1 metodichka po mikrobiologii

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Оренбургский государственный университет» Кафедра микробиологии

Е.А. ДРОЗДОВА

МИКРОБИОЛОГИЯ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНОМУ ПРАКТИКУМУ

Рекомендовано к изданию Редакционно-издательским советом государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Оренбургский государственный университет»

Оренбург 2008 УДК 579(076.5) ББК 28.4 я 73 Д 75

Рецензент канд. биолог. наук, доцент каф. микробиологии, А.Н. Сизенцов

Д-75

Дроздова Е.А. Микробиология: методические указания к лабораторному практикуму/ Е.А. Дроздова. – Оренбург: ГОУ ОГУ, 2008. – 84 с.

Методические указания предназначены для выполнения лабораторных работ студентами третьего курса факультета пищевых производств по дисциплинам «Микробиология», «Биология и микробиология». Лабораторный практикум состоит из 11 лабораторных работ. Каждая лабораторная работа включает теоретический материал, описание методик проведения микробиологических исследований, задание и вопросы для самоподготовки.

ББК 28.4 я 73

2

© Дроздова Е.А., 2008 © ГОУ ОГУ, 2008

3

Содержание Введение…………………………………………………………………….……..5 1 Правила поведения в лаборатории……………………………………….……6 2 Лабораторная работа № 1. Устройство светового микроскопа. Виды и техника микроскопирования…………………………….….……………………6 2.1 Устройство светового микроскопа……………………………..….………...6 2.2 Правила работы с биологическим микроскопом. Техника микроскопии……………………………………………..…………….14 2.3 Изготовление нативных препаратов (содержащих живые клетки) микроорганизмов……………………..…………………………….…..14 2.4. Задание к лабораторной работе………………………………………...…..15 2.5 Вопросы к защите лабораторной работы № 1…………………………......16 3 Лабораторная работа № 2 Понятие о прокариотах и истинно ядерных микроорганизмах.……………………………………………..………17 3.1 Сравнительный анализ прокариотических и эукариотических клеток………………………………………………………...17 3.2 Методика выполнения работы……………………………………………...19 3.3 Вопросы к защите лабораторной работы № 2…………………..………....19 4 Лабораторная работа № 3 Морфология, строение и химический состав бактериальных клеток………………………………………………..….19 4.1 Морфология бактерий…………………………………….………………....20 4.2 Методы окраски микробиологических препаратов……………………….26 4.3 Задания к лабораторной работе……………………………………………..30 4.4 Вопросы к защите лабораторной работы № 3……………………………..30 5 Лабораторная работа № 4 Эндоспоры, цитоплазматические включения бактерий. Передвижение бактерий…………………………..........31 5.1 Капсула бактерий…………………………………………………………....31 5.2 Эндоспоры бактерий………………………………………………………...31 5.3 Цитоплазматические включения…………………………………………...33 5.4 Подвижность бактерий…………………………………………………..….34 5.5 Задание к лабораторной работе…………………………………………….35 5.6 Вопросы к защите лабораторной работы № 4………………………….....35 6 Лабораторная работа № 5 Мицелиальные грибы. Систематика……….......36 6.1 Морфология мицелиальных грибов. Общая характеристика…………….36 6.2 Размножение и классификация……………………………………………..41 6.3 Задание к лабораторной работе……………………………………………..45 6.4 Вопросы к защите лабораторной работы № 5……………………………..45 7 Лабораторная работа № 6. Дрожжи……………..……...……………….……45 7.1 Общая характеристика дрожжей…………………………………………....45 7.2 Задание к лабораторной работе……………………………………………..48 7.3 Вопросы к защите лабораторной работы № 5……………………………..49 8 Лабораторная работа № 7. Молочно-кислое брожение……………...……..50 8.1 Общая характеристика молочно-кислого брожения и микроорганизмов, его вызывающих……………………………………………50 4

8.2 Задание к лабораторной работе……………………………………………..51 8.3 Вопросы к защите лабораторной работы…………………………………..52 9 Лабораторная работа № 8. Определение бактериальной обсемененности пищевых продуктов…………………………………….....….53 9.1 Методика выполнения работы……………………………………………...53 9.2 Задание к лабораторной работе……………………………………………..55 9.3 Вопросы к защите лабораторной работы…………………………………..55 10 Лабораторная работа № 9. Культивирование микроорганизмов.......……..56 10.1 общая характеристика питательных сред. Классификация питательных сред……………………………………………………….………..60 10.2 Состав питательных сред…………………………………………………..60 10.3 Культивирование микроорганизмов……………………………………....63 10.3.1 Техника посева микроорганизмов в жидкие питательные среды…......66 10.3.2 Техника посева микроорганизмов на агаризованную среду……….….66 10.3.3 Техника культивирования анаэробных микроорганизмов…………….67 10.4 Методы стерилизации……………………………………………………...68 10.5 Задание к лабораторной работе……………………………………….…...71 10.6 Вопросы к защите лабораторной работы………………………………....74 11 Лабораторная работа № 10. Количественный учет и идентификация микроорганизмов. Выделение чистых культур микроорганизмов…………...75 11.1 Задание к лабораторной работе…………………………………………....75 11.2 Вопросы к защите лабораторной работы……………….……….………..78 12 Лабораторная работа № 11. Определение чистоты выделенной культуры микроорганизмов……………………….………….………................79 12.1 Задание к лабораторной работе…………………………..………………..79 Список использованных источников….………………………..………………79 Приложение А Вопросы для подготовки к экзамену по дисциплине «Микробиология» для студентов специальностей: 260201 – ТХПЗ, 260202 – ТХМК, 260204 – ТБПиВ ……………………..………………………81 Приложение Б Вопросы для подготовки к экзамену по дисциплине «Микробиология» для студентов специальностей: 260502 – Технология продукции общественного питания, 260505 – Технология детского и функционального питания……...…………………………………………….83

5

Введение Дисциплины «Микробиология», «Биология и микробиология» изучаются студентами факультета пищевых производств по направлениям подготовки: - 260200 – «Производство продуктов питания из растительного и животного сырья» у специальностей: 260201 – Технология хранения и переработки зерна, 260202 – Технология хлеба, кондитерских и макаронных изделий, 260204 – Технология бродильных производств и виноделие; - 260500 – Технология продовольственных продуктов специального назначения и общественного питания у специальностей: 260502 – Технология продукции общественного питания, 260505 – Технология детского и функционального питания; - 260300 - Технология сырья и продуктов животного происхождения для специальностей: 260301 – Технология мяса и мясных продуктов, 260303 – Технология молока и молочных продуктов. Дисциплина «Микробиология» изучается студентами в 6-ом семестре в цикле общепрофессиональных дисциплин (Федеральный компонент ОПД.Ф.09, ОПД.Ф.08). Дисциплина «Биология и микробиология» изучается студентами в 6-ом семестре в цикле общих математических и естественнонаучных дисциплин (Федеральный компонент ЕН.Ф.06). Дисциплины изучаются в соответствии с учебными планами специальностей с учетом ГОС ВПО (раздел 4 «Общие требования к обязательному минимуму содержания основной образовательной программы по направлениям подготовки дипломированного специалиста), введенными в действие Министерством образования Российской Федерации. Методические указания предназначены для выполнения лабораторных работ студентами третьего курса факультета пищевых производств по дисциплинам «Микробиология», «Биология и микробиология». Лабораторный практикум состоит из 11 лабораторных работ. Каждая лабораторная работа включает теоретический материал, описание методик проведения микробиологических исследований, задание и вопросы для самоподготовки. Основной целью преподавания дисциплин является освоение основных методов исследования, применяемых к микроорганизмам (световая, фазовоконтрастная, люминесцентная и электронная микроскопии); формирование развернутых представлений о морфологии и классификации микроорганизмов, а также основных процессах, ими вызываемых. В органической связи с получением фундаментальных знаний по данной дисциплине важной целью ее изучения является формирование практических навыков проведения различных видов микроскопии, приготовления микроскопических препаратов, оценки результатов микроскопических исследований.

6

1 Правила поведения в лаборатории На первом практическом занятии студентам необходимо ознакомиться с техникой безопасности и режимом работы микробиологической лаборатории. Входя в лабораторию, надеть медицинский халат, проверить, исправно ли оборудование, микроскопы. Обо всех неисправностях немедленно сообщить преподавателю или ведущему инженеру. Вход без халата в микробиологическую лабораторию воспрещен. Во время выполнения практических работ избегать излишнего хождения и разговоров, открывания и закрывания дверей, что усиливает движение воздуха, не принимать пищу. Личные вещи держать в отведенном для этого месте. При себе иметь ручку, цветные карандаши и тетрадь для записи занятий и зарисовки микробиологических признаков микроорганизмов, производить которые следует непосредственно с препарата, а не из книги или таблицы. Стол, одежду или другие предметы, случайно загрязненные исследуемым материалом или культурой микробов (разбилась пробирка и т.д.) подвергнуть немедленной дезинфекции в присутствии преподавателя или ведущего инженера. После окончания работы сдать засеянные культуры инженеру или преподавателю, привести в порядок рабочее место, протереть и убрать микроскоп, тщательно вымыть руки и снять халат.

2 Лабораторная работа № 1. Микроскоп. Виды и техника микроскопирования Цель работы – изучить устройство светового микроскопа и технику микроскопирования на примере препаратов «висячая» и «раздавленная капля».

2.1 Устройство светового микроскопа Микроскоп (от греч. mikros - малый и skopeo - смотрю) - оптический прибор для получения увеличенного изображения мелких объектов и их деталей, невидимых невооруженным глазом. Первый из известных микроскопов был создан в 1590 году в Нидерландах потомственными оптиками Захарием и Хансом Янсенами, смонтировавшими две выпуклые линзы внутри одной трубки. Позднее Декарт в своей книге "Диоптрика" (1637) описал более сложный микроскоп, составленный из двух линз - плоско-вогнутой (окуляр) и двояковыпуклой (объектив). Дальнейшее же совершенствование оптики позволило Антони ван Левенгуку в 1674 г. изготовить линзы с увеличением, достаточным для

7

проведения простых научных наблюдений и впервые в 1683 году описать микроорганизмы. Современный микроскоп (рисунок 1) состоит из трех основных частей: оптической, осветительной и механической.

1 — основание микроскопа; 2 — коробка с механизмом микрометрического фокусирования; 3 — микрометрический винт; 4 — макрометрический винт; 5 и 6 — винты для перемещения столика; 7 — тубусодержатель; 8 — головка микроскопа; 9 — насадка монокулярная (тубус с окуляром); 10 — винт для крепления насадки; 11 — винт, фиксирующий револьвер относительно тубуса; 12 — револьвер с объективами; 13 — предметный столик; 14 — винт для крепления конденсора; 15 — конденсор; 16 — дополнительная линза; 17 — рукоятка кронштейна; 18 — зеркало; 19 — кронштейн. Рисунок 1 - Схема микроскопа «Биолам» Основными деталями оптической части микроскопа являются две системы увеличительных линз: обращенный к глазу исследователя окуляр и обращенный к препарату объектив. Окуляры имеют две линзы, верхняя из которых называется главной, а нижняя собирательной. На оправе окуляров обозначают производимое ими увеличение (×5, ×7, ×10, ×15). Количество окуляров у микроскопа может быть различным, в связи с чем различат монокулярные и бинокулярные микроскопы (предназначены для наблюдения за объектом одним или двумя глазами), а также тринокуляры, позволяющие подключать к микроскопу системы документирования (фото- и 8

видеокамеры). Объективы представляют собой систему линз, заключенных в металлическую оправу, из которых передняя (фронтальная) линза производит увеличение, а лежащие за ней коррекционные линзы устраняют недостатки оптического изображения. На оправе объективов цифрами также указано производимое ими увеличение (×8, ×10, ×40, ×100). Большинство моделей, предназначенных для микробиологических исследований, имеют в комплекте несколько объективов с разными степенями увеличения и поворотный механизм, предназначенный для их быстрой смены – турель, часто называемый «револьверной головкой». Осветительная часть предназначена для создания светового потока, который позволяет осветить объект таким образом, чтобы оптическая часть микроскопа предельно точно выполняла свои функции. Осветительная часть в прямых микроскопа проходящего света расположена за объектом под объективом и включает в себя источник света (лампу и электрический блок питания) и оптико-механическую систему (конденсор, полевую и апертурную регулируемую диафрагмы). Конденсор состоит из системы линз, которые предназначены для собирания идущих от источника света лучей в одной точке – фокусе, которая должна находиться в плоскости рассматриваемого объекта. В свою очередь диафрагма расположена под конденсором и предназначена для регулирования (увеличения или уменьшения) потока лучей, проходящих от источника света. Механическая часть микроскопа содержит детали, объединяющие описанные выше оптическую и осветительную части, а также позволяющие размещать и перемещать исследуемый препарат. Соответственно, механическая часть состоит из основания микроскопа и держателя, к верхней части которого прикрепляются тубус – полая трубка, предназначенная для размещения объектива, а также упомянутая выше револьверная головка. Ниже находится предметный столик, на который устанавливаются предметные стекла с исследуемыми образцами. Предметный столик может перемещаться в горизонтальной плоскости с использованием соответствующего устройства, а также вверх и вниз, что обеспечивает настройку резкости изображения с помощью грубого (макрометрического) и точного (микрометрического) винтов. Увеличение, которое дает микроскоп, определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Кроме светопольной микроскопии широкое применение в специальных методах исследования плучили: темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная (флюоресцентная) и электронная микроскопия. Метод светлого поля в проходящем свете применяется для изучения прозрачных объектов с неоднородными включениями (простейшие и бактерии в жидкостях, тонкие срезы растительных и животных тканей, тонкие полированные пластинки некоторых минералов). При выполнении данного вида микроскопии пучок лучей из осветительной системы проходит сквозь препарат и дает равномерно освещенное поле в плоскости изображения. В свою очередь элементы структуры препарата частично 9

