PRUEBAS IN VITRO COMO
HERRAMIENTA PARA EVALUAR LA EFICACIA DE LOS ADSORBENTES DE MICOTOXINAS
Una revisión sistemática
La presencia de micotoxinas en los piensos es un problema relevante en la industria de la alimentación animal.
Entre los más de 400 tipos de micotoxinas, un grupo de seis micotoxinas representan un alto riesgo para la salud animal y las ganancias productivas, siendo tres especies principales de mohos responsables de su producción:
Fusarium
Aspergillus
Penicillium
El desarrollo fúngico depende de las condiciones climáticas donde la temperatura, la humedad y la sequía influyen en el tipo de moho y, como consecuencia, en el tipo de micotoxinas producidas (Schatzmayr y Streit, 2013; Moretti et al., 2019).
Por ejemplo, Gruber- Dorninger et al. (2019) señalaron que el principal contaminante de muestras de maíz fue la fumonisina (FUM, 80%), seguido de deoxinivalenol (DON, 67%) y zearalenona (ZEN, 44%).
Los adsorbentes de micotoxinas (ADS) pueden reducir la carga de micotoxinas en el tracto gastrointestinal del animal, clasificándose en: ⮚
Inorgánicos, como las arcillas y el carbón activado
Orgánicos, como la pared celular de levaduras
La unión de las micotoxinas a los adsorbentes se debe principalmente a:
Interacciones químicas
La capacidad de intercambio catiónico involucra diferentes tipos de enlaces como:
Ion-dipolo
Fuerzas de Van der Walls
Enlaces de hidrógeno
ADSORCIÓN DE MICOTOXINAS
Estas propiedades no son específicas para adsorber micotoxinas, sino que moléculas orgánicas como los amino ácidos o vitaminas también pueden ser absorbidas.
Por ejemplo,Kihaletal.(2020) y BarrientosVelázquez,(2016) reportaron que la bentonita tiene capacidad para adsorber amino ácidos al 44% y vitaminas al 49%.
Características físicas
Tamaño de los poros del adsorbente
Estructura y forma de la micotoxina
La capacidad de adsorción de los adsorbentes de micotoxinas se determina mediante diferentes pruebas in vitro que simulan el tracto gastrointestinal de los animales.
Estas pruebas sirven como una herramienta de selección para evaluar el porcentaje de adsorción de micotoxinas un tipo de adsorbente antes de pasar los productos con los mejores resultados a pruebas in vivo
Con la ventaja de ser sencillas, rápidas y económicas, estas pruebas se han utilizado ampliamente, pero en ciertas condiciones, generan una variabilidad entre los estudios, siendo necesario que el método esté estandarizado y validado con pruebas in vivo
El objetivo de este estudio fue de revisar diferentes estudios in vitro publicados en la bibliografía para evaluar la capacidad de adsorción de micotoxinas de diferentes adsorbentes.
Materiales y métodos
Se realizó una búsqueda bibliográfica exhaustiva para identificar estudios que evaluaron la capacidad de adsorción de micotoxinas in vitro de distintos adsorbentes.
La búsqueda utilizó como palabras clave: Seis micotoxinas: aflatoxina (AF), deoxinivalenol (DON), fumonisina (FUM), ocratoxina A (OTA), toxina T-2 y zearalenona (ZEN).
Ocho adsorbentes: carbón activado (CA), bentonita, zeolita, clinoptilolita, sepiolita, montmorillonita, aluminosilicato de calcio y sodio hidratado (HSCAS) y pared celular de levaduras (LEV).
Capacidad de adsorción in vitro
Los estudios se retuvieron si:
A. Se describía el tipo del adsorbente.
B. El adsorbente se evaluó individualmente.
C. Se describía el medio de incubación del experimento.
El análisis final incluyó 68 artículos con 1.843 datos de porcentaje de adsorción de micotoxinas.
Los datos recopilados incluyeron las variables predictoras:
La micotoxina y el adsorbente
El pH del medio y el tipo de medio de incubación utilizado
En general, los artículos seleccionados utilizaron el modelo de concentración única con incubación a un solo valor de pH o con el cambio de un pH bajo a pH alto:
Cuando se utilizaba un solo valor de pH los medios de incubación fueron: metanol:agua o ácido clorhídrico:agua.
Cuando se utilizaba un dos pasos), se usaron medios de incubación para imitar el pH del tracto gastrointestinal usando medios de fosfato, acetato o citrato. se identificaron otros medios para simular la digestión gastrointestinal utilizando un medio con enzimas digestivas pancreatina), fluido ruminal o jugo gástrico.
La variable respuesta porcentaje de adsorción se analizó mediante el PROC MIXED de SAS (versión 9.4; SAS Institute Inc., Cary, NC).
