Presentación porciFORUM 2020 - Alberto Morillo

Microbiota y salud intestinal en la nueva era bajo la restricción de antibióticos Alberto Morillo Alujas Tests and Trials

Con la colaboración de Sofía Lázaro (Exopol)

Microbiota y salud intestinal • Introducción: ¿Qué es salud intestinal?

• Procesos que conducen al síndrome post-destete • La función intestinal • Microbiota • Composición del alimento • Conclusiones

¿Qué es salud intestinal? ¿La que está en la naturaleza?

Festines y hambrunas

¿Veterinarios?

Ausencia de enfermedad

¿Nutricionista?

Aditivos…

¿Científicos?

Todavía no lo sabemos…

¿Producción animal?

Alto rendimiento y productividad.

Economía

¿Qué es salud intestinal?

• Digestión eficiente con una absorción de nutrientes máxima: dieta y su digestión • Microbiota normal y estable • Inmunidad efectiva • Bienestar global Bischoff, S.C. 2011. «“Gut health”: A new objective in medicine?» BMC Medicine 9.

Microbiota y salud intestinal • Introducción: ¿Qué es salud intestinal?

• Procesos que conducen al síndrome post-destete • La función intestinal • Microbiota • Composición del alimento • Conclusiones

Procesos que conducen al sĂ­ndrome post-destete

Procesos que conducen al síndrome post-destete Factores de riesgo Nutricionales: ● ● ● ●

Consumo de alimento errático Factores anti nutricionales Componentes complejos de las dietas Alto nivel de proteínas

Problemas ● ●

Consecuencias

De manejo: ● ● ●

Camadas numerosas, pesos bajos a destete Alta densidad de lechones en los destetes Higiene

Atrofia de las vellosidades intestinales Incremento de la permeabilidad y secreción de cloro

● ● ●

Translocación bacteriana Incremento de componentes no deseados de la dieta Diarrea

Procesos que conducen al síndrome post-destete Estrés psicológico ● ● ●

Separación de la cerda Mezcla con otros lechones Nuevo ambiente

Estrés del destete y sistema nervioso ● ● ●

Hipersecreción e hiper permeabilidad

Activación del sistema nervioso entérico CRF y mastocitos

El receptor CRF-R1 está sobre expresado en el yeyuno y colon de lechones destetados

Moeser AJ, et al. 2007. Stress signaling pathways activated by weaning mediate intestinal dysfunction in the pig. American Journal of Physiology - G Physiology.;292(1):G173–G181.

¿Por qué los lechones al destete comen poco?

Porcentaje de lechones destetados que no comieron tras el destete como función del intervalo entre el destete y el momento en que comienzan a comer. (media=10.7 h; SD=1.73 h).

Las curvas son para: • los comieron antes del destete (—), • para los que no comieron, (línea negra) y • para los que no tuvieron acceso al pienso (----).

Bruininx, E.M.A.M., et al., 2002. «Effect of creep feed consumption on individual feed intake characteristics and performance of group-housed weanling pigs». Journal of Animal Science 80 (6): 1413-18

¿Por qué los lechones al destete comen poco?

• Incremento

de consumo cuando el demostrador y el observador eran de la misma camada o corral

Figueroa, J., et al. 2013. «Social learning of feeding behaviour in pigs: Effects of neophobia and familiarity with the demonstrator conspecific». Applied Animal Behaviour Science 148 (1–2): 120-27

¿Cómo medir la salud intestinal?

M. Varley, 2017 (comentario en Pig Progress), alta correlación entre salud general y salud intestinal: • GMD desde 30 kg a matadero • Número de días en tratamiento antibiótico • Puntuación de lesiones pulmonares • Medida de proteína aguda • Mortalidad

¿Cómo medir la salud intestinal?

Cómo medirla: • Celi et al., 2018, biomarcadores:

• El establecimiento de biomarcadores de la función intestinal es crucial para el avance en la comprensión del funcionamiento de la barrera intestinal, su ecología y la microbiota intestinal • Conocemos cómo se absorben los nutrientes • Pero no acerca de: • Permeabilidad intestinal, función de la barrera intestinal, sistema endocrino del intestino y de la microbiota y sus metabolitos

Microbiota y salud intestinal • Introducción: ¿Qué es salud intestinal?

• Procesos que conducen al síndrome post-destete • La función intestinal • Microbiota • Composición del alimento • Conclusiones

La función intestinal •

Digestión de los alimentos

•

Absorción de nutrientes, electrolitos y secreción de agua

•

Proliferación de células epiteliales intestinales y diferenciación

•

Restitución epitelial tras agresiones y daños

•

Proteger al organismo frente a:

• Constituyentes alimenticios dañinos • Bacterias y virus Lallès JP. 2010. Basis and regulation of gut barrier function and epithelial cell protection: Applications to the weaned pig. Dynamics in Animal Nutrition. p. 31–51.

La función intestinal •

El epitelio es el mayor componente de la barrera intestinal

• Entre células (Tight Junctions, TJ) • A través de sistemas de protección celular (Heat Shock Proteins, HSP)

•

Uniones estrechas (Tight junctions): • • • •

Uniones intercelulares para conectar células del epitelio intestinal Une el citoesqueleto con filamentos de actina Controlan la permeabilidad paracellular Tipos: > 40, claudinas, ocludinas, proteínas de entramado de las uniones ocluyentes

Lallès JP. 2010. Basis and regulation of gut barrier function and epithelial cell protection: Applications to the weaned pig. Dynamics in Animal Nutrition. p. 31–51.

Ma TY, Anderson JM.2006. Tight Junctions and the Intestinal Barrier. 1559-1594 p.

La función intestinal • Función de la barrera epitelial y su regulación neuronal e inmunitaria • Comunicación directa entre el hospedador y la microbiota

(cross-talk) • Componente integrado en el eje cerebro-intestino • Sistema nervioso, mastocitos de la mucosa y otros mediadores del epitelio

Ma TY, Anderson JM.2006. Tight Junctions and the Intestinal Barrier. 1559-1594 p.

La función intestinal • Pérdida de enterocitos maduros ricos en enzimas digestivas.

• Reducción de la actividad enzimática del borde en cepillo del epitelio intestinal.

Microbiota y salud intestinal • Introducción: ¿Qué es salud intestinal?

• Procesos que conducen al síndrome post-destete • La función intestinal • Microbiota • Composición del alimento • Conclusiones

¿Es posible predecir en los primeros días de vida qué lechones tendrán diarrea tras el destete?

Fig 5. Contribution plots.

Fig 4. Individual plot of sPLS-DA classification model.

Dou, S. et al. 2017. «Characterisation of Early-Life Fecal Microbiota in Susceptible and Healthy Pigs to Post-Weaning Diarrhoea». PloS one 12 (1): e0169851.

Microbiota

¿Buena?, ¿Mala? o ¿más bien óptima?

ÂżExiste una microbiota sana?

PEA: Ruminococcus y Treponema

PEB: Prevotella y Mitsuokella Mayor peso y mayor GMD en el post-destete

Ramayo-Caldas, Y., et al.2016. Phylogenetic network analysis applied to pig gut microbiota identifies an ecosystem structure linked with growth traits.

The ISME journal, 10(12), 2973-2977.

Microbiota Microbiota intestinal del lechón: • • • • • •

Establecida 48h tras el nacimiento Heces maternas Autóctona o indígena Alóctona o no indígena Colonización Patógena

Depende de: • • • • • •

La edad del animal Del ambiente Agentes anti microbianos Dieta Estrés Genética

Reis de Souza TCR, et al. 2010. Some physiological and nutritional factors affecting the incidence of post-weaning diarrhea. Vet Méx. ;41:4.

Pluske JR, et al. 2002. Nutritional influences on some major enteric bacterial diseases of pigs. Nutrition Research Reviews.;15(2):333–71.

Holman, DB., et al. 2017. «Meta-Analysis To Define a Core Microbiota in the Swine Gut». MSystems 2 (3): e00004-17.

Microbiota Estómago e intestino delgado: • 103-105 bacterias/g, bajo pH y flujo rápido • Lactobacillus y Streptoccocus Intestino delgado distal • 108 bacterias/g Intestino grueso: • 400 especies diferentes • 1010 a 1011 bacterias/g Reis de Souza TCR, et al. 2010. Some physiological and nutritional factors affecting the incidence of post-weaning diarrhea. Vet Méx. ;41:4.

Pluske JR, et al. 2002. Nutritional influences on some major enteric bacterial diseases of pigs. Nutrition Research Reviews.;15(2):333–71.

Holman, DB., et al. 2017. «Meta-Analysis To Define a Core Microbiota in the Swine Gut». MSystems 2 (3): e00004-17.

Microbiota • Interacciones entre las bacterias intestinales y el epitelio intestinal • Mucina, repelente o atrayente

• Tratamientos proteolíticos dietéticos de los receptores de las glicoproteínas pueden prevenir su fijación al epitelio intestinal: bromelaína

• Bacterias comensales y patogénicas son determinantes en el desarrollo intestinal y en el mantenimiento de su homeostasis • Via Toll-Like Receptors (TLR)

Cario E, et al. 2007. Toll-Like Receptor 2 Controls Mucosal Inflammation by Regulating Epithelial Barrier Function. Gastroenterology. 132(4):1359–74.

Microbiota Funciones:

• Exclusión competitiva de las bacterias patógenas • Producción de nutrientes (como vit B, K, AGV) a través de rutas • •

metabólicas Estimulación del desarrollo de la protección intestinal El sistema inmunitario de la mucosa intestinal depende de las bacterias comensales y patógenas

Perez, JF, y Nofrarías, M.2008. Influencia de la nutricion sobre la patologia digestiva del lechon. XXIV Curso de especializacion Fedna. Madrid; p. 81–105.

Microbiota Cómo estudiarla:

• Técnicas de basadas en cultivo anaeróbicas: • • • •

Puedes cultivarla si conoces sus necesidades Falta de clasificación filogenética Diferentes tasas de supervivencia in vitro Bajo porcentaje de bacterias cultivables en el intestino

Leser TD, et al. 2002. Culture-independent analysis of gut bacteria: The pig gastrointestinal tract microbiota revisited. Applied and Environmental Microbiology. 68(2):673–90.

Microbiota Cómo estudiarla: • Técnicas independientes de basadas en el gen rRNA 16s • • • •

cultivo,

RFLP (Restriction Fragment Lenght Polimorfism) DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis) CE-CSSP (Capillary Electrophoresis single-strand conformation polymorphism)

• Bacterias no cultivables, puedes identificarlas • Ver la diversidad bacteriana • No hacer asignación taxonómica

Leser TD, et al. 2002. Culture-independent analysis of gut bacteria: The pig gastrointestinal tract microbiota revisited. Applied and Environmental Microbiology. 68(2):673–90.

Microbiota Cómo estudiarla: • Técnicas independientes de cultivo, basadas en el gen rRNA 16s • Real Time PCR – Búsqueda dirigida • Secuenciación de DNA (clonaje plásmidos)

en

• Bacterias no cultivables, puedes identificarlas • Ver la diversidad bacteriana • Hacer asignación taxonómica • Alto coste y tiempo

Leser TD, et al. 2002. Culture-independent analysis of gut bacteria: The pig gastrointestinal tract microbiota revisited. Applied and Environmental Microbiology. 68(2):673–90.

ÂżExisten diferencias en la microbiota en los diferentes tramos intestinales del lechĂłn?

¿Cómo es la microbiota intestinal en el cerdo?

1 mes

Yeyuno

2 meses

Íleon

3 meses

Ciego

6 meses

Colon

Zhao, W., et al. 2015. The dynamic distribution of porcine microbiota across different ages and gastrointestinal tract segments. PloS one, 10(2).

pH, ĂĄcidos biliares, disponibilidad de oxĂ­geno, nutrientes simples/complejos...

Zhang, L., 2018. Spatial heterogeneity and co-occurrence of mucosal and luminal microbiome across swine intestinal tract. Frontiers in microbiology, 9, 48.

Microbiota en el destete

Gresse, R., et al. 2017. Gut microbiota dysbiosis in postweaning piglets: understanding the keys to health. Trends in microbiology, 25(10), 851-873

Microbiota

“the intestinal microbiota (or microbiome, representing the genomic information of the microbiota) represents a compromise between helpful barrier functionality, synthesis of beneficial nutrients and proteins and improved energy harvest from dietary components with low inherent potential, and the deleterious effects of inflammation and sub-clinical (and clinical) pathologies (Celi et al., 2017)”

“La microbiota intestinal (o microbioma, que representa la información genómica de la microbiota) representa un compromiso entre: • la funcionalidad de barrera intestinal, • la síntesis de proteínas, de nutrientes beneficiosos, • el incremento de la absorción de energía de los componentes dietéticos con bajo potencial inherente, • y los efectos perjudiciales de la inflamación y la subinfección de las patologías clínicas.

Celi, P., et al. 2017. «Gastrointestinal Functionality in Animal Nutrition and Health: New Opportunities for Sustainable Animal Production». Animal Feed Science and Technology 234 (diciembre): 88-100.

Microbiota

Dou, S. et al. 2017. «Characterisation of Early-Life Fecal Microbiota in Susceptible and Healthy Pigs to Post-Weaning Diarrhoea». PloS one 12 (1): e0169851.

Microbiota

• 5 cerdas entre 3 y 5 partos.

• 2 hembras y 2 machos de cada cerda y peso en la mediana del peso de la camada.

• Pesados a las 0 y 24 h de vida • Muestras tomadas a los 7, 14, 21, 28, 30, 38, 40 días de vida.

Dou, S. et al. 2017. «Characterisation of Early-Life Fecal Microbiota in Susceptible and Healthy Pigs to Post-Weaning Diarrhoea». PloS one 12 (1): e0169851.

Fig 2. Dynamics of bacterial diversity (A) and evenness (B) in D and H pigs.

Sin diferencia en la toma de calostro ni en los componentes calostrales Dou, S. et al. 2017. ÂŤCharacterisation of Early-Life Fecal Microbiota in Susceptible and Healthy Pigs to Post-Weaning DiarrhoeaÂť. PloS one 12 (1): e0169851.

Microbiota • Diversidad bacteriana durante episodios de diarrea post destete asociado a la susceptibilidad de los lechones • Lechones con o sin diarrea post destete podían ser clasificados ya al día 7 de vida dependiendo de la microbiota: • Sanos: • abundancia de Prevotellaceae, Lachnospiraceae, Ruminocacaceae y Lactobacillaceae a día 7 de vida positivamente correlacionado con altos niveles de Bacteroidetes y negativamente con bajos niveles de Enterobacteriaceae

• Diarreicos: • A día 38 correlación negativa entre la abundancia de Enterobacteriaceae y la materia seca fecal Dou, S. et al. 2017. «Characterisation of Early-Life Fecal Microbiota in Susceptible and Healthy Pigs to Post-Weaning Diarrhoea». PloS one 12 (1): e0169851.

Microbiota

• 5 cerdas entre 3 y 5 partos.

Cerda Cerda Cerda Cerda Cerda 1 2 3 4 5

• 2 hembras y 2 machos de cada cerda y peso en la mediana del peso de la camada.

D

3

3

4

3

0

• Pesados a las 0 y 24 h de vida

H

1

1

0

1

4

• Muestras tomadas a los 7, 14, 21, 28, 30, 38, 40 días de vida.

Dou, S. et al. 2017. «Characterisation of Early-Life Fecal Microbiota in Susceptible and Healthy Pigs to Post-Weaning Diarrhoea». PloS one 12 (1): e0169851.

Fig 5. Contribution plots.

Fig 4. Individual plot of sPLS-DA classification model.

Dou, S. et al. 2017. «Characterisation of Early-Life Fecal Microbiota in Susceptible and Healthy Pigs to Post-Weaning Diarrhoea». PloS one 12 (1): e0169851.

Fig 5. Contribution plots.

(A) OTUs

en heces a PND 7 que contribuyen mayormente al grupo discriminante y su frecuencia. OTUs ordenadas (top 15 OTUs) de acuerdo a su contribución ponderada a la componente 1. i) Grupo H (sanos) o RE naranja ii) Grupo D (diarreicos) azul

B) Frecuencia de las familias bacterianas entre las OTU de grupo H (con barras naranjas).

C) Frecuencia de las familias bacterianas entre las OTU de grupo D (con barras azules).

Diarreico, D; H o RE, sano.

Dou, S. et al. 2017. «Characterisation of Early-Life Fecal Microbiota in Susceptible and Healthy Pigs to Post-Weaning Diarrhoea». PloS one 12 (1): e0169851.

Trasplante de heces (FMT: fecal microbiota transplantation) • Cerdos Jinhua no tratados con antibióticos, • SPF y también libres de circovirus-2 • 12 camadas paridas el mismo día y del mismo parto, de 9-10 lechones, • 2 grupos, 1,5 mL de suspension fecal y de solución salina • Destetados el día 28 • 6 lechones por grupo eutanasiados a día 12 y 27

Hu, L., et al.2017. Exogenous Fecal Microbiota Transplantation from Local Adult Pigs to Crossbred Newborn Piglets. Frontiers in microbiology 8: 2663.

Trasplante de heces

Hu, L., et al.2017. Exogenous Fecal Microbiota Transplantation from Local Adult Pigs to Crossbred Newborn Piglets. Frontiers in microbiology 8: 2663.

Microbiota y salud intestinal • Introducción: ¿Qué es salud intestinal?

• Procesos que conducen al síndrome post-destete • La función intestinal • Microbiota • Composición del alimento • Conclusiones

Composición del alimento • E. coli but what else?

• Contenido y composición de la fibra

Modificado de McDonald, 2001

Fuentes de fibra

Lechones no infectados

Lechones infectados

Valor P

Arroz

Cebada

Arroz

Cebada

Ganancia de PVV(g/d)

74

26

-28

-56

36.3

*

***

Intestino grueso (% peso vivo) AGV en el colon distal (mmol L-1)

2.7 84

3.8 114

2.6 60

3.2 78

0.62 20.4

** **

NS **

AGV en el ileon (mmol L-1) pH en el colon distal

18 6.8

9 6.1

12 6.8

14 6.5

5 0.37

* **

NS

E. coli yeyuno (log10CFUg-1) E. coli colon(log10CFUg-1)

0 0

0 0

0.9 3.2

4.2 6.2

2.44 1.89

* **

2.1

2.8

1.6

2.3

1.13

*

â—? Influencia del tipo de fibra

Viscosidad ileal (cP)

SEM Dieta Salud

McDonald D. et al. 2001. Soluble non-starch polysaccharides from pearl barley exacerbate experimental post-weaning colibacillosis. Proceedings of the 8th Symposium on Digestive Physiology in Pigs. ;280–2.

*

Fibra: ¿fermentabilidad o viscosidad?

Proporción de cerdos con diarrea Dieta

Día 7

Día 8

Día 9

Día 10

Arroz

0/8a

1/8a

0/8a

0/8a

Arroz + CMC baja viscosidad

5/8b

3/8b

4/8b

4/8b

Arroz + CMC alta viscosidad

7/7b

7/7b

7/7b

5/7b

< 0.05

< 0.05

< 0.05

< 0.05

p-valor

McDonald DE, et al. 2001. Increasing viscosity of the intestinal contents alters small intestinal structure and intestinal growth, and stimulates proliferation of enterotoxigenic Escherichia coli in newly-weaned pigs. British Journal of Nutrition. 86(4):487–98.

Fibra y colonización microbiana Concentración (micromol/g FM) de SCFA en la digesta del colon y poblaciones bacterianas en la digesta del ciego de lechones de 15 días tras el destete (modificado de Molist, 2009) Dietas

SEM

Control Salvado

Valor p

Pulpa de Salvado+ remolacha Pulpa

Butírico (colon)

11.7y

35.9x

12.2y

31.3x

10.83

0.027

Enterobacteria

11.1x

10.0xy

10.8xy

8.3y

1.14

< 0.05

Lactobacilli

11.7

12.0

11.9

11.5

0.53

0.572

Molist F, et al.2009. Effects of the insoluble and soluble dietary fibre on the physicochemical properties of digesta and the microbial activity in early weaned piglets.

Animal Feed Science and Technology. 149(3-4):346–53.

Molist, F., et al. 2014. «Relevance of functional properties of dietary fibre in diets for weanling pigs». Animal Feed Science and Technology 189 : 1-10

G/F: peor en Poor Diarrea: más en Poor en Fase I Enteroccocus en diarrea Fin tratamiento: Poor: + Lactobacillus, +Enterobacteria, - sulfito reductoras Poor: más VFA independiente de dieta

Fuentes de fibra39

S: condiciones sanitarias; D: dieta Montagne, L., et al. 2012. «Comparative effects of level of dietary fiber and sanitary conditions on the growth and health of weanling pigs». Journal of Animal Science 90 (8): 2556-69.

Las enzimas exรณgenas afectan a la microbiota del lechรณn.

Enzimas exógenas • Las enzimas no afecta a la microflora per se • Su efecto es como consecuencia de la rotura química de los PNA, principalmente arabinoxilanos y xilanos • Cambian el ratio entre Bifidobacteria y Lactobacilli • Reducen la viscosidad indirectamente

Aditivos no antibióticos en dietas de cerdos • Acidificantes: • Disminuyen las citoquinas proinflamatorias • Incrementan el número de lactobacilos y disminuyen el número de patógenos • Ácidos orgánicos: fórmico, láctico, fumárico, benzoico y cítrico • Ácidos grasos de cadena media • Combinación de ácidos orgánicos y grasos de cadena media • Ácidos inorgánicos: fosfórico • Sales de ácidos: diformiato potásico, formiato cálcico, diformiato sódico, fumarato sódico, butiratos…

• Mezcla de ácidos Liu, Y. et al. 2018.«Non-Antibiotic Feed Additives in Diets for Pigs: A Review». Animal Nutrition 4 (2): 113-25.

Aditivos no antibióticos en dietas de cerdos • Minerales: Cobre y Zinc • Prebióticos:

• Inulina, FOS, MOS, transgalacto-oligosacáridos, lactulosa y almidón resistente

• Microbianos y levaduras (probióticos) • Nucleótidos • Plantas y aceites esenciales

Liu, Y. et al. 2018.«Non-Antibiotic Feed Additives in Diets for Pigs: A Review». Animal Nutrition 4 (2): 113-25.

Microbiota y salud intestinal • Introducción: ¿Qué es salud intestinal?

• Procesos que conducen al síndrome post-destete • La función intestinal • Microbiota • Composición del alimento • Conclusiones

Conclusiones • La tecnología molecular, genética y la potencia de cálculo así como el big data, nos ayudarán a comprender y entender mejor cómo la microbiota interacciona con el sistema digestivo para incrementar la productividad de los lechones • El conocimiento de la composición de los ingredientes nos facilitará la comprensión de las fermentaciones digestivas • La manipulación del sistema inmunitario nos ayudará a modular la respuesta exacerbada ante desafíos a los que sometemos a los lechones

¡Gracias por su atención!

Alberto Morillo Alujas Tests and Trials

Con la colaboración de Sofía Lázaro (Exopol)