodos. Los principales métodos de amplificación de la diana son la reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (ligase chain reaction, LCR). Dentro de las técnicas de amplificación de la señal se encuentra la del ADN de cadena ramificada (branched-chain DNA).

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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) - Principios y proceso general El fundamento de la reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) es la repetición cíclica de tres reacciones simples, que varían sólo en la temperatura de incubación. Este método emplea una ADN polimerasa termoestable, grandes cantidades de los desoxinucleósidos trifosfato (trifosfato de desoxiadenosina [dATP], desoxiguanosina [dGTP], desoxicitidina [dCTP] y desoxitimidina [dTTP]) y dos oligonucleótidos cebadores de cadena sencilla, complementarios de secuencias conocidas del ADN diana.

Mecanismo de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa - El primer paso es desnaturalizar por calentamiento a gran temperatura el ADN nativo de doble cadena para obtener cadenas sencillas. - En el segundo paso, que se realiza a temperatura reducida, los dos oligonucleótidos cebadores se hibridan con sus secuencias complementarias en las cadenas opuestas del ADN que se quiere amplificar. Se eligen oligonucleótidos que encierren el material genético que se desea amplificar. Los dos cebadores no deben hibridarse uno con otro y sus lugares de hibridación deben encontrarse lo bastante alejados entre sí para que sea posible sintetizar productos nuevos. La especificidad del método deriva de la precisión, aun con cebadores cortos, de esta reacción de hibridación ADN:ADN. La especificidad de la hibridación puede controlarse ajustando la temperatura, de forma que se pueda amplificar las secuencias flanqueadas por regiones similares, aunque no idénticas, en complementariedad con los cebadores. - El tercer paso es sintetizar una segunda cadena complementaria de nuevo ADN, que se produce al extenderse cada cebador utilizando la ADN polimerasa Taq (de la bacteria Thermus aquaticus), en presencia de un exceso de desoxirribonucleósidos trifosfato, y copiando la secuencia de ADN molde adyacente. Por cada cebador se sintetiza una nueva cadena. Las propias cadenas de ADN resintetizadas son moldes de los cebadores, por lo que los ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación del cebador y extensión producen una acumulación exponencial del ADN.

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Los dos cebadores y los cuatro desoxirribonucléosidos trifosfato deben hallarse inicialmente en grandes cantidades respecto a la cantidad de ADN o sustrato, ya que los cebadores son necesarios para comenzar cada cadena de ADN, y los desoxirribonucleósidos, para sintetizarlas. Tras la extensión de los cebadores el ciclo se repite. Primero, aumentando la temperatura de modo que todo el ADN de doble cadena se convierta en ADN de cadena sencilla y abortando cualquier polimerización que avance; y luego, disminuyendo la temperatura para que puedan tener lugar los pasos de hibridación y extensión. Un ejemplo de las condiciones de un proceso de PCR es: • Desnaturalización inicial 94 °C/5 min • 25 ciclos de: Desnaturalización 94 °C/1 min Hibridación 60 °C/1 min Extensión 70 °C/1 min • Extensión final 70 °C/10 min El proceso dura aproximadamente 2 h y el volumen de reacción se mantiene aproximadamente en 100 μl. El proceso de PCR no requiere purificar el ADN que se amplifica. Las proteínas contaminantes que pueden interferir se inactivan durante el paso inicial de desnaturalización. El procedimiento exige también conocer suficientemente la secuencia del ADN sustrato, al menos la del lugar de hibridación de los cebadores, para poder sintetizar los cebadores complementarios adecuados. En la actualidad se comercializan equipos de reactivos para realizar los procesos de PCR, Contienen todos los reactivos necesarios para realizar la amplificación (ADN polimerasa Taq, dATP, dTTP, dGTP, dCTP y amortiguadores), excepto el ADN que se quiere amplificar y los oligonucleótidos cebadores correspondientes. - Cantidad de amplificación La cantidad de amplificación del proceso de PCR viene dada por la fórmula: N = n (1 + E)c donde N = cantidad de producto final; n = cantidad inicial de fragmentos de ADN diana que van a amplificarse; E = eficacia media; c = número de ciclos. La amplificación del proceso de PCR es geométrica. La visualización de una banda en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio requiere alrededor de 1012 pb. Así, en condiciones óptimas, una sola molécula de 100 nucleótidos produce una banda adecuada tras 39 ciclos. Sin embargo, 105 moléculas de 100 nucleótidos producirán la misma cantidad de ADN tras sólo 21 ciclos. Tras 20 ciclos, una eficacia del 100% producirá N = (1 + 1)20 = 1.048.576 moléculas, mientras que con un 80% de eficacia sólo producirán N = (1 + 0,8)20 = 127.482 moléculas, tras el mismo número de ciclos; esto es, el rendimiento sólo será del 12%. En esta situación, siempre que se tengan diez copias del molde por reacción se tendrá un 100% de casos positivos, mientras que cinco copias producirán un 99%, y una copia, sólo un 63%. - Proceso de amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa -

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- Automatización Dado que las tres reacciones del proceso de PCR tienen lugar en el mismo tubo de reacción y todos los componentes (polimerasa Taq, cebadores y desoxirribonucleósidos trifosfato) son termoestables, esta técnica es fácil de automatizar. Se ha conseguido utilizando el llamado amplificador de ADN o termociclador. El proceso puede realizarse en tubos de microcentrífuga, placas de microtitulación o tubos capilares. - Amplificación múltiplex Se denomina amplificación múltiplex al método que se usa para amplificar más de un fragmento simultáneamente durante un proceso de PCR. Los cebadores deben elegirse de forma que no hibriden entre sí y que generen fragmentos de tamaños diferentes para que puedan separarse adecuadamente por electroforesis en gel. Al aumentar el número de fragmentos que se amplifican a la vez, hay que aumentar el tiempo de extensión que puede ser de hasta varios minutos por ciclo. La gran sensibilidad del proceso de PCR lo hace muy vulnerable a la contaminación por cantidades mínimas arrastradas de experimentos anteriores. Cuando se realice este proceso deben extremarse las precauciones para minimizar la formación de aerosoles y otras posibilidades de contaminación. Deben separarse físicamente las áreas del laboratorio donde se efectúen las PCR de aquellas en las que se analicen los productos de la reacción. Hay que tener un gran cuidado con las pipetas, las puntas de pipeta y los reactivos. - Detección y análisis de los productos El método más empleado para analizar los productos del proceso de PCR es la electroforesis en gel. Se utilizan geles de agarosa o de poliacrilamida, según el tamaño de las secuencias de ADN amplificadas. Los productos de amplificación separados en el gel pueden visualizarse directamente con colorantes fluorescentes como el bromuro de etidio. La forma más frecuente de identificar los productos del proceso de PCR es usar sondas marcadas con las que hibridar, bien en fase sólida o en fase líquida. Las sondas pueden marcarse con isótopos radiactivos o con marcadores no radiactivos. El isótopo radiactivo más utilizado para este fin es el 32P. Para la rutina de los laboratorios clínicos se prefieren los marcajes no radiactivos. Se han utilizado sondas de oligonucleótidos marcadas con esteres de acridinio, peroxidasa, fosfatasa alcalina, digoxigenina, colorantes fluorescentes y quimioluminiscencia. Los productos del proceso de PCR pueden secuenciarse para su detección. Se han descrito varios protocolos para la secuenciación directa de estos productos. Tras eliminar los desoxinucleótidos y los cebadores que no se hayan utilizado, el producto de doble cadena podrá secuenciarse por los métodos habituales. Puede obtenerse el producto del proceso de PCR de una sola cadena mediante una técnica llamada reacción en cadena de la polimerasa asimétrica, en la que se utiliza una cantidad mucho menor de uno de los cebadores, la digestión enzimática selectiva de una de las cadenas o la captura selectiva de una de ellas marcando un oligonucleótido con biotina e inmovilizando el producto sobre lechos magnéticos recubiertos de estreptavidina. El ADN amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa también se cuantifica e identifica mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). - Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o a tiempo real Esta técnica permite obtener la concentración inicial del ADNmolde. Uno de los métodos más utilizados es el sistema de detección 5'-nucleotidasa o prueba Taq-Man. En esta se marca uno de los oligonucleótidos cebadores con un compuesto fluorescente y una molécula apagadora en cada extremo. Cuando los cebadores se unan a su secuencia diana, la actividad 5-exonucleasa de la polimerasa Taq degradará y liberará el compuesto fluorescente del apagador. De esta forma, se generará una señal que aumentará de forma proporcional al número de moléculas iniciales. El sistema de detección es capaz de inducir y detectar la fluorescencia en tiempo real a medida que avanza el proceso de PCR.

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REACCIÓN EN CADENA DE LA LIGASA El método de reacción en cadena de la ligasa utiliza una ligasa termoestable. Se utilizan cuatro cebadores que hibridan en regiones inmediatamente adyacentes al molde. Dos de ellos hibridan con la cadena superior. El segundo par de cebadores es complementario del primero e hibrida con la cadena opuesta. La hibridación entre los cebadores se evita incluyendo ADN portador y una cola 39 en cebadores opuestos. Estos cebadores se mezclan con el molde y la ligasa termoestable/ y se incuban a 95 °C durante 1 min para la desnaturalización, y a continuación a 65 °C durante 4 min para la hibridación del cebador y la ligazón. Los pasos de desnaturalización y alineación/ligazón se repiten 10-20 ciclos. La amplificación se produce sólo tras la ligazón de los oligonucleótidos adyacentes. El cebador de adelante debe estar fosforilado en el extremo 5', ya que la ADN ligasa requiere como sustrato un 5'-fosforilado y un 3' libre. El cebador 5' está marcado en su extremo con 32P, y los productos amplificados se observan tras la electroforesis en gel y la autorradiografía. Alternativamente, para la detección no radiactiva de estos productos pueden sintetizarse cebadores que lleven biotina.

MÉTODO DEL ADN DE CADENA RAMIFICADA Este método amplifica la señal. Para ello se hace hibridar el ácido nucleico diana con un gran número de sondas de captura fijadas a un pocilio. A continuación se produce la hibridación con una serie de sondas de extensión. El resultado final es una sonda de amplificación muy ramificada con muchas copias de enzimas generadoras de señal que actúan sobre un sustrato quimioluminiscente para producir la luz. SONDAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS Una sonda es un fragmento de ácido nucleico que se usa para el reconocimiento específico de una molécula determinada de ácido nucleico de cadena sencilla en un proceso de hibridación. Las sondas pueden o no estar marcadas con una o varias moléculas reporteras dependiendo de la técnica utilizada para detectar la hibridación. Las sondas pueden obtenerse por clonación, producirse mediante PCR o sintetizarse.

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- Sondas clonadas Se obtienen mediante técnicas de ADN recombinante insertando el fragmento de ADN en un plásmido que luego se propaga en una bacteria. La sonda resultante es de doble cadena y debe desnaturalizarse antes de ser utilizada. - Sondas producidas por PCR Durante la amplificación, el producto de la PCR se marca utilizando nudeótidos radiactivos o un compuesto fluorescente. - Sondas de oligonucleótidos Estas sondas tienen una longitud de entre 15 y 45 nucleótidos, son de cadena sencilla y se sintetizan por métodos químicos a partir de una secuencia especificada. Se sintetizan con sistemas automáticos que emplean el método en fase sólida de la fosforamidita. Para ello, se une el primer nucleótido por su hidroxilo 3' a la matriz sólida. A continuación se añade el segundo nucleótido, con un grupo fosforamidita en su hidroxilo 3' y otro bloqueante en el hidroxilo 5', con lo que se produce la reacción de unión de los dos nucleótidos. Luego se elimina el grupo bloqueante del extremo 5' del segundo nucleótido, se añade el tercer nucleótido con un grupo fosforamidita en el extremo 3' y otro bloqueante en el hidroxilo 5', y se repite el proceso anterior. De esta forma, se va sintetizando la secuencia programada desde el extremo 3' al 5'. El sintetizador de ADN ensambla oligonucleótidos con una longitud de hasta 200 nucleótidos y una tasa de síntesis de 12 a 15 min. por ciclo. Las principales características de las sondas de oligonucleótidos sintéticos son su producción rápida y barata y su excelente estabilidad. Sus desventajas más importantes son que exigen conocer la secuencia de nucleótidos con la que van a hibridar, y unas condiciones de hibridación y de lavado más rigurosas.

MARCAJE DE LAS SONDAS DA ÁCIDOS NUCLEICOS Las sondas se marcan durante su síntesis o, posteriormente, utilizando isótopos radiactivos o marcadores no radiactivos. La actividad específica de la sonda depende de la del mareaje introducido en ella y de la densidad de este. El isótopo radiactivo más utilizado para marcar los nucleótidos en la mayoría de las técnicas de ADN es el 32P, mientras que el 3H y el 35S se usan principalmente para la hibridación in situ. Como la mayoría de los isótopos utilizados para marcar las sondas de ácidos nucleicos tienen una vida media corta, hay que preparar las sondas frecuentemente. Las marcadas con isótopos radiactivos se detectan cuantitativamente por contaje en centelleo líquido, y cualitativamente por autorradiografía, por exposición sobre una película fotográfica. El límite de detección es de 0,2 a 1 pg de ADN. Para la rutina en los laboratorios clínicos se prefieren los marcajes no radiactivos. Pueden ser directos, uniendo directamente el marcador al ácido nucleico mediante un enlace covalente, o indirectos, uniendo un hapteno al ácido nucleico que luego se detecta. Se dispone de varios procedimientos para introducir marcajes no radiactivos en las moléculas de ADN de cadena sencilla; entre otros, la biotinilación covalente, la biotinilación enzimática y la poliadenilación, así como la unión directa de enzimas marcadoras, como la fosfatasa alcalina y la peroxidasa. La estrategia general para el mareaje no isotópico de los oligonucleótidos sintéticos comprende cinco pasos básicos: síntesis de los oligonucleótidos; funcionalizacíón de los mismos; rotura y desprotección en soporte sólido; unión del marcaje; y purificación y análisis.

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS La hibridación es el proceso de complementación de pares de bases entre dos cadenas sencillas de ADN, ADN y ARN, o ARN con y sin sentido. La fuerza de hibridación entre las secuencias de los ácidos nucleicos es proporcional a su grado de homología.

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La sensibilidad de las reacciones de hibridación entre un fragmento de ADN y una sonda depende de varios factores. Los más importantes son la longitud y la complementariedad de la sonda, la concentración de esta, las condiciones de hibridación, la actividad específica de la sonda marcada y la concentración del ADN que se va a identificar. En la mayoría de los casos, el fin principal de la hibridación es conseguir la máxima interacción entre la sonda y la molécula de ácido nucleico que se quiere detectar. Cuando la molécula de ácido nucleico está inmovilizada sobre un soporte sólido, se establecen unas condiciones de hibridación que hagan máximas las interacciones con la sonda, independientemente de la especificidad de las uniones. A continuación, se establece la especificidad aumentando gradualmente el rigor de las soluciones de lavado, desde condiciones permisivas con bajas temperaturas y fuerzas iónicas elevadas hasta condiciones muy rigurosas con altas temperaturas y fuerzas iónicas bajas. Como en toda técnica analítica, hay que procesar controles positivos y negativos. Los primeros contienen secuencias complementarias de la sonda. Se utilizan para comprobar que la preparación del espécimen es adecuada para producir la hibridación y para asegurar que la sonda hibridará de forma específica en las condiciones de la prueba. La sonda de control puede emplearse también para valorar la sensibilidad de la prueba, cuando se elija un control positivo cercano al límite inferior de detección. Por su parte, el control negativo, esto es, un espécimen que no contenga secuencias complementarias a las de la sonda, se utiliza para valorar la especificidad de las interacciones sonda-diana. Los controles de la sonda incluyen secuencias vector o sondas no relacionadas que se marcan, hibridan y detectan en condiciones idénticas a las de la prueba. Estos controles permiten seguir la señal de fondo generada por la localización de la sonda mediante el atrapamiento físico o interacciones de carga sin hibridación. Hay varias técnicas de hibridación; las más usadas son la hibridación en disolución, la hibridación directa, la hibridación sandwich y la hibridación in situ. - Hibridación en disolución En la hibridación en disolución, la sonda y el espécimen interaccionan en disolución. La hibridación puede detectarse por la unión específica de los híbridos a una matriz sólida, como la hidroxiapatita, que une sólo estructuras dúplex. Una vez unidos los híbridos, la sonda que no ha hibridado puede eliminarse mediante lavado. La detección del marcaje en la sonda unida permite cuantificar la reacción de hibridación. Como en este tipo de hibridación sólo se desean los híbridos de la sonda con las moléculas de ácido nucleico que quieren detectarse, sus condiciones de hibridación son mucho más rigurosas que en otras técnicas. Se establecen las condiciones óptimas de cada variable, como la temperatura y la fuerza iónica, para maximizar el número de especies específicas que permanecen tras completarse la hibridación. - Hibridación directa Consiste en la reacción de las sondas marcadas de cadena sencilla con el ADN o el ARN del espécimen que se ha desnaturalizado e inmovilizado sobre un soporte sólido. Después de la reacción, la fase sólida se lava y se cuantifica la sonda hibridada. Los métodos de hibridación directa más empleados son la hibridación en filtro, la transferencia Southern y la transferencia Northern. • Hibridación en filtro La hibridación en nitro es la técnica de hibridación más simple. Consiste en colocar ADN o ARN desnaturalizados, extraído de células o tejidos, sobre una membrana que actúa como soporte inerte del ácido nucleico y lo hace accesible a la hibridación con las sondas marcadas. La modificación más efectiva de esta técnica es el llamado dot blot, que permite procesar fácilmente sobre una misma membrana más de 70 especímenes diferentes. Las principales ventajas de este método son su rapidez, ya que no requiere un tratamiento con enzimas de restricción ni electroforesis en gel, y que puede utilizarse para muchos especímenes a la vez. Que todos los especímenes y controles estén expuestos exactamente a los misinos reactivos y condiciones aumenta la coherencia interna de la prueba. La técnica es muy sensible, aunque a veces no sea muy específica. • Transferencia Southern En la transferencia Southern se separan los fragmentos de ADN, obtenidos tras la acción de una endonucleasa de restricción, por electroforesis en gel de acuerdo con su tamaño. Los fragmentos mayores se mueven más lentos que los pequeños. Una vez separados los fragmentos se transfieren a una membrana inerte de nailon y la

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separación producida permanece en el gel. Para transferir los fragmentos de ADN del gel al soporte sólido, generalmente se emplea un tratamiento ácido que elimina las purinas y fragmenta los trozos de ADN separados, haciéndolos más pequeños y fáciles de eluir del gel. Luego se desnaturalizan las bases, ya que las cadenas sencillas se unen a las membranas con mayor eficacia, y se neutraliza. Los primeros métodos de transferencia utilizaban la acción capilar con la membrana en contacto con el gel. En la parte superior se colocaba un papel absorbente para embeber el tampón de transferencia y el ADN al filtro. Así se permitía que se produjera la transferencia durante la noche. En cambio, en la actualidad, se emplean sistemas de vacío o de presión para acelerar la transferencia. Consumada esta, el ADN se inmoviliza de forma permanente sobre el filtro, por calentamiento o tratamiento con luz ultravioleta. En este momento, el filtro está listo para la hibridación. Para ello, se sumerge la membrana en una solución de hibridación que contiene la sonda marcada de cadena sencilla. En la membrana tiene lugar la reacción de hibridación con la sonda, fijándose esta a las secuencias complementarias, por lo que es retenida en el filtro en aquellas posiciones donde haya fragmentos complementarios de ADN de la sonda marcada. Transcurrido el tiempo suficiente para que se produzca el proceso de fijado, se saca la membrana de la solución de hibridación y se lava. La localización de los fragmentos que hayan hibridado se realiza por autorradiografía, si la sonda estaba marcada radiactivamente, o mediante otras técnicas, si se usaron sondas marcadas con compuestos no radiactivos. La interpretación se lleva a cabo observando las bandas por autorradiografía o espectroscopia, que indican la presencia de ácido nucleico en el espécimen que híbrida con la sonda aplicada. La ausencia de bandas indicará que no hay secuencias complementarias. • Transferencia Northern La técnica de transferencia Northern es similar a la Southern, pero se utiliza para detectar la presencia de moléculas específicas de ARN. Para ello, se desnaturalizan las moléculas de ARN tratándolas con formamida o glioxal, que rompen los puentes de hidrógeno entre los pares de bases, para asegurar que el ARN esté en forma lineal sin pliegues. A continuación, se realiza una electroforesis en gel del ARN y luego se transfiere a la membrana de nailon. Se produce la hibridación con una sonda de ADN marcada complementaria del ARN, y después se lleva a cabo la autorradiografía. Las transferencias Southern y Northern no sólo proporcionan información sobre la presencia de moléculas que hibridan, sino que también permiten determinar el tamaño molecular de las especies híbridantes. - Hibridación sandwich Este tipo de hibridación requiere dos fragmentos diferentes de ácido nucleico de dos partes adyacentes, aunque no solapantes, del genoma. Utiliza un sistema de tres componentes: una sonda de captura unida a una fase sólida, el fragmento de ADN diana y una sonda que genera la señal. Se inmoviliza la sonda captora de ADN de cadena sencilla sobre un soporte sólido y se añade el espécimen junto con la sonda marcada. Si el resultado es positivo, el ADN del espécimen hibridará con los del filtro y de la sonda marcada, uniendo la sonda al filtro. El fragmento de ADN que quiere detectarse actúa como enlace de la sonda sobre el soporte sólido y la sonda generadora de la señal. Debido a que los ADN que se utilizan como reactivos no tienen secuencias comunes, no se formarán híbridos con ácidos nucleicos incorrectos. El resultado de la reacción de unión es un sandwich de hibridación con tres ADN componentes. - Hibridación in situ La hibridación in situ permite detectar secuencias específicas deADN genómico o de ARNm en secciones de tejidos intactas, células dispersas o preparaciones cromosómicas. Permite demostrar la información genética dentro de un contexto morfológico y es análoga a la inmunohistoquímica. La sensibilidad de la hibridación in situ está limitada por varias variables, incluidas la conservación del ácido nucleico durante la fijación, la accesibilidad de la sonda molecular a los ácidos nucleicos durante la hibridación, la actividad específica de la sonda marcada y la sensibilidad del sistema de detección. El tejido se trata con una proteasa para que la sonda pueda acceder al ADN nuclear que se desnaturaliza por calor. Se añade la sonda en un amortiguador y la hibridación se produce cuando se halle presente ADN complementario. Con un lavado se separan la sonda marcada no unida y las secuencias mal apareadas.

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Después se detecta la sonda con diversos métodos. Para la hibridación in situ con todo tipo de sondas moleculares se han utilizado sistemas de detección isotópicos y no isotópicos. Las sondas de ARN complementario (ARNc) marcadas radiactivamente son las más sensibles para detectar números pequeños de copias de secuencias específicas de ARNm o de ADN en secciones de tejidos. En cuanto a las sondas de ADN marcadas con sustancias fluorescentes, son las más útiles para células intactas en la hibridación in situ con detección por citometría de flujo y ofrecen un gran potencial para las preparaciones cromosómicas. La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) utiliza sondas de ADN marcadas con fluorescencia que hibridan con cromosomas desperdigados para detectar no sólo la presencia o la ausencia de la región cromosómica correspondiente a la sonda, sino también su posición en el genoma. Pueden usarse de forma simultánea varias sondas marcadas con diferentes compuestos fluorescentes. La técnica FISH es particularmente adecuada para detectar aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones y reagrupamientos complejos. Se ha combinado la hibridación in situ con la inmunocitoquímica para detectar ARN y proteínas víricas en la misma célula. Una modificación de la hibridación in situ es la cuantificación de la fluorescencia de la hibridación de secuencias de ADN de núcleos en interfase en suspensión mediante la citometría de flujo.

SECUENCIACIÓN DE ADN Método de Sanger automatizado La secuenciación de ADN se realiza en la actualidad de forma rutinaria en los laboratorios clínicos. El método más habitual utiliza un paso inicial de PCR para amplificar la región que se desea secuenciar y luego se introduce la secuenciación empleando una modificación del método de Sanger de terminación de cadena. De acuerdo con este método, a partir de un ADN molde monocatenario y de un cebador marcado radiactivamente, utilizando la ADN polimerasa de Escherichia coli se preparan cuatro sistemas de reacción, cada uno de los cuales tiene los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato y uno de los cuatro desoxirribonucleósidos en cada sistema en forma de 2',3'-didesoxirribonucleósido. Estos compuestos detienen la síntesis de la cadena, ya que no tienen el grupo 3'OH. La incorporación del análogo tiene lugar al azar, por lo que cada sistema produce una mezcla de cadenas marcadas que terminan con el mismo nucleótido. Se separan los fragmentos marcados radiactivamente por electroforesis en gel de poliacrilamida en cuatro calles adyacentes, una para cada nucleótido según su tamaño. Mediante autorradiografía, se obtiene una imagen de los fragmentos separados. La secuencia de nucleótidos del segmento de ADN se deduce a partir del orden de tamaños de los fragmentos del ácido resueltos en las cuatro calles. En el método de Sanger, cada una de las cuatro reacciones puede codificarse también con un color, utilizando cebadores de secuencia marcados con un compuesto fluorescente distinto. Los productos pueden combinarse y separarse en una sola calle de un gel de poliacrilamida o utilizando electroforesis capilar. Con un láser, se dirige el rayo hacia un segmento horizontal de la parte baja del gel o en la salida del capilar electroforético. Al pasar los fragmentos marcados con el compuesto fluorescente, se excitan y producen la fluorescencia. Tras pasar a través de cuatro filtros fluorescentes sobre una rueda que gira, la luz emitida se recoge en un detector. La identidad del nucleótido terminador de cada fragmento que pasa se identifica por la fluorescencia asociada con él. Asimismo, el orden temporal de las moléculas fluorescentes que pasan se traduce automáticamente en una secuencia lineal de ADN que se almacena en el ordenador. Con este método se obtienen con facilidad secuencias de hasta 600 nucleótidos.

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Método de Sanger de secuenciación de ADN

- Pirosecuenciación La pirosecuenciación es un método para determinar la secuencia de fragmentos cortos de ácidos nucleicos sin necesidad de electroforesis. Se híbrida un cebador de secuenciación con un molde monocatenario generado por PCR. En la mezcla de reacción se incluyen cuatro enzimas: ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa; y dos sustratos: adenosina 5'-fosfosulfato y luciferina. Se añade uno de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato a la reacción. Si la base es complementaria de la cadena molde, la ADN polimerasa cataliza su incorporación. Cada incorporación produce la liberación de pirofosfato (PPi) que se determina por la conversión con la adenosina 5rfosfosulfato en ATP por la ATP sulfurilasa. Luego el ATP produce la conversión de la luciferina en oxilucíferina que genera luz visible. La luz producida es proporcional al número de nucleótidos incorporados. La apirasa degrada continuamente el ATP y los desoxinucleótidos no incorporados. El proceso se repite añadiendo cada vez un desoxinucleótído, con lo que se determina la secuencia de la cadena complementaria del ADN. La técnica está automatizada.

DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES GENÉTICAS Las enfermedades genéticas se producen a consecuencia de cambios del ADN. De hecho, se conocen los genes alterados de muchas enfermedades genéticas. Con frecuencia, el gen que codifica una proteína determinada presenta formas diferentes en las personas normales. Se denomina alelos a los múltiples genes del mismo locus genético que codifican la misma proteína. De cada locus, cada persona posee dos alelos, uno del padre y otro de la madre. Si los dos son iguales, la persona se llama homocigoto, mientras que si son distintos, se denomina heterocigoto. La existencia de alelos se debe a las mutaciones de un precursor producidas durante la evolución de las especies. Los alelos suelen diferenciarse en el cambio de una base por otra, que generalmente es una mutación de sentido erróneo. En la mayoría de los casos, las proteínas producidas por los alelos de un locus dado funcionan de forma

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análoga, debido a que la diferencia del aminoácido no suele afectar la estructura ni la función de la proteína. La mayoría de los loci genéticos presentan un alelo normal, que es el que tiene la mayoría de la población, y alelos alternativos raros. Sin embargo, existen algunos loci que no presentan un alelo con la frecuencia suficiente para llamarle normal. Esta situación representa un ejemplo extremo de polimorfismo genético. En términos estrictos, se dice que hay polimorfismo cuando el alelo más común de un locus genético dado representa menos del 99% de los alelos de la población. Por definición, cuando existe polimorfismo en un locus, al menos el 2% de la población debe ser heterocigota para ese locus. Las enfermedades genéticas pueden clasificarse así: Alteraciones cromosómicas. Suponen la pérdida, el incremento o el agrupamiento anómalo de uno o más cromosomas. • Alteraciones mendelianas o monogénicas. Son aquellas en las que se afecta un único gen. Según su forma de herencia se agrupan en: a) autosómicas dominantes, que afectan a heterocigotos para el gen mutado con una copia defectuosa del gen; b) autosómicas recesivas, que afectan a los homocigotos con dos copias defectuosas del gen; c) recesivas ligadas al sexo, que afectan sobre todo a los varones con una mutación en la única copia de un gen ligado al cromosoma X, y d) dominantes ligadas al sexo, que son muy raras. En algunas enfermedades monogénicas se ha detectado una sola alteración de la secuencia de ADN, pero lo más frecuente es que existan varias alteraciones, lo que produce variantes de la misma enfermedad. • Alteraciones multigenicas. Se producen por interacción entre varios genes y varios factores exógenos o ambientales. • Alteraciones del ADN mitocondrial. Se heredan por vía materna. •

En el diagnóstico molecular, el problema principal es la heterogeneidad de las alteraciones genéticas de las enfermedades hereditarias. La función genética puede modificarse por una gran variedad de cambios, que van desde la pérdida completa de un gen a la sustitución de una base por otra en un nucleótido del ADN. A nivel molecular, algunas enfermedades son relativamente homogéneas, como la anemia drepanocítica, en la que siempre se encuentra la sustitución de A →T en el sexto codón del gen de la β-globina, mientras que otras tienen un gran número de mutaciones diferentes. La posibilidad de una gran variabilidad complica el diseño de una prueba que trate de detectar todas las alteraciones en una misma enfermedad. - Elección de las técnicas Las alteraciones voluminosas de los genes, como las pérdidas, las inserciones o los reagrupamientos de cientos, miles o más pares de bases y potencialmente muchos genes pueden detectarse mediante el análisis microscópico de preparaciones de cromosomas teñidos en metafase. Sin embargo, la mayoría de las pérdidas son demasiado pequeñas para la microscopía óptica, aunque con frecuencia pueden verse con FISH. La alteración genética más dramática es la pérdida de un gen entero o de una parte importante de un gen. Es difícil detectar estos cambios, ya que, como los genes no ligados al sexo están en dos copias, el gen normal tiende a enmascarar la pérdida de toda la otra copia o parte de ella. Los genes ligados a X son fáciles de detectar, pues como el varón tiene un solo cromosoma X, la pérdida de una secuencia de X no deja otra representación de la misma. Por lo tanto, una transferencia Southern después de tratar el ADN con una endonucleasa de restricción mostrará la ausencia de una banda. Un procedimiento más rápido es usar la PCR para amplificar la secuencia deseada. El tamaño del producto amplificado puede determinarse por electroforesis en gel de agarosa. También pueden utilizarse diferentes cebadores. El uso de la PCR es especialmente útil para las enfermedades ligadas al cromosoma X, donde sólo hay una copia del gen. Las mutaciones puntuales pueden detectarse por: • Análisis con endonucleasas de restricción (con o sin PCR). • Hibridación con oligonucleótidos (con o sin PCR).

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• • • •

Análisis de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Análisis heterodúplex. Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante tras una PCR. Secuencíación de nucleótidos tras una PCR.

Análisis con endonucleasas de restricción Algunas mutaciones puntuales pueden detectarse mediante análisis con endonucleasas de restricción, cuando la enzima corte en el lugar de la mutación, esto es, la mutación elimine o cree una secuencia de nucleótidos que reconozca una determinada enzima. Sólo alrededor del 5 al 10% de las mutaciones puntuales pueden detectarse por los análisis con endonucleasas de restricción. Como los dinucleótidos CG son lugares hipervariables del genoma humano, las enzimas que los poseen en su secuencia de reconocimiento, como la TaqI y la MspI, son muy útiles para detectar las mutaciones que se producen en esos lugares. La aplicación de la técnica de PCR al análisis con endonucleasas de restricción ha aumentado mucho su rendimiento. La ventaja principal que aporta la PCR es que pueden utilizarse enzimas que tengan una secuencia de reconocimiento de cuatro nucleótidos, y estudiar por ende pequeños fragmentos de ADN. Además, el uso de la PCR hace innecesarios los isótopos radiactivos. Hibridación con oligonucleótidos Otra forma de detectar mutaciones puntuales conocidas es la hibridación con olinogucleótidos. Como sondas, se utilizan oligonucleótidos sintéticos que reconocen específicamente los alelos normal y mutante. La hibridación con oligonucleótidos puede realizarse con ADN genómico o con secuencias de ADN amplificadas por PCR. Análisis de polimorfismos de conformación de cadena sencilla El análisis de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (single-strand conformation polymorphisms, SSCP) es una técnica en la que se amplifica mediante PCR la región del gen que quiere estudiarse. El producto amplificado de doble cadena se desnaturaliza por medio de calor y se realiza una electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Durante esta, los fragmentos de ADN de cadena sencilla se pliegan en una forma tridimensional de acuerdo con su secuencia. La separación depende, por tanto, de la forma de las moléculas de cadena sencilla. Si los productos normal y mutante difieren en algún nucleótido adoptarán estructuras tridimensionales diferentes y mostrarán distintas movilidades electroforéticas. Análisis heterodúplex En esta técnica se mezcla un fragmento de ADN normal con el fragmento mutante. Se forma un heterodúplex con un mal apareamiento, que proporciona una movilidad electroforática diferente. Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) se basa en la diferente desnaturalización de las moléculas de ADN de doble cadena de acuerdo con sus secuencias. Un cambio de la secuencia del ADN de doble cadena debido a una mutación cambia la temperatura de fusión del ADN, y esto produce la separación parcial de la cadena de ADN en el lugar de un mal apareamiento y altera la movilidad del ADN mal apareado en un gel desnaturalizante. En esta técnica se amplifican mediante PCR fragmentos de ADN de personas normales y afectadas, y se realiza una electroforesis en gel de poliacrilamida con una concentración creciente de agentes desnaturalizantes, como la urea o la formamida. Las moléculas de ADN con sólo un mal apareamiento de bases presentan una movilidad diferente y pueden detectarse con esta técnica. Secuenciación del producto amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa La secuenciación del producto amplificado por la PCR se está convirtiendo en el método principal para detectar mutaciones. La secuenciación no sólo detecta la mutación, sino que también define su naturaleza. El método más utilizado para secuenciar ADN es el de Sanger en su forma automatizada.

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- Algunos ejemplos de enfermedades específicas Fibrosis quística La fibrosis quística es una de las enfermedades de origen genético más frecuente. Es una enfermedad multiorgánica que afecta sobre todo a los aparatos respiratorio, digestivo y reproductor. El gen se encuentra en el cromosoma 7 en 7q31 y es muy grande, con 27 exones. El gen codifica una proteína grande (1.480 aminoácidos) que actúa como canal iónico a la que se ha llamado regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística. Se han identificado más de 800 mutaciones que producen la enfermedad. La principal es la pérdida de ios tres nucleótidos del codón 508 que codifica la fenilalanina (ΔF508). Esta mutación representa alrededor del 50% de los casos de mutación en la población española. Por otra parte, en España, menos de 20 mutaciones engloban la mayoría de los casos de fibrosis quística, pero a pesar de este número relativamente pequeño, es imposible excluir la enfermedad sólo con el análisis de ADN. Para el diagnóstico se utiliza la amplificación por PCR y la hibridación. Distrofia muscular de Duchenne La distrofia muscular de Duchenne es una enfermedad recesiva ligada al cromosoma X que la produce la mutación de una proteína que se llama distrofina. Un 65% de las mutaciones son delecciones de parte del gen, mientras que el resto son duplicaciones (5%) y mutaciones puntuales (35%). Las delecciones suelen detectarse mediante PCR multiplex, que amplifica simultáneamente varios exones de diferentes regiones del gen. Para las mutaciones puntuales se emplean otras técnicas, como los SSCP y la DGGE, seguida de la secuenciación. Enfermedades neurodegenerativas Entre las enfermedades neurodegenerativas hay dos grandes categorías: las enfermedades producidas por expansiones de trinudeótidos repetidos y las producidas por depósitos de proteínas. Las enfermedades producidas por expansiones del trinucleótido repetido CAG son la enfermedad de Huntington, las ataxias espinocerebelosas, la atrofia dentato-rubro-pálido-luysiana y la atrofia muscular bulboespinal. En la ataxia de Friedreich se produce la expansión del trinucleótido repetido GAA dentro de un intrón. El diagnóstico de laboratorio de las expansiones de trinudeótidos repetidos utiliza la amplificación por PCR y la separación de los productos amplificados mediante electroforesis en gel, y determina el tamaño de las repeticiones expandidas. Hemocromatosis hereditaria La hemocromatosis hereditaria es un trastorno autosómico recesivo que produce una absorción inadecuada de hierro, lo que se traduce en un aumento de la concentración de hierro en suero y de los depósitos de hierro en los tejidos. Actualmente, se sabe que la mayoría de los casos de hemocromatosis hereditaria se deben a las mutaciones del gen HFE que codifica una proteína de 343 aminoácidos. Se han descrito varías mutaciones de este gen; la más frecuente es un cambio de G a A en la posición 845 en el exón 4 (G845A), que produce un cambio de cisteína a tirosina en el aminoácido 282 (C282T). Se han detectado otras dos mutaciones, una sustitución de C a G en el exón, lo que da la sustitución de histidina por ácido aspártico en el codón 63 (H63D) y un cambio de A a T que da la sustitución de serina por cisteína en el codón 65 (S65C) en el exón 2. Las mutaciones se detectan mediante la amplificación con PCR y electroforesis. Diagnóstico de enfermedades infecciosas Las técnicas moleculares utilizan sondas de ácidos nucleicos para detectar directamente el material genético de los microorganismos. Diagnóstico molecular de las neoplasias hematológicas El empleo de las técnicas de diagnóstico molecular para el diagnóstico de las neoplasias hematológicas ha adquirido en los últimos años una posición central. Las anomalías genéticas características de leucemias y linfomas sirven para su más exacta clasificación y tienen también un valor pronóstico e implicaciones terapéuticas.

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Las pruebas moleculares más utilizadas para la evaluación de las neoplasias hematológicas son las de reagrupamiento de los genes del receptor de antígenos y los análisis de las translocaciones cromosómicas recurrentes. Enfermedades oncológicas Los oncogenes son un grupo de genes presentes en el genoma humano que pueden activarse por alteraciones genómicas cuantitativas o cualitativas y que, cuando están activados, pueden desempeñar un papel importante en la transformación neoplásica. Los genes antecedentes o protooncogenes parecen tener funciones esenciales en la fisiología celular normal y se encuentran, con frecuencia, implicados en la regulación del crecimiento, la proliferación y la diferenciación de las células. Los oncogenes pueden activarse por una mutación puntual, por una translocación cromosómica o por amplificación. Hay también genes supresores de tumores cuya pérdida produce la transformación neoplásica. Ejemplos de oncogenes formados por mutaciones somáticas de loci genéticos normales son el oncogén abl, que se activa en la leucemia mielocítica crónica, el oncogén myc, que se activa en el linfoma de Burkitt, el oncogén N-myc, que se activa en el neuroblastoma, y el oncogén neu/erb B2, que se activa en el carcinoma de mama. Otros oncogenes, como los de tipo ras, parecen asociarse con varios tipos de tumores. Entre los tumores producidos por la pérdida de genes supresores de tumores está el retinoblastoma.

Análisis de identidad Desde hace años el análisis de marcadores de ADN se ha convertido en el mejor método para los estudios de identificación empleados tanto para las pruebas de paternidad como para los análisis forenses. Se utilizan los polimorfismos, que son las diferencias en el ADN de las personas. El análisis del genoma humano ha demostrado la presencia de áreas con gran polimorfismo en las regiones del ADN que no se expresan. En ellas, entre el 20 y el 30% está formado por regiones repetitivas. Muchas de estas regiones repetitivas varían en el número de repeticiones entre las personas y reciben el nombre de número variable de repeticiones tándem (NVRT). Las unidades que se repiten contienen entre dos y siete nucleótidos (repeticiones tándem cortas, RTC). Los alelos de estos loci están definidos por el número de unidades repetidas. Se emplean diversos loci RTC para los análisis de identidad, tanto en las pruebas de paternidad como en los análisis forenses.

MICROMATRICES DE ADN Un microarray o micromatriz de ADN es una disposición ordenada de centenares o millares de secuencias de ADN (oligonucleótidos o ADN complementario [ADNc]) depositados sobre una superficie sólida de un tamaño aproximado de 1,2 X 1,2 cm. El soporte sólido normalmente es una placa de vidrio, aunque se han empleado también placas de silicio. La micromatriz puede representar el ARNm producido en un determinado tipo celular (micromatrices de expresión de ADNc) o representar regiones codificantes y reguladoras de un determinado gen o grupo de genes. La micromatriz se híbrida con una sonda de ADNc marcada y se mide la hibridación de la sonda con cada componente de la micromatriz para obtener una medida cuantitativa de la abundancia de cada componente en la sonda. Las principales aplicaciones clínicas de las micromatrices son los estudios de la expresión de los genes en los tumores.

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14.19. TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA___________________________________________________ INTRODUCCIÓN La citogenética combina la citología y la genética. Estudia fundamentalmente los aspectos celulares de la herencia, especialmente la descripción de la estructura de los cromosomas y la identificación de las aberraciones genómicas que dan lugar a enfermedades. En este capítulo se presentan de forma simple las técnicas y los métodos que utiliza la citogenética, sus principales aplicaciones clínicas y sus resultados.

CROMOSOMAS Los cromosomas son estructuras muy ordenadas formadas por ADN y proteínas que transportan la información genética. A excepción de los gametos (espermatozoides y óvulos), las células del ser humano contienen 46 cromosomas en 23 pares. Se hereda del padre un miembro de cada par y de la madre el otro miembro del par. Veintidós pares se denominan autosomas y son homólogos, esto es, no se diferencian el uno del otro. El par 23 corresponde a los cromosomas sexuales, que en las mujeres son homólogos, dos cromosomas X, mientras que en los varones son distintos, un cromosoma X y otro Y. Durante el ciclo celular cambia la longitud absoluta de los cromosomas, cuya forma más condensada se produce en la metafase. En este momento es cuando mejor se observan. Debido a esta circunstancia, la mayoría de los estudios citogenéticos utilizan cromosomas en metafase. El centrómero divide a los cromosomas en dos regiones diferentes, denominadas brazos. El brazo más corto se llama p y el más largo, q. Uno de los criterios que se emplean para describir los cromosomas es la posición del centrómero. Cuando el centrómero equidista aproximadamente de los dos extremos y los brazos son de longitud semejante, el cromosoma se denomina metacéntrico. Cuando el centrómero se encuentra desplazado hacia un lado y los brazos son de longitud diferente, el cromosoma se denomina submetacéntrico, y finalmente cuando el centrómero está cerca del extremo, el cromosoma se denomina acrocéntrico. Los extremos de los cromosomas se llaman telómeros. Estas regiones están formadas por repeticiones en tándem de la secuencia (TTAGGG)n, que estabilizan el cromosoma.

CULTIVO CELULAR Dado que el análisis cromosómico requiere células en metafase, estas deben cultivarse in vitro. Especímenes Los estudios citogenéticos corrientes utilizan sangre periférica que se obtiene usando heparina como anticoagulante. El espécimen más frecuente para los análisis prenatales es el líquido amniótico, que se extrae mediante amniocentesis. También puede obtenerse un espécimen de las vellosidades coriónicas. Todos los especímenes clínicos para los análisis citogenéticos deben recogerse de forma estéril siempre que sea posible. Para conseguir el mayor número de células viables, hay que llevar los especímenes al laboratorio tan pronto como se pueda. La sangre, la médula ósea, el líquido amniótico y las vellosidades coriónicas deben mantenerse a temperatura ambiente, mientras que los tejidos sólidos han de transportarse en hielo seco. Técnicas de cultivo Dependiendo del tipo celular, se emplean técnicas de cultivo de suspensiones o monocapas. Las células sanguíneas y las de la médula ósea crecen en suspensión y se añaden al medio de cultivo. La médula se cultiva de 24 a 48 h, y los linfocitos requieren de 3 a 4 días. Además, como estas células normalmente no se dividen en cultivo, debe inducirse su división con mitógenos como la fitohemaglutinina, y las células en metafase se recogen con un inhibidor de la mitosis como la colchicina.

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Las células de líquido amniótico, de las vellosidades coriónicas y los tejidos sólidos crecen en monocapas. Los tejidos y las vellosidades coriónicas deber desagregarse antes tratándolos suavemente con colagenasa. El líquido amniótico ha de centrifugarse, y las células sembrarse en placas para formar colonias. Se cultivan entre 5 y 10 días. Una vez obtenido el crecimiento máximo, se recogen las células y se hinchan hipotónicamente, sin que se llegue a romper la membrana, y luego se fijan. Un soplado suave sobre el cubreobjetos que contiene las células fijadas de los cultivos produce la rotura de la membrana celular y la diseminación de los cromosomas metafásicos. En los cultivos en suspensión, las células fijadas deber, colocarse sobre un porta, que mecánicamente rompe las membranas y separa los cromosomas ligeramente entre sí, pero en una región pequeña ocupada por una sola célula. Tras el secado, las extensiones pueden teñirse. Tinción Los cromosomas se tiñen habitualmente con Giemsa, un colorante con cargas positivas que se une a las negativas del ADN. La tripsinización suave de los cromosomas antes de teñirlos debilita las interacciones ADNproteína y proporciona un patrón definido de regiones claras y oscuras que se llama patrón de bandas. Cada par de cromosomas posee un patrón de bandas característico que se utiliza para identificar el cromosoma y las subregiones cromosómicas. Los cromosomas metafásicos producen, por conjunto haploide, aproximadamente entre 350 y 550 bandas; los cromosomas prometafásicos, aproximadamente 850 bandas; y los cromosomas metafásicos estirados de forma mecánica, hasta 1.400 bandas.

CARIOTIPO Los análisis citogenéticos identifican cada cromosoma y determinan las anomalías presentes. El primer paso es contar el número de cromosomas que hay en la célula. Como el cultivo in vitro puede dar lugar a artefactos, deben contarse los cromosomas de unas 20 células para llegar a un resultado concluyente. Los cromosomas individuales se identifican de acuerdo con el tamaño, la posición del centrómero y el patrón de bandas. En este punto, debe detectarse cualquier alteración de la estructura del cromosoma. En la mayoría de los casos, el patrón de bandas G habitual de los cromosomas en metafase es suficiente para los fines clínicos. Sin embargo, algunos trastornos producen pequeñas pérdidas de material cromosómico que no pueden apreciarse a este nivel. De ser así, se utiliza un análisis de gran resolución. Las células se cultivan de forma que puedan recogerse en una fase ligeramente más temprana de la división celular, la prometafase. En este momento de la división celular, los cromosomas están menos condensados y es más fácil detectar anomalías pequeñas. A continuación se observan los cromosomas con el microscopio y se determina si el juego es normal o anormal. Para documentarlo se toma una fotografía, se cortan los cromosomas y se pegan en una hoja de papel. Los cromosomas homólogos se ordenan de mayor a menor en siete grupos, de la A a la G, más el par de cromosomas sexuales. Por convención, el brazo corto (p) se coloca hacia arriba y el largo (q), hacia abajo. El producto final se denomina cariotipo. Los cromosomas se ordenan en grupos, en orden decreciente de tamaño y posición del centrómero (ver figura):

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Ordenación de los cromosomas en el cariotipo

• Grupo A (1-3): cromosomas grandes metacéntricos. Se diferencian entre sí por el tamaño y la posición del centrómero. • Grupo B (4-5): cromosomas grandes submetacéntricos. Son difíciles de distinguir entre sí. • Grupo C (6-12, X): cromosomas medios metacéntricos. El X es el más grande del grupo. Son los más difíciles de diferenciar. • Grupo D (13-15): cromosomas medios acrocéntricos. Pueden tener satélites. • Grupo E (16-18): cromosomas medios metacéntricos (16) y submetacéntricos (17-18). • Grupo F (19-20): cromosomas pequeños metacéntricos. • Grupo G (21, 22 e Y): cromosomas muy pequeños acrocéntricos. Pueden tener satélites.

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Nomenclatura de las bandas Las bandas se numeran consecutivamente desde el centrómero hasta los extremos del cromosoma (ver figura). Cada brazo se divide en cuatro regiones (de la 1 a la 4). Las regiones se subdividen de acuerdo con las bandas. De esta forma, la zona correspondiente a la banda 1 de la región segunda del brazo largo del cromosoma 5 se define como 5q21.

Numeración de bandas en los cromosomas

Cariotipo mediante ordenador Actualmente, suele realizarse el cariotipo mediante ordenador. Para ello, en lugar de la cámara fotográfica se emplea una cámara de vídeo. Utilizando un programa de ordenador adecuado, se digitalizan las imágenes y se genera el cariotipo. Mosaicismo cromosómico El mosaicísmo cromosómico es la presencia de dos o más líneas celulares con distintos cariotipos en el espécimen. Este mosaicismo es una característica común en los tejidos neoplásicos y detectarlo es lo más problemático en el análisis cromosómico de las células del líquido amniótico.

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HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU La hibridación fluorescente in situ (FISH) combina la biología molecular y la genética en lo que se denomina citogenética molecular. En lugar de un colorante, se usa una sonda molecular, esto es, un fragmento de ADN, marcado con un compuesto fluorescente. La sonda marcada híbrida con dianas citológicas como cromosomas metafásicos, núcleos en interfase, fibras de cromatina extendidas o micromatrices de ADN. Hay tres clases básicas de sondas: las de secuencia única, las de «decorado» cromosómico y las de secuencia repetida. Las sondas de secuencia única se emplean para detectar pérdidas cromosómicas o reagrupamientos que no se puedan detectar por medio de las técnicas convencionales de obtención de bandas cromosómicas. Las sondas de decorado cromosómico son un conjunto de muchos trozos de ADN de un cromosoma, que tras la hibridación producen la fluorescencia de este. Son útiles para identificar reagrupamientos complejos. Finalmente, las sondas de secuencia repetida se aislan de regiones teloméricas o centroméricas y se usan para detectar la ganancia o la pérdida de cromosomas y reagrupamientos crípticos (ocultos). FISH convencional Para realizar la técnica FISH se cultivan las células que se recogen preparando extensiones de modo análogo a las de los estudios citogenéticos clásicos. Se desnaturaliza el ADN de las extensiones y se añade la sonda marcada con el compuesto fluorescente. Se deja que hibride utilizando una temperatura de alineamiento que favorezca la hibridación de regiones de ADN homólogas. Tras un tiempo adecuado de hibridación, se elimina por medio de un lavado la sonda en exceso que no ha hibridado. Luego se observa la preparación con un microscopio de fluorescencia y se analiza esta mediante programas de ordenador. La selección de las sondas adecuadas es fundamental en la técnica FISH. Es muy útil para detectar las microdeleciones, esto es, las pequeñas pérdidas de material genético. En estos casos la ausencia de la señal fluorescente indica que no se ha producido la hibridación y que, por tanto, hay una deleción. FISH multicolor La FISH puede utilizar distintas sondas marcadas con diferentes compuestos fluorescentes. Utilizando un marcaje combinatorio con cinco o más fluorocromos, pueden asignarse combinaciones de estos específicas a cada cromosoma humano, que después puede tener una presentación de un solo color. Con la aplicación del marcaje combinatorio es posible detectar a la vez los 24 cromosomas de cada célula. La FISH multicolor tiene al menos tres versiones: M-FISH, SKY (spectral karyotyping, cariotipado espectral) y Rx-FISH. La FISH multicolor no sólo es capaz de identificar la eucromatina, esto es, los segmentos de los cromosomas que expresan genes, sino también translocaciones, inserciones y anomalías cromosómicas crípticas, que son los reagrupamientos cromosómicos invisibles con el microscopio óptico. El refinamiento de esta tecnología ha producido un código de barras multicolor de gran resolución que permite diferenciar regiones específicas de los cromosomas. Hibridación genómica comparada Es una técnica que permite detectar cambios numéricos de secuencias de ADN (pérdidas, ganancias o amplificaciones) en un tejido humoral. Se basa en la hibridación in situ del ADN tumoral y de un ADN control marcados con fluorocromos de distinto color sobre metafases normales. Tras la hibridación, se cuantifican las variaciones numéricas del ADN mediante el coeficiente de intensidad de la fluorescencia entre ambos tipos de ADN. La hibridación genómica comparada tiene un interés especial para analizar los cambios numéricos de las secuencias de ADN en los tumores sólidos y las neoplasias hematológicas de índice prolíferativo bajo. Asimismo, es útil en los casos de cariotipos complejos con muchos cromosomas marcadores, dobles diminutos y regiones de tinción homogénea. Esta técnica sólo detecta los cambios presentes en una gran proporción de células humorales. Como requiere un programa informático complejo y caro, no se suele utilizar. Citogenética de interfase En esta técnica se visualizan los cromosomas o las subregiones cromosómicas en el núcleo, lo cual permite el análisis del genoma de las células individuales en un contexto más natural que en las dispersiones metafásicas y permite el estudio de la organización tridimensional del genoma. Además, como la cromatina del núcleo en

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interfase está condensada una décima parte menos que la de los cromosomas metafásicos, la citogenética de interfase ha permitido ordenar las sondas en distancias menores. Con la selección adecuada de las sondas pueden verse hasta reagrupamientos estructurales, como las translocaciones y las inversiones. Microdisección cromosómica Técnica en la que se aisla un cromosoma completo o una región de un cromosoma (por ejemplo, el brazo de un cromosoma o una banda cromosómica) utilizando una aguja de vidrio micromanipulada o un rayo láser muy enfocado. La muestra se transfiere a un tubo para su posterior amplificación y análisis con una sonda. Aplicaciones de la FISH La FISH se emplea para evaluar las anomalías siguientes: • Translocaciones en leucemias. • Aneusomía clonal en la leucemia. • Síndromes de microdeleción. • Detección de una enfermedad mínima residual. Una de las aplicaciones clínicas más habitual de la FISH es la detección de microdeleciones, demasiado pequeñas para poder verse con la citogenética clásica. Para ello, se emplea una sonda que hibride con el gen de forma que, cuando este se ha perdido, no se observa fluorescencia. Una persona normal presenta dos señales por célula (una en cada cromosoma homólogo), mientras que una persona afectada con la microdeleción sólo tiene una señal por célula.

ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Indicaciones del análisis cromosómico El análisis cromosómico en especímenes de sangre periférica puede realizarse por diversas indicaciones. Entre las más frecuentes están: Anomalías congénitas múltiples en un paciente. Parejas sin hijos o con muchos abortos espontáneos. Personas con genitales ambiguos, infértiles o con amenorrea. Pacientes con antecedentes de un reagrupamiento cromosómico. Pacientes con retraso mental o del desarrollo. Personas en las que se sospeche un síndrome cromosómico. Familias con un patrón de retraso mental ligado al cromosoma X. Las anomalías cromosómicas pueden ser de dos clases: numéricas y estructurales. Anomalías numéricas Se denomina euploidía a los múltiplos exactos del conjunto haploide de cromosomas. La ganancia o pérdida de uno o varios cromosomas recibe el nombra de aneuploidía. La diploidía, que es el estado normal de las células humanas, es una forma de euploidía. Entre las euploidías anómalas se encuentran la triploidía (3N = 69 cromosomas) y la tetraploidía (4N = 92 cromosomas), que no son compatibles con la vida y se detectan principalmente en las células de los abortos espontáneos. La aneuploidía se produce cuando un par de cromosomas no se separa adecuadamente durante la división y se produce un cromosoma extra o se pierde un cromosoma por célula. La trisomía o monosomía pueden tener lugar en cualquier cromosoma, aunque la mayoría son incompatibles con la vida y acaban de forma espontánea. Se han encontrado trisomías de los cromosomas 13,18 y 21 en nacidos vivos. Las trisomías de los cromosomas sexuales son viables. La única monosomía viable es la del cromosoma X (45X). La trisomía 21, que ocasiona el síndrome de Down, es la causa más frecuente de retraso mental, con una incidencia de 1 de cada 700 nacimientos. Las otras dos trisomías con nacidos vivos son la del 13 y la del 18. La

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trisomía del 13 (síndrome de Patau) tiene una incidencia de 1 de cada 4.000 a 10.000 nacimientos. La trisomía del 18 (síndrome de Edwards) se presenta en 1 de cada 8.000 nacimientos. Las aneuploidías de los cromosomas sexuales son relativamente frecuentes, con una frecuencia global de 1 de cada 500 nacimientos. Las principales son la trisomía XXX, la trisomía XYY, la trisomía XXY (síndrome de Klinefelter) y la monosomía XO (síndrome de Turner). Anomalías estructurales Los cromosomas durante los procesos de mitosis y meiosis experimentan el fenómeno de la recombinación. A veces se producen errores que dan lugar a reagrupamientos que modifican la estructura de uno o varios cromosomas. Los reagrupamientos pueden ser equilibrados, cuando está presente todo el material cromosómico y es funcional, y sólo se encuentra distribuido de forma diferente; o desequilibrados, si hay una pérdida o duplicación de parte del material cromosómico. Los reagrupamientos equilibrados suelen ser benignos, mientras que los desequilibrados producen anomalías. Los términos habituales para describir las anomalías cromosómicas estructurales son: • Translocación (t): intercambio de material entre dos o más cromosomas. • Deleción (d): pérdida de ADN de un cromosoma. • Inversión (inv): rotura de un cromosoma en dos bandas, después de lo cual se invierte la porción central. • Isocromosoma (i): duplicación de un brazo entero de un cromosoma con pérdida del otro brazo. • Duplicación (dup): duplicación de un segmento dentro de un cromosoma. • Cromosoma dicéntrico (dic): cromosoma con dos centrómeros que sustituye a uno o dos cromosomas normales, lo cual suele producir una pérdida de ADN. • Cromosoma derivativo (der): cromosoma con una reorganización cromosómica generada por más de una reorganización en un solo cromosoma o por reorganizaciones de dos o más cromosomas. • Cromosoma marcador (mar): cromosoma anómalo cuya procedencia se puede identificar. Se han descrito diversos síndromes relacionados directamente con una anomalía cromosómica estructural. Entre ellos el síndrome de Wolf-Hirschhorn, en el que hay una pérdida terminal del brazo corto del cromosoma 4 [del(4) (p16)] y el síndrome Cri-du-chat [del(5)(p15)]. Las microdeleciones son pérdidas muy pequeñas del material genético. En algunos casos hay deleciones de porciones de varios genes adyacentes no relacionados, lo que se conoce como síndromes de genes contiguos. Entre los síndromes de microdeleción más conocidos se encuentran el síndrome de Prader-Willi y el síndrome de Angelman. Ambos comparten la misma deleción del brazo largo del cromosoma 15 [del(15)(p11.2q11.2)], pero tienen presentaciones clínicas diferentes.