поглощают и отклоняют падающий на них свет, что и обусловливает появление изображения. Темнопольная и фазово-контрастная микроскопия. Возможность наблюдения микроорганизмов в живом (неокрашенном) состоянии обеспечивается использованием темнопольной и фазово-контрастной микроскопии, требующих использования специальных конденсоров и позволяющих получать черно-белые изображения исследуемых микроорганизмов с возможностями изучения их формы, подвижности, деления и т.д. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. Данный вид микроскопии впервые был предложен австрийскими учеными Р.Зигмонди и Р.Зидентопфом в 1903 г. При его выполнеии объект освещают не снизу, а сбоку, в результате чего прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают и поле зрения остается темным. Подобный тип освещения достигается использованием специального темнопольного конденсора (параболоида или кардиоида) с затемненной центральной частью. Кроме того, чтобы в объектив не попадали прямые лучи от осветителя, апертура объектива должна быть меньше, чем апертура конденсора (для уменьшения апертуры в обычный объектив помещают диафрагму или пользуются специальными объективами, снабженными ирисовой диафрагмой). В свою очередь объект освещается косыми боковыми лучами и в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате. Сказанное объясняет, почему при темнопольной микроскопии микроорганизмы выглядят ярко светящимися на черном фоне (рисунок 3). Ограничениями же темнопольной микроскопии является то, что она позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучать его внутреннюю структуру. В основе метода фазово-контрастной микроскопии, также предназначенного для наблюдения микроорганизмов в живом (неокрашенном) состоянии лежит иной физический принцип, впервые предложенный Ф.Цернике в1935 году (Нобелевская премия по физике, 1953 г.). Суть его заключается в том, что в обычных условиях при прохождении пучка света через неокрашенный объект, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменяется лишь фаза колебания световой волны, не воспринимаемая человеческим глазом. Чтобы изображение стало контрастным необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные, что достигается с помощью специального фазово-контрастного устройства. Основными деталями подобного устройства, которое может быть установлено на любом световом микроскопе, являются фазовоконтрастный конденсор и фазовый объектив. Фазовоконтрастный конденсор представляет собой револьверную конструкцию, в которой установлены кольцевые диафрагмы, обеспечивающие освещение препарата полным конусом света и 10

соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов. В свою очередь фазовый объектив отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе расположена фазовая пластинка, имеющая форму кольца и получаемая нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. При этом установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо. При изучении препарата весь свет, прошедший через его участки, в которых нет каких-либо объектов, без изменений пройдет и через фазовое кольцо, обусловив светлое изображение фона. В свою очередь свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например, бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча — недифрагированный и дифрагированный. Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы. Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости же полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как они идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение с уменьшением амплитуды. Благодаря применению этого метода микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов относительно фона резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст). Фaзoвoму кoнтpacту пpиcущ эффeкт Гaлo - появление светящегося ореола по контуру изображения объекта, что затрудняет изучение cвoйcтв кpaeвыx cтpуктуp наблюдаемых объектов, нaпpимep, не позволяет тoчнo зaмepять углы или расстояния. Для устранения данного недостатка используется вариант фазово-контрастной микроскопии – так называемый «хоффмановский контраст». Другой разновидностью данного метода является аноптральная микроскопия, преимуществами которой являются большая разрешающая способность с выявлением минимальных разностей плотности в неокрашенных препаратах. Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия. Основы люминесцентной микроскопии были заложены А.Келером, обосновавшим принципиальную возможность подобного метода исследования. Первое устройство для его осуществления впервые было создано в 1911 г., однако широкое распространение получило двумя десятилетиями позже, когда для окрашивания препаратов были предложены специальные вещества – флюорохромы, избирательно связывающиеся с определенными структурами клеток (М.Хайтингер, 1933-1935). Чуть позже было предложено коньюгировать флюорохромы с антителами, что положило начало метода иммунофлюоресценции (А.Н.Кунс, 1942). В бывшем СССР наибольший вклад в развитие метода люминесцентной микроскопии и создание отечественной промышленностью люминесцентных микроскопов и устройств, основанных на этом принципе, внес М.Н.Мейсель (1953).

11

В основе люминесцентной микроскопии (от лат. lumen - свет; греч. micros -малый + skopeo - рассматривать) лежит принцип люминесценции (видимого глазом свечения) микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур. При этом физические основы возникновения свечения связаны с процессом поглощения определенными молекулами падающего на них света с последующим испусканием квантов с другой (большей) длиной волны (правило Стокса). Первичная (собственная) флюоресценция возникает без специальной обработки препаратов и присуща ряду биологически активных веществ, таких, как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А, В2, В1 , некоторые антибиотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол). Вторичная (наведенная) флюоресценция возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями – флюорохромами. Некоторые из этих красителей диффузно распределяются в клетках, другие избирательно связываются с определёнными структурами клеток или даже с определёнными химическими веществами. Для проведения данного вида микроскопии используются специальные люминесцентные (флюоресцентные) микроскопы, отличающиеся от обычного светового микроскопа наличием мощного источника освещения (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления или галогеновая кварцевая лампа накаливания), излучающего преимущественно в длинноволновой ультрафиолетовой или коротковолновой (сине-фиолетовой) области видимого спектра. Данный источник используется для возбуждения флюоресценции, прежде, чем испускаемый им свет проходит через специальный возбуждающий (сине-фиолетовый) светофильтр и отражается интерференционной светоделительной пластинкой, почти полностью отсекающими более длинноволновое излучение и пропускающими только ту часть спектра, которая возбуждает флюоресценцию. При этом в современных моделях люминесцентных микроскопов возбуждающее излучение попадает на препарат через объектив (!) После же возбуждения флюоресценции возникающий свет вновь попадает в объектив, после чего проходит через расположенный перед окуляром запирающий (желтый) светофильтр, отсекающий коротковолновое возбуждающее излучение и пропускающий свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя. В силу использования подобной системы светофильтров интенсивность свечения наблюдаемого объекта обычно невелика, в связи с чем люминесцентную микроскопию следует проводить в специальных затемненных помещениях. Важным требованием при выполнении данного вида микроскопии является также применение нефлюоресцирующих иммерсионных и заключающих сред. В частности, для гашения собственной флюоресценции кедрового или иного иммерсионного масла к нему добавляют небольшие количества нитробензола (от 2 до 10 капель на 1 г). В свою очередь в 12

качестве заключающих сред для препаратов могут быть использованы буферный раствор глицерина, а также нефлюоресцирующие полимеры (полистирол, поливиниловый спирт). В остальном при проведении люминесцентной микроскопии применяют обычные предметные и покровные стёкла, пропускающие излучение в используемой части спектра и не обладающие собственной люминесценцией. Соответственно, важными преимуществами люминесцентной микроскопии являются: 1) цветное изображение; 2) высокая степень контрастности самосветящихся объектов на черном фоне; 3) возможность исследования клеточных структур, избирательно поглощающих различные флуорохромы, являющиеся при этом специфическими цитохимическими индикаторами; 4) возможность определения функциональноморфологических изменений клеток в динамике их развития; 5) возможность специфического окрашивания микроорганизмов (с использованием иммунофлюоресценции). Электронная микроскопия. Теоретические основы использования электронов для наблюдения микроскопических объектов были заложены У.Гамильтоном, установившим аналогию между прохождением световых лучей в оптически неоднородных средах и траекториями частиц в силовых полях, а также де Бройлем, выдвинувшим гипотезу о существовании у электрона одновременно корпускулярных и волновых свойств. При этом, благодаря чрезвычайно малой длине волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, теоретически рассчитанный предел разрешения, характеризующий способность прибора отобразить раздельно мелкие, максимально близко расположенные детали объекта, у электронного микроскопа составляет 2-3 Å (Ангстрем, где 1Å=10-10м), что в несколько тысяч раз выше, чем у оптического микроскопа. Первое изображение объекта, сформированное пучками электронов, было получено в 1931г. немецкими учеными М. Кноллем и Э.Руска. В конструкциях современных электронных микроскопов источником электронов служит металл (обычно вольфрам), из которого после его нагревания до 2500 ºС в результате термоэлектронной эмиссии испускаются электроны. С помощью электрических и магнитных полей формирующийся поток электронов можно ускорять и замедлять, а также отклонять в любых направлениях и фокусировать. Таким образом, роль линз в электронном микроскопе играет совокупность соответствующим образом рассчитанных магнитных, электростатических и комбинированных устройств, называемых «электронными линзами». Необходимым условием перемещения электронов в виде пучка на большое расстояние является также создание на их пути вакуума, поскольку в этом случае средняя длина свободного пробега электронов между столкновениями с газовыми молекулами будет значительно превышать расстояние, на которое они должны перемещаться. Для этих целей достаточно поддерживать в рабочей камере отрицательное давление приблизительно 10-4 Па.

13

По характеру исследования объектов электронные микроскопы разделяют на просвечивающие, отражательные, эмиссионные, растровые, теневые и зеркальные, среди которых первые два являются наиболее часто используемыми. Оптическая схема просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа полностью эквивалентна соответствующей схеме оптического микроскопа, в котором световой луч заменяется электронным лучом, а системы стеклянных линз заменяются системами электронных линз. Соответственно, просвечивающий электронный микроскоп состоит из следующих основных узлов: осветительной системы, камеры объекта, фокусирующей системы и блока регистрации конечного изображения, состоящего из фотокамеры и флуоресцирующего экрана. Все эти узлы соединены друг с другом, образуя так называемую «колонну микроскопа», внутри которой поддерживается вакуум. Другим важным требованием, предъявляемым к исследуемому объекту, является его толщина менее чем 0,1 мкм. Окончательное же изображение объекта формируется после соответствующей фокусировки прошедшего сквозь него пучка электронов на фотопленке или флюоресцирующем экране, покрытом специальным веществом – люминофором (аналогичен экрану в кинескопах телевизоров) и превращающем электронное изображение в видимое. При этом образование изображения в просвечивающем электронном микроскопе связано главным образом с различной степенью рассеяния электронов различными участками исследуемого образца и в меньшей мере с различием в поглощении электронов этими участками. Контраст усиливают также, применяя «электронные красители» (четырёхокись осмия, уранил и др.), избирательно связывающиеся с некоторыми участками объекта. Устроенные подобным образом современные просвечивающие электронные микроскопы обеспечивают максимальное полезное увеличение до 400000 раз, что соответствует разрешающей способности в 5,0 Å. Выявляемое с использованием просвечивающей электронной микроскопии тонкое строение бактериальных клеток называют ультраструктурой. В отражательном (сканирующем) электронном микроскопе изображение создается с помощью электронов, отраженных (рассеянных) поверхностным слоем объекта при его облучении под малым углом (приблизительно несколько градусов) к поверхности. Соответственно, образование изображения обусловлено различием рассеяния электронов в разных точках объекта в зависимости от его поверхностного микрорельефа, а сам результат подобной микроскопии предстает в виде структуры поверхности наблюдаемого объекта. Контрастность может быть усилена напылением на поверхность объекта частиц металла. Достигнутая разрешающая способность микроскопов такого типа составляет порядка 100 Å.

14

2.2 Правила работы с биологическим микроскопом. Техника микроскопии При необходимости переноски микроскопа с одного места на другое, его держат одной рукой за ручку, другой поддерживают за ножку штатива. Наклонять микроскоп в сторону нельзя, т.к. при этом окуляр может выпасть из тубуса. На рабочем столе микроскоп помещают ручкой к себе, на расстоянии 3-5 см от края стола. Перед началом работы следует мягкой тканью удалить пыль с механической, осветительной и оптической части, не касаясь линз объектива руками: 1) включают микроскоп в сеть и нажимают клавишу включения осветителя; 2) настройку микроскопа начинают на минимальном увеличении (устанавливают окуляр ×10 и объектив ×40); 3) полностью открывают диафрагму; 4) помещают препарат на предметный столик и закрепляют его; 5) под наблюдением сбоку, пользуясь макрометрическим винтом, медленно поднимают препарат до уровня объектива, не касаясь его; 6) глядя в окуляр и пользуясь макрометрическим винтом, медленно опускают предметный столик до появления объекта; 7) проведят окончательную фокусировку препарата микрометрическим винтом, вращая его только в пределах одного оборота; 8) препарат рассматривают в нескольких местах, за счет перемещения предметного столика; 9) по окончании работы предметный столик опускается, револьвер поворачивается так, чтобы внизу оказался объектив с минимальным увеличением; 10) на микроскоп по окончании работы надевается чехол.

2.3 Изготовление нативных препаратов (содержащих живые клетки) микроорганизмов Для изучения живых клеток микроорганизмов применяют препараты «раздавленная капля», «висячая капля», «отпечаток», «агаровая пленка» («микрокультура»). Эти препараты можно использовать как для оценки подвижности бактерий, так и для оценки прижизненной формы микроорганизмов, их жизненных циклов, особенностей размножения и формирования покоящихся форм. С использованием темнопольной микроскопии изучают препараты типа «раздавленная капля». На предметное стекло наносят каплю стерильного физиологического раствора, помещают в нее небольшое количество клеток изучаемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. При этом предметные стекла должны быть не толще 1,11,2 мм, а покровные 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении 15

препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат). Микроорганизмы, выращенные или на плотной, или в жидкой питательной среде, переносят в каплю воды бактериологической петлей; выращенные в жидкой среде можно переносить также стерильной пипеткой. В последнем случае каплю воды на предметное стекло можно не наносить. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы из-под покровного стекла не выступал избыток жидкости. Если он образовался, его необходимо удалить фильтровальной бумагой. При продолжительном изучении микроскопируемого объекта края покровного стекла рекомендуется залить лаком для ногтей, что предотвратит быстрое высыхание препарата. Препарат «раздавленная капля» используют для установления форм клеток микроорганизмов, их размеров, взаимного расположения, способа размножения. Препарат «висячая капля». Для приготовления препарата каплю суспензии микроорганизмов петлей или обычным пером наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят в жидкой питательной среде. Препарат «висячая капля» используют для наблюдения за ростом и размножением микроорганизмов, образованием и прорастанием спор, установления подвижности клеток.

2.4 Задание к лабораторной работе 1 Изучить устройство микроскопа и правилами работы с ним.

2 Ознакомиться с видами микроскопии.

3 Приготовить препарат «раздавленная капля», рассмотреть его на различном увеличении. Для выполнения работы используют культуру мицелиальных плесневых грибов, выросшую на пищевых продуктах, или взвесь пекарских дрожжей Saccharomyces в физиологическом растворе, которую наносят на поверхность предметного стекла.

4 Приготовить препарат «висячая капля» из культур простейших, рассмотреть его на различном увеличении.

5 Результаты микроскопирования зарисовать в лабораторный журнал, обозначив клетки микроорганизмов, окружающий их фон, а так же простейших, основываясь на рисунке 2.

16

1 2 3 4 5 6 Простейшие: 1 - Paramecium putrinum; 2 - Podophria fixa; 3 - Oicomonas mutabilis; 4 - Vorticella microstoma; 5 - Colpidium colpoda; 6 - Pelomyxa palustris.

7 8 9 Инфузории: 7 - Chilodonella uncinata; 8 - Aspidisca costata; 9 - Carchesium polypium;

10 11 12 13 14 15 Инфузории: 10 - Vorticella companula; 11 - Vorticella mayeri; 12 Litonotus Cygnus; 13 - Stylonichia muscorum. Коловратки: 14 - Rhinoglena frontalis; 15 - Tncentrum mustella.

16 17 18 19 20 Инфузории: 16 - Strobilidium gyrans; 17 - Vorticella picta. Коловратки: 18 - Philodina citrine, 19 - Otostephanos annulatus; 20 - Philodinavus paradoxus. Рисунок 2 - Простейшие 2.5 Вопросы к защите лабораторной работы 1 Краткая история развития микробиологии.

2 Основные признаки микроорганизмов.

3 Классификация микроорганизмов.

17

4 Каковы правила поведения в микробиологической лаборатории?

5 Устройство, назначение и принцип работы микроскопа.

6 Правила работы с биологическим микроскопом.

7 Виды микроскопии.

8 Цель, методика приготовления препарата «раздавленная капля».

9 Цель, методика приготовления препарата «висячая капля».

3 Лабораторная работа № 2. Понятие о прокариотах и истинно ядерных микроорганизмах Цель работы – изучить размеры и общую морфологию прокариотических и эукариотических клеток в мазке буккального эпителия (световая микроскопия, простой метод окрашивания).

3.1 Сравнительный анализ прокариотических и эукариотических клеток Все известные микроорганизмы делятся на два большие группы – прокариотические и эукариотические микроорганизмы. К прокариотическим микроорганизмам относятся бактерии, к эукариотическим микроорганизмам – простейшие, микроскопические водоросли, слизевики, микроскопические грибы. Прокариотические микроорганизмы отличаются от эукариотических по целому ряду признаков и, в первую очередь, по строению клетки (таблица 1). Кроме строения клеток прокариотические микроорганизмы отличаются от эукариотических по следующим свойствам: 1 Форма и размеры клеток. Прокариотические микроорганизмы – одиночные клетки или простые ассоциации сходных клеток, имеющих, за редким исключением, сферическую, цилиндрическую или изогнутую форму и средние размеры 0,2-10,0 мкм. Например, клетки нитчатой серобактерии Beggiatoa alba имеют диаметр до 50 мкм, а клетки Achromatium oxaliferum достигают в длину 15-100 мкм при поперечном размере 5-33 мкм. С другой стороны, самые мелкие прокариоты – микоплазмы (например, Mycoplasma mycoides) могут иметь размеры всего 0,1×0,25 мкм. На этом фоне значительно более сложно организованные эукариотические клетки характеризуются линейными размерами как минимум на порядок выше: например, дрожжевые клетки Saccharomyces имеют в диаметре 6-10 мкм, а зеленая водоросль Chlorella 2-10 мкм. Эукариотические микроорганизмы имеют диаметр клетки до 40 мкм и являются одноклеточными, нитчатыми или истинно многоклеточными организмами. Обычные же размеры эукаритоических клеток обычно 100 мкм и выше.

2 Размножение. Прокариотические микроорганизмы, как правило, размножаются бинарным делением, в то время, как для эукариотических 18

микроорганизмов характерны различные формы бесполого и полового размножения.

3 Дыхание и фотосинтез. Процессы дыхания и фотосинтеза и связанные с ними пигменты и ферменты у тех представителей прокариот, которые обладают этими физиологическими функциями, связаны с цитоплазматической мембраной или ее производными. У эукариотических микроорганизмов аэробное дыхание происходит в митохондриях, а фотосинтез в хлоропластах, содержащих специальные мембраны, организованные в ламеллы или граны. Кроме того, большая группа прокариотических микроорганизмов способна жить без доступа молекулярного кислорода (в анаэробных условиях) и получать энергию в процессе анаэробного дыхания или брожения.

4 Источник энергии. Некоторые прокариотические микроорганизмы (хемолитотрофы) могут получать энергию путем окисления различных неорганических соединений в процессе аэробного дыхания, что не характерно для эукариотических микроорганизмов.

5 Фиксация молекулярного азота. Некоторые прокариоты обладают этой способностью, в то время, как ни один эукариотический организм не способен фиксировать молекулярный азот. Таблица 1 - Различия в строении клеток прокариотических и эукариотических микроорганизмов Признак 1 Организация генетического материала

Локализация ДНК

Прокариотическая клетка 2 Нуклеоид, состоящий чаще всего из одной замкнутой в кольцо или линейной хромосомы, расположен непосредственно в цитоплазме. Имеются гистоноподобные белки. Гены не несут интронов (за исключением архебактерий). Гены организованы в опероны. В нуклеоиде и плазмидах

Цитоплазматичес Отсутствуют (кроме рикие органеллы босом) Рибосомы в 70 S-типа цитоплазме

Эукариотическая клетка 3 Ядро, содержащее обычно более одной хромосомы, окружено двухслойной ядерной мембраной. Есть белки гистоны. Гены имеют экзонно-интронную организацию. Опероны отсутствуют. В ядре и некоторых органеллах (митохондриях, хлоропластах) Имеются 80 S-типа

19

Продолжение таблицы 1 1 Движение цитоплазмы Жгутики

2 Отсутствует

3 Часто обнаруживается

Состоят из одной фибриллы

Состоят из микротрубочек, собранных в группы Клетка разделена мембранами на отдельные отсеки Пептидогликан муреин отсутствует

Компартментали- Слабо выражена зация клеток Клеточная стенка Содержит пептидогликан муреин (за исключением архебактерий) 3.2 Методика выполнения работы

1) стеклянной лопаточкой возьмите соскоб с внутренней поверхности щеки и внесите его круговыми движениями в каплю воды, предварительно нанесенную в центр предметного стекла; 2) после высыхания мазка зафиксируйте его над пламенем горелки; 3) на поверхность мазка нанесите краситель – щелочной раствор метиленового синего Леффлера на 3-5 мин; 4) мазок промойте водой, высушите на воздухе и микроскопируйте; 5) результаты микроскопии зарисуйте, обозначив прокариотические клетки (бактерии) и их примерные размеры, а также эукариотические клетки (клетки буккального эпителия), обозначив их ядра и примерные линейные размеры.

3.3 Вопросы к защите лабораторной работы 1 Назовите основные признаки прокариотических микроорганизмов.

2 Назовите основные признаки эукариотических микроорганизмов.

3 Перечислите основные свойства, отличающие прокариот от эукариот.

4 Перечислите основные различия в строении клеток прокариотических и эукариотических микроорганизмов.

4 Лабораторная работа № 3. Морфология, строение и химический состав бактериальных клеток Цель работы – изучить морфологию и строение бактериальных клеток, освоить практические навыки изготовления фиксированных окрашенных препаратов микроорганизмов.

20

4.1. Морфология бактерий Бактериальная клетка имеет достаточно простое строение, что обуславливает высокую степень её адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды (рисунок 3). Морфологические типы бактерий, в сравнении с высшими организмами, немногочисленны. Клетки большинства бактерий имеют сферическую, цилиндрическую или извитую форму, но существует небольшая группа мицелий образующих форм, нитчатых бактерий и бактерий, образующих выросты. В соответствии с этим все бактерии по форме подразделяются на несколько групп (рисунок 4). Кокки (сферические) клетки (от греч. kokkos — зерно, шарик) могут иметь диаметр клеток – 1 – 2 мкм и разделяться на следующие группы: Микрококки (от лат. micro — маленький). В природе встречаются в виде одиночных шаровидных клеток. Примером могут служить клетки Micrococcus agilis (от лат. agilis — подвижный).

цитоплазма

нуклеоид капсула клеточная стенка цитоплазматическая мембрана рибосомы пили

жгутик

Рисунок 3 - Строение прокариотической (бактериальной) клетки Диплококки (от греч. diploos — двойной) — шаровидные бактерии, соединенные по двое и образующие единую жизненную систему. К ним относится Azoto-bacter chroococcum. Родовое название этих бактерий отражает их способность фиксировать азот атмосферы, видовое — продуцировать коричневый пигмент (от лат. chroo — коричневеющий). Стрептококки (от греч. streptos — цепь) — шаровидные бактерии, образующие в результате деления клеток в одной плоскости разнообразной 21

длины цепочки. К роду стрептококков относятся в основном патогенные бактерии. Но стрептококковую форму имеют многие молочнокислые бактерии рода лактококкус. Поэтому с этой формой бактерий знакомятся при изучении молочнокислого брожения на примере Lactococcus lactis. Родовое и видовое названия этих бактерий, образующих короткие цепочки, отражают их причастность к молочнокислому брожению (от лат. lactis — молочный). Стафилококки – образующие в результате деления клеток в различных плоскостях скопления в виде виноградной грозди или треугольника. Сарцины (от лат. sarceo — соединяю) — шаровидные бактерии, группирующиеся по 8 клеток. Располагаются в виде куба, с каждой стороны которого по 4 клетки. Такая форма возникает в результате деления клетки в трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Некоторые виды сарцин формируют большие сарциноподобные кубообразные пакеты, в которых с каждой стороны находится уже не по 4 клетки (субъединицы сарцины), а по 4 сарцины. Удобна для просмотра Sarcina flava (сарцина желтая) — наиболее распространенный представитель микрофлоры воздуха. Все шаровидные формы бактерий, за исключением Lactococcus lactis, просматривают на фиксированных и окрашенных фуксином препаратах. Палочковидные бактерии – наиболее многочисленная группа, клетки представляют собой цилиндрические структуры. Размеры таких клеток сильно варьируют и могут быть от сотых долей до 5 – 10 мкм. Такие бактерии часто образуют пары или цепочки клеток (например, палочка сибирской язвы), но могут быть и одиночными (например, энтеробактерии). К палочковидным относят формы, образующие споры (роды Bacillus, Clostridium и др.) и не образующие их (роды Pseudomonas, Achromobacter, Lactobacillus и др.). У неспорообразующих бактерий цитоплазма клеток прокрашивается равномерно, и под микроскопом клетки выглядят как тонкие, четко очерченные, равномерно окрашенные палочки (неспорообразующая палочка Pseudomonas stutzeri). С представителями бацилл – палочковидных бактерий, образующих споры, можно познакомиться на примере Bacillus mycoides или Bacillus mesentericus. В названии первого вида отражена его способность развиваться на питательных средах в виде ложно-грибовидного налета (от лат. mycoides — грибовидный), напоминающего мицелий грибов. Поскольку Bacillus mycoides — спорообразующая палочка, цитоплазма клетки, приступившей к спорообразованию, прокрашивается красителем, а спорогенная зона — нет. Поэтому под микроскопом бацилла выглядит неравномерно окрашенной. Спорогенная зона, как более плотная и непрокрашенная, иначе преломляет свет, чем цитоплазма клетки. Клетки Bacillus mycoides относятся к стрептобациллам, так как обычно располагаются цепочками. Для просмотра лучше брать двух-трехсуточную культуру (в более позднем возрасте клетки переходят в стадию спорообразования).

22

Bacillus mesentericus (картофельная палочка) также относится к стрептобациллам. Палочковидные бактерии просматривают на фиксированных и окрашенных фуксином препаратах.

Шаровидные бактерии: 1 — микрококки; 2 — стрептококки; 3 — диплококки и тетракокки; 4 — стафилококки; 5 — сарцины; палочковидные: 6 — палочки без спор; 7 — палочки со спорами (бациллы); извитые: 8 — вибрионы; 9 — спириллы; 10 — спирохеты. Рисунок 4 - Основные морфологические типы бактерий Извитые бактерии могут быть трех типов: вибрионы, спириллы и спирохеты. Вибрионы (от лат. vibrare — извиваться, дрожать) — слегка изогнутые в виде запятой клетки: изгиб их меньше половины окружности (холерный вибрион, кампилобактер); Спириллы (от лат. spiro — штопор) имеют несколько крупных завитков (возбудитель возвратного сыпного тифа). В отличие от вибрионов их клетки более длинные, толстые и извитые: извитость или равна, или больше 23

половины окружности. Спириллы могут иметь два завитка в виде латинской буквы S или несколько — в виде спирали. Спирохеты имеют вид длинных и тонких спиралевидных клеток с большим количеством мелких, но крутых завитков; длина клеток превышает их толщину в 5—200 раз. Вибрионы и спириллы удобно просматривать на фиксированном и окрашенном фуксином препарате, приготовленном из навозной жижи, предварительно инкубированной в течение нескольких суток в термостате. На таком препарате много клеток разных видов микроорганизмов, среди них часто встречаются извитые формы. Нитчатые бактерии – это цепочки (трихомы) из цилиндрических, овальных или дисковидных клеток, часто окруженные общим влагалищем, или чехлом. Нитчатые бактерии распространены в ил ах, почве и водоемах, особенно с высоким содержанием железа. В водоемах эти бактерии часто образуют охристые осадки. Типичными представителями данных бактерий являются бактерии, окисляющие серу (Beggiatoa, Thiotrix). Для знакомства с нитчатыми бактериями рекомендуется брать пробу воды с охристыми отложениями из естественных водоемов. Препарат готовят в раздавленной капле и просматривают с иммерсионной системой. Наиболее часто на нем встречаются железобактерии рода Leptothrix, окисляющие закисные формы железа в окисные. Гидрат окиси железа откладывается во влагалищах, отчего они имеют желтовато-бурую (охристую) окраску. Размножается Leptothrix делением концевой (молодой) клетки, обращенной внутрь влагалища. При этом старые клетки оттесняются (выталкиваются) молодыми; нить и влагалище в результате размножения и роста клеток удлиняются. Нередко старые клетки отчленяются от общей нити. На препарате часто обнаруживаются остатки ожелезненных чехлов (в виде тонких трубок) и другие ожелезненные структуры. Для выявления вегетативных клеток железобактерий пробу берут непосредственно из охристых осадков, препарат фиксируют 96 %-ным спиртом, обрабатывают 1 %-ным раствором НС1 (для обесцвечивания влагалищ) и окрашивают в течение суток эритрозином. Влагалища клеток на таком препарате бесцветны, а вегетативные клетки и гонидии красные. Гонидии — образования овальной или округлой формы, в некоторых случаях имеющие жгутики. Гонидии формируются у тех нитчатых бактерий, которым свойственна дифференциация нити. Миксобактерии, или скользящие бактерии. Это группа бактерий, стоящих на более высокой ступени эволюционного развития, чем описанные выше. У отдельных представителей миксобактерии {Sorangium, Polyangium) даже в световой микроскоп четко видно дифференцированное ядро. Вегетативные клетки имеют палочковидную форму с заостренными или округлыми концами. По мере старения они укорачиваются и переходят в миксоспоры, соединяющиеся впоследствии слизью и образующие первичные и вторичные цисты. Из последних в дальнейшем формируются плодовые тела.

24

Для наблюдений за формой миксобактерии берут колонии, развившиеся вокруг комочков почвы на гелевых пластинах, на которых единственным источником углерода служит целлюлоза. К мицелийобразующим бактериям относятся истинные актиномицеты, которые имеют сильно разветвленный мицелий (рисунок 5). Актиномицеты (от греч. aktis — луч, mykes — гриб) — лучистые грибы (рисунок 5 а). Эта группа микроорганизмов занимает промежуточное положение между бактериями и грибами, поэтому ее представителей называют грибобактериями. Они одноклеточные, как бактерии, но образуют мицелий, как грибы; диаметр нитей у них очень мал, как у бактерий (не более 0,5— 0,8 мкм), но гифы мицелия длинные и ветвистые, как у грибов. У актиномицетов длина ветвящихся нитей достигает нескольких миллиметров, мицелий грибов в длину — нескольких сантиметров. С грибами актиномицетов объединяет также способность размножаться спорами. На питательных средах актиномицеты образуют пушистые, бархатистые, мучнистые, преимущественно плотные кожистые колонии, срастающиеся с субстратом, иногда имеющие характерный землистый запах. Мицелий актиномицетов на питательных средах дифференцирован: одна часть его погружена в субстрат (субстратный мицелий), другая находится над субстратом (воздушный мицелий). Многие представители актиномицетов продуцируют пигменты, поэтому их воздушный мицелий и особенно колонии окрашены в голубой, синий, фиолетовый, розовый, бурый, коричневый или черный цвета. Актиномицеты, образующие диффундирующие в питательную среду пигменты, окрашивают ее в соответствующие цвета. Чтобы выявить характерные морфологические признаки колоний актиномицета, сначала следует рассмотреть их при малом увеличении непосредственно на питательной среде на чашках Петри или по краю колонии в пробирке. При этом можно видеть, что гифы мицелия частично внедряются в субстрат, частично стелются по поверхности и приподнимаются над ней. На концах нитей воздушного мицелия хорошо просматриваются спороносцы со спорами. Спороносцы по строению бывают прямыми, волнистыми, спиральными и мутовчатыми. Затем готовят фиксированный, окрашенный фуксином, препарат. Для этого на предметное стекло наносят кусочек колонии актиномицета вместе со средой, чтобы захватить не только воздушный, но и субстратный мицелий. Вторым предметным стеклом плотно прижимают этот кусочек к стеклу, раздавливают и размазывают по стеклу. Далее препарат сушат, фиксируют, красят. На фиксированном окрашенном препарате дифференциации мицелия не видно, как правило, не видны и споры, однако четко просматриваются мицелиальные одноклеточные нити. Много общего с актиномицетами имеют нокардии, или проактиномицеты. У нокардий и микобактерий мицелий является временным и возникает на определенных стадиях роста. Это наименее 25

дифференцированные формы актиномицетов. Воздушный мицелий у них отсутствует или развит слабо. На питательных средах развиваются колонии тестообразной (мягкой) консистенции с характерным мицелиальным ободком. Окраска их так же разнообразна, как и у нокардиеформных актиномицетов. В молодом возрасте проактиномицеты образуют мицелий, который вскоре начинает септироватъся (в нитях образуются перегородки) и расчленяться на палочковидные фрагменты, в дальнейшем переходящие в укороченные палочки, но чаще — в кокки. Для знакомства с проактиномицетами можно воспользоваться чистой культурой Nocardia rubra, образующей красные (от лат. ruber — красный) колонии (рисунок 5 б). Микобактерии - это палочковидные, иногда ветвящиеся, образующие подобие мицелия бактерии (рисунок 5 в). Настоящего мицелия микобактерии не имеют. Колонии тестообразной консистенции, продуцируют пигмент. В молодой культуре формируются палочки искривленной формы с неровным контуром — звездообразные, иногда довольно длинные, с боковыми отростками. В старых культурах ветвистые палочки часто распадаются сначала на более короткие палочки, затем — на кокки. У коринеподобных бактерий клетки имеют только тенденцию к ветвлению, но при росте культуры наблюдается плейоморфизм клеток.

Рисунок 5 - Актиномицеты, нокардии и микобактерии К бактериям, образующим выросты, относятся почкующиеся и стебельковые бактерии. Выросты – это выпячивания клеточного содержимого, окруженного клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной и не отделенные от клетки перегородкой. У некоторых бактерий 26

выросты служат для размножения, у других – для прикрепления к субстрату или друг к другу. Кроме выше перечисленных, известны бактерии, которые не имеют клеточной стенки – микоплазмы. В культуре одного вида можно одновременно обнаружить сферические, эллипсовидные, грушевидные, дисковидные и даже разветвленные и неразветвленные нитчатые формы. Архебактерии представляют собой группу бактерий с клеточной стенкой уникальной структуры, содержащей специфические химические соединения. Морфологически могут быть неправильной формы, сферическими, палочковидными. В микробиологической практике для изучения морфологии бактерий используют неокрашенные препараты (нативный материал) или окрашенные препараты (мазки), приготовленные из естественный образцов либо из колоний выросших микроорганизмов.

4.2 Методы окраски микробиологических препаратов Клеточная стенка бактерий является их важным отличительным признаком. В целях более подробного изучения клеточных структур бактерий микробиологические препараты окрашивают. Можно окрашивать живые бактериальные формы, однако такая окраска не даёт полной картины строения микробной клетки. В связи с этим приготавливают фиксированные препараты микроорганизмов. Фиксация убивает живые клетки и одновременно закрепляет их на поверхности предметного стекла. Получение фиксированных окрашенных препаратов включает приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску. Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала, как для препарата «раздавленная капля». Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1 - 2 см максимально тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы быстро высыхал после приготовления. Высушивание мазка лучше всего производить при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает очень быстро. Если высушивание происходит медленно, препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазок, иначе клетки микроорганизмов деформируются. Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат обычно трижды проводят через наиболее 27

горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например, их сморщивание. Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксирующим раствором. Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают кислые и основные красители. К кислым относятся красители, у которых красящими свойствами обладает анион, у основных красителей хромофором является катион. Примерами кислых красителей служат эозин, эритрозин, нигрозин, кислый фуксин; все они интенсивно связываются с цитоплазматическими компонентами клетки. Основные красители - метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристалл-виолет, сафранин — интенсивнее связываются с ядерными компонентами клетки. Высокая концентрация ДНК и рибосомальной РНК в клетке бактерии делает ее более чувствительной к основным красителям. В связи с этим в микробиологической практике применяются почти исключительно основные красители. Различают простое и дифференциальное окрашивание микроорганизмов. В первом случае прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальное окрашивание выявляет только определенные структуры клетки и запасные вещества.

1 Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные палочки, лежащие над лотком, наносят на него раствор красителя и выдерживают в нем в течение 1 - 3 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания краситель на мазке не подсыхал, и в случае необходимости добавляют новую порцию красителя. По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой, помещают на окрашенный мазок каплю иммерсионного масла и просматривают с объективом 100х. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки. Фиксировать и окрашивать можно также и препараты-«отпечатки». Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время. Форму клеток и их расположение (цепочки, розетки, пакеты, тетрады и т.д.) выявляют, как правило, на препаратах «раздавленная капля» при светло28

польной или фазово-контрастной микроскопии. Для определения формы клеток мелких палочковидных бактерий, таких как Serratia marcescens, готовят препарат фиксированных клеток и применяют простое окрашивание. Клетки мелких бактерий, имеющих выросты - простеки (роды Caulobacter, Labrys, Prosthecomicrobium, Stella и некоторые другие), целесообразно исследовать методом фазового контраста или в темном поле. Естественное расположение клеток в колонии микроорганизмов, а также спор и спороносцев у актиномицетов и мицелиальных грибов изучают на препарате «отпечаток». Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

2 Окраска по Граму (сложное окрашивание микроорганизмов) и ее использование для дифференциации бактерий с различным строением клеточной стенки. Данный сложный (использующий более одного действующего вещества) метод окраски впервые был предложен в 1884г. датским ученым Х.Грамом (Ch.Gram) для окрашивания тканей, а позднее получил широкое распространение при окраске прокариот и был назван именем его разработчика. Важное значение метода окраски по Граму в микробиологии определяется тем, что результаты окрашивания бактерий оказываются напрямую связанными с особенностями строения их клеточных стенок. Объяснением этого являются выраженные различия в строении клеточных стенок грамположительных (по данному методу окрашивающихся в фиолетовый цвет) и грамотрицательных (по данному методу окрашивающихся в красный цвет) бактерий. Первые из них имеют достаточно толстые слои из муреина (у эубактерий) или псевдомуреина (у архебактерий), удерживающие образующийся в протопласте комплекс «кристаллический фиолетовый + иод» и препятствующие его вымыванию из клетки при последующей обработке спиртом. В свою очередь грамотрицательные бактерии не образуют подобных гетерополисахаридов или содержат их в небольших количествах, недостаточных для предотвращения экстрагирования комплекса красителя с йодом из протопласта при его обработке спиртом. Сказанное объясняет, почему несмотря на кажущуюся простоту метода Грама, именно он получил наибольшее распространение в качестве важного таксономически значимого теста, с результатами которого хорошо коррелируют многие прочие свойства прокариот. Для реализации данного метода готовят специальный краситель – карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллического фиолетового: 1 г красителя растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты до консистенции кашицы, прибавляют небольшими порциями 10 мл 96 % спирта, окончательно разводят 100 мл дистиллированной воды, сливают в бутыль, отстаивают и через сутки 29

фильтруют. Вторым важным компонентом для окраски по Граму является раствор Люголя: в 10 мл дистиллированной воды растворяют 2 г иодида калия и 1 г иода кристаллического, смесь хорошо укупоривают и оставляют на сутки, после чего добавляют 300 мл дистиллированной воды. Процедура окрашивания по Граму начинается с обработки фиксированных бактериальных клеток красителем кристаллическим фиолетовым, за чем следует обработка клеток раствором иода. Эти два компонента вместе образуют крупномолекулярный комплекс, нерастворимый в воде и слабо растворимый в спирте. Поэтому, используя спирт, клетки дифференцируют: при промывании в нем «грамположительные» клетки удерживают комплекс «кристаллический фиолетовый + иод» и остаются синими, а «грамотрицательные» обесцвечиваются. Для того же, чтобы также сделать их видимыми, образцы дополнительно окрашивают каким-либо контрастным красным красителем – обычно фуксином. Среди множества предложенных в настоящее время вариантов, окрашивания по Граму (по Г.П.Калине, по Эткинсу и др.) достаточно широкое распространение получила модификация по А.И.Синеву, для реализации которой предварительно готовят полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором кристаллического фиолетового и высушенной. Процедура сложного окрашивания микроорганизмов: 1) на предметном стекле готовят мазок бактериальной культуры, который фиксируют над пламенем горелки; 2) на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной раствором кристаллического фиолетового, на который наносят 2-3 капли воды и выдерживают в течение 2 мин; 3) снимают фильтровальную бумагу; 4) не смывая водой (!) на препарат наносят 2-3 капли раствора Люголя и выдерживают в течение 1 мин; 5) сливают раствор Люголя; 6) опускают предметное стекло в стаканчик с 95 % спиртом, где тщательно прополаскивают препарат в течение 0,5-1 мин, пока не перестанет отходить краситель; 7) тщательно промывают препарат водой; 8) наносят на предметное стекло раствор водного фуксина и прокрашивают препарат в течение 0,5-1 минут; 9) краситель сливают, тщательно промывают препарат водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. Считается, что в большинстве случаев интерпретация результатов окраски мазка по Граму не представляет трудностей, однако некоторые грамположительные микроорганизмы, в частности представители рода Bacillus, могут иметь грамотрицательную окраску. Напротив, некоторые штаммы грамотрицательных родов Acinetobacter и Moraxella проявляют тенденцию не обесцвечиваться спиртом, поэтому выглядят 30

грамположительными. Для уточнения таких «грам-сомнительных» реакций предложены особые методы. В Японии предложили метод «тяжа», позволяющий отличить с помощью КОН-теста грамотрицательные микроорганизмы от грамположительных. В основе метода с КОН лежит способность клеточной стенки грамположительных бактерий сохранять целостность при воздействии гидроокиси калия, тогда как клеточная стенка грамотрицательных микроорганизмов разрушается при указанном воздействии. Методика выполнения работы. На предметное стекло наносят каплю 3 %-ного водного раствора КОН. Петлей вносят суточную агаровую культуру исследуемых бактерий и тщательно эмульгируют. При положительной реакции, если суспензия в капле становится вязкой, нити слизи тянутся за петлей на 0,5 – 2,0 см и даже дальше, это - грамотрицательные бактерии, если нет – грамположительные бактерии. Учет этой пробы более удобен на черном фоне. Образование слизистой консистенции после обработки грамотрицательных бактерий КОН обусловлено выходом из их клеток ДНК, являющейся вязким компонентом.

4.3 Задания к лабораторной работе 1 Для ознакомления с морфологией бактерий (со спирохетами) следует приготовить фиксированный окрашеный препарат зубного налета. Особенно удачны препараты соскоба из кариесного (гнилого) зуба. Зубные спирохеты чрезвычайно тонкие, почти волосовидные, короткие (всего 2—3 завитка).

2 Приготовить из чистых культур микроорганизмов фиксированные препараты, окрасить их простым способом, изучить форму, размеры и взаимное расположение микроорганизмов.

3 Для ознакомления с методикой сложного окрашивания и типом клеточной стенки бактерий, приготовить из чистых культур микроорганизмов фиксированные препараты, окрасить их дифференциальным способом по Граму. Произвести световую микроскопию препаратов. Результаты микроскопирования зарисовать, описать форму микроорганизмов.

4 Определите тип клеточной стенки бактерий методом «тяжа». Учтите результат реакции, сделайте заключение о типе клеточной стенки исследуемой культуры.

4.4 Вопросы к защите лабораторной работы 1 Общая характеристика бактерий.

2 Морфология бактерий.

3 Строение бактериальной клетки.

4 Способы размножения бактерий.

31

5 Спорообразование.

6Этапы приготовления окрашенных препаратов.

7 Простое окрашивание микроорганизмов. Цель, методика.

8 Окраска бактерий по методу Грамма.

5 Лабораторная работа № 4. Эндоспоры, цитоплазматические включения бактерий. Передвижение бактерий Цель работы - выявить наличие капсулы и эндоспор у исследуемых бактерий, изучить цитоплазматические включения и подвижность бактерий.

5.1 Капсула бактерий При определенных условиях культивирования многие виды бактерий различных таксономических групп образуют слизистое вещество, формирующее вокруг клетки структуру, которая называется капсулой. Колонии капсулообразующих бактерий имеют влажную, блестящую поверхность и называются мукоидными. Среди сапрофитных бактерий капсула хорошо выражена у представителей родов Azotobacter, Leuconostoc, Rhizobium, патогенных – Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae и др. Капсула предохраняет клетку от обезвоживания, механического повреждения, капсульное вещество создает вокруг клетки дополнительный осмотический барьер, регулирующий поступление и выделение различных веществ и ионов, а также аэрацию бактерий. Лучше всего капсулы выявляются во влажных препаратах, так как составляющие их сильно гидратированные коллоидные полимеры легко разрушаются и сокращаются в размерах при высушивании и фиксации. Для выявления капсул пользуются различными методами, среди которых можно отметить: Окраска по Бури. Методика окрашивания: На середину предметного стекла наносят капельку туши и смешивают её петлёй с каплей культуры. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и микроскопируют. На черном фоне видны неокрашенные микробы, капсулы. Можно применить так же усовершенствованный метод Гинса – Бурри (метод негативного контрастирования). Методика окрашивания.

1 На предметное стекло наносят каплю водного раствора фуксина, в которую с помощью стерильной петли вносят исследуемую культуру бактерий.

32

2 Рядом с первой каплей помещают каплю туши. Две капли смешивают и с помощью другого предметного стекла делают мазок как мазок крови (ребром одного стекла проводят по поверхности другого).

3 Мазок высушивают на воздухе.

4 Микроскопируют, пользуясь иммерсионной системой. На темнодымчатом фоне препарата видны розовые клетки микроорганизмов, окруженные бесцветной капсулой.

5.2 Эндоспоры бактерий Важной особенностью многих микроорганизмов, значимой для их длительного переживания при неблагоприятном изменении условий существования, является способность к образованию морфологически дифференцированных клеток, объединяемых общим понятием «покоящиеся формы». В некоторых случаях для их образование необходимо особое неравное деление исходной родительской клетки, в других случаях в покоящееся состояние переходит обычная вегетативная клетка. Общей морфологической особенностью покоящихся форм является упрочение поверхностных барьерных структур, имеющихся и у обычных вегетативных клеток микроорганизмов, а также, в ряде случаев, возникновение дополнительных поверхностных образований. Общей физиологической особенностью покоящихся форм является выраженное угнетение процессов обмене веществ и энергии, что сопровождается общим снижением активности метаболического, биосинтетического и генетического аппаратов бактериальной клетки. В то же время для некоторых из покоящихся форм характерно накопление ряда резервных питательных веществ (в виде включений). Важным следствием морфофункциональных перестроек в покоящихся формах микроорганизмов является приобретение ими повышенной устойчивости к действию разнообразных повреждающих факторов среды обитания: высоких и низких температур, кислотности среды, радиации и др. Спорообразование свойственно бактериям нескольких родов, к числу которых относятся Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desufotomaculum, etc. Обычно внутри каждой клетки образуется одна спора, которая может размещаться центрально (у бацилл); субтерминально или терминально, превышая диаметр материнской клетки (у клостридий). Это приводит к формированию у клостридий клеток веретеновидной формы (Clostridium perfringens), разливной ложки (Clostridium diauvoci), ракетки или барабанной палочки (Clostridium tetani). Бактериальные споры устойчивы к высокой температуре, высушиванию, воздействию токсических веществ и других неблагоприятных факторов. Микроскопическое выявление эндоспор основано на их особенностях, возникающих при спорообразования и значимо отличающих подобные структуры от исходной родительской клетки (спорангия), внутри которой они образуются. При этом в качестве подобной особенности наиболее часто 33

используется кислотоустойчивость эндоспор, определяющая различное сохранение красителя в эндоспоре и спорангии после обработке сильными обесцвечивающими реагентами. Бактериальные споры могут быть выявлены с использованием как простых, так и сложных методов окраски. Например, с использованием 7 % водного раствора нигрозина микроорганизм окрашивается в зеленый цвет, споры – бесцветные, а фон – черный. Наиболее простой метод подобен окраске кислотоустойчивых бактерий. Методика окрашивания.

1 Препарат, подготовленный обычным способом, при нагревании окрашивают 1-2 мин карболовым фуксином Циля.

2 Промывают водой и обесцвечивают, погружая стекло в 2 % раствор азотной кислоты в спирте или 1 % водный раствор серной кислоты. Обесцвечивать надо так, чтобы на препарате не было видно следов красителя.

3 Промывают водой.

4 Докрашивают водным раствором метиленового синего. В результате окрашивания споры окрашиваются в красный цвет. Наиболее часто используемым сложным методом окрашивания эндоспор является метод Шефера – Фултона. Методика окрашивания.

1 Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги, на который наносят 5-6 капель 0,5 % водного раствора малахитового зеленого и 2 – 3 раза нагревают в пламени спиртовки до появления паров.

2 Фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают водой и в течение 30 с докрашивают 0,5 % раствором сафранина.

3 Препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетка – в красный.

5.3 Цитоплазматические включения У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включениями. Среди них – отложения жира, поли-βгидрооксимасляной кислоты, полифосфатов, полисахаридов, серы и различных кристаллов. Для выявления этих включений, которые сильно преломляют свет, применяется несколько методов. Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans, Bacillus subtilis, а также у возбудителей сибирской язвы и дифтерии. Гранулы волютина имеют относительно крупные размеры, окрашиваются различными красителями, изменяя цвет последних. Например, при окрашивании метиленовым синим волютин окрашивается в ярко-красный цвет. Такое явление получило название 34

метахромазии. Гранулы волютина представлены полифосфатами – запасающимся веществом, которое служит источником фосфатных групп. Окраска гранул волютина по Нейссеру. Методика окрашивания.

1 На фиксированный мазок наносят 2 – 3 капли раствора метиленового синего по Нейссеру и окрашивают в течение 1 – 2 мин.

2 Краситель сливают, препарат промывают водой.

3 Мазок обрабатывают раствором Люголя в течение 20 – 30 с.

4 Не промывая препарат водой, мазок дополнительно окрашивают 2 – 3 мин 2 % раствором везувина (или хризоидина).

5 Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют, используя иммерсионную систему. Цитоплазма окрашивается в желтый цвет, а гранулы волютина – в темно-синий.

5.4 Подвижность бактерий Поступательное движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев светлопольный микроскоп. Наиболее эффективно наблюдение за подвижностью в темнопольном микроскопе. На основании количества и характера расположения жгутиков на поверхности бактериальной клетки отнесите ее к одному из следующих типов: монотрихи (имеют только один жгутик, прикрепленный к одному полюсу клетки), лофотрихи (на одном из своих полюсов имеют пучок из 250 жгутиков), амфитрихи (пучки жгутиков имеются на каждом из полюсов бактериальной клетки), перитрихи (многочисленные жгутики расположены по всей поверхности клетки). Чтобы убедиться, что жгутики действительно присущи данным микроорганизмам, а также определить их расположение (полярное, перитрихиальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания. Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO4)2, HgCl2) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности. Одним из предложенных методов окрашивания жгутиков является метод Лейфзона. Методика окрашивания.

1 Выращенные на скошенном агаре бактерии, осторожно ресуспендируют в пептонной воде. Бактериальной петлей суспензию наносят на предметное стекло и высушивают на воздухе.

2 Восковым стеклографом очерчивают вокруг бактериальной пленки прямоугольник.

35

3 Наносят на предметное стекло 1 мл раствора красителя таким образом, чтобы он не вытекал за пределы восковой линии. Оставляют краситель на определенное время (до 1 часа). В состав красителя входят 1,5 % хлористого натрия, 3 % таннина (дубильной кислоты) и 0,03 % фуксина.

4 Как только на поверхности красителя образуется золотистая пленка, а по всему мазку выпадет осадок, краситель удаляют под струей воды, а препарат высушивают на воздухе.

5 Препарат микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки бактерий окрашиваются в красный цвет, жгутики принимают вид толстых нитей, отходящих от клетки. Подвижность бактерий может быть выявлена с использованием техники посева в столбик агара. При этом культуру бактерий засевают уколом в столбик 0,3 % питательной среды в пробирке. Пробирки помещают в термостат для инкубирования. Результаты учитывают через 24 – 48 часов. Подвижные бактерии растут по всей толще агара, вызывая диффузное помутнение среды, неподвижные – только по линии укола.

5.5 Задание к лабораторной работе 1 Выявить наличие капсул бактерий при помощи метода Гинса – Бурри (метод негативного контрастирования).

2 Методом Шефера – Фултона изучить наличие и расположение эндоспор бактерий.

3 Цитоплазматические включения гранул волютина изучить методом окраски по Нейссеру.

4 Методом Лейфзона выявить наличие жгутиков на теле бактерий. На основании количества и характера расположения жгутиков на поверхности бактериальной клетки определить ее тип.

5 Результаты опытов зарисовать, сделать выводы.

5.6 Вопросы к защите лабораторной работы 1 Строение бактериальной клетки.

2 Цитоплазматические включения. Химический состав, назначение, способы окраски.

3 Перечислите органоиды, которые можно отнести к необязательным органоидам бактериальной клетки. Назовите их химический состав, функции.

4 Капсула бактерий. Химический состав, функции, способы окраски.

5 Типы передвижения бактериальных клеток. Способы окраски жгутиков.

36

6 Лабораторная работа № 5. Мицелиальные грибы. Систематика Цель работы – изучить морфологию мицелиальных грибов, произвести их идентификацию. Познакомиться с основными классами грибов.

6.1 Морфология мицелиальных грибов. Общая характеристика Грибы принадлежат к эукариотическим (рисунок 6) микроорганизмам, т.к. имеют ядерную мембрану и хорошо развитую систему мембран, и являются гетерогенной группой, насчитывающей более 100 тыс. видов, характеризующихся различными физиологическими особенностями. Занимают они практически все экологические ниши и входят как компоненты во все жизненные среды: почву, пресные и соленые водоемы, предметы промышленного производства и т.д. Наиболее важными особенностями грибов, которые обеспечивают их широкое распространение в биосфере, являются следующие: 1) наличие мицелиальной структуры таллома, обеспечивающей большую величину отношения поверхности гиф к объему, позволяет полнее заселять субстрат, пронизывая его гифами по всему объему, дает высокую степень контакта со средой и повышает эффективность метаболических процессов; 2) значительные скорости роста и размножения, позволяющие грибам в короткие сроки заселять обширные массы субстрата и накапливать большое число пропадативных структур; 3) высокая активность метаболизма, в том числе и удельная, проявляющаяся в широком интервале действия различных экологических факторов: температуры, влажности, света, кислотности среды, аэрации и т.п.

4) большая генетическая и биохимическая изменчивость, позволяющая грибам быстро адаптироваться к меняющимся условиям среды обитания и к новым питательным субстратам; 5) способность быстро реагировать на действие неблагоприятных факторов среды переходом к анабиозу, сохранять это состояние в течение длительного времени и быстро восстанавливать активность в благоприятных условиях.

37

цитоплазматический

ЭПС микрофиламенты

ядро комплекс Гольджи

митохондрии лизосомы

ядрышко

хромосомы

околоядерный ЭПС везикулы

микротрубочки плазматическая мембрана

Рисунок 6 - Эукариотическая клетка Все грибы, за немногим исключением, имеют мицелиальное строение, т.е. их вегетативное тело (таллом) состоит из мицелия (грибницы), который представляет собой систему ветвящихся нитей (гиф), пронизывающих субстрат и имеющих с ним большую поверхность соприкосновения. Грибы – неподвижные организмы, подвижными бывают только отдельные стадии в цикле развития. Все грибы лишены хлорофилла, поэтому необходимое условие для их существование – наличие органического источника углерода. Клетки мицелиальных грибов имеют вытянутую форму в виде нитей (гифов), размеры которых достигают до 5—30 мкм в диаметре, что значительно превышает размеры бактериальной клетки. Переплетение гиф образует тело гриба — мицелий, или грибницу (рисунок 7). Большая часть гиф развивается над поверхностью субстрата (воздушный мицелий), на которой располагаются органы размножения, а часть — в толще субстрата (субстратный мицелий). Гифы у большинства мицелиальных грибов многоклеточные, в их клетках имеются поперечные перегородки — септы. Такой мицелий называют септированным, он имеется у аскомицетов и дейтеромицетов. Мицелий зигомицетов несептированный (ценоцитный) и представляет собой одну гигантскую клетку с несколькими ядрами. Гифы растут за счет верхушечных клеток, и клетки гиф неодинаковы по длине.

38

а

б

а — несептированный; б — септированный Рисунок 7 - Мицелий грибов Некоторые грибы на определенной стадии развития образуют плодовые тела, внутри которых находятся органы размножения, покрытые сверху плотным переплетением гиф. У других видов грибов из плотных переплетений сильно разветвленных гиф образуются склероции, богатые запасными питательными веществами. Они служат для перенесения неблагоприятных условий и являются покоящейся формой гриба. Гифы, погруженные в субстрат, как правило, более вакуолизированы, содержат больше жира, чем воздушный мицелий. Субстратные гифы могут иметь некоторые модификации, в виде сильно разветвленных ризоидов, которые выполняют функцию прикрепления к субстрату и адсорбции питательных веществ (Rhizopus). В природе грибы относятся к гетеротрофам, зависящим от наличия в среде готовых органических факторов питания. По этой причине они, наряду с большинством микроорганизмов, входят в блок гетеротрофного компонента биогеоценоза, занимая уровень редуцентов или деструкторов органического материала. В рамках этого они выполняют в биогеоценозе ряд функций, вызывая 1) минерализацию или 2) гумификацию мертвого ОВ, в том числе и такого, которое недоступно другим организмам (лигнин, кератин), 3) выветривание пород, 4) выщелачивание металлов, 5) формирование почв, и 6) служат источником питания для других групп организмов: бактерий, актиномицетов, беспозвоночных и позвоночных животных. По взаимоотношениям со средой и другими организмами грибы могут быть разделены и на другие группы: облигатные паразиты, грибы-хищники и грибы-микоризообразователи, не имеющие значения с точки зрения деструкции ОВ; важными в этом смысле являются сапрофиты и факультативные патогены. При заселении какого-либо субстрата и его последующем разложении наблюдается определенная сукцессия или смена видов. Сукцессия, которая происходит при разложении мертвого ОВ, называется деградационной; если в последовательных сменах видов участвуют гетеротрофы - гетеротрофной. В конце концов, она заканчивается полной минерализацией ОВ или его 39

потреблением. Например, на корнях растений ее можно представить следующим образом: а) слабые паразиты, внедряющиеся в корни; б) сапрофитные грибы, усваивающие легкодоступные субстраты (сахара, пентозаны, гемицеллюлозу), иначе «сахарные грибы»; в) грибыцеллюлозоразрушители; г) грибы-лигнинразлагатели. Слабые паразиты некоторое время продолжают существовать поверхностно, и после отмирания корня мицелий растет, не внедряясь внутрь хозяина. Это Fusarium, Phythium, Cladosporium. Они открывают дорогу «сахарным грибам», не выдерживая конкуренции с ними и переходя в состояние покоя. В группу сапрофитных «сахарных грибов» входят грибы, быстро утилизирующие углеводы (кроме целлюлозы). Особенности этих грибов: способность быстро захватывать пространство, активный рост мицелия, быстрое прорастание спор и покоящихся клеток. Многие из них характеризуются продукцией антибиотиков, что дает еще больше преимуществ в захвате экологической ниши. Сюда относятся главным образом Zygomycetes (Mucor), а так же Aspergillus, некоторые виды Penicillium. Целлюлозоразрушающие грибы - менее определенная группа, растущие очень медленно. В нее входят сумчатые и несовершенные грибы, лигнинразрушающие грибы – главным образом базидиомицеты. Они начинают развиваться, когда легкодоступные источники углерода уже исчерпаны и использованы первичными колонизаторами. Характеризуются они развитым мицелием, способствующим переброске питательных веществ на большие расстояния по бесплодному субстрату и лучшему освоению и закреплению на нем. По мере разложения растительных остатков начинают развиваться грибы, довольствующиеся малым количеством питательных веществ и способные разлагать специфические вещества гумуса. На лесной подстилке смену видов можно представить следующим образом: - колонизация листьев начинается еще до их опада грибами филлопланы, которые утилизируют листовые экссудаты. Наиболее активны дрожжи, утилизирующие сахара и белки, и сахарные грибы; - сразу после опадения листьев и до шести месяцев преобладающими формами являются следующие: Cladosporium, Aureobasidium, из макромицетов – Mycena; - через шесть месяцев наиболее активно идут процессы разложения, появляются грибы родов Penicillium, Mucor, Trichoderma; - постоянные компоненты следующего этапа – макромицеты Inocybe, Agaricus, Melanoleuca. Можно отметить и специализацию видов грибов к типу опада: хвоя, листья и т.д. На субстратах животного происхождения прослеживается своя смена видов. Специфическими субстратами для них являются кератин в виде остатков волос, рогов, копыт, перьев и хитин, содержащийся в тканях 40

животных и клетках грибов. Такие типы грибов-деструкторов встречаются преимущественно в богатых ОВ почвах, активно посещаемых животными, садовых почвах и на фермах. Относятся в основном к роду Keratinomyces. Интересной является группа грибов пирогенных мест обитания или карбофилов. Условия их существования весьма своеобразны и специфичны: - растительность и органический материал отсутствуют, почва сильно обогащена зольными элементами; - сильно изменяется почва и в отношении воздушного и водного режима, рН смещен в кислую сторону, органо-минеральные коллоиды сильно разрушаются; - огонь вызывает гибель большинства организмов, что снижает антагонистический потенциал и уменьшает конкуренцию со стороны сапрофитов. Среди пирогенных грибов выявлена своя сукцессия видов: через 2-3 недели появляются термофильные виды Sordaria, Pyronema; затем они вытесняются медленно растущими, но обладающими анта-гонистической активностью видами, затем поселяются макромицеты Aleuria, Pholiota. Экологическая роль таких грибов состоит в том, что они подготавливают места выгорания для последующего заселения другими группами микроорганизмов и растений. Водные грибы, обнаруженные в составе гидробионтов еще в XIX веке, занимают практически всю толщу водной среды до сотен - тысяч метров. В водных экосистемах они выполняют несколько функций: 1) разложение органических остатков; 2) участие в симбиотрофных ассоциациях; 3) присутствие в биогенных обрастаниях; 4) паразитизм на водорослях, высших растениях и животных. Сапротрофные водные грибы, вероятно, являются первичными поселенцами на гниющих в воде листьях и древесине. Растительный опад, попадающий в ручьи, часто заселяют водные грибы (Hyphomyces), имеющие споры с клейкими кончиками и необычную форму. Они могут распространяться, разрастаясь внутри тканей, от одной клетки к другой. Разрушая и перерабатывая растительные ткани, они облегчают их использование водными беспозвоночными. При этом они сами часто становятся источником питания для микроскопических животных, поедающих споры и мицелий. Разлагая ОВ, грибы, вместе с другими гидробионтами, принимают участие в процессах биогенного очищения водоемов. При этом некоторые виды грибов могут разрушать вещества и материалы антропогенного происхождения, ядохимикаты, удобрения, очищать промышленные стоки. Кроме грибов, развивающихся за счет органических веществ отмерших организмов и участвующих в круговороте веществ в природе, имеются и такие, которые могут существовать только в живых организмах и вызывать их заболевания. Некоторые из грибов выделяют ядовитые вещества — микотоксины. Многие грибы вызывают порчу пищевых продуктов и 41

повреждение разнообразных изделий и материалов, некоторые могут развиваться даже на оптических поверхностях, где имеется мизерное количество смазки. Они утилизируют смазку и вызывают помутнение линз. Но грибы имеют и важное практическое значение, многие из них употребляются в пищу, используются в производстве этилового спирта, органических кислот, ферментов, антибиотиков, витаминов, некоторых сортов сыра и т. д. Царство грибов делится на семь классов, но объектами изучения микробиологии являются, в основном, три, включающие мицелиальные грибы, — зигомицеты (ранее их называли плесневые грибы), аскомицеты и дейтеромицеты.

6.2 Размножение и классификация Мицелиальные грибы размножаются бесполым и половым путем. Оба способа размножения связаны с образованием спор — наружных (экзоспоры) и внутренних (эндоспоры). При бесполом размножении экзоспоры образуются открыто на специализированных гифах или на мицелии различными способами и называются конидиями (рисунок 8). Эндоспоры образуются в специальных вместилищах – спорангиях и называются спорангиоспорами (представители родов Мuсог и Rhizopus).

а

б

а — у грибов рода Аspergillus; б — у грибов рода Penicillium; 1 — вегетативный мицелий; 2 — конидиеносец; 3 — фиалиды; 4 — конидии Рисунок 8 - Конидиеносцы аскомицетов Образованию спор при половом размножении предшествует процесс слияния содержимого двух клеток и их ядер. Вновь образовавшееся ядро делится на несколько частей — спор. Грибы, способные к половому размножению, относятся к совершенным (аскомицеты, зигомицеты), а те, которые не имеют полового размножения, относятся к несовершенным грибам (дейтеромицеты). У грибов имеется большое разнообразие способов и органов размножения. Вегетативное размножение – это размножение без образования специализированных органов размножения. Чаще всего это происходит 42

отдельными участками мицелия, каждая часть которого способна дать начало новому организму. Вегетативным является так же размножение, при которм в гифах предварительно образуются частые перегородки, а затем гиф распадается на отдельные клетки цилиндрической или овальной формы (оидиями, или артроспорами). Если они до своего разделения покрываются дополнительной толстой оболочкой, они будут называться хламидоспорами. В природе широко распространены представители класса зигомицеты. Наибольшее значение среди них имеют представители родов Мuсог и Rhizopus (рисунок 9). Из мицелиальных аскомицетов чаще всего встречаются виды родов Penicillium и Аspergillus (рисунок 10).

а)

б)

а)

1

в)

б)

2

в)

1 – Мuсог: а – формирование спорангиоспор, б – спорангии; 2 – Rhizopus: а – спорангий, б – ризойды, в – столоны Рисунок 9 - Зигомицеты

д)

в)

е)

43

б) Аspergillus: а – формирование конидиеносца с конидиями, б – конидии, в – конидиеносец; Penicillium: г, д - формирование конидиеносца с конидиями, е – мицелий, е Рисунок 10 - Мицелиальные аскомицеты а) К несовершенным грибам относят мицелиальные грибы, половой процесс у которых не выявлен, размножаются они исключительно бесполым г) путём, имеют несептированный мицелий. В класс несовершенных грибов относятся представители родов Cladosporium, Endomyces lactis, Alternaria, Catenularia, Fusarium (рисунки 11, 12, 13, 14, 15), а так же Trichoderma, Oidium iactis, Trichothecium, Botrytis (рисунки 16, 17, 18, 19). а

Рисунок 11 - Cladosporium

Рисунок 12 - Endomyces lactis

44

Рисунок 13 - Alternaria

Рисунок 14 - Catenularia

Рисунок 15 - Fusarium

Рисунок 16 - Trichoderma

Рисунок 17 - Oidium iactis

45

Рисунок 18 - Trichothecium

а

б а –конидии, б- конидиеносец Рисунок 19 - Botrytis 6.3 Задание к лабораторной работе 1 Ознакомиться с морфологией мицелиальных грибов.

2 Приготовить препарат «раздавленная капля» из культур изучаемых грибов. Изучить под микроскопом и зарисовать.

3 Произвести идентификацию мицелиальных грибов, указав детали их строения.

6.4 Вопросы к защите лабораторной работы 1 Морфология мицелиальных грибов.

2 Чем грибы отличаются от бактерий?

3 Общая характеристика грибов.

4 Назовите основные особенности грибов, которые обеспечивают их широкое распространение в биосфере.

5 Виды бесполого размножения грибов.

6 Половое размножение мицелиальных грибов.

7 Лабораторная работа № 6. Дрожжи Цель работы – изучить морфологию дрожжевой клетки, способы размножения и методы микробиологического контроля дрожжей.

46

7.1 Общая характеристика дрожжей По современным представлениям, дрожжи — это сборная группа одноклеточных микроскопических организмов, относящихся к разным классам грибов, преимущественно — к классу аскомицетов. Диаметр клеток дрожжей колеблется от 8 до 15 мкм. Форма их разнообразна: эллипсовидная, грушевидная, округлая, цилиндрическая. На протяжении всего или большей части жизненного цикла существуют в виде различных одиночных клеток. Дрожжи обладают всеми признаками грибных организмов, но одноклеточность их строения и большое значение соотношения площади поверхности к объёму, влечет за собой более высокую скорость метаболических процессов, по сравнению с мицелиальными грибами. Дрожжи растут и размножаются так же с большей скоростью, вызывая при этом ряд существенных изменений в окружающей среде. Однако среди дрожжей нет видов, образующих токсические для человека вещества. При порче пищевых продуктов, вызываемой дрожжами, меняется вкус и внешний вид, но не происходит накопления вреднодействующих веществ, как это бывает у некоторых грибов и бактерий. На плотных питательных средах дрожжи растут в виде колоний разного цвета, формы и консистенции, в жидких образуют муть, пленки, осадки. Дрожжевые клетки морфологически довольно разнообразны. Они могут иметь округлую, цилиндрическую, удлиненно-цилиндрическую, овальную, лимоновидную, бутылевидную, треугольную или серповидную форму (рисунок 20). Размножаются дрожжи вегетативным и половым путем. Вегетативные способы размножения — почкование и деление; половой способ размножения связан с образованием спор. К почкующимся дрожжам (рисунок 20 а) относятся представители «культурных» дрожжей рода Saccharomyces (сахаромицеты), к делящимся — виды рода Schizosaccharomyces (шизосахаромицеты). При половом процессе слияние вегетативных клеток ведет к образованию сумок со спорами или сначала могут сформироваться споры, которые в последующем копулируют друг с другом. В каждой сумке образуется от 2 до 8, иногда 12 спор. Среди дрожжей есть аспорогенные, ложные дрожжи, не способные к половому процессу и спорообразованию. Они относятся к классу несовершенных грибов.

1б

2

1а

3

4

5

47

1 – делящиеся дрожжи (а – копуляция клеток, б – клетка со спорами); 2 – шаровидные; 3 – яйцевидные; 4 – палочковидные; 5 - эллипсоидальные. Рисунок 20 - Формы дрожжевых клеток С делящимися дрожжами (рисунок 20 б) можно познакомиться на примере Schizosaccharomyces pombe (schizo — рваться, делиться, saccharomyces — сахарный гриб, pombe — название африканского напитка, из которого этот организм выделен). Дрожжам размножение делением несвойственно, поэтому данный род дрожжей является отклонением от нормы. Шизосахаромицеты размножаются и половым путем, связанным со спорообразованием, что характерно для сумчатых грибов.

Schizosaccharomyces pombe рассматривают на фиксированных, окрашенных фуксином препаратах. Это цилиндрической формы крупные клетки с округлыми концами. Размножение делением свойственно также дрожжам рода Endomyces. Из почкующихся дрожжей наиболее «одомашнены» дрожжи пекарские — Saccharomyces cerevisiae.

а - почкующиеся «культурные» дрожжи рода Saccharomyces; б делящиеся дрожжи Schizosaccharomyces. Рисунок 20 - Дрожжи Размножаются они почкованием (вегетативный способ размножения) и аскоспорами. При почковании на материнской клетке возникает маленькая выпуклость — почка — дочерняя клетка, в которую переходит одно ядро. Клетка увеличивается в размерах и отделяется. Если условия для такого размножения благоприятны (достаточное количество сахара, соответствующая температура, аэрация), процесс идет очень быстро. У некоторых представителей рода клетки после почкования не успевают разъединяться и возникает псевдомицелий (ложный мицелий). Для лабораторных занятий могут быть использованы пекарские дрожжи. Небольшой кусочек дрожжевой массы за несколько часов до занятий помещают в теплую подсахаренную воду и ставят в теплое место. Образуется беловатая мутная жидкость. Каплю этой жидкости наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, сверху наносят каплю кедрового масла и просматривают препарат с иммерсионной системой. Клетки хорошо видны и при меньших увеличениях. В пекарских дрожжах обычно присутствуют две расы: одна 48

представлена округло-эллипсовидными клетками, быстро разъединяющимися при почковании; другая — удлиненно-цилиндрическими, образующими при почковании ветвистые кустики (псевдомицелий). На многих клетках видны почки. В мелкозернистом содержимом живых дрожжей хорошо заметны крупные прозрачные вакуоли, занимающие иногда центральное положение. С представителями аспорогенных дрожжей, размножающихся только почкованием и не образующих спор, можно познакомиться на примере Candida keflri. Их клетки мелкие, диаметром около 5 мкм. Размножение у дрожжеподобных организмов может происходить также в результате распада гиф на отдельные клетки — оидии, или артроспоры, как у Geotrichum candidum (Oidium lactis).

7.2 Задание к лабораторной работе 1 Провести микробиологический контроль дрожжей.

1.1 Приготовить препарат «раздавленная капля» из дрожжевой суспензии. Промикоскопировать с объективом х40. определить форму дрожжевых клеток, определить количество почкующихся клеток, зарисовать. При определении формы дрожжевых клеток и количества почкующихся клеток чаще всего используют препарат «раздавленная капля». Микроскопируют с объективом х40. При необходимости определения наличия бактериальной инфекции препарат «раздавленная капля» микроскопируют с объективом х90 (МИ), при этом препарат должен быть очень тонким. Или готовят мазок, проводят простое окрашивание и микроскопируют с объективом х90 (МИ). Определение количества почкующихся клеток Почкующимися клетками принято считать те, у которых дочерние клетки меньше материнских. При равных размерах материнской и дочерней клеток их считают двумя самостоятельными клетками. В препарате дрожжевой суспензии в 5 полях зрения подсчитывают общее количество дрожжевых клеток и количество почкующихся. Процентное содержание почкующихся клеток определяют по формуле: Х=А∙100/Б, где А- число почкующихся клеток в 5 полях зрения; Б – общее количество клеток в 5 полях зрения.

1.2 Приготовить препарат для выявления мертвых дрожжевых клеток. Промикроскопировать, зарисовать. Оценить процентное содержание мертвых клеток. Определение количества мертвых дрожжевых клеток Метод основан на том, что мертвые и ослабленные дрожжевые клетки способны пропускать через оболочку краситель – метиленовую синь. На предметное стекло с каплей дрожжевой суспензии наносят каплю раствора 49

метиленовой сини. Краем покровного стекла смешивают капли и затем накрывают, оттягивая избыток жидкости фильтровальной бумагой и через 12 минуты препарат микроскопируют с объективом х40. Мертвые дрожжевые клетки окрашиваются в сине-голубой цвет, живые – остаются неокрашенными. Подсчитывают количество окрашенных и неокрашенных дрожжевых клеток в 5 полях зрения и процентное содержание мертвых клеток. В производственных дрожжах мертвых клеток должно быть не более 1 %. В активных сухих дрожжах – не более 30 %.

1.3 Приготовить препарат для выявления гликогена в клетках. Промикроскопировать, зарисовать. Определить степень упитанности дрожжей. Определение гликогена Гликоген – полисахарид, который является запасным питательным веществом и откладывается в клетке в виде гранул. Он не является постоянным компонентом клетки, образуется в зависимости от условий культивирования, возраста культуры и может использоваться в метаболизме клетки. Метод определения основан на окраске гликогена йодом. Окрашивание гликогена происходит в кислой среде, поэтому перед выявлением гликогена среду подкисляют, либо на предметное стекло вместо воды наносят 0,5 % раствор соляной кислоты и в ней эмульгируют исследуемую культуру. Для определения на предметное стекло наносят небольшую каплю микробной суспензии, добавляют каплю концентрированного раствора Люголя и выдерживают 2-3 минуты. Далее каплю накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости и микроскопируют с объективом х40 или х90 (МИ). Клетки дрожжей окрашиваются в светло-желтый цвет, а гранулы гликогена – в коричневый. Подсчитывают количество клеток, содержащих гликоген в 5 полях зрения, и вычисляют процентное содержание клеток с гликогеном. При хорошей упитанности дрожжи содержат не менее 50 % клеток с гликогеном, при степени упитанности выше средней – 35-50 %, при средней – 20-35 %, при слабой – менее 20 %.

7.3 Вопросы к защите лабораторной работы 1 Строение дрожжевой клетки.

2 Чем грибы отличаются от дрожжей?

3 Общая характеристика дрожжей.

4 Назовите основные группы дрожжей и типы осуществляемых ими процессов.

5 Виды бесполого размножения дрожжей.

6 Половое размножение дрожжей.

50

8 Лабораторная работа № 7. Молочно-кислое брожение Цель работы – изучить механизм молочно-кислого брожения, его возбудителей и значение в народном хозяйстве.

8.1 Общая характеристика микроорганизмов, его вызывающих

молочно-кислого

брожения

и

В пищевых производствах используются процессы, основанные на жизнедеятельности хемогетеротрофов. По субстрату, на который воздействуют хемогетеротрофные микроорганизмы, все процессы можно разделить на две основные группы: превращения органических веществ, не содержащих азота (различные виды брожения и окисления); превращения органических веществ, содержащих азот (гниение). Молочнокислое брожение — это процесс превращения углеводов в молочную кислоту, которая является для них единственным источником энергии. Оно вызывается группой молочнокислых бактерий, которая очень разнообразна и широко распространена в природе. Молочно-кислые бактерии обитают на поверхности растений, в молоке, на пищевых продуктах, в кишечнике человека и животных. Молочнокислые бактерии подразделяются на две группы — гомоферментативные и гетероферментативные, которые вызывают соответственно либо гомоферментативное, либо гетероферментативное молочнокислое брожение. В основе этого деления лежат различия в характере образующихся продуктов, что определяется набором ферментов у молочнокислых бактерий. Гомоферментативные молочнокислые бактерии из сахара образуют только молочную кислоту. Гетероферментативные молочнокислые бактерии благодаря разнообразию имеющихся у них ферментов из сахара образуют кроме молочной кислоты и другие продукты брожения (уксусную кислоту, этиловый спирт, диоксид углерода, некоторые виды образуют еще янтарную кислоту, водород). Кроме того, среди молочнокислых бактерий имеются ароматобразующие виды, которые синтезируют ароматические вещества: диацетил и ацетоин. Конечные продукты, образущиеся при гетероферментативном молочнокислом брожении, накапливаются в среде в различных количественных соотношениях, что зависит от вида микроорганизмов, питательной среды и внешних условий.

51

Молочно-кислые бактерии имеют много общих признаков, важнейшими из которых являются: они положительно окрашиваются по Граму, обычно не образуют спор, неподвижны, кокки или палочки, требовательны к источнику азота (многие не развиваются на простых синтетических средах), не образуют каталазу. Если на колонию молочнокислых бактерий нанести каплю 3 % раствора перекиси водорода, выделение кислорода не наблюдается. Для изучения молочно-кислого брожения чаще всего в качестве питательной среды используют молоко. В нем имеются все необходимые элементы для развития молочно-кислых бактерий. В этой среде могут хорошо развиваться и другие бактерии, например, гнилостные, маслянокислые, однако молочно-кислые быстро подавляют их развитие вследствие накопления молочной кислоты.

8.2 Задание к лабораторной работе 8.2.1 Приготовить микропрепараты из подготовленных различными способами проб молока. Методика выполнения работы. Молоко необходимо разлить в колбы объёмом 100 мл приблизительно по 40-50 мл, закрыть их ватными пробками. Параллельно осуществляют второй вариант опыта. Разлив молоко в колбы, закрывают их ватными пробками, доводят молоко до кипения. Колбы с кипяченым и некипячёным молоком ставят в термостат при температуре 30 0С. Через 10-12 ч свежее (некипяченое) молоко скисает. В колбе образуется плотный, ровный сгусток без следов газа. Сгусток образуется вследствие того, что молочная кислота реагирует с казеинатом кальция и кальций выпадает в осадок. В кипячёном молоке молочно-кислые бактерии, поскольку они не образуют спор, погибают, споры же масляно-кислых бактерий сохраняются. При инкубации в термостате они прорастают, осуществляя масляно-кислое брожение лактозы. В результате реакции масляной кислоты с казеинатом кальция в этом варианте в осадок выпадает казеиновая кислота. В дальнейшем она подвергается пептонизации; осадок переходит в кремовую жидкость с неприятным запахом масляной кислоты (запах пота) и прогорклым вкусом.

1 Из прокисшего молока готовят микропрепарат. Бактериологической петлёй извлекают сгусток, размазывают его на предметном стекле очень тонким слоем без воды.

2 Сушат на воздухе 3 Фиксируют смесью спирта с эфиром (примерно 1:1), несколько раз нанося смесь на мазок и сливая её. При такой фиксации бактерии не только погибают и прикрепляются к стеклу, но и, параллельно, эфиром извлекается и удаляется жир. Это необходимо, поскольку капли жира на препарате мешают окраске и микроскопированию.

4 Фиксированный препарат окрашивают метиленовым синим в течение 52

2-3 мин 5 Промывают водой 6 Высушивают и микроскопируют с иммерсией. Метиленовый синий – лучший краситель для молочно-кислых бактерий, так как он слабо окрашивает основной фон (казеин) и хорошо окрашивает клетки бактерий. Получаются наиболее четкие препараты.

8.2.2 Полученные результаты зарисовать, сделать выводы. В микропрепарате чаще преобладают мелкие округлые клетки Streptococcus lactis, соединенные в короткие цепочки. Этот микроорганизм является возбудителем естественным скисанием молока в наших широтах. Оптимальная температура его развития – 30 0С. Он накапливает до 1 % молочной кислоты. Нередко в препарате наблюдаются тонкие палочки рода Lactobacterium, варьирующие в размере, иногда содержащие зерна волютина. Чаще встречается Lactobacterium bugaricum – возбудитель естественного скисания молока в южных широтах. Оптимальная температура его развития – 40 0С. Кислотоустойчив, он накапливает до 3,5 % молочной кислоты. Если на поверхности скисшего молока появляется плёнка, то в мазке обнаруживается так же и молочная плесень, четырехугольные или овальные клетки которой отличаются от молочно-кислых своими размерами.

8.2.3 Скисшие образцы проверить на наличие молочной кислоты. Наличие молочной кислоты в скисших образцах можно подтвердить качественными реакциями. Методика выполнения работы. В коническую колбу объёмом 100 мл берут 5 мл фильтрата, добавляют 2 мл крепкой серной кислоты, и нагревают при взбалтывании до начала кипения. Затем, продолжая кипячение и помешивание, пипеткой по каплям приливают 5 мл 5 % р-ра КМnО4, который обесцвечивается. В этих условиях молочная кислота переходит в уксусный альдегид. Для распознавания уксусного альдегида быстро покрывают горлышко колбы фильтровальной бумагой, смоченной аммиачным раствором АgNО3. Аккуратно, чтобы не разорвать фильтровальную бумагу, прижимают её к краям горла колбы, продолжая нагревание. Уксусный альдегид улетучивается и, реагируя с аммиачным раствором АgNО3, вызывает почернение бумаги с серебристой побежалостью. Так выделяется металлическое серебро.

8.2.4 Учесть результаты реакции и занести в таблицу (таблица 3). Таблица 3 - Протокол исследования Название опыта Молоко некипячёное Микроскопия Реакция на молочную кислоту

Молоко кипячёное

53

8.3 Вопросы к защите лабораторной работы 1 На какие виды в зависимости от соотношения получаемых конечных продуктов подразделяется молочно-кислое брожение?

2 Что является продуктом брожения гомоферментативных молочнокислых бактерий 3 Какой продукт образуется в результате брожения гетероферментативных молочно-кислых бактерий?

4 Охарактеризуйте молочно-кислые бактерии.

5 Какими по морфологии могут быть молочно-кислые бактерии?

6 Какой антибиотик вырабатывается некоторыми молочно-кислыми бактериями?

9 Лабораторная работа № 8. Определение бактериальной обсемененности пищевых продуктов Цель работы – познакомиться с лабораторными методами исследования пищевых продуктов.

9.1 Ход работы В соответствии со стандартом свежесть мяса убойных животных, субпродуктов, птицы определяют по органолептическим показателям: внешнему виду и цвету поверхности туши и мышц на разрезе, консистенции, запаху, состоянию жира, сухожилий, прозрачности и аромату бульона. Мясо сомнительной свежести хотя бы по одному из этих показателей подвергают химическому и бактериологическому анализу. Бактериоскопический метод подсчета (метод отпечатков) применяется для оценки свежести мяса, однако может быть использован и для ориентировочной оценки количественного и качественного состава микрофлоры других продуктов – рыбы и полуфабрикатов. Для микроскопического исследования из проб мяса готовят не меньше трех мазков-отпечатков: один с поверхностного слоя с глубины 1-2 см, другой с глубины 2-2,5 см и третий – с глубины 3-3,5 см. Для приготовления препарата-отпечатка с поверхностного слоя мяса стерильными ножницами вырезают кусочек 0,5-1 г и срезанной стороной делают тонкие отпечатки на слегка подогретом предметном стекле. Чтобы приготовить препарат-отпечаток из глубоких слоёв, поверхность мяса сначала прижигают нагретым шпателем, а затем стерильным скальпелем производят глубокий разрез, пинцетом раздвигают края, вырезают кусочек мяса и, прикладывая его к поверхности предметного стекла, делают отпечатки.

54

Приготовленные мазки подсушивают на воздухе, фиксируют на пламени спиртовки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Просматривают не менее 5 полей зрения. В каждом поле подсчитывают отдельно кокковые и палочковидные микробы, затем вычисляют их средне арифметическое количество в одном поле зрения. Свежесть мяса определяют по справочной таблице 4. При микроскопическом анализе кисломолочных продуктов обязательно обращают внимание на видовой состав микрофлоры продукта. Различные кисломолочные продукты характеризуются свойственной им микрофлорой, так как для приготовления обыкновенной простокваши, кефира, сметаны и творогаиспользуются закваски, состоящие из чистых культур Str. lactis, Str. cremoris, Str. diacetilactis и др. Таблица 4 – Оценка свежести мяса микроскопическим методом Степень свежести мяса Свежее

рН 5,9-5,5

Сомнительной свежести

6,5

Несвежее

6,7

Характеристика отпечатков Микрофлора не обнаруживается или видны единичные экземпляры кокков, дрожжей, палочек в поле зрения препарата. Отсутствуют остатки разложившейся ткани мяса. Окраска микрофлоры грамположительная. На отпечатках 20-30 кокков или несколько палочек в поле зрения микроскопа. Ясно видны следы распада мышечной ткани. Окраска микрофлоры грамотрицательная. В поле зрения много микроорганизмов, преобладают грамотрицательные палочки (почти все поле зрения усеяно ими). Много распавшейся ткани мышц.

Поэтому, чтобы сделать вывод о свежести кисломолочных продуктов, необходимо хорошо знать микрофлору закваски и как она выглядит под микроскопом. Из продукта приготавливают окрашенные комбинированным фиксатором препараты (комбинированный фиксатор: 1 часть метилового 55

спирта, 1 часть эфира, 0,2 части метиленового синего). При микроскопировании определяют морфологию и количественное соотношение молочнокислых микробов закваски. Регистрирует постороннюю микрофлору, которая определяет загрязненность продукта (дрожжи, бациллы, мицелий и др.). для определения свежести продукта используйте справочную таблицу 5. Таблица 5 – Микрофлора кисломолочных продуктов Наименование продукта Простокваша, ряженка Ацидофильное молоко Кефир, кумыс Творог, сметана

Микрофлора закваски Молочнокислые стрептококки, единичные палочки Молочнокислая палочка Молочнокислые стрептококки, палочки, единичные клетки дрожжей Молочнокислые стрептококки

9.2 Задание к лабораторной работе 1 Познакомиться с сущностью метода определения свежести мяса бактериоскопическим методом и выписать показатели свежести мяса в соответствии со стандартом.

2 Приготовить и окрасить мазки из образцов мяса, и рассмотреть их под микроскопом (объектив х90, МИ), зарисовать их и сделать вывод о свежести мяса.

3 Познакомиться с сущностью метода оценки качества кисломолочных продуктов.

4 Приготовить и окрасить мазки из кефира или сметаны, рассмотреть их под микроскопом (объектив х90, МИ), зарисовать их и сделать вывод о свежести кисломолочных продуктов.

9.3 Вопросы к защите лабораторной работы 1 Какие виды порчи мяса вам известны?

2 Какие методы определения свежести мяса вы знаете?

3 Наличием какой микрофлоры характеризуется свежее мясо?

4 Наличием какой микрофлоры характеризуется мясо сомнительной свежести?

5 Наличием какой микрофлоры характеризуется несвежее мясо?

6 Какие виды порчи молока и молочных продуктов вам известны?

7 Что позволяет установить микроскопический метод определения качества кисломолочного продукта?

8 Что является анормальной микрофлорой кисломолочных продуктов?

9 Каков состав заквасок для простокваши и кефира?

56

10 На основании каких кисломолочный продукт свежий?

10 Лабораторная микроорганизмов

данных

работа

можно

№

9.

сделать

вывод,

что

Культивирование

Цель работы – познакомиться с основными видами питательных сред, их составом и применением, а так же особенностями культивирования микроорганизмов.

10.1 общая характеристика питательных сред. Классификация питательных сред Известно значительное количество питательных сред, используемых для культивирования и поддержания (сохранения) микроорганизмов. Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Еще в 1930 году их было классифицировано не менее двух тысяч наименований, но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико, а их композиции создаются на определенных общих принципах. Для размножения любых бактерий необходимо обеспечить подходящее биофизическое окружение и биохимические питательные компоненты. Любая питательная среда должна соответствовать следующим требованиям: содержать все необходимые для роста питательные вещества в легко усвояемой форме; иметь оптимальную влажность, вязкость, рН, быть изотоничной, сбалансированной с высокой буферной емкостью и, по возможности, прозрачной. Для роста автотрофных бактерий потребности в питательных веществах довольно просты: вода, двуокись углерода и соответствующие неорганические соли. Например, бактерии рода Nitrobacter ассимилируют СО2 и получают энергию путем окисления нитритов в нитраты. Гетеротрофные бактерии получают энергию в результате окисления (диссимиляции) восстановленных углеродных соединений. Гетеротрофные бактерии используют органические соединения в двух целях: 1) в качестве источника энергии; при этом органическое вещество окисляется или расщепляется с высвобождением энергии и образованием ряда конечных продуктов типа СО2, органических кислот и др; 2) в качестве субстратов, ассимилируемых непосредственно с образованием клеточных компонентов или для их синтеза в реакциях, требующих затрат энергии. Так, E.coli способна к росту на простой среде, содержащей только глюкозу и неорганические соли. Молочнокислые же бактерии растут на сложных 57

средах, содержащих в качестве добавок ряд органических соединений (витамины, аминокислоты и др.), которые клетки не в состоянии синтезировать самостоятельно. Такие соединения называются факторами роста. Организмы, которые нуждаются в их добавлении к ростовой среде, называются ауксотрофными по соответствующим соединениям. Другая группа организмов, способная к росту на простых средах, содержащих источник углерода и энергии, а также набор основных биогенных элементов, получила название прототрофных. Следует учитывать и то, что в природе встречаются бактерии, которые способны размножаться в местах с низким пищевым потоком углерода – до 0,1 мг/л в день. Они получили название олиготрорфных, противоположную группу для них составляют бактерии копиотрофные – способные к росту на богатых пищевых субстратах. Выбор питательной среды зависит в значительной степени от целей эксперимента, а существующая классификация питательных сред учитывает характеристику их следующих особенностей. По составу питательные среды делятся на натуральные и синтетические. Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов растительного или животного происхождения, имеющих неопределенный химический состав. Примерами питательных сред такого типа являются среды, представляющие собой смесь продуктов распада белков (казеина, мышц млекопитающих), образующихся при их гидролизе. Кислотный (НСl) гидролиз белков используется для приготовления полных гидролизатов. Действие ферментов типа трипсина, панкреатина, папаина, приводит лишь к частичному (неполному) гидролизу белков, в результате чего образуются пептоны. Как правило, на пептонных питательных средах микроорганизмы растут лучше, чем на питательных средах, приготовленных из полных гидролизатов или смесей аминокислот. При ферментативном гидролизе, вероятно, сохраняются лабильные факторы роста. Кроме того, многие микроорганизмы лучше размножаются на средах, содержащих небольшие пептиды, потому что их они могут усваивать непосредственно, а отсутствующие аминокислоты – нет. Обычно в составе такой среды ферментативный гидролизат белка обеспечивает потребность в таких источниках азота, как аминокислоты, углеводы (глюкоза), используется как источник углерода и энергии, соли удовлетворяют потребности бактерий в неорганических ионах, а дрожжевой экстракт обеспечивает потребности в витаминах. К питательным средам неопределенного состава можно отнести и среды, полученные на основе растительного сырья: картофельный агар, томатный агар, отвары злаков, дрожжей, пивное сусло, настои сена и соломы и др. Основное назначение таких питательных сред – выделение, культивирование, получение биомассы и поддержание культур микроорганизмов. К числу сред неопределенного состава относят и среды полусинтетические. В такую среду вносят известные соединения как явно необходимые; а также добавляют небольшое количество дрожжевого или кукурузного экстракта (или любого другого природного продукта) для 58

обеспечения неизвестных потребностей роста. Такие среды часто используются в случае промышленного культивирования биологических объектов для получения продуктов метаболизма. Синтетические среды – это среды определенного состава, представленные чистыми химическими соединениями, взятыми в точно указанных концентрациях и соотношениях отдельных элементов. Обязательными компонентами таких сред являются неорганические соединения (соли) и углерод- и азотсодержащие вещества (типичными представителями являются глюкоза и (NH4)2SO4. Часто к таким средам добавляют буферные растворы и хелатирующие соединения. Ауксотрофные организмы растут на таких средах только при добавлении соответствующих факторов роста. Основное назначение таких питательных сред – изучение особенностей физиологии и метаболизма микроорганизмов, выделение генетических рекомбинантов и т. д. По назначению среды разделяют на элективные и дифференциально-диагностические. Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного или целой физиологической группы микроорганизмов. Например, для преимущественного выделения грамотрицательных бактерий бывает достаточным добавления в питательную среду трифенилметановых красителей (кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый и т. д.). Для выделения стафилоккоков в среду может быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5 %. При этой концентрации рост других бактерий подавляется. Элективные среды применяются на первом этапе выделения чистой культуры бактерий, т. е. при получении накопительной культуры. Дифференциально-диагностические среды применяются для быстрой идентификации близкородственных видов микроорганизмов, для определения видовой принадлежности, в клинической бактериологии и др. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности и имеют неодинаковый набор ферментов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды. В состав дифференциально-диагностической среды входят: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроорганизма; в) цветной индикатор, изменение окраски которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма. Например, среда Эндо позволяет отличить клоны, сбраживающие лактозу от клонов, не обладающих этим свойством. Основными компонентами этой среды являются питательный (пептонный) агар, углевод и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом (реактив Шиффа). Исходная питательная среда окрашена в розовый цвет. Микроорганизмы, не 59

сбраживающие лактозу, образуют бесцветные колонии. При сбраживании лактозы до ацетальдегида последний реагирует с сульфитом и развививается красная окраска соответствующих колоний. Среда с эозином и метиленовым синим (среда Левина) в качестве индикаторов содержит эозин и метиленовый синий и исходно окрашена в черно-синий цвет. Клетки, осуществляющие брожение, образуют колонии, окрашенные в черный с металлическим блеском цвет, а колонии, не обладающие этим свойством, бесцветны. Подобные изменения окраски происходят потому, что красители присутствуют в среде не в виде самостоятельных соединений, а в виде комплексов с веществами питательной среды. При низких значениях рН эти комплексы выпадают в осадок, исходные же красители в этих условиях растворимы, при больших рН комплексы красителей бесцветны, тогда как метиленовый синий приобретает синюю окраску. Данная среда позволяет дифференцировать бактерии рода Escherichia от бактерий рода Proteus. По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими, твердыми, сыпучими. Жидкие питательные среды получают при растворении в воде определенного необходимого набора питательных веществ, макро- и микроэлементов. По составу они могут быть как натуральными, так и синтетическими. Рост микроорганизмов в жидкой среде может происходить в периодической (закрытой) системе, в этом случае после инокуляции среды не происходит ни добавления, ни удаления какихлибо компонентов, кроме газовой фазы (закрытая система). При проточном (непрерывном) культивировании характерна постоянная подача свежих питательных компонентов со скоростью, равной скорости удаления среды (открытая система). Среды в твердом состоянии в форме плотных гелей используются в бактериологии со времен Р. Коха. Наиболее важным преимуществом использования твердых сред является то, что на них можно выращивать микроорганизмы в виде колоний, образующихся из отдельных клеток популяции. Приготовление твердых питательных сред достигается добавлением к жидким средам определенных уплотнителей, в качестве которых могут выступать агар, желатина, силикагель, каррагенан. Наиболее распространенным из уплотнителей является агар – полисахарид, выделяемый из красных морских водорослей и состоящий из двух полисахаридов – агарозы (70 %) и агаропектина. Он обладает рядом полезных свойств, в частности: 1) способен образовывать в воде гели; 2) плавится при температуре 100 °С и затвердевает при 45 °С ; 3) не расщепляется под влиянием ферментов большинства видов микроорганизмов; 4) термолабильные вещества и живые микроорганизмы не разрушаются при добавлении к нагретому до 45 °С расплавленному агару, если смесь сразу же охладить; 5) агаровые гели имеют высокую степень прозрачности; 6) обычно используемые концентрации 60

1,5 - 2,0 % являются относительно невысокими и их использование экономично. Желатина – белок, приготовленный из кожи и костей, – в настоящее время используется для специальных целей, поскольку образуемый ею гель плавится при температурах около 25 – 30 °С. Кроме того, желатина разжижается протеолитическими ферментами многих микроорганизмов. «Уплотняющая» концентрация желатины – 17 – 20 %. Силикагелем называют двуокись кремния (SiO2). Его стерильный золь готовят из раствора силиката натрия и перед использованием, для того чтобы вызвать образование геля, к нему добавляют питательную среду, содержащую электролиты. Среды на основе силикагеля (1,5 – 2,0 %) используют для получения культур автотрофных бактерий, так как при этом в среде отсутствуют органические вещества. При добавлении в такие минеральные среды различных органических веществ можно исследовать способность гетеротрофных бактерий использовать их в качестве единственных источников углерода. С помощью силикагелиевых сред также можно определять потребности бактерий в витаминах. Каррагенан («растительная желатина») – добывается путем экстракции из определенных видов красных морских водорослей. Калиевые соли некоторых типов каррагенанов способны образовывать плотные (2 %) прозрачные гели, которые могут быть заменителями агара. Каррагенан значительно дешевле агара, не разрушается большинством видов бактерий. Однако разливать приготовленные среды следует при высокой температуре – 55 – 60 °С . Полужидкие среды содержат гелеобразующее вещество в низкой (0,3 – 0,7 %) концентрации и имеют мягкую желеподобную консистенцию. Такие среды пригодны для изучения подвижности и хемотаксиса клеток, культивирования микроаэрофилов. Сыпучие среды представляют собой массу в той или иной степени измельченного и увлажненного сырья (чаще всего, растительного). Основное их назначение – использование в пищевой промышленности (получение соевого соуса или рисовой водки), сельском хозяйстве (силосование кормов) и т. д. В бактериологической практике чаще всего используются сухие питательные среды, которые получают в промышленных масштабах – триптические гидролизаты дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин) и питательный агар. Сухие среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке, имеют относительно стандартный состав.

10.2 Состав питательных сред Определение состава питательной среды предполагает, что при этом будут учтены и такие биофизические факторы как рН среды, температура, подача и удаление молекулярного кислорода, являющиеся критическими для 61

роста любой бактериальной культуры. Температура, аэрация и давление определяются условиями культивирования, окислительновосстановительный потенциал зависит как от состава ростовой среды, так и от условий культивирования. Контроль окислительно-восстановительного потенциала особенно важен при культивировании облигатно-анаэробных бактерий. Агар-агар - растительный коллоид, получаемый из некоторых морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды с ничтожным содержанием азотистых веществ. Желатина - кислый азотсодержащий продукт, добываемый путем выварки костей и хрящей. В качестве плотных питательных сред широко применяют также гелевые пластины, введенные в микробиологическую практику С. Н. Виноградским. Для выращивания микроорганизмов, использующих органические формы азота, часто употребляют мясопептонные среды: мясопептонный бульон, мясопептонный агар и мясопептонную желатину. Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо-пептонных сред используют мясной бульон, который получают так: 500 г мелко изрубленного свежего мяса без костей, жира и сухожилии заливают в эмалированной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50 °С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50-55 °С. Мясо отжимают, экстракт процеживают через марлю со слоем ваты, кипятят в течение 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз через марлю с ватой, второй - через бумажный фильтр). Фильтр доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги). Ватные пробки должны быть плотными, так как они являются фильтром, препятствующим проникновению бактерий из воздуха после стерилизации. Мясной бульон может быть использован в любое время для приготовления соответствующих сред. Если их готовят сразу, то предварительная стерилизация излишня. Нередко в лабораторных условиях мясной настой кипятят вместе с мясом, а затем мясо отжимают. Бульон получается хорошего качества. Если желательно иметь мясной бульон особо высокой питательности, во время настаивания мяса с водой добавляют немного пепсина и подкисляют бульон соляной кислотой. Пепсин дополнительно гидролизует белковые соединения мяса, и количество усвояемых бактериями питательных веществ возрастает. Мясо можно заменить мясным экстрактом, беря его по 5 г на 1 л среды. Для приготовления мясопептонного бульона к 1 л мясного бульона добавляют 5-10 г пептона (пептон - первый продукт гидролиза белка с высокой молекулярной массой) для повышения калорийности среды и 5 г поваренной соли с целью создания осмотической активности. Среду нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая. Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, приливая 20 %-ный раствор NagCOa (до посинения влажной красной лакмусовой 62

бумажки; при этом фенолфталеин еще не показывает щелочную реакцию при добавлении его к среде в фарфоровой чашке розовая окраска не выявляется). Удобно использовать индикатор бромтимолблау. 1-2 капли его вносят стеклянной палочкой в фарфоровую чашку и добавляют каплю бульона. В нейтральной среде бромтимолблау бутылочно-зеленый, в кислой желтый, в щелочной - синий. После установления реакции среду снова кипятят 5-10 мин и белки, свернувшиеся от изменения реакции, отфильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульона или осветлив его белком. Прозрачный Мясо-пептонный бульон разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С в течение 20 мин. Мясо-пептонный агар (МПА). К 1 л мясо-пептонного бульона добавляют 15-20 г мелко нарезанного агар-агