Методическое указание для студентов к практическому занятию 12 Тема: Ферменты бактерий. Идентификация выделенной чистой культуры. Цель: Выучить методы идентификации выделенных чистых культур бактерий. Модуль 1. Морфология и физиология микроорганизмов. Инфекция. Иммунитет. Содержательный модуль 3. Метаболизм у бактерий. Физиология бактерий. Тема 12. Ферменты бактерий. Идентификация выделенной чистой культуры. Актуальность темы. Ферменты - биологические катализаторы высокомолекулярной структуры, которые вырабатываются живой клеткой. Они имеют белковую природу и играют важную роль в обмене веществ микроорганизмов. Ферменты обеспечивают усвоение бактериями питательных веществ и синтез сложных органических соединений. Основные 6 группы ферментов: а) гидролазы - расщепляют белки, углеводы, липиды путем присоединения воды; б) оксидоредуктазы - катализируют окислительно-восстановительные реакции; в) трансферазы - осуществляют перенос отдельных атомов от молекулы к молекуле; г) лиазы - отщепляют химические группы негидролизным путем; д) изомеразы - принимают участие в обмене углеводов; е) лигазы - оказывают содействие биосинтетическим реакциям клетки. Различают конститутивные и адаптивные ферменты, а также ферменты агрессии. Ферменты бактерий имеют высокую активность и широко применяются в промышленности, сельском хозяйстве, медицине. В медицинской промышленности благодаря применению ферментов получают алкалоиды, стероиды, полисахариды. В сельском хозяйстве на основе ферментов дрожжей получают белково-витаминные концентраты на продуктах отхода нефти. Для каждого вида бактерий характерны специфические ферменты, поэтому в микробиологии ферментативная активность бактерий используется для идентификации бактерий. Изучение биохимических свойств бактерий проводится на дифференциальнодиагностических средах (Эндо, Левина, Плоскирева, Ресселя, Гисса и др.). Дифференциально-диагностические среды делятся на три группы: 1) среды для выявления протеолитических свойства бактерий (МПБ, мясопептонный желатин); 2) среды для изучения ферментации углеводов (Эндо, Плоскирева, Гисса, Ресселя); 3) среды для определения гемолитических свойств (кровяной агар).
Изучение протеолитических свойств проводиться с помощью индикаторов, позволяющих обнаруживать образование сероводорода, индола и т.д. при расщеплении белка. Для этого используют индикаторы ацетата свинца (на сероводород) и щавелевой кислоты (на индол). Индикаторы при их использовании изменяют цвет: при выделении сероводорода - чернеют, при выделении индола - краснеют. Для определения ферментации углеводов используются среды Гисса, в состав которых входят глюкоза, лактоза, маннит, мальтоза, сахароза и индикатор Андреде (карболовый фуксин, обесцвеченный содой). При ферментации того или другого углевода среда краснеет. • • • •
• • • • • • 1. 2. 3. 4. 5.
Конкретные цели: Изучить методы идентификации выделенных чистых культур бактерий. Описывать наиболее употребляемые дифференциально-диагностические питательные среды и их приготовление. Объяснять изменения в дифференциально-диагностических средах при росте бактерий. Трактовать результаты идентификации выделенных чистых культур бактерий и делать вывод. Уметь: Проводить посев бактерий на дифференциально-диагностические питательные среды. Проводить проверку выделенных культур бактерий на чистоту. Готовить микропрепараты из выделенных культур бактерий. Окрашивать микропрепараты по Граму. Проводить микроскопию микропрепаратов с помощью иммерсионного микроскопа. Анализировать ферментативные свойства выделенных чистых культур. Теоретические вопросы: Ферменты бактерий, их классификация. Использование микробов и их ферментов в биотехнологии. Методы изучения ферментативной активности бактерий и использование их для идентификации бактерий. Современные методы ускоренной идентификации бактерий с помощью автоматизированных индикаторов ферментативной активности. Дифференциально-диагностические питательные среды. Общий принцип их пользования (примеры).
Практические задачи, которые выполняются на занятии: 1. Продолжение выделения чистых культур бактерий: проверка чистоты культуры. 2. Приготовление микропрепаратов из выделенной чистой культуры.
3. Окрашивание микропрепаратов по Граму. 4. Микроскопия микропрепаратов из чистых культур бактерий, их анализ и зарисовывание в протокол. 5. Пересев выделенной чистой культуры на среды Гисса, и МПБ для выявления индола и сероводорода. 6. Оформление протокола. Литература: 1. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбаков А.М. Микробиология.М.: Медицина, 1998.- 336с. 2. Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.- М.: ГЕОТАФ-МЕД, 2001.- 768с. 3. Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія.- К.: "Вища школа", 1992.– 431с. 4. Коротяев А.И., Бабичев С.О. Медицинская микробиология, иммунология и вірусологія /Учебник для медицинских ВУЗов.- С-Пб.: «Специальная литература», 1998.- 592с. 5. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология /Учебник.– 2-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1983,- 512с. 6. Конспект лекций. Дополнительная литература: 1. Тiтов М.В. Iнфекцiйнi хвороби.- К., 1995.– 321с. 2. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни.- М.: Медицина, 1990.- 559 с. 3. БМЭ, Т. 1, 2, 7. Короткие методические указания к работе на практическом занятии. В начале занятия проводится проверка уровня подготовки студентов к занятию. Самостоятельная работа состоит из изучение дифференциальнодиагностических питательных сред, используемые для идентификации выделенных бактерий. Потом студенты изучают собственные посевы, сделанные на предыдущем занятии: проводится проверка чистоты культуры. Для этого студенты готовят микропрепараты из выделенной чистой культуры, окрашивают их по Граму и проводят микроскопию. После анализа микропрепаратов, их зарисовывают в протокол. На втором этапе студенты проводят пересев выделенной чистой культуры на среды Гисса и МПБ для выявления индола и сероводорода. В конце занятие проводится оформление протокола, тестовый контроль и анализ итогов результатов самостоятельной работы каждого студента.
Технологическая карта проведения практического занятия № Этапы Вре Средства Оснащение Место п/п мя в обучения проведения мин. 1 Проверка и 20' Тестовые задачи Таблицы, колкоррекция исисходного лекция диффеходного уровуровня ренциальноУ ня подготовки диагностичесЧ к занятию ких сред, чисЕ тых и засеянБ ных бактерияН ми (Левина, А Плоскирева, Я Гисса, кровяной агар) 2 Самостоятель 35' Графы Иммерсионный К ная работа логической микроскоп, О структуры. краски, предМ метное стекло, Н бактериологиА ческие петли, Т собственные А посевы чистых культур бактерий, среды Гисса, КиттТароцци, молоко под вазелиновым маслом, МПБ, индикаторы на сероводород и индол. 3 Самоконтроль 15' Целевые учебные и коррекция задания усвоения материала 4 Тестовый 15' Тесты контроль 5 Анализ 5' результатов работы
Целевые учебные задачи: 1. Резистентность к пенициллинам и цефалоспоринам, в частности стафилококков, обусловлена их способностью вырабатывать беталактамазы. Укажите, к какому типу из пересчитанных групп принадлежат эти ферменты? А. Конструктивные D. Каталитические В. Индуктивные Е. Эффекторные С. Трансферазы 2. У ребенка 6 мес., страдающего на кишечную инфекцию, из испражнений высеяли бактерии, образующие красные колонии на среде Эндо. Какой вид бактерий дает колонии такого типа на среде Эндо? А. Стафилококки D. Сальмонеллы В. Стрептококки Е. Шигеллы С. Кишечная палочка 3. При плановом обследовании персонала одного из детских садов на бактерионосительство патогенных бактерий, у одной из воспитательниц выделена чистая культура бактерий, которая на кровяном агаре образовывала золотистые колонии с зоной гемолиза. Носительство какого вида бактерий можно заподозрить в этом случае? А. Менингококки D. Сарцины В. Гонококки Е. Стафилококки С. Микрококки 4. В хирургическом отделении возникла вспышка госпитальной инфекции, вызванная сальмонеллами. Какие колонии образовывают эти бактерии на среде Эндо? А. Бесцветные колонии D. Белые колонии В. Красные колонии Е. Не дают роста С. Желтые колонии 5. На практическом занятии студенты оценивали протеолитические свойства сальмонелл и выявили потемнение индикатора с ацетатом свинца. Какое вещество способствовало потемнению индикатора? А. СО2 С. Аммиак Е. Метан В. Индол D. Н2 S 6. В лаборатории была приготовлена среда Эндо и разлита в чашки Петри. Когда через 2 дня ее должны были использовать для выделения кишечных бактерий, оказалось, что среда имеет красный цвет. Какая наиболее вероятная ошибка была сделана при приготовлении среды? A. Неверно выбран способ стерилизации B. Избыточное количество индикатора C. Не соблюдено соотношения глюкозы и лактозы D. При разливе среды в нее попали бактерии из воздуха E. Не было проверено рН среды
7. Известно, что в состав клеток бактерий входят разнообразные ферменты. Какие с перечисленных ферментов есть ферментами агрессии? А. Коллагеназы D. Карбогидразы В. Пермеазы Е. Лигазы С. Дегидрогеназы 8. Известно, что питательные среды разделяют на универсальные, специальные, элективные и дифференциально-диагностические. Какие из перечисленных питательных сред относятся к дифференциальнодиагностическим? А. МПА D. МПБ В. Щелочная пептонная вода Е. Сывороточный агар С. Гисса 9. Известно, что для выделения чистой культуры бактерий кишечнотифозной семейства используется дифференциально-диагностическая среда Эндо. Какой углевод входит в состав этой среды? А. Глюкоза С. Мальтоза Е. Сахароза В. Лактоза D. Маннит 1. При бактериологическом обследовании больного ангиной на кровяном агаре изолирована культура патогенного стафилококка. Какой фермент патогенности стафилококка выявляется на такой среде? A. Лецитиназа D. Фибринолизин В. Гемолизин Е. Каталаза С. Плазмокоагулаза
1.
2. 3. 4. 5. 6.
Алгоритм лабораторной работы: Изучение роста выделенной чистой культуры на скошенном МПА: а) описание роста бактерий, б) проверка чистоты культуры - приготовление мазков, окраска по Граму, микроскопия и анализ. Зарисовать приготовленный микропрепарат в протокол. Пересеять выделенную чистую культуру на среду Гисса. Пересеять выделенную чистую культуру на МПА и установить индикаторы на индол и сероводород. С целью подготовки к следующего занятию, посеять грунт на среду Китт-Тароцци и молоко под вазелиновым маслом. Оформление протокола.
Граф логической структуры темы: “ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СРЕДЫ” Дифференциальнодиагностические среды
Среды для определения ферментации углеводов
Среды для выявления протеолитических свойств
МПБ
Среды для определения гемолитических свойств Кровяной агар
МПЖ
Эндо
Ресселя
Гисса
Граф логической структуры темы: “ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ” Ферменты бактерий
Оксидоредуктазы
Трансферазы
Перенос электронов
Перенос разных химических групп
Гидролазы
Реакции гидролиза
Лиазы
Образование двойных связей и катализ обратных реакций
Изомеразы
Образование изомерных форм
Лигазы
Образование С-С, С-S, С-О, С-N связей при гидролизе АТФ