APLICACIONES CLÍNICAS DE LA CITOGENÉTICA Los análisis citogenéticos se emplean prácticamente en todas las especialidades de la medicina. Hay dos campos especialmente significativos, que son la citogenética prenatal y la genética del cáncer, principalmente en las hemopatías malignas. Citogenética prenatal El análisis cromosómico en líquido amniótico para el diagnóstico prenatal se realiza entre las semanas decimosexta y decimoctava de gestación con las indicaciones siguientes: • Edad materna avanzada. • Resultados elevados de alfa fetoproteína en el suero de la madre. • Detección de una anomalía fetal por ecografía. • Antecedentes familiares de anomalías cromosómicas o trastornos genéticos.

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Hemopatías malignas Se han observado diversas anomalías citogenéticas en leucemias y linfomas. La detección de estas anomalías se emplea para establecer el diagnóstico correcto, proporcionar el tratamiento adecuado y disponer de un pronóstico. El análisis citogenético de las enfermedades oncológicas se realiza en las propias células tumorales. En las leucemias se utiliza médula ósea y cuando esta no pueda obtenerse se emplea una muestra de sangre en los pacientes con células mieloides o linfoides inmaduras.

14.20. TÉCNICAS PROTEÓMICAS_______________________________________________________ INTRODUCCIÓN El término proteoma se utilizó por primera vez en 1995 para describir el conjunto de proteínas de un organismo. Poco después se aplicó el término proteo-mica al estudio del proteoma. Las tecnologías proteómicas permiten el análisis simultáneo de cientos de proteínas y su identificación, así como el análisis de sus modificaciones estructurales. En este capítulo se presentan las principales técnicas proteómicas y su aplicación en los laboratorios clínicos. PROTEÓMICA CLÍNICA La proteómica clínica es la aplicación de las técnicas de la proteómica al campo de la medicina. Comprenden el análisis cuantitativo y cualitativo de las proteínas y los péptidos presentes en los especímenes clínicos, como los tejidos y los líquidos corporales. Uno de los objetivos de la proteómica clínica es la búsqueda de marcadores biológicos (biomarcadores). Los marcadores biológicos son pruebas que reflejan información sobre el estado biológico de la persona que se analiza. Su valor fundamental es su capacidad de diferenciar dos o más estados biológicos. Aunque en la actualidad el principal enfoque de la proteómica clínica es el diagnóstico y el descubrimiento de biomarcadores, la proteómica clínica incluye también la identificación de nuevas dianas terapéuticas, fármacos o vacunas para conseguir mejores resultados terapéuticos y tener éxito en la prevención de las enfermedades. Los líquidos biológicos son la muestra más adecuada para la búsqueda de marcadores biológicos de diagnóstico, pronóstico y valoración del tratamiento de las enfermedades debido a su fácil accesibilid ad en comparación con las biop-sías tisulares. El plasma/suero sanguíneo es la principal muestra clínica para el diagnóstico de las enfermedades; otros líquidos son la orina, el líquido cefalorraquídeo, el líquido sinovial, la saliva, el líquido seminal y las lágrimas. En 2001 se creó la Human Proteotne Organisation (HUPO) (Organización del Proteoma Humano) con el fin de impulsar el estudio del proteoma del hombre. Desde esa fecha se han realizado un gran número de estudios para descifrar el proteoma normal del ser humano y el proteoma en diferentes líquidos biológicos, tanto en la salud como en diversas enfermedades. Dos enfoques tecnológicos principales se usan en la aplicación de la proteómica para el diagnóstico y seguimiento de las enfermedades. Por un lado, la combinación de una técnica de separación de proteínas y la espectrometría de masas para el descubrimiento de biomarcadores de enfermedad y, por otro, las micromatrices proteínicas para analizar simultáneamente muchas proteínas.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA LOS ANÁLISIS PROTEÓMICOS La preparación de las muestras para los estudios proteómicos es un punto fundamental. La preparación debe ser lo más simple posible para obtener una

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buena reproducibilidad. Asimismo, debe procurarse que durante la preparación de la muestra las proteínas sufran las menores modificaciones posibles. Un paso importante en muchos estudios proteómicos es el fraccionamiento previo de la muestra, debido principalmente a que el intervalo de concentraciones de las proteínas en la mayoría de los medios biológicos es muy grande. Otra de las razones para el fraccionamiento previo de las muestras es la gran diferencia de propiedades de las proteínas. Muestras de tejidos Los tres pasos principales en la preparación de las muestras de tejidos son la rotura de las células, la inactivación o eliminación de las sustancias que interfieren y la solubilización de las proteínas. El método de rotura de las células depende del material biológico y puede realizarse por lisis osmótica, ciclos de congelacióndescongelación, lisis con detergentes, sonicacion, pulverización con o sin nitrógeno líquido, presiones elevadas, homogeneización con bolas de vidrio y una trituradora. Estos métodos pueden combinarse para conseguir una mayor eficacia. Para evitar la degradación de las proteínas hay que desactivar las proteasas de los tejidos. Se emplean desnaturalizantes fuertes, como urea 8 M, ácido tricloroacético al 10% o dodecil sulfato sódico al 2%. Además, la preparación de la muestra debe realizarse a bajas temperaturas. La precipitación proteínica es un paso opcional en la preparación de la muestra para la electroforesis bidimensional. Los principales métodos de precipitación utilizan sulfato amónico, ácido tricloroacético, acetona, y combinaciones de algunos de estos precipitantes. Muestras de plasma/suero Los estudios realizados han llevado a recomendar el plasma mejor que el suero para los estudios proteómicos. El suero y el plasma se diferencian como consecuencia de la coagulación. Además de ía reducción de las proteínas y el fibrinógeno debido a la cascada de la coagulación, existen otras muchas diferencias. En general, hay más péptidos en suero, pero el tipo de anticoagulante también influye sobre la composición de péptidos. La concentración de cada una de las proteínas que contiene el plasma sanguíneo presenta una variación muy grande. Así, la albúmina es 109 veces más abundante que la troponina I. Un pequeño número de proteínas que incluye la albúmina, las inmunoglobulinas, la transferrína, las haptoglobinas, la Oj-anti-tripsina, y la cíTglucoprotema, constituyen hasta el 80% de todas las proteínas del plasma humano. Las 22 proteínas más abundantes constituyen más del 99% de la masa de las proteínas plasmáticas. El 1% restante, presumiblemente ía población con interés biológico, está compuesta por miles de diferentes proteínas muy poco abundantes. Así pues, la eliminación de las proteínas más abundantes es un paso importante para obtener un perfil proteómico plasmático mejor al expandir el intervalo de concentraciones que pueden detectarse. Hay muchos métodos para eliminar las proteínas más abundantes del plasma sanguíneo para los estudios proteómicos. Los principales son los que emplean anticuerpos. Muestras de orina La orina normal tiene una concentración baja de proteínas con un elevado contenido de sales y otras sustancias de bajo peso molecular que interfieren con los análisis proteómicos. Los principales métodos para aislar /con centrar las proteínas de la orina son la precipitación, la liofilización, la ultracentrifuga-ción y la filtración con centrifugación. Muestras de líquido cefalorraquídeo El líquido cefalorraquídeo (LCR) contiene una concentración de proteínas baja y una concentración salina elevada, por lo que hay que enriquecer las proteínas y eliminar las sales antes de las separaciones proteínicas. Se han empleado diversos métodos de desalinización: ultrafiltración, diálisis, precipitación de proteínas y columnas.

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MÉTODOS PE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS Hasta ahora la técnica predominante de separación de proteínas para los estudios proteómicos ha sido la electro foresis bídimensional en gel de poliacrila-mida (2D-PAGE). Más recientemente, se están aplicando cada vez más las técnicas de separación multidimensionales en fase líquida que combinan diversas técnicas cromatográficas o cromatografía y electroforesis capilar.

ELECTROFORESIS BÍDIMENSIONAL La electroforesis bidimensional es una técnica potente de separación que utiliza dos dimensiones. En la primera dimensión se emplea el enfoque isoeléctrico (isoelectric focusing, IEF), y la electroforesis en gel de acrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) en la segunda dimensión. Por medio del IEF las proteínas se separan según su punto isoeléctrico y con la SDS-PAGE se separan de acuerdo con su masa molecular. De esta forma, tras la electroforesis bidimensional se obtiene un mapa proteínico en el que las coordenadas de cada proteína corresponden a su punto isoeléctrico y a su masa molecular (fig. 18-1). Según el tamaño del gel y el gradiente de pH utilizado en la primera dimensión, la 2D-PAGE puede resolver más de 5.000 proteínas simultáneamente. Otra de las ventajas es que las proteínas separadas se encuentran en su forma natural por lo que pueden detectarse las modificaciones posteriores a la traducción, que suelen aparecer como «trenes» de manchas diferenciadas en el eje horizontal y/o vertical del gel. Para la primera dimensión se emplean tiras IPG, que contienen reactivos bifuncionales de inmovilina, que son un conjunto de 10 derivados de acrilamida químicamente bien definidos que forman un conjunto de amortiguadores con diferentes valores de pH entre 1 y 13. Como el extremo reactivo copolime-riza con la matriz de acrilamida, se generan gradientes de pH muy estables, lo cual permite verdaderos enfoques isoeléctricos de estado estacionario con una mayor reproducibilidad. Las tiras IPG pueden contener intervalos de pH lineales y no lineales amplios (pH 3-12), medios (pH 4-7), estrechos (pH 4,5-5,5) o ultraestrechos {pH 4,9-5,3), y con diferentes longitudes (7,18, 24 cm). La segunda dimensión se corre en gel de acrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS) y puede hacerse en sistemas horizontales o verticales. Los poros del gel de la segunda dimensión separan las proteínas de acuerdo con su tamaño, ya que el dodedil sulfato sódico recubre de cargas negativas todas las proteínas de forma proporcional a su masa. El efecto neto es que las proteínas migran como elipsoides con un cociente carga negativa /masa uniforme y una movilidad relacionada de forma logarítmica con la masa. Pueden emplearse geles homogéneos o con gradiente. La electroforesis suele hacerse enfriando mediante recirculación de agua por la cámara que contiene el gel para que no se produzcan temperaturas superiores a los 25 °C, Detección y cuantificación de las proteínas Después de la electroforesis bidimensional, las proteínas separadas deben visualizarse, ya sea con métodos de tinción universales o específicos. Entre los métodos universales están la tinción con colorantes amónicos como el azul Coomasie, la tinción negativa con cationes metálicos, como el cinc, la tinción con nitrato de plata, la tinción o mareaje fluorescente y los isótopos radiactivos y la posterior detección por autorradiografía. En la actualidad, los mareajes fluorescentes son los preferidos. Se utiliza el SYPRO Ruby y los colorantes de cianuro (Cy2, Cy3, Cy5). El empleo de colorantes fluorescentes aumenta la sensibilidad, ofrece un intervalo dinámico lineal y permite la comparación cuantitativa de los patrones en los geles. Electroforesis bidimensional en gel diferencial (DIGE-2D) En esta técnica se emplean dos colorantes fluorescentes para marcar las proteínas de dos muestras que van a compararse. Se mezclan las dos muestras marcadas y se separan en un gel 2D. La señal de los dos colorantes puede diferenciarse y obtenerse el cociente de los dos mareajes, lo cual permite la comparación cuantitativa de las muestras.

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Técnicas de análisis de imagen Para analizar la expresión diferencial se emplean programas de ordenador de análisis de imagen. Las imágenes se capturan con escáneres, dispositivos de carga acoplada o captores fluorescentes. Una vez capturadas, se digitalizan para su análisis.

SEPARACIONES MULTIDIMENSIONALES Son separaciones en fase líquida que combinan diversos métodos de cromatografía líquida (LC) y de electroforesis capilar (CE). La muestra se separa primero por un método y luego los componentes separados se vuelven a separar por al menos otro método adicional independiente. Cada mecanismo de separación descansa en una propiedad física independiente de la sustancia que hay que separar. Las propiedades físicas independientes corresponden a «dimensiones», y pueden ser: tamaño, carga, hidrofobicidad o afinidad a un sustrato determinado. Los principales sistemas utilizados son los bidimensionales. Las mejores separaciones bidimensionales se consiguen cuando se acoplan mecanismos de separación muy diferentes. Una combinación muy utilizada es la cromatografía líquida de intercambio iónico y la cromatografía en fase reversa (v. el capítulo 14). Los sistemas multidimensionales pueden acoplarse entre ellos de diferentes formas. El eluyente del primer sistema de separación puede transportarse de forma manual al siguiente sistema (off-line), de forma automática con un robot o mediante un tubo o válvula que lleva directamente una corriente líquida al sistema siguiente (on-íine). Una ventaja fundamental de los métodos líquidos de separación es que pueden acoplarse directamente a los espectrómetros de masas.

ESPECTROMETRÍA DE MASAS Técnica analítica cualitativa y cuantitativa de gran capacidad que permite elucidar las estructuras y las propiedades químicas de las moléculas. La base de esta técnica reside en la formación de iones a partir de moléculas neutras y su posterior análisis. Su límite de detección se acerca a 10-2 gramos que equivalen a 10-15 moles de un compuesto con una masa molecular de 1.000 dalton. Estas cifras señalan que es posible la identificación de compuestos que se encuentren en concentraciones de hasta 1 parte por billón (1012) en muestras químicas complejas. Componentes de un espectrómetro de masas Los espectrómetros de masas (EM) son aparatos que miden la masa de las moléculas que previamente se han transformado en iones. En un espectro de masas se representan las relaciones masa/carga (miz) de todas las especies iónicas producidas a partir de la molécula. Cuando los iones tienen carga 1, la relación m/z es igual a la masa molecular de la especie iónica expresada en dalton. Los dos componentes fundamentales de los EM son el sistema de volatilización/ionización y el analizador de masa. Sistema de volatilización/ionización Existen dos tipos de técnicas para volatilizar e ionizar las proteínas, que son la ionización por pulverización eléctrica (electrospray ionizatíon, ESI) y la desorción/ionización por láser con ayuda de una matriz (matrix-assisted desorption/ ionizatíon, MALDI). En la técnica ESI se pulveriza una disolución de las proteínas en forma de gotitas desde un capilar de vidrio bajo un campo eléctrico fuerte. Las gotitas captan cargas positivas al salir del capilar. La evaporación del disolvente deja moléculas con muchas cargas. Una proteína de unos 20 kDa capta entre 10 y 30 cargas positivas. El espectro de masas de esta proteína muestra todas las especies cargadas en forma de un conjunto de picos agudos cuyos valores consecutivos m/z se diferencian por la carga y la masa de un único protón. La técnica EST es fácil de acoplar a la mayoría de los métodos de separación de sustancias en fase líquida como la cromatografía y la electroforesís.

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En la técnica MALDI, la muestra se solidifica dentro de una matriz sólida. Un pulso láser excita la matriz creando un microplasma que transfiere la energía a las proteínas ionizándolas y haciéndolas pasar a la fase gaseosa. Entre los productos se encuentran moléculas que han captado un solo protón. Como la técnica MALDI sólo produce la adición de un único protón, el espectro de masas sólo presenta un único pico correspondiente a ese ion. Analizadores de masa Los analizadores de masa separan los iones de acuerdo con su cociente m/z. El movimiento del ion en el analizador de masa se manipula mediante campos eléctricos o magnéticos para dirigir el ion hacia el detector que registra el número de iones de cada valor individual m/z. En la investigación proteó-mica se emplean cuatro tipos de analizadores de masa: de trampa iónica, de tiempo de vuelo, de cuadrupolo y de resonancia ion ciclotrón con transformada de Fourier. Cada uno de ellos difiere considerablemente en sensibilidad, resolución, exactitud de masa y posibilidad de fragmentar los iones peptídicos. Clases de espectrómetros de masa La combinación del sistema de ionización con el analizador de masas determina la aplicación del espectrómetro de masas. La técnica ESI se acopla frecuentemente con las trampas iónicas y las combinaciones cuadrupolo/TOF (espectrómetro tándem o MS/MS). La técnica MALDI se acopla con analizadores TOF (MALDI-TOF). Esta combinación se utiliza con frecuencia para obtener las huellas de masa. La espectrometría de masas tándem o MS/MS se realiza con dos espectrómetros de masas secuenciales con una célula de colisión entre ellos. Estos sistemas se emplean para la secuenciación de péptidos.

IDENTIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS Las manchas que interesen de un gel 2D-PAGE pueden extraerse y someterse a una digestión proteolítica. Los péptidos resultantes se analizan mediante espectrometría de masas. En la figura 18-2 se muestra el espectro de masas de una proteína. Cada uno de los picos corresponde a un péptido, formados tras la digestión con tripsina. La identificación de una proteína específica a partir de los datos de espectrometría de masas puede hacerse mediante la huella de masas peptídica o por secuenciación de péptidos. En el primer caso, se comparan las masas de los péptidos con los espectros de masas de proteínas en bases de datos utilizando los programas adecuados. La secuenciadón de péptidos mediante espectrometría de masas utiliza dos espectrómetros de masas conectados en serie. Los péptidos cargados se separan en el primer espectrómetro de masas. Se selecciona el que interesa secuenciar y se lleva a una cámara de colisión donde se produce la fragmentación del esqueleto peptídico entre los aminoácidos. Estos se llevan al segundo espectrómetro de masas donde se deduce la secuencia. Como en el primer caso, se emplean programas para comparar las secuencias obtenidas de los diferentes péptidos con las bases de datos.

MICROMATRICES PROTEÍNICAS Las micromatrices están formadas por moléculas biológicas inmovilizadas sobre una superficie plana. Estas moléculas pueden ser oligonucleótidos, productos de PCR, proteínas, péptidos u otras moléculas pequeñas. Las micromatrices proteínicas y, en particular, las micromatríces de anticuerpos ofrecen posibilidades únicas para desarrollar análisis de gran volumen, múltiplex y ultrasensibles que permitan obtener perfiles de estados patológicos. Una alternativa a las micromatrices proteínicas utilizada en los estudios del cáncer es la técnica SELDI-TOF que emplea chips proteínicos acoplados a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (TOF-MS). Las proteínas de la muestra se adsorben inicialmente sobre el chip y luego se extraen mediante desorción/ionización por láser y se introducen en el TOF-MS. La técnica genera un mapa en el que las proteínas individuales se presentan en forma de picos separados de acuerdo con su cociente tn/z. La comparación de la huella de masa entre los controles sanos y los pacientes puede detectar los biomarcado-res de enfermedad.

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PROTEÓMICA DEL PLASMA SANGUÍNEO El plasma sanguíneo es un gran depósito de proteínas que contiene miles de proteínas diferentes procedentes de todos los tejidos del organismo. Aunque parece ideal para el análisis proteómico, su estudio es más complicado que el de otros medios. Uno de los objetivos de la HUPO es el Proyecto del Proteoma Plasmático (PPP), que pretende el análisis completo de los constituyentes proteínicos del plasma y el suero humano y la identificación de sus variaciones debidas a aspectos fisiológicos, como la edad y el sexo, o patológicos. Se han realizado muchos estudios para obtener ía imagen más completa de las proteínas del plasma. Se han detectado e identificado más de 5.000 proteínas diferentes. Con relación a la patología, el mayor número de estudios se ha realizado en el cáncer. La técnica más utilizada ha sido ía espectrometría de masas SELDI-TOF. Esta metodología se ha aplicado al cáncer de ovario, mama, cabeza y cuello, gastrointestinal, pancreático, hepático y prostático. Los estudios realizados hasta el momento han proporcionado datos prometedores, pero la mayoría de ellos no han dado lugar a resultados concluyentes. Otras enfermedades en las que se han aplicado estrategias proteómicas para la búsqueda de biomarcadores de diagnóstico o seguimiento han sido las coronarias y las hepáticas.

PROTEÓMICA DE LA ORINA El proteoma urinario contiene no sólo proteínas plasmáticas, sino también proteínas renales y proteínas del aparato urinario inferior. En las personas sanas, aproximadamente el 30% de las proteínas de la orina son plasmáticas, mientras que el otro 70% corresponden a protemas renales. Se está analizando el proteoma urinario normal y se están buscando en la orina utilizando las técnicas proteómicas posibles biomarcadores de enfermedades renales y no renales. Recientemente, se han identificado más de 1.500 proteínas en la orina de las personas sanas. Sorprendentemente, casi la mitad de las proteínas identificadas son proteínas de membrana. Las principales enfermedades renales estudiadas con un enfoque proteómico han sido las glomerulares, el rechazo del injerto renal en los trasplantes y los cánceres urológicos.

PROTEÓMICA DEL LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO El líquido cefalorraquídeo (LCR) es especialmente importante para la identificación de biomarcadores en las enfermedades neurológicas. Más del 80% del contenido de proteínas del LCR se origina a partir del plasma sanguíneo por ultrafiltración y pinocitosis; el resto procede de la síntesis intratecal. Se han identificado un gran número de proteínas en el LCR, con un solapamiento parcial con el proteoma plasmático. Diversas enfermedades neurodegenerativas han sido objeto de estudios proteómicos en el LCR a fin de descubrir biomarcadores para el diagnóstico o seguimiento. Se han estudiado en la enfermedad de Alzheiiner y la esclerosis múltiple, entre otras patologías.

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Capítulo 15. La fase analítica

Definiciones 15.1. Analizadores automáticos 15.2. Modelos de automatización 15.3. Instrucciones para el uso de los analizadores 15.4. El agua para el laboratorio clínico 15.5. Los reactivos 15.6. Los materiales de calibración 15.7. Los materiales de control 15.8. Serie analítica 15.9. Límite inferior de detección - sensibilidad analítica 15.10. Intervalo de medida - Linealidad 15.11. Interferencias 15.12. Alarmas y avisos 15.13. Resultados aberrantes o absurdos 15.14. Diluciones, factor de dilución, comprobaciones y repeticiones 15.15. Procedimiento analítico alternativo 15.16. POCT (Point Of Care Testing)

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DEFINICIONES______________________________________________________________________ Analito: componente que se indica en el nombre de una magnitud mensurable. Una sustancia o constituyente químico que se analiza, como glucosa, colesterol, TSH, etc. Analizador: instrumento que permite mesurar o medir la concentración, u otro tipo de magnitud, de algunos de los componentes de una muestra. Automatización: El término automatización describe los aparatos y dispositivos que se utilizan en los laboratorios de bioquímica clínica para mecanizar los procesos de preparación de los especímenes y de determinación de sustancias químicas con una reducida intervención de los operadores. La automatización ha permitido hacer frente al enorme incremento del número de especímenes y de la carga de trabajo que se ha producido en los últimos años. Al mismo tiempo, se han reducido la variabilidad de los resultados y los errores inherentes al trabajo m anual humano repetitivo. La automatización puede ir desde unos pocos pasos del proceso analítico hasta todo el trabajo del laboratorio. En este capítulo se presentan los componentes fundamentales de los analizadores automáticos para bioquímica clínica. Fase analítica: conjunto de procesos directamente relacionados con la medida de una magnitud biológica. También llamada fase metrológica. Sistema analítico: conjunto de medios analíticos (instrumentos, métodos, reactivos, calibradores, controles, consumibles, etc.) que permite determinaciones analíticas según un modo operativo definido.

15.1. ANALIZADORES AUTOMÁTICOS___________________________________________________ En la actualidad, los analizadores automáticos para bioquímica clínica son del tipo denominado discreto, en donde la mezcla de reacción se produce en una cubeta individual. Los principales componentes de estos analizadores son: • Dispositivo de carga de los especimenes • Sistema de identificacion de los especimenes • Dispositivo de toma y dispensacion de los especimenes • Sistema de dispensacion de los reactivos • Baño de incubacion • Sistema de medida de la reaccion Dispositivo de carga de los especímenes La mayoria de los analizadores de bioquimica clinica puede utilizar tubos primarios, esto es, los mismos tubos de extraccion después de centrifugados, ya que las pipetas de toma de muestra disponen de sensores de nivel que detienen su accion cuando alcanzan el liquido. La zona de carga del analizador es la parte donde se mantienen los especimenes en el instrumento antes de que se analicen. Esta zona puede tener la forma de una bandeja circular, una gradilla o una cadena transportadora con capacidades variables, que generalmente dependen de la velocidad de trabajo del analizador. Respecto a los contenedores secundarios (tubos o copas), cada analizador los utiliza de forma diferente, y están diseñados de manera que el volumen muerto sea minimo y se produzca poca evaporacion cuando no estén tapados. La evaporation de los especimenes puede causar errores analiticos destacables cuando deban permanecer mucho tiempo en la zona de carga de los especimenes. La mayoria de los analizadores automáticos poseen tapas para el dispositivo de carga de los especimenes, que suelen ser opacas para impedir que la luz degrade algunos componentes.

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La carga de los especimenes en los dispositivos correspondientes puede ser discontinua o continua. En el primer modo, se cargan los especimenes en un dispositivo que se cambia cuando se han tornado todos los especimenes del primero, y en el segundo modo se van cambiando continuamente los contenedores de los especimenes a medida que se van aspirando del dispositivo de carga situado en el analizador. Sistema de identificación de los especímenes La identificacion de los especimenes puede introducirse mediante el ordenador del analizador. Sin embargo, en la actualidad, los analizadores automáticos de bioquimica clinica suelen estar conectados al sistema informático del laboratorio, que les pasa directamente los datos. Los analizadores para bioquimica clinica tienen lectores de códigos de barras para la identificacion positiva de los especimenes. El uso de estos códigos presenta un gran numero de ventajas; entre ellas, que se eliminan las listas de trabajo del analizador y se evitan posibles mezclas de los especimenes durante su colocación en el mismo, sobre todo cuando se emplean contenedores secundarios. Dispositivo de toma y dispensación de los especímenes El dispositivo de toma y dispensacion de los especimenes tiene por función trasladar un volumen definido del espécimen desde su contenedor hasta la cubeta de reaccion. Las pipetas de toma y dispensarion de los especimenes disponen de sensores de nivel para detectar el liquido, que pueden ser de tres tipos: de capacitancia, de conductimetria y de ultrasonidos. Algunos analizadores automáticos tienen también pipetas de toma de especimenes capaces de detectar pequeños coágulos en el espécimen, en cuyo caso detienen la aspiración para no obstruirse. Para dispensar los especimenes, los analizadores automáticos actuales utilizan jeringas de desplazamiento liquido positivo. La pipeta se mueve hasta el contenedor del espécimen, lo aspira, y luego mueve el brazo de toma hasta la cubeta de reaccion y dispensa un volumen fijo del espécimen en la cubeta, bien solo o mezclado con diluyente o reactivo. Una vez lavada la punta de aspiration interna y externamente, la pipeta vuelve a la posicion de toma para aspirar el espécimen siguiente. La transferencia del espécimen desde su contenedor hasta el lugar de reaccion es un proceso critico, ya que las técnicas actuales de los analizadores automáticos utilizan volumenes muy pequeños, inferiores en muchos casos a 5 µL. Para estos volumenes tan pequeños, la inexactitud y la imprecision de los dispositivos de toma y dispensacion de especímenes no deben superar el 1%. Sistema de dispensación de los reactivos En la mayoria de los analizadores automáticos, los reactivos están en forma líquida, dentro de contenedores de vidrio o de plástico cuyo tamaño dependerá de la estabilidad y de la tasa de trabajo del analizador. Normalmente, cada prueba utiliza uno o dos reactivos, aunque algunos analizadores permiten usar tres o mas. Los compartimentos para los reactivos suelen estar refrigerados y mantener la temperatura entre 4 y 8 °C. Por otra parte, como los contenedores de los reactivos se identifican mediante un codigo de barras, el contenedor puede colocarse en cualquier posicion del compartimento de reactivos, pues el analizador detecta automáticamente su situación. Los reactivos se dispensan por medio de pipetas conectadas a jeringas de desplazamiento liquido positivo. Generalmente, se utilizan las mismas pipetas para dispensar todos los reactivos, por lo que deben lavarse por dentro y por fuera cada vez que tomen un reactivo distinto. Con relation a los reactivos, los analizadores pueden ser abiertos o cerrados. En el primer caso, pueden modificarse la mayoria de las magnitudes del análisis, de forma que es posible utilizar reactivos de diferentes suministradores. En cambio, en los sistemas cerrados no pueden realizarse modificaciones, por lo que deben utilizarse los reactivos que proporcione el suministrador del analizador en los contenedores y formatos adecuados.

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Cubetas de reacción Las cubetas de reaccion pueden ser desechables o reutilizables. En la mayoria de los sistemas, la cubeta de reaccion sirve también como cubeta de lectura fotométrica, mientras que en otros se aspira la solucion de las cubetas de reacción y se lleva a otra de medida. Las cubetas de plástico de la mayoria de los sistemas tienen una vida de entre uno y dos meses. En cambio, las cubetas de vidrio no se reemplazan, a no ser que se dañen. Una vez hecha la lectura, el ciclo de lavado implica aspirar la mezcla de reacción. Se añade una solucion de lavado varias veces y se aspira de la cubeta. Luego se añade agua desionizada y, tras aspirarla, se seca la cubeta mediante vacio o con aire a presión. De esta manera, la cubeta queda lista para utilizarse de nuevo. Baño de incubación Las cubetas de reacción van introducidas en baños de agua o en cámaras de aire termostatizadas a la temperatura de incubacion, generalmente 37ºC. Sistemas de medida La mayoría de las determinaciones de los analizadores automáticos de bioquimica clinica se realizan por medidas espectroscopicas de absorbancia. Algunos analizadores pueden realizar también medidas de fiuorescencia, turbidimétricas, nefelométricas y electroquimicas. Aamplificador y convertidor analógico-digital Por lo común, las señales eléctricas de los detectores deben amplificarse. Asi mismo, hay que convertir en digitales las señales analógicas amplificadas. Las señales analógicas que proceden de los detectores se transforman en digitales por medio de los convertidores adecuados. Procesadores de datos, pantalla e impresora Los datos digitales se procesan con los algoritmos programados para transformarlos en resultados que luego se imprimen. Mediante la pantalla, el operador está en todo momento informado de la situación del analizador. La pantalla se utiliza también para programar el analizador y solicitar las calibradones y las pruebas a realizar sobre cada espécimen. Principales tipos de analizadores comerciales En el momento actual existen en el mercado muchos sistemas automáticos para bioquimica clinica. Segun su capacidad de procesado pueden dividirse en tres grupos:

grandes sistemas y células de trabajo (work cell) sistemas para volumenes elevados sistemas para volumenes medios-bajos

Los grandes sistemas y células de trabajo son para grandes laboratorios con gran capacidad de especímenes, mientras que los otros sistemas se ajustan a laboratorios de diferentes tamanos. En las tablas siguientes se presentan los principales sistemas comerciales para volumenes medios-altos y bajos.

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15.2. MODELOS DE AUTOMATIZACIÓN______________________________________________________ El concepto de organización de laboratorio unificado (core lab) ha variado en los últimos años como consecuencia del progreso tecnológico. Pueden distinguirse dos modelos claramente diferenciados de core lab: el laboratorio totalmente automatizado y el laboratorio automatizado modular. En cualquiera de los dos casos, el laboratorio central obtiene beneficios cuando lleva acoplada toda la gestión del proceso preanalítico. En los laboratorios clínicos de gran volumen, totalmente automatizados, los tubos se llevan mediante una cinta transportadora a los módulos analíticos correspondientes, donde se cargan para procesarlos. El diseño del sistema de automatización y el de los analizadores se encarga de dirigir la conexión con la cadena. Hay dos tipos principales de conexiones: toma de muestras directa del tubo primario o de una alícuota de la cadena y toma de muestra por brazo robotizado que puede extraer temporalmente el tubo de la cadena. En los últimos años, la evolución de la tecnología ligada a los laboratorios ha planteado propuestas más flexibles, de tipo modular, que permiten a los laboratorios adaptarse mejor a futuros cambios importantes, tanto de tecnología como de estructura organizativa de trabajo. En este modelo la instrumentación se agrupa en “islas” o módulos de automatización (work-cells), atendiendo a criterios tecnológicos o de tipo de muestra, de manera que se crean áreas, físicamente independientes, para atender: • Área de preanalítica, con clasificación, centrifugación, preparación de alícuotas y sistemas de carga (racks) de los distintos analizadores, de las propias work-cells, o de equipos situados en otras áreas del laboratorio. • Determinaciones en sangre total, suero, plasma, orina o líquidos biológicos. • Bioquímica básica, inmunoanálisis homogéneos y heterogéneos. Algunas de estas work-cells, poseen su propio sistema de transporte mecánico de muestras entre los diferentes módulos incorporados o están constituidas por un solo instrumento modular. • Hematimetría. Pueden agrupar más de un equipo, sistema de transporte de muestras propio e incluso sistemas de preparación y teñido automático de extensiones de sangre. • Coagulación básica. Como ventajas de este sistema se pueden considerar: • Menor inversión inicial. • Mayor flexibilidad en la elección de los instrumentos analíticos. • Resolución de problemas de la fase preanalítíca. • No necesita grandes instalaciones. • Permite una mejor gestión de la urgencia. • Menores limitaciones arquitectónicas. Como inconvenientes: • No permite la gestión integral de la muestra. Sobre todo en cuanto a trazabilidad, custodia gestión de la fase postanalítica, sin un desarrollo informático especialmente dedicado a tal fin. • En los sistemas separados, o se transporta el tubo manualmente, de un analizador a otro, o no hay un ahorro significativo en el número de alícuotas. • Los sistemas modulares integrados, son totalmente cerrados, al igual que los que se sustentan sobre un solo equipo modular. No permiten la consolidación del inmunoanálisis, al tener que limitarse al panel desarrollado por el fabricante.

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15.3. INSTRUCCIONES PARA EL USO DE LOS ANALIZADORES____________________________________ Para el manejo de los analizadores y equipos auxiliares existen dos tipos de información:

Manual del usuario: proporcionado por el fabricante del aparato. Procedimiento Normalizado de Trabajo (PNT), elaborado por el laboratorio y que contiene las siguientes instrucciones: Puesta en marcha del analizador (encendido y apagado) Comunicación-conexión con el sistema informático Tareas de mantenimiento y limpieza Carga y disposición de reactivos, soluciones de calibración y control Solicitud de calibraciones y revisión de resultados de calibración Solicitud de controles de calidad y revisión de resultados de control Procesamiento de muestras de pacientes Revisión de resultados de pacientes Consulta de resultados Repeticiones, comprobaciones y diluciones Avisos y alarmas y su interpretación Imprimir y borrar datos Eliminación de residuos

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Fichas de analizadores y equipos auxiliares Cada analizador del laboratorio debe de tener una ficha en el que figuren los siguientes datos:

Nombre del analizador Código laboratorio / número de inventario Número de serie Proveedor Situación administrativa Fecha de instalación / baja Ubicación Requisitos de instalación Area asignada del laboratorio Manual de funcionamiento Mantenimiento preventivo Mantenimiento externo Registro de incidencias Técnica analítica que usa Finalidad de uso

Equipos auxiliares: El laboratorio necesita para realizar su trabajo una serie de equipos auxiliares: centrífugas, microscopios, micropipetas, estufas, termómetros, incubadores, placas termostáticas, etc. Cada equipo auxiliar del laboratorio debe de tener una ficha en el que figuren los siguientes datos:

• • • • • • • • • •

Nombre del equipo Código laboratorio / número de inventario Número de serie Proveedor Fecha de alta / baja Control de mantenimiento / calibración Frecuencia de mantenimiento / calibración Responsable de mantenimiento / calibración Intervalo de trabajo Incertidumbre máxima admisible

15.4. EL AGUA PARA EL LABORATORIO CLÍNICO_____________________________________________ En los laboratorios, la sustancia química que más se usa es el agua. Esta se utiliza para preparar la mayoría de los reactivos y de las disoluciones que se emplean en los laboratorios clínicos. El agua que proviene de la red pública contiene una variedad de contaminantes orgánicos e inorgánicos que pueden producir interferencias analíticas muy importantes. En general, en el laboratorio clínico se requiere el uso de agua pura. Lo que implica la eliminación del material disuelto o en suspensión en el agua. Es muy difícil obtener, y más difícil aún conservar, agua totalmente pura, ya que absorbe CO2 e iones metálicos procedentes del aire y de los recipientes que la contienen.

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La medida de la conductividad eléctrica o de la resistividad eléctrica del agua se utiliza para indicar su pureza en relación a iones inorgánicos. a > [material ionizable] > conductividad < pureza a < [material ionizable] > resistividad > pureza La forma más corriente de expresar la pureza del agua es indicar su resistividad específica, que es la resistencia que tiene cuando se coloca en un recipiente cúbico de 1 cm de lado, y se expresa en megaohmios (MΩ) por centímetro. Cuanto menor sea la cantidad de sustancias ionizables, menor será la conductividad y, por tanto, mayor la resistividad. Se emplea el término agua de grado reactivo, seguido de la concreción del tipo (de I a III). De esta forma se define las especificaciones del agua, con independencia del método de preparación. Los principales métodos para obtener agua de buena calidad son:

Destilación. Es una técnica física para purificar el agua que la convierte en vapor que luego se condensa, a la vez que se retienen las sustancias no volátiles contenidas en el agua original —como las impurezas inorgánicas y orgánicas y los microorganismos— que, de esta forma, se eliminan. En cambio, la destilación no consigue el mismo resultado con las impurezas volátiles, como el CO2, el cloro, el amoníaco y algunos compuestos orgánicos. Desionización. Se logra al pasar agua a través de resinas de intercambio iónico. Los cambiadores pueden ser de aniones o de cationes, pero nunca de ambos simultáneamente. Al pasar el agua por la columna que contiene las resinas cambiadoras, las impurezas iónicas contaminantes se cambian por los iones H+ y OH", localizados en la superficie de las resinas, que quedan retenidas en la columna. Las resinas cambiadoras pueden utilizarse en unidades separadas que cambien aniones o cationes, o en unidades mixtas que contengan una mezcla de resinas cambiadoras aniónicas y catiónicas. Con el uso, las resinas van perdiendo su capacidad de intercambio, pero pueden regenerarse tratándolas con ácidos o bases. La electrodesionización (EDI) elimina iones (inorgánicos y orgánicos). Esta tecnología utiliza resinas aniónicas y catiónicas de membrana selectiva semipermeable y de intercambio iónico (IEX) que se regeneran constantemente con una pequeña corriente eléctrica. Osmosis inversa. Es un proceso por el que se fuerza el agua a pasar a. través de una membrana semipermeable que actúa como un filtro molecular. La membrana elimina entre el 95 y el 99% de la materia orgánica, las bacterias y las demás materias particuladas, y entre el 90 y el 97% de todos los minerales ionizados o disueltos. Sin embargo, elimina menos las impurezas gaseosas. Aunque el proceso no es adecuado para producir agua de grado reactivo para el laboratorio, puede emplearse como método preliminar de purificación.

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Filtración con membranas: consiste en hacer pasar el agua a través de membranas semipermeables. La calidad de la filtración depende del tamaño del poro; un poro de 0,2 µm puede eliminar materiales insolubles, sólidos emulsionados y microorganismos. Adsorción: proceso por el que se eliminan algunas impurezas orgánicas del agua al tratarla con carbón activo, arcillas o silicatos. Cuando la adsorción se combina con la desionización y la filtración se produce agua de tipo I. Oxidación ultravioleta. La radiación ultravioleta de 254 nm elimina muchas bacterias y rompe muchos compuestos orgánicos ionizantes que posteriormente pueden eliminarse por desionización.

El control de las bacterias puede lograrse por diversos medios, incluyendo filtración de membrana (0,22 μm), UV germicida a 254 nm y sanitización química (ácido peracético, blanqueante, dióxido de cloro). La ultrafiltración (UF) como método de eliminación de los subproductos bacterianos. En general, ningún proceso de purificación de agua proporciona por sí solo agua que cumpla las rígidas especificaciones del agua de grado reactivo de tipo I. Por esto, se emplean diversas combinaciones de los procesos de purificación. Los sistemas más utilizados en los laboratorios clínicos para obtener agua de calidad combinan la desionización y la destilación, de forma que se eliminen tanto los iones como las sustancias orgánicas no volátiles. El agua de tipo III (resistividad de 0,1 MΩ/cm) se emplea para lavar el material de vidrio y para algunos procesos cualitativos. El agua de tipo II (resistividad de 1 MΩ/cm) se usa para la mayoría de las pruebas de laboratorio; y el agua de tipo I (resistividad de 10 MΩ/cm), para métodos como la absorción atómica.

15.5. LOS REACTIVOS________________________________________________________________ En bioquímica clínica se utilizan una gran variedad de reactivos con diversas finalidades. Un reactivo es cualquier compuesto químico usado como reactante en una reacción química. Los reactivos se pueden emplear para formar un precipitado o para impedir su aparición, para originar o evitar la formación de un color, o para cambiar las propiedades oxidantes o reductoras de una sustancia, etc. Según su utilización, los reactivos pueden ser de dos tipos fundamentalmente: reactivos líquidos o reactivos en fase sólida. Los reactivos líquidos se emplean en la mayoría de los analizadores: se colocan en recipientes de vidrio o plástico, el volumen del recipiente depende de la estabilidad del reactivo y de la capacidad de trabajo del analizador. Los reactivos en fase sólida se utilizan para una sola medición y se preparan impregnando el reactivo en una lámina de papel o de celulosa, de manera que la reacción tiene lugar cuando la muestra se coloca sobre la lámina (tiras o láminas reactivas).

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Equipos de reactivos Un kit o equipo de reactivos es un conjunto de dos o más reactivos que se emplean para determinar una sustancia y se suministran juntos en un envase con las instrucciones del procedimiento. Los kits de reactivos pueden utilizarse para hacer determinaciones manuales o con un instrumento o analizador automático en particular. Inicialmente, los equipos de reactivos se fabricaban para su uso general en el laboratorio y se adaptaban fácilmente a cualquier sistema analítico, tanto manual como automático. Sin embargo, en los últimos años, las empresas que fabrican reactivos para los laboratorios clínicos están sacando al mercado equipos de reactivos cada vez más cerrados, de forma que sólo puedan usarse con un sistema específico, por lo que modificar los equipos comerciales es cada vez más difícil. No obstante, estos equipos tienen ventajas, especialmente que las técnicas requieren una intervención cada vez menor de los operadores, lo que hace que disminuyan los errores. Entre sus inconvenientes está que estos equipos generalmente son más caros. Un equipo de reactivos es un conjunto de productos químicos e instrucciones de empleo, envasados conjuntamente, que sirven para medir una magnitud biológica. La presentación es muy variable: uno o varios productos liofílizados, sólidos que deben mezclarse antes de su empleo, o bien soluciones listas para su uso. Hace ya tiempo que existen equipos de reactivos para bioquímica clínica, sin embargo en los últimos años el crecimiento en el mercado de este tipo de productos ha sido exponencial. Es imprescindible que el fabricante incluya la información necesaria para que el usuario pueda trabajar en condiciones correctas con el material adquirido. El folleto que acompaña a cada equipo de reactivos debe informar sobre los siguientes aspectos: principio químico en que se basa el procedimiento, composición y estabilidad, temperatura óptima de conservación, error sistemático e imprecisión del procedimiento, valores de referencia, especificando cómo se han obtenido, y las oportunas referencias bibliográficas de los trabajos a que ese ha recurrido para preparar el equipo de reactivos. Todos los reactivos deberían fabricarse en condiciones estrictamente controladas y someterse a los oportunos programas de control de la calidad. El fabricante de equipos de reactivos debe establecer las especificaciones necesarias para todas las sustancias químicas que vayan a formar parte del equipo, asegurando así la pureza de los reactivos en todos los lotes. Se deben preparar los reactivos en condiciones de fabricación controladas en lo que respecta a temperatura, pureza del agua, exención de contaminación ambiental. Asimismo, debe inspeccionarse la calidad del material de vidrio o de plástico de los recipientes de los reactivos. Se debe comprobar que los frascos cierren herméticamente y que estén perfectamente limpios. Los reactivos pueden deteriorarse si se conservan a temperaturas incorrectas; es necesario determinar los efectos de la temperatura sobre la estabilidad de los reactivos e indicar la caducidad en la etiqueta de ios mismos. Siempre que sea posible, todos los reactivos, incluidos los equipos de reactivos, deben adquirirse a un fabricante que posea una certificación de la Organización Internacional de Normalización (ISO) o similar. Símbolos de peligrosidad internacionalmente reconocidos

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Definiciones y simbología de riesgo y etiquetado

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Ficha de datos de seguridad del reactivo La ficha de seguridad de un reactivo debe de contener la siguiente información: 1. Identificación de la sustancia / preparado y de la empresa distribuidora 2. Composición / información sobre los componentes 3. Identificación de los peligros 4. Primeros auxilios 5. Medidas de lucha contra incendios 6. Medidas en caso de vertido accidental 7. Manipulación y almacenamiento 8. Controles de la exposición y protección personal 9. Propiedades físicas y químicas 10. Estabilidad y reactividad 11. Información toxicológica 12. Información ecológica 13. Consideraciones relativas a la eliminación 14. Información relativa al transporte 15. Información reglamentaria 16. Otras informaciones

Documentación del reactivo (insert) Los kits de reactivos suelen contener la información necesaria para el procedimiento de medida de la prueba analítica:

Información para pedidos / Número de referencia Uso previsto Descripción de la prueba analítica para la que van a ser utilizados Procedimiento de medida (analizador, técnica y método de medida) Reactivos y soluciones de trabajo Medidas de precaución y advertencias Preparación de los reactivos Conservación y estabilidad de los reactivos Obtención, preparación y estabilidad de la muestra Programación de la prueba en el analizador Calibración Control de calidad Cálculo de resultados Limitaciones del análisis – interferencias Intervalo de medición – Límite inferior de detección - Dilución Precisión Valores de referencia Referencias bibliográficas

Varios de estos datos son registrados en la documentación del Procedimiento Normalizado de Trabajo (PNT) de los analizadores (ver capítulo 3.10) y en la referente a descripción, indicaciones e interpretación de las pruebas analíticas del laboratorio (ver capítulo 6.4).

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Buenas prácticas en gestión de reactivos Recomendaciones para una escasez controlada y un consumo adecuado Aprovechar al máximo los reactivos, calibradores y controles. Evitar repeticiones, calibraciones y controles innecesarios (ver intervalos de referencia, rango de las calibraciones y de los controles, etc). Conservar adecuadamente los reactivos, calibradores y controles. Calcular los cambios de lote para evitar gastos innecesarios. Conocer el tiempo de respuesta del suministrado. No acumular reactivos en neveras o almacén. Deben estar medio vacías. Conocer la caducidad de los reactivos, soluciones de calibración y control. Consumir siempre primero las cajas con una caducidad más próxima. Evitar el tener que desechar productos por haber caducado. Al llegar el pedido, poner las cajas de caducidad más temprana en primera fila. Hacer pedidos mínimos. Se sirven rápido. Se pueden hacer urgentes. Conocer lo consumido, lo que se va a consumir, la duración de los envases y el precio de los reactivos y del material. Conocer el número aproximado de determinaciones mensuales que se hacen de cada magnitud. Antes de pedir, revisar el último pedido, ver si llegó todo o si falta algo, mirar bien lo que queda en nevera y/o almacén. Consultar con supervisora. Periódicamente realizar una valoración del stock del laboratorio (neveras, almacenes, etc).

15.6. LOS MATERIALES DE CALIBRACIÓN___________________________________________________ Calibración: conjunto de operaciones que establecen, bajo determinadas condiciones, la relación entre los valores de una magnitud en unos materiales de referencia y los valores de las señales que estos generan en un analizador o en otro sistema de medida. Calibrador: material de referencia usado para la calibración. Matriz: La sustancia que contiene el analito que se analiza (por ejemplo, suero, orina, líquido cefalorraquídeo, sangre completa). Materiales de calibración: Son disoluciones que contienen sustancias en concentración conocida y en las que el disolvente puede ser acuoso o bien orgánico. Estos últimos tienen características fisicoquímicas (matriz) similares a las de los especímenes del laboratorio clínico. Según su origen, los calibradores pueden ser primarios o secundarios. El sistema de referencia para las medidas del laboratorio clínico, establecido en 1979, explica con claridad la relación entre los materiales de referencia (que pueden utilizarse como calibradores) y los métodos analíticos. Material de referencia primario: es una disolución de sustancias bien caracterizadas, estables, homogéneas, en las que se ha verificado que una o más propiedades fisicas o químicas están exentas de incertidumbre. Por lo general los solutos se añaden al disolvente (acuoso u orgánico) mediante pesada. - Material de referencia certificado: es un material que ha elaborado un organismo aceptado como competente. El material lleva un certificado indicando las propiedades. Existen varios organismos

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certificadores: el National Bureau of Standards (NBS), el European Community Bureau of Reference (BCR), el National Physical Laboratory (Reino Unido) y el Bureau National de Métrologie (Francia). - Materiales de referencia de matriz biológica: son mezclas de suero purificadas mediante diálisis, en las que se determina la concentración con métodos definitivos. Todos estos materiales al utilizarse como calibradores se denominan calibradores primarios. - Materiales de referencia secundarios: son soluciones acuosas u orgánicas en las que los constituyentes se han valorado analizándolos con métodos definitivos o de referencia. Al utilizarse como calibradores se denominan calibradores secundarios. - Métodos definitivos: son métodos analíticos capaces de dar la mayor exactitud posible y que cumplen los requisitos para los que se ha creado el método. Se han definido para muy pocos constituyentes bioquímicos y por lo general consisten en una combinación de espectrometría de masas y dilución isotópica. - Métodos de referencia: son los métodos con una inexactitud e imprecisión perfectamente documentadas y con una mínima susceptibilidad de interferencias. Se han descrito para muchos constituyentes bioquímicos. - Métodos de rutina: son los que se utilizan en los laboratorios asistenciales, con una inexactitud, imprecisión y especificidad suficientes para el uso que se les da.

Sistema de referencia para las medidas del laboratorio clínico Métodos

Materiales

Métodos definitivos Uso: evaluación de métodos de referencia y de materiales de referencia primarios

Materiales primarios Uso: desarrollo y evaluación de métodos de referencia, calibración de métodos definitivos y/o de referencia, producción de materiales secundarios

Métodos de referencia Uso: asignación de valores a materiales de referencia secundarios y controles, evaluación de métodos de rutina

Materiales secundarios Uso: calibradores para métodos de rutina, asignación de valores a materiales de control

Métodos de rutina Uso: análisis de magnitudes biológicas en laboratorios asistenciales

Materiales de control Uso: garantía de calidad

Sistema de referencia; estructura jerárquica Los calibradores se emplean para relacionar una determinada medida del sistema analítico (por ejemplo, la absorbancia) con una determinada concentración. A partir de esta relación, se calcula la concentración de especímenes problema en función de la medida obtenida en el análisis de los especímenes problema.

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15.7. LOS MATERIALES DE CONTROL_____________________________________________________ Los materiales de control son muestras que se intercalan entre los especímenes de los pacientes para determinar la calidad del proceso analítico. Tienen que cumplir tres condiciones fundamentales:

- ser estables para detectar cambios en la metodología con el tiempo - ser repetitivos, es decir, presentar variaciones mínimas en sus propios resultados - tener un comportamiento similar al de los especímenes en los métodos analíticos

Los materiales de control se pueden preparar en el propio laboratorio a partir de los sobrantes de las muestras de los enfermos, tras descartar las muestras que podrían producir interferencias (hemolizadas, ictéricas...). La mezcla se homogeneiza y se mantiene congelada en alícuotas. Estos controles son baratos, tienen una matriz idéntica a la de los especímenes de los pacientes y no necesitan reconstitución. Presentan problemas de estabilidad y requieren ser analizados en condiciones óptimas de trabajo antes de emplearlos como controles en la rutina diaria. Es imprescindible comprobar que no presentan anticuerpos frente a la hepatitis y al VIH. Otra posibilidad es comprar controles comerciales. Son más caros, pero también más estables, y permiten calcular parámetros estadísticos a largo plazo. Los de origen animal no presentan peligro de infección por los virus de la hepatitis y por el VIH, pero tienen el inconveniente de que pueden comportarse de forma diferente que los especímenes humanos en determinados métodos analíticos. Pueden tener una matriz sérica, urinaria, de sangre total, líquido cefalorraquídeo, etc. Hay controles comerciales liofilizados en los que es imprescindible que la variabilidad vial a vial sea la menor posible. También hay controles líquidos que se mantienen a -20°C en estado líquido; así evitan los problemas de reconstitución, pero, en cambio, presentan problemas de estabilidad y de efecto matriz. La estabilidad de los liofilizados comerciales, una vez reconstituidos, a veces plantea problemas en los laboratorios con la jornada laboral larga, especialmente en los de urgencias que funcionan las 24 horas. Los constituyentes más afectados son las enzimas, para las que se recomienda reconstituir el liofilizado con agua destilada a 4°C y mantenerlas refrigeradas.

Materiales de control Materiales Valorados

No valorados

Preparados en el laboratorio

Ventajas Control imprecisión Control inexactitud No infectivos Control imprecisión Control inexactitud * Caducidad larga Coste reducido Control imprecisión

Desventajas Coste elevado Caducidad corta

------Coste incontrolable Análisis previos Inestabilidad

* sólo en programas externos de calidad

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Matrices de los materiales de control

Bioquímica

Suero humano Suero animal Gases en sangre Orina Sangre total Matriz sérica con fármacos Matriz urinaria con drogas de abuso Líquido cefalorraquídeo

Hematología

Sangre total

Coagulación

Plasma

La concentración del control ha de coincidir con los niveles de interés clínico, los cuales generalmente son valores cercanos al límite superior del intervalo de referencia, aunque en determinadas patologías interesa controlar determinadas concentraciones críticas. Lo más habitual es trabajar con dos o tres niveles de concentración. La asignación de valores al material control es un tema muy importante. Hay que evitar que las muestras control se procesen en condiciones diferentes a las de los especímenes de los pacientes, ya que se podrían manipular con cuidado especial para obtener mejores resultados. Por eso existen los llamados controles semiciegos, con un valor desconocido por el personal del laboratorio que hace el análisis. También se pueden utilizar controles ciegos, los cuales no son identificados como control por los técnicos del laboratorio. Controles normales y patológicos. Un producto de control normal contiene concentraciones normales para el analito sometido al test. Un producto de control patológico contiene el analito a una concentración superior o inferior al intervalo normal para dicho analito. Cuando el resultado del QC diario obtenido para el control se compara con el intervalo calculado para dicho control, y todos los resultados están dentro del intervalo previsto, indica que el proceso analítico está “controlado” durante los días en los que se realizaron los tests. Cuando el resultado del QC diario se compara con el intervalo definido para dicho control y se observa que alguno o varios resultados están fuera del intervalo aceptable, el proceso analítico está “fuera de control” para esa concentración. Este resultado indica que se ha producido un error que puede haber originado resultados de pacientes que serían anormalmente altos o bajos, según la concentración del control y que no tienen fiabilidad. Por lo tanto, resulta evidente que el intervalo definido para cada nivel de control es esencial para el sistema de control de calidad.

15.8. SERIE ANALÍTICA________________________________________________________________ Es el conjunto de medidas realizadas, o de resultados obtenidos, con un mismo procedimiento de medida entre dos momentos previamente definidos. Conjunto de análisis realizados consecutivamente en un intervalo dentro del cual se considera que la inexactitud y la imprecisión del sistema de medición son estables; es específica para cada sistema analítico. En algunos sistemas incluye todos los resultados calculados a partir de un único proceso de calibración.

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15.9. LÍMITE INFERIOR DE DETECCIÓN – SENSIBILIDAD ANALÍTICA_______________________________ El límite inferior de detección equivale a la menor concentración medible de analito que puede distinguirse de cero (blanco). Se calcula como el valor situado a tres desviaciones estándar por encima del estándar más bajo (estándar 1 + 3 DE, precisión intraensayo, n = 21). Diferencia en concentración del constituyente correspondiente a la más pequeña diferencia en la respuesta del método que pueda ser detectada. La sensibilidad de un instrumento de medida puede depender del valor del mensurando. Es igual a la pendiente de la función de calibración. En química analítica y en bioquímica clínica, para aludir a este concepto a menudo se usa el término sensibilidad analítica.

15.10. INTERVALO DE MEDIDA – LINEALIDAD______________________________________________ Intervalo de valores de una magnitud en el que el procedimiento de medida es aplicable sin modificaciones. En el laboratorio clínico habitualmente abarca desde el valor crítico hasta el límite de dilución. También puede abarcar la diferencia entre dos límites de un rango nominal. Linealidad (de un procedimiento de medida): característica de un sistema de medida dada por el hecho que su función de calibración coincide con la ecuación de una recta. La linealidad acostumbra a darse sólo dentro de un intervalo de valores determinado.

15.11. INTERFERENCIAS______________________________________________________________ Interferencia: Desviación clínicamente significativa en la medida de la concentración de un constituyente, debida al efecto de otro componente o propiedad de la muestra. El efecto puede ser debido a la inespecificidad del sistema de medida, a la supresión de la reacción del indicador, a la inhibición del constituyente si se trata de una enzima o a cualquier causa de desviación dependiente de la muestra. Error sistemático producido por un interferente en un proceso analítico. Según que el error sea positivo (resultados falsamente elevados) o negativo (resultados falsamente disminuidos), la interferencia se denomina positiva o negativa, respectivamente. Interferencia clínicamente significativa: interferencia superior al error de medida máximo tolerable para una magnitud dada. Para cada magnitud biológica el error de medida máximo tolerable suele establecerse a partir de la variabilidad biológica. Interferente; sustancia interferente: componente de una muestra, distinto del componente en estudio, que causa una interferencia. Indices séricos: determinación objetiva automatizada de sustancias interferentes que pueden afectar a los test de laboratorio clínico por la presencia de componentes endógenos y exógenos en la matriz de la muestra. Esta determinación objetiva ofrece beneficios sobre la interpretación visual subjetiva, tales como: trazabilidad, eficiencia y efectividad del proceso analítico. Los índices séricos se denominan índice de lipemia (L), hemólisis (H) e ictericia (I). Las interferencias pueden ser endógenas y exógenas y las más habituales están producidas por:

Lipemia Hemólisis Bilirrubina Fármacos

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La muestra lipémica

Las muestras de plasma y suero a veces presentan turbidez en grados variables debido a un aumento de la concentración de lipoproteínas. En casi todos los casos, la turbidez esta ocasionada por una concentración elevada de triglicérido. Al plasma o suero turbio también se le ha llamado opalescente, translúcido, o lechoso. El grado de turbidez depende no solamente de la concentración de triglicérido sino también, más notablemente, de la presencia de especies macromoleculares de lipoproteínas. Por esta razón a las muestras turbias se les llaman lipémicas. La importancia diagnóstica de la turbidez Debido a que las muestras normales no exhiben ninguna turbidez excepto después de una comida rica en grasas, la turbidez de una muestra es siempre de relevancia clínica y debería ser evaluada, documentada e informada por el laboratorio. Puede indicar hipertrigliceridemia debido a un aumento en quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) o ambos. Como se describe en los libros de texto, estas formas pueden ser diferenciadas observando el comportamiento en la flotación de las lipoproteínas durante la centrifugación y almacenamiento. Una capa cremosa distinguible que flota sobre una capa clara después de centrifugar y almacenar durante al menos 12 h en el refrigerador indica la presencia de quilomicrones. En contraste, una turbidez más homogénea está ocasionada por la presencia de concentraciones aumentadas de VLDL en la mayoría de los casos. La concentración de triglicérido que produce turbidez depende de la composición de las lipoproteínas. Los quilomicrones, debido a su tamaño, desvían la luz en proporción perceptible incluso a concentraciones de triglicérido por debajo de 3,4 mmol/L. Sin embargo, las lipoproteínas de densidad intermedia pueden ser invisibles incluso a concentraciones de triglicérido de 9,0 mmol/L, o más altas. Con las VLDL se observan diversos grados de turbidez, dependiendo de su tamaño y composición. Mecanismos de interferencia Se ha encontrado que los siguientes mecanismos pueden ocasionar que los resultados de laboratorio estén falsamente elevados o disminuidos: -

No homogeneización de la muestra. Desplazamiento de agua. Interferencia por turbidez. Interferencia por mecanismos fisicoquímicos.

Hemólisis

Introducción La sangre se compone de células y plasma. Muchos componentes cuya concentración se mide en el plasma tienen concentraciones relativamente altas en las células de la sangre. Por lo tanto, deberá evitarse la hemólisis para obtener resultados fiables. La hemólisis en las muestras para diagnóstico puede generar resultados erróneos en muchas de las determinaciones habituales en química clínica y puede, en algún caso, tener repercusión grave para el paciente. La hemólisis es la principal causa de rechazo preanalítico de muestras de suero. Definición de la hemólisis La hemólisis es el proceso de destrucción de los hematíes, que conlleva la liberación del contenido intraeritrocitario en el plasma alterando su composición. La principal molécula intraeritrocitaria es la hemoglobina, que tiene un espectro de absorción característico del grupo Hem, con un pico de 405 nm y varios picos entre 500-600 nm, lo que produce un color rojizo en el plasma proporcional a la hemoglobina liberada. La hemólisis se ha definido como la salida de componentes de las células sanguíneas al plasma o al suero.

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En la hemólisis in vivo sólo aparecen en plasma los componentes de alto peso molecular (hemoglobina o LDH) y tiene significado patológico. En la hemólisis in vitro el contenido intraeritrocitario íntegro se diluye en el plasma de la muestra. Se reconoce comúnmente por un aspecto más o menos rojizo del plasma o suero después de la centrifugación, ocasionado por la hemoglobina liberada desde los eritrocitos Causas de la hemólisis En la mayoría de las enfermedades que cursan con destrucción acelerada de los hematíes, ésta se produce en la red microvascular y en las áreas especializadas en la recuperación de los elementos intraeritrocitarios, como el bazo (hemólisis extravascular). Solamente en las enfermedades que producen una destrucción masiva, que sobrepasa la capacidad de los sistemas de recuperación, se encuentra hemoglobina libre en el plasma (hemólisis intravascular). Con gran diferencia, la causa más frecuente de aparición de muestras hemolizadas es el deterioro producido en la fase preanalítica extralaboratorio, principalmente durante la obtención de las muestras, pero también durante su transporte y procesamiento. Las causas más estudiadas están en relación con estos procesos: • Flebotomía (extracción de sangre) • Transporte de las muestras de sangre • Procesamiento de las muestras Mecanismos de interferencia - Los efectos de la hemólisis pueden clasificarse de acuerdo con los mecanismos implicados: - Aumento de los componentes intracelulares en el fluido extracelular. - Interferencia óptica debida al color de la hemoglobina. - Interferencia por componentes intracelulares con el mecanismo de reacción del procedimiento de medida (interferencia química, bioquímica e inmunológica).

La bilirrubina

La ictericia se define como un nivel elevado de bilirrubina en sus diferentes tipos (conjugada o sin conjugar) en suero y plasma. Los niveles elevados de bilirrubina pueden deberse a trastornos o condiciones orgánicas que, por hemólisis, hacen que la producción de bilirrubina sea más rápida de lo que el hígado requiere en metabolizarla. La inmadurez del hígado y otras numerosas enfermedades en las cuales el mecanismo de conjugación de la bilirrubina está alterado provocan asimismo un aumento similar de la bilirrubina no conjugada circulante. La obstrucción del conducto biliar o daños en la estructura hepatocelular conllevan concentraciones elevadas de la bilirrubina conjugada (directa) y no conjugada (indirecta) en el torrente sanguíneo. La concentración de bilirrubina en suero es una magnitud influyente en la medida de la concentración de creatinina en el mismo suero por el método de Jaffé con lectura a varios puntos.

Los fármacos

Los mecanismos de interferencia de los fármacos La interferencia de los fármacos sobre las pruebas de laboratorio pueden catalogarse en sentido amplio como biológica o química. Un efecto farmacológico surge como consecuencia de que el fármaco se metaboliza en el cuerpo y el metabolito subsiguiente interfiere con el examen de laboratorio. Otro efecto farmacológico es el relacionado con la capacidad del fármaco para aumentar la concentración de proteínas transportadoras.

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Esto puede dar lugar a un aumento en la concentración de componentes enlazados a tales proteínas. La interferencia de fármacos que se clasifica como técnica, por otra parte, se refiere a las interferencias in vitro que pueden ser o bien químicas o físicas, tales como muestras bemolizadas o ictéricas, etc. Mecanismos de interferencia: Influencia biológica in vivo: - Inducción enzimática. - Inhibición enzimática en el hígado o en el plasma. - Incremento de proteína enlazante. - Competición con componentes endógenos por glucoronización. - Efecto antivitamina. - Citotoxicidad hepática del riñón. Interferencia química y física in vitro: - Reactividad cruzada en procedimientos inmunoquímicos. - Reactividad química con el reactivo. - Producción de hemoglobinas atípicas.

15.12. ALARMAS Y AVISOS____________________________________________________________ Alarma instrumental: señal emitida por un instrumento de medida que indica que se ha producido una anomalía en el proceso de medida. Relacionados habitualmente con problemas de: • Mecánicos de funcionamiento del analizador • Red eléctrica • Informáticos de hardware o software • Reactivos y soluciones • Calibración • Control de calidad • Muestras • Reacción química • Técnica analítica • Interferencias • Valores de referencia y alarmantes En algunas ocasiones la alarma puede originar la parada del equipo y en otras puede ser un aviso de que algo no funciona correctamente y deben de emprenderse acciones correctivas para solucionarlo.

«No se informará ningún resultado que presente cualquier signo de alarma, no linealidad, fuera de rango de medición, interrogaciones, inestabilidad, aviso de muestra, etc. Se tomarán las medidas necesarias para comprobar el estado de la muestra, reprocesarla, diluirla, etc.,. o solicitar una nueva muestra»

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15.13. RESULTADOS ABERRANTES O ABSURDOS____________________________________________ Valor aberrante: elemento de un conjunto de valores que es incoherente con otros elementos de dicho conjunto. Son aquellos resultados que se salen de tal manera de los límites de referencia que, como su nombre indica, son absurdos, aberrantes, imposibles e incompatibles con la vida y no se deben informar nunca, procediéndose una vez estudiadas las posibles causas de su aparición, a su repetición analítica.

15.14. DILUCIONES, FACTOR DE DILUCIÓN, COMPROBACIONES Y REPETICIONES____________________ Es habitual en el laboratorio que cuando la concentración de la magnitud que se pretende analizar es muy elevada en la muestra, dando avisos o alarmas de linealidad o agotamiento de sustrato, etc., en los analizadores no permitiendo su análisis directo, se proceda a disminuir su concentración diluyendo la muestra, para que de esta manera, con concentración más baja permita su medición dentro de los rangos de medida del método analítico. El resultado obtenido se deberá multiplicar por el denominado factor de dilución para obtener el resultado final. La dilución expresa la relación de una disolución en un volumen total. Así, por ejemplo, una dilución 1:5 contiene 1 volumen de una disolución original en un volumen total de 5. La fórmula: V x c = V' x c' (donde V = volumen de la disolución concentrada; c = concentración de la disolución concentrada; V' = volumen de la disolución diluida; c' = concentración de la disolución diluida) es la más utilizada para preparar diluciones. Por ejemplo, para diluir una muestra de suero 1:10: • • •

Se toma 1 volumen de suero (0,1 mL, 1 mL, etc.) y Se añaden 9 volúmenes del diluyente (0,9 mL, 9 mL, etc.), respectivamente. El factor de dilución en este caso sería 10 y habría que multiplicar el resultado obtenido en la muestra diluida x 10 para tener el resultado final.

El diluyente, habitualmente, suele ser agua destilada o solución salina.

15.15. PROCEDIMIENTO ANALÍTICO ALTERNATIVO__________________________________________ Se establecerá en la documentación del Procedimiento Normalizado de Trabajo (PNT) del laboratorio que procedimiento analítico alternativo (analizador, reactivos, método, etc.) está previsto realizar para la determinación de las pruebas en el caso de no poderse realizar con el habitual y de esta forma no parar o bloquear el procesamiento de muestras y la emisión de informes de resultados de aquellas analíticas solicitadas al laboratorio que requieran un resultado en un margen reducido de tiempo o porque produzcan una gran cantidad de muestras pendientes, que habrá que almacenar y conservar, que altere el funcionamiento adecuado del laboratorio.

15.16. POCT (POINT OF CARE TESTING)___________________________________________________ Pruebas en el punto de cuidados: Las pruebas en el lugar de asistencia al paciente se definen como aquellas magnitudes biológicas que se determinan, fuera del laboratorio, en un entorno próximo al lugar de asistencia al paciente y que son realizadas por personal ajeno al mismo. Supone una descentralización del laboratorio y un control remoto o a distancia por parte de este.

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La aparición y el desarrollo de este tipo de pruebas han estado condicionados, en buena parte, por los progresos y cambios tecnológicos. Los progresos en la electroquímica y la óptica, la eficiencia en la transducción de la señal térmica y, en especial, la miniaturización electrónica han contribuido al desarrollo de analizadores pequeños y portátiles que pueden utilizarse en el lugar de asistencia (unidades de cuidados intensivos, urgencias, ambulancias, centros periféricos, consultas médicas, etc.). El objetivo de las pruebas cerca del paciente es facilitar un diagnóstico rápido y unas decisiones más rápidas sobre el tratamiento para mejorar el cuidado del paciente y reducir la morbilidad y mortalidad. Sistemas sin instrumentos Estos sistemas utilizan tiras de plástico o cartuchos con todos los reactivos necesarios para producir la reacción y dar un resultado que puede evaluarse visualmente. Utilizan reacciones químicas, reacciones enzimáticas o inmunoanálisis. Pueden analizarse diversos especímenes como sangre total, suero o plasma, orina, saliva o heces. Las formas predominantes son los análisis cualitativos con una lectura positiva o negativa, aunque también hay sistemas semicuantitativos. Entre estos sistemas se encuentran las tiras reactivas para el análisis de orina, los test de gestación, las drogas de abuso, los marcadores cariacos, los marcadores de enfermedades infecciosas, la sangre oculta en heces y las tiras reactivas para la medida de glucosa. Se emplean controles de calidad positivos/negativos incorporados a las pruebas que se realizan simultáneamente con el análisis del espécimen. Sistemas con instrumentos Este tipo de instrumentos de pequeño tamaño que proporcionan resultados cuantitativos, se presentan en una importante variedad de formatos. Sin duda alguna, los más difundidos son los analizadores de glucosa en la sangre, de los que existen opciones recientes que permiten su conexión a los sistemas de información del laboratorio. También son cada vez más frecuentes las instalaciones de analizadores de gases descentralizados, que han supuesto una mejora asistencial importante en el tratamiento de pacientes críticos. Existen otros instrumentos que pueden realizar un panel más amplio de mediciones, incluyendo la concentración de glucosa, de lactato, de los electrólitos más importantes, marcadores cardiacos, pruebas de coagulación y hemoglobina glicosilada. Todos estos instrumentos utilizan pequeñas cantidades de sangre que puede obtenerse por una extracción convencional o mediante punción en el dedo, con lo que han obviado la necesidad de la centrifugación de la muestra. Utilizan generalmente controles de calidad automáticos, en el que se analizan controles de calidad líquidos de forma automática por los aparatos, sin intervención de los operadores. Controlan la electrónica de los aparatos y la integridad de los reactivos. Se pueden programar de forma que avisan al usuario cuando detectan fallos y sea necesario el control de la calidad. Las próximas generaciones podrán incluir analizadores in vivo, extracorpóreos o basados en catéteres. Algunos pocos componentes, como la glucosa, pueden ser incluso susceptibles de controlarse de forma incruenta, mediante la espectroscopia transcutánea de infrarrojos. Existen algunas ventajas evidentes asociadas a la implantación de las POCT. La más clara es la reducción del tiempo de respuesta, lo que contribuye a minimizar el tiempo que el clínico necesita para valorar todo el proceso general, desde la solicitud de la medición hasta la interpretación del resultado y la intervención terapéutica. Otra ventaja, de índole más práctica, es que la medición puede realizarla el mismo personal de las salas de hospitalización, que ya proporciona otros cuidados al paciente, con lo que la frecuencia de las mediciones puede adecuarse a las necesidades asistenciales reales. También se han descrito algunos inconvenientes asociados al uso de estas pruebas. El coste por medición puede ser superior, aunque existen discrepancias en los estudios publicados sobre esta cuestión. Puede existir una importante variación respecto a los resultados del laboratorio central, lo que obliga a extremar

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las precauciones para asegurar la transferibilidad de los resultados. Además, conseguir una correcta formación del personal que utiliza los equipos, desarrollar un programa de control de la calidad adecuado y el mantenimiento de los instrumentos pueden ser cuestiones difíciles de resolver, particularmente cuando mucho personal ajeno al laboratorio realiza estas mediciones. Sin embargo, aún quedan muchas cuestiones por resolver que van a dar la auténtica dimensión futura de las POCT. Lo primordial es que el laboratorio se haga responsable de ellas, tanto de la selección de los instrumentos como de que su puesta en marcha responda a una serie de premisas y condicionantes que van a ser los que determinarán el éxito del mismo:

Debe existir una justificación médica, basada en la necesidad de información en un período de tiempo concreto, que influya de forma significativa en las decisiones sobre la atención al paciente. La calidad de la información del laboratorio clínico debe dar soporte a una atención médica de calidad. La información del laboratorio errónea o poco fiable es peor que no disponer de información. El método utilizado debe permitir que el personal ajeno al laboratorio pueda realizar adecuadamente la medición, incluso si la realiza de forma infrecuente. El procedimiento de medida y la instrumentación deben ser seleccionados o aprobados por el facultativo del laboratorio clínico experto en ese campo. El laboratorio clínico debe proporcionar y actualizar los procedimientos de operación de los equipos. El laboratorio debe desarrollar el procedimiento para capturar los resultados del paciente y supervisar el proceso de transmisión de los mismos al sistema de información del laboratorio y al del hospital. El personal del laboratorio clínico ha de ser responsable de la formación del personal que utilizará estos equipos y realizará las mediciones. El personal que realice estas mediciones deberá estar acreditado para esta finalidad, para lo cual deberá demostrar su capacidad para obtener resultados adecuados de forma reiterada. Sólo el personal que haya sido identificado, formado y acreditado por el laboratorio estará autorizado para realizar estas mediciones. El mantenimiento básico de los equipos debe estar a cargo del personal que utiliza los equipos. Las averías y los mantenimientos considerados complejos serán responsabilidad del personal del laboratorio clínico central. Los datos de control de la calidad deben obtenerse en el transcurso de la actividad ordinaria por el personal que normalmente utiliza los equipos para estas mediciones. El laboratorio clínico central controlará periódicamente la habilidad del personal que realiza estas mediciones usando muestras desconocidas que simulen muestras reales. El personal del laboratorio clínico proporcionará información crítica a las unidades de hospitalización sobre los resultados del control de la calidad y sobre los datos de los controles expuestos en el punto anterior al responsable adecuado de la unidad de hospitalización. La desatención o el desinterés en cualquiera de los puntos anteriores deberá considerarse como una indicación clara en contra de la puesta en marcha de las mediciones junto a la cabecera del paciente.

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Capítulo 16. Garantía de la calidad. Sistemas de gestión de la calidad. Certificación. Acreditación

Terminología 16.1. Variabilidad extraanalítica 16.2. Variabilidad analítica aleatoria 16.3. Soluciones de control de calidad 16.4. Datos estadísticos básicos para control de calidad 16.5. Gráficas de control de calidad 16.6. Reglas de control de procesos estadísticos 16.7. Indicadores de calidad analítica. Control de calidad interno y externo 16.8. Aplicaciones del control interno de la calidad. Planes de mejora 16.9. Especificaciones-objetivos de calidad analítica 16.10. Control de calidad pre y post analítico. Indicadores 16.11. Sistemas de gestión de la calidad. Certificación. Acreditación. Mejora continua

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TERMINOLOGÍA____________________________________________________________________ Control de la calidad (Quality Control): Parte de la Gestión de la Calidad orientada al cumplimiento de los requisitos de calidad. Define los procedimientos para monitorizar la calidad de los resultados de las pruebas, detectando problemas antes de la entrega de resultados, de manera que asegure la prestación necesaria para cumplir los requisitos clínicos. Sistema de actividades que tiene por objetivo controlar la calidad de un producto o servicio de forma que cumpla las necesidades de los usuarios. El objetivo es proporcionar la calidad satisfactoria, apropiada, segura y económica. El control de la calidad se realiza al final del proceso y por tanto es de naturaleza reactiva (acción correctiva). Evaluación de la Calidad (Quality Assessment): Se refiere al examen sistemático de la extensión en que una entidad es capaz de cumplir los requisitos especificados. Se refiere a la revisión objetiva de los resultados del laboratorio por medio de un organismo externo, mediante la comparación con otros laboratorios para comprobar si se cumplen los requisitos de calidad (programas de evaluación externa de la calidad). Garantía de la Calidad (Quality Assurance): Parte de la Gestión de la Calidad orientada a proporcionar confianza en que se cumplirán los requisitos de la calidad. Se refiere a la monitorización de una forma amplia, englobando la totalidad de los procesos y características que comportan la consecución del cumplimiento de las necesidades clínicas. Sistema de actividades que tiene por objetivo dar al usuario de un producto la garantía de que el producto cumple las normas o estándares de calidad definidos. La garantía de calidad consta de dos actividades separadas pero relacionadas entre sí: control de calidad y evaluación de la calidad. Gestión total de la Calidad (Total Quality Management): Sistema global de actividades coordinadas para dirigir y controlar una organización con respecto a la calidad. Diagrama de Deming: Planificación – Procedimientos analíticos – Control – Evaluación – Mejora – Planificación. Mejora de la Calidad (Quality Improvement): Parte de la Gestión de la Calidad orientada a aumentar la capacidad para cumplir los requisitos de la calidad. Se refiere a aquellas actividades que ayudan a determinar las causas y el origen de los problemas detectados. Planificación de la Calidad (Quality Planning): Parte de la Gestión de la Calidad enfocada al establecimiento de los objetivos de la calidad y a la especificación de los procesos operativos necesarios y de los recursos relacionados para cumplir estos objetivos. Describe como establecer y validar los procesos que cumplen los objetivos de la calidad, es decir, las necesidades clínicas. Incluye la selección y evaluación de nuevos métodos y la selección y diseño de los procedimientos de control de la calidad. Procesos Operativos de Calidad (Quality Laboratory Processes): Describe los sistemas y procedimientos que definen como se ha de realizar el trabajo diario en el laboratorio.

16.1. VARIABILIDAD EXTRAANALÍTICA___________________________________________________ Desde el punto de vista de la secuencia temporal, todas las pruebas de laboratorio atraviesan tres fases. Fase preanalítica (clínico, solicitud de análisis, toma de muestra, preproceso de la muestra), fase analítica (análisis) y fase postanalítica (transcripción de resultados, elaboración del informe, emisión del informe, interpretación del informe). La primera y la última constituyen lo que se llama fase extraanalítica de las pruebas.

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Desde hace años los laboratorios clínicos han invertido gran parte de los recursos en el control de la fase analítica, mientras que a la fase extraanalítica no se le ha dado gran importancia o en muchos casos se ha olvidado. Variabilidad preanalítica Es la variabilidad que se da en la fase preanalítica. La fase preanalítica es la que abarca todos los procesos que van desde el momento en que se hace la petición hasta que la muestra ya preparada entra en la fase analítica. Esta fase, que muchas veces no se ha considerado adecuadamente, es de gran importancia, porque los factores que inciden en ella afectan de forma muy importante a los resultados, incluso llegan a invalidar un informe analítico, ya que la mayor parte de los componentes analizados, por no decir la totalidad, quedan afectados. Para sistematizar el estudio de los agentes capaces de influir en la variabilidad preanalitica, lo dividiremos en los siguientes apartados: - Variabilidad biológica intraindividual. - Variabilidad debida a factores fisiológicos. - Variabilidad debida a factores del momento de la extracción. - Variabilidad debida al procedimiento de extracción - Variabilidad debida a factores de la muestra. •

Variabilidad biológica intraindividual

Mientras que normalmente se tiene en cuenta la variabilidad analitica (imprecisión) en la interpretación de los resultados del laboratorio, se suele ignorar la variabilidad biológica, seguramente porque es dificil interpretar su contribución a la variabilidad total. El componente de esta variación habitualmente se ha interpretado con modelos un poco primitivos, como el modelo homeostático, que se expresa como un punto alrededor del cual fluctúan, más o menos al azar, el conjunto de resultados de un individuo. Cabe definir la variación intraindividual como el componente biológico de la variación total observada durante un período de tiempo. Las causas de esta variación incluyen tanto los factores endógenos como los exógenos. Entre los factores endógenos, los más importantes son los relativos a los ciclos hormonales que se producen durante el día y que pueden influir de forma importante en otros componentes analíticos. Entre los factores exógenos están las causas ambientales, como el estrés y la actividad física que se haya realizado antes de la extracción. Con finalidad preventiva es importante dividir la variación biológica en variación intradía y variación interdía, y ambas tienen dos componentes: uno sistemático y previsible y otro aleatorio e imprevisible. •

Variabilidad debida a factores fisiológicos

- Efecto de la ingesta de alimentos La ingesta reciente de alimentos afecta de manera importante a muchos componentes bioquimicos séricos, mientras que los componentes urinarios únicamente presentan pequeños cambios. Los triglicéridos pueden alcanzar 10 veces más su valor inicial tras una comida rica en grasas, y deberán transcurrir doce horas para volver a los valores iniciales. El colesterol refleja las tendencias alimentarias a largo plazo; sin embargo, en algunos pacientes también se puede ver afectado por las comidas recientes. La glucosa aumenta rápidamente tras la ingesta de alimentos y vuelve a los valores iniciales al cabo de tres horas en condiciones normales. Otros constituyentes pueden verse afectados tras una comida rica en proteínas, como ocurre. por ejemplo, con la urea.

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También un ayuno prolongado afecta a los resultados del laboratorio; está descrita una disminución de prealbúmina, albúmina, C3 y transferrina. - Variaciones horarias y ciclicas Las variaciones horarias están descritas para muchos constituyentes y pueden llegar a constituir un verdadero problema para la interpretación de los resultados si se desconoce la hora de extracción. Tales variaciones pueden ser intrínsecas o fisiológicas, o bien extrínsecas, secundarias de comer, el ejercicio u otras actividades. En condiciones fisiológicas, ACTH, cortisol, hormona de crecimiento, prolactina y TSH, entre otras, tienen un ritmo circadiano que hace necesario fijar la hora de obtención de la muestra e indicarla en el informe para poder interpretar correctamente el resultado. La postura y la ingesta de sodio desempeñan un papel importante en la regulación de la secreción del eje renina-angiotensina-aldosterona, a pesar de que también hay una variación horaria. Las concentraciones de proteínas séricas y de albúmina tienden a disminuir durante la noche, seguramente debido a un efecto postural. El hierro, el calcio y el zinc también presentan variaciones importantes durante el dia. Además de estos ciclos de duración corta, existen otros más largos que también influyen sobre algunos constituyentes. Así, el ciclo menstrual afecta a concentraciones séricas y urinarias de hormonas (gonadotropinas, prolactina, estrógenos, andrógenos, progesterona) y de otros constituyentes, como colesterol, albúmina, fibrinógeno, creatinina, magnesio, urato, sodio, cloruros, fosfatos y hierro. También hay variaciones a largo plazo, como las variaciones estacionales y climáticas, pero no tienen tanta importancia. - Actividad física La actividad física tiene mucha influencia sobre un gran número de constituyentes séricos. El ejercicio moderado produce un aumento de la concentración de glucosa, lo que repercute en un aumento de insulina y de cortisol. Las enzimas también quedan afectadas; así, la CK puede llegar a doblar su actividad, y otras, como la AST, la LDH y la fosfatasa alcalina presentan incrementos menores. Después de ejercicio moderado también se han descrito variaciones para la angiotensina, renina, aldosterona, tiroxina, HGH y prolactina. - Efectos de drogas autorizadas La cafeína, presente en muchas bebidas, como café, colas, té y algunos medicamentos, es un inhibidor de la fosfodiesterasa, y a consecuencia de su ingesta se puede observar un aumento de triglicéridos, ácidos grasos libres y cortisol plasmático, así como una disminución de colesterol. El etanol tiene un efecto diabetógeno, pues produce un aumento de glucosa poco tiempo después de su ingesta; al interferir en la glucogenolisis, tiene un efecto hipoglucemiante retrasado. Fumar tabaco produce una elevación de monóxido de carbono y, por consiguiente, de carboxihemoglobina, lo que lleva a una eritrocitosis. Como es lógico, también se produce absorción de nicotina, lo que aumenta las catecolaminas. Se ha descrito asimismo un aumento de colesterol y triglicéridos en la población fumadora. •

Variabilidad debida a factores del momento de la extracción

- Efecto postural El efecto postural en el momento de la extracción es importante. En un estudio sobre los cambios producidos por la postura en 17 constituyentes, Statland demostró que la posición erecta producía aumentos superiores al 5 % en proteínas totales, albúmina, hierro, colesterol, ALT y fosfatasas ácida y

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alcalina , y aumentos inferiores al 5 % en sodio, potasio, calcio, cloruros, fosfatos, urea y creatinina. Los constituyentes ligados a proteínas están afectados por cambios posturales, mientras que los constituyentes disueltos en el agua plasmática lo están mucho menos o no lo están. Además de este efecto ortostático, hay una serie de hormonas cuya regulación está afectada por cambios posturales, como las catecolaminas, la angiotensina, la renina, la aldosterona y la hormona antidiurética; el valor de las hormonas mencionadas puede aumentar varias veces en posición erecta. - Tiempo de aplicación del torniquete La aplicación del torniquete es una práctica habitual en la extracción de sangre; produce dilatación venosa, estasis y trasudación de agua plasmática a través de las paredes capilares por debajo del punto de aplicación del torniquete; también se produce hipoxia y, por consiguiente, acidosis. Statland demostró que, tras un minuto de aplicación del torniquete, la albúmina aumentaba un 6 %, Y al cabo de tres minutos encontraba aumentos superiores al5 % en bilirrubina, fosfatasa alcalina, AST, colesterol y hierro. •

Variabilidad debida al procedimiento de extracción

Los tapones que se emplean en los tubos de extracción son generalmente inertes. Existe, sin embargo, un plastificante, el tris-(butoxi-etil)-fosfato (TBEP), que interfiere en algunas determinaciones. En cuanto a los aditivos, debe tenerse en cuenta que la silicona que llevan algunos tubos como recubrimiento interior por regla general no interfiere con los constituyentes bioquímicos, mientras que los tubos que tienen glicerol no pueden utilizarse en determinaciones de triglicéridos ni de alcohol. Respecto a los separadores de suero, que son sustancias con una densidad intermedia entre el suero y los hematíes, se ha demostrado que los que están elaborados con material plástico, como elpoliestireno, no interfieren, pero los geles pueden provocar disminución de algunas drogas, como lidocaína, difenilhidantoína y fenobarbital. •

Variabilidad debida a factores de la muestra o a su procesamiento

- Hemólisis La hemólisis puede ser consecuencia de una enfermedad o bien de una extracción inco rrecta. Como los hematíes tienen diferente concentración que el suero en varios constituyentes, su ruptura significará la incorporación de algunos constituyentes y la dilución de otros. Además, el color aportado por la hemoglobina puede interferir directamente en muchas pruebas colorimétricas. - Lipemia La lipemia puede ser consecuencia de una comida rica en grasas o consecuencia de dislipemias con alteración de la concentración de triglicéridos y con presencia de quilomicrones. La turbidez causada por la lipemia produce la dispersión de la luz y afecta de forma importante a todas las técnicas fotométricas. Para obviar ese efecto se utilizan técnicas bicromáticas, aunque en sueros muy lipémicos hay que clarificar el suero por medio de ultracentrifugación o de técnicas químicas. Además, la lipemia produce un desplazamiento del agua plasmática de tal forma que los constituyentes que están disueltos en agua plasmática dan valores anormalmente bajos por unidad de volumen sérico (ya que hay una cantidad importante de lipidos), pero tienen una concentración normal en el volumen de agua correspondiente. - Fibrina La fibrina es un interferente físico. La interferencia se produce por obturación de los muestreadores de los autoanalizadores. Para obviar esa posible interferencia habrá que esperar 20/30 minutos después de la extracción antes de centrifugar la muestra, si bien en enfermos con medicación anticoagulante este intervalo de tiempo debe ser mayor.

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- lnterferencias por la medicación La medicación de los enfermos puede afectar de forma importante a los resultados del laboratorio, aunque difícilmente el laboratorio conoce la medicación del enfermo y pocas veces podrá informar de una posible interferencia. - Estabilidad de los constituyentes Idealmente las determinaciones deberían efectuarse inmediatamente después de la extracción, pero ello no siempre es posible, y en muchos casos el análisis tiene que retrasarse horas, días o semanas; por este motivo hay que conocer la estabilidad de los diferentes constituyentes. El sodio y el potasio son estables una semana en suero después de separarlo de los hematíes. La glucosa es un constituyente que se ha de separar lo antes posible de los hematíes; para ello se utilizará un inhibidor enzimático como el fluoruro sódico. Las enzimas presentan una gran variedad en cuanto a estabilidad. Así, la fosfatasa alcalina se mantiene estable una semana a 4°C, y la fosfatasa ácida pierde rápidamente su actividad a menos que se acidifique la muestra. Errores Además de todos los factores descritos anteriormente, hay que tener en cuenta los errores que se pueden producir en la fase extraanalítica, los cuales, a diferencia de las causas de variación, tienen unos efectos incalculables. Los errores se pueden producir en cualquier fase y no hay que escatimar esfuerzos para evitarlos. Se pueden clasificar en dos tipos: - Errores de identificación: a) de muestra; b) de enfermo. - Errores de transcripción.

Estrategias para disminuir la variabilidad extraanalítica Preparación del paciente A pesar de que el laboratorio normalmente no tiene control sobre la preparación del paciente, deberá dar normas sobre la conducta que ha de seguir el mismo para obtener resultados satisfactorios en cuanto a la calidad: - El paciente no ha de ingerir alimentos durante las 12 horas anteriores a la extracción, y si es posible ha de interrumpir la medicación. - Deben evitarse esfuerzos importantes el día antes de la extracción. - La hora de extracción tiene que ser siempre la misma. Obtención de la muestra En el momento de la extracción debe identificarse al enfermo y a los recipientes. La extracción se llevará a cabo en posición decúbito o bien cómodamente sentado. La aplicación del torniquete, si resulta indispensable, deberá ser lo más corta posible. Manipulación y almacenamiento de la muestra Los especímenes deben centrifugarse cuando lleguen al laboratorio y procesarse de acuerdo con las normas del laboratorio y la estabilidad de los constituyentes. Emisión de resultados Antes de entregarlos, es preciso someter los resultados a diferentes filtros, que pueden ir desde la inspección visual a la validación electrónica (procesos de delta check y algoritmos de compatibilidad de resultados).

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16.2. VARIABILIDAD ANALÍTICA ALEATORIA________________________________________________ Las pruebas de laboratorio están sujetas a variabilidad aleatoria o imprecisión. Para poder interpretar correctamente los datos del laboratorio es necesario el conocimiento básico de algunos conceptos analíticos, en especial de los que se refieren a las características de seguridad del funcionamiento del método analítico. Dichas características de seguridad o fiabilidad incluyen: el intervalo analítico, la imprecisión, la inexactitud, el límite de detección, las interferencias y la especificidad del método. El grupo de expertos en nomenclatura y principios de control de calidad de la IFCC ha dado las siguientes definiciones de dichas características: - Intervalo analítico: es el intervalo de concentración en que se puede aplicar el método analítico sin ninguna modificación. - Imprecisión: es la desviación estándar o el coeficiente de variación de los resultados de un grupo de mediciones repetidas. - Inexactitud: es la diferencia numérica entre la media de una serie de mediciones repetidas y el valor verdadero. - Límite de detección: es el resultado aislado más pequeño que, con una determinada probabilidad, se puede distinguir de un verdadero blanco. - Interferencia: es el efecto de un componente, que no produce una lectura por símismo, en la exactitud de la medición de otro componente. - Especificidad: es la capacidad de un método para determinar únicamente el componente que se pretende medir. Los conceptos de imprecisión y de inexactitud pueden representarse recurriendo a la analogía de una galería de tiro, donde tres tiradores realizan diez disparos a tres dianas (ver fig). Los diez disparos del tirador A quedan desparramados por toda la diana: diremos que tiene mucha imprecisión. Los diez disparos del tirador B se sitúan en una estrecha zona, pero lejos de la diana: diremos que tiene poca imprecisión y mucha inexactitud. Los diez disparos del tirador e dan justo en la diana: diremos que tiene muy poca inexactitud y muy poca imprecisión.

Si, por ejemplo, el laboratorio efectúa veinte determinaciones de cualquier magnitud biológica en el mismo espécimen, los resultados a causa del error aleatorio, imprecisión, no serán exactamente iguales. La imprecisión es inherente a todos los métodos analíticos y se puede intentar minimizarla mediante la acertada selección del método y cuidando al máximo todos los aspectos de la técnica, pero nunca se puede evitar del todo. Si los resultados de esas veinte determinaciones se representan en un histograma de frecuencias, se puede ver que la distribución se asemeja a una curva en forma de campana. Es la llamada distribución gaussiana.

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Para describir una distribución gaussiana se utiliza la estadística paramétrica. En primer lugar, se calcula la media como valoración de la tendencia central y, en segundo lugar, la desviación estándar (s) como medida de la dispersión de la distribución. La desviación estándar tiene la propiedad de que el intervalo de media +/-ls incluye una fracción central de la distribución igual al 0,67; si se toma la media +/-2s, incluye una fracción igual al 0,95; y si se toma la media +/- 3s, incluye una fracción igual al 0,997 (ver fig). La desviación estándar expresada como número absoluto es poco indicativa de la dispersión de la distribución y por eso se utiliza el coeficiente de variación, que es el porcentaje de la desviación estándar sobre la media.

El conocimiento de la imprecisión analítica es de gran ayuda para la interpretación de los datos del laboratorio. Por ejemplo, cuando el laboratorio da un resultado de creatinina de 200 µmol/L y sabemos que tiene un CV del 3 % (s = 6), estamos diciendo que este resultado aislado tiene una probabilidad del 0,67 de estar entre 200 +/- 6, es decir, entre 194 y 206, una probabilidad del 0,95 de estar entre 188 y 212, Y una probabilidad del 0,997 de estar entre 182 y 218 µmol/L. Esto es particularmente importante cuando se valoran resultados individuales, especialmente al comparar los resultados individuales con los valores de referencia. En segundo lugar, la imprecisión analítica proporciona la posibilidad de valorar si se ha producido algún cambio analíticamente significativo entre dos resultados del mismo enfermo: si los dos resultados difieren en más de 2,8 s, existe una probabilidad de 0,95 de que la diferencia sea analíticamente significativa. La imprecisión analítica deseable está en función de la variabilidad biológica intraindividual. Hoy en día se acepta como imprecisión admisible la mitad de la variación biológica intraindividual. En algunos parámetros esto no es posible y hay que tomar como imprecisión aceptable la que nos viene dada por la tecnología actual, como en el caso del calcio. La inexactitud se debe a una variación sistemática, consecuencia, por ejemplo, de la utilización de un calibrador en el que el valor asignado no es el correcto, del empleo de un espectrofotómetro con la longitud de onda desajustada, etc. La inexactitud puede ser constante (los resultados son inexactos en la misma cantidad para todos los valores de la magnitud bioquímica en cuestión) o proporcional (los resultados son inexactos en la misma cantidad relativa a diferentes valores de la magnitud bioquímica). Los dos tipos de inexactitud pueden coexistir y ambos pueden ser positivos y negativos (ver fig).

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16.3. SOLUCIONES DE CONTROL DE CALIDAD__________________________________________________ Los materiales de control son muestras que se intercalan entre los especímenes de los pacientes para determinar la calidad del proceso analítico. Más información en capítulo 13.7. Controles normales y patológicos. Un producto de control normal contiene concentraciones normales para el analito sometido al test. Un producto de control patológico contiene el analito a una concentración superior o inferior al intervalo normal para dicho analito. Cuando el resultado del QC diario obtenido para el control se compara con el intervalo calculado para dicho control, y todos los resultados están dentro del intervalo previsto, indica que el proceso analítico está “controlado” durante los días en los que se realizaron los tests. Cuando el resultado del QC diario se compara con el intervalo definido para dicho control y se observa que alguno o varios resultados están fuera del intervalo aceptable, el proceso analítico está “fuera de control” para esa concentración. Este resultado indica que se ha producido un error que puede haber originado resultados de pacientes que serían anormalmente altos o bajos, según la concentración del control y que no tienen fiabilidad. Por lo tanto, resulta evidente que el intervalo definido para cada nivel de control es esencial para el sistema de control de calidad. Utilidad de las muestras Control:

Comprobante y control de todos los pasos de la técnica. Verificar validez del proceso de medida Establecimiento del Rango aceptable de valores.

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Características: Controles Independientes Controles ajenos a la instrumentación. No fabricados ni optimizados para ningún instrumento o equipo de reactivos. Comportamiento idéntico a las muestras de pacientes para identificar tendencias o cambios en el sistema de medida.

Frecuencia: Cada 8 horas. 1 vez al día Cada 50 muestras Emplazamiento muestras de control: Aleatorio Fijo Aspectos a considerar de una solución de control:

Caducidad Estabilidad del vial Tamaño del vial Niveles de concentración Nº de constituyentes o analitos Matriz o fuente Mínima variabilidad vial a vial Evaluación Externa

Tipos de Controles Valorados No Valorados Específicos de un solo parámetro Multiparamétricos Líquidos Liofilizados

16.4. DATOS ESTADÍSTICOS BÁSICOS PARA CONTROL DE CALIDAD______________________________ Un sistema de QC total debe controlar tanto la veracidad como la precisión. El objetivo es que tanto el ES (Error Sistemático) como la imprecisión de la prueba sean bajos. Dada la informatización y mecanización del proceso analítico, no es tan probable que los problemas relacionados con la imprecisión causen un fallo analítico en un laboratorio moderno. En consecuencia, el ES adquiere el papel preponderante. La figura siguiente muestra un ES y una imprecisión bajos como objetivo, mientras que el centro de la diana representa el valor diana.

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Las figuras que se incluyen a continuación muestran las otras dos posibilidades: • La figura de la izquierda refleja una situación en la que la desviación estándar (DE) de una prueba es pequeña (buena precisión), pero se ha desplazado del valor deseado (ES alto). • La figura de la derecha refleja una mala precisión aunque, sorprendentemente, un ES bajo debido a que el promedio de los resultados se aproxima al objetivo. Resulta evidente que, considerados por separado, ninguno de estos puntos está próximo y sus valores z reflejarían este hecho.

Datos estadísticos útiles Distribuciones Cuando se realiza una medida repetidas veces con un mismo espécimen, o cuando se mide un parámetro en un grupo de personas, se observa que los resultados se distribuyen alrededor de uno o varios valores: es lo que se conoce como distribución de la población. En su forma más simple, una distribución es un listado de las medidas individuales que se hacen de una variable. Una distribución de frecuencias es una representación de los datos obtenidos según su frecuencia. Por ejemplo, si analizamos la concentración de glucosa en sangre de 100 personas sanas, se obtienen valores que pueden representarse frente a su frecuencia de presentación. Se genera un histograma como el de la figura . Para comprender mejor el significado de los datos, debe describirse la distribución de forma concisa. Con este fin, se utilizan las medidas de tendencia central de la distribución, las medidas de dispersión de los datos, las medidas de posición y las de forma de la distribución.

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Distribución normal o de Gauss Es la distribución teórica que con más frecuencia aparece en fenómenos reales. En ella coinciden la media aritmética, la mediana y la moda (ver fig). Las distribuciones gaussianas se denominan paramétricas y se caracterizan por dos valores: su localizacíón y su extensión. La primera es especificada por la desviación estándar. Las curvas gaussianas con desviaciones estándar pequeñas son altas y estrechas y su pico desciende rápidamente, mientras que las que tienen desviaciones estándar grandes son bajas y amplias y el pico cae lentamente.

Para la evaluación del ES y de la imprecisión de una prueba se utilizan varios cálculos. • Media. • Desviación estándar. • Índice de desviación estándar. • ES. • Coeficiente de variación. • Cociente del coeficiente de variación. • Error total y Error total admisible. • Valor z. Análisis estadístico de los datos ❖El valor de la media y desviación estándar de la población, viene definido como “VALOR VERDADERO”. ❖El valor verdadero NO ES CONOCIDO. ❖El valor verdadero puede ser ESTIMADO a partir de los datos de una muestra representativa de la población. ❖La estimación estadística tiene por definición un grado de INCERTIDUMBRE. ❖La incertidumbre de la estimación viene expresada en términos de LIMITES DE CONFIANZA.

Grupo de medidas en una distribución ❖CENTRALIZACIÓN: para describir los grupos de observaciones, generalmente se emplea un valor alrededor del cual se centra la distribución de los datos. –Valor medio o media aritmética o promedio –Mediana (M) –Percentiles (P) –Moda (Mo)

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❖DISPERSIÓN: una distribución no queda totalmente definida con las medidas de tendencia central; debe conocerse también la dispersión de los datos alrededor del centro. -Varianza (s2) –Desviación estándar (s) –Rango o intervalo –Coeficiente de variación (CV)

❖POSICIÓN: sirven para clasificar a un individuo o elemento dentro de una determinada población o muestra. Dividen la distribución en partes iguales.

- Cuartiles (Qk): los tres valores que dividen a la muestra en 4 grupos porcentualmente iguales. – Deciles (Dk): valores que dividen a la muestra en 10 grupos porcentualmente iguales. – Percentiles (Pk): valores que dividen a la muestra en 100 grupos porcentualmente iguales. ❖FORMA –Coeficiente de Sesgo y Asimetría –Coeficiente de Curtosis

Medidas de centralización ❖Valor medio o Media (X) –Valor de referencia –Tendencia central –NCCLS recomienda 20 valores ❖Mediana (M): Valor central de un conjunto de valores ordenados. ❖Percentiles (Px): Valor que divide los datos en CIEN partes iguales: ( P50 = mediana ) ❖Moda (Mo): Es el valor más frecuente.

Media La media se define como el promedio aritmético de un conjunto de datos puntuales. La media describe la “tendencia central” de un conjunto de datos. En el laboratorio clínico, la media identifica el “valor diana” de un conjunto de datos puntuales, normalmente de control de calidad o de datos del paciente. La media es el parámetro estadístico fundamental que se usa para comparación o para el cálculo de otros valores estadísticos. La guía de control de calidad estadístico del Clinical and Laboratory Standards

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Institute (C24-Statistical Quality Control for Quantitative Measurement Procedures: Principles and Definitions) recomienda que se utilicen al menos 20 datos puntuales obtenidos en 20 o más series “independientes” a fin de establecer los valores diana del laboratorio para los materiales de control. Los laboratorios deben establecer sus propios valores diana y utilizar los valores de análisis del fabricante sólo como referencia. Se pueden establecer valores diana provisionales analizando 20 duplicados en menos de 20 series, pero los valores provisionales deben reemplazarse cuando se acumulan datos de 20 series separadas. Para calcular la media se utiliza la fórmula siguiente:

Desviación estándar (DE) La desviación estándar cuantifica el grado de dispersión de los datos puntuales en relación con la media y se utiliza para establecer el intervalo que determina la aceptación del resultado del control. La desviación estándar se abrevia a menudo como DE, SD ó s. En general, los datos de control de calidad muestran una distribución “normal” o de Gauss alrededor de la media. En una distribución gaussiana: • el 68,3% de los valores están dentro de ±1,0 desviaciones estándar de la media. • el 95,5% de los valores están dentro de ±2,0 desviaciones estándar de la media. • el 99,7% de los valores están dentro de ±3,0 desviaciones estándar de la media.

Para calcular la desviación estándar se utiliza la fórmula siguiente:

La desviación estándar también es valiosa para comparar métodos o evaluar nuevos instrumentos. Un método o un instrumento con una desviación estándar baja produce resultados uniformes. Un laboratorio que usa un instrumento o un método con desviaciones estándar altas tiene menor certeza acerca de la

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precisión del diagnóstico o de la eficacia del tratamiento debido a la variabilidad de los resultados de la prueba. En otras palabras, una desviación estándar alta (baja precisión, mayor variabilidad) puede afectar la integridad de todos los resultados. El método o el instrumento seleccionado debe generar una desviación estándar aceptable desde el punto de vista médico. Cálculo de la media y el intervalo de un control 1. Recopilar un mínimo de veinte datos puntuales para cada nivel de control. • Obtener los datos puntuales a partir de veinte series analíticas distintas que reflejen variables como la frecuencia de la calibración, el cambio de reactivo o el lote de reactivos, la técnica del usuario, la temperatura y humedad del lugar donde se realizan las pruebas, el mantenimiento diario y semanal, etc. • Comparar los nuevos productos de control con otros validados previamente (pruebas paralelas). 2. Calcular la media y la desviación estándar correspondiente a los datos puntuales recopilados. • Utilizar una prueba estadística para valores atípicos antes de eliminar datos puntuales dudosos. • Calcular los límites de control estadístico a partir de la media ±2 DE y la media ±3 DE. Importante: Utilizar los intervalos que figuran en el prospecto del producto sólo a modo de referencia. Los intervalos se basan en lotes de reactivos y materiales disponibles en el momento de la asignación de valores. Durante el periodo de validez del lote de control, los fabricantes pueden reformular pruebas o empezar a utilizar una nueva fuente de materias primas para la producción de reactivos/kits. Los intervalos publicados no pueden explicar variables tales como actualizaciones de software de instrumentos o diferencias en el rendimiento a lo largo del tiempo. Índice de desviación estándar (IDE) Otro valor estadístico útil para evaluar el rendimiento es el índice de desviación estándar (IDE). Este dato estadístico, que normalmente se obtiene mediante la participación en un programa externo de pruebas de idoneidad o de control de calidad, se usa para comparar los resultados de un laboratorio con su grupo de consenso. El programa interlaboratorios Unity™ de Bio-Rad utiliza el valor del grupo de consenso como valor diana. Para calcular el IDE se utiliza la fórmula siguiente:

Interpretación del IDE El IDE diana es 0,0 que indica que no hay diferencia entre la media del laboratorio y la media del grupo de consenso. Un IDE de ±1 indica un posible problema con la prueba. El IDE expresa el ES en forma de incrementos de la desviación estándar. Un IDE de -1,8 indica un ES negativo de 1,8 desviaciones estándar de la media del grupo de consenso. Este resultado no es favorable. El ES aumenta o reduce el porcentaje de pacientes que queda fuera del límite de referencia definido. Por ejemplo, un ES positivo reduce el porcentaje de pacientes que normalmente quedan fuera del límite inferior y aumenta el porcentaje de pacientes que normalmente quedan fuera del límite superior de referencia. Esto crea un incremento en la cantidad de resultados falsos positivos. El ES negativo tiene el efecto contrario, es decir, reduce los positivos reales y crea falsos negativos. Para interpretar el IDE utilizar las siguientes directrices:

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Error Sistemático ES (bias en inglés) El ES (sesgo) mide la distancia entre el valor observado y el valor diana. Determine el ES como un valor de referencia o calcúlelo a partir de fuentes externas tales como los resultados de una prueba de idoneidad o del programa interlaboratorios Unity™ de Bio-Rad. El ES se expresa como un porcentaje. Para calcular el ES se utiliza la fórmula siguiente:

Desplazamiento: Un tipo de error sistemático evidenciado por un cambio abrupto en la media de los valores de control. Tendencia: Un tipo de error sistemático que provoca un aumento o reducción gradual, con frecuencia sutil, en los valores de control y posiblemente los resultados del paciente.

Coeficiente de variación (CV) El coeficiente de variación (CV) es una medida de la variabilidad. El coeficiente de variación es útil para comparar la precisión de distintas concentraciones siempre y cuando los materiales utilizados sean similares y los CV se calculen en idénticas condiciones. Este parámetro estadístico generalmente se usa para comparar afirmaciones de los fabricantes, resultados de estudios realizados por el Colegio de Patología de los Estados Unidos (CAP, por sus siglas en inglés) e informes de control de calidad del grupo par. También se puede utilizar como parte del sistema interno de control de calidad cuando se hacen pruebas de precisión en pacientes. Para calcular el coeficiente de variación se utiliza la fórmula siguiente ( x 100 ):

El uso del CV facilita la comparación de la precisión total de dos sistemas analíticos. El CV permite una comparación más precisa que la desviación estándar, puesto que la desviación estándar suele aumentar a medida que aumenta la concentración del analito. La comparación de la precisión de dos métodos diferentes mediante el uso exclusivo de la desviación estándar puede ser errónea.

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Determinación de un CV aceptable Cuando se determina un CV aceptable, son varias las fuentes que proporcionan los niveles esperados de precisión, entre ellas: • Los datos de precisión incluidos en el prospecto del producto o en el manual del instrumento. • Programas de comparación interlaboratorios. • Estudios de idoneidad. • Evaluaciones de instrumentos y métodos publicadas en revistas profesionales. Estas fuentes son útiles para evaluar el CV obtenido para una prueba o al comparar dos sistemas de pruebas. Cociente del coeficiente de variación (CVR) El cociente del coeficiente de variación (CVR) compara la precisión del laboratorio para una prueba específica con el CV de otros laboratorios que realizan la misma prueba. Para calcular el CVR se utiliza la fórmula siguiente:

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Error total (ET) y Error total admisible (ETa) Los conceptos de error total y error total admisible son útiles a la hora de decidir las reglas de CPE que se deben aplicar a una prueba. Por ejemplo, las reglas de CPE pueden identificar una prueba que excede la especificación de calidad (ETa). El error total de una prueba incluye el ES y la imprecisión. Para calcular el ET se utiliza la fórmula siguiente:

Las especificaciones del ETa están disponibles en distintas fuentes. Después de seleccionar un ETa, calcule el Ratio de ET. Para calcular el Ratio de ET se utiliza la fórmula siguiente:

Valor z El valor z es el número de desviaciones estándar del resultado de un control con respecto a la media esperada. Para calcular el valor z se utiliza la fórmula siguiente:

Un valor z de 2,3 indica que el valor observado tiene una DE de 2,3 con respecto a la media esperada. Un dato puntual con este valor z incumpliría la regla 12s, pero no la regla 13s. Seis Sigma (σ) Seis Sigma es un método adecuado para supervisar la capacidad de rendimiento de un sistema de realización de pruebas.

SIGMA = 3 (MÍNIMA CALIDAD ACEPTABLE)

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16.5. GRÁFICAS DEL CONTROL DE CALIDAD_______________________________________________ Gráfico de Levey-Jennings El gráfico de Levey-Jennings representa datos puntuales del laboratorio de un periodo de tiempo determinado con respecto al intervalo de la media fija o acumulada (flotante) ±3 DE para un conjunto de datos definidos. Cómo utilizar el gráfico de Levey-Jennings El empleo de datos estadísticos para evaluar los valores de QC supone que, mientras el sistema sea estable y la distribución de valores sea gausiana (normal), la distribución de las mediciones de control nuevas y antiguas será similar.

Con estos supuestos, el 95,5% de los valores deberían estar en un intervalo de ±2 DE de la media y el 99,7% en un intervalo de ±3 DE de la media. Mientras el sistema sea estable, un valor que quede fuera del intervalo de ±3 DE de la media sólo debería surgir un 0,3% de las veces. El gráfico de Levey-Jennings permite identificar visualmente esos datos puntuales y también los desplazamientos (cambios imprevistos) y las tendencias (cambios graduales) de los datos del laboratorio. -

La desviación estándar es el parámetro para crear la gráfica en la cual se indican los valores diarios de los controles. Esta gráfica se crea para cada prueba y para cada nivel de control. Los límites de la gráfica son: ±1SD, ±2SD, ± 3SD, respecto a la media.

Histograma El histograma representa las medias mensuales con respecto a un intervalo de ±3 DE. Por tanto, es útil para visualizar desplazamientos y tendencias a largo plazo. El histograma muestra la media del laboratorio para varios meses representada con respecto a uno de los siguientes parámetros:

• La media acumulada (si no se especifica una media fija). El histograma se superpone al intervalo de la media acumulada ±3 DE. La media acumulada determina la escala del eje Y (media ±3 DE). • La media fija (si se especifica una media fija). El histograma se superpone al intervalo de la media fija ±3 DE especificado para el test. La media fija determina la escala del eje Y (media ±3 DE). El histograma también muestra la DE, el CV y el número de puntos de cada media mensual.

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Gráfico de Youden El gráfico de Youden es una representación gráfica de los datos emparejados (Nivel 1 y Nivel 2, Nivel 1 y Nivel 3, etc.) durante un periodo de tiempo determinado sobre los ejes X- e Y. Los datos puntuales se representan en el gráfico agrupados en uno de los cuatro campos siguientes: • Dentro del intervalo de ±1 DE de la media • Dentro del intervalo de ±2 DE de la media • Dentro del intervalo de ±3 DE de la media • Fuera del intervalo de ±3 DE de la media Cómo utilizar el gráfico de Youden El centro del gráfico de Youden representa el objetivo óptimo. Cuanto más próximos entre sí se agrupen los puntos alrededor del centro del objetivo, mayor será la precisión de los niveles de control.

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16.6. REGLAS DE CONTROL DE PROCESOS ESTADÍSTICOS______________________________________ En 1981, el Dr. James Westgard, de la Universidad de Wisconsin, publicó un artículo sobre control de calidad en laboratorios que sentó las bases para la evaluación de la calidad de series analíticas en laboratorios clínicos. El sistema Westgard se basa en los principios del control de procesos estadísticos utilizado en la fabricación en los Estados Unidos desde la década de 1950. Hay seis reglas básicas en el programa de Westgard: 13s, 22s, R4s, 12s, 41s, y 10x. Estas reglas se utilizan por separado o combinadas (reglas múltiples) para evaluar la calidad de las series analíticas. Las combinaciones de reglas son seleccionadas por el laboratorio y dependen de la calidad requerida y del rendimiento del laboratorio para cada método analítico. El objetivo general es obtener una alta probabilidad de detección de errores y una baja frecuencia de series con falsos rechazos. El fundamento para la aplicación de estas reglas es el siguiente: • Reducir los falsos rechazos que se producen al aplicar sólo la regla 12s para rechazar una serie. • Aumentar la detección de errores obtenida al aplicar sólo la regla 13s para rechazar una serie. • Incluir reglas para detectar y distinguir errores sistemáticos y aleatorios (13s y R4s para detectar errores aleatorios y 22s, 41s, y 10x para detectar errores sistemáticos). Westgard diseñó una notación abreviada para expresar las normas de control de calidad. La mayoría de las normas de control de calidad se pueden expresar como: - NL donde N representa el número de observaciones de control que se van a evaluar y L representa el límite estadístico para la evaluación de las observaciones de control. En consecuencia, 13s representa la violación de una regla de control cuando una observación de control excede el límite de ±3 DE. Regla operativa: Define cuales son los límites del control interno, dentro de los cuales se puede afirmar que el procedimiento analítico está controlado. Estos límites se basan en múltiplos de la desviación estandar o en rangos entre resultados. Regla operativa idónea Se ha de definir una regla operativa para cada prueba del laboratorio No es válido utilizar la misma regla operativa para todas las pruebas analizadas en un instrumento Debe ser capaz de detectar el máximo número de errores y producir el mínimo número de falsos rechazos. Se han de escoger reglas con: - probabilidad de detección de errores > 0.9 - probabilidad de falsos rechazos < 0.05 Reglas control con 2 controles por serie _ 12s: un dato control fuera de ± 2DS _ 13s: un dato control fuera de ± 3DS _ 22s: dos datos control fuera de ± 2DS _ R4s: la diferencia entre dos datos es>4DS _ 41s : 4 datos fuera de 1DS en un mismo lado de la media _10x: 10 datos por encima o por debajo de la media

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Reglas control con 3 controles por serie _ 13s: un dato control fuera de ± 3DS _ 2 de 32s: dos de cada tres datos control fuera de ± 2DS _ R4s: la diferencia entre dos datos es>4DS _ 31s : 3 datos fuera de 1DS en un mismo lado de la media _ 6 o 9 o 12x: 6, 9,o 12 datos por encima o debajo de la media Interpretación reglas operativas

Reglas según detección del tipo de error

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16.7. INDICADORES DE CALIDAD ANALÍTICA. CONTROL DE CALIDAD INTERNO Y EXTERNO_____________ Control interno de la calidad: conjunto de procedimientos realizados por el personal del laboratorio para la evaluación contínua de la fiabilidad del trabajo del laboratorio y los resultados obtenidos, con el fin de decidir si son suficientemente fiables para ser entregados. Mide la imprecisión y el error sistemático. Control externo de la calidad: conjunto de procedimientos realizados por el personal del laboratorio para la evaluación continua de la fiabilidad del trabajo del laboratorio y los resultados obtenidos en comparación con otros laboratorios. Mide la inexactitud. Ver evaluación externa de la calidad). Evaluación externa de la calidad: sistema de comparación objetivo y retrospectivo de los resultados de diferentes laboratorios, realizado por una organización externa. Sistema que objetivamente revisa los resultados del laboratorio por medio de un organismo externo, mediante la comparación con otros laboratorios y con el propósito de determinar la exactitud. Comparación entre laboratorios que se extienden a todas las fases de un proceso de análisis, incluyendo la interpretación de los resultados. El principal objetivo es educacional. Estado del arte: Un objetivo analítico utilizado para mantener la imprecisión del test dentro de unos límites especificados con la idea de que la imprecisión de cada test debe ser igual o menor que la mejor imprecisión que puede alcanzar la tecnología. El Estado del arte utiliza la información del grupo de consenso del programa interlaboratorios. La “mejor imprecisión alcanzable” se define como la imprecisión calculada para un grupo de consenso específico (grupo par, por método o todos los laboratorios). El grupo par es el grupo de consenso ideal para las comparaciones, pero los grupos de consenso por método y todos los laboratorios proporcionan alternativas cuando no se dispone de un grupo par representativo o es inaceptablemente pequeño. Grupo de consenso: Un grupo de laboratorios que presentan datos al programa interlaboratorios.

Indicadores de calidad analítica Imprecisión: coeficiente de variación de un conjunto de resultados obtenidos al mensurar repetidamente un mensurando con un mismo procedimiento de medida en unas condiciones estipuladas NOTA: Según las condiciones en que se efectúen las medidas repetidas la imprecisión puede ser intraserial, interserial, interdiaria o interlaboratorial. Se determina, tras veinte o más resultados de medida de un mensurando obtenidos en condiciones interdiarias, con el coeficiente de variación (CV%), que se calcula dividiendo la desviación estandar por la media y multiplicando el resultado por 100. Se obtiene del control de calidad interno. Error sistemático (ES) -sesgo- (bias en inglés): media de veinte o más resultados de medida de un mensurando obtenidos en condiciones interdiarias menos el valor verdadero o convencionalmente verdadero del mensurando, dividido por el valor verdadero y este cociente se multiplica por 100 para expresarlo en porcentaje. También llamado desviación y sesgo. El ES mide lo lejos que se encuentra del valor diana un valor observado, y se expresa como porcentaje. El ES se determina mediante un valor de referencia o se calcula a partir de una fuente externa como los resultados de una prueba de idoneidad o del programa interlaboratorios. NOTAS: 1. el error sistemático es igual al error de medida menos el error aleatorio. 2. el error sistemático puede ser constante o proporcional al del mensurando. Se obtiene del control de calidad interno. Inexactitud: (inaccuracy en inglés) es la diferencia numérica entre la media de una serie de mediciones repetidas y el valor verdadero. Se obtiene a partir del control de calidad externo.

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En el laboratorio es posible calcular tres indicadores de la calidad analítica. Dos de ellos, la imprecisión y el error sistemático (bias en inglés) proceden del control interno diario, es decir, del control que se procesa cada día que se realiza una determinada técnica. El tercer indicador, la inexactitud (inaccuracy en inglés) se obtiene a partir del control externo esporádico (por ejemplo mensual). A continuación se presentan algunas fórmulas para calcular de forma práctica estos tres indicadores. La imprecisión y el error sistemático se calculan a partir de los resultados del control interno obtenidos durante un periodo de tiempo, que suele ser de un mes (20 datos) o bien períodos más largos para técnicas no diarias. Las fórmulas para su cálculo son las siguientes:

La imprecisión anual se puede calcular de una forma práctica promediando los 12 coeficientes de variación obtenidos durante el año para cada magnitud. El error sistemático anual se calcula promediando los 12 valores mensuales obtenidos para cada magnitud, siempre y cuando tengan el mismo signo. La inexactitud se calcula comparando los resultados del control externo esporádico frente a la media de consenso (media de los laboratorios que utilizan el mismo instrumento, método o global), tal y como se realiza en los Programas de la SEQC:

La inexactitud anual se calcula promediando los valores absolutos de los 12 datos obtenidos para cada magnitud. En la evaluación anual de los Programas de Garantía Externa de la Calidad de la SEQC se calcula un índice de Inexactitud, Imprecisión y Fiabilidad. Dicha evaluación no debe confundirse con los cálculos descritos anteriormente. La evaluación anual de los Programas permite clasificar y ordenar a los laboratorios según la Inexactitud, Imprecisión y Fiabilidad de los resultados obtenidos en el control externo, pero no sustituye al seguimiento de ía Imprecisión y Error Sistemático de cada técnica, que debe ser realizado por el laboratorio mediante el uso de controles internos.

Cálculo de las desviaciones obtenidas respecto a la media del instrumento:

En caso de haber menos de 10 laboratorios con su mismo instrumento, el cálculo se realiza utilizando la media y desviación estándar del método. Si en este grupo tampoco se llega a un mínimo de 10 participantes, se utilizará la media y desviación estándar global.

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Cálculo de las desviaciones respecto a la media de consenso Para conocer la inexactitud de los resultados del laboratorio respecto a la media de consenso, deben aplicarse las fórmulas que se indican a continuación, teniendo en cuenta las siguientes aclaraciones: - Los resultados del laboratorio deben estar expresados en las mismas unidades en las que se han realizado los cálculos de la Media y la Desviación Estándar (DE). - La Media y la DE están disponibles en el Informe de Resultados mensual. - Por defecto debe utilizarse la Media y DE del instrumento, excepto en aquellos casos en los que el nº de resultados aceptados en el grupo sea inferior a 10. Si fuera así, se realizaría la evaluación frente a la Media y DE del método, y si en este caso tampoco se llegara a un mínimo de 10 resultados aceptados en el grupo, se realizaría utilizando la Media y DE global, con la finalidad de asegurar que el cálculo sea suficientemente robusto. DESVIACIÓN PORCENTUAL

ÍNDICE DE DESVIACIONES ESTÁNDAR

Control de calidad interno - externo CONTROL DE CALIDAD INTERNO vs. EXTERNO C.C. INTERNO Gestionado por personal del laboratorio Diario Inmediato Niveles conocidos

C.C. EXTERNO Gestionado por una agencia independiente Periódico Retrospectivo Niveles desconocidos

16.8. APLICACIONES DEL CONTROL INTERNO DE LA CALIDAD: PLANES DE MEJORA__________________ Indicadores analíticos 1. Control interno de la calidad: - E. Aleatorio - E. Sistemático 2. Control externo de la calidad: - E. Total Indicador analítico: EA E. Aleatorio ó Imprecisión: Dispersión. Resultado de una medición menos la media de infinitas mediciones del mismo mesurando, en condiciones de repetibilidad. Se expresa en s y CV.

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Algunas causas del EA • Inestabilidad de reactivos. • Problemas en el sistema de dosificación. • Variaciones en la Temperatura. • Fluctuaciones en la energía eléctrica. • Son causas accidentales, impredecibles e inherentes a todo sistema de medida. • 12.5s, 13s, 13.5s, R4s Indicador analítico: ES E. Sistemático: Localización. Media de infinitas mediciones en condiciones de repetibilidad, menos el valor verdadero del mesurando. Se expresa en % Algunas causas del ES • Preparación del calibrador. • Asignación del valor. • Factores de calibración. • Blanco de reactivos. • Son causas permanentes, habitualmente asociadas al calibrador. • 31s, 22s, 41s, 10x Qué resultados del control de calidad interno debemos utilizar para el cálculo del EA y ES? • ¿Todos?: No. • Hay que emplear los resultados obtenidos a lo largo de la jornada. • Descartar aquellos resultados derivados de una mala utilización de los materiales control y, por tanto, no atribuibles al sistema analítico. ¿Cuándo calcular los indicadores metrológicos? … mensualmente. Una vez calculados el EA y ES, ¿qué hacer con esos datos? 1. Comprobar si cumplen las especificaciones de calidad preestablecidas. 2. Determinar si el procedimiento analítico es “homo” o “hetero”. (Homocedasticidad: propiedad de los resultados de un procedimiento de medida por la cual la desviación estándar es la misma para cualquier valor del mensurando, dentro de un intervalo de valores particular; Heterocedasticidad: propiedad de los resultados de un procedimiento de medida por la cual la desviación estándar depende del valor del mensurando, dentro de un intervalo de valores particular). 3. ¿Hay variaciones significativas respecto a los meses previos?

¿Es suficiente que nuestro ES cumpla con las especificaciones preestablecidas? ¿Tenemos que considerar otras cuestiones? Si, la transferibilidad de los resultados. Transferibilidad de resultados: Propiedad de poder asumir como propios datos procedentes de: • un laboratorio diferente del que los produjo. • el mismo laboratorio por un procedimiento analítico distinto. • Diferencia: < 0.33 CVi • Sueros y materiales control Imaginemos el siguiente ejemplo: en Urgencias tenemos 2 analizadores iguales para realizar Glucosa. Analizador 1 Valor medio control: 102 mg/dL ES: +2% Especificación: 2.2% Analizador 2 Valor medio control: 98 mg/dL ES: - 2% Especificación: 2.2% Valor diana: 100 mg/dL Diferencia: 4% (1,9)

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Indicador metrológico: ET Diferencia entre un valor medido de una magnitud y un valor de referencia. Se expresa en % y z Conclusiones Calcular los indicadores de calidad analítica (EA, ES y ET) de todos sus procedimientos analíticos y llevar un histórico. Comprobar si éstos cumplen con las especificaciones preestablecidas. Hacer un seguimiento a lo largo del tiempo. Comprobar la transferibilidad de nuestros resultados analíticos. El ET calculado puede ser empleado como (una aproximación a) la incertidumbre.

16.9. ESPECIFICACIONES-OBJETIVOS DE CALIDAD ANALÍTICA____________________________________ Especificación de la calidad: Valor de una medición que no debe ser excedido sobre la base de un requisito preestablecido En química clínica, los objetivos analíticos de calidad se definen como los máximos valores de error tolerables, que no inducirán al clínico a interpretar erróneamente los datos del laboratorio, y se expresa en términos de error total (inexactitud más imprecisión). Objetivos de calidad analítica:

❖ Inexactitud: igual a cero (teóricamente eliminable a través de la mejora de materiales y métodos) ❖ Imprecisión: cercana a cero (nunca eliminable por la medida del error aleatorio) Se han descrito seis teorías para definir objetivos analíticos de calidad basados en: a) Los valores de referencia. b) Opiniones de los clínicos. c) Punto de vista de expertos. d) Efecto de las prestaciones del laboratorio sobre la interpretación de datos en determinadas situaciones clínicas. e) Prestaciones medias de los métodos analíticos actuales. f) Variación biológica. - Los valores de referencia fueron propugnados por Tonks (concretamente una cuarta parte del intervalo de referencia) y tienen la ventaja de que están definidos para la mayor parte de los constituyentes de los líquidos biológicos. Sin embargo, no son valores constantes porque dependen de la población, de los métodos estadísticos para su cálculo y de la calidad de los métodos analíticos empleados en su determinación. - Las opiniones de los clínicos carecen de subjetividad y tienen el inconveniente de no tener en cuenta las variaciones inherentes a los propios individuos. - Los puntos de vista de los expertos tienen el inconveniente de que son empíricos, es decir, no obedecen a razones demostradas científicamente, sino a los resultados observados en la práctica diaria. - El efecto de las prestaciones del laboratorio sobre la interpretación de los resultados en diversas situaciones clinicas tiene el inconveniente fundamental de que no se puede aplicar en casos generales, pero podría tenerse en cuenta en determinadas circunstancias muy particulares. - Las prestaciones medias de los métodos actuales se calculan según el coeficiente de variación analítica obtenido mediante un determinado porcentaje (por ejemplo, el 50 %) de los laboratorios participantes en

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programas de control de calidad externo de amplia difusión. Calculadas de esta manera, podrían ser falsas si las muestras control se trataran de forma especialmente cuidadosa, y tienen el inconveniente de que varían con el tiempo, ya que los métodos analíticos mejoran día a día. A pesar de estos inconvenientes, es una forma práctica de definir objetivos analíticos de calidad cuando no se dispone de otros mecanismos. - La variación biológica intraindividual presenta varias ventajas: se fundamenta en datos objetivos, se ha demostrado su constancia entre razas, edades, sexos, localizaciones geográficas, salud o patologías en fase estacionaria, métodos analíticos para establecerla, y está descrita para magnitudes bioquímicas y hematológicas. Constituye el objetivo de calidad teórico para las determinaciones del laboratorio, es decir, que deberían utilizarse como límites de rechazo en cualquier sistema de control interno. Utilidad especificaciones de la calidad • Asegurar que los resultados son adecuados para el cuidado de los pacientes • Evaluar las prestaciones analíticas • Planificar y diseñar el control interno • Establecer límites de aceptabilidad de los programas de evaluación externa de la calidad • Validar sistemas de medida y métodos analíticos Especificaciones de calidad en el laboratorio clínico. Modelo jerárquico - Efecto de las prestaciones de calidad analíticas en situaciones clínicas concretas - Efecto de las prestaciones de calidad analíticas en las decisiones clínicas generales Valor de referencia del cambio Seguimiento: controlar la imprecisión analítica (Variación biológica) Diagnóstico: controlar el error sistemático analítico Especificaciones deseables Imprecisión: CVa <0.50CVi Error sistemàtico: Esa <0.250(CVi2 +CVb2)1/2 Error total: ETa <0.250(CVi2 +CVb2)1/2 +1.65(0.50CVi) - Recomendaciones de grupos profesionales - Propuestos por ley/EQAS: (CLIA en USA, Rilibak en Alemania, Consenso especificaciones mínimas AEBM/AEFA/SEQC en España). - Estado del arte Prestación de calidad de los laboratorios y métodos actuales • Organizadores de programas de evaluación externa • Grupos de profesionales Expresión: Imprecisión interlaboratorios (CV%) Tendencia central de los resultados de los indicadores (Percentil 50) Recomendaciones prácticas – Especificaciones de calidad Inspección de los datos de control interno - imprecisión - error sistemático Inspección de los datos de control externo - error total

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Conclusiones - Definir las especificaciones de calidad para todos los indicadores analíticos y extraanalíticos - Para los procesos analíticos utilizar las especificaciones derivadas de la variación biológica - Si no se conocen datos de variación biológica o para los procesos extraanalíticos seguir el modelo jerárquico para establecer la especificación más adecuada - Controlar periódicamente el cumplimiento de las especificaciones - Control de Calidad: definición - Conjunto de actividades y técnicas operacionales emprendidas por el personal de un laboratorio para la evaluación continuada de la fiabilidad de su trabajo y los resultados obtenidos.

Aplicación en el laboratorio de las especificaciones de calidad analítica La tendencia actual es identificar objetivos analíticos. El laboratorio tendría que comparar sus prestaciones con estos objetivos de calidad: Datos derivados de la Variación biológica. Recomendaciones de grupos profesionales. Establecidos por entidades legislativas o organizadores de programas EQAS. Estado del Arte (datos extraidos de programas externa de la calidad). RECOMENDACIÓN PRÁCTICA. - PRIMERO: Estado del Arte. - SEGUNDO: Una vez conseguido el Estado del Arte, aplicar Variación Biológica (más estricto en muchos casos). ESTADO DEL ARTE Es la prestación de los métodos analíticos actuales. El llamado “State of the Art” expresa la imprecisión interlaboratorios (CV%). El laboratorio tendría que comparar sus prestaciones con estos objetivos de calidad. El llamado “State of the Art” es la calidad alcanzada por una determinada proporción (fractil) de los mejores laboratorios participantes en un programa de Evaluación Externa de la Calidad. VARIACIÓN BIOLÓGICA Es la fluctuación de la concentración de los constituyentes de los fluidos humanos, alrededor del punto de equilibrio homeostático. Si conocemos lo que fluctúa la concentración de un analito, podremos compararla con la variación de las muestras control. Tiene dos componentes: variación intra (CVbi) e interindividual (CVbg). Utilización de los datos derivados de la variación biológica Los componentes de la variación biológica intra e interindividual se han utilizado para: • • • • • • • •

Para obtener especificaciones de la calidad analíticas Para valorar el significado de los cambios en resultados seriados (valor de referencia de un cambio) Para evaluar la utilidad de los valores de referencia poblacionales Para calcular el número de especímenes requeridos para la estimación del punto homeostático Para escoger el mejor sistema de informar de los resultados Para seleccionar el mejor especímen (el de menor variabilidad) Para comparar pruebas de laboratorio Para evaluar la utilidad clínica de las pruebas de laboratorio

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OBJETIVOS DE CALIDAD ANALÍTICA Imprecisión Analítica (CV): cercana a cero (nunca eliminable por la medida del error aleatorio). Error Sistemático (Inexactitud): igual a cero (teóricamente eliminable a través de la mejora de materiales y métodos). Error Total: Máximo error aceptable de la medida para prestación analítica deseable. Imprecisión (Cva) + Error Sistemático (ESa) = Error Total analítico (Eta) COEFICIENTE DE VARIACIÓN ANALÍTICO Imprecisión analítica (error aleatorio): CVa = ( SD / x ) *100 CVa : CV analítico, es importante minimizarlo en monitorización del estado del paciente. CVa : es el CV de los datos internos en un mes o en un año. Es recomendable comparar el CV del mes con el previo para ver que el sistema permanece estable.

ESPECIFICACIONES DE CALIDAD ANALÍTICA. IMPRECISIÓN Máxima imprecisión tolerable (máximo error aleatorio aceptable): Imprecisión (CVa) < 0,5 CVbi 0,75 mínimo (25%) 0,50 deseable (12%) 0,25 óptimo ( 3%)

ERROR SISTEMÁTICO ANALÍTICO Error sistemático (Inexactitud): [ (Media QC int. Lab - Valor diana) / Valor diana ] * 100 Importante en cribado, diagnóstico e identificación del caso individual cuando se usa un valor discriminante, para definir una condición patológica o de salud. Valor diana: valor consensual asignado o por método de un material de control interno-externo.

ESPECIFICACIONES DE CALIDAD ANALÍTICA. ERROR SISTEMÁTICO Máxima Inexactitud Tolerable (máximo error sistemático aceptable): Error sistemático (ESa) < 0,25 (CV2bi + CV2bg)0,5 bi = Variación biológica intra-individual bg= Variación biológica inter-individual Prestación analítica 0,375 mínima 0,25 deseable 0,125 óptima

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ESPECIFICACIONES DE CALIDAD ANALÍTICA. ERROR TOTAL ANALÍTICO Máximo error aceptable de la medida para prestación analítica deseable: (K * 0,50 * CVbi) + 0,25 (CV2bi + CV2bg)0,5 (K * 0,50 * CVbi) + 0,25 (CV2bi + CV2bg)0,5

IMPRECISIÓN

ERROR SISTEMÁTICO

ERROR TOTAL ANALÍTICO (Eta)

K = 1,65 para 95% nivel de probabilidad (gr. de confianza, α < 0,05) K = 2,33 para 99% nivel de probabilidad (α < 0,01)

FÓRMULAS DE CÁLCULO Los componentes de variación intra e interindividual, expresados como coeficientes de variación (CVbi y CVbg respectivamente) y las correspondientes especificaciones de calidad deseables para imprecisión (CVa), error sistemático (ESa) y error total (ETa), expresados en porcentajes, se calculan según las siguientes formulas: CVa < 0.5 Cvbi ESa < 0.25 (CVbi 2 + CVbg 2) ½ ETa < k. 0.5 CVbi + 0.25(CVbi 2 + CVbg 2) ½ donde k = 1.65 a α= 0,05 En el caso de los procedimientos analíticos con los que es difícil alcanzar las especificaciones de calidad deseables, con la metodología actual, se pueden utilizar las especificaciones de calidad mínimas que se calculan: CVa < 0.75 CVbi ESa < 0.375 (CVbi 2 + CVbg 2) ½ ETa < k. 0.75 CVbi + 0.375(CVbi 2 + CVbg 2) ½ donde k = 1.65 a α= 0,05 Por otro lado, para algunas magnitudes es fácil alcanzar las especificaciones de la calidad con los procedimientos analíticos existentes. En estos casos se pueden utilizar las especificaciones de la calidad óptimas que se calculan: CVa < 0.25 CVbi ESa < 0.125 (CVbi 2 + CVbg 2) ½ ETa < k. 0.25 CVbi + 0.375(CVbi 2 + CVbg 2) ½ donde k = 1.65 a α= 0,0

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Aplicaciones de las especificaciones de la calidad analítica en la rutina diaria Las especificaciones de la calidad para imprecisión, error sistemático y error total se pueden utilizar en el trabajo diario para: 1. Diseñar el protocolo de control de calidad interno (obtención de reglas control) 2. Evaluar la prestación analítica del laboratorio (aseguramiento de la calidad de los resultados) Obtención de reglas control Cuando se diseña un protocolo de control interno de la calidad, el primer paso es definir el nivel de calidad que se desea conseguir (especificación de la calidad analítica) para un determinado procedimiento analítico. El segundo paso es conocer la prestación estable del procedimiento analítico. Entonces, se ha de seleccionar una regla control (límites del control y número de controles por serie), capaz de avisar cuando la prestación estable sobrepase la especificación de calidad (5). Es importante entender que la especificación de calidad no debe usarse como límite del control, sino que éste ha de estar entre la especificación de calidad y la prestación del procedimiento analítico. Las reglas control se pueden calcular de una manera sencilla mediante el uso de algunos programas comerciales presentes en el mercado. La información presentada en este trabajo se puede utilizar para definir los requisitos analíticos pedidos por el programa con el fin de determinar las reglas control. Si la prioridad del laboratorio es detectar el error aleatorio, se puede poner como requisito analítico la especificación de calidad para imprecisión mostrada en la base de datos. Si la prioridad es detectar errores sistemáticos, se usará la especificación para error sistemático. Si el laboratorio quiere detectar la combinación de errores aleatorios y sistemáticos puede usar la especificación para error total. Aseguramiento de la calidad de los resultados: Para evaluar la prestación del laboratorio, se compara la imprecisión y el error sistemático analíticos (obtenidos de la puesta en práctica del protocolo de control interno) con las especificaciones de calidad (estándares) para estos dos componentes del error analítico. Los procedimientos analíticos que se desvíen de los estándares deben revisarse por los profesionales del laboratorio, e implementar procesos para mejorar la prestación de los mismos. Los datos obtenidos de la participación en programas externos de la calidad, esto es, la desviación en porcentaje de cada resultado respecto a la media del grupo de métodos, se pueden comparar con la especificación de la calidad analítica para error total para evaluar la inexactitud. Muchos organizadores de programas externos utilizan límites fijos, que son equivalentes a las especificaciones para error total dadas en este trabajo, para evaluar la prestación de los laboratorios participantes.

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ESPECIFICACIONES DE CALIDAD ANALÍTICA DEL LABORATORIO

Laboratorio de Bioquímica Clínica

Especificaciones de calidad analítica 2013 Analito

Variación Biológica

Especificaciones de calidad analítica

CVi

CV(%) ES(%) ET(%)

Selección de ETa

Alanina-aminotransferasa (ALT)

18,0

4,5

5,7

13,1

BV Opt bias/ Opt imprecision

Albúmina orina

36,0

9,0

8,2

23,1

BV Opt bias/ Opt imprecision

3,1

2,3

2,0

5,8

BV Min bias/ Min imprecision

Albúmina suero/plasma

23,8

11,9

11,4

31,1

BV Des bias/ Des imprecision

Calcio suero/plasma

1,9

1,4

1,3

3,6

BV Min bias/ Min imprecision

Colesterol

5,4

2,7

4,0

8,5

BV Des bias/ Des imprecision

24,0

12,0

8,6

28,4

BV Des bias/ Des imprecision

6,0

3,0

4,0

8,9

BV Des bias/ Des imprecision

Bilirrubina Total

Creatinina orina Creatinina suero/plasma

26,4

13,2

9,4

31,1

BV Des bias/ Des imprecision

Fosfato suero/plasma

8,5

4,3

3,2

10,2

BV Des bias/ Des imprecision

Glucosa suero/plasma

6,1

3,1

2,2

7,2

BV Des bias/ Des imprecision

Inmunoglobulina G (IgG)

4,5

3,4

6,4

12,0

BV Min bias/ Min imprecision

Ión Potasiosuero/plasma

4,8

2,4

1,8

5,8

BV Des bias/ Des imprecision

Ión Sodio suero/plasma

0,7

1,5

2,0

3,4

AEFA 2005

Lactato-deshidrogenasa (LDH)

8,6

4,3

11,4

BV Des bias/ Des imprecision

39,6

9,9

5,4

21,8

BV Opt bias/ Opt imprecision

2,7

2,0

1,8

5,2

BV Min bias/ Min imprecision

Triglicérido

20,9

10,5

10,7

27,9

BV Des bias/ Des imprecision

Urato orina

24,7

12,4

8,3

28,7

BV Des bias/ Des imprecision

Fosfato orina

Proteínas totales orina Proteínas totales suero/plasma

9,0

4,5

4,9

12,4

BV Des bias/ Des imprecision

Urea orina

22,7

11,4

8,6

27,3

BV Des bias/ Des imprecision

Urea suero/plasma

12,3

6,2

5,5

15,7

BV Des bias/ Des imprecision

Urato suero/plasma

CVbi: Coeficiente de VARIACIÓN BIOLÓGICA INTRAINDIVIDUAL CVa: IMPRECISIÓN ANALÍTICA (Coef. de Variación analítico) - Error Aleatorio. (Deseable): CVa < 0,50 CVbi (Mínimo): < 0,75 CVbi (Óptimo): < 0,25 Cvbi Esa: INEXACTITUD ANALÍTICA, Veracidad o Sesgo (Desv. respecto a la media) - Error Sistemático analítico. (Deseable): ESa < 0,25 (CVbi2 + CVbg2)½ (Mínimo): < 0,375 (Óptimo): < 0,125 ETa: ERROR TOTAL analítico = Imprecisión + Inexactitud = (1,65 x CVa) + ESa Mínimo: para las magnitudes en las que es difícil alcanzar las especificaciones de calidad con los procedimientos analíticos existentes. Óptimo: para las magnitudes en las que es fácil procedimientos analíticos existentes.

alcanzar las especificaciones de calidad con los

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16.10. CONTROL DE CALIDAD PRE Y POSTANALÍTICO. INDICADORES______________________________ El control de calidad de la fase preanalítica y postanalítica se realiza estableciendo una serie de indicadores con unos objetivos fijados previamente, que sirven para evaluar la calidad de ambos procesos. Laboratorio de Bioquímica Clínica Indicadores pre y postanalíticos PROCESO

PREANALÍTICA

INDICADOR

OBJETO

OBTENCIÓN DE DATOS

Errores de petición: cumplimentación Conocer el nivel de cumplimentación y y registro registro adecuado de las peticiones.

INCIDENCIA

(A) Número de peticiones con errores de cumplimentación y/o registro. (B) Número total de peticiones

(A) Número de peticiones con Conocer los errores en la identificación incidencias asociadas a la de de pacientes identificación de pacientes. (B) Número total de peticiones

PREANALÍTICA

Errores de petición: identificación

PREANALÍTICA

Conocer el nivel de cumplimentación Instrucciones incumplidas pacientes por parte de los pacientes de las condiciones preanalíticas establecidas.

PREANALÍTICA

Adecuación de muestra

PREANALÍTICA

Adecuación del transporte

PREANALÍTICA

Adecuación de muestra y envío

POSTANALÍTICA

Validación facultativa-clínica

(A) Instrucciones incumplidas en pacientes. (B) Número total de peticiones

Conocer el % de peticiones con incidencias de muestra que impiden realizar las determinaciones

(A) Número de muestras con incidencias en toma o procesado. (B) Número total de muestras (A) Número de envíos recibidos fuera Valorar la calidad del transporte de de plazo, o con incidencias en muestras desde los centros de transporte o temperatura en circuitos extracción periféricos externos periféricos. (B) Número total de envíos (A) Número de muestras con Valorar la calidad del envío de muestras incidencias. (B) Número total de muestras enviados a laboratorios a laboratorios externos de referencia externos

ALGORITMO DE CÁLCULO

A x 100 / B

Asegurar la fiabilidad de los resultados analíticos obtenidos.

(A) Número de incidencias registradas en validación facultativa-clínica. (B) Número total de peticiones

A x 100 / B

A+B/C

POSTANALÍTICA

Aportación de valor añadido

Conocer el nivel de valor añadido

(A) Número pruebas añadidas por facult. lab. (B) Número de comentarios no codificados añadidos por el facult. lab. (C) Número de peticiones

POSTANALÍTICA

Informes: Incidencias total

Conocer la calidad de la gestión de informes analíticos de resultados.

(A) Número de informes con incidencias. (B) Número total de informes de resultados

POSTANALÍTICA

Informes: Disponibilidad de resultados rutina

(A) Número de determinaciones con Conocer las incidencias en la entrega de incidencias por demora en laboratorio resultados del Laboratorio General general. (B) Número total de determinaciones laboratorio general

A x 1000 / B

POSTANALÍTICA

Informes: Disponibilidad de resultados urgencias

(A) Número de determinaciones con incidencias por demora en laboratorio Conocer las incidencias en la entrega de de urgencias. (B) Número total de resultados del Laboratorio de Urgencias determinaciones laboratorio de urgencias

A x 1000 / B

POSTANALÍTICA

Informes: Tiempo de respuesta analíticas urgentes

(A) Hora disponibilidad de resultado. Conocer la disponibilidad de resultados (B) Hora recepción de muestra en en el Laboratorio de Urgencias laboratorio de urgencias

POSTANALÍTICA

Comunicación urgente de resultados Conocer el nivel de comunicación de críticos resultados críticos

POSTANALÍTICA

Resultados laboratorios externos

Evaluar la gestión de los resultados de los laboratorios externos de referencia

(A) Número de comunicaciones urgentes de valores críticos. (B) Número de peticiones con valor/es crítico/s. (A) Número de resultados reclamados. (B) Número pruebas enviadas a laboratorios externos

A x 100 / B

A-B

A x 100 / B

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16.11. SISTEMAS DE GESTIÓN DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO CLÍNICO_______________________ Para obtener el reconocimiento formal de estar trabajando según unas determinadas directrices mediante un sistema de gestión de la calidad, por motivos legales, de prestigio o de competitividad, existen diversas vías o niveles en el camino hacia la excelencia con la utilización de herramientas de mejora contínua: • • •

Autorización administrativa Certificación Acreditación

AUTORIZACIÓN ADMINISTRATIVA La autorización administrativa es el reconocimiento legal del laboratorio por parte de la administración pública, con la finalidad de asegurar que cumple las condiciones adecuadas y garantizar a los potenciales usuarios un nivel correcto de calidad asistencial. Este primer nivel es legislativo, y por tanto obligatorio. En todas las Comunidades Autónomas del Estado Español existe legislación vigente sobre la autorización administrativa de apertura, funcionamiento, modificación y registro de centros, servicios y establecimientos sanitarios y socio-sanitarios; sin embargo, solamente algunas de estas Comunidades tienen legislación específica de autorización de laboratorios clínicos tanto públicos como privados, con diversos niveles de exigencia. Cataluña, Islas Baleares, País Vasco, Andalucía, País Valenciano, Galicia, Castila-La Mancha, Canarias, Madrid y Castilla/León.

CERTIFICACIÓN El siguiente nivel de calidad sería la certificación del sistema de gestión de la calidad implantado en el laboratorio, con carácter voluntario. La certificación es el «procedimiento mediante el cual una tercera parte da garantía escrita de que un producto, proceso o servicio es conforme con unos requisitos específicos».

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Diferencia entre certificación y acreditación La diferencia entre la certificación y la acreditación estriba en que mientras en la primera un organismo externo da garantía de que en el caso del laboratorio un proceso o servicio es conforme a unos requisitos previamente establecidos, la acreditación sería el reconocimiento formal por parte de un organismo externo de la competencia técnica de un laboratorio para realizar una técnica analítica o un conjunto de técnicas analíticas. Una forma gráfica y esquemática de explicar mejor la diferencia entre certificar o acreditar un laboratorio clínico, se representa en el esquema de modelo de cadena sanitaria aplicada al laboratorio clínico en tres bloques interrelacionados (proveedores / laboratorio / clientes) propuesto por J.C. Libeer. Así en la década 1990-2000, las empresas fabricantes de productos de diagnóstico in vitro han tenido claro qué sistema de gestión de la calidad debían implantar: la certificación de la empresa, a nivel internacional mediante la norma ISO 9001 ó ISO 9002, o a nivel europeo mediante la norma EN 46001 ó EN 46002, dependiendo de si la empresa era fabricante de un producto o sólo distribuidora, así como su adaptación a la de diagnóstico in vitro correspondiente. Pero, en el caso de los laboratorios clínicos ¿qué sistema de gestión de calidad implantar? Si se realiza una pequeña modificación al esquema de Libeer, la exigencia de los laboratorios hacia sus proveedores de instrumentación, reactivos, controles y resto de material imprescindible para realizar su trabajo, es que el producto que nos proporcionen cumpla con los requisitos o exigencias de calidad prometidos en su propaganda, es decir, que un organismo externo certifique que es conforme a los requisitos previamente establecidos. Mientras que la exigencia de nuestros clientes (clínicos y pacientes) hacia los laboratorios clínicos es que sean competentes para realizar este tipo de determinaciones analíticas, es decir, que esté acreditado por un organismo externo con capacidad legal para ello. Sin embargo, debido a la falta de una norma especifica para acreditar laboratorios clínicos, muchos laboratorios se decantaron por conseguir la certificación de su sistema de gestión de la calidad a través de una de las entidades de certificación acreditadas por la Entidad Nacional de Acreditación (ENAC).

Normas vigentes relacionadas Las normas actuales de certificación para todo tipo de empresa u organización y que pueden aplicarse específicamente a los laboratorios clínicos, se describen en la tabla siguiente.

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Estas normas son las de la serie 9000, elaborados por los Cuerpos Técnicos de la ISO (normas ISO 9000), aceptadas por el CEN (normas EN ISO 9000) y por AENOR (normas UNE-EN ISO 9000) y publicadas en castellano. La norma ISO 9001:2008 presenta los requisitos para un sistema de gestión de la calidad basado en el modelo de procesos, contempla el aseguramiento de la calidad de la conformidad de los productos y servicios e incluye la demostración de la capacidad para lograr la satisfacción de los clientes. La norma se publicó en el mes de noviembre de 2008, siendo vigente a partir de esta fecha. Las normas de la serie ISO 9000 se basan en ocho principios de gestión de la calidad: • • • • • • • • •

Organización orientada al cliente. Liderazgo. Implicación del personal. Enfoque por procesos. Dirección basada en sistemas. Mejora continua. Toma de decisión basada en los datos. Relaciones mutuamente beneficiosas con los suministradores. Incorporan la orientación hacia los clientes a través de la medición de sus exigencias y su satisfacción, la gestión por procesos y la mejora continua.

Modelo y despliegue de procesos de gestión de la calidad El modelo de procesos descrito en la norma ISO 9001 :2008, se basa en el ciclo de Deming (ver capítulo 3) y contiene 5 requisitos que no son extraños a ninguna empresa u organización sanitaria: • • • • •

Sistema de gestión de la calidad. Responsabilidad de la dirección. Gestión de los recursos. Realización del producto o servicio. Evaluación o medición, análisis y mejora.

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Una de las novedades más importantes de la norma es la definición del mapa de procesos partiendo de la definición de la misión y visión del laboratorio en la pirámide documental formada (desde la cúspide hasta la base) por el manual de la calidad, los procesos, los procedimientos, las instrucciones de trabajo y los registros. Para el despliegue de los procesos se realiza un diagrama de los mismos, identifícando las actividades y sus interrelaciones. Una vez definidos, analizados y mejorados los procesos, se definen los indicadores asociados a los mismos. Los procesos servirán para confeccionar los diferentes procedimientos que conforman el manual de procedimientos del laboratorio. En caso necesario, los procesos se pueden desplegar en subprocesos, a los que se asociarán asimismo indicadores y procedimientos.

Organismos de certificación a nivel nacional El organismo a nivel nacional que acredita entidades certificadoras de sistemas de gestión de la calidad es la Entidad Nacional de Acreditación (ENAC). Algunas de dichas entidades certificadoras a nivel nacional son: Asociación Española de Normalización y Acreditación (AENOR), SGS-ICS Ibérica, Bureau Veritas Quality Internacional España, S.A., Det Norske Ventos Classiíication Sucursal Española, Lloyd's Register Qualily Assurance Ltd., Applus España + LGAI. División de Laboratorios y Certificación, etc.

ACREDITACIÓN El siguiente nivel de calidad, también con carácter voluntario, sería la acreditacíón del sistema de gestión de la calidad implantado en el íaboratorio. La acreditación de un laboratorio genérico de ensayo es el «reconocimiento formal de la competencia técnica de un laboratorio de ensayo para realizar un ensayo o un conjunto de ensayos determinados». También sería el «procedimiento por el cual un organismo autorizado da reconocimiento formal de que una entidad o persona es competente para llevar a cabo unas tareas específicas». Normas vigentes relacionadas De todas las normas que existen, la específica para la acreditación de laboratorios clínicos es la ISO 15189. Dicha norma ha sido preparada por el Comité Técnico SO/TC 212 de la organización ISO y contiene iodos los requisitos que los laboratorios clínicos tienen que cumplir para demostrar: • • •

Que disponen de un sistema de gestión de la calidad. Que son técnicamente competentes. Que son capaces de producir resultados técnicamente válidos.

El uso de la norma es adecuado para todas las disciplinas reconocidas en el laboratorio clínico e incorpora una relación cruzada provisional con los requisitos de la Norma ISO 9001:2000. La estructura de la norma se divide claramente en dos tipos de requisitos: 1. Requisitos de gestión, similares a los respectivos 9001:2008, con los siguientes apartados: -

Organización y sistema de gestión de la calidad. Control de la documentación. Revisión de los contratos. Análisis efectuados por laboratorios subcontratistas. Servicios externos, de suministros y de asesoramiento.

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Resolución de reclamaciones. Identificación y control de las no conformidades Acciones correctivas y preventivas. Mejora continua. Registros de la calidad y registros técnicos. Auditorias internas. Revisión por la dirección.

2. Requisitos técnicos, similares a los respectivos de la norma ISO/IEC 17025:2005, pero adaptados a los laboratorios clínicos, con los siguientes apartados: -

Personal. Instalaciones y condiciones ambientales. Equipo de laboratorio. Procedimientos preanalíticos, analíticos y postanalíticos. Aseguramiento de la calidad de los procedimientos analíticos Informe de laboratorio

Organismos de acreditación a nivel nacional La Entidad Nacional de Acreditación (ENAC) es el único organismo designado por la Administración para establecer y mantener el sistema de acreditación a nivel nacional, de acuerdo a normas internacionales, siguiendo en todo momento las políticas y recomendaciones establecidas por la Unión Europea. ENAC (www.enac.es) es una organización declarada de utilidad pública, independiente y sin ánimo de lucro, auspiciada y tutelada por la Administración, garantizando que todas sus actuaciones se basan en principios de imparcialidad, independencia y transparencia, con un marcado carácter técnico, aportando valor a todos los agentes que tienen intereses en los distintos aspectos de la acreditación. Su misión es evaluar la competencia técnica de los organismos de evaluación de la conformidad para generar así confianza en sus actividades a la Administración, al mercado y a la sociedad en general. De esta forma consigue que sus servicios estén reconocidos y aceptados nacional e internacionalmente, contribuyendo así a una mayor protección de las personas y del medioambiente y al aumento de la competitividad de los productos y servicios españoles. En relación a los laboratorios clínicos, ENAC realiza las auditorias de los laboratorios españoles que solicitan ser acreditados por la norma ISO 151 89 y expide los certificados correspondientes si cumplen los requisitos.

MEJORA CONTINUA Un proceso de mejora continua está definido como la «actividad recurrente para aumentar la capacidad para cumplir los requisitos». Cada palabra en este término tiene un mensaje específico. «Proceso» implica una secuencia relacionada de acciones y de pasos, y no tan solo un conjunto de ideas. «Mejora» significa que este conjunto de acciones incremente los resultados de rentabilidad de la empresa, basándose en variables que son apreciadas por el mercado (calidad, servicio, etc.) y que den una ventaja diferencial a la empresa en relación a sus competidores. «Continua» implica que dado el medio ambiente de competencia en donde los competidores hacen movimientos para ganar una posición en el mercado, la generación de ventajas debe ser algo constante.

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El proceso de mejora continua es un concepto que pretende mejorar los productos, servicios y procesos e implica el seguimiento de una filosofía de gestión y la participación activa de todo el personal. Herramientas para la mejora Para alcanzar la calidad total y conseguir así el nivel de excelencia, se necesita aplicar un proceso de mejora continua de la calidad sobre la base de la implantación de un sistema de gestión de la calidad, mediante la utilización de una serie de herramientas para abordar la optimización de recursos. Existen muchas herramientas de mejora continua para alcanzar la calidad. Sólo citaremos algunas de ellas: El ciclo de mejora continua de Deming o ciclo PDCA es la herramienta más conocida y aplicada (ver capítulo 3), enfocada a la mejora de procesos existentes, con estos cuatro puntos básicos: Plan: planificar una mejora. Do: elaborar un proyecto piloto. Check: observar los resultados de la propuesta. Act: actuar sobre toda la organización. La metodología o ciclo de mejora DMAI2C es una modificación mejorada y actualizada del ciclo PDCA, que es un método estandarizado para el desarrollo y resolución de proyectos que buscan disminuir los problemas de calidad, enfocado también a la mejora de procesos existentes y se basa en el uso profundo de las herramientas estadísticas de cada una de las fases.

La metodología DMAI2C es una potente metodología utilizada para abordar problemas complejos cuya solución no se vislumbra y orientada a conseguir elevados beneficios económicos en un corto período de tiempo. Dicha metodología utilizada por el equipo para solucionar los problemas e identificación de planes de acción está constituida por cinco etapas bien definidas, cada una de las cuales tiene asociadas unas herramientas de mejora; - Define: definir un proyecto, proceso o problema. - Measure: medir el problema y determinar las entradas más críticas y la capacidad del proceso. - Analyze: identificar las causas principales del problema y desarrollar un diagrama causa-efecto. - Innovative/lmprovement: definir e implementar las mejoras o contramedidas para eliminar las causas raíz y generar soluciones y mejoras. - Control: controlar el plan y el resultado del proyecto, y ejecutar un plan de cambio de gestión.

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El método LEAN consiste en eliminar los tiempos de espera para acelerar el flujo de trabajo y conseguir un mejor valor del tiempo de entrega de resultados. La aplicación de la metodología LEAN al laboratorio, pretende incrementar la calidad, disminuir los costes, disminuir el espacio físico, disminuir los tiempos de espera y mejorar la satisfacción del cliente y del personal del laboratorio. Los objetivos del método LEAN son: Reducir las operaciones que no aportan valor añadido. Incrementar la capacidad productiva y la flexibilidad. Incrementar la productividad. Mejorar la fiabilidad y la calidad. Reducir «stocks». Reducir las pérdidas de tiempo. Llevar a cabo un sistema de producción denominado «justo a tiempo», que sería producir los elementos que se necesitan, en las cantidades que se necesitan, en el momento en que se necesitan. El sistema LEAN se basa en los siguientes fundamentos: Hacer únicamente «lo que es necesario, cuando es necesario, y en la cantidad necesaria». La calidad debe ser parte inherente del proceso. El tiempo total de procesado debe ser mínimo (cuanto más corto sea, con mayor rapidez recuperaremos la inversión realizada en la materia prima y los procesos, eliminando inventarios innecesarios y tiempos de espera inútiles). Alta utilización de instrumentación y personal. Mejora continua (el proceso nunca acaba, siempre habrá una manera mejor de hacerlo). La métrica sigma (Seis Sigma), en síntesis, sería la medición y reducción de errores y la tasa de defectos con el objetivo de la mejora de resultados. Es un programa de mejora íntegrador de muchas herramientas y procedimientos ya conocidos. Dicha herramienta de mejora continua mide la calidad mediante la escala sigma, contabilizando los errores o la variabilidad del proceso. En el caso de la medición de errores, el proceso secuencial consiste en contar el número de fallos, calcular los fallos por millón (en ppm) y convertir los ppm en escala métrica sigma. En el caso de medir la variabilidad, expresarla como desviación estándar y llevarla a la escala seis sigma. Alcanzar el valor seis sigma (6) significa tener 2,4 defectos por millón. El sistema Seis Sigma es un enfoque sistemático y un lenguaje para la mejora, con la finalidad de reducir los defectos de los procesos que afectan a lo que es crítico para el cliente y mejorar su eficiencia, así como una filosofía y metodología para mejorar la calidad, el coste y e tiempo de ciclo de cualquier tipo de proceso. Las fases de un programa seis sigma, utilizado para el diseño de nuevos procesos, productos y servicios, sobre la base del ciclo DMAI2C serían: Definir: Definir los proyectos en función de los requerimientos del cliente y del beneficio de la empresa. Medir: Definir la métrica para medir el comportamiento de los procesos relacionados con el proyecto, conocer la situación actual y establecer objetivos. Analizar: Encontrar qué factores influyen en la variación de nuestra métrica y cómo interaccionan. Mejorar: Encontrar cómo los factores afectan a la métrica y establecer sus condiciones óptimas. Controlar: Crear un sistema para controlar permanentemente los factores importantes. Acumular el conocimiento obtenido. Herramientas para la gestión del riesgo - El Análisis Modal de Fallos potenciales y sus Efectos (AMFE). El objetivo de esta herramienta es reducir el riesgo de los errores potenciales cuando se introducen cambios o modificaciones en los procesos (ver capítulo 20).

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Capítulo 17. La fase postanalítica

Terminología 17.1. Validación técnica 17.2. Validación facultativa o clínica 17.3. Disponibilidad de resultados 17.4. Informe de resultados 17.5. Comunicación urgente de resultados críticos o alarmantes 17.6. Comentarios interpretativos de los resultados

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TERMINOLOGÍA____________________________________________________________________ Fase postanalítica o postmetrológica: Procesos que siguen al análisis que incluyen la revisión y validación de los resultados, la elaboración del informe del laboratorio y su interpretación, autorización para entrega y transmisión de resultados, y el almacenamiento de las muestras. Validación: confirmación mediante el examen y la aportación de evidencias objetivas de que se han cumplido los requisitos particulares para una utilización específica prevista. Verificación de que los requisitos establecidos son adecuados para un uso previsto (VIM: Vocabulario Internacional de Metrología). A efectos prácticos los términos de validación y verificación se pueden considerar sinónimos. Informe de laboratorio clínico; informe de resultados: documento producto final del laboratorio que contiene los resultados de las magnitudes bioquímicas analizadas y validadas técnica y facultativamente, sus unidades y valores de referencia, así como los datos identificativos del paciente, del peticionario, de las muestras y del laboratorio, además de cualquier información o comentario que pueda facilitar la interpretación de los resultados y que es remitido al solicitante como respuesta a su petición de análisis.

17.1. VALIDACIÓN TÉCNICA____________________________________________________________ Validación técnica: parte del proceso de validación realizado por el personal técnico del laboratorio. Proceso por el que se comprueba que la muestra es la adecuada, los reactivos están en buen estado, los equipos funcionan correctamente, las técnicas analíticas estan calibradas, se han realizado los controles de calidad, se han aplicado los criterios de aceptación de los controles, se han comprobado las alarmas de los equipos, se ha comprobado la ausencia de resultados aberrantes o absurdos y se han comprobado los resultados alarmantes. La validación técnica, es la verificación de que los equipos mantienen sus características y que los resultados obtenidos se han procesado en equipos adecuados en condiciones adecuadas. Es decir, la confirmación mediante el examen y provisión de evidencias objetivas de que los resultados de las magnitudes valoradas cumplen con los requisitos especificados por los responsables del área técnica:

- adecuación de la muestra - funcionamiento de los analizadores - estado de los reactivos - estado de las calibraciones - aceptación de los controles de calidad - ausencia de avisos y alarmas - ausencia de resultados aberrantes o absurdos - comprobación de resultados críticos o alarmantes

Esta validación la realiza el Técnico de Laboratorio. Entre sus funciones está la de verificar que las muestras son adecuadas, que los equipos e instrumentos funcionan correctamente, que se han realizado los mantenimientos preventivos que se han procesado los controles de calidad y que los resultados coinciden con los objetivos.

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La programación de controles y verificación de objetivos se hará por el responsable facultativo del área técnica y cualquier “no conformidad” le será comunicada a fin de establecer las medidas correctoras adecuadas. Es función técnica la verificación de los resultados: que ha habido suficiente muestra, que los resultados obtenidos están dentro del intervalo de ensayo del procedimiento, y que no hay resultados aberrantes. Los resultados alarmantes deberán ser comunicados comprobados y confirmados. Cuando existan resultados fuera del intervalo de ensayo del procedimiento deberán proceder a repetir la determinación debidamente diluida, en caso de que el resultado sea superior al rango estipulado, en caso de que sea inferior se informará como tal a menos que haya instrucciones contrarias por parte del facultativo responsable del área. Así mismo es responsabilidad del personal técnico proceder a las instrucciones que le dé el facultativo responsable del área, dentro de sus competencias, para verificar y asegurar cualquier resultado que habiendo sido conforme para validación técnica, se estime que no cumple las condiciones para validación facultativa. Resultados que no se deben informar

• Los que presenten indicadores de alarma o avisos en los analizadores: • Los relacionados con la calidad e identidad de la muestra: identificación no correcta, muestra coagulada, hemolizada, con burbujas de aire, lipémica, contaminada, insuficiente, etc. • Los relacionados con la identificación de la petición: falta trazabilidad o correlación entre identificación de la petición y de la muestra, petición sin identificar, etc. • Los resultados alarmantes o críticos que no han sido debidamente repetidos, comprobados y confirmados. • Los resultados muy discordantes con resultados anteriores que no han sido repetidos y confirmados. • Los resultados aberrantes, absurdos o inverosímiles. • Los resultados obtenidos con errores previos en la calibración y/o en los controles de calidad. • Siempre que se sospeche anomalía de funcionamiento de los analizadores, calidad de la muestra procesada, identidad del paciente o se tengan dudas de la certeza de los resultados obtenidos.

Procedimiento La validación técnica podrá realizarse de forma automática, mediante el empleo de criterios informáticos definidos por el facultativo responsable de aquellas muestras que están dentro de un intervalo definido y que han sido procesadas en instrumentos debidamente controlados y con los mantenimientos realizados. En caso contrario los resultados se validarán manualmente por el técnico responsable, dejando constancia de su firma electrónica. Los resultados retenidos no conformes se efectuarán los procedimientos adecuados para asegurar un resultado correcto. Los resultados una vez validados técnicamente pasarán a revisión del personal facultativo.

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17.2. VALIDACIÓN FACULTATIVA O CLÍNICA_______________________________________________ Validación facultativa: proceso de validación realizado por el personal facultativo del laboratorio. Proceso por el que se comprueba la congruencia de los resultados con el diagnóstico señalado en la petición, su coherencia biológica, así como con los datos demográficos del paciente con el objetivo de identificar los resultados imposibles, aberrantes o incongruentes. La validación de los resultados analíticos constituye una de las funciones más importantes de los facultativos del laboratorio clínico, para detectar posibles errores producidos en cualquier fase del proceso y añadir información (valor añadido) que ayude a la interpretación clínica. Coherencia biológica: conexión y ausencia de contradicción entre los resultados de las magnitudes biológicas de un paciente y otros conocimientos biológicos que se dispone de este paciente. La comprobación de la coherencia biológica es la base de la validación de los informes del laboratorio clínico. La validación facultativa es la confirmación mediante el examen y provisión de evidencias objetivas de que los resultados de las magnitudes valoradas cumplen con los requisitos especificados para ser informadas a los clínicos solicitantes. El laboratorio clínico tiene como misión elaborar informes útiles a partir del estudio de muestras de origen humano, para ayudar al diagnóstico, pronóstico o seguimiento de un episodio clínico. El personal facultativo tiene la responsabilidad personal sobre los informes que emite y firma, con cualquier tipo de identificación aceptada, sea particular, genérica, física o informática. El ámbito de responsabilidad del facultativo del laboratorio alcanza todas las actividades previas que están directamente relacionadas con la elaboración de los informes que emite, es decir, todos los pasos intermedios desde que se toma la muestra a la disponibilidad del informe por parte del clínico solicitante. De acuerdo con la estructura organizativa del laboratorio, la responsabilidad de los procesos globales puede estar compartida por distintos facultativos, que tengan responsabilidad establecida sobre determinadas etapas del proceso. El facultativo es así mismo responsable de las estructuras físicas y organizativas que influyen en la calidad del resultado obtenido, así como de la seguridad y confidencialidad de los resultados registrados en cualquier tipo de soporte. En el caso de actividades referidas a otros laboratorios, la responsabilidad final puede estar compartimentada entre las diferentes entidades colaboradoras. Requisitos previos El personal responsable de la validación facultativo debe estar debidamente cualificado y disponer de las competencias adecuadas, para elaborar el informe final del laboratorio clínico. Es importante antes de proceder a la validación facultativa asegurarse de que las muestras sobre las que se han realizado los procesos pertinentes para obtener resultados son adecuadas o en caso contrario de muestras no adecuadas o presencia de interferentes, asegurarse de establecer los circuitos y acciones adecuadas para informar de estas situaciones. El facultativo deberá establecer los procedimientos de calidad que estime adecuados así como el procedimiento de acciones no conformes. Es necesario el conocimiento del estado de instrumentos del que el facultativo es responsable, esto incluye los programas de mantenimiento preventivo, acciones correctoras o averías de equipos. Deberá así mismo recoger cualquier incidencia que afecte a la muestra o a los instrumentos de su responsabilidad. Es responsabilidad de los facultativos verificar que instrumentos volumétricos, empleados para hacer diluciones estén debidamente calibrados. Es importante establecer criterios e instrucciones al personal técnico a fin de que los resultados de las distintas magnitudes lleguen a la validación facultativa en las debidas condiciones de calidad y fiabilidad técnicas.

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Procedimiento La validación es el paso último antes de la elaboración del informe de laboratorio, deberá hacerse de forma ágil y con la menor demora posible a fin de facilitar la emisión de este informe. Cada facultativo es responsable de la validación del área de laboratorio asignada y eventualmente las áreas de otros facultativos cuando éstos no se encuentren en el laboratorio. Se realiza sobre soporte informático, identificándose previamente mediante su usuario y clave. A juicio del facultativo se empleará la modalidad que estime más adecuada: - Revisar todo - Revisar anormales (que excedan del intervalo de referencia) - Revisar patológicos (que excedan de los rangos establecidos como patológicos). - Revisar alarmantes (que excedan del rango establecido como alarmante). Los facultativos deberán establecer los rangos que se especifican en cada modalidad, teniendo en cuenta que son responsables tanto de las magnitudes que se revisan como las que cumplen criterios para ser revisadas por el software del laboratorio. En la revisión es importante verificar que los instrumentos donde se han procesado las distintas magnitudes son conformes así como se han seguido los procedimientos adecuados. Hay que considerar las evidencias que permiten asegurar la correcta validación facultativa, entre estas podemos citar: - La congruencia del resultado con el diagnóstico presuntivo si está disponible. - La congruencia de una determinada magnitud con otras del mismo informe, del mismo área de responsabilidad o de otras áreas de responsabilidad de compañeros. - La congruencia con resultados previos si existen. En caso de estimar que un informe no es apto para su validación se procederá a repetir las magnitudes que se estimen convenientes o se procesarán nuevas magnitudes. Es importante complementar los informes con comentarios aclaratorios, informativos o explicativos. Los resultados alarmantes se confirmarán y se informarán personalmente o por teléfono de forma rápida. La repetición de resultados sobre magnitudes se procurará hacer de forma rápida a fin de no demorar en exceso el informe de laboratorio. Tras la validación los informes quedan firmados electrónicamente por el responsable. Los facultativos estarán disponibles para cualquier aclaración que se solicite sobre el informe o parte de este de su responsabilidad.

17.3. DISPONIBILIDAD DE RESULTADOS___________________________________________________ El laboratorio establecerá el plazo de entrega o la demora en la disponibilidad de resultados y lo comunicará a sus clientes, elaborando un documento donde se informe de la demora de cada una de las pruebas analíticas que realiza el laboratorio y de las que se remiten a laboratorios externos de referencia. Se establecen los siguientes criterios de disponibilidad de resultados: • • • •

Urgente – inmediato Antes de las 15 h En el día (máximo 24 horas) Diferido (se indican número de días de demora)

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17.4. INFORME DE RESULTADOS________________________________________________________ Una vez concluida la validación facultativa se procede a la emisión del informe de resultados que es el producto final del proceso del laboratorio. El informe puede ser impreso en formato papel o en formato electrónico -pdf-. El laboratorio establecerá el procedimiento de distribución de los informes y verificará que los clientes reciben adecuadamente los informes de resultados en el tiempo previsto, con la información completa y legible. El informe de resultados deberá contener la siguiente información:

Identificación del laboratorio Datos demográficos del paciente Datos del peticionario Identificación de la petición y la muestra Datos clínicos Magnitudes bioquímicas analizadas Resultados Unidades Valores de referencia Comentarios interpretativos Observaciones Firma del facultativo

17.5. COMUNICACIÓN URGENTE DE RESULTADOS CRÍTICOS O ALARMANTES______________________ Límite crítico: Límite superior o inferior que indican que el paciente se encuentra en una situación de peligro agudo y que deben llevar directamente a la inmediata atención al paciente. Valor crítico: Valor que está por encima o por debajo de los límites críticos. Cuando se obtiene inesperadamente un valor alarmante se debe notificar inmediatamente. Un valor alarmante es aquel que indica un peligro inmediato para el paciente en el que se ha observado y que, cuando se obtiene inesperadamente, debe ser notificado inmediatamente al médico solicitante de la analítica en cuestión. La notificación la hará el facultativo del laboratorio. No todas las magnitudes presentan valores críticos. Unas magnitudes presentan valores críticos tanto por encima como por debajo del límite crítico (p.ej: glucosa) y otras sólo por encima (p.ej: creatinina) o sólo por debajo (p.ej. albúmina). Existen publicaciones en la literatura científica con valores críticos.

En la siguiente tabla se pueden observar algunos de los valores críticos que tiene establecido el laboratorio:

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Magnitud

Límite inferior

Alanina-aminotransferasa (ALT) Albúmina Calcio total Creatinina Dióxido de carbono-presión parcial (pCO2) Glucosa Ión potasio Ión sodio Lactato pH sangre art. Urato Urea

1,5 7,0 20 47 2,8 121 7,20 -

Límite superior 1000 12,0 5,2 70 445 6,3 156 3,4 7,60 >13 214

Unidades U/L g/dL mg/dL mg/dL mmHg mg/dL mmol/L mmol/L mmol/L mg/dL mg/dL

El laboratorio ha elaborado un procedimiento de comunicación urgente de resultados críticos en el que, entre otras, figura la siguiente documentación: - Comprobación de resultados críticos: Cuando se obtenga un resultado con valor crítico, el facultativo responsable de la sección comprobará: ⇒ Si la muestra o espécimen está correctamente identificada (si se utiliza una alícuota, verificar el resultado con el tubo primario). ⇒ Que la misma sea aceptable (comprobar hemólisis, lipemia, ictericia, vías, catéteres, tiempo de muestreo, etc). ⇒ Que el resultado ha sido repetido o comprobado y confirmado en una segunda determinación efectuada en la misma muestra del paciente. ⇒ Si fuera necesario se solicitará una nueva muestra tomada en las debidas condiciones. ⇒ Comprobar si es un paciente ya conocido, con resultados previos concordantes o similares, o consultar diagnóstico y valorar, a la vista de estos datos, si procede o no la comunicación urgente. - Comunicación de resultados críticos: Siempre que sea posible, el facultativo responsable del área o sección donde se ha producido el valor crítico lo comunicará al clínico que ha solicitado la petición analítica o a personal responsable de la siguiente forma: Comprobación del resultado Comunicación al facultativo o personal clínico responsable Envío de preinforme o de fax Registro en libro de incidencias La comunicación de resultados por teléfono o fax deberá ser limitada en la medida de lo posible y seguida por información escrita tan pronto sea posible. - Registro de la notificación Existe como registro de notificación un libro de incidencias en el que consta: - Fecha - Identificación del paciente (apellidos y nombre)

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- Número de petición - Médico solicitante - Servicio, Unidad o Centro de Salud - Resultado de la magnitud con valor crítico y unidades - Persona o unidad a la que se le ha comunicado el resultado - Persona que comunica el resultado - Forma o medio de comunicación del resultado

17.6. COMENTARIOS INTERPRETATIVOS DE LOS RESULTADOS__________________________________ Son una opinión, basada en criterios científicos, que sobre los resultados de los análisis de un paciente determinado, emite en forma narrativa un facultativo del laboratorio clínico, con el fin de ayudar a interpretar estos resultados a quienes ha solicitado los análisis. La introducción de comentarios interpretativos proporciona un valor añadido a los resultados e incrementa la relación entre la clínica y el laboratorio clínico.

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Capítulo 18. Interpretación de los resultados. Valor semiológico.

18.1. Valores de referencia 18.2. Variabilidad 18.3. Valor de referencia de un cambio 18.4. Prevalencia e incidencia 18.5. Capacidad discriminante 18.6. Sensibilidad y especificidad diagnóstica 18.7. Valor predictivo positivo y negativo 18.8. Eficiencia diagnóstica 18.9. Análisis de los datos 18.10. Dicotomización. Curvas de rendimiento diagnóstico ROC 18.11. Cociente o razón de verosimilitud 18.12. Magnitud apropiada 18.13. Poder diagnóstico 18.14. El resultado inesperado

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18.1. VALORES DE REFERENCIA________________________________________________________ La teoría de los valores de referencia se fundamenta en tres conceptos básicos: individuo de referencia, valor de referencia, y valor observado en un posible paciente. Estos conceptos y otros derivados de ellos se resumen en la siguiente figura.

Individuo de referencia El concepto fundamental de la teoría de los valores de referencia es el concepto de individuo de referencia. Un individuo de referencia es una persona caracterizada por un estado clínico bien establecido. Por lo general, se pretenden establecer comparaciones con individuos sanos, Sin embargo, el concepto de salud es ambiguo. Si bien la OMS definió la salud de forma precisa, se trata de una definición más próxima a las utopías que a la realidad. Precisamente en un contexto real, el término salud adquiere diversas acepciones. Cuando se defina al individuo de referencia deberá eliminarse toda sombra de ambigüedad en la descripción de las características clínicas que correspondan al estado de salud. Tales características implicarán una serie de factores o circunstancias de inclusión y otras de exclusión que deberán ser mencionadas explícitamente en cualquier descripción de la producción de valores de referencia. Población de referencia La población de referencia es el conjunto de todos los posibles individuos de referencia. En muchos casos, la población de referencia está formada por un número inmenso de individuos, por lo que sería imposible obtener resultados analíticos de todos ellos. Por esta razón, debe precederse a estimarlos a partir de una muestra de esta población. Muestra de referencia La muestra de referencia es un subconjunto de la población de referencia integrado por un número asequible y representativo de individuos de referencia. Los resultados de las investigaciones practicadas en este subconjunto serán extrapolables a la población de donde procede, con mayor o menor seguridad (confianza); por ejemplo, según el número de integrantes de la muestra. Valores de referencia Los resultados analíticos obtenidos en la determinación de las magnitudes bioquímicas correspondientes a especímenes obtenidos en individuos de referencia son los valores de referencia. Distribución de referencia Hasta este punto, la información obtenida en la producción de valores de referencia consiste en una serie de resultados. Esta serie de resultados es de difícil utilización práctica, por lo que debe recurrirse a la

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aplicación de conceptos de estadística matemática que permitan reducir esta información a unas pocas, pero significativas cantidades. Éstas, que constituyen medidas de centralización y medidas de dispersión de la población, se denominan parámetros estadísticos. Las mediciones efectuadas en la muestra, estimaciones (desconocidas, por tanto) de la población, se denominan estadísticos. Cuanto mayor sea el número de elementos que integran la muestra, tanto mayor será la calidad de las estimaciones. En otras palabras, mayor será la confianza que ofrecerán tales estimaciones. Los valores de referencia obtenidos en la muestra de referencia se repiten con mayor asiduidad alrededor de un valor central, la media, que es la estimación de la media de la población. El recuento de resultados idénticos es la frecuencia absoluta, y la proporción de la frecuencia absoluta sobre la totalidad de las observaciones es la frecuencia relativa, cuyo valor estará comprendido entre 0 y 1. Esta frecuencia relativa corresponde a la noción intuitiva de probabilidad en sentido clásico. La representación gráfica de los posibles resultados analíticos frente a la frecuencia relativa (o probabilidad) tiene el aspecto de la figura de abajo y se denomina distribución de frecuencia. Por tratarse de la muestra de referencia, se denomina distribución de referencia.

Distribución de referencia. Alrededor de la media (x), el intervalo comprendido entre el límite inferior (l i ) y el límite superior (ls) es el intervalo de referencia. Puesto que estos límites son estimaciones de los parámetros de la población, pueden definirse sendos intervalos de confianza, que con una determinada probabilidad incluyan el verdadero límite. En ocasiones aparecen resultados extremos que, dada su posición, parecen no pertenecer a la distribución. En caso de demostrarse que se trata de datos espurios, estos resultados se califican de aberrantes, outliers. La definición de dato aberrante es sorprendentemente difícil y ha generado gran cantidad de literatura, así como el desarrollo de numerosos métodos numéricos para detectarlos y para superar las limitaciones que impone su presencia. Prescindiendo de datos que contengan errores groseros evidentes e identificables con facilidad, es posible que en el estudio de la distribución de referencia aparezcan datos alejados notablemente de la distribución y que, aislados de todo contexto, parecen no pertenecer a dicha distribución. La inspección de la representación gráfica de los datos puede provocar la sospecha de que existan datos aberrantes. Ante esa sospecha, lo primero que debe hacerse es confirmar que se trata realmente de tales datos aberrantes, mediante procedimientos estadísticos y la revisión crítica del cumplimiento por parte del individuo de las características de inclusión en la definición de individuo de referencia. Si se comprueba fehacientemente que se trata de un dato aberrante, podrá eliminarse de la distribución. Sin embargo, esta actitud sólo es posible cuando se está completamente seguro de que se trata de un dato aberrante, ya que las pruebas estadísticas no son fiables, y no siempre cabe la verificación clínica en profundidad. En caso de que no exista justificación razonable para la exclusión de estos datos, puede optarse por dos soluciones. La primera de ellas consiste en estimar los parámetros de la

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población mediante pruebas robustas, es decir que, a diferencia de los métodos de cálculo convencionales, soporten la presencia de factores limitantes como es la existencia de datos aberrantes. Uno de estos métodos es el procedimiento de Healy para el cálculo de la media y la varianza en presencia de datos aberrantes. La segunda posibilidad consiste en revisar las expectativas sobre la forma de la distribución y considerar la posibilidad de una transformación que elimine el sesgo introducido por la presencia de los datos presuntamente aberrantes. Intervalo de referencia La comparación de los resultados obtenidos en un presunto paciente se puede hacer confrontándolos con el listado completo de los valores de referencia. Obviamente se trataría de una empresa poco práctica. La forma razonable de utilizar esta información es a través de estimaciones de los denominados parámetros poblacionales. Unos parámetros facilitan información de la situación de la población de referencia: media, mediana y moda. Otros proporcionan información de la dispersión de los resultados: desviación estándar, varianza, intervalo. Este intervalo puede abarcar la totalidad de los valores de referencia obtenidos en la muestra de referencia, y estará limitado por los valores máximo y mínimo. Para eliminar la posibilidad de que se incluyan individuos que no pertenezcan a la población de referencia y que presenten por tanto resultados extremos, se convino en retener una fracción (central) de los valores de referencia, por ejemplo el 0,95. Es tradicional utilizar esta fracción, pero debe tenerse en cuenta que no se trata ni mucho menos de una cantidad rígida. Límites de referencia Los valores de referencia que limitan el intervalo de referencia se denominan límites de referencia. Como se trata de unos estadísticos que estiman los verdaderos pero desconocidos valores de la población, la fiabilidad de la estimación puede establecerse mediante unos límites de confianza de cada límite. Estos intervalos de confianza serán más o menos amplios según sea el número de datos y la variabilidad intrínseca de la medición analítica.

18.2. VARIABILIDAD_________________________________________________________________ Variabilidad biológica o fisiológica: Variación de los valores de las propiedades biológicas, que no son constantes puesto que varían en un mismo individuo (variabilidad biológica intraindividual) y entre los individuos (variabilidad biológica interindividual), causada por las fluctuaciones metabólicas y otros procesos fisiológicos. -

Variabilidad biológica intraindividual (CVi): variación biológica inherente alrededor del punto de equilibrio homeostático; fenómeno por el que los valores de las magnitudes biológicas de un individuo pueden cambiar de un momento a otro.

Variabilidad biológica interindividual (CVg): fenómeno por el que los valores de las magnitudes biológicas de los individuos pueden ser diferentes entre sí. Es absolutamente independiente de la variabilidad debida a los procedimientos de medida (variabilidad metrológica).

Variabilidad iatrogénica: Variación causada principalmente por los tratamientos farmacológicos. Variabilidad metrológica: variación causada por los procedimientos de medida. Variabilidad patológica: Variación causada por las enfermedades.

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Variabilidad biológica o fisiológica Para una correcta evaluación de los resultados es necesario considerar los factores preanalíticos y analíticos mencionados anteriormente y considerar la variabilidad fisiológica o biológica intra e interindividual (fluctuación fisiológica de los constituyentes de los fluidos orgánicos alrededor de su punto homeostático). Estas variaciones se deben sobre todo a: oscilaciones metabólicas aleatorias, ritmos biológicos, ejercicio físico, variaciones alimenticias, emocionales, climáticas y estacionales, así como a crecimiento y envejecimiento. Es decir, estados a actividades de la vida cotidiana, considerados fisiológicos o saludables, que pueden causar alteraciones de los resultados del laboratorio sin que exista ningún proceso patológico.

La variación biológica tiene dos componentes, intra e interindividual. Para la mayoría de las magnitudes, la variación intraindividual es menor que la interindividual, lo que es un reflejo de la fuerte regulación fisiológica en una misma persona, en comparación con la existente entre personas distintas. El laboratorio clínico es un servicio de soporte al diagnóstico clínico, que ofrece datos relativos al paciente procedentes de una muestra biológica obtenida en un momento determinado. Los datos aportados por el laboratorio van a servir para: • discriminar a un individuo de entre un grupo poblacional • diagnosticar a un paciente • hacer el seguimiento del estado de salud del paciente • verificar el efecto de un tratamiento médico, etc. La información obtenida mediante el análisis del laboratorio se facilita al médico clínico en el informe analítico, documento que plasma todo el conocimiento adquirido por el profesional del laboratorio a través de las determinaciones realizadas en muestras del paciente. Esta información procede de la muestra biológica, que no es un elemento fijo e inmutable, sino que procede de un ser vivo y, por tanto, está sometido a ciertas fuentes de variación: • relacionadas con la edad, debidas al crecimiento • con el sexo, por ejemplo los cambios hormonales en las mujeres • con la dieta y el ejercicio físico • variaciones dentro del día y estacionales • como consecuencia de enfermedades y de su tratamiento • variación debida al equilibrio entre el recambio metabólico y la regulación homeostática que, de forma simplificada, se denomina variación biológica (VB). Las cinco primeras causa de variación se minimizan mediante acciones de estandarización, como: • estratificar los resultados analíticos según edad o sexo según la magnitud biológica que se determina y cuyo valor en el paciente se informa • dando instrucciones concretas al paciente sobre qué alimentos debe tomar o no ingerir previamente a la obtención de la muestra, y qué tipo de actividad física debe evitar, en determinados casos • obteniendo las muestras en una franja horaria adecuada, por ejemplo de 8 a 10h de la mañana, alejado de la liberación pulsátil si se determinan ciertas hormonas, añadiendo información sobre el posible efecto de la estación del año sobre el resultado obtenido cuando sea necesario.

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La sexta causa de variación, la biológica, es imposible evitarla y por lo tanto lo únicoo que se puede

hacer es tratar de minimizarla. - Fase preanalítica: Existen diversos aspectos de la fase preanalítica del laboratorio clínico en los que, aplicando los datos derivados de la VB se puede minimizar la posible variabilidad de los resultados. Éstos son: • Tipo de muestra • Intervalo entre muestras • Estabilidad de la muestra

- Fase analítica: Existen tres actividades dentro de la fase analítica donde la aplicación de los datos derivados de la VB resulta fundamental: • Control interno del proceso analítico • Revisión de los resultados y evaluación de la prestación • Garantía externa de la calidad

- Fase postanalítica En la fase postanalítica se puede utilizar la VB en dos ocasiones: • Verificación automática de los resultados • Valor de referencia del cambio Utilización de los datos derivados de la variación biológica Los componentes de la variación biológica intra e interindividual se han utilizado para varios propósitos: — — — — — — — —

Para monitorizar el estado de un paciente la variación analítica se ha de mantener por debajo de la mitad de la variación biológica intraindividual. Esta misma especificación se ha de cumplir para el cribado, diagnóstico e identificación del caso individual cuando se utiliza un valor discriminante para definir una condición patológica o de salud. Para determinar el estado del paciente en esos tres supuestos cuando se utilizan intervalos de referencia poblacionales, se ha de mantener el error sistemático por debajo de la cuarta parte de variación biológica intraindividual más la interindividual. La variación biológica es una buena base para obtener las especificaciones de la calidad analítica que satisfagan las necesidades médicas generales. Aplicaciones de las especificaciones de la calidad analítica en la rutina diaria Las especificaciones de la calidad para imprecisión, error sistemático y error total se pueden utilizar en el trabajo diario para: 1. Diseñar el protocolo de control de calidad interno (obtención de reglas control) 2. Evaluar la prestación analítica del laboratorio (aseguramiento de la calidad de los resultados)

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Coeficientes de variación biológica de algunas magnitudes publicadas en la literatura científica. Magnitud biológica Srm-Glucosa Srm-Colesterol Srm-Urato Srm-Alanina aminotransferasa Srm-Calcio Srm-Proteína Srm-Creatinina Srm-Hierro

Variab. biológica intraindividual (CVi) % 6,1 5,4 9,0 18,0 1,9 2,7 6,0 26,5

Variab. biológica interindividual (CVg) % 6,1 15,2 17,6 42,0 2,8 4,0 14,7 23,2

Variabilidad iatrogénica Las variaciones iatrogénicas las provocan medicamentos, actos terapéuticos o diagnósticos y también otros xenobióticos de uso generalizado en nuestra sociedad — cafeína, nicotina y etanol — así como las drogas de abuso. Como consecuencia pueden producir un efecto de incremento o disminución de la concentración de algunas magnitudes. Los xenobióticos* pueden producir variaciones de las propiedades biológicas in vitro, debidas a su interferencia química, física o inmunológica en el proceso de medida. Pero los xenobióticos también pueden producir variaciones in vivo, es decir, alteraciones reales de las propiedades biológicas en el propio organismo. Estas variaciones se producen por mecanismos diversos: inducción enzimática, inhibición metabólica, competencia por la unión a las proteínas transportadoras, etc., y no afectan de forma regular a todos los individuos, puesto que dependen de la cantidad de xenobiótico ingerido, del tiempo que hace que se toma el xenobiótico y de la idiosincrasia del paciente. En cualquier caso los xenobióticos pueden dar lugar a decisiones médicas incorrectas y parece claro que para interpretar correctamente el valor de una propiedad se debería conocer cuales son los medicamentos que está tomando el paciente. Esto es especialmente importante en aquellos casos en que aparece un valor inesperadamente “patológico”, puesto que la explicación de la anomalía podría ser debida a algún xenobiótico; aunque también puede suceder el contrario, es decir, un resultado inesperadamente “normal” también puede ser debido a la variación provocada por un medicamento u otro xenobiótico. El laboratorio clínico en la mayoría de ocasiones no conoce la medicación del paciente y no puede alertar al médico solicitante sobre la posible alteración del valor de la propiedad medida. *Un xenobiótico es un compuesto químico captado por el organismo, que no se incorpora a las vías metabólicas energéticas ni actúa como precursor de los compuestos naturales del organismo. Variabilidad metrológica El conocimiento de estos datos de variabilidad biológica junto con los de variabilidad de los procedimientos de medida, inexactitud, imprecisión y error total (variabilidad metrológica) intraserial e interserial, obtenidos por el propio laboratorio, son necesarios para el establecimiento de las especificaciones de calidad analítica del laboratorio.

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Variabilidad patológica Por último hay una variabilidad patológica debida a las entidades nosológicas (enfermedades) que pueden causar alteraciones de los resultados del laboratorio, lo cual no conlleva necesariamente que tengan utilidad clínica para el estudio de esas entidades. Es mayor que la intraindividual. Variación en una magnitud por alteración de: - SÍNTESIS (factores de la coagulación hormonas) - PERMEABILIDAD MEMBR (enzimas) - ÓRGANO O SISTEMA (creatinina, O2, CO2) - PROCESO METABÓLICO (glucosa, HCO3) - DESREPRESIÓN GENÉTICA (marcadores tumorales)

18.3. VALOR DE REFERENCIA DE UN CAMBIO______________________________________________ Valor de referencia de un cambio (VRC): Diferencia significativa entre dos resultados consecutivos, que puede ser biológicamente relevante. La diferencia puede indicar un cambio en el estado de salud del paciente. Cambio significativo. Variabilidad total = variabilidad analítica + variabilidad biológica El problema con el que se enfrenta el médico en la práctica diaria es decidir si un cambio en la determinación sucesiva de una magnitud bioquímica es significativo o irrelevante, y por tanto debe actuar o no en consecuencia. Esta actuación se refiere a revisar un diagnóstico, iniciar o modificar un tratamiento o efectuar un pronóstico clínico. Esta cuestión es importante en otro aspecto del laboratorio clínico: la gestión de la calidad. Obviamente la variabilidad analítica no debe enmascarar la variabilidad biológica reflejada como cambio en mediciones sucesivas cuando no hay cambios clínicos; por ello debe tenderse a alcanzar una variabilidad analítica por debajo de la biológica, concretamente del componente intraindividual. Una aproximación a esta idea fue la introducción de los denominados delta checks (∆ Check) , valores límite basados en la existencia de datos anteriores de un mismo paciente y en la variación habitual en la determinación seriada de un constituyente bioquímico. Otra aproximación procede de contextos clínicos, en estudios retrospectivos basados en encuestas realizadas a clínicos experimentados. En estas encuestas se proponían diferentes límites y se solicitaba que se indicara cuál de ellos era clínicamente relevante en la decisión médica. Esta aproximación adolece de subjetividad y de prescindir en muchos casos de la noción de variabilidad biológica. Por último, en los estudios acerca de la variación biológica intraindividual, aparece una dificultad inherente a los estudios clínicos, la dificultad de encontrar series lo suficientemente largas como para aplicar los métodos estadísticos más corrientes. El caso extremo es la serie que tan sólo consta de dos observaciones, es decir, el cambio entre dos mediciones sucesivas. A lo largo de estos estudios se observó cierta constancia en la variabilidad intraindividual y se estudió la distribución de las variancias observadas en grupos de individuos clínicamente sanos, así como en algunas enfermedades crónicas. Basándose en un número limitado de individuos se puede obtener una estimación de la variancia intraindividual real de un sujeto, para un período de tiempo determinado entre determinaciones. A partir de la distribución de las varianzas se selecciona una estimación que se utilizará para calcular un límite de referencia de cambio válido para la población. Si se selecciona, por ejemplo, la mediana de esta distribución (la variación observada en la mitad de individuos) el límite de referencia resultante será demasiado propenso a dar falsos positivos, por lo que se recomienda seleccionar un fractil superior, por ejemplo el fractil 0,90.

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Complejo Asistencial de Soria. Laboratorio de Bioquímica Clínica Su fórmula de cálculo es: VRC = 2,77 *(CVa2+ CVi2)1/2 CVa: es el coeficiente de variación analítico de la magnitud CVi: es el coeficiente de variación biológica intraindividual de la magnitud Utilidad del VRC - Interpretar resultados en magnitudes con fuerte individualidad. - Índice de Individualidad (I.I.) = CVI / CVG - Si I.I. < 0.6 es mejor utilizar VRC que valor de referencia poblacional Dentro del laboratorio: - Δ Check ≤ 21/2 * Z (CVA2 + CVI2)1/2 - Z = 1.96 significativo: autovalidación - Z = 2.58 muy significativo: verificación manual Fuera del laboratorio: - Aviso en el Informe analítico - Z = 1.96 significativo - Z = 2.58 muy significativo El VRC es un criterio objetivo, basado en la biología y fácil de calcular. Es una herramienta muy útil para ayudar a los clínicos y al laboratorio en el seguimiento de un paciente

18.4. PREVALENCIA E INCIDENCIA_______________________________________________________ Para comprender y usar el modelo del valor predictivo, es necesario comprender los términos de prevalencia e incidencia. Prevalencia: es la fracción de personas que padecen una enfermedad determinada en una población determinada. (Probabilidad previa o pretest). Incidencia: es la fracción de personas que desarrollan una enfermedad determinada en un periodo de tiempo determinado.

18.5. CAPACIDAD DISCRIMINANTE______________________________________________________ La teoría de los valores de referencia permite la comparación con una población de individuos para decidir si un individuo es normal o patológico. Cuando se determina una magnitud bioquímica en una población de pacientes con una enfermedad bien caracterizada, que se denominará E, se pretende que esta información permita diferenciarla de la población de referencia que constituye el estado alternativo, denominado Ē. Este estado de ausencia de enfermedad puede ser una situación de salud como generalmente se identifica a la población de referencia, pero puede ser cualquier otra situación clínica con la que interese hacer el diagnóstico diferencial de la enfermedad E. Se entiende por capacidad discriminante de una magnitud bioquímica la propiedad de producir resultados distintos en los individuos de la población Ē y de la población E. Esta propiedad depende exclusivamente de la determinación bioquímica y de las poblaciones Ē. y E. La capacidad discriminante es inversamente proporcional al área de solapamiento entre las dos funciones densidad de probabilidad.

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En la figura inferior se representa la distribución de probabilidad que se puede observar al medir la magnitud bioquímica X en las poblaciones Ē y E. Si esta magnitud bioquímica es un constituyente bioquímico que permite una separación o discriminación perfecta entre ambas poblaciones, no se observará ningún solapamiento relevante (a). En este caso, la magnitud bioquímica posee una capacidad de discriminación máxima y constituye una prueba de laboratorio ideal para efectuar el diagnóstico diferencial entre Ē y E. Si no se observa separación entre las distribuciones de X en ambas poblaciones, apareciendo totalmente solapadas (c), X posee una pobre capacidad discriminante entre Ē y E, y será de nula utilidad en el diagnóstico diferencial. No obstante; en muchos casos se observa una situación intermedia (b), donde existe un recubrimiento parcial de ambas curvas.

18.6. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DIAGNÓSTICA_________________________________________ La capacidad discriminante no es fácil de medir directamente ya que en la práctica no suele disponerse de poblaciones tan numerosas que permitan obtener curvas tan regulares como las de la figura anterior, por lo que debe recurrirse a algunos parámetros numéricos que faciliten la evaluación simple de la capacidad discriminante, como la sensibilidad y la especificidad diagnóstica. Considérese una prueba de laboratorio que ofrezca como conclusión que el individuo pertenece a la población Ē cuando el resultado es negativo, o que pertenece a la población E cuando el resultado es positivo. Es de esperar que si se realiza la determinación de esta magnitud bioquímica a una muestra de la población no enferma, un considerable número de individuos presente un resultado negativo y cuyo número calificaremos de negativos ciertos (NC). Asimismo se observará cierta cantidad de resultados positivos falsos (PF). De igual modo, si se realiza la misma determinación bioquímica a una muestra de pacientes de la enfermedad E, aparecerá una cantidad de resultados positivos ciertos (PC) y una cantidad de resultados negativos falsos (NF). Los positivos falsos, son los positivos sanos. Los negativos falsos, son los negativos enfermos. « La sensibilidad y la especificidad están inversamente relacionadas. Dependen del valor discriminante » - SENSIBILIDAD: es la fracción de resultados que son POSITIVOS CIERTOS (resultados + en personas enfermas) PC / PC + NF - ESPECIFICIDAD: es la fracción de resultados que son NEGATIVOS CIERTOS (resultados - en personas sin la enfermedad) NC / PF + NC

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18.7. VALOR PREDICTIVO POSITIVO Y NEGATIVO____________________________________________ Está directamente relacionado con la prevalencia (probabilidad postest) Los valores predictivos positivo y negativo son índices que dependen de la prevalencia de la enfermedad en la población de procedencia de los sujetos a los que se aplica la prueba. Es decir, evalúan el comportamiento de la prueba diagnóstica en una población con una determinada proporción de enfermos. Valor predictivo de un resultado positivo: es la fracción de resultados positivos que son positivos ciertos. PC / PC + PF Valor predictivo de un resultado negativo: es la fracción de resultados negativos que son negativos ciertos. NC / NC + NF En general, el valor predictivo positivo disminuye a medida que la prueba diagnóstica se aplica a poblaciones con prevalencia de enfermedad más baja.

18.8. EFICIENCIA DIAGNÓSTICA_________________________________________________________ Es la fracción de los resultados que son ciertos, ya sean positivos ciertos (PC) o negativos ciertos (NC).

18.9. ANÁLISIS DE LOS DATOS___________________________________________________________ El uso del modelo del valor predictivo es sencillo cuando se dispone de datos sobre personas con y sin la enfermedad en estudio. En primer lugar, la población se divide en cuatro grupos: I. Personas con la enfermedad y resultado positivo (positivo cierto P) II. Personas con la enfermedad pero con resultados negativos (negativos falsos FN) III. Personas sin la enfermedad pero con resultados positivos (positivos falsos FP) IV. Personas sin la enfermedad y con resultados negativos (negativos ciertos N) Los cuatro grupos se presentan en una tabla y se totalizan las columnas y las filas. RESULTADO DE LA PRUEBA ENFERMEDAD

TOTAL POSITIVO

NEGATIVO

PRESENTE

P + FN

SENSIBILIDAD = P / ( P + FN )

AUSENTE

N + FP

ESPECIFICIDAD = N / ( N + FP )

P + FP

N + FN

VPP = P/ (P+FP)

VPN = N / (N+FN)

TOTAL

EFICIENCIA = P + N / ( P + N + FP + FN )

SENSIBILIDAD: Fracción de positivo ciertos de entre los enfermos ESPECIFICIDAD: Fracción de negativos ciertos de entre los sanos. VALOR PREDICTIVO POSITIVO (VPP): Fracción de positivos que son positivos ciertos. VALOR PREDICTIVO NEGATIVO (VPN): Fracción de negativos que son negativos ciertos. EFICIENCIA: Fracción de positivos y negativos ciertos.

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18.10. DICOTOMIZACIÓN. CURVAS DE RENDIMIENTO DIAGNÓSTICO____________________________ Todo lo dicho hasta ahora es válido para determinaciones bioquímicas cuyo resultado sea dicotómico, es decir aquellas en las que sólo existen dos posibles resultados: positivo o negativo. Sin embargo, la inmensa mayoría de las determinaciones bioquímicas produce resultados cuantitativos, números reales. Por tanto, la capacidad discriminante de una magnitud bioquímica podrá expresarse de la forma descrita anteriormente si se transforma en una variable dicotómica. Esta transformación consiste en seleccionar un valor (que se denominará valor discriminante, punto de corte, valor referente o cut-off poinf) que efectúe una partición en el conjunto de todos los resultados posibles. De un lado se identificarán todos ellos como resultado positivo y del otro como resultado negativo. En muchas determinaciones bioquímicas, el incremento de la concentración del constituyente es indicativo de enfermedad, por lo que a partir de ahora, para simplificar la exposición, se considerará solamente esta posibilidad. Considérense dos poblaciones, Ē y E, cuyas funciones densidad de probabilidad se representan en la figura de abajo. Si A es el valor discriminante, todos los individuos pertenecientes a E serán correctamente clasificados como enfermos. Es decir, la sensibilidad diagnóstica será muy alta. Sin embargo, gran cantidad de individuos de Ē también serán incorrectamente clasificados como enfermos, por lo que la especificidad diagnóstica será baja. Si este valor discriminante se va desplazando hacia la derecha (valores B, C, D), se observa cómo la sensibilidad diagnóstica va disminuyendo y la especificidad va aumentando hasta que ésta es máxima (valor E). Por tanto, existe una relación inversa entre la sensibilidad y la especificidad diagnósticas. La capacidad discriminante de la magnitud bioquímica depende por lo tanto de esta selección.

Relación entre sensibilidad y especificidad diagnóstica. Si se considera el resultado A como valor discriminante, la sensibilidad diagnóstica será máxima ya que todos los elementos de E son considerados correctamente como enfermos. Por el contrario, muchos de los elementos del conjunto complementario, Ē, serán incluidos asimismo come enfermos, por lo que la especificidad será baja. Si se va desplazando el valor de corte hacia concentraciones más altas (B, C, D), la especificidad irá aumentando, a la vez que va disminuyendo la sensibilidad, hasta que en (E), la especificidad es máxima, pero a costa de una sensibilidad mínima. Efecto del punto de corte sobre la sensibilidad y la especificidad de la prueba. Para puntos de corte bajos la prueba es muy sensible: la mayoría de los sujetos enfermos son correctamente clasificados por la prueba, pero a costa de uin incremento de sujetos sanos que son diagnosticados como enfermos. Para puntos de corte altos la prueba es muy específica: la mayoría de sujetos sanos son correctamente clasificados por la prueba, pero a costa de un incremento de sujetos enfermos no identificados como tales.

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Valores discriminantes óptimos. Curvas ROC. El resultado de la determinación de una magnitud bioquímica puede considerarse como una forma de obtención de información o de una señal, que debido a la imperfección del sistema, está contaminada con ruido que perturba la interpretación. Basándose en esta aproximación se aplicaron a la bioquímica clínica las ideas de la teoría de reconocimiento de señales desarrollada hace décadas en la discriminación de señal/ruido en pantallas de radar. Esta aproximación utiliza la representación en un sistema cartesiano de los pares (sensibilidad diagnóstica, 1 - especificidad diagnóstica) correspondientes a una serie de posibles límites discriminantes (ver figura). Esta curva parabólica se denomina ROC, acrónimo correspondiente a receiver operating characterístics, y expresa el rendimiento diagnóstico de una magnitud bioquímica en sus posibles dicotomizaciones. Si la magnitud bioquímica no tiene capacidad discriminante, cuando se solapan las funciones densidad de probabilidad de Ē y E, la proporción de positivos ciertos (su sensibilidad diagnóstica) será igual a la proporción de negativos falsos (el complementario de la especificidad diagnóstica). Es decir, la curva ROC adquiere el aspecto de la diagonal principal, y = x (fig. a). En el caso de la discriminación ideal, sin solapamiento, la curva ROC se superpone a los ejes y = 0, x = 1 (fig. c). En los casos más habituales tiene el aspecto intermedio (fig. b). El valor discriminante más próximo al punto (0,1) es el que ofrece mayor sensibilidad diagnóstica con mayor especificidad diagnóstica.

Curva ROC. (c) La curva correspondiente a la discriminación ideal se aproxima al punto (1,0), mientras que la curva correspondiente a la discriminación nula (a) es la diagonal (correspondiente a los valores sensibilidad = 1 - especificidad). La curva (b) corresponde a una situación intermedia. La ventaja del análisis ROC sobre las otras aproximaciones es que no únicamente permite el cálculo del mejor punto de corte, sino que permite seleccionarlo en función de las necesidades concretas de cada problema clínico. En ocasiones puede ser más interesante optimizar la sensibilidad (por ejemplo en pruebas de cribaje) y otras ser más selectivo, optimizando la especificidad (en pruebas que implican riesgos o costes importantes). Para construir una curva ROC o curva de rendimiento diagnóstico, es necesario calcular la sensibilidad y la especificidad de la prueba para todos los posibles puntos de corte. La sensibilidad (Se), que es el porcentaje de verdaderos positivos se sitúa en el eje de ordenadas y en el eje de abscisas se sitúa el complementario de la especificidad (1- Sp) que es el porcentaje de falsos positivos. La curva se dibuja uniendo los pares de valores (1-Sp; Se), que corresponden a cada punto de corte con una función escalonada. Si el punto corresponde a un empate (un sano y un enfermo con igual puntuación en la prueba) se une con un segmento diagonal.

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En esta curva podemos tener dos situaciones extremas: - Una prueba con una discriminación diagnóstica perfecta (Se=1; Sp=1) que tiene probabilidad de 1 de diagnosticar tanto a un sujeto enfermo como a uno no enfermo da una curva ROC representada por los lados izquierdo y superior del gráfico. - Una prueba sin discriminación diagnóstica, es decir que tiene probabilidad de 0,5 de diagnosticar correctamente tanto a un enfermo como a un no enfermo (Se=0,5; Sp=0,5) da una curva ROC representada por una diagonal en el gráfico. De estas dos situaciones extremas se deduce que el área bajo la curva ROC denominada AUC (“area under curve”) es un valor comprendido entre 0,5 y 1 que puede ser utilizado como medida de exactitud global: Area = 1 (PRUEBA DIAGNÓSTICA PERFECTA) Area = 0,5 (PRUEBA SIN PODER DIAGNÓSTICO) Se pueden comparar dos pruebas diagnósticas dibujando sobre el mismo gráfico sus curvas ROC y observando el AUC que deja cada una de ellas. La mejor prueba será aquella que deje por debajo un área mayor, es decir, cuya curva ROC se acerque más a los lados izquierdo y superior del gráfico. La peor corresponderá a aquella que deje por debajo un área menor, es decir, cuya curva ROC esté más cerca de la diagonal del cuadro.

18.11. COCIENTE O RAZÓN DE VEROSIMILITUD_________________________________________ Razón de verosimilitud: para detectar o excluir enfermedad. R.V. Detección: PC / PF (SENSIB / 1- ESPECIFICIDAD) R.V. Exclusión: NF / NC (1-SENSIB / ESPECIFICIDAD) Cuando la magnitud medida es binaria o se ha utilizado un valor discriminante para obtenerla, el cociente de verosimilitud se define como la razón entre la probabilidad de obtener positivos ciertos (sensibilidad diagnóstica) y la probabilidad de obtener negativos falsos (1 - especificidad). Cuando la magnitud analizada es de tipo continuo, la razón de verosimilitud se define como el cociente de dos funciones densidad de probabilidad, correspondientes a E y Ē.

Representación gráfica del cociente de verosimilitud. Para el resultado x = A, la probabilidad de observar A en los enfermos E es b, y en los no enfermos E, es a. Por tanto, la razón de verosimilitud, el cociente entre ambas probabilidades es L(A) = b/a. En el caso de que x = B, a=b y por tanto L(B) = 1

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18.12. MAGNITUD APROPIADA______________________________________________________ Nos interesará tener una prueba MUY SENSIBLE (pocos falsos negativos) cuando: - La enfermedad sea grave pero curable. - La enfermedad tiene tratamiento. - Un resultado FP no supone para el sujeto ningún traumatismo psicológico ni económico. Nos interesará una prueba MUY ESPECÍFICA (pocos falsos positivos) cuando: - La enfermedad es grave y prácticamente incurable. - Es importante, desde el punto de vista sanitario y psicológico, saber que no se padece la enfermedad. - Un resultado FP supone un trauma económico y psicológico para el sujeto. GRAN SENSIBILIDAD: ausencia de negativos falsos - ayuda a excluir un proceso; improbable si la prueba es negativa. GRAN ESPECIFICIDAD: ausencia de positivos falsos - ayuda a confirmar una enfermedad; muy probable si el test es positivo. GRAN EFICIENCIA: - EVITAR FALSOS POSITIVOS Y NEGATIVOS

18.13. PODER DIAGNÓSTICO________________________________________________________ Si son independientes, el poder es mayor. Poder diagnóstico de un test: Dos posibilidades: - Objetivo logrado - Objetivo no logrado Repetir Asociar a otros Poder diagnóstico de dos tests diferentes: Si son independientes el poder es mayor • Regla más estricta (creer el negativo): – exigimos que los dos sean + para considerar + el resultado – se prima la Especificidad por encima de la Sensibilidad – mejora el VPP • Regla menos estricta (creer el positivo): – nos vale con un resultado + – se prima la Sensibilidad a expensas de la Especificidad – mejora el VPN Simultáneo (en paralelo) Secuencialmente (en serie) – Algoritmos diagnósticos: ahorro de pruebas –aplicar el 2º sólo a los + con el 1º. POS si (+/+) –aplicar el 2º sólo a los - con el 1º. NEG si (-/-)

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18.14. EL RESULTADO INESPERADO___________________________________________________ Situaciones a considerar ante la aparición de un resultado inesperado.

Evaluación de un resultado inesperado Preanálisis

Toma del espécimen

Factores de laboratorio

Valores de referencia Variación biológica Valor predictivo

Ingestión de alimentos y bebidas. No ayuno Ingestión de alcohol Postura Tensión emocional Embarazo Ejercicio físico Hospitalización Terapia medicamentosa Atención médica y/o quirúrgica previa Efectos de otros constituyentes Identificación del paciente Lugar de la extracción sanguínea Identificación del espécimen Contaminación del espécimen Anticoagulación apropiada Aplicación del torniquete Hemólisis Correcta recogida de la orina Transporte y manipulación adecuado Almacenamiento adecuado Separación de plasma y suero Espécimen equivocado Error analítico Error de cálculo Transcripción del resultado Intervalo apropiado Dependencia de la edad, sexo, masa corporal, etc. Toma del espécimen a la hora adecuada Existencia de ritmos circadianos, mensuales o estacionarios Idoneidad de la magnitud seleccionada Resultados en la enfermedad (sensibilidad) Resultados en la salud (especificidad) Significado de un resultado positivo Estrategia para posteriores exploraciones

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Capítulo 19. Errores e incidencias en el laboratorio

Introducción 19.1. Definición de error en el laboratorio 19.2. Términos y definiciones 19.3. Clasificación de los errores 19.4. Errores en la fase preanalítica 19.5. Errores en la fase analítica 19.6. Errores en la fase postanalítica 19.7. Conclusiones y recomendaciones 19.8. Incidencias. Definición y registro 19.9. Incidencias relacionadas con la petición analítica 19.10. Incidencias relacionadas con la preparación del paciente 19.11. Incidencias relacionadas con la toma de la muestra 19.12. Incidencias relacionadas con el transporte de la muestra 19.13. Incidencias relacionadas con la calidad de la muestra y los contenedores 19.14. Incidencias relacionadas con la fase analítica 19.15 . Incidencias relacionadas con la validación de resultados 19.16. Incidencias relacionadas con la comunicación urgente de resultados críticos 19.17. Incidencias relacionadas con el informe de resultados

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INTRODUCCIÓN____________________________________________________________________

El médico clínico, en el curso de sus investigaciones diagnósticas, solicita la medida de magnitudes y la realización de pruebas, muchas de ellas a los laboratorios clínicos. La finalidad de estas pruebas puede ser diversa: confirmar o excluir un diagnóstico, detectar la presencia de enfermedad, controlar el efecto de un tratamiento, establecer un pronóstico, investigar diferentes procesos fisiopatológicos, etc. En definitiva, el informe analítico proporciona siempre una información importante del paciente que permite tomar las decisiones médicas apropiadas. Aunque se admite que "equivocarse es humano", la presencia de cualquier tipo de error en el proceso global del laboratorio clínico puede conducir a equivocaciones que afectan negativamente al proceso diagnóstico, con el consiguiente riesgo potencial para los pacientes. Los errores producidos en los laboratorios clínicos y el alcance de los mismos han sido poco valorados. El interés y la importancia de la seguridad del paciente en el laboratorio ha llevado a algunos profesionales a la creación de revistas especializadas, que intentan crear una cultura de conocimiento de los errores y proponer estrategias para su control y disminución. La implantación de sistemas de gestión de la calidad en los laboratorios clínicos implica la gestión del proceso total, incluyendo las fases preanalítica y postanalítica. La mejora continua se fundamenta en la utilización de las acciones correctivas y preventivas y en el control de los indicadores de los procesos, con objeto de gestionar y disminuir de manera objetiva todos los errores generados en la realización de la actividad de los laboratorios clínicos.

19.1. DEFINICIÓN DE ERROR EN EL LABORARORIO___________________________________________ El error en el laboratorio puede definirse como cualquier fallo o defecto producido en el proceso total, desde que se realiza la petición de las magnitudes hasta el momento en que se reciben sus resultados. Cuando los resultados enviados se encuentran dentro del intervalo de referencia o son absurdos, la repercusión del error es mínima en la adopción de una decisión médica, pero existe un 12,5% de resultados erróneos que pueden tener una trascendencia importante, como consecuencia de las decisiones que se toman al considerar dichos resultados como correctos. El objeto de este capítulo es poner de manifiesto y destacar que la probabilidad de error en el laboratorio puede ser significativa; describir los diferentes tipos de error y también recomendar la utilización de prácticas adecuadas en el laboratorio para conseguir un mejor conocimiento, detección, prevención y solución de los posibles errores que pueden afectar a los informes de los resultados analíticos.

19.2. TÉRMINOS Y DEFINICIONES_______________________________________________________ . Efecto gancho (hook): Producción de resultados inferiores a los reales en la medición del constituyente en muestras con una elevada concentración del mismo. . Efecto matriz: 1) Influencia de una propiedad de la muestra, distinta de la magnitud, en la medición y por lo tanto en el valor del mesurando; 2) efectos fisicoquímicos (por ejemplo la interferencia) de la matriz en la capacidad del método analítico para medir un constituyente con exactitud.

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. Error (de medida): Resultado de una medición menos el valor verdadero del mesurando. (Nota: Puesto que generalmente el valor verdadero no se puede determinar, en la práctica se utiliza un valor convencionalmente verdadero). . Error aleatorio: Resultado de una medición menos la media que se obtendría de un número de mediciones del mismo mesurando, realizadas en las condiciones de repetición. (Nota: Puesto que no es posible realizar un número infinito de mediciones sólo se puede obtener una estimación del error aleatorio). . Error cognitivo: Error producido por decisiones incorrectas debidas a insuficiente conocimiento, incorrecta interpretación de la información disponible o aplicación de una regla cognitiva errónea (Nota: También llamado error de atención). . Error de laboratorio: Fallo al completar una acción planificada como se deseaba o utilización de un plan incorrecto para alcanzar un objetivo; un defecto producido en cualquier parte del ciclo del laboratorio, desde que se solicitan las magnitudes hasta que se informan los resultados, se interpretan y se produce una reacción a los mismos. . Error latente: Error debido a factores estructurales subyacentes que no pueden ser controlados por el operador. . Error no cognitivo: Error debido a fallos inadvertidos o inconscientes en una conducta prevista automática (Nota: También llamado error esquemático). . Error sistemático: Media de los resultados que se obtendrían con un número infinito de mediciones del mismo mesurando, realizadas en las condiciones de repetición, menos el valor verdadero del mesurando. (Notas: 1. Puesto que no es posible realizar un número infinito de mediciones, sólo se puede obtener una estimación del error sistemático. 2. El error sistemático puede variar según el valor del mesurando. 3. Este concepto casi coincide con el concepto de "inexactitud" utilizado en química analítica y en bioquímica clínica). . Interferencia: Desviación clínicamente significativa en la medida de la concentración de un constituyente, debida al efecto de otro componente o propiedad de la muestra. (Nota: El efecto puede ser debido a la inespecificidad del sistema de medida, a la supresión de la reacción del indicador, a la inhibición del constituyente si se trata de una enzima o a cualquier causa de desviación dependiente de la muestra). . Razón de posibilidades (Odds Ratio): Cociente entre la probabilidad de que el episodio de interés ocurra y la probabilidad de que no ocurra. Se estima por el cociente entre el número de veces que ha ocurrido el acontecimiento y el número de veces que no ha ocurrido. . Variabilidad biológica intraindividual: Variación biológica inherente alrededor del punto de equilibrio homeostático.

19.3. CLASIFICACIÓN DE LOS ERRORES____________________________________________________ a. Considerando la fase en la que se producen: . Errores preanalíticos. . Errores analíticos. . Errores postanalíticos.

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b. Según el lugar físico donde se detectan: . Laboratorio. . Externo al laboratorio. . En ambos lugares. c. Responsabilidad del error: . Error latente. . Error cognitivo o no cognitivo. . Interno, externo, no identificable. d. Posibilidad de evitarlo: . No se puede prevenir. . Posibilidad elevada de prevenirlo. e. Impacto en el cuidado del paciente: . Ninguno o mínimo. . Retraso en el diagnóstico o tratamiento. . Incorrecto diagnóstico o tratamiento.

19.4. ERRORES EN LA FASE PREANALÍTICA________________________________________________ Se incluyen en esta fase todos los pasos desde que se genera la petición hasta que se realiza la medida de la magnitud biológica. El error preanalítico es el más frecuente. En distintos estudios se estima su frecuencia en un 17%, 31%, 75% e incluso hay autores que llegan a encontrar un 84%. Ya que en la fase preanalítica inciden aspectos muy diversos, estas diferencias pueden explicarse por los distintos criterios de evaluación o por un aumento de las variables en el estudio. No obstante, los errores descritos en la literatura con mayor frecuencia son los que se refieren a la calidad de la muestra recibida en el laboratorio: muestra hemolizada, lipémica, insuficiente, incorrecta o coagulada. En un estudio realizado por el College of American Pathologists en 660 laboratorios observaron que 5.514 peticiones de un total de 114.934 (4,8%) tenian un error de programación de la petición. La mayoria de los laboratorios participantes comunicaron uno o más errores de petición en el 6% de las solicitudes y el 10% de los laboratorios tenían como minimo errores en el 18% de las solicitudes. Destacaban los errores por prescripciones verbales, programación errónea de las peticiones e incorrecta política de revisión de las mismas. En otros estudios se considera también que la incidencia de error en la transcripción de los datos varia entre un 3 y un 39%, con valores medios de 13% para algunos laboratorios. Los errores pueden ser diversos, ya sea por falta de información correcta o diagnóstica, que impide la valoración adecuada de la magnitud en estudio, como por ejemplo en el caso de la realización del estudio de cribaje prenatal en las embarazadas en el que se valora la edad gestacional, el peso, la edad de la madre, los hábitos etc., o bien por estar el paciente tomando algún medicamento que puede interferir en la medida de la magnitud que se solicita o inducir variaciones biológicas. En la fase preanalítica pueden diferenciarse dos etapas; una primera extralaboratorio y la segunda en el laboratorio o intralaboratorio. Los errores que pueden generarse son de significación distinta y su medida es difícil ya que algunos de ellos se ponen de manifiesto en la fase analítica y otros no se evidenciarán.

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Errores en la fase preanalítica extra-laboratorio: . Solicitud de análisis por parte del médico clínico: elección de la magnitud, peticionario, información precisa. . Características y condiciones previas del paciente: edad, sexo, biorritmo, estado físico, ayuno, reposo, hábitos alimentarios y tóxicos, medicación. . Registro administrativo: entrada de datos del paciente y peticiones (petición remota). . Obtención del espécimen: tubos y contenedores apropiados, orden correcto de llenado de los tubos, evitar la contaminación de las infusiones intravenosas y la identificación del espécimen y del paciente. . Transporte al laboratorio.

Errores en la fase preanalítica intra-Iaboratorio: . Registro administrativo: entrada de datos del paciente y peticiones. . Almacenamiento: tiempo de espera de las muestras hasta su manipulación. . Centrifugación. . Distribución y alicuotado. . Preparación de especímenes. . Elección del espécimen correcto. Demostrar la causa que puede generar una interferencia y conocer el número de errores de laboratorio procedentes de la fase preanalítica que la provocan es una tarea difícil, pero si se analiza paso a paso todo el proceso, se comprueba que muchas de ellas tienen su origen en esta fase. Entre las posibles causas de error se pueden citar: . La medicación administrada al paciente y una mala preparación del mismo para la magnitud a medir. . La extracción incorrecta de la muestra: éstasis venosa, toma de una vía, higiene defectuosa. . La recogida en recipiente inadecuado, conservante incorrecto, contaminación por arrastre en el llenado de los tubos. . El transporte y almacenamiento sin las condiciones adecuadas o de duración prolongada, que puede alterar las condiciones físicoquímicas de las muestras o deteriorarlas. . La centrifugación insuficiente o excesiva. . La demora en la medida de la magnitud o la mala preparación del espécimen. En los estudios de interferencias se valoran los efectos que el interferente tiene sobre el resultado obtenido para la magnitud en estudio, pero pocas veces se analiza el origen del mismo. Por ejemplo la hemólisis ha sido muy estudiada en distintos trabajos para averiguar su efecto sobre distintas magnitudes bioquímicas, y es la causa de un número considerable de errores, pero no se considera si es endógena o si es provocada por una extracción defectuosa, o por un problema de transporte o una mala conservación o centrifugación. Plebani y Carraro consideran la obtención de la muestra de una vía, el extravío de la petición médica y la incorrecta indicación del destino de los resultados como responsables de la mitad de los errores producidos en la fase preanalítica. Bonini et al. atribuyen a la calidad de la muestra (incorrecta, hemolizada, insuficiente y coagulada) la mayor contribución al error en esta tase. La Comisión de Calidad Preanalítica de la SEQC ha publicado los resultados del Programa de Evaluación Externa de la Calidad en la fase preanalítica, observando que el 88,8% de las causas de rechazo de los especímenes se corresponden con muestras no recibidas, hemolizadas, coaguladas o insuficientes, datos que son coincidentes con los publicados por Bonini.

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Se deben diferenciar con claridad los efectos preanalíticos de las interferencias. Los efectos preanalíticos pueden producir problemas en la interpretación clínica de las magnitudes, pero en realidad no se pueden considerar interferencias. Ejemplos de dichos efectos son: . Efectos biológicos de los medicamentos. . Alteraciones químicas del constituyente: hidrólisis, oxidación, etcétera. . Alteración física del constituyente: desnaturalización de las enzimas. . Evaporación o dilución de la muestra. . Contaminación de la muestra con constituyente adicional: infusiones intravenosas, disminución de la glucosa por contacto prolongado con el coágulo o la incorporación del contenido de los hematíes por la hemólisis.

19.5. ERRORES EN LA FASE ANALÍTICA____________________________________________________ En la fase analítica, la incidencia de errores se estima en un 13% del total de los errores que se producen, aunque hay fuentes que consideran esta incidencia de 4,35% o de 7%, siendo la causa más importante la debida a la interferencia con diversos métodos analíticos o a la inespecificidad de los mismos. La otra causa sería un procedimiento analítico defectuoso, como una exactitud o precisión inaceptables. En la fase analítica, la correcta calidad de la medida es un aspecto básico para conseguir unos resultados eficientes; actualmente la mejora producida en esta fase implica que los errores inherentes al procedimiento sean menores, con lo que a mayor calidad de medida del procedimiento analítico, menor magnitud de los errores y viceversa. Los errores más frecuentes descritos por Plebani y Carraro en la fase analítica son el manejo inadecuado de la muestra, el funcionamiento defectuoso del analizador y la inespecificidad del método, aspecto directamente relacionado con las interferencias analíticas. Dentro de los errores inherentes al procedimiento analítico, se pueden considerar dos tipos de error, el error sistemático y el error aleatorio: - El error sistemático puede ser constante o proporcional al valor real de la determinación. Además existe el error sistemático constante y proporcional que sería aquel en el que la medida está afectada por los dos tipos de error descritos. . Error sistemático proporcional = Valor real x K error . Error sistemático constante = Valor real + K (constante de error independiente de la magnitud) . Error sistemático constante y proporcional = Valor real x K error + K (independiente de la magnitud de la determinación) - El error aleatorio es mucho más grave, por el hecho de ser impredecible, aunque posiblemente pueda seguir un patrón determinado. En el anexo se explica un ejemplo de la influencia de la sensibilidad, especificidad diagnóstica y de la probabilidad de error en una prueba diagnóstica. Con respecto a la importancia de valorar el error analítico, se debe tener en cuenta que una de las fuentes de error más común, debido a su origen múltiple, es la relacionada con los efectos producidos por los medicamentos. - Efectos biológicos Los efectos biológicos se producen cuando un medicamento o sus metabolitos alteran el metabolismo del

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paciente mediante mecanismos fisiológicos, farmacológicos o bioquímicos y producen un cambio en la concentración de una magnitud. Las variaciones observadas son reales, siendo otra potencial causa de errores en la interpretación de los resultados analíticos, si se desconoce esta acción de los medicamentos. - Interferencias analíticas Es evidente que la interferencia es la causa de error de tipo aleatorio más importante en la fase analítica. Se debe resaltar que un 7% de los pacientes que toman un medicamento muestran algún tipo de alteración analítica, incrementándose este porcentaje a medida que aumenta el número de medicamentos administrados, llegando al 100% en el caso de que tomen cinco o más medicamentos, pero no existen mecanismos de rutina capaces de detectar estas interferencias. Detección de interferencias De modo general, se pueden establecer unas reglas orientativas para detectar una interferencia: . Reprocesar la muestra para verificar el resultado. . Comparar los resultados actuales con los previos. . Realizar un estudio crítico de los resultados analíticos comparándolo con su condición clínica. . Hacer una comparación de las variables fisiológicamente dependientes para ver si se correlacionan. . Revisar los resultados inesperados o fisiológicamente imposibles. . Considerar un fallo en las reglas estequiométricas; por ejemplo, en una dilución lineal de la muestra el resultado no es el esperado. . Observar marcadas diferencias de los resultados obtenidos al realizarse la medición por diversos métodos analíticos. Mecanismos de producción de interferencias Las interferencias que producen errores analíticos se pueden clasificar en función del mecanismo que las produce: . Causas químicas: el interferente compite con los reactivos o inhibe el indicador de la reacción. También puede producir complejos o precipitados con el constituyente. . Causas fisicas: el interferente tiene propiedades parecidas al constituyente, como fluorescencia, color, dispersión de la luz , la posición de elución o idéntica respuesta que el constituyente en el electrodo de medida. . Efecto matriz: el interferente altera una propiedad física de la matriz de la muestra, como la viscosidad, tensión superficial, turbidez o fuerza iónica. . Inhibición enzimática: el interferente altera la actividad de la enzima presente en el reactivo o en la muestra por diferentes mecanismos. - Secuestro de los metales activadores. - Unión en el lugar catalítico. - Oxidación de los grupos sulfhidrilo. - Competición con el substrato. . Inespecificidad: el interferente reacciona de la misma manera que el constituyente. . Reactividad cruzada: el interferente tiene estructura similar al antígeno y reacciona con el anticuerpo. . Desplazamiento del agua: las sustancias no acuosas afectan a las medidas de actividad por el desplazamiento del volumen de agua. Clasificación de las interferencias en inmunoanálisis Cabe destacar que las interferencias en los inmunoanálisis son otra fuente importante de error, con una tendencia creciente, debido en parte al incremento en su utilización. Las interferencias que producen errores analíticos en los inmunoanálisis se pueden clasificar en: Efecto matriz: es el efecto causado por la suma de todos los componentes, cuantitativos y cualitativos de un sistema, con excepción del constituyente que se mide.

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- Efecto de los reactivos: . Tampones: el pH y la fuerza iónica correctas minimizan la adsorción inespecífica. . Detergentes: la excesiva concentración de detergente desnaturaliza las proteínas e impide la absorción de los anticuerpos de la fase sólida. . Los peróxidos: los detergentes pueden contener peróxidos que inhiben la reacción antígeno-anticuerpo. . Los bacteriostáticos: pueden destruir la peroxidasa. - Anticuerpos: . Los anticuerpos policlonales además de unir al antígeno, también pueden ligar a fragmentos y metabolitos que contienen el epítopo adecuado. . Los anticuerpos monoclonales contienen subclases de inmunoglobulinas que pueden ser poliméricas. - Conjugados: tienen una gran influencia en el inmunoanálisis. - Separación de las fracciones: existen varios procedimientos para separar el anticuerpo libre y el unido. Es el mayor problema de los inmunoanálisis heterogéneos. - Proteínas: . La albúmina tiene capacidad para unir o liberar grandes cantidades de ligandos. . El factor reumatoide interfiere en la medición de T4libre. . Complemento: se une al fragmento Fc bloqueando los lugares de unión del constituyente. . Lisozima: está fuertemente asociada con proteínas de bajo punto isoeléctrico. . Proteínas transportadoras de hormonas: afectan a la medición de hormonas sexuales, tiroideas y corticosteroides. . Anticuerpos heterófilos (presentes en el 30-40% de las muestras): posiblemente causados por el contacto con animales y reaccionan con anticuerpos usados en la detección. Interferencias mecánicas: especialmente las causadas por efecto de la viscosidad, generalmente son debidas al aumento del fibrinógeno o a las paraproteínas. Interferencias no especificas: exceso de altas concentraciones de otros constituyentes del plasma como los ácidos grasos libres, lípidos, ácidos biliares y esteroides. El efecto gancho (hook): es la producción de resultados anormalmente bajos en una muestra que contiene una elevada concentración del constituyente que se mide.

19.6. ERRORES EN LA FASE POSTANALÍTICA_______________________________________________ Los errores postanalíticos son los que se producen después del proceso analítico y la incidencia descrita varia ampliamente, entre un 18%, un 24% y un 59% de los errores totales. Los más frecuentes son la revisión defectuosa de los resultados por el laboratorio, el extravío y la demora en la entrega de los informes, y la falta de notificación de incidencias al médico responsable del paciente. Otro error que posiblemente se incrementará en el futuro, es la imposibilidad de la consulta de los resultados en la historia clínica electrónica por problemas informáticos. En los errores de interpretación debe tenerse en cuenta lo que espera el médico de la información que le suministra el laboratorio, aunque éste no posea responsabilidad directa en este tipo de error. El juicio diagnóstico se basa en dos pilares básicos: la probabilidad y la estimación. La probabilidad es la posibilidad de que ocurra la hipótesis que genera el médico ante un problema diagnóstico; por lo tanto, cuando se solicita una magnitud biológica, la probabilidad de confirmar el diagnóstico puede ser previa (antes de solicitar la magnitud) o posterior (después de haber recibido el informe analítico). La estimación es el grado

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de confianza que genera la magnitud (hipótesis), pero esta estimación no es total porque siempre hay un grado de incertidumbre. Por lo tanto, la fiabilidad de una prueba viene dada por el grado de incertidumbre que pueda generar. La información de una magnitud se puede considerar como la suma de la estimación o información útil y la incertidumbre o información parásita. En consecuencia, no toda información viene asegurada con una certeza total, más bien viene acompañada de un cierto grado de incertidumbre, que cuanto mayor sea, menor será la confianza en el informe final del médico. La incertidumbre está presente en todas las pruebas que se solicitan, siendo arrastrada desde el principio del proceso diagnóstico. La incertidumbre final es la suma de todas las incertidumbres concomitantes a cada magnitud, por lo que desde un principio la sensibilidad y la especificidad de cada magnitud influirán en el diagnóstico final.

19.7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES______________________________________________ Estadísticamente se observa que la mayoría de los errores ocurren en la fase preanalítica, por lo que deberían tomarse algunas decisiones en dicha fase, y el primer paso es tener conciencia de las consecuencias de estos errores de una manera objetiva. Algunos errores no afectan clínicamente al paciente, pero otros implican la repetición de la solicitud analítica o la generación de exploraciones innecesarias, dando como resultado un incremento de los costes y en ocasiones, incluso un diagnóstico incorrecto o un tratamiento inadecuado que incide en la salud del paciente.

Medidas recomendadas para disminuir la incidencia de errores 1. Crear una cultura donde la prevención del error sea responsabilidad de cada elemento de la cadena del proceso analítico. 2. Considerar el error total en el laboratorio clínico en un sentido amplio, incluyendo todas las fases (preanalítica, analítica y postanalítica), con objeto de conocer su valor e incidir en su control, ya que existe una importante interrelación entre las mismas. 3. Aplicar de forma rigurosa las condiciones de extracción y estabilidad de las muestras. 4. Conocer la medicación que se administra al paciente para prevenir las posibles interferencias. 5. Establecer unas reglas o protocolos de rutina para detectar posibles interferencias. 6. Exigir que la información que acompaña a los reactivos incluya la descripción de los posibles interferentes que influyan en la medida de la magnitud y las limitaciones de medición de los mismos. 7. Es imprescindible que cada laboratorio establezca los indicadores de calidad para monitorizar el error en todas las fases del proceso y disminuir los errores. 8. Aumentar la cooperación de los diversos departamentos con el laboratorio para evitar los efectos de los errores que se produzcan.

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19.8. INCIDENCIAS. DEFINICIÓN Y REGISTRO________________________________________________ Incidencia: fracción de personas que desarrollan una enfermedad determinada en un periodo de tiempo determinado. Suceso inesperado. Incidente: Circunstancia o cualquier desvío de la asistencia que podría haber ocasionado o ha ocasionado un daño innecesario a un paciente. Este puede alcanzar o no al paciente y si lo alcanza puede o no causarle daño. Trazabilidad: capacidad para reconstruir, mediante registros, la historia de los procesos aplicados para llegar al resultado final. Metrológica: propiedad del resultado de una medición, o del valor de un patrón, que permite relacionado con referencias declaradas, generalmente patrones nacionales o internacionales, a través de una cadena ininterrumpida de comparaciones todas ellas con incertidumbres declaradas. Rechazo: cuando para una o varias de las determinaciones solicitadas no se puede entregar el resultado al clínico debido a causas imputables a errores preanalíticos.

Mediante el registro de incidencias, manual o automático-codificado en el sistema informático del laboratorio (SIL), se pretende, tras el tratamiento estadístico correspondiente, clasificar y cuantificar los errores que se producen en las fases del proceso (prenalítica, analítica y postanalítica) con el objetivo de controlar estas variables, asegurar la trazabilidad de los procesos y mejorar la calidad de la información y de las muestras procesadas y por lo tanto, de los resultados del laboratorio. Las incidencias analíticas están relacionadas con el funcionamiento de los analizadores y con el procedimiento de medida y ya han sido objeto de comentario en el capítulo 13. Así que en este, se definen las incidencias más habituales en la fase pre y postanalítica, indicando las acciones y el registro que procede según el tipo de incidencia.

19.9. INCIDENCIAS RELACIONADAS CON LA PETICIÓN ANALÍTICA_______________________________ Petición con incidencias en identificación de paciente: o no figuran o no se entienden los apellidos y nombre del paciente. Rechazo de petición. No procesar. Contactar con peticionario. Registrar en SIL. Petición con error de registro: se ha detectado ausencia o error de transcripción de los datos de la solicitud al ser registrados en el sistema informático del laboratorio, bien de forma manual por el personal administrativo o por petición electrónica. Verificar datos, modificar y registrar en SIL. Petición sin identificar o mal etiquetada: petición sin código de barras identificativo o etiqueta ilegible. Rechazo de petición. No procesar. Contactar con peticionario. Registrar en SIL. Petición falta formulario: el laboratorio no tiene petición de analítica. Contactar con peticionario en urgencias. Registrar en SIL. Petición faltan CIP o número de historia: no figuran en la petición. Registrar en SIL. Petición sin datos del peticionario o ilegibles: no figura o no se entiende el médico peticionario. Registrar en SIL. Petición sin origen y destino de resultados: faltan los dos datos en la petición. Contactar con peticionario en urgencias. Registrar en SIL. Petición sin datos extractor: faltan la identificador del tomador de la muestra. Registrar en SIL. Petición sin datos clínicos: no figuran datos clínicos en la petición. Registrar en SIL. Petición pruebas o perfiles mal marcados: en la petición analítica las pruebas solicitadas se prestan a confusión (las piden o no). Contactar con facultativo del laboratorio. Contactar con peticionario. Registrar en SIL. Petición modificada por facultativo peticionario: el facultativo que ha hecho la petición contacta con el

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laboratorio para modificar (añadir o suprimir prueba/s). Registrar incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Prueba añadida por facultativo del laboratorio: el facultativo del laboratorio, a la vista de los resultados, ha añadido una o varias prueba a la petición. Registrar incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Prueba suprimida por facultativo del laboratorio: el facultativo del laboratorio, estudiando la petición y los datos clínicos e histórico del paciente, ha suprimido una o varias pruebas a la petición. Registrar incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Petición modificada por facultativo del laboratorio: el facultativo del laboratorio, estudiando la petición y los datos clínicos e histórico del paciente, ha modificado la petición, añadiendo unas pruebas -ysuprimiendo otras. Registrar incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Paciente con más de un número de petición: paciente que, por motivos diversos de codificación no habituales, presenta dos números diferentes de petición. Indicar la incidencia en el informe de resultados. Registrar en SIL.

19.10. INCIDENCIAS RELACIONADAS CON LA PREPARACIÓN DEL PACIENTE________________________ Instrucciones previas incumplidas por el paciente: el paciente o no está en ayunas o no ha cumplido las horas de ayuno necesarias para la toma de la muestra. No ha cumplido otras instrucciones previas a la toma de la muestra. Consultar previamente con facultativos del laboratorio, si procede la toma de muestra. Registrar en SIL.

19.11. INCIDENCIAS RELACIONADAS CON LA TOMA DE LA MUESTRA____________________________ Extracción dificultosa: la toma de muestra de sangre se ha realizado con gran dificultad y esto puede ocasionar una incidencia en la muestra. Registrar en SIL. Imposibilidad de toma de muestra: tras repetidos intentos y por diversos motivos, no ha sido posible realizar la toma de muestra de sangre. Se debe indicar los motivos por los que no se ha podido realizar. Contactar con peticionario. Registrar en SIL. Recogida de muestra inadecuada: el paciente ha recogido una muestra que no es la adecuada para la determinación solicitada. Rechazo de muestra. No procesar. Informar al paciente y volver a citar. Registrar en SIL. Tubo o contenedor defectuoso: el recipiente que contiene la muestra no permite realizar la determinación solicitada. Rechazo de muestra. No procesar. Informar al paciente y volver a citar. Registrar en SIL.

19.12. INCIDENCIAS RELACIONADAS CON EL TRANSPORTE DE LA MUESTRA________________________ Muestra con incidencia en transporte: debido al transporte se ha producido un deterioro de la muestra (tiempo excesivo, temperatura excesiva, rotura, etc.), que puede causar un resultado erróneo para alguna de las determinaciones solicitadas. Rechazo de muestra. No procesar. Contactar con centro de extracción. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL.. Muestra con incidencia en temperatura: debido a una inadecuada temperatura de conservación o transporte se ha producido un deterioro de la muestra que puede causar un resultado erróneo para alguna de las determinaciones solicitadas. Rechazo de muestra. No procesar. Contactar con centro de extracción. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra recibida fuera de plazo: muestra de rutina (de paciente de consultas o plantas de hospitalización) que se ha recibido después del horario establecido. Registrar en SIL. Centros periféricos envío fuera de plazo: el envío ha llegado al laboratorio después del horario establecido. Registrar en SIL. Centros periféricos incidencia en transporte: rotura, vertido, falta formularios de petición, ilegibilidad de

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muestras o formularios, etc, que impida o retrase su procesamiento. Registrar en SIL. Centros periféricos incidencia en temperatura nevera transporte: temperatura excesivamente alta o baja que altere la calidad de las muestras e altere su composición. Registrar en SIL. Muestra externa con problemas de transporte: durante el envío al laboratorio externo de referencia se ha producido se ha producido un deterioro de la muestra (tiempo excesivo, temperatura excesiva, rotura, etc.), que puede causar un resultado erróneo para alguna de las determinaciones solicitadas. Repetir toma de muestra. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL..

19.13. INCIDENCIAS RELACIONADAS CON LA CALIDAD DE LA MUESTRA Y LOS CONTENEDORES_________ Muestra no remitida / falta muestra: se requiere un tipo de muestra que no ha llegado al laboratorio. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra inadecuada: la muestra remitida al laboratorio no es la adecuada para la determinación solicitada. Rechazo de muestra. No procesar. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra coagulada: un tubo con anticoagulante contiene una muestra coagulada. Jeringa de gases con coágulo. Rechazo de muestra. No procesar. Solicitar nueva muestra en urgencias. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra insuficiente: para realizar todas las determinaciones solicitadas la muestra remitida no es suficiente. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra hemolizada: para alguna de las determinaciones solicitadas está descrita una interferencia debida a la hemólisis. Solicitar nueva muestra en urgencias. Indicar la incidencia en la/s determinación/es que no se realiza/n. Registrar en SIL.. Muestra contaminada: por extracción a partir de una vía parenteral para una muestra de sangre o por aire para una muestra anaerobia (gasometría). Rechazo de muestra. No procesar. Solicitar nueva muestra en urgencias. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra sin identificar o mal identificada / sin etiquetar: se ha remitido al laboratorio un contenedor de espécimen sin identificación o con una etiqueta equivocada. Rechazo de muestra. No procesar. Indicar la incidencia en informe de resultados. Contactar con peticionario. Registrar en SIL. Muestra mal recogida: el paciente ha recogido una muestra que no está completa o no se ha recogido de forma adecuada para la determinación solicitada. Rechazo de muestra. No procesar. Informar al paciente y volver a citar. Registrar en SIL. Muestra no remitida cuando coexisten orina reciente y de 24 horas: al coexistir ambas muestras de orina, sólo se ha remitido una de las dos. Informar al paciente y volver a citar. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra sobra: se ha remitido una muestra al laboratorio a la que no se le solicita ninguna determinación, o se ha remitido por duplicado. Registrar en SIL. Muestra con volumen incorrecto: no se ha recogido el volumen total de muestra correspondiente al periodo de tiempo requerido, porque se ha despreciado volumen o no se ha respetado el tiempo de recogida. Rechazo de muestra. No procesar. Informar al paciente y volver a citar. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra con interferencias: la muestra contiene alguna sustancia contaminante. No dar resultado e indicar la incidencia en la/s determinación/es que no se realiza/n. Solicitar nueva muestra en urgencia. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra insuficiente anticoagulante: la proporción entre el anticoagulante y la sangre no es la adecuada (llenado incorrecto del tubo), siendo dicha proporción crítica para la determinación solicitada. Rechazo de muestra. No procesar. Solicitar nueva muestra en urgencias. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra contenedor inadecuado: el contenenedor remitido no es ninguno de los adecuados para esta muestra. Rechazo de muestra. No procesar. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra vertida: en el transporte se ha vertido el contenedor y ha inutilizado la muestra. Informar al

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paciente y volver a citar. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra con incidencias en centrifugado: al acondicionar la muestra por centrifugación se ha producido la rotura del tubo o no se ha obtenido una muestra adecuada. Repetir toma de muestra. Contactar con peticionario en urgencias. Informar al paciente y volver a citar. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra orina sedimento falta: se requiere un tipo de muestra que no ha llegado al laboratorio. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra sangre jeringa de gases falta: se requiere un tipo de muestra que no ha llegado al laboratorio. Contactar con peticionario en urgencias. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra sangre EDTA falta: se requiere un tipo de muestra que no ha llegado al laboratorio. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra orina de 24 horas falta: se requiere un tipo de muestra que no ha llegado al laboratorio. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra heces falta: se requiere un tipo de muestra que no ha llegado al laboratorio. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra archivo no localizada: no se encuentra la muestra o alícuota que estaba almacenada en nevera o congelador. Repetir toma de muestra. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra archivo mal conservada: la muestra no se ha conservado en las condiciones adecuadas de temperatura, tiempo o contenedor. Rechazo de muestra. No procesar. Repetir toma de muestra. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra externa sin identificar o mal identificada / sin etiquetar: se ha remitido al laboratorio externo de referencia un contenedor de espécimen sin identificación o con una etiqueta equivocada. Rechazo de muestra. No procesar. Repetir toma de muestra. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra externa falta: no se puede enviar muestra al laboratorio externo de referencia porque no ha llegado al laboratorio. Hay petición pero no muestra. Repetir toma de muestra. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra externa mal conservada: no se puede enviar la muestra al laboratorio externo de referencia porque la muestra no se ha conservado en las condiciones adecuadas de temperatura, tiempo o contenedor. Rechazo de muestra. No procesar. Repetir toma de muestra. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Muestra externa inadecuada: se ha remitido al laboratorio externo de referencia una muestra que no es la adecuada para la determinación solicitada. Rechazo de muestra. No procesar. Repetir toma de muestra. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Tubo roto: el tubo que contenía la muestra se ha roto en el transporte al laboratorio. Informar al paciente y volver a citar. Indicar la incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL.

19.14. INCIDENCIAS RELACIONADAS CON LA FASE ANALÍTICA__________________________________ Las incidencias analíticas están relacionadas con el funcionamiento de los analizadores y con el procedimiento de medida y ya han sido objeto de comentario en el capítulo 15.

19.15. INCIDENCIAS RELACIONADAS CON LA VALIDACIÓN DE RESULTADOS________________________ Incidencia en validación técnica: durante el proceso de validación técnica se ha registrado una incidencia importante que impide la información de resultados. Comunicar al facultativo responsable del área del laboratorio. Registrar en SIL. Incidencia en validación facultativa: durante el proceso de validación facultativa o clínica se ha detectado una incidencia grave que impide la información de resultados. Comunicar a personal técnico del área analítica o administrativo. Registrar en SIL.

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19.16. INCIDENCIAS RELACIONADAS CON LA COMUNICACIÓN URGENTE DE RESULTADOS CRÍTICOS_____ Petición con valor/es crítico/s: petición con uno o más valores considerados críticos. Comunicar urgentemente y registrar incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL. Valores críticos conocidos: petición que contiene prueba/s con valor/es crítico/s ya conocidos, repetidos o habituales en el histórico, que no se comunican de forma urgente por este motivo. Registrar en SIL. Comunicación urgente de valores críticos: se han comunicado (facultativo o técnico) con carácter urgente a personal responsable del paciente resultados de pruebas que se consideran críticos. Registrar incidencia en informe de resultados. Registrar en SIL.

19.17. INCIDENCIAS RELACIONADAS CON EL INFORME DE RESULTADOS___________________________ Resultados incidencia en informe: no se ha recibido, no se puede ver en pantalla, no se ha impreso, faltan resultados de pruebas, faltan pruebas solicitadas, envíos a destinos incorrectos, etc. Registrar en SIL. Resultados ilegibles: no se entienden o no se interpretan correctamente (resultado, unidades, valores de referencia, etc.). Contactar con facultativo de laboratorio responsable del área. Registrar en SIL. Resultados erróneos: se ha producido un envío de resultados erróneos (concentración, unidades, valores de referencia, comentarios, etc) y que, o bien han sido detectados por el laboratorio, o el facultativo peticionario reclama al laboratorio la incongruencia, la imposibilidad o la falta de credibilidad del resultado. Contactar con facultativo del laboratorio. Registrar en SIL. Resultados incidencia en demora urgencias: se han reclamado unos resultados de muestras recibidas que han sobrepasado el tiempo de entrega comprometido. Registrar en SIL.. Resultados incidencia en demora rutina: se han reclamado al laboratorio unos resultados de rutina que han sobrepasado el tiempo de entrega comprometido. Registrar en SIL. Resultados laboratorios externos reclamación: se han reclamado al laboratorio resultados de pruebas remitidas a laboratorios externos que han sobrepasado el tiempo de entrega comprometido. Registrar en SIL. Comentario no codificado: el facultativo, en el proceso de validación clínica, añade un comentario, a una o varias pruebas o al informe final a modo de valor añadido, que no está codificado en el sistema informático del laboratorio. Registrar en SIL.

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Capítulo 20. La seguridad del paciente en el laboratorio

Introducción 20.1. Objeto y campo de aplicación 20.2. Terminología básica 20.3. Seguridad del paciente en el proceso de laboratorio clínico 20.4. Cultura de seguridad del paciente 20.5. El papel del laboratorio clínico en la seguridad del paciente 20.6. El mapa de riesgos en los procesos del laboratorio 20.7. Análisis modal de fallos y efectos 20.8. Identificación de riesgos en el laboratorio

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INTRODUCCIÓN___________________________________________________________________ La Seguridad del Paciente comenzó a tomar relevancia cuando en 1999 el Instituto de Medicina (IOM) de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos publicó el informe “To Err is Human” en el que según las estadísticas, cada año en Estados Unidos, los errores médicos ocasionaban la muerte de hasta 98.000 pacientes, cifra superior a la de las muertes por accidentes de tráfico, cáncer de mama o SIDA. A las consecuencias directas en la asistencia sanitaria se suman otras repercusiones entre las que destacan las de tipo social y económico. Los grandes adelantos en la tecnología y el conocimiento desarrollado en las últimas décadas han generado un sistema de salud de enorme complejidad. Esta complejidad entraña numerosos riesgos potenciales inherentes al sistema que, al combinarse con la variabilidad de procedimientos y la actuación humana, pueden provocar que los pacientes finalmente se vean afectados a pesar de los cuidados y dedicación de los profesionales. Por ello, la Seguridad del Paciente se considera un aspecto clave de las políticas de calidad de los sistemas de salud y por tanto, debe ser tratado como un principio esencial. Esta recomendación ha sido avalada por diferentes organismos, como la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Joint Commission (JC), la Organización Panamericana de la Salud (OPS) y el Comité Europeo de Sanidad del Consejo de Europa En España, al igual que en el resto de países, la preocupación por la Seguridad del Paciente se pone claramente de manifiesto en el Plan de Calidad para el Sistema Nacional de Salud. A nivel de las diferentes Comunidades Autónomas, esta inquietud queda igualmente reflejada en los diferentes planes de Calidad y estrategias específicas para la Seguridad del Paciente. Los últimos estudios e investigaciones evidencian el impacto que los eventos adversos (EA) tienen sobre la morbilidad y la mortalidad, apareciendo un amplio arsenal de problemas relacionados con la seguridad en todos los ámbitos de atención. Esto se ha puesto de manifiesto en los dos grandes estudios epidemiológicos realizados en nuestro país, el Estudio Nacional de Efectos Adversos ligados a la Hospitalización (ENEAs) y el Estudio de Eventos Adversos en Atención Primaria (APEAs).

20.1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN__________________________________________________ En este capítulo se presentan las ideas esenciales y conceptos básicos con el propósito de de generar cultura de Seguridad del Paciente en el Laboratorio Clínico, sensibilizar y concienciar a los profesionales y fomentar el abordaje de mejoras para Seguridad del Paciente en este ámbito.

20.2. TERMINOLOGÍA BÁSICA__________________________________________________________ Para mejorar la Seguridad del Paciente es necesario poner de manifiesto los riesgos, prevenir los eventos adversos y mitigar sus efectos cuando se producen. Para conseguir esto se requiere más capacidad para aprender de los errores. Esta capacidad se adquiere fomentando su notificación y realizando una investigación competente de los incidentes y un intercambio responsable de datos y para ello es importante tener una terminología común. Existe un gran número de conceptos relacionados con la Seguridad del Paciente, sin embargo se han seleccionado aquellos términos imprescindibles para facilitar la comprensión y la transferencia de

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información entre los profesionales de Laboratorio Clínico. Estos términos que se han considerado elementales son: Accidente: Evento que sucede de forma imprevista y que produce algún tipo de consecuencia impidiendo los resultados deseados. Daño relacionado con la atención sanitaria: daño que se deriva de los planes o acciones de un profesional sanitario durante la prestación de asistencia sanitaria o que se asocia a ellos, y no el que se debe a una enfermedad o lesión subyacente. Casiincidente, casierror o Nearmiss: Incidente que no ha llegado al paciente. Situación que pudo haber terminado en un accidente, pero una intervención a tiempo (planificada o no), o la casualidad evitó que le alcanzara. Complicación: Alteración del proceso natural de la enfermedad, derivada de la misma y no provocada por la intervención médica propiamente dicha. Error: Es no llevar a cabo una acción como se debería realizar. Una acción que no se realiza como se planificó (error activo) o una planificación equivocada para la consecución de un objetivo (condición latente). Evento adverso: Acontecimiento que produce una lesión o daño al paciente como resultado de una intervención sanitaria. Incidente con daño. Evento centinela: Es un incidente o suceso inexplicado que produce la muerte o serias secuelas físicas o psicológicas, o el riesgo de que éstas se produzcan. Una lesión grave comprende específicamente la pérdida de una extremidad o una función. La frase "o el riesgo de que se produzcan" comprende toda variación del proceso cuya repetición conllevaría una probabilidad importante de un resultado adverso grave. Esos eventos se denominan «centinelas» porque avisan de la necesidad de una investigación y una respuesta inmediatas. Factor atenuante: acción o circunstancia que impide o modera la evolución de un incidente hacia la provocación de un daño al paciente. Factor contribuyente: circunstancia o acción que influye sobre el origen o la evolución de un incidente, o que ha aumentado el riesgo de que se produzca éste. Incidente: Circunstancia o cualquier desvío de la asistencia que podría haber ocasionado o ha ocasionado un daño innecesario a un paciente. Este puede alcanzar o no al paciente y si lo alcanza puede o no causarle daño. Prevenible: algo evitable en las circunstancias particulares del caso. Riesgo: probabilidad de que se produzca un incidente. Seguridad del Paciente: ausencia, para un paciente, de daño innecesario o daño potencial asociado a la atención sanitaria. El conocimiento y uniformidad en la terminología ayudará a “hablar todos en el mismo idioma” y nos permitirá aprender de nuestros errores, así como de las experiencias de los demás.

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20.3. SEGURIDAD DEL PACIENTE EN EL PROCESO DE LABORATORIO CLÍNICO_______________________ Entre los diferentes riesgos y problemas de seguridad, recientemente se han constatado los relacionados con los centros diagnósticos. Esta problemática de la Seguridad del Paciente con los centros diagnósticos queda reflejada igualmente en el ENEAs. Al presentarse en este estudio los diferentes tipos de EA y su distribución, se revela que los EA detectados relacionados con el diagnóstico o con pruebas diagnósticas suponen un 2,75%. Este porcentaje podría parecer bajo respecto a otras causas, sin embargo es relevante por ser evitable en un 84,2%, siendo este porcentaje de los más elevados. En este estudio, los principales problemas detectados fueron: “diagnóstico incorrecto”, “retraso en el diagnóstico por falta de pruebas pertinentes”, “falta de atención a la anamnesis”, “error de identificación del paciente”, “error de etiquetas identificativas en los tubos de hemograma”, “transmisión incorrecta de los resultados de microbiología”, “contaminación de la sangre en el Laboratorio”, “reactivos caducados”, “suspensión de la exploración por insuficiente preparación del paciente” y “equipos mal calibrados”. Siguiendo en la misma línea, a nivel nacional, se han realizado otros estudios como el de Incidentes y eventos adversos en medicina intensiva, seguridad y riesgo en el enfermo crítico, SYREC. Todos estos estudios vienen a refrendar la importancia del Laboratorio en diferentes campos, confirmando que las actividades en el Laboratorio Clínico están sometidas a múltiples fuentes de error, que pueden evitarse en un alto porcentaje y que en su conjunto determinan la calidad del análisis. Igualmente, es importante la calidad de la información que se transmita, ya que repercutirá en la gestión adecuada del paciente, diagnosis, tratamiento de la enfermedad, supervisión clínica y prevención de la enfermedad. La mejora en la calidad de los procedimientos analíticos, el establecimiento de protocolos y el funcionamiento correcto y oportuno del Laboratorio Clínico, teniendo en cuenta aspectos transversales como el trabajo en equipo, la formación y comunicación y poniendo en evidencia los riesgos potenciales, antes de que puedan llegar a los pacientes, optimiza la seguridad y la salud de éstos.

Aspectos a considerar en la seguridad del paciente

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Como se ha explicado, son muchas las organizaciones nacionales e internacionales que han incluido la Seguridad del Paciente en su agenda de prioridades, específicamente para el Laboratorio Clínico. Concretamente, la Joint Commission incluyó el programa de Laboratorio, como una de sus metas y objetivos específicos, en los años 2008 y 2009 y lo ha incluido también en el 2010. Esta organización recomienda que, además de involucrar a los propios pacientes en sus propios cuidados desde una perspectiva de seguridad, es necesario poner en marcha tres objetivos concretos relativos a la Seguridad del Paciente como son la mejora en la identificación inequívoca del paciente (NPSG.01.01.01), la mejora de la comunicación efectiva entre los proveedores de cuidados (NPSG.02.03.01) y la reducción del riesgo de infecciones en los pacientes asociadas a la atención sanitaria (NPSG.07.01.01). También la OMS en su documento “nueve soluciones para la Seguridad del Paciente”, Programa central de la Alianza Mundial para la Seguridad del Paciente, establece como soluciones estratégicas: la correcta identificación del paciente y la comunicación de la información durante la transferencia del paciente de un Servicio a otro o de un nivel asistencial a otro. Básicamente estas soluciones tienen por objeto ayudar a reformular los procedimientos y la asistencia a los pacientes y evitar errores, tanto humanos como del sistema. La visión convencional del Laboratorio Clínico ha enfocado el control de calidad fundamentalmente en las actividades de la fase analítica y hasta ahora con carácter reactivo, una vez ocurrido el problema. Sin embargo, hay que cambiar este enfoque y buscar oportunidades de mejora para la Seguridad del Paciente, y por consiguiente de la calidad, con actitud proactiva, de prevención. Esta forma de trabajar se puede desarrollar a través de la monitorización, no solo de la fase analítica, sino de las fases preanalítica y postanalítica. La bibliografía disponible revela que la distribución de errores en estas fases es mayor que en la analítica. Dependiendo de los autores, las cifras pueden oscilar entre el 4571% para la fase preanalítica y 11-45% para la fase postanalítica, frente al 13-18% para la fase analítica, aunque quizás esta última fase ha sido la más considerada hasta ahora . Es por ello que la oportunidad más grande, para la mejora en calidad y la optimización de la Seguridad del Paciente, se presenta en las fases preanalítica y postanalítica.

Proceso global del laboratorio

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Como aspectos más críticos y con mayor margen de mejora destacan en la fase preanalítica, la adecuación e indicación de la prueba, las condiciones y preparación previa del paciente, la recogida adecuada de la muestra, la identificación, el transporte y la entrada de datos. En la fase postanalítica destacan principalmente la interpretación de los resultados y la comunicación de estos. Esto último es importante ya que el proceso total de solicitud de pruebas analíticas, engloba desde el momento en que el facultativo decide realizar una prueba a un paciente, hasta que el resultado de dicha prueba llega al clínico para establecer el diagnóstico correcto y la correspondiente toma de decisiones en base a éste. En consecuencia cualquier medida que se adopte con el objetivo de mejorar la seguridad y por tanto la calidad del proceso, se puede alcanzar más fácilmente si existe una fluida colaboración entre los facultativos clínicos y los del Laboratorio. Así, los errores en el Laboratorio pueden dar lugar a un error o un retraso en el diagnóstico, un error en el tratamiento, omisión de pruebas o el uso de pruebas inadecuadas. Dado que las pruebas de Laboratorio proporcionan la información esencial usada por los médicos para que éstos tomen decisiones, es importante determinar dónde ocurren los errores de Laboratorio, si causan daño al paciente y qué podemos hacer para mejorar y prevenir su ocurrencia. Cabe destacar que la creciente automatización y consolidación en los sistemas analíticos y la mejora sustancial en la fase preanalítica se ofrece como una alternativa eficiente a los procedimientos actuales. No obstante, debemos recordar que esta creciente automatización y la disponibilidad de nuevas tecnologías, en sí, también puede ser una fuente de error y por tanto se debe analizar en qué medida contribuye a la seguridad su correcto funcionamiento.

20.4. CULTURA DE SEGURIDAD DEL PACIENTE______________________________________________ El objetivo de la Seguridad del Paciente es lograr que los sistemas, especialmente de gran tamaño y complejidad, como es el caso del Laboratorio, funcionen de forma más segura. Su desarrollo se basa en el conocimiento acumulado mediante el análisis de errores, incidentes y eventos adversos. Para esto es necesario crear una cultura de Seguridad del Paciente en el Laboratorio Clínico. Probablemente este es el mayor cambio y el más difícil de lograr. Esta cultura se debe extender a todos los profesionales del Laboratorio y para ello se deben implantar políticas y procedimientos basados en el análisis de los tipos de errores que tiene la organización, de modo que, cuando se produzca un evento adverso, el profesional sepa que lo debe informar y que no va a recibir una sanción por ello. La problemática del error se puede abordar desde dos perspectivas, desde una aproximación a la persona (modelo centrado en la persona) y desde una aproximación al sistema (modelo centrado en el sistema). Cada modelo afronta la gestión del error de manera diferente. En el modelo centrado en la persona, el incidente se atribuye directamente al error humano. Se asume que los individuos se equivocan porque prestan escasa atención, tienen olvidos, descuidos y/o falta de motivación, en definitiva son malos profesionales y por tanto los errores que cometen son la causa principal de la aparición de los eventos adversos. En este caso, la estrategia a seguir para minimizar la ocurrencia de los eventos adversos sería la de identificar al culpable y aplicar medidas disciplinarias. Por desgracia, este modelo es el más arraigado en nuestro sistema. En el modelo centrado en el sistema, en lugar de buscar directamente al culpable, se atribuye la principal responsabilidad de los eventos adversos a problemas en el sistema. Es decir, deficiencias en el diseño, en la organización y en el funcionamiento del sistema. Esto queda claramente explicado con el ejemplo ideado por James Reason o el modelo del queso suizo, donde queda de manifiesto que un evento adverso es la

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consecuencia final de una superposición de fallos, teniendo en cuenta las diferentes barreras y pasando por los fallos de la organización hasta el acto inseguro de la persona. Asumiendo este enfoque, la estrategia de prevención se centraría en analizar los errores, aprender de ellos y establecer medidas de mejora. En base a esto debemos recordar que personas muy hábiles y capacitadas, aún pueden cometer errores y que existe la posibilidad de aprender de nuestros errores y así modificar nuestro desempeño. Por todo ello, es necesario tener una actitud proactiva y poner en marcha iniciativas dirigidas a monitorizar e implementar medidas para la disminución de los diferentes errores. Así mismo debe fomentarse la comunicación y el trabajo en equipo en las distintas fases, fundamentalmente en las que intervienen diferentes profesionales y diferentes ámbitos, como es el caso de la fase pre y post-analítica. Es prioritario establecer una estrategia de calidad en todo el Laboratorio Clínico orientada a la identificación de riesgos para conocer y estudiar la ocurrencia de los eventos adversos, analizar los errores y eventos ocurridos, determinar sus causas y proponer mejoras que eviten su repetición. Garantizar la Seguridad del Paciente debe ser el eje sobre el que nos movamos al prestar los servicios sanitarios en el Laboratorio Clínico.

20.5. EL PAPEL DEL LABORATORIO CLÍNICO EN LA SEGURIDAD DEL PACIENTE________________________ El Laboratorio Clínico forma parte de la atención sanitaria del paciente dentro y fuera del hospital, siendo partícipe prácticamente en todos los procesos asistenciales. La información proporcionada por el Laboratorio Clínico tiene un impacto directo sobre la Seguridad del Paciente, por lo que un fallo en cualquiera de sus pasos puede afectar al paciente. De hecho, en muchas ocasiones ocurre de esta manera (error de diagnóstico, de tratamiento, etc.). Así, una mejora en la seguridad de los procesos de Laboratorio pasa por una comprensión detallada de los pasos involucrados para poner de manifiesto los riesgos propios de cada Laboratorio y por tanto los retos que deben abordarse. Además, es evidente la necesidad urgente de una comunicación y cooperación estrecha con todos los profesionales implicados para asegurar una buena interpretación y utilización adecuada de los resultados del Laboratorio. Los niveles de coordinación y comunicación son inversamente proporcionales a la probabilidad de ocurrencia de errores. Recordemos que una de las causa principales de los eventos centinela analizados es por un déficit de comunicación. Por todo esto la Seguridad del Paciente se ha convertido en una prioridad para los Laboratorios Clínicos y se reconoce como un problema grave que requiere un enfoque global con el propósito de minimizar sus tasas de error y promover la mejora de la calidad. En este sentido The Education and Management Division (EMD) de la International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) ha creado un grupo de trabajo específico sobre errores de Laboratorio y Seguridad del Paciente (Working Group on “Laboratory errors and patient safety” - WG-LEPS 9.3.8) como herramienta para mejorar el conocimiento en este campo a nivel internacional, y recomendar el desarrollo y aplicación de protocolos operativos estandarizados. El objetivo del Grupo de Trabajo de la (Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular (SEQC) es fomentar los estudios sobre Seguridad del Paciente en el Laboratorio y recomendar acciones de mejora.

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20.6. EL MAPA DE RIESGOS EN LOS PROCESOS DEL LABORATORIO______________________________ El propósito de un mapa de riesgos es establecer una priorización de los riesgos detectados con la intención de aplicar la intervención más eficaz para su minimización. Para pode realizar una identificación adecuada de los riesgos, el paso previo es la realización de un análisis de la situación y de contexto con el que conocer a fondo el ámbito de trabajo.

Tipos de riesgos y ejemplos

Factores contribuyentes

Una de las herramientas para la identificación y el análisis proactivo es la matriz de riesgos que clasifica los riesgos en grupos de acuerdo con su nivel de importancia: magnitud y trascendencia (gravedad clínica e impacto). La agrupación de riesgos es importante porque proporciona consistencia y un marco para el análisis, además de facilitar la recogida y la agrupación de datos dispersos.

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Matriz de riesgos por categorías

Matriz de riesgos por magnitud y trascendencia Para la elaboración de un mapa de riesgo se siguen los siguientes pasos: Elección del proceso o ámbito de estudio. A la hora de elegir sobre qué proceso realizar un mapa de riesgos se priorizan aquellos que incluyan a pacientes con más riesgo de sufrir eventos adversos, relacionados con la asistencia sanitaria, por su condición de vulnerabilidad (por la edad, afección, nivel cognitivo, etc.) o unidades de más alto riesgo en la institución, procedimientos (diagnósticos, terapéuticos, etc.) que entrañen un mayor riesgo o simplemente prácticas habituales relacionadas con la asistencia que se consideren inseguras. Formación del equipo de trabajo. Debe es tar integrado por profesionales con conocimiento y experiencia en el proceso que se va a evaluar. Identificación de los riesgos. Dentro de este paso se realiza la localización de los agentes generadores de riesgos. Diagnóstico de los riesgos en función de su magnitud y trascendencia. Situación de los riesgos existentes en una matriz de gestión del riesgo. Implantación de medidas de mejora según la información obtenida de la matriz.

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Aplicación práctica El laboratorio del hospital A es el laboratorio de referencia para el envío de muestras de diferentes centros de salud. El jefe del laboratorio, durante los últimos meses, ha realizado un seguimiento sobre los incidentes que vienen ocurriendo en su ámbito de influencia. Ha comprobado que, como se recoge en la bibliografía, es en la fase preanalítica donde aparecen un mayor número de problemas y se cometen un número más elevado de errores, por lo que decide identificar los problemas y riesgos, así como determinar su importancia, en el proceso que va desde la petición de la analítica hasta que la muestra llega al laboratorio (petición, toma de la muestra, conservación y transporte de la muestra). El jefe del laboratorio decide utilizar la matriz de riesgos para clasificar y agruparlos, y para ello forma un grupo de trabajo compuesto por profesionales que representan aquellas categorías que intervienen en el proceso (un facultativo, un técnico especialista, un administrativo, un enfermero, un facultativo de atención primada y un celador conductor). Explica al grupo el objetivo, y el enfermero de atención primaria se hace cargo de coordinar el grupo, ya que tiene experiencia con esta herramienta. Para la identificación de los riesgos, se decide utilizar la técnica de tormenta de ideas. Tras unos 15 minutos se identifican los siguientes problemas: • • • • • • • • • • • • • •

Petición inadecuada. Cumplimentación incorrecta de la solicitud. Inadecuada preparación del paciente. Limpieza incorrecta de la zona de extracción. Extracción venosa errónea. Muestra insuficiente para la obtención de resultados. Utilización de tubos incorrectos para la realización de las diferentes pruebas analíticas. Manipulación incorrecta de la muestra. Identificación errónea de la muestra. Identificación errónea del paciente. Incorrecta conservación. Transporte inadecuado Confusión en la entrega de peticiones y muestras. Olvido de las peticiones analíticas y/o muestras en el centro.

Tras la identificación de los problemas, el grupo procede a la puntuación. Para ello, se acuerda asignar una puntuación para cada uno de los riesgos entre los valores de 1 y 5 atendiendo a las dimensiones de aparición y gravedad para el paciente (ver tabla).

Rango de puntuación por dimensión

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Una vez clasificados los riesgos (ver tabla), el producto de los números correspondientes a las dos dimensiones ha facilitado la importancia de los riesgos detectados.

Tabla de clasificación de importancia de los riesgos Tras clasificarlos en orden descendente de importancia, los riesgos han quedado de la siguiente manera: 1. Riesgos muy graves: - Inadecuada preparación del paciente. - Extracción venosa errónea. - Petición inadecuada. - Identificación errónea del paciente. 2. Riesgos importantes: - Identificación incorrecta de la muestra. - Cumplímentación incorrecta de la solicitud. 3. Riesgos apreciables: - Manipulación incorrecta de la muestra. - Muestra insuficiente. - Uso de tubos incorrectos. - Incorrecta conservación. - Transporte inadecuado. - Olvido de las peticiones y/o muestras. 4. Riesgos marginales: - Limpieza inadecuada de la zona de extracción. - Confusión en la entrega de peticiones y/o muestras. Para los riesgos del grupo 1 habrá que tomar medidas preventivas de manera urgente; para los del grupo 2 deben establecerse medidas preventivas obligatorias; para los del grupo 3, habrá que estudiar qué medidas con

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menor impacto económico se podrían implementar para reducir el nivel de riesgo. Los riesgos incluidos en el grupo 4 deberán someterse a un seguimiento, aunque a veces algunas de las medidas tomadas para reducir otros riesgos podrían utilizarse también para minimizar los riesgos englobados en este grupo de riesgos marginales. Algunas de estas medidas sobre metodología del análisis modal de fallos y efectos (AMFE), podrían resumirse en la promoción de la comunicación, además de la formación y la protocolización.

20.7. ANÁLISIS MODAL DE FALLOS Y EFECTOS______________________________________________ Definición y cualidades. El AMFE (Análisis Modal de Fallos y Efectos) es un método de análisis que se emplea para evaluar diseños, procesos y/o servicios de forma estructurada y sistemática, con el propósito de identificar y prevenir los posibles fallos, evaluando su probabilidad de aparición, posibilidad de detección y posibles efectos y gravedad, así como sus causas. Permite la priorización para establecer acciones de mejora y eliminar o reducir la probabilidad de que se produzcan dichos fallos. El AMFE es un método para identificar y prevenir fallos. El AMFE es una metodología que presenta muchas cualidades, y destaca por: • Ser una metodología proactiva: se realiza un análisis de los posibles fallos, esto es, se evidencian antes de que éstos hayan ocurrido. Tiene carácter preventivo. • Ser una metodología sistemática y estructurada: el seguimiento de los pasos de esta metodología y la técnica utilizada aseguran que prácticamente se tengan en cuenta todas las posibilidades de fallo del proceso. • Fomentar la colaboración y comunicación: se realiza un trabajo en equipo que requiere la puesta en común de conocimientos de todas las áreas afectadas. Es una metodología proactiva, sistemática, estructurada y que fomenta la comunicación. No obstante, también presenta algunos inconvenientes, como son requerir tiempo y personas implicadas. Por ello, esta metodología se aplica fundamentalmente cuando se diseñan nuevos procesos o servicios, cuando se modifica algún procedimiento o bien cuando se buscan mejoras en los diseños, procesos y/o servicios establecidos. Esta metodología se aplica al diseñar nuevos procesos, al modificarlos o para buscar mejoras en los existentes. Con el AMFE se pretende dar respuesta a preguntas como las siguientes: • • • •

En un proceso, diseño o servicio, ¿qué puede ir mal? Si algo puede ir mal, ¿cuál es la probabilidad de que así sea? Si ocurriese, ¿sería fácil detectarlo? ¿Cuáles serían sus consecuencias? Una vez que se han identificado los fallos y sus causas, ¿cómo pueden minimizarse o evitarse? ¿Por dónde empezamos a actuar?

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Descripción de la metodología La aplicación de esta metodología en un sistema o proceso concreto da respuesta a dicho proceso en el ámbito donde se estudie. Es un error adoptar resultados de un AMFE previo realizado en otro laboratorio, aunque el proceso analizado sea idéntico. A continuación se indican los pasos que se deben seguir para la aplicación del método AMFE:

Esquema de la metodología de AMFE

1. Seleccionar el proceso, diseño o servicio que se va a analizar. Es conveniente ser muy específico en cuanto al proceso que se va a analizar. Hay que elegir aquel proceso que presente un mayor riesgo para el laboratorio clínico. Quizá se deba a que sea un proceso nuevo, implique una mayor participación de profesionales con distintas categorías o niveles asístendales, no exista protocolo o no esté actualizado, sea un procedimiento que se lleva a cabo en situaciones de estrés, o bien últimamente estén apareciendo muchos errores en aspectos determinados. Se selecciona para el AMFE el proceso de mayor riesgo.

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2. Creación del equipo de trabajo. Para ser operativo, el grupo de trabajo que debe llevar a cabo el proceso de AMFE no debe ser numeroso, pero deben estar representadas las categorías profesionales involucradas (grupo interdisciplinar que aporte diferentes puntos de vista). Han de ser personas con experiencia y conocimiento en el ámbito en que se desarrolla el estudio. Se formará un grupo diferente por cada proceso que se vaya a analizar. Es preciso que en el grupo haya alguna persona que conozca la metodología y tenga experiencia en su aplicación práctica. En algún momento también puede ser necesario acudir a otras personas en calidad de consultores. El grupo de trabajo debe contar con el apoyo de la dirección del laboratorio para que pueda llevarse a cabo de forma efectiva y alcanzar los objetivos perseguidos. Debe haber un coordinador del grupo, que será el encargado de fijar y convocar las reuniones y conducir el grupo. Es importante fijar los plazos adecuados y determinar los límites del estudio. El equipo de trabajo debe ser un grupo multidisciplinar y con conocimiento del proceso seleccionado. 3. Elaborar un diagrama del proceso. Se describe de forma gráfica y detallada el proceso que se va a analizar. El grupo de trabajo desarrollará el diagrama de flujo del proceso que se va a estudiar, poniendo de manifiesto cada uno de los pasos. Si un proceso es complejo, se dividirá en subprocesos y éstos, a su vez, en pasos, de los que también se desarrollará el diagrama de flujo. Es importante establecer la cadena de sucesos en el orden correcto para una mejor comprensión del proceso que se estudia. Se elaborará una representación gráfica del proceso que se va a analizar indicando todos los pasos. 4. Realizar el análisis de riesgos. Centrándose en cada uno de los pasos, los miembros del equipo seguirán los siguientes puntos: a) Elaborar una lista de todos los modos de fallo o errores potenciales para determinar posteriormente su probabilidad de aparición. Esto se puede realizar mediante la técnica de tormenta de ideas, mediante la cual se identificarán los modos de fallo, los posibles efectos y las causas potenciales. Se plantea una tormenta de ideas sobre codos los fallos que puedan ocurrir para cada uno de los pasos. b) Describir los posibles efectos de los fallos que se han identificado anteriormente, suponiendo que ocurriesen. Si se identifican diferentes efectos para el mismo fallo, hay que quedarse con el más grave. También puede utilizarse la técnica de tormenta de ideas. c) Detallar las causas que se podrían atribuir a cada fallo. Éstas deben ser lo más concisas y completas posibles para facilitar la identificación de acciones correctoras y/o preventivas pertinentes. Se puede usar la misma técnica que en los puntos anteriores. Es importante tener en cuenta que el fallo puede estar originado por una o más causas. d) Listar controles o métodos de detección para los fallos anteriores. Se reflejarán los controles existentes para prevenir las causas del fallo y detectar el efecto resultante. e) A continuación, se priorizan los errores y sus causas en función de estas últimas, y se calcula el número de prioridad del riesgo (NPR), que debe calcularse para todas las causas y es el producto de la probabilidad de aparición (A), la gravedad (G) y la probabilidad de detección: - La probabilidad de aparición (A) es la frecuencia con que ocurren los fallos. Los valores van de 1 a 10, siendo 1 la menor frecuencia y 10, la aparición máxima.

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- La gravedad (G) de los efectos se basa en las consecuencias resultantes de un posible fallo. Los valores van de 1 a 10, siendo 1 la menor gravedad y 10, la gravedad máxima. - La probabilidad de detección (D) corresponde a la posibilidad de que el fallo se detecte antes de que se produzca el daño. Los valores oscilan de 1 a 10, siendo 10 la detección muy difícil. NPR = A x G x D EL NPR se usa con el fin de priorizar la causa potencial del fallo y establecer así posibles acciones correctoras. Para determinar el valor de los diferentes índices (gravedad, aparición y detectabilidad), el grupo puede establecer su escala propia para el proceso o puede apoyarse en una matriz de puntuación existente. Un ejemplo de éstas puede encontrarse en la tabla siguiente, en la que se presenta una forma de puntuación para los diferentes índices. Las tablas son oríentativas; se pueden relativizar según el proceso que se vaya a analizar. Estas tablas establecen un rango de puntuacíón de los diferentes índices. Por ello, es importante identificar el valor mínimo y máximo que afecte a cada uno de los índices que se vaya a aplicar en los procedimientos que se analicen. Así, al calcular el NPR, se podrá discriminar mejor entre los diferentes ítems identificados para priorizar las causas potenciales y establecer acciones correctoras atendiendo a esa priorización.

Puntuación de los índices de gravedad, frecuencia y detectabilidad

5. Definir acciones de mejora. A partir de la ordenación de los NPR, el grupo propone medidas de mejora, como pueden ser: rediseñar circuitos del laboratorio, mejorar recursos, supervisar la capacitación de los diferentes profesionales, revisar el entorno y las condiciones de trabajo en el laboratorio, establecer nuevos controles y barreras, etc. Para determinar si deben tomarse las acciones correctivas, pueden apoyarse en un árbol de decisión. Las acciones de mejora surgen tras la priorízación de las causas. 6. Definir responsabilidades. Es necesario establecer un responsable por cada una de las acciones de mejora propuestas y, sí se cree preciso, las fechas previstas de implantación de éstas. Los responsables pueden ser personas que participan directamente en el proceso o que, sin participar, estén indirectamente implicadas. Hay que destacar que la persona seleccionada debe mostrar un alto componente de motivación por la actividad y no tiene que ser, necesariamente, un cargo de responsabilidad. La definición de responsabilidades es importante para el seguimiento de las acciones de mejora. 7. Analizar y evaluar de nuevo el proceso. Estas medidas de mejora han de ser controladas y evaluadas como fase final del método. Para ello se establecerán medidas de resultado, con el diseño de indi-

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cadores cuantitativos o cualitativos para el seguimiento de las mejoras, la elaboración de estudios de evaluación, el registro de incidencias, etc. Una vez que se han puesto en marcha las medidas de mejora, deberían evaluarse los modos de fallo para analizar la efectividad de las acciones correctoras y reorganizar las causas según una nueva priorización. La revisión debe ser periódica con el propósito de obtener una mejora continua. En cualquier caso, siempre se puede reabrir un AMFE para revisar, evaluar o mejorar nuevamente el proceso existente e implantar nuevas medidas de mejora según un criterio de oportunidad. Tras la implantación de las medidas se evaluará nuevamente el proceso.

20.8. IDENTIFICACIÓN DE RIESGOS EN EL LABORATORIO______________________________________

COMPLEJO ASISTENCIAL DE SORIA MAPA DE RIESGOS DE LOS PROCESOS DE LABORATORIO Laboratorio de Bioquímica TRANSPORTE Y RECEPCIÓN MUESTRA LAB. DE REFERENCIA

HISTORIA DEL PACIENTE

ANÁLISIS LAB. REFERENCIA

PREPARACIÓN MUESTRA LAB. REFERENCIA

10 MANTENIMIENTO Y CALIBRACIÓN

7 CLASIFICACIÓN, 1 PETICIÓN ANALITICA

5 TRANSPORTE Y

4 TOMA DE MUESTRA

CONSERVACIÓN

6 RECEPCIÓN

DE ANALIZADORES

DISTIBUCIÓN Y PREPARACIÓN MUESTRA

11 CONTROL DE CALIDAD

8 REGISTO DE 22INFORMACIÓN INFORMACIÓN PEPARACIÓN DEL

ANALÍTICO

DETERMINACIONES CITACIÓN

PEPARACIÓN PACIENTE DEL PACIENTE

12 ANÁLISIS Y

9 REGISTO DE

VALIDACIÓN TÉCNICA

DEMOGRÁFICOS

Fase pre-analítica

Fase analítica

SIL 13 VALIDACIÓN FACULTATIVA

PROCESO GENERAL DEL LABORATORIO Cada etapa (subproceso) está marcado con el número que lo identifica en el Mapa de Riesgos

15 TRANSPORTE O ENVIO INFORMES

RECEPCIÓN DE RESULTADOS LAB. REFERENCIA

14 IMPRESIÓN INFORMES

18 ARCHIVO

(IMPRESORA / PDF)

DE MUESTRAS

16 DISTRIBUCIÓN DE INFORMES O CAPTURA EN Hª CLÍNICA

17 TOMA DECISIONES CLÍNICAS

INFORME DE INFORME DE RESULTADOS RESULTADOS (PAPEL / VIRTUAL) (PAPEL / VIRTUAL)

Fase post-analítica

Para cada uno de los subprocesos se definen los conceptos que se enumeran a continuación: QUIÉN: Quién o quienes son los responsables de este subproceso. DÓNDE: En qué lugar físico se realiza la tarea. A QUIÉN o A QUÉ: Se añade este epígrafe dado que estos procesos pueden realizarse sobre el paciente, sobre el personal sanitario, sobre la petición analítica o sobre las muestras.

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CUANDO: En qué momento se realizan o deben realizarse. CÓMO: Qué metodología seguir, que conocimientos o habilidades aplicar. RIESGOS POTENCIALES: Según la experiencia del Laboratorio, qué errores se pueden cometer al efectuar cada tarea. Los errores pueden implicar daño al paciente, daño al personal sanitario o daño al Sistema Sanitario (confianza, credibilidad, gasto innecesario). VISIBILIDAD Y RECUPERACIÓN: Por visibilidad se entiende una estimación sobre si el error es fácil o difícilmente detectable por el responsable del subproceso o en etapas posteriores. Con el concepto recuperación estimamos si el error se puede corregir sin daño o molestias al paciente, al personal sanitario o al Sistema. ACTUACIONES DEL LABORATORIO PARA MINIMIZARLOS: Se refiere a las actuaciones y estrategias que empleamos en el laboratorio para intentar minimizar estos riesgos. FRECUENCIA DE APARICIÓN: Según nuestra experiencia con qué frecuencia se producen estos errores. CARACTERISTICAS DE CALIDAD: Son normas que deben cumplir todos y cada uno de los responsables de los subprocesos para minimizar estos errores. INDICADORES: Son medidas realizadas por el laboratorio para estimar la frecuencia de aparición de los mismos y planificar actuaciones y estrategias para evitarlos o disminuir su frecuencia. PUNTUACIÓN FRECUENCIA / SEVERIDAD: Según la norma ISO/TS 22367:2008(E) sobre Reducción de Errores a través de la Gestión de Riesgos y Mejora Continua en los Laboratorios Médicos, es conveniente evaluar los riesgos de cada subproceso con una puntuación de niveles de severidad que relacione frecuencia de aparición con la gravedad de sus efectos. La siguiente tabla muestra dicha puntuación o grado de aceptación.

PROBABILIDAD

Nivel Despreciable

Nivel Menor

Nivel Serio

Nivel Crítico

Nivel Catastrófico

Frecuente

Inaceptable

Probable

Aceptable

Inaceptable

Ocasional

Aceptable

Inaceptable

Remota

Aceptable

Inaceptable

Muy Improbable

Aceptable

Inaceptable

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Capítulo 21. Seguridad en el laboratorio clínico. Prevención de riesgos laborales.

Introducción 21.1. Consideraciones generales sobre seguridad 21.2. Programa de seguridad 21.3. Equipos de seguridad 21.4. Materiales y riesgos químicos 21.5. Agentes y riesgos biológicos 21.6. Riesgos eléctricos 21.7. Riesgos de incendio 21.8. Tratamiento y eliminación de residuos 21.9. Guía de prevención de riesgos biológicos

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INTRODUCCIÓN________________________________________________________________________ Los laboratorios clínicos son instalaciones en las que se trabaja con sustancias químicas y muestras biológicas de diversa peligrosidad. Además, se generan residuos peligrosos que deben eliminarse de forma adecuada para evitar contaminaciones ambientales. En este capítulo se presentan los conceptos principales sobre la seguridad en el laboratorio clínico.

21.1. CONSIDERACIONES GENERALES SOBRE SEGURIDAD_____________________________________________ La seguridad en los laboratorios clínicos es un tema de gran importancia que afecta a todas las personas que trabajan en ellos. Por este motivo, las medidas preventivas son esenciales para impedir los accidentes. Con frecuencia, la causa de algunos de ellos es la inexperiencia, aunque otros muchos se deben a la ignorancia, el cansancio, los descuidos o la dejadez. El Instituto Nacional de Segundad e Higiene en el Trabajo (INSHT), dependiente del Ministerio de Trabajo e Inmigración, publica unas denominadas Notas Técnicas de Prevención (NTP), entre las que se incluyen diversas relacionadas con el trabajo en los laboratorios clínicos. Asimismo, en 1997 se publicó el Real Decreto 664/1997 sobre protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a diversos agentes durante el trabajo. En el contexto europeo se ha publicado la Directiva 2000/54/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 18 de septiembre de 2000, sobre la protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo.

21.2. PROGRAMA DE SEGURIDAD________________________________________________________________ Todos los laboratorios clínicos deben disponer de un programa y un manual de seguridad, ya que todo su personal debe conocer los riesgos que conlleva su trabajo en dichos laboratorios. En ellos se deben señalar las medidas generales para la prevención de riesgos y las condiciones particulares para cada una de las áreas de trabajo y los diferentes riesgos específicos y las medidas a tomar cuando se produzca un accidente. El manual debe revisarse con frecuencia para poner al día todas las acciones relativas a la seguridad. Aunque el responsable final de la seguridad del laboratorio es el director del mismo, debe existir una persona encargada de la seguridad. Una parte importante del programa de seguridad del laboratorio es la formación y motivación de todas las personas que trabajan en el laboratorio clínico sobre los temas de seguridad. Otro aspecto fundamental del programa de seguridad es garantizar que todo el laboratorio satisface los estándares de seguridad aceptados.

21.3. EQUIPOS DE SEGURIDAD___________________________________________________________________ El diseño de los laboratorios clínicos debe tener en cuenta los posibles riesgos que puedan presentarse durante su funcionamiento. Para ello, los arquitectos deben colocar adecuadamente por las instalaciones del laboratorio todos los dispositivos adecuados que contribuyan a la seguridad. Asimismo, los laboratorios clínicos deben disponer de diversos equipos de seguridad adecuados. Entre ellos se encuentra el vestuario, que incluye batas y pijamas, guantes y protectores oculares que han de emplearse en las áreas donde sean necesarios. Asimismo, deben colocarse por el laboratorio lavabos para ojos y manos. También duchas de seguridad, situadas estratégicamente por el laboratorio. Se dispondrá de guantes para manipular el material de vidrio caliente y el hielo seco. También se dispondrá de protectores oculares de diversos tipos y tamaños para adaptarse adecuadamente a todas las personas que trabajan en el laboratorio. Las personas que usen lentes de contacto deben tener especial cuidado cuando manipulen sustancias irritantes. Los laboratorios

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clínicos tendrán una campana de extracción donde manipular los materiales tóxicos o las muestras que contengan agentes infecciosos. Una cantidad importante de las bajas producidas en el personal que trabaja en los laboratorios clínicos se debe a trastornos del sistema musculoesqueléti-co producidos por el trabajo rutinario frente a las pantallas de'los analizadores o los ordenadores. Debe disponerse de las sillas y los taburetes adecuados para evitar en lo posible estas lesiones. Asimismo, hay que evitar los ruidos intensos que puedan producir lesiones.

21.4. MATERIALES Y RIESGOS QUÍMICOS__________________________________________________________ Los laboratorios clínicos emplean sustancias y reactivos sólidos, líquidos y gaseosos de diversa peligrosidad. Los avances tecnológicos y la automatización han conducido a que cada vez se empleen menos sustancias químicas peligrosas al ser sustituidas por reactivos ya preparados y listos para su uso, lo que ha hecho que disminuyan en gran medida los riesgos químicos. Los productos químicos deben almacenarse y utilizarse de forma adecuada para evitar el riesgo de quemaduras, explosiones, fuegos, humos tóxicos, etc. Las salpicaduras de ácidos, materiales cáusticos y agentes oxidantes fuertes probablemente son el mayor peligro para la ropa y los ojos, y son un origen potencial de quemaduras químicas. Cuando se trabaje con soluciones acidas o alcalinas habrá de llevarse gafas de seguridad. Los ácidos fuertes deben diluirse añadiéndolos lentamente al agua mientras se mezcla. No debe añadirse nunca agua sobre un ácido concentrado. Por otra parte, todos ios recipientes con reactivos estarán etiquetados adecuadamente. Conviene señalar, además del nombre del reactivo y su concentración, la fecha de preparación y, si caduca, la de caducidad. Los ácidos fuertes, todas las sustancias cáusticas y los agentes oxidantes fuertes deben dispensarse mediante cualquiera de los dispositivos automáticos señalados en el capítulo 2. En ningún caso se pipeteará con la boca. - SUSTANCIAS VOLÁTILES El uso de disolventes orgánicos en el laboratorio clínico supone un riesgo potencial de fuego, y riesgos para la salud por inhalación de vapores tóxicos o por contacto con la piel. Estos disolventes deben manipularse en una campana de humos. Es esencial que el extractor de la campana esté en perfectas condiciones de funcionamiento, ya que, si no lo estuviera, la campana representaría, más que una protección, un riesgo para los usuarios. La salida de la campana tiene que disponer de un filtro y, cuando haya varias campanas, debe tenerse cuidado de que no estén intercomunicadas. - GASES COMPRIMIDOS Los principales gases que se emplean en los laboratorios clínicos son el oxígeno, el hidrógeno, el nitrógeno, el helio, el dióxido de carbono y, en menor medida, el acetileno y el propano. Estos gases se aplican sobre todo a los analizadores de pH y gases en sangre, las estufas de cultivo, los fotómetros de llama y los espectrómetros de absorción atómica. Las bombonas de gases deben estar bien aseguradas a una pared mediante una cadena para evitar que se caigan, pues si no podrían ocasionar daños materiales o personales, ya que la bombona puede salir despedida como una bala. Ha de comprobarse periódicamente que no haya fugas. Las pequeñas pérdidas de oxígeno o nitrógeno no tienen consecuencias, pero las de hidrógeno, acetileno u otros gases inflamables no pueden tolerarse.

21.5. AGENTES Y RIESGOS BIOLÓGICOS___________________________________________________________ Los laboratorios clínicos procesan especímenes biológicos como sangre, suero, plasma, orina, líquidos de cavidades, etc. potencialmente infecciosos. Los agentes biológicos son aquellos microorganismos, cultivos celulares o endopa-rásitos humanos vivos, o los productos derivados de los mismos, capaces de producir

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enfermedades, alergias o toxicidad. De acuerdo con su riesgo, los agentes biológicos se clasifican en cuatro grupos: Grupo 1. Aquellos que con poca probabilidad causan una enfermedad en el ser humano. Grupo 2. Aquellos que pueden causar una enfermedad en el ser humano y pueden suponer un peligro para los trabajadores, pero que es poco probable que se propaguen a la colectividad y para los que existe profilaxis o tratamiento eficaz. Grupo 3. Aquellos que pueden causar una enfermedad grave en el ser humano y representan un peligro serio para los trabajadores, con riesgo de que se propaguen a la colectividad y para los que existe profilaxis o tratamiento eficaz. Grupo 4. Aquellos que causan una enfermedad grave en el ser humano y suponen un peligro serio para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propaguen a la colectividad y sin que exista profilaxis o tratamiento eficaz. Todos los especímenes biológicos deben manipularse como si fueran infecciosos. Las precauciones tienen que extenderse a todos los especímenes de sangre, suero, plasma, productos sanguíneos, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, semen y secreciones vaginales. Además, cualquier espécimen que contenga trazas visibles de sangre debe manejarse cuidadosamente. Las principales vías de penetración en el organismo son la respiratoria, la digestiva y la parenteral, La exposición a los agentes patógenos puede producirse mediante pinchazos accidentales con agujas hipodérmicas, la difusión de materiales infecciosos por una jeringa o la salpicadura de los mismos en poyatas o suelos, los accidentes de centrífugas y los cortes o arañazos con vidrios contaminados. Cualquier tejido sin fijar, incluidas las extensiones sanguíneas, debe considerarse un material potencialmente infeccioso. Las precauciones al respecto contemplan el uso de barreras adecuadas como guantes, gorros, mascarillas y gafas que eviten el contacto de la piel y las mucosas con los especímenes. Hay que lavarse siempre las manos tras quitarse los guantes y siempre que hayan estado en contacto con sangre u otros líquidos biológicos. Nunca deben reutilizarse los guantes, antes bien, se desecharán en los recipientes adecuados una vez usados. En las áreas de trabajo ha de prohibirse comer, beber, fumar, maquillarse o realizar cualquier operación que pueda poner en contacto con potenciales agentes infecciosos. En 2001, el National Committee for Clinical Laboratory Stand ards (NCCLS) proporcionó las siguientes recomendaciones con relación a los riesgos biológicos: • No pipetear con la boca y no soplar nunca pipetas que contengan material potencialmente infeccioso. • No mezclar este tipo de material burbujeando aire a través del líquido. • Hay que tener y emplear barreras de protección, como guantes, mascarillas, protectores oculares y batas, cuando se extraiga sangre de un paciente y cuando se manipulen todos los especímenes de los pacientes. Esto incluye la separación de los tapones de los tubos. • Lavarse las manos siempre que se cambien los guantes. • Deben utilizarse barreras de protección facial cuando exista la posibilidad de salpicaduras de sangre o de líquidos biológicos. • Evitar el uso de jeringas siempre que se pueda y desechar las agujas en contenedores rígidos, sin manipularlos. • Desechar de forma adecuada todo el material cortante. • Utilizar ropa protectora que sirva de barrera eficaz frente a los materiales potencialmente infecciosos. • Intentar evitar las lesiones accidentales. • Fomentar el lavado frecuente de las manos en el laboratorio. Los trabajadores deben lavárselas siempre que vayan a salir del mismo. • Fomentar el hábito de mantener las manos lejos de la boca, la nariz, los ojos y cualquier otra membrana mucosa. Esto reduce la posibilidad de autoinocu lación. • Minimizar los goteos y las salpicaduras.

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• Descontaminar todas las superficies y los dispositivos reutilizables tras su uso con los desinfectantes adecuados. • No deben utilizarse etiquetas de alarma en los especímenes de los pacientes. • Siempre que sea adecuado, hay que utilizar procedimientos de seguridad biológica de nivel 2. • Antes de centrifugar los tubos, compruébese que no estén rotos- También se ha de comprobar que el interior del recipiente del tubo no tenga signos de erosión o de materia adherida. Y que los amortiguadores de goma no tengan ningún trozo pequeño de vidrio. • Utilizar técnicas de eliminación de residuos biológicos. • No dejar nunca un tubo de desecho o material infectado sin atender o sin marcar. • Periódicamente, limpiar los congeladores para eliminar tubos rotos con especímenes biológicos. Durante la limpieza, hay que emplear guantes de goma y protección respiratoria

21.6. RIESGOS ELÉCTRICOS________________________________________________________________ Los cables eléctricos o las conexiones son una fuente potencial de descargas o de riesgo de incendios. Las descargas eléctricas pueden producir lesiones graves y la muerte. Todos los equipos deben estar conectados a tierra. Nunca deben manipularse los equipos eléctricos y las conexiones con las manos húmedas, ni debe emplearse un equipo eléctrico que haya sido salpicado por líquidos. La inspección regular de los equipos en lo referente a su integridad eléctrica ayuda a reducir daños potenciales, como los derivados de la presencia de interruptores sin tierra cerca de las tuberías del laboratorio.

21.7. RIESGOS DE INCENDIO___________________________________________________________________ Cada laboratorio debe disponer del equipo necesario para apagar o cercar un fuego en el laboratorio, o para apagar el de la ropa de una persona. Es esencial que se acceda fácilmente a las duchas de seguridad. Hay varios tipos de extintores, adecuado cada uno para un tipo de fuego. Todos los trabajadores de los laboratorios han de saber usarlos.

21.8. TRATAMIENTO Y ELIMINACIÓN DE RESIDUOS_______________________________________________ La actividad de los laboratorios clínicos produce una gran cantidad de residuos. La gestión de residuos es un aspecto muy importante de la seguridad de los laboratorios clínicos. Muchos de los residuos que se generan contienen sustancias químicas tóxicas o peligrosas, así como microorganismos. Entre los residuos que generan los laboratorios clínicos se encuentran los residuos generales que no contienen ningún tipo de contaminación específica y que no representan riesgo de infección, los residuos asimilables a los urbanos, los residuos potencialmente infecciosos, los residuos químicos peligrosos y los residuos radiactivos. Cada tipo de residuo debe recogerse en su propio contenedor, sin mezclar residuos de diferente tipo. Asimismo, su eliminación debe realizarse de acuerdo con la legislación sobre esta materia.

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RESIDUOS SANITARIOS. DEFINICIÓN Y CLASIFICACIÓN. Se definen como residuos sanitarios, cualquier sustancia u objeto sólido, pastoso, lÍquido o gaseoso contenidos o no en recipientes, del cual su poseedor se desprenda o tenga intención o la obligación de desprenderse, generados por actividades sanitarias. El Decreto 204/94 de Residuos Sanitarios, de la Comunidad de Castilla y León, establece la siguiente clasificación para los residuos de origen sanitario:

Clasificación de Residuos Sanitarios en La Comunidad de Castilla y León Peligrosidad

Clase

SÍ

III

SÍ

Descripción Residuos asimilables a urbanos: papel, cartón, comida, vidrio, mobiliario, restos de jardinería. Residuos sanitarios no especificos: producidos de la actividad sanitaria y no incluidos dentro del grupo III. - Residuos sanitarios especiales: - Residuos de pacientes con infecciones altamente virulentas, erradicadas, importadas o de muy baja incidencia en España*. - Residuos anatómicos. - Sangre y hemoderivados en forma líquida. - Vacunas de virus atenuados. - Residuos punzantes o cortantes. Residuos tipificados en normativas especifícas. - Residuos citostáticos. - Residuos químicos. - Medicamentos caducados. - Aceites minerales y residuales. - Residuos radioactivos, etc..

(*) Sólo pacientes infectados por alguna de las siguientes enfermedades: Cólera, Fiebre hemorragica causada por virus, Brucelosis, Difteria, Meningitis-encefalitis, Fiebre Q. Hepatitis vírica, Tuberculosis activa, Tularemia, Tifus abdominal, Lepra, Ántrax, Fiebre paratifoidea A, B y C., Peste, Poliomielitis, Disentería bacteriana, Rabia y Sida.

Responsabilidades de los centros productores. Los Centros Sanitarios, como centros productores, tienen las siguientes responsabilidades en la gestión de los residuos: -

Correcta selección y segregación de los residuos. Correcto envasado. Transporte interno con garantías de seguridad. Almacenamiento de los residuos en el Centro en las debidas condiciones. Organización documental: Documentos de Control y Seguimiento y de Documentos de Aceptación.

Correcta selección y segregación de los residuos. Para conseguir una correcta segregación de los residuos en origen, basta con conocer y comprender la clasificación de los residuos mostrada anteriormente.

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De esta clasificación genérica de los residuos sanitarios se desprende que, dada la actividad específica de los Centros Sanitarios, la clasificación de residuos sanitarios generados es la siguiente:

GRUPO GRUPO I ASIMILABLES A URBANOS (bolsa negra) GRUPO II SANITARIOS NO ESPECÍFICOS (bolsa verde) GRUPO III SANITARIOS ESPECIALES (contenedor rígido)

GRUPO IV QUÍMICOS GRUPO IV CITOSTATICOS

COMPOSICIÓN

PROCEDENCIA

Productos de limpieza, papel, cartón, vidrio, restos de comida, etc.

Consulta, despachos, WC, habitaciones, almacén, comedor, vestuarios

Sondas, bolsas de orina vacias, bolsas de sangre vacías, vendas, compresas, empapadores, algodón, gasas, envases de sueros, viales, y en general todo material en contacto con pacientes no infecciosos. Residuos por asistencia a pacientes infecciosos*, vacunas vivas o atenuadas, sangre y hemoderivados (en cantidades mayores de 100 mL., agujas de sutura, objetos cortantes y punzantes.

Salas de curas, despertar y exploración, office/enfermería, zona sucia, hemodíálisis, etc.

Disolventes, medicamentos caducados, residuos líquidos (fijador, revelador), etc. Restos de medicación, agujas, jeringuillas, mascarilla, guantes, etc.

Boxes (UCI, Urgencias), Hemodiálisis, Salas de Autopsias, LABORATORIOS de Bioquímica, Hematología, Anatomía Patológica y Microbiología, etc. Anatomía Patológica, Laboratorios, Farmacia etc. Farmacia, Oncología, Hospital de día

Esta clasificación marca las pautas generales a seguir para conseguir una correcta segregación. No obstante, excepcionalmente podrían producirse residuos sanitarios de cualquiera de las otras clases señaladas que deberán ser gestionados adecuadamente. Los residuos de Clase I y II, son residuos no peligrosos que no necesitan un tratamiento especial antes de ser eliminados. Una vez estos residuos son introducidos en bolsas (bolsa negra, clase I y bolsa verde, clase II) pueden ser eliminados como basura común. Los Residuos Sanitarios Especiales (Clase III) son residuos peligrosos, y como tal, deben ser sometidos a un tratamiento específico previo a su eliminación. La peligrosidad del residuo de Clase III se basa en su carácter potencialmente infeccioso. Para eliminar esta peligrosidad, el residuo retirado del Centro Sanitario es previamente tratado mediante esterilización en autoclave para después ser llevado a vertedero. Este proceso garantiza la destrucción de toda forma de vida, ya sea fúngica, vírica o bacteriana, así como de las esporas y demás propágulos presentes. En ocasiones, el Decreto que rige la clasificación puede presentar ambigüedades debido a la particularidad del residuo. En estos casos, seguiremos el criterio técnico y el sentido común del profesional sanitario. Siempre hay que tener en cuenta que, ante la duda de si un residuo es peligroso o no, deberemos clasificarlo como peligroso. Habitualmente, la clasificación de los residuos sanitarios en los Centros Sanitarios es bastante sencilla. El mayor volumen de residuos sanitarios generados pertenece a las Clases I y II, que no son residuos peligrosos, siendo los residuos de Clase III en su gran mayoría objetos cortantes y punzantes.

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Cabe destacar que, si bien es muy grave eliminar un residuo de Clase III (Ej.: una aguja) en un contenedor de Clase II, también hay que evitar hacerlo a la inversa. No debemos "sobreproteger" nuestra actividad clasificadora de los residuos. El Decreto 204/94 está basado en directrices técnicas de la UE que nos garantizan que no hay riesgo para la salud pública o el medio ambiente si seguimos sus criterios de clasificación. Residuos Sanitarios Especiales (Clase III) El residuo Sanitario Especial (Clase III) más común que vamos a encontrar en las actividades sanitarias de los Centros Sanitarios serán los residuos cortantes y punzantes. Este grupo de residuos no plantea grandes problemas para su identificación, ya que no tenemos que evaluar si proviene de asistencia a un paciente infeccioso*. Dentro de este grupo se incluirán: -

Agujas de inyecciones. Agujas de sutura. Hojas de bisturí, cuchillas de rasuramiento, etc. Lancetas. Cualquier otro residuo cortante y/o punzante.

Para este tipo de residuo, existen unos contenedores rígidos de color amarillo y de diversos tamaños especialmente diseñados y homologados para contener residuos de este grupo. Llevaran el logotipo de “residuos de riesgo”.

Siempre utilizaremos este tipo de contenedor para la eliminación de los residuos cortantes y punzantes, y no otro. Otro residuo Sanitario Especial habitual son las vacunas, vivas o atenuadas, así como los envases que las contienen (viales). Para el resto de residuos sanitarios peligrosos, excepto para objetos cortantes y punzantes, existen los contenedores de 30 y 60 litros, que también tienen un cierre temporal y otro definitivo.

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«Seguir instrucciones del fabricante del contenedor para garantizar que su transporte y manipulación se hace con completa seguridad.» Transporte interno con garantías de seguridad. La premisa básica para que el transporte dentro del centro se pueda efectuar sin riesgos, es que los contenedores estén correctamente cerrados de forma definitiva. El transporte de contenedores con residuos peligrosos debe ser llevado a cabo sólo por personal autorizado que conozca las medidas de emergencia necesarias para actuar en caso de derrame accidental. Debemos evitar que el transporte de los residuos se efectúe por zonas de paso públicas o donde puedan haber alimentos. En ningún caso podrán ser almacenados en ningún lugar intermedio que no sea el almacén de residuos peligrosos homologado a tal fin en cada centro. Los contenedores disponen de unas asas para el transporte que siempre se deberán utilizar. Nunca se acercarán los contenedores al cuerpo.

Almacenamiento de los residuos en el centro en las debidas condiciones Todos los Centros de Atención Especializada deben poseer un lugar destinado para el almacenamiento de residuos peligrosos, que cumpla con las debidas condiciones de seguridad marcadas por la legislación. El almacén debe estar siempre cerrado y el acceso al mismo limitado sólo a personal autorizado. De igual forma, debe estar correctamente señalizado externamente. Hay que evitar apilamientos de contenedores inestables que puedan provocar desprendimientos y caídas de los mismos. Nunca hay que dar lugar a que el almacén esté excesivamente lleno (más de las ¾ partes del mismo), por lo que habrá que avisar con suficiente antelación al gestor autorizado para la recogida de los residuos. Nunca almacenaremos temporalmente residuos peligrosos en lugares del centro que no estén destinados para tal fin (pasillos, salas, etc.). Una vez que el contenedor esté lleno y debidamente cerrado, hay que transportarlo al almacén de residuos peligrosos. Los contenedores deben se estar debidamente etiquetados, de forma que se pueda identificar su contenido en todo momento.

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Organización documental: Documentos de Control y Seguimiento y de Documentos de Aceptación. La normativa exige, a todos los agentes implicados en la gestión de residuos peligrosos, una organización documental que permita una trazabilidad total de los residuos desde su producción hasta su eliminación. Los Centros Sanitarios, como productores, tienen la obligación de tener a disposición de la Autoridad Laboral los Documentos de Control y Seguimiento y los Documentos de Aceptación. El Documento de Control y Seguimiento (D.C.S.) es un registro oficial de la Comunidad Autónoma de Castilla y León, en el que quedan perfectamente identificados todos los agentes implicados en la gestión (interna y externa) del residuo peligroso, así como la cantidad y tipología del mismo manejado en cada momento. Este documento debe conservarse durante un periodo mínimo de 5 años. El Documento de Aceptación es emitido por el Gestor Autorizado, y en él se identifican claramente el Centro Productor, el Centro Gestor Autorizado y el tipo de residuo que se autoriza a retirar. Ambos documentos deben estar perfectamente archivados y localizados para poder ser consultados en cualquier momento.

Gestión externa de los residuos sanitarios peligrosos La gestión externa de los residuos sanitarios peligrosos comprende una serie de procesos muy controlados por la Administración. Podemos clasificar estos procesos en: - Transporte por carretera: El transporte de los residuos peligrosos por carretera está regulado por el ADR (Acuerdo Europeo para el Transporte de Mercancías Peligrosas por Carretera). Todos los Estados miembros de la UE se rigen por este reglamento que impone una serie de normas comunes a cumplir, como son: - Etiquetado de residuos, - Homologación de vehículos, - Señalización y seguridad, - Homologación de envases - Documentación - Tratamiento de los residuos sanitarios: esterilización en autoclave. Para comprobar la eficacia del proceso existen pruebas físicas, químicas y biológicas realizadas por personal cualificado. - Eliminación: una vez que los residuos biosanitarios han sido esterilizados, estos pasan a considerarse no peligrosos y son depositados en un vertedero autorizado.

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21.9. GUÍA DE PREVENCIÓN DE RIESGOS BIOLÓGICOS______________________________________ INTRODUCCION. El R.D. 664/1997, de 12 de mayo, sobre protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo, define a dichos agentes como "microorganismos, con inclusión de los genéticamente modificados, cultivos celulares y endoparásitos, susceptibles de originar cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad". En el medio sanitario, el riesgo biológico es el que más frecuentemente encontramos, siendo los profesionales más expuestos el personal sanitario que presta asistencia directa a los enfermos, el personal de laboratorio que procesa muestras contaminadas o posiblemente contaminadas y el personal que trabaja con animales o con derivados de éstos. En la actualidad, de entre las enfermedades infecciosas a las que están expuestos los profesionales sanitarios, destacan aquellas de etiología vírica como la Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis Delta y el SIDA, sin olvidar otros virus y enfermedades producidas por otros microorganismos (tétanos, TBC, legionelosis, fiebre Q, rubeola, ... ).

VIAS DE ENTRADA DE LOS AGENTES BIOLOGICOS Las principales vías de entrada de los diferentes microorganismos son: -VIA RESPIRATORIA. Por inhalación de aerosoles en el medio de trabajo, que son producidos por la centrifugación de muestras, agitación de tubos, aspiración de secreciones, toses, estornudos, etc. -VÍA DIGESTIVA (FECAL - ORAL). Por ingestión accidental, al pipetear con la boca, al comer, beber o fumar en el lugar de trabajo, etc. -VIA SANGUÍNEA, POR PIEL O MUCOSAS. Como consecuencia de pinchazos, mordeduras, cortes, erosiones, salpicaduras, etc. -AGENTES BIOLÓGICOS Y AIRE INTERIOR. - Los microorganismos más preocupantes del aire interior son las bacterias, los virus y los hongos, aunque sin olvidar a los ácaros de polvo, susceptibles todos ellos de generar infecciones en el ser humano. - Otra fuente importante son los humidificadores que, a causa de un deficiente mantenimiento pueden producir la llamada "fiebre del humidificador". También los sistemas de agua y torres de refrigeración pueden propagar la legionella. - Ciertos microorganismos pueden producir metabolitos tóxicos o irritantes y las esporas fúngicas producen alergias y reacciones de hipersensibilidad.

ESTRATEGIAS PREVENTIVAS. La Ley de Prevención de Riesgos Laborales (Ley 31/1995, de 8 de noviembre), en su artículo 14 convierte al empresario y a las Administraciones Públicas respecto del personal a su servicio, en el garante de la Seguridad y la Salud de los trabajadores. En esta línea, deberá adoptar cuantas medidas sean necesarias para la protección permanente de estas condiciones de seguridad y salud.

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En lo que respecta a la protección de los trabajadores frente a los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo, la obligación genérica del empresario de garantizar la seguridad y la salud de los trabajadores, se materializa en una norma legal, el R.D. 664/1997, de 12 de mayo, donde se establecen una serie de obligaciones a cumplir por el empresario. Por tanto, la mejor estrategia preventiva que tenemos a nuestro alcance es el adecuado cumplimiento por parte del empresario del texto de este Real Decreto. Otro aspecto importante es inculcar a los trabajadores la necesidad de notificar a Medicina Preventiva, al Servicio de Prevención o, en su defecto, al responsable inmediato, todos y cada uno de los accidentes que se produzcan, así como conseguir que estos Servicios encargados de la actividad preventiva, se encuentren operativos las 24 horas del día, ya que el accidente biológico puede precisar de tratamiento inmediato y puede ocurrir en cualquier momento. Otro pilar fundamental donde se asienta la consecución de unos adecuados niveles de seguridad y salud en lo que a la exposición a agentes biológicos se refiere, lo constituye el cumplimiento de las Precauciones Universales o estándar y de las recomendaciones específicas por áreas o unidades; es fundamental la elaboración y adecuada difusión de protocolos preventivos y la actuación ante situaciones especificas.

ESTRATEGIAS GENERALES DE PREVENCION

Debemos tener en cuenta que el mayor número de accidentes laborales con material biológico se producen en el colectivo de enfermería y más concretamente en las áreas quirúrgicas y médicas, seguido de los laboratorios y servicios de extracciones. El 89% de las exposiciones accidentales son inoculaciones percutáneas de las cuales el 87% son pinchazos. El pinchazo es el accidente más frecuente, quizás debido a la costumbre de reencapsular las agujas o por no disponer de un sistema de eliminación de residuos adecuado con el suficiente número de contenedores rígidos; por este motivo, seria conveniente implantar en todos los centros sanitarios la utilización de material punzante que se autoprotege una vez utilizado. Las actividades con mayor riesgo de accidente son la administración de medicación IM/IV, la recogida de material usado, la manipulación de sangre, reencapsular, suturar, las agujas abandonadas y la recogida de basura. Hay que tener en cuenta que la mayoría de los accidentes de este tipo no se notifican a los Servicios de Prevención o de Medicina Preventiva, por lo que los datos podrían ser aún más alarmantes si existiese un adecuado registro de accidentes. Las estrategias generales de prevención se basan en el establecimiento de una serie de barreras: a) BARRERAS FISICAS: Guantes, mascarillas, gafas, batas y cualquier otro Equipo de Protección Individual. b) BARRERAS QUIMICAS: Desinfectantes como hipociorito sódico, formaldehido, glutaraldehido, Nduopropenida, povidona yodada, gluconato de ciorhexidina, etc., así como biocidas en la limpieza de conductos de aire. c) PRECAUCIONES UNIVERSALES y códigos de buena práctica. d) BARRERAS BIOLOGICAS: Vacunas, inmunoglobulinas y quimioprofilaxis.

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PRECAUCIONES UNIVERSALES O ESTÁNDAR.

Se basan en que el riesgo de transmisión de un agente biológico en el medio sanitario es debido a la inoculación accidental con sangre de la persona infectada. Como resulta imposible identificar a todas las personas se recomienda considerar a todos los pacientes como potencialmente infecciosos. Además, el riesgo de infección va a ser proporcional a la prevalencia de la enfermedad en la población asistida y a la probabilidad de producción de accidentes durante la realización de los procedimientos. a) Vacunación de la Hepatitis B de todo el personal sanitario. b) Normas de higiene personal. - Cubrir cortes y heridas con apósitos impermeables. - Cubrir lesiones cutáneas con guantes. - Retirar anillos y otras joyas. - Lavado de manos antes y después de atender al paciente. c) Elementos de protección de barrera. - Uso de guantes al manejar sangre o fluidos corporales, objetos potencialmente infectados o al realizar procedimientos invasivos. - Utilización de mascarillas cuando se prevea la producción de salpicaduras de sangre o fluidos a la mucosa nasal u oral. - Protección ocular, cuando se prevea la producción de salpicaduras de sangre o fluidos corporales a la mucosa ocular. - Utilización de batas y delantales impermeables, cuando se prevea la producción de grandes volúmenes de salpicaduras de sangre o líquidos orgánicos. d) Manejo de objetos cortantes o punzantes. - Extremo cuidado. - No reencapsular las agujas. - Eliminación en contenedores rígidos de seguridad. - No dejarlos abandonados en cualquier sitio. - Comprobar que no van entre ropas que se envían a lavandería. e) Señalización de muestras ya que todas deben considerarse potencialmente infectadas. f) Aislamiento, si el enfermo presenta: - Hemorragia incontrolada. - Alteraciones importantes de la conducta. - Diarrea profusa. - Procesos infecciosos que exijan aislamiento (por ejemplo tuberculosis). g) Eliminación adecuada de los residuos. h ) Esterilización y desinfección. Preferiblemente, debemos utilizar material de un solo uso. Si esto no es posible, los objetos deben esterilizarse entre paciente y paciente, siendo limpiados previamente para eliminar restos de sangre u otras sustancias, para posteriormente ser aclarados antes de su desinfección o esterilización. Todos estos procedimientos deben realizarse con guantes resistentes.

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ACTUACIÓN ANTE SALPICADURAS O VERTIDOS DE SANGRE O FLUIDOS SOBRE SUPERFICIES U OBJETOS. - Colocarse guantes resistentes. - Verter lejía diluida al 10% sobre la superficie contaminada. - Limpiar la superficie con toallas desechables. - Quitarse los guantes y lavarse las manos.

PROTOCOLO DE ACTUACIÓN ANTE EXPOSICIONES ACCIDENTALES A SANGRE. - ACCIDENTES PERCUTANEOS (CORTES, PINCHAZOS ... ). - Retirar el objeto con el que se ha producido el accidente. - Limpiar la herida con agua corriente, sin restregar, dejando fluir la sangre durante 2-3 minutos, induciendo el sangrado si es preciso. - Desinfectar la herida con povidona yodada u otro desinfectante, y aclararla bien. - Cubrir la herida con apósito impermeable. - SALPICADURAS DE SANGRE O FLUIDOS A PIEL. - Lavado con jabón y agua. - SALPICADURAS DE SANGRE O FLUIDOS A MUCOSAS. - Lavado inmediato con agua abundante.

IMPORTANTE. - Todos los accidentes deberán ser comunicados al servicio o unidad designada para registrarlos, aplicando en cada caso el protocolo de procedimiento del centro. - Al personal expuesto accidentalmente al VHB, se le debe ofrecer profilaxis post-exposición. - Al personal expuesto al VHC, debe ofrecérsele profilaxis con gammaglobulina inespecífica. - A pesar de no haberse demostrado la eficacia del tratamiento con zidovudina (ZDV) para prevenir la infección por VIH tras accidente laboral, la decisión de realizar este tratamiento debe ser individualizada, por lo que debe estar disponible a cualquier hora del día en los centros de trabajo.

RECOMENDACIONES ESPECÍFICAS PARA LABORATORIO CLÍNICO PERSONAL DE LABORATORIO. a) Adoptar las precauciones estándar. b) La zona de trabajo estará perfectamente delimitada. c) La manipulación de cualquier muestra se realizará siempre con guantes. d) Todas las muestras deben ser transportadas en recipientes con tapa segura que impida la salida de líquidos.

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e) Todos los procedimientos y manipulaciones deben realizarse cuidadosamente para evitar la formación de gotas y aerosoles. Deben utilizarse cabinas de seguridad biológica (I y II) en procedimientos de homogeneización y mezcla vigorosa. f) Si se rompen los tubos en la centrifuga, esperar 5 minutos antes de abrir la tapa para evitar aerosoles. Desinfectar las cestillas y paredes de la cámara con lejía en disolución 1/10 u otro desinfectante efectivo por inmersión durante 10 minutos. Desinfectar las superficies de trabajo cuando se derramen muestras. g) No pipetear con la boca. Usar sistemas mecánicos. h) Restringir al máximo el uso de agujas y jeringas. Desechar las jeringas y agujas de un sólo uso en contenedores sólidos especiales, sin reencapsular. i) Todos los materiales y equipos científicos potencialmente contaminados deben descontaminarse preferiblemente por esterilización, antes de ser reutilizados, reparados o transportados. j) No comer, beber o fumar en el lugar de trabajo. No aplicarse cosméticos. k) Todo el personal debe lavarse las manos después de su actividad, antes de dejar el laboratorio y al quitarse la bata. Usar ropa exclusivamente para el laboratorio. i) Se recomienda la vacunación antihepatitis B.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. ______________________________________________________________________________________ 1.- El vehículo más importante de transmisión ocupacional es la sangre y sus derivados. 2.- El profesional con mayor riesgo es aquél que está expuesto a un accidente con aguja hueca. (Más de la mitad de los accidentes biológicos los sufren los/as enfermeros/as). - Adoptar las precauciones universales. 3.- Todos los pacientes deben considerarse potencialmente infecciosos. 4.- El empresario debe cumplir las obligaciones recogidas en el R.D. 664/1997 y entre ellas: - Identificación y evaluación de los riesgos. - Adecuada recepción, manipulación y transporte de los agentes biológicos y de sus residuos. - Protección colectiva e individual. - Establecimiento de adecuadas medidas higiénicas (aseos adecuados, fuentes, botiquín de primeros auxilios, almacenamiento de los equipos de protección, facilitar ropas de trabajo así como su lavado y desinfección, descontar de la jornada laboral el tiempo para el aseo, etc.) - Vigilancia de la salud de los trabajadores mediante la realización de reconocimientos médicos específicos previos a la exposición y periódicos. - Conservar la documentación. - Formar e informar a todos los trabajadores sobre los riesgos a los que están expuestos y sus medidas de prevención. 5.- La vacunación antihepatitis B debe realizarse a todos los trabajadores sanitarios. 6.- El lavado de manos es importantísimo para controlar las infecciones en el medio sanitario.

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7.- No efectuar ninguna técnica invasiva sin equiparse con guantes estériles apropiados. 8.- Antes de comenzar el trabajo diario, deben cubrirse las lesiones cutáneas, los cortes y las heridas. 9.- Es necesaria la implantación y difusión de una adecuada política de gestión de residuos. Los objetos punzantes y cortantes deben eliminarse en contenedores rígidos de bioseguridad. 10.- No reencapsular las agujas. Seria conveniente la utilización de material punzante que se autoprotege una vez utilizado. 11.- Utilización de una señal de peligro biológico. 12.- Asegurar la calidad del aire interior y el buen estado de las conducciones de agua, mediante la revisión y el mantenimiento preventivo de las instalaciones. 13.- Los servicios de prevención o de medicina preventiva deben garantizar de manera efectiva la asistencia inmediata a cualquier trabajador sanitario accidentado durante las 24 horas del día. 14.- Debe implantarse un adecuado sistema de notificación y registro de accidentes que sea conocido por todos los trabajadores. 15.- Tras cualquier exposición accidental, aplicar inmediatamente medidas de arrastre del contaminante, tratamiento local y acudir al servicio de prevención para su tratamiento y registro. ______________________________________________________________________________________

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Prevención de riesgos laborales. Recomendaciones y Actuaciones

1) Normas de higiene personal. - Cubrir cortes y heridas con apósitos impermeables. - Cubrir lesiones cutáneas con guantes. - Todo el personal debe lavarse las manos después de su actividad, antes de dejar el laboratorio y al quitarse la bata. Las manos se secaran con toallas de papel desechables o corriente de aire. Usar ropa exclusivamente para el laboratorio. 2) Toma de muestras. Uso de sistemas de extracción con mecanismos de seguridad para evitar pinchazos. La toma se realizará usando guantes. 3) Transporte de muestras. Todas las muestras deben ser transportadas en recipientes con tapa segura que impida la salida de líquidos. 4) Manipulación de muestras: se realizará siempre con guantes. Todos los procedimientos y manipulaciones deben realizarse cuidadosamente para evitar la formación de gotas y aerosoles. Desinfectar las superficies de trabajo cuando se derramen muestras. «Todo fluido orgánico debe considerarse potencialmente infeccioso». 5) Medidas de protección. Utilización de guantes. Utilización de mascarillas cuando se prevea la producción de salpicaduras de sangre o fluidos a la mucosa nasal u oral. Protección ocular con gafas cuando se prevea la producción de salpicaduras de sangre o fluidos corporales a la mucosa ocular. Deben utilizarse cabinas de seguridad biológica en procedimientos de homogeneización y mezcla vigorosa. 6) Procedimiento de descontaminación de centrífuga en caso de rotura. Si se rompen los tubos en la centrifuga, esperar 5 minutos antes de abrir la tapa para evitar aerosoles. Desinfectar las cestillas y paredes de la cámara con lejía en disolución 1/10 u otro desinfectante efectivo por inmersión durante 10 minutos. 7) Uso de instrumental. No pipetear con la boca. Usar sistemas mecánicos. 8) Manejo de objetos cortantes o punzantes. - Cuidado extremo - No reencapsular las agujas. - Eliminación en contenedores rígidos de seguridad. - No dejarlos abandonados en cualquier sitio. - Comprobar que no van entre ropas que se envían a lavandería. 9) Eliminación de resíduos. Emplear medios seguros en la recogida, almacenamiento y evacuación de los residuos, planificando el número y el lugar de colocación de forma que sean fácilmente accesibles, en número suficiente y no estén en lugares de paso. 10) Otras actividades. No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en el lugar de trabajo. 11) Inmunización activa: Se recomienda la vacunación antihepatitis B. 12) Productos químicos. Minimizar la exposición. No infravalorar los riesgos. Interpretación de las etiquetas indicativas del riesgo. Manipularlos en zonas bien ventiladas. Nunca pipetear con la boca, emplear dispositivos manuales o automáticos de pipeteo. Protegerse con guantes, gafas, mascarillas o cabina extractora si fuera necesario. Después de su uso, cerrar perfectamente el envase contenedor y lavarse las manos. Almacenarlos evitando posibles caidas, derrames, roturas o emanaciones.

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ACTUACIÓN ANTE SALPICADURAS O VERTIDOS DE SANGRE O FLUIDOS SOBRE SUPERFICIES U OBJETOS: - Colocarse guantes resistentes. - Verter lejía diluida al 10% sobre la superficie contaminada. - Limpiar la superficie con toallas desechables. - Quitarse los guantes y lavarse las manos. ACTUACIÓN ANTE EXPOSICIONES ACCIDENTALES A SANGRE O FLUIDOS BIOLÓGICOS: • ACCIDENTES PERCUTANEOS (CORTES, PINCHAZOS ... ): - Retirar el objeto con el que se ha producido el accidente. - Limpiar la herida con agua corriente, sin restregar, dejando fluir la sangre durante 2-3 minutos, induciendo el sangrado si es preciso. - Desinfectar la herida con clorhexidina u otro desinfectante y aclararla bien. - Cubrir la herida con apósito impermeable. • SALPICADURAS DE SANGRE O FLUIDOS A PIEL: - Lavado con jabón y agua.

• SALPICADURAS DE SANGRE O FLUIDOS A MUCOSAS: Lavado inmediato con agua abundante.

ACTUACIÓN ANTE EXPOSICIONES ACCIDENTALES A REACTIVOS QUÍMICOS: - Si se producen salpicaduras en los ojos, lávese inmediatamente con agua abundante. - Seguir las instrucciones que figuran en las FICHAS DE DATOS DE SEGURIDAD (FDS) DE LOS REACTIVOS Y AGENTES QUÍMICOS que se utilizan en el laboratorio. OTRAS ACTUACIONES - Si fuera necesario, acudir a la unidad de urgencias. - Todos los accidentes deberán ser comunicados al servicio o unidad designada para registrarlos, aplicando en cada caso el protocolo de procedimiento del centro. - Al personal expuesto accidentalmente al VHB, se le debe ofrecer profilaxis post-exposición. - Al personal expuesto al VHC, debe ofrecérsele profilaxis con gammaglobulina inespecífica. - A pesar de no haberse demostrado la eficacia del tratamiento con zidovudina (ZDV) para prevenir la infección por VIH tras accidente laboral, la decisión de realizar este tratamiento debe ser individualizada, por lo que debe estar disponible a cualquier hora del día en los centros de trabajo.

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Anexo I. La protección de datos de carácter personal Ley Orgánica 15/99 de 13 de Diciembre

Los puestos de trabajo estarán bajo la responsabilidad del usuario autorizado que garantizará que la información que muestran no pueda ser visible por personas no autorizadas. Esto supone que tanto las pantallas como las impresoras u otro tipo de dispositivos conectados al puesto de trabajo deberán estar físicamente ubicados en lugares que garanticen esa confidencialidad, lo que implica que cuando el responsable de un puesto de trabajo lo abandone, bien temporalmente o bien al finalizar su turno de trabajo, deberá dejarlo en un estado que impida la visualización de los datos protegidos. Esto podrá realizarse a través de un protector de pantalla que impida la visualización de los datos. La reanudación del trabajo implicará la desactivación de la pantalla protectora con la introducción de la contraseña o código de usuario correspondiente. El código de usuario y la contraseña son estrictamente personales y secretas; nunca deben dejarse escritas en ningún tipo de soporte informático o en papel, ni cederse a otros usuarios. En caso de sospechar que nuestra contraseña es conocida por otras personas, se deberá cambiar inmediatamente y comunicar la incidencia. La contraseña debe modificarse con periodicidad. Aunque la aplicación lo permita, no deben utilizarse contraseñas antiguas ya utilizadas. Tampoco es recomendable establecer patrones de contraseñas como: Pedr01, Pedr02, Pedr03... Nadie debe de trabajar en el sistema con una contraseña o código de usuario que no sea el suyo. El sistema guarda trazabilidad (capacidad para reconstruir, mediante registros, la historia de los procesos aplicados para llegar al resultado final) de todas las intervenciones realizadas por cada uno de los usuarios. Hay que evitar imprimir o realizar fotocopias de documentos que contengan datos confidenciales a menos que sea imprescindible. Nunca se deben tirar resultados de análisis, informes, pruebas, formularios de petición analítica, etc. que contengan datos de pacientes a la papelera o a contenedores para reciclaje de papel. Únicamente se deben utilizar los programas facilitados por SACyL y en ningún caso deben instalarse ni usarse, programas ilegales o sin licencia. Si necesitas instalar un programa para tu trabajo, habla con el Servicio de Informática. El software antivirus debe estar habilitado permanentemente (ventana inferior derecha junto a reloj) protegiendo al sistema de virus, gusanos, troyanos,... Si se detecta que el antivirus se ha deshabilitado, debe hablarse inmediatamente con el Servicio de Informática. No se debe utilizar ningún soporte informático que provenga de fuera del ámbito del trabajo. Tampoco Cd's, discos portátiles, reproductores MP3, etc. Está prohibida la introducción en el Centro de portátiles, Pda's o cualquier equipo informático, y en especial su conexión a la red sin permiso.

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Hay que mantener el secreto profesional y no divulgar información de datos, documentos, metodología, claves o cualquier otra información referida al Sistema de Seguridad de los Datos. No entregar los datos por teléfono, fax (si no existe consentimiento previo por escrito), o vía telemática (cuando esta no sea segura), como correo electrónico, etc. Sólo está permitida, ocasionalmente, la comunicación telefónica de resultados del facultativo del laboratorio al facultativo clínico debidamente identificado. Si se comunican urgentemente resultados críticos o marcadamente patológicos por fax, se avisará previamente de su envío al personal debidamente autorizado para recibir dicha información del correspondiente centro de salud donde esté ubicado el dispositivo, con objeto de que esté preparado delante del mismo para recoger inmediatamente el impreso que se va a enviar según lo imprima el fax. Se tomará nota de la persona que va a recibir dicho informe y se anotará junto con la hora y el responsable del envío del laboratorio en el libro de registro correspondiente (comunicación urgente de valores críticos). No entregar resultados a familiares o conocidos de pacientes. Los resultados se entregarán al propio paciente debidamente identificado (DNI), al facultativo solicitante o a personal debidamente autorizado para su recogida. Cualquier usuario que tenga conocimiento de una incidencia es responsable de la comunicación de la misma. Deben comunicarse las incidencias para conocer de forma objetiva en qué puntos se está fallando. El conocimiento y la no notificación de una incidencia por parte de un usuario sera considerado como una falta contra la seguridad de los datos. Una incidencia es cualquier anomalía que afecte o pudiera afectar a la seguridad de los datos, provocando su pérdida, destrucción, alteración o acceso no autorizado (imposibilidad de entrada en la aplicación, problemas con código de usuario y contraseñas, error en los datos, error en la realización de la copia de seguridad..., etc).

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Anexo II. Evaluación de competencias Competencia: característica de una persona, ya sea innata (habilidades y calidades) o adquirida (conocimientos y experiencia), que está relacionada con una actuación de éxito en un puesto de trabajo. Las competencias profesionales se han clasificado en competencias técnicas y sociales. Las competencias técnicas aparecen desglosadas en el saber hacer y en el saber; y las competencias sociales en el saber estar. Este conjunto de “saberes” constituyen las tres dimensiones más simples y clásicas de la competencia profesional. La dimensión relacionada con el saber hacer aparece explicitada en forma de actividades profesionales que subyacen en las realizaciones profesionales y criterios de realización. La dimensión de la competencia relacionada con el saber, comprende el conjunto de conocimientos de carácter técnico sobre conceptos y procedimientos. En cuanto a la dimensión de la competencia relacionada con el saber estar, se han extraído en forma de capacidades de tipo actitudinal.

Técnico del Laboratorio General

Competencias en el Saber y en el Saber Hacer Fase Preanalítica Conoce el catálogo de pruebas que va a realizar en su área de trabajo Conoce los diferentes tipos de contenedores de muestras que se utilizan en el laboratorio Conoce el tipo de muestra necesario para la realización de las pruebas Conoce el sistema de identificación-numeración de peticiones y de muestras Sabe reconocer cuando una muestra no es adecuada y como proceder Conoce el proceso de centrifugación de muestras Sabe hacer alícuotas e identificar tubos Sabe el sistema de conservación y almacenamiento de muestras Sabe buscar una muestra en el archivo Conoce el sistema de adecuación de la muestra tras su descongelación Conoce el proceso de envío de muestras para laboratorios externos

Fase Analítica Conoce el funcionamiento básico de los analizadores de su área de trabajo Sabe hacer las tareas de mantenimiento programadas Sabe preparar los reactivos, cuándo, su estabilidad, su caducidad y el número de determinaciones que pueden realizar Conoce el sistema de pedidos de material y reactivos y su periodicidad Conoce las soluciones de calibración que tiene que utilizar, su preparación, su estabilidad y conservación Sabe realizar las tareas de calibración de las técnicas analíticas asignadas Sabe reconocer cuando una calibración no es correcta y como proceder Sabe como buscar resultados de calibración en la pantalla del analizador Conoce las soluciones de control de calidad que tiene que utilizar, su preparación, su estabilidad y conserv.

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Sabe como solicitar los controles de calidad de las técnicas analíticas asignadas y su frecuencia Conoce los valores de los límites de los controles, cuando están fuera de rango y como proceder Sabe como buscar resultados de control de calidad en la pantalla del analizador Sabe procesar el control de calidad analítico externo, las pruebas a realizar y su periodicidad Sabe diferenciar lo que es un tubo primario de una alícuota Sabe posicionar correctamente las muestras en el analizador Sabe pedir manualmente pruebas al analizador Conoce los avisos y alarmas que dan los analizadores referentes a resultados y a funcionamiento Sabe como y con qué hacer diluciones y el concepto de factor de dilución y su influencia sobre los resultados Sabe hacer un seguimiento de las muestras en el analizador y detectar problemas de lectura de códigos de barras Sabe hacer un seguimiento de las muestras en el analizador y detectar problemas con la muestra o el reactivo Sabe como actuar ante averías de los equipos

Fase Postanalítica Sabe cuando no se puede informar un resultado Sabe reconocer resultados aberrantes o absurdos Sabe reconocer cuando un resultado esta fuera del rango de referencia Conoce los valores de resultados alarmantes o críticos de comunicación urgente y el procedimiento de comunicación Sabe cuando tiene que repetir o comprobar un resultado Sabe como buscar resultados de pacientes en la pantalla del analizador Conoce el concepto de validación técnica de resultados Conoce cual es el facultativo responsable de su área analítica Sabe cuando tiene que comunicarle una incidencia Conoce el procedimiento de eliminación de muestras y gestión de residuos

Documentación y Registros Conoce los manuales de registro (de lotes, de trabajo diario, de incidencias, de mantenimiento de equipos, de pedidos de reactivos) Conoce el/los procedimiento/s de trabajo (PNT) de su área analítica Conoce la relación de incidencias y como registrarlas Sabe imprimir listas de trabajo del sistema informático del laboratorio Conoce el sistema de impresión de listas de control de recepción de muestras desde el sistema informático Sabe imprimir etiquetas de código de barras para identificar tubos Sabe identificar errores de identificación en códigos de barras Conoce las normas referentes a previsión de riesgos laborales y la actuación ante incidencias Conoce la documentación referente a la ley de protección de datos

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Propone alternativas con el objetivo de mejorar resultados. Demuestra interés por el conocimiento de la organización del laboratorio y sus procesos Colabora en la implantación de los requisitos del sistema de gestión de la calidad para la certificaciónacreditación del laboratorio Cumple en todo momento la normativa de seguridad del laboratorio Respeta la confidencialidad de toda la información recibida y generada en el laboratorio

Técnico del Laboratorio de Urgencias

Competencias en el Saber y en el Saber Hacer Fase Preanalítica Conoce el catálogo de pruebas que se realizan con carácter urgente Conoce los diferentes tipos de contenedores de muestras que se utilizan en el laboratorio de urgencias Conoce el tipo de muestra necesario para la realización de las pruebas Conoce el sistema de identificación-numeración de peticiones y de muestras Sabe reconocer cuando una muestra no es adecuada Sabe como actuar ante peticiones o muestras no conformes Conoce el proceso de centrifugación de muestras Sabe hacer alícuotas e identificar tubos Sabe el sistema de conservación y almacenamiento de muestras Conoce el sistema de adecuación de la muestra tras su descongelación Conoce el proceso de conservación de muestras para rutina Conoce el proceso de conservación de muestras con contenido legal (alcoholemia y drogas de abuso en orina)

Fase Analítica Conoce el funcionamiento básico de los analizadores del laboratorio de urgencias Sabe hacer las tareas de mantenimiento programadas Sabe preparar los reactivos, cuándo, su estabilidad, su caducidad y el número de determinaciones que pueden realizar Conoce el sistema de pedidos de material y reactivos y su periodicidad Conoce las soluciones de calibración que tiene que utilizar, su preparación, su estabilidad y conservación Sabe realizar las tareas de calibración de las técnicas analíticas asignadas Sabe reconocer cuando una calibración no es correcta y como proceder Sabe como buscar resultados de calibración en la pantalla del analizador Conoce las soluciones de control de calidad que tiene que utilizar, su preparación, su estabilidad y conservación Sabe como solicitar los controles de calidad de las técnicas analíticas asignadas y su frecuencia Conoce los valores de los límites de los controles, cuando están fuera de rango y como proceder Sabe como buscar resultados de control de calidad en la pantalla del analizador Sabe procesar el control de calidad analítico externo, las pruebas a realizar y su periodicidad Sabe diferenciar lo que es un tubo primario de una alícuota Sabe posicionar correctamente las muestras en el analizador Sabe pedir manualmente pruebas al analizador Conoce los avisos y alarmas que dan los analizadores referentes a resultados y a funcionamiento y cómo actuar Sabe como y con qué hacer diluciones y el concepto de factor de dilución y su influencia sobre los resultados Sabe hacer un seguimiento de las muestras en el analizador y detectar problemas de lectura de códigos de barras Sabe hacer un seguimiento de las muestras en el analizador y detectar problemas con la muestra o el reactivo Sabe hacer el sedimento de la orina Sabe como actuar ante averías de los equipos y sus procedimientos alternativos

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Fase Postanalítica Sabe cuando no se puede informar un resultado Sabe reconocer resultados aberrantes o absurdos Sabe reconocer cuando un resultado esta fuera del rango de referencia Conoce los valores de resultados alarmantes o críticos y el procedimiento de comunicación urgente Sabe cuando tiene que repetir o comprobar un resultado Sabe como buscar resultados de pacientes en la pantalla del analizador Conoce el concepto de validación técnica de resultados y que requisitos mínimos debe cumplir un resultado para ser informado.

Fase Postanalítica (cont) Conoce cual es el facultativo responsable de su área analítica y cómo contactar con él en cada momento Sabe cuando tiene que avisar al facultativo responsable de las urgencias Conoce el procedimiento de eliminación de muestras y gestión de residuos

Documentación y Registros Conoce los manuales de registro (de lotes, de trabajo diario, de incidencias, de mantenimiento de equipos, de validación de controles de calidad) Conoce el/los procedimiento/s de trabajo (PNT) de su área analítica Conoce la relación de incidencias y como registrarlas Sabe como entrar y salir del sistema informático del laboratorio Omega4 Conoce los menús del sistema informático Conoce las pantallas de pendientes y finalizadas Conoce el sistema de petición electrónica Sabe registrar datos demográficos de pacientes en el sistema informático Sabe registrar pruebas en el sistema informático Sabe registrar resultados en el sistema informático Sabe consultar analíticas previas Sabe buscar peticiones y/o pacientes Conoce el estado de las peticiones en las pantallas Sabe registrar comentarios en las pruebas y en las peticiones Sabe como añadir pruebas a peticiones ya finalizadas Conoce el proceso de validación de resultados Sabe como actuar ante consultas de resultados de analíticas de rutina Sabe como imprimir y reimprimir informes y preinformes de resultados Sabe como actuar ante averías del sistema informático y el procedimiento alternativo Sabe ver el estado de conexión de los equipos con el sistema informático a través del sistema de gestión PSM Sabe modificar y actualizar el estado de las conexiones informáticas de los analizadores Conoce las normas referentes a previsión de riesgos laborales y la actuación ante incidencias Conoce la documentación referente a la ley de protección de datos

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Se responsabiliza del trabajo que desarrolla y del cumplimiento de los objetivos Demuestra un buen hacer profesional Propone alternativas con el objetivo de mejorar resultados. Demuestra interés por el conocimiento de la organización del laboratorio y sus procesos Colabora en la implantación de los requisitos del sistema de gestión de la calidad para la certificaciónacreditación del laboratorio Cumple en todo momento la normativa de seguridad del laboratorio Respeta la confidencialidad de toda la información recibida y generada en el laboratorio

Auxiliar de Enfermería

Competencias en el Saber y en el Saber Hacer Gestión de peticiones y muestras Conoce el catálogo de pruebas que va a realizar en su área de trabajo Conoce los diferentes tipos de contenedores de muestras que se utilizan en el laboratorio Conoce el tipo de muestra necesario para la realización de las pruebas Conoce el sistema de identificación-numeración de peticiones y de muestras Sabe colaborar en la toma de muestras Sabe transportar muestras al laboratorio Conoce el procedimiento de recepción de muestras y su aceptación o rechazo Conoce el procedimiento de recepción de muestras desde centros periféricos y el horario de recepción Conoce el procedimiento de recepción de muestras para espermiograma y realizar la encuesta de calidad Sabe comprobar la correspondencia de los formularios de petición con las muestras recibidas Conoce el procedimiento de clasificación y distribución de muestras Sabe manejar el programa de gestión preanalítica de procesado de muestras -PSMSabe reconocer cuando una muestra no es adecuada y como proceder Sabe centrifugar los diferentes tipos de muestras Sabe identificar y codificar contenedores de muestras Sabe acondicionar muestras de orina Sabe medir volúmenes de orina Conoce la administración de aditivos y conservantes para muestras de orina Sabe preparar alícuotas de muestras Sabe el sistema de conservación y almacenamiento de muestras Sabe como ordenar y archivar muestras Sabe como localizar una muestra del día y del archivo Sabe localizar muestras enviadas fuera del horario de recepción (tarde, noche, días festivos, etc.) Sabe codificar las muestras que llegan al laboratorio sin etiquetar Sabe preparar el material estéril para estudios de inseminación Conoce el procedimiento de eliminación de muestras y gestión de residuos

Mantenimiento y almacén Sabe registrar las temperaturas de frigoríficos, congeladores y estufa. Sabe como reponer el carro de extracciones Sabe limpiar y reponer laboratorios, sala de extracciones, almacenes y frigoríficos Sabe ordenar el almacén Sabe colaborar en la recepción de pedidos de material y reactivos Sabe eliminar y reponer ropa Sabe recepcionar y almacenar material procedente del laboratorio externo Reference Laboratory Sabe limpiar las centrífugas y el registro de su mantenimiento

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Documentación y Registros Conoce el procedimiento de trabajo de su área analítica Conoce los manuales de registro de su área de trabajo Conoce la relación de incidencias y como registrarlas Sabe imprimir listas de trabajo para el área de orinas Sabe imprimir listados de las muestras que faltan Sabe generar e imprimir etiquetas para los contenedores de muestras Conoce las normas referentes a previsión de riesgos laborales y la actuación ante incidencias Conoce la documentación referente a la ley de protección de datos

Competencias en el Saber Estar Transmite información con claridad, de manera ordenada, estructurada, y precisa. Participa y colabora activamente en el equipo de trabajo Se comunica eficazmente con las personas adecuadas en cada momento, respetando los canales establecidos en la organización Comparte información con el equipo de trabajo Interpreta y ejecuta instrucciones de trabajo Transmite información con claridad, de manera ordenada, estructurada y precisa Actúa con rapidez en situaciones problemáticas y no se limita a esperar Demuestra cierto grado de autonomía en la resolución de contingencias relacionadas con su actividad. Se responsabiliza del trabajo que desarrolla y del cumplimiento de los objetivos Demuestra un buen hacer profesional Propone alternativas con el objetivo de mejorar resultados. Demuestra interés por el conocimiento de la organización del laboratorio y sus procesos Colabora en la implantación de los requisitos del sistema de gestión de la calidad para la certificaciónacreditación del laboratorio Cumple en todo momento la normativa de seguridad del laboratorio Respeta la confidencialidad de toda la información recibida y generada en el laboratorio

Administrativo

Competencias en el Saber y en el Saber Hacer Sistema Informático del Laboratorio Conoce el formulario de petición analítica del laboratorio Conoce las diferentes pantallas del Sistema Informático del Laboratorio (SIL) Omega4 Conoce el concepto de petición electrónica Conoce el sistema de identificación-numeración de las peticiones Sabe registrar datos demográficos Sabe registrar pruebas Sabe imprimir listas de trabajo y distribuirlas en las diversas áreas de trabajo Sabe registrar resultados de analíticas de pacientes por lista de trabajo y por número de petición Sabe hacer consultas de peticiones analíticas Sabe buscar resultados de pacientes Sabe localizar peticiones de fechas anteriores, devolverlas al diario y añadirle pruebas Sabe localizar muestras en el archivo del laboratorio Sabe imprimir resultados de pacientes y enviar preinformes Sabe imprimir resultados y enviarlos por fax cuando no se pueden ver en pantalla Sabe reimprimir informes de resultados

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Sabe unificar número de historias clínicas del mismo paciente con diferentes analíticas Sabe registrar incidencias en el sistema Sabe hacer el recuento estadístico de los formularios de petición de los centros de extracción Conoce el sistema de archivo de los formularios de petición analítica Sabe manejar el programa de gestión de peticiones y resultados del laboratorio externo Referente Laboratory Sabe manejar el programa de gestión de peticiones y resultados del laboratorio externo del Hospital Río Hortega Sabe registrar resultados en el programa de gestión de cribado de cáncer de colon en Castilla y León

Gestión administrativa Sabe hacer pedidos de material y reactivos en el programa informático del laboratorio Sabe hacer pedidos de material de oficina Conoce el equipamiento de ofimática y sabe enviar fax y hacer fotocopias Sabe realizar escritos en soporte informático Sabe gestionar la telefonía del laboratorio Sabe atender a las consultas personales o telefónicas que se le realicen relacionadas con la actividad del laboratorio

Documentación Conoce el Procedimiento General de Trabajo del Area Administrativa Conoce la relación de incidencias de su área de trabajo Sabe reconocer errores de identificación de pacientes y peticiones Sabe reconocer errores de identificación en códigos de barras Conoce las normas referentes a previsión de riesgos laborales y la actuación ante incidencias Conoce la documentación referente a la ley de protección de datos

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Anexo III. Términos y definiciones Aceptación (de una serie): aceptación de los resultados de las series analíticas, debida a que los datos de control están dentro de los límites del control. Actividad catalítica: incremento de la velocidad de reacción de una reacción química particular que una enzima produce en un sistema determinado. Alarma instrumental: señal emitida por un instrumento de medida que indica que se ha producido una anomalía en el proceso de medida. Alícuota: porción de una muestra que tiene su misma composición. Analito: componente que se indica en el nombre de una magnitud mensurable. Analizador: instrumento que permite mesurar o medir la concentración, u otro tipo de magnitud, de algunos de los componentes de una muestra. Anticoagulante: aditivo que se añade a un espécimen para evitar su coagulación. Cadena de custodia: término empleado para describir los procesos que documentan la manipulación de muestras desde el momento de la obtención, durante su análisis y hasta que el laboratorio emite un informe con los resultados. Calibración: conjunto de operaciones que establecen, bajo determinadas condiciones, la relación entre los valores de una magnitud en unos materiales de referencia y los valores de las señales que estos generan en un analizador o en otro sistema de medida. Calibrador: material de referencia usado para la calibración. Calidad: Grado en el que un conjunto de características inherentes cumple con los requisitos. Conjunto de características de un producto o servicio que le confiere la aptitud necesaria para satisfacer e incluso superar las necesidades y expectativas del cliente o usuario. Capacidad de detección: capacidad de un procedimiento de medida para detectar pequeñas cantidades de un componente. NOTA 1: La capacidad de detección se expresa mediante el valor crítico y el límite de detección. NOTA 2: A este concepto la IFCC le había llamado detectabilidad. Certificación (ISO) del laboratorio: reconocimiento otorgado al sistema de gestión de la calidad implantado en el laboratorio que ha demostrado que cumple todos los requisitos especificados en la norma ISO adoptada y especificados en su manual de la calidad. La organización que otorga la certificación ISO debe tener acreditación ISO emitida por una entidad oficial y nacional de calidad reconocida internacionalmente. Código de usuario: forma de identificación de cada usuario, personal e intransferible, que permite la trazabilidad en la gestión de la información. Coeficiente de variación (CV): Es la relación de desviación estándar respecto de la media expresado en porcentaje. Es una medida útil para comprobar la variabilidad relativa entre dos muestras que no son idénticas (concentración) o que no han sido procesadas en condiciones iguales. Se usa para expresar la precisión del análisis. Compara imprecisión. CV % = ( desviación estandar / media ) x 100 Coherencia biológica: conexión y ausencia de contradicción entre los resultados de las magnitudes biológicas de un paciente y otros conocimientos biológicos que se dispone de este paciente. NOTA: la comprobación de la coherencia biológica es la base de la validación de los informes del laboratorio clínico. Comentario interpretativo: opinión sobre los resultados de los análisis de un paciente determinado, emitida en forma narrativa por un facultativo del laboratorio clínico, con el fin de ayudar a interpretar estos resultados a quienes ha solicitado los análisis. La introducción de comentarios interpretativos proporciona un valor añadido a los resultados e incrementa la relación entre la clínica y el laboratorio clínico. Componente; constituyente: entidad que forma parte de una entidad superior. Entidad perteneciente a un sistema. Es el elemento interdependiente de un sistema. Un componente puede ser tanto una entidad física, como un proceso. Por ejemplo: la hemoglobina (de la sangre), la fosfatasa alcalina (del plasma), la secreción de cortisol (por las glándulas suprarrenales) ó la tolerancia a la glucosa (por un paciente).

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Concentración: cociente entre un tipo de magnitud extensivo de un componente de un sistema y el volumen del sistema. NOTA: Los tipos de magnitud extensivos son aquellos que varían con el tamaño del sistema. Los más habituales en bioquímica clínica son la cantidad de sustancia, la masa, la actividad catalítica y el número de entidades. Concentración terapéutica: concentración de un fármaco en un sistema biológico que produce el efecto terapéutico deseado. Conservante: compuesto químico que se añade a otro diferente con el fin de evitar o retrasar su deterioro. Consultoría semiológica: servicio de asesoramiento que ofrece un laboratorio clínico sobre el significado fisiopatológico de los valores de las propiedades biológicas. Contaminación analítica: proceso por el cual ciertos materiales son transportados a una mezcla de reacción a la que no pertenecen. Control de la calidad: es la parte de la gestión de la calidad orientada a examinar y conocer el grado de cumplimiento de los requisitos establecidos o requeridos de los procesos, de los productos o de los servicios del laboratorio. El control de la calidad se realiza al final del proceso y por tanto es de naturaleza reactiva (acción correctiva). Control externo de la calidad: conjunto de procedimientos realizados por el personal del laboratorio para la evaluación continua de la fiabilidad del trabajo del laboratorio y los resultados obtenidos en comparación con otros laboratorios. (Ver evaluación externa de la calidad). Control interno de la calidad: conjunto de procedimientos realizados por el personal del laboratorio para la evaluación continua de la fiabilidad del trabajo del laboratorio y los resultados obtenidos, con el fin de decidir si son suficientemente fiables para ser entregados. Curva de calibración: representación gráfica de la función de calibración. Desviación del control: Se caracteriza por un salto repentino o un cambio en los valores promedio. Los valores en días consecutivos son constantes y sistemáticamente por encima o debajo de la media. Su causa son malas calibraciones, deterioro de reactivos, temperatura, calibración de materiales. Desviación estandar o típica (S): Cuantifica el grado de dispersión de los datos alrededor del valor promedio y se usa para establecer los límites de aceptación de futuros resultados de control. Es una medida de dispersión que se utiliza para: 1. Fijar los límites de aceptabilidad (X y S), 2. Comparar métodos, 3. Comparar instrumentos. DE = [ Σ (Xn – x)2 / n-1 ]½ Determinación: ver medición o medida. Diluyente: sustancia que se adiciona a una disolución para disminuir la concentración de sus componentes. Disolución; solución: mezcla molecularmente homogénea de dos o más sustancias. Disolución primaria: solución primaria: disolución del soluto con un disolvente adecuado. Disolvente: componente mayoritario de una disolución respecto al soluto o solutos presentes. Disponibilidad de resultados: tiempo máximo en el que el laboratorio se compromete a entregar un resultado desde la recepción de la muestra. Dosis terapéutica: dosis de un fármaco que produce el efecto terapéutico deseado. Dosis tóxica: dosis de un compuesto químico que produce intoxicación sin resultado letal. Efectividad: probabilidad de obtener los resultados previstos en las condiciones reales de trabajo. La eficacia es en condiciones ideales. La diferencia entre eficacia y efectividad será tanto mayor cuanto más se alejen las condiciones reales de las ideales. Mide el impacto final (outcome) que sobre la población tienen los resultados producidos (outputs). Por ejemplo, años de vida ganados o mejora de la calidad de vida por intervención sanitaria. Efecto biológico: resultado de la acción de un medicamento sobre el organismo. Efecto gancho (hook): Producción de resultados inferiores a los reales en la medición del constituyente en muestras con una elevada concentración del mismo. Efecto matriz: 1) Influencia de una propiedad de la muestra, distinta de la magnitud, en la medición y por lo tanto en el valor del mensurando; 2) efectos fisicoquímicos (por ejemplo la interferencia) de la matriz en la capacidad del método analítico para medir un constituyente con exactitud. Eficacia: es el logro de los objetivos señalados. Mide los resultados obtenidos frente a los planificados

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(óptimo factible), independientemente de los medios utilizados. Eficiencia: obtener los resultados previstos con los recursos apropiados. En términos de gestión de laboratorio: proporcionar resultados de calidad analítica contrastada, en tiempos de respuesta y coste adecuados para la toma de decisiones médicas. Relaciona los bienes y servicios consumidos (inputs) frente a los bienes o servicios producidos (outputs). Eficiencia diagnóstica: En términos de características diagnósticas de las pruebas de laboratorio, fracción de positivos y negativos ciertos. fracción de los resultados que son ciertos, ya sean positivos ciertos o negativos ciertos (S+E) EF = PC + NC / PC + PF + NC + NF Endógeno -a: desarrollado u originado dentro del organismo o causado por factores internos. Equipo: dispositivo físico, aparato, instrumento. Error aleatorio: diferencia entre el resultado de una medida y la media de los resultados que se obtendrían de un número infinito de medidas del mismo mensurando, realizadas en condiciones de repetibilidad. NOTAS: 1. El error aleatorio es igual al error de medida menos el error sistemático. 2. En la práctica, el error aleatorio se puede estimar con 30 o mas medidas repetidas de un mensurando en unas condiciones determinadas. Error cognitivo: Error producido por decisiones incorrectas debidas a insuficiente conocimiento, incorrecta interpretación de la información disponible o aplicación de una regla cognitiva errónea (Nota: También llamado error de atención). Error inherente al método: es la imprecisión del método analítico expresada como desviación estándar. Error de laboratorio: Fallo al completar una acción planificada como se deseaba o utilización de un plan incorrecto para alcanzar un objetivo; un defecto producido en cualquier parte del ciclo del laboratorio, desde que se solicitan las magnitudes hasta que se informan los resultados, se interpretan y se produce una reacción a los mismos. Error latente: Error debido a factores estructurales subyacentes que no pueden ser controlados por el operador. Error de medida: resultado de una medida menos el valor verdadero o convencionalmente verdadero del mensurando. NOTA: 1. Cuando es necesario distinguir entre "error" y "error relativo", el primero se denomina a veces "error absoluto de medida". 2. Muchas veces el error de medida se denomina "error total". Error de medida máximo permisible : valor máximo del error de medida que es admisible sin invalidar la utilidad clínica de los resultados de un procedimiento de medida. Error de medida relativo: error de medida dividido por un valor verdadero, o convencionalmente verdadero, del mensurando. Error de medida relativo máximo permisible : valor máximo del error de medida relativo que es admisible sin invalidar la utilidad clínica de los resultados de un procedimiento de medida. Error no cognitivo: Error debido a fallos inadvertidos o inconscientes en una conducta prevista automática (Nota: También llamado error esquemático). Error sistemático : media de veinte o más resultados de medida de un mensurando obtenidos en condiciones interdiarias menos el valor verdadero o convencionalmente verdadero del mensurando, dividido por el valor verdadero y este cociente se multiplica por 100 para expresarlo en porcentaje. También llamado desviación y sesgo. NOTAS: 1. el error sistemático es igual al error de medida menos el error aleatorio. 2. el error sistemático puede ser constante o proporcional al del mensurando. 3. este concepto es prácticamente equivalente al concepto "inexactitud" anteriormente recomendado por la IFCC. Sesgo % lab = ( Mlab – Mgrupo ) / Mgrupo Error sistemático máximo permisible: valor máximo del error sistemático que es admisible sin invalidar la utilidad clínica de los resultados de un procedimiento de medida. Error sistemático relativo máximo permisible: valor máximo del error sistemático relativo que es admisible sin invalidar la utilidad clínica de los resultados de un procedimiento de medida. Error tolerable u objetivo de calidad: es la magnitud de error por encima de la cual los resultados del laboratorio no satisfacen las necesidades clínicas. Debe expresarse en términos de error global (inexactitud más imprecisión), indicando en qué nivel de decisión médica se define. El nivel de decisión

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médica es la concentración en la que la interpretación clínica del resultado de la prueba resulta crítica (por ejemplo, el límite superior del intervalo de referencia). Error total analítico: Suma de la imprecisión (error aleatorio) más la inexactitud (error sistemático). Máximo error aceptable de la medida para una prestación analítica deseable. Los conceptos de error total (ET) y error total admisible (ETa) son útiles a la hora de decidir la regla o reglas de control de procesos estadísticos (CPE) que se deben aplicar a un test. Se pueden seleccionar reglas para advertir cuando el error total de un test exceda de una especificación de calidad (ETa) que se elija. El error total correspondiente a un test incluye tanto el error sistemático como la imprecisión, como se muestra en la fórmula siguiente (con un intervalo de confianza del 99%): ET lab = [ Sesgo(%) lab ] + 2,33 CV lab Escala ordinal: escala compuesta de valores que son números ordinales o palabras o símbolos que denotan un cierto orden. EJEMPLOS: (ausentes; escasos; abundantes), (0; 1), (negativo; positivo). Escala racional: escala compuesta de números multiplicados por una unidad, en la cual los cocientes que tienen lugar entre los aumentos o disminuciones de los valores de las magnitudes particulares los corresponden los mismos cocientes que existen entre los números de la escala, EJEMPLOS: (0,01 μkat/L; 0,02 μkat/L; 1000,00 μkat/L). Especificación: documento que establece requisitos que un producto o servicio debe cumplir. Especificidad analítica: capacidad de un método para determinar únicamente el componente que se pretende medir. Especificidad diagnóstica o nosográfica: fracción de negativos ciertos de entre los sanos. Fracción de resultados que son NEGATIVOS CIERTOS (resultados - en personas sin la enfermedad). NC / PF + NC NEG FALSOS: - enfermos. Inversamente relacionada con la sensibilidad. Dependen del valor discriminante. Espécimen: es una parte representativa de un sistema biológico que cambia continuamente tomada de un individuo en un momento dado (sangre, orina, heces, líquidos biológicos). Se refiere a la muestra original, tal y como se extrae del paciente. Ver muestra primaria. Estabilidad de una muestra: la estabilidad metrológica de las propiedades físico-químicas de los componentes de especímenes biológicos humanos se define como, la capacidad de una muestra de retener el valor inicial de las magnitudes biológicas dentro de unos límites establecidos durante un determinado periodo de tiempo cuando ésta se conserva en condiciones definidas. Estado del arte: en términos de calidad analítica es, la calidad alcanzada por una determinada proporción (fractil) de los mejores laboratorios participantes en un programa de evaluación externa de la calidad. Estándar: ver patrón. Evaluación externa de la calidad: sistema de comparación objetivo y retrospectivo de los resultados de diferentes laboratorios, realizado por una organización externa. Exactitud de medida: concordancia entre el resultado de una medida y el valor verdadero del mensurando. Concordancia estrecha entre el resultado de una medición y el valor verdadero de la misma. NOTA: 1. exactitud es un concepto cualitativo y el error de medida es su equivalente cuantitativo. 2 . la IFCC ha utilizado este término con el significado de veracidad. Factor de interferencia: componente de la matriz de una muestra que difiere del analito e interfiere con el procedimiento analítico para dar una señal de medida falsa. Fármaco: compuesto químico que tras ser absorbido por un organismo vivo es capaz de producirle modificaciones anatómicas o funcionales. NOTAS: 1. Cuando un fármaco restaura una función patológicamente alterada o atenúa los síntomas de una enfermedad recibe el nombre de medicamento. 2. Cuando un fármaco produce dependencia física o psíquica y cuya supresión desencadena un síndrome de abstinencia, se denomina droga. Fiabilidad: en los programas de evaluación externa de la calidad el índice de fiabilidad se calcula ordenando los valores obtenidos en inexactitud e imprecisión por orden creciente y sumando el número de orden del participante en inexactitud más número de orden en imprecisión dividiendo la suma por el número total de participantes.

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Formulario de petición: Documento en el que figuran el conjunto de pruebas, perfiles y protocolos solicitados por el clínico para la evaluación analítica de un paciente que origina una o más muestras y un número de identificación en el laboratorio. Función: conjunto de cometidos que se desempeñan con el fin de ejercer las responsabilidades específicas de un cargo. Guías de práctica clínica: directrices elaboradas sistemáticamente para asistir a los clínicos en la adecuada toma de decisiones sobre enfermedades o condiciones clínicas específicas. Imprecisión: coeficiente de variación de un conjunto de resultados obtenidos al mensurar repetidamente un mensurando con un mismo procedimiento de medida en unas condiciones estipuladas NOTA: Según las condiciones en que se efectúen las medidas repetidas la imprecisión puede ser intraserial, interserial, interdiaria o interlaboratorial. Se determina, tras veinte o más resultados de medida de un mensurando obtenidos en condiciones interdiarias, con el coeficiente de variación (CV%), que se calcula dividiendo la desviación estandar por la media y multiplicando el resultado por 100. Imprecisión interdiaria: imprecisión observada en un laboratorio a partir de resultados obtenidos en días diferentes. NOTA: Los resultados pueden estar afectados por distintas calibraciones (calibración diaria, semanal, etc.), distintos operadores, distintos lotes de calibradores y distintos lotes de reactivos. Imprecisión interdiaria máxima permisible: valor máximo de la imprecisión interdiaria que es admisible sin invalidar la utilidad clínica de los resultados de un procedimiento de medida. Imprecisión intraserial: imprecisión observada en un laboratorio a partir de resultados obtenidos en una misma serie de medidas. NOTA: La imprecisión intraserial es la expresión cuantitativa de la repetibilidad. Impreso: documento donde se describen los diferentes procesos y procedimientos del sistema de calidad. Incertidumbre de medida: parámetro, asociado al resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que pueden atribuirse razonablemente al mensurando. NOTAS: 1. La incertidumbre del resultado de una medida refleja la falta de un conocimiento completo del valor del mensurando. Un conocimiento completo exigiría una cantidad infinita de información. 2 . La expresión del resultado de una medida está completo sólo cuando contiene tanto el valor atribuido al mensurando como la incertidumbre de medida asociada al dicho valor. 3. El parámetro puede ser, por ejemplo, una desviación estándar (o un determinado múltiplo de este), o la mitad de un intervalo con un determinado nivel de confianza. Incidencia: fracción de personas que desarrollan una enfermedad determinada en un periodo de tiempo determinado. Suceso inesperado. Indicador: es un dato objetivo y cuantificable que refleja el comportamiento o la evolución de un proceso o de una actividad de manera cuantitativa. La implantación de un sistema de indicadores beneficia al laboratorio al facilitar el control de los procesos y la evaluación del éxito o fracaso de cada etapa, proporcionando información para retroalimentación y facilitando la actuación de la mejora. Los sistemas de gestión (económica y de calidad) se nutren del uso de indicadores, ya que sólo se puede gestionar lo que se puede medir. Indicadores de calidad: Se definen y se calculan a partir de los datos obtenidos y recogidos en los controles de calidad de los procesos y constituyen uno de los pilares de la mejora. En el laboratorio es posible calcular tres indicadores de calidad analítica. Dos de ellos, la imprecisión y el error sistemático proceden del control interno diario. El tercer indicador, la inexactitud se obtiene a partir del control externo de calidad. La implantación de un sistema de indicadores beneficia al laboratorio al facilitar el control de los procesos y la evaluación del éxito o fracaso de cada etapa, proporcionando información para retroalimentación y facilitando la actuación de la mejora. Los sistemas de gestión (económica y de calidad) se nutren del uso de indicadores, ya que sólo se puede gestionar lo que se puede medir. Indice de desviación estándar (IDS): es una medición del error sistemático que relaciona la media del laboratorio con la del grupo de consenso y su desviación estandar. IDS = ( Medialab – Mediagrupo) / DEgrupo Inespecificidad: efectos de componentes de la muestra, que no son el analito, que por sí mismos producen una señal del sistema medidor.

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Inexactitud: es la diferencia numérica entre la media de una serie de mediciones repetidas y el valor verdadero. Informe: dictamen emitido por un facultativo que asume la responsabilidad de su contenido, sobre un asunto de su competencia profesional. Informe de laboratorio clínico; informe de resultados: documento producto final del laboratorio que contiene los resultados de las magnitudes bioquímicas analizadas y validadas técnica y facultativamente, sus unidades y valores de referencia, así como los datos identificativos del paciente, del peticionario, de las muestras y del laboratorio, además de cualquier información o comentario que pueda facilitar la interpretación de los resultados y que es remitido al solicitante como respuesta a su petición de análisis. Instrumento: Equipo de laboratorio que procesa muestras para obtener resultados de las magnitudes solicitadas Instrumento de medida: dispositivo, o combinación de dispositivos, empleado para realizar procesos de medida. Equipo de laboratorio que procesa muestras para obtener resultados de las magnitudes solicitadas Interferencia: Desviación clínicamente significativa en la medida de la concentración de un constituyente, debida al efecto de otro componente o propiedad de la muestra. (Nota: El efecto puede ser debido a la inespecificidad del sistema de medida, a la supresión de la reacción del indicador, a la inhibición del constituyente si se trata de una enzima o a cualquier causa de desviación dependiente de la muestra). Error sistemático producido por un interferente en un proceso analítico. (Nota: Según que el error sea positivo o negativo, la interferencia se denomina positiva o negativa, respectivamente) Interferencia clínicamente significativa: interferencia superior al error de medida máximo tolerable para una magnitud dada. Nota: Para cada magnitud biológica el error de medida máximo tolerable suele establecerse a partir de la variabilidad biológica. Interferente; sustancia interferente: componente de una muestra, distinto del componente en estudio, que causa una interferencia. Intervalo de control: intervalo que contiene, con una probabilidad muy alta, los resultados de medida obtenidos en unos materiales de control cuando el proceso de medida es fiable. Intervalo de medida o analítico: intervalo de valores de una magnitud en el que el procedimiento de medida es aplicable sin modificaciones. NOTA 1: En el laboratorio clínico habitualmente abarca desde el valor crítico hasta el límite de dilución. NOTA 2: También puede abarcar la diferencia entre dos límites de un rango nominal (VIM) Intervalo de referencia biológico: intervalo de referencia: Intervalo central del 95% de la distribución de los valores de referencia. NOTA 1 - Este término sustituye a otros utilizados incorrectamente tales como "intervalo normal”. NOTA 2 - Es convención arbitraria pero común definir el intervalo de referencia como el intervalo central del 95%. En casos particulares puede ser más apropiado otro tamaño o una posición asimétrica del intervalo de referencia. Intervalo terapéutico: intervalo de concentraciones plasmáticas de un fármaco que tiene como límite inferior aquella concentración por debajo de la cual el fármaco es ineficaz, y como limite superior la concentración por encima de la cual no se obtiene mejoría en el efecto terapéutico o bien se inicia el efecto tóxico. Nota: Incluye el 95% de la población que presenta dicha respuesta. Límite de control: límite de un intervalo de control. Límite de control: es el resultado de la muestra control a partir del cual se rechaza la serie analítica. Por regla general se expresa como múltiplo de la desviación estándar inherente al método. La norma operativa se abrevia con la expresión Al: A es la abreviación de un estadístico y I el límite de control. Límite de detección: resultado individual mínimo que, con una cierta probabilidad, se puede distinguir de un blanco adecuado. Límite de dilución: límite superior del intervalo de medida. Límite de referencia: valor que pertenece a una distribución de referencia y que excluye, con una probabilidad determinada, una fracción de esta distribución. NOTA: habitualmente se excluyen las fracciones 0,025 de cada extremo de la distribución de referencia. Linealidad (de un procedimiento de medida): característica de un sistema de medida dada por el hecho que su función de calibración coincide con la ecuación de una recta. NOTA: la linealidad

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acostumbra a darse sólo dentro de un intervalo de valores determinado. Magnitud: atributo de un fenómeno, cuerpo o sustancia que puede distinguirse cualitativamente y determinarse cuantitativamente; (ej. Srm-Glucosa;c). A veces se emplea el término prueba de laboratorio. Magnitud bioquímica: las magnitudes son propiedades de los sistemas. Cuando el sistema es biológico y la propiedad considerada cae en el ámbito de la bioquímica, entonces se llama magnitud bioquímica. Magnitud influyente: magnitud diferente del mensurando que afecta el resultado de la medida. Nota: En ciencias de laboratorio clínico, el componente de una magnitud influyente generalmente se denomina interferente analítico. Manual de procedimiento: procedimiento documentado. Manual de usuario: documento que describe cómo utilizar una unidad funcional, y que suele incluir información acerca de las responsabilidades del usuario, del propietario y del proveedor. Masa molar: es la cantidad de masa que hay en un mol de una entidad molecular determinada (p.ej, glucosa, masa molar: 180,16 g/mol). Sabiendo la masa molar de una entidad se pueden transformar concentraciones de masa (mg/dL) en concentraciones de sustancia (mmol/L). Materiales de calibración: Son disoluciones que contienen sustancias en concentración conocida y en las que el disolvente puede ser acuoso o bien orgánico. Estos últimos tienen características fisicoquímicas (matriz) similares a las de los especímenes del laboratorio clínico. Según su origen, los calibradores pueden ser primarios o secundarios. El sistema de referencia para las medidas del laboratorio clínico, establecido en 1979, explica con claridad la relación entre los materiales de referencia (que pueden utilizarse como calibradores) y los métodos analíticos. Los calibradores se emplean para relacionar una determinada medida del sistema analítico (por ejemplo, la absorbancia) con una determinada concentración. A partir de esta relación, se calcula la concentración de especímenes problema en función de la medida obtenida en el análisis de los especímenes problema. Material de control: material sometido al mismo procedimiento de medida que la muestra de un paciente para controlar la calidad de este procedimiento, ya sea formando parte del control interno de la calidad o bien participando en un programa de evaluación externa de la calidad. Tiene que cumplir tres condiciones fundamentales: 1. ser estable para detectar cambios en la metodología con el tiempo, 2. ser repetitivo, es decir, presentar variaciones mínimas en sus propios resultados y 3. tener un comportamiento similar al de los especímenes en los métodos analíticos. Pueden ser valorados, no valorados o preparados en el laboratorio. Media (X): La media o promedio aritmético describe la tendencia central de un grupo de datos y es la mejor estimación del valor verdadero (esperado) para un nivel específico de control, se requieren 20 datos (NCCLS) para establecer este valor. Para calcular el promedio se deben sumar los valores individuales del control. Posteriormente dividir el resultado de la suma, entre el número total de datos. Media = Σ Xn / n. Mediana (M): Valor central de un conjunto de valores ordenados. Medición o medida: conjunto de operaciones cuyo objeto es determinar un valor de una magnitud. Conjunto de operaciones destinadas a determinar el valor de una magnitud. NOTA: la observación de una propiedad cualitativa se considera como una medida. Mensurando: magnitud particular sometida a una medida. El mensurando se define mediante los siguientes parámetros: a) Analito a medir. Por ejemplo: proteína, ion sodio, colesterol, antiestreptolisina O, hemoglobina, número de leucocitos, etc. b) Sistema. Por ejemplo: suero, orina, sangre venosa, líquido pleural, etc. c) Tipo de magnitud y unidad. Por ejemplo: concentración de sustancia (mmol/L), concentración de masa (g/L), concentración catalítica (nkat/L), etc. d) Procedimiento de medida. Habitualmente descrito en un procedimiento documentado de trabajo o similar. Metabolito: compuesto químico producido en el metabolismo. Método de medida: secuencia lógica de operaciones, en términos genéricos, usada en la realización de una medición según un principio dado. Sucesión lógica de operaciones para realizar medidas descritas de forma genérica. Moda (Mo): es el valor más frecuente, el que más se repite de un conjunto de valores.

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Modo operativo: documento que establece y describe la manera de cómo debe realizarse una operación. Muestra: Material biológico útil para análisis que el laboratorio toma directamente del paciente (espécimen) o que le es remitido para su análisis. Una o más partes tomadas de un sistema y previstas para proporcionar información sobre el mismo a menudo como base de decisión sobre el sistema o sus productos. Procede de una manipulación del espécimen que lo convierte en muestra (ej: centrifugación). Se refiere a la muestra tal y como se va a analizar. EJEMPLO: Un volumen de suero tomado de un volumen mayor del mismo. Muestra primaria; espécimen: conjunto de una o más partes inicialmente tomadas de un sistema. (Nota: en algunos países, el término "espécimen" se utiliza en vez de la muestra primaria -o una submuestra de la misma-, que es la muestra preparada para ser enviada al laboratorio, o la que es recibida por el mismo y que está lista para el análisis.) Muestra de referencia: Es un subconjunto de la población de referencia constituido por el numero adecuado de individuos para que sea representativo de la población de referencia. Muestreo: acción de tomar una o más muestras de un sistema. No conformidad (disconformidad): incumplimiento o no correspondencia con los requisitos cualitológicos preestablecidos. Nomenclatura sistemática: para que una magnitud bioquímica esté perfectamente caracterizada, hay que describir el sistema (aunque en algunos casos no se considere ninguno en particular y, por lo tanto, no haga falta describirlo) y el tipo de magnitud estudiado. Según recomendaciones de: Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC), Unión Internacional de Bioquímica (IUB) y en el caso de los fármacos, de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Sistema - Componente; tipo de magnitud, (p.ej.: Srm-Glucosa; concentración de sustancia). Objetivo de calidad: algo ambicionado o pretendido relativo a la calidad. Obtención de una muestra: proceso por el cual una persona legalmente capacitada obtiene una muestra directamente de un paciente, mediante un procedimiento adecuado. Patrón: medida materializada, instrumento de medida, material de referencia o sistema de medida destinado a definir, realizar, conservar o reproducir una unidad o uno o varios valores de una magnitud para que sirvan de referencia (VIM). Percentil (Px): valor que divide los datos en cien partes iguales (P50 = Mediana). Perfil analítico: conjunto de propiedades analíticas, la medida de las cuales suministra la máxima información posible para una finalidad médica concreta y que posee una relación óptima entre el coste de las medidas y el beneficio diagnóstico. Conjunto de magnitudes biológicas agrupadas para que puedan ser solicitadas unitariamente al laboratorio. Petición analítica: proceso por el cual un cliente autorizado solicita la medida de magnitudes bioquímicas mediante una hoja de petición. Documento de solicitud de mediciones de laboratorio, que cumplimenta el médico y es remitido al laboratorio. Petición electrónica: solicitud de pruebas de laboratorio en soporte informático, cumplimentada por el médico peticionario y remitida al SIL a través de redes electrónicas. Petición electrónica asistida: solicitud de pruebas de laboratorio en la que el médico peticionario es asistido por el sistema informático en la elección de la prueba más adecuada. Petición manual: solicitud de pruebas de laboratorio en soporte papel, cumplimentada por el médico peticionario e introducida en el SIL por mecanografía o medios de lectura digitalizada. pH: magnitud de dimensión 1 utilizada para expresar la concentración de sustancia de iones hidrógeno, aproximadamente igual al logaritmo decimal negativo de la actividad molal de los iones hidrógeno. Plasma: es el medio líquido en el que estan suspendidas las células sanguíneas. Si un espécimen de sangre se trata de forma que no se coagule (anticoagulantes) y luego se centrífuga o se deja reposar se separan las células de un líquido sobrenadante ambarino que es el plasma. Precisión: concordancia entre resultados de medida independientes del mismo mensurando obtenidos en unas condiciones estipuladas. NOTA: precisión es un concepto cualitativo y la imprecisión es su equivalente cuantitativo. NOTA: En las ciencias de laboratorio clínico, la medida de la precisión se expresa

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habitualmente en términos de imprecisión calculada como el coeficiente de variación de los resultados de medida. Prestaciones: De un equipo: especificaciones (valor de las características) que muestra un equipo en la práctica o rutina diaria en las condiciones del laboratorio (p. ej., precisión, sesgo, linealidad, rendimiento, etc.). De una organización: conjunto de servicios que provee una organización. Prevalencia: fracción de personas que padecen una enfermedad determinada en una población determinada. (probabilidad previa o pretest). Principio de medida: base científica de un método de medida. Probabilidad de detección de error: es la probabilidad de dar señales de rechazo cuando hay error analítico. Probabilidad de rechazo incorrecta (falsa alarma): es la probabilidad de dar señales de rechazo cuando no hay más error que el inherente al método. Procedimiento: forma especificada y normalizada para llevar a cabo un proceso. La descripción escrita de las tareas. Procedimiento de laboratorio: conjunto de operaciones, en términos específicos, usado en la realización de actividades particulares del laboratorio según un método concreto. Procedimiento de medida; procedimiento analítico: conjunto de operaciones, en términos específicos, usado en la realización de medidas particulares según un método concreto. NOTA: el procedimiento de observación de una propiedad cualitativa se considera como un procedimiento de medida Procedimiento normalizado de trabajo: Documento que describe las actividades para ejecutar las diferentes técnicas del laboratorio. Como lo hace el laboratorio. Procedimientos postanalíticos: fase postanalítica: procesos que siguen al análisis incluyendo la revisión sistemática, preparación del informe de laboratorio e interpretación, autorización para entrega y transmisión de los resultados, y el almacenamiento de las muestras de los análisis. Procedimientos preanalíticos: fase preanalítica: Procesos que comienzan cronológicamente a partir de la petición del médico clínico e incluyen la petición de los análisis, la preparación del paciente, la recogida de la muestra primaria y el transporte hasta el interior del laboratorio, y que terminan cuando comienza el procedimiento analítico. Proceso: conjunto de actividades mutuamente relacionadas o que interactúan, las cuales transforman elementos de entrada (insumos) en elementos de salida (resultados). Conjunto de actividades (tareas) que producen un resultado. Es lo que hace el laboratorio. Conjunto de actividades mutuamente relacionadas o que interactúan, las cuales transforman elementos de entrada en resultados. NOTA 1: Esta es la definición que consta a la norma UNE- ISO 9000 Sistemas de gestión de la calidad. Fundamentos y vocabulario. NOTA 2: un proceso se puede considerar como un componente de un sistema. EJEMPLOS: coagulación, secreción de insulina. La secuencia sería: entradas – actividades (recursos) – resultados Proceso fin de día: proceso que permite traspasar las peticiones finalizadas cada día, es decir validadas y editadas, a ficheros históricos que serán susceptibles de cualquier consulta posterior. Propiedad biológica: propiedad genérica relacionada con un componente biológico o con un sistema biológico. Protocolo: conjunto de pautas explícitas y detalladas de todos los pasos implicados en el desarrollo de un estudio experimental. Protocolo analítico: conjunto de actividades acordadas para la realización de magnitudes biológicas y asociadas a una o varias entidades clínicas determinadas. Conjunto de determinaciones analíticas de demostrada efectividad para el diagnóstico, seguimiento y terapéutica de episodios o procesos clínicos bien definidos. Conjunto de pautas explícitas y detalladas de todos los pasos implicados en el desarrollo de un estudio experimental. Protocolos clínicos: incluyen el conjunto de actividades diagnósticas y terapéuticas dirigidas al manejo clínico de una determinada enfermedad o situación del paciente, e incluyen la solicitud de pruebas de laboratorio. Prueba: ver ensayo.

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Prueba analítica: Es la unidad de trabajo del laboratorio. Cada uno de los productos incluidos en los catálogos de las especialidades del laboratorio clínico se considera una prueba analítica. Son necesarios varios procesos para poder producir el resultado final de una prueba. Prueba complementaria: prueba añadida secuencialmente por el laboratorio en el momento de la validación, según la información clínica y analítica disponible. Pruebas derivadas: Remitidas a un laboratorio subcontratado distinto al que emite el informe debiendo constar claramente este hecho en el informe de resultados. Prueba diagnóstica: Exploración complementaria que se realiza para comprobar la verdad o falsedad de un diagnóstico. Una prueba diagnóstica es una herramienta de ayuda a la decisión clínica. Prueba funcional: conjunto de procedimientos que permiten orientar sobre el valor de una magnitud relacionada con un proceso bioquímico o fisiológico, mediante la medida de otras magnitudes antes y después de la administración de alguna sustancia o de la realización de alguna actividad particular. Pruebas en el punto de cuidados (point of care testing (POCT): Las pruebas en el lugar de asistencia al paciente se definen como aquellas magnitudes biológicas que se determinan, fuera del Laboratorio, en un entorno próximo al lugar de asistencia al paciente y que son realizadas por personal ajeno al mismo. Puerto informático: punto de acceso para la entrada o salida de datos. Prueba redundante: Prueba solicitada cuando no aporta información relevante sobre las previamente indicadas, en la misma petición o en peticiones concurrentes. Prueba refleja: prueba añadida automáticamente por el laboratorio, según los resultados obtenidos en otra prueba previa incluida en una petición. Prueba repetida: prueba solicitada antes de que haya transcurrido un intervalo de tiempo mínimo razonable para que se observen cambios clínicos significativos. Rango de un control: Valor medio +/- 1S, 2S, 3S. Se debe establecer para cada nuevo instrumento o lote de control. Al menos 20 valores. Razón del coeficiente de variación (CVR): compara la precisión del laboratorio para un test con la de otros laboratorios que realizan el mismo test. CVR = Cvlab / CVgrupo Razón de posibilidades (Odds Ratio): Cociente entre la probabilidad de que el episodio de interés ocurra y la probabilidad de que no ocurra. Se estima por el cociente entre el número de veces que ha ocurrido el acontecimiento y el número de veces que no ha ocurrido. Razón de verosimilitud: detectar o excluir enfermedad. R.V. detección: PC / PF (SENSIB / 1ESPECIFICIDAD). R.V. exclusión: NF / NC (1-SENSIB / ESPECIFICIDAD). Reactivo: sustancia empleada para producir una reacción química con el fin de medir magnitudes, que pertenecen a otras sustancias. Rechazo (de una serie): no aceptación de los resultados de una serie debido a que el procedimiento de control da una señal de incumplimiento de especificaciones. De una muestra: cuando para una o varias de las determinaciones solicitadas no se puede entregar el resultado al clínico debido a causas imputables a errores preanalíticos. Red (de ordenadores): conjunto constituido por dos o más ordenadores interconectados. Registro: anotación o apunte que proporciona evidencia objetiva de actividades realizadas o de resultados obtenidos y por lo tanto variable, que generalmente se hace en un impreso. Registro de la calidad: documento que proporciona evidencia objetiva de la extensión del cumplimiento de los requisitos para la calidad o de la eficacia del funcionamiento de un elemento del sistema de la calidad. Regla de control: condición de los resultados de medida obtenidos en unos materiales de control que de darse determinan la aceptación (conformidad) de una calibración o de una serie de resultados. Reglas CAR: conjunto articulado de reglas de decisión, dado al sistema de gestión de la información del laboratorio, que permite que se ejecuten acciones de forma automática por éste. Repetibilidad: precisión bajo las condiciones de repetibilidad. NOTAS: 1. Las condiciones de repetibilidad son: mismo procedimiento de medida, mismo observador, mismo instrumento de medida usado en iguales condiciones, mismo laboratorio, repetición durante un periodo corto de tiempo. 2. La repetibilidad puede expresarse cuantitativamente mediante los estadísticos de dispersión de los

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resultados (desviación típica o coeficiente de variación). 3. La repetibilidad puede depender de los valores del mensurando. Puede ser intraserial o interserial. Repetición: procedimiento analítico que se realiza con una muestra a fin de comprobar un resultado. Reproductibilidad: precisión bajo las condiciones de reproductibilidad. NOTAS: 1. Las condiciones de reproductibilidad son: el mismo método de medida, pero diferente operador, instrumento de medida, calibrador y laboratorio. 2. La reproductibilidad puede expresarse cuantitativamente mediante los estadísticos de dispersión de los resultados. Requisito: disposición que formula criterios que deben cumplirse. Resultado: valor atribuido a una magnitud particular, obtenido mediante una medida. Resultado de control: resultados de una medida realizada en un material de control. Revisión: Actividad emprendida para asegurar la conveniencia, adecuación y eficacia del tema objeto de la revisión, cuyo fin es alcanzar unos objetivos establecidos. Sección fisiopatológica o metrológica : conjunto de propiedades biológicas, pertenecientes a un mismo grupo funcional, que se han agrupado para facilitar la obtención del informe de laboratorio clínico. También pueden constituir una sección informática. Sección informática: conjunto de propiedades biológicas, pertenecientes a un mismo grupo funcional, que se han agrupado para facilitar la obtención del informe de laboratorio clínico. Sensibilidad metrológica o analítica: diferencia en concentración del constituyente correspondiente a la más pequeña diferencia en la respuesta del método que pueda ser detectada. Cambio en la respuesta de un instrumento de medida dividido por el correspondiente cambio del valor del NOTAS: 1. la sensibilidad de un instrumento de medida puede depender del valor del mensurando. 2. es igual a la pendiente de la función de calibración. 3. en química analítica y en bioquímica clínica, para eludir a este concepto a menudo se usa el término sensibilidad analítica. Ver límite de detección. Sensibilidad diagnóstica o nosográfica: fracción de positivos ciertos de entre los enfermos. fracción de resultados que son NEGATIVOS CIERTOS (resultados - en personas sin la enfermedad). NC / PF + NC NEG FALSOS: - enfermos. Inversamente relacionada con la especificidad. Dependen del valor discriminante. Serie analítica: conjunto de medidas realizadas, o de resultados obtenidos, con un mismo procedimiento de medida entre dos momentos previamente definidos. Conjunto de análisis realizados consecutivamente en un intervalo dentro del cual se considera que la inexactitud y la imprecisión del sistema de medición son estables; es específica para cada sistema analítico. En algunos sistemas incluye todos los resultados calculados a partir de un único proceso de calibración. Sistema: conjunto de entidades interrelacionadas. Sistema analítico: conjunto de medios analíticos (instrumentos, métodos, reactivos, calibradores, controles, consumibles, etc.) que permite determinaciones analíticas según un modo operativo definido. Sistema biológico: Los sistemas son conjuntos de elementos interdependientes. Cuando los elementos son entidades biológicas, el sistema se llama sistema biológico (p.ej: sistema digestivo, sangre, orina, etc). Sistema de extracción con vacío: método de obtención de sangre que permite la extracción directa desde los vasos sanguíneos a los tubos primarios, en los que se ha hecho el vacío. Sistema de gestión de la calidad: Sistema para establecer la política y los objetivos y para lograr dichos objetivos. Estructura organizativa, procesos, procedimientos y recursos necesarios para implantar la gestión de la calidad. El sistema de gestión de la calidad es aquella parte del sistema de gestión de la organización enfocada al logro de las "salidas" (resultados), en relación con los objetivos de la calidad, para satisfacer las necesidades, expectativas y requisitos de las partes interesadas, según corresponda. Los objetivos de la calidad complementan otros objetivos de la organización, tales como los relacionados con el crecimiento, recursos financieros, rentabilidad, el medio ambiente y la seguridad y salud ocupacional. Las diferentes partes del sistema de gestión de una organización pueden integrarse conjuntamente con el sistema de gestión de la calidad, dentro de un sistema de gestión único, empleando elementos comunes. Esto puede facilitar la planificación, la asignación de recursos, el establecimiento de objetivos complementarios y la evaluación de la eficacia global de la organización. Sistema informático: unidad funcional consistente en uno o más ordenadores y su soporte lógico asociado que emplean una memoria común para todo o parte de un programa y también para todos o

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parte de los datos necesarios para la ejecución del programa. Si está diseñado para el trabajo en el laboratorio se conoce como Sistema Informático de Laboratorio (S.I.L.). Sistema internacional de unidades (S.I.): sistema coherente de unidades de medida adoptado y recomendado por la Conferencia General sobre Pesos y Medidas. Nota: el S.I. está basado actualmente sobre siete unidades de medida básicas: el metro (m), el kilogramo (kg), el segundo (s), el amperio (A), el grado kelvin (K), el mol (mol) y la candela (cd). Sistema de medida: conjunto de instrumentos de medida y otros equipos que, agrupados, permiten mesurar una o más magnitudes. NOTA: En ciencias de laboratorio clínico los sistemas de medida más empleados son los analizadores. Solución: disolución. Soluto: componente menor de una solución que ha sido disuelto por el disolvente. Soporte físico (hardware): equipamiento electrónico o mecánico empleado en asociación con el proceso de datos. Soporte lógico (software): creación intelectual que comprende los programas, los procedimientos, las reglas y la documentación asociada, referente al funcionamiento de un sistema de proceso de datos. Sostenibilidad: Se refiere a la capacidad de prestar un servicio de calidad a lo largo del tiempo. Subcontratista (proveedor): organización que proporciona un producto a un suministrador. Suero: es el líquido sobrenadante cuando se permite que la sangre coagule. El suero no contiene las proteinas de la coagulación (se han consumido). Tendencia del control: Es una desviación progresiva (ascendente o descendente) de los resultados hacia un mismo lado de la media. Se caracteriza por cambios graduales en los sistemas o reactivos. Es importante observar que los resultados estén dentro de los limites aceptables. Terminal (de usuario): unidad de entrada-salida mediante la cual el usuario se comunica con el ordenador. Tiempo consumido en la etapa postlaboratorio: es el tiempo transcurrido desde que se emite el informe del laboratorio hasta que el clínico lo recibe. Tiempo consumido en la etapa prelaboratorio: es el tiempo transcurrido desde que el clínico solicita el análisis hasta que el espécimen llega al laboratorio. Tiempo de respuesta del laboratorio: intervalo entre la recogida del espécimen primario por el personal del laboratorio o por personal externo al mismo y la entrega de resultados al solicitante (tiempo desde la obtención del espécimen a la entrega o intervalo entre la recepción de la solicitud y la entrega de resultados). Tiempo transcurrido desde que se recibe el espécimen en el laboratorio hasta que se emite el informe de resultados. Tiempo de respuesta total: es el tiempo transcurrido desde que el clínico solicita el análisis hasta que recibe el informe de resultados. Tipo de magnitud: tipo de propiedad cuantitativo. Tipo de propiedad: aquello que, poseído por una entidad, contribuye a que esta sea cómo es Transferibilidad: propiedad de un procedimiento de medida de ser ejecutado en varios laboratorios con idéntica fiabilidad. Propiedad de los resultados obtenidos al medir con dos o más procedimientos las mismas magnitudes en los mismos especímenes que permite utilizarlos indistintamente para una finalidad concreta. Trazabilidad: capacidad para reconstruir, mediante registros, la historia de los procesos aplicados para llegar al resultado final. Metrológica: propiedad del resultado de una medición, o del valor de un patrón, que permite relacionado con referencias declaradas, generalmente patrones nacionales o internacionales, a través de una cadena ininterrumpida de comparaciones todas ellas con incertidumbres declaradas. Tubo primario: contenedor de espécimen o muestra en el que se va a realizar la prueba y que ha sido tomado directamente del paciente sin haber sido trasvasado a recipiente alguno. Turbidez: opacidad de una disolución causada por partículas en suspensión que dispersan la luz. Unidad de medida: magnitud particular, definida y adoptada por convención, con la que las otras magnitudes mensurables del mismo tipo se comparan a fin de expresar sus magnitudes relativas respecto a tal magnitud.

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Validación: confirmación mediante el examen y la aportación de evidencias objetivas de que se han cumplido los requisitos particulares para una utilización específica prevista. Verificación de que los requisitos establecidos son adecuados para un uso previsto (VIM: Vocabulario Internacional de Metrología). A efectos prácticos los términos de validación y verificación se pueden considerar sinónimos. NOTA 1: la validación de las características petrológicas de un procedimiento de medida es la confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que el procedimiento de medida cumple los requisitos metrológicos del laboratorio clínico para la medición de muestras de pacientes. NOTA 2: la validación se realiza cuando se implanta el procedimiento de medida y cada vez que se modifica de tal forma que puedan verse afectadas sus características metrológicas. Validación (de informes de laboratorio clínico): comprobación de la conexión y ausencia de contradicción entre los resultados de las magnitudes bioquímicas de un paciente y los otras conocimientos biológicos que se dispone de este paciente. Ver coherencia biológica. Validación automática o autoverificación: la verificación de resultados se realiza de forma automática mediante los sistemas de información del laboratorio, si cumplen una serie de reglas definidas previamente en el mismo sistema. Validación facultativa: proceso de validación realizado por el personal facultativo del laboratorio. La validación de los resultados analíticos constituye una de las funciones más importantes de los facultativos del laboratorio clínico, para detectar posibles errores producidos en cualquier fase del proceso y añadir información que ayude a la interpretación clínica. Validación técnica: parte del proceso de validación realizado por el personal técnico del laboratorio. Valor: es la característica numérica o no numérica, de una magnitud. Las características numéricas, llamadas cuantías, se expresan como el producto de un número y de una unidad de medida (p.ej: nmol/L). Las características no numéricas se expresan con una palabra, una letra o cualquier otro símbolo (p.ej: turbio). En términos de política de calidad: el valor es algo que se aprecia; no se percibe, se estima. En la toma de decisiones siempre intervienen los valores. Valor aberrante: elemento de un conjunto de valores que es incoherente con otros elementos de dicho conjunto. Valor alarmante: valor de una magnitud biológica que constituye un peligro para el paciente en quien se observa. NOTA: cuando se obtiene inesperadamente un valor alarmante se debe notificar inmediatamente. Un valor alarmante es aquel que indica un peligro inmediato para el paciente en el que se ha observado y que, cuando se obtiene inesperadamente, debe ser notificado inmediatamente al médico solicitante de la analítica en cuestión. Valor de alerta: resultado que provoca la busca de información clínica para verificar un resultado o para validar un informe de laboratorio clínico. NOTA: la selección de los valores de alerta se basa en la experiencia profesional. Valor convencionalmente verdadero: valor atribuible a una magnitud particular aceptado por convenio que posee una incertidumbre apropiada para un propósito determinado. NOTA: habitualmente se conoce como "valor asignado". o “valor diana”. Valor crítico: resultado individual mínimo que, con una cierta probabilidad, se puede distinguir de un blanco adecuado. NOTAS: Anteriormente este concepto se denominaba límite de detección. 2: Este valor define el resultado a partir del que la medida es factible. 3: La estimación del valor crítico, xL , se hace mediante la ecuación xL = xb +ksb , donde xb es la media de las medidas del blanco, sb es la desviación estándar de las medidas del blanco, y k es un factor numérico según el nivel de confianza deseado. Ver valor alarmante. Valor discriminante: valor de una magnitud biológica, establecido mediante consideraciones clínicoepidemiológicas, con el que se comparan los resultados de medir esa magnitud en pacientes para dicotomizarlos en resultados positivos o negativos. Valor fisiológico: valor de una magnitud biológica, o resultado de su medición, que se halla dentro del intervalo de referencia de la población sana. Valor inverosímil: resultado que tiene una probabilidad ínfima de corresponder a un paciente. NOTAS: 1. un valor inverosímil acostumbra a ser incompatible con la vida humana. 2. los valores inverosímiles utilizados por el Servicio los han establecido los facultativos responsables correspondientes. 3 . nunca se

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puede entregar un informe de laboratorio clínico que lo contenga. Valor observado: Es el valor de una magnitud obtenido en un individuo determinado. Los valores observados pueden ser comparados con los valores, distribuciones, límites o intervalos de referencia. Valor predictivo: directamente relacionado con la prevalencia. Probabilidad postest. Valor predictivo negativo: fracción de resultados negativos que son negativos ciertos. VPN = NC / NC + NF. Valor predictivo positivo: fracción de resultados positivos que son positivos ciertos. VPP = PC / PC + PF.. Valor de referencia: Es el valor de una magnitud obtenida en un individuo de refeencia que forma parte de la muestra de referencia. Valor de referencia del cambio (VRC): diferencia significativa entre dos resultados consecutivos, que puede ser biológicamente relevante. VRC = 2,77(CVa2+ CVi2)1/2. Valor Z: es el número de desviaciones estándar del resultado de un control con respecto a la media esperada. valor z = ( Resultadoobservado – Mediaesperada ) / DEesperada Variabilidad biológica o fisiológica: Variación de los valores de las propiedades biológicas, que no son constantes puesto que varían en un mismo individuo (variabilidad biológica intraindividual) y entre los individuos (variabilidad biológica interindividual), causada por las fluctuaciones metabólicas y otros procesos fisiológicos. Variabilidad biológica intraindividual (CVi): variación biológica inherente alrededor del punto de equilibrio homeostático; fenómeno por el que los valores de las magnitudes biológicas de un individuo pueden cambiar de un momento a otro. Variabilidad biológica interindividual (CVg): fenómeno por el que los valores de las magnitudes biológicas de los individuos pueden ser diferentes entre sí. Es absolutamente independiente de la variabilidad debida a los procedimientos de medida (variabilidad metrológica). Variabilidad iatrogénica: Variación causada principalmente por los tratamientos farmacológicos. Variabilidad metrológica: variación causada por los procedimientos de medida. Variabilidad patológica: Variación causada por las enfermedades. Veracidad de medida: concordancia entre la media de los resultados de medida de un mensurando obtenidos en condiciones interdiarias y el valor verdadero o convencionalmente verdadero del mensurando. NOTAS: 1. la veracidad es un concepto cualitativo y el error sistemático es su equivalente cuantitativo. 2. este concepto es prácticamente equivalente al concepto "exactitud" anteriormente recomendado por la IFCC. Verificación: realizar el seguimiento y la medición de los procesos y los productos respecto a las políticas, los objetivos y los requisitos para el producto, e informar sobre los resultados. Confirmación mediante el examen y la aportación de evidencias objetivas que se han cumplido los requisitos especificados. Aportación de evidencia objetiva de que un elemento satisface los requisitos establecidos (VIM). Controlar y guardar traza de lo hecho (de la metodología “Planificar-Hacer-Verificar-Actuar”). NOTAS:1. confirmación que un resultado de control es aceptable según una gráfica de Levey-Jennings (lo cual indica que el procedimiento de medida se ha comportado cómo hacía falta esperar). 2. confirmación que la imprecisión de un sistema de medida es la especificada.

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DIRECCIONES WEB DE INTERÉS

http://www.aebm.org/ http://www.aefa.es/ http://www.aetel.es/ http://www.labtestsonline.es/ http://www.seqc.es/

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