Resultados y discusión
Efecto de los medios de incubación sobre la capacidad de adsorción de los adsorbentes
Los estudios in vitro se utilizan para evaluar la capacidad de adsorción de los adsorbentes, pero los resultados pueden verse afectados por las condiciones de incubación que pueden influir en la interacción entre los adsorbentes y las micotoxinas.
El reparto de los datos de adsorción incluidos en el análisis se clasifica en 6 diferentes medios de incubación, laFigura1 representa el porcentaje de datos para cada medio de incubación.
El método de dos pasos representó el 69% del total de los datos (Figura 1).
Los medios de agua y el tracto gastrointestinal simulado representaron el 10% de los datos, los medios de jugo gástrico el 6%, el ácido clorhídrico:agua el 3% y el metanol:agua el 2%.
CAF: medio citrato acetato fosfato; SGI: medio de simulación gastrointestinal; LG: jugo gástrico; HCL: clorhídrico.
El análisis del efecto de los medios sobre la capacidad de adsorción mostró que el jugo gástrico era el único método que difería de los otros métodos de dos pasos (P < 0,05) y, debido a que los resultados se vieron afectados por este método y representaron solo el 6% de los datos, fueron eliminados del conjunto de datos.
La capacidad de adsorción general de diferentes adsorbentes de micotoxinas
La Figura 2 muestra la repartición de datos dentro de los estudios incluidos en este análisis. La gráfica de la izquierda muestra la capacidad de adsorción media para cada de los 8 adsorbentes de micotoxinas para las 6 micotoxinas representadas en la gráfica de la derecha.
Entre los adsorbentes analizados, las LEV y la bentonita tuvieron el mayor número de observaciones (36% y 29% del total de los datos, respectivamente) y la clinoptilolita y la sepiolita tuvieron el menor número de observaciones (2% y 1% de los datos, respectivamente).
Figura 2. Distribución de los datos incluidos en el análisis para las micotoxinas (derecha) y adsorbentes de micotoxinas (izquierda).
CA: Carbón activado; HSCAS: aluminosilicato de calcio y sodio hidratado, LEV: pared celular de levaduras.
La Tabla 1 muestra los resultados de adsorción de cada adsorbente por cada micotoxina.
a, b, c Letras distintas en la misma columna indica efecto significativo entre adsorbentes (P < 0.05). x, y, z Letras distintas en la misma fila indica efecto significativo entre micotoxinas (P < 0.05). 1CA: carbón activado; HSCAS: aluminosilicatos de sodio y calcio hidratados; LEV: pared celular de levaduras. 2AFB1: aflatoxina B1; DON: deoxinivalenol; FUM: fumonisina; OTA: ocratoxina A; ZEN: zearalenona
Tabla 1. Porcentaje de adsorción de cada adsorbente de micotoxinas por cada micotoxina (Media ± SEM; adaptada de Kihal et al., 2022).
La capacidad de adsorción fue más alta para el CA (media del 81%) y no fue diferente entre las micotoxinas (rango entre el 53% con la toxina T-2 y el 93% con AFB1).
El resto de adsorbentes tuvieron menor adsorción en comparación con el CA, pero fueron similares entre sí, variando desde el 32% para zeolita hasta el 48% para HSCAS.
La adsorción media del HSCAS (48%) fue más alta para la AFB1 y ZEN, y más baja para el DON.
La adsorción media de la montmorillonita (48%) y bentonita (45%) fue alta para la AFB1 y baja para las demás micotoxinas.
La adsorción media de la sepiolita (46%) y LEV (34%) fue similar entre las micotoxinas, con un rango del 13-20% para el DON y 49% para la AF. Sin embargo, no había datos en los estudios incluidos en el análisis para evaluar la capacidad de adsorción de la sepiolita para las fumonisinas, OTA y toxina T-2.
La adsorción media de la clinoptilolita (32%) fue alta para AFB1 y baja para ZEN, e igual que la sepiolita, para el DON, las fumonisinas y OTA no había datos incluidos.
La adsorción de zeolita (32%) fue alta para la AFB1 y baja para el DON.
La adsorción media de la bentonita (45%) fue alta para la AFB1 y baja para las otras micotoxinas.
La mayor capacidad de adsorción del CA podría estar relacionada con su mecanismo de adsorción.
El tamaño de los poros del CA (nanómetros, nm) es más grande que el espacio interlaminar de las arcillas (angstrom, Å). Por tanto, las micotoxinas con estructuras químicas complejas pueden ingresar más fácilmente en los poros del CA. Además, la activación del CA mejora la capacidad de unión de micotoxinas polares y no polares, lo que lo hace menos selectivo y adsorbe diferentes tipos de micotoxinas.
En los estudios incluidos en esta revisión, las arcillas fueron menos efectivas, con una capacidad de adsorción similar entre los diferentes tipos.
ARCILLAS
El mecanismo de adsorción de las arcillas se basa en su capacidad de intercambio catiónico que incluye diferentes interacciones iónicas débiles. Las variaciones entre las micotoxinas pueden estar asociadas con la capacidad de intercambio de cationes y el espacio interlaminar, lo que varía entre diferentes tipos de arcillas según su origen (Nuryono et al., 2012; De Mil et al., 2015).
PARED CELULAR DE LEVADURAS
La capacidad de adsorción media de la LEV fue similar a la de las arcillas, aunque el mecanismo de adsorción es diferente y se basa en la combinación de estructuras de β-glucanos y micotoxinas (Jouany, 2007, Yiannikouris et. al, 2013).
En la gráfica de la derecha de la Figura2, se representa el porcentaje de adsorción media de cada una de las 6 micotoxinas por los diferentes adsorbentes. Al analizar los resultados desde el punto de vista de la adsorción de micotoxinas, y la ZEN tuvieron la mayor cantidad de observaciones 38%, 24% y 21% del total de los datos, respectivamente, y el DON, las fumonisinas y la toxina T-2 tuvieron las observaciones más bajas con el 9%, 6% y 1% del total de los datos, respectivamente (Figura 2).
La adsorción media fue la más alta para la AFB las micotoxinas, siendo la más alta para el CA (93%), la bentonita (86%) y la montmorillonita (88%) y la más baja para la LEV (49%).
AFLATOXINAS
Dos características principales permiten de AFB1 a los adsorbentes inorgánicos:
La estructura química pequeña y plana en el espacio interlaminar de las arcillas y los poros del CA.
La alta polaridad que facilita la interacción iónica con los adsorbentes. En cambio, estas propiedades no facilitan su adsorción a LEV.
FUMONISINA & TOXINA T-2
Las propiedades de las aflatoxinas son diferentes a las de otros tipos de micotoxinas como la fumonisina (peso molecular = 721 g/mol) y la toxina T-2 (peso molecular = 466 g/mol), cuyas estructuras químicas son mayores que la de las aflatoxinas (peso molecular = 312 g/mol) y con muchas ramificaciones.
Esta conformación estructural puede limitar la entrada de estas micotoxinas al espacio interlaminar de los adsorbentes a base de arcillas y, en consecuencia, disminuir su capacidad de adsorción.
A pesar de que el peso molecular del DON (296 g/ mol) es menor que el de la AFB1, su adsorción fue menor que la de la AFB1 (77% frente a 23%).
DEOXINIVALENOL
En este caso, podría sugerirse que la baja capacidad de adsorción del DON no está relacionada con su peso molecular o tamaño estructural, sino con sus propiedades químicas, como la baja polaridad o el alto número de átomos estereocéntricos (2 vs 7 para AFB1 y DON, respectivamente) que representan los dobles enlaces incluidos en la estructura química de la micotoxina y pueden afectar las interacciones de los enlaces con los cationes del adsorbente.
El DON tuvo la adsorción media más baja (23%), con la adsorción más alta al CA (69%) y la más baja a LEV (20%), bentonita (18%), HSCAS (11%), zeolita (10%) y montmorillonita (9%), pero la adsorción de sepiolita (13%) no fue diferente debido al bajo número de observaciones (n = 2).
La baja adsorción del DON podría deberse a su hidrofobicidad atribuida a ciclos aromáticos que limitan su unión a los adsorbentes con características hidrofílicas.
Además de la AFB1, la ZEN (50%) y la OTA (47%) tuvieron una adsorción media similar.
Para la ZEN, la adsorción al CA fue más alta (93%) y más baja en el resto de los adsorbentes (media de 38%), excepto para la sepiolita que no fue diferente (39%) probablemente debido al pequeño número de tratamientos reportados (n = 3).
De manera similar, la adsorción de OTA al CA fue más alta (88%) y más baja en el caso de las LEV (43%) y la bentonita (22%).
Joannis-Cassan et al. (2011) indicaron que el alto potencial de las LEV para adsorber OTA se debe a la alta correlación de manoproteínas en la LEV que representa el factor clave en la adsorción de la OTA. En cambio, para otras micotoxinas, los β-glucanos son el principal factor de adsorción.
Las fumonisinas y la toxina T-2 fueron las micotoxinas con menos observaciones (6% y 1%, respectivamente).
Para las fumonisinas (adsorción media de 45%), la capacidad de adsorción fue mayor en el caso del CA (83%) y menor en bentonita (32%), LEV (30%) y zeolita (26%).
Para la T-2 (media de 31%) la adsorción no fue diferente entre los adsorbentes (varía de 5,3% con zeolita a 53% con CA).
Hay investigaciones limitadas disponibles sobre la capacidad de adsorción de la toxina T-2. Carson y Smith (1983) y Bratich et al. (1990) señalaron que la adsorción de T-2 depende de la dosis del adsorbente y sugirieron que su dosis debe ser 10 veces mayor que la dosis habitual utilizada para la adsorción de aflatoxinas.
Si bien es cierto que las aflatoxinas han sido las micotoxinas más prevalentes en los alimentos, su prevalencia en las materias primas en los últimos años ha cambiado debido a estrategias de control exhaustivas y al cambio climático que afectan a los patrones de proliferación de mohos en ciertas regiones (Moretti et al., 2019).
Varios estudios han reportado la prevalencia de diferentes tipos de micotoxinas en todo el mundo (Streit et al., 2013; Eloska et al., 2019; Gruber-Dorninger et al., 2019) y los resultados del análisis de las muestras fueron coherentes entre los estudios.
Streit et al. (2013) reportaron datos sobre la prevalencia de micotoxinas entre 2004 y 2011 y demostraron que el DON (64%) y las fumonisinas (63%) fueron los principales contaminantes de los alimentos. Sin embargo, la aparición de las aflatoxinas solo fue importante en el sudeste de Asia, donde aumentó del 33% en 2004 al 70% en 2011. Los autores atribuyeron la alta incidencia de aflatoxinas en esta región al clima cálido de las regiones del sur.
Más tarde, Gruber- Dorninger et al. (2019) reportaron datos sobre la aparición de micotoxinas entre 2008 y 2017, y los resultados también mostraron una alta incidencia de DON (64%) y fumonisinas (60%) y una menor aparición de aflatoxinas (23%).
Eskola et al. (2019) compararon la prevalencia de micotoxinas de los conjuntos de datos de EFSA (EFSA Ref. 17238686; PAD 2017 017) y de Biomin (Kovalsky et al., 2016), y los resultados mostraron incidencias similares entre los dos conjuntos de datos con la incidencia más alta para la ZEN (80%) y el DON (60%).
Sorprendentemente, los datos recopilados en este estudio fueron mucho más bajos para la toxina T-2 (n = 26) y fumonisinas (n = 105) que para las aflatoxinas (n = 669), lo que pone de manifiesto la importancia que se le da a las aflatoxinas en detrimento de otras micotoxinas que también tienen alta prevalencia en los cultivos.
Efecto del pH sobre la capacidad de adsorción de los adsorbentes de micotoxinas
Los valores de pH de los medios de incubación se agruparon en 4 rangos:
Bajo: pH 1-4 (42% de los datos)
Intermedio: pH 5-6 (17% de los datos)
Alto: pH 7-9 (33% de los datos)
Métodos de dos pasos (de bajo a alto pH) registrando solo los valores finales de adsorción del procedimiento de incubación.
El análisis de los datos mostró que el pH tiene tendencia en afectar la adsorción de OTA y ZEN (P < 0,08):
La adsorción de OTA fue más alta con el pH de dos pasos (58%) y más baja con el pH bajo (53%) e intermedio (32%).
La adsorción de ZEN fue más alta con el pH de dos pasos (58%) y más baja con el pH bajo (47%), intermedio (49%) y alto (45%).
Es razonable pensar que el pH afecta más la adsorción de moléculas polares (Thieu y Pettersson, 2008).
Los resultados mostraron que la adsorción de OTA y ZEN es más eficiente cuando se utiliza el método de pH de dos pasos.
Sin embargo, las fumonisinas y las aflatoxinas son las micotoxinas más polares y su adsorción no se vio afectada por el pH. Por el contrario, la ZEN es la micotoxina menos polar y se vio afectada por el pH. En este sentido, otros factores podrían influir en la adsorción de micotoxinas como el tamaño y la estructura molecular o la solubilidad.
El análisis de datos también reveló el efecto del pH sobre la capacidad de adsorción de los adsorbentes (Figura 3).
pH bajo
pH intermedio
pH alto
Dos pasos
Adsorbentes de micotoxinas
CA: carbón activado; HSCAS: aluminosilicatos de sodio y calcio hidratados; LEV: pared celular de levaduras.
Concretamente, la capacidad de adsorción de las LEV se vio afectada por el pH (P < 0,05) y fue mayor con el pH bajo (43%) y menor con el pH alto (35%).
Estos resultados son consistentes con los de Faucet-Marquis et al. (2014) que reportaron que la capacidad de adsorción de las LEV es mayor a pH bajo o neutro al mejorar la estabilidad de los β-glucanos, responsables de la capacidad de adsorción de las LEV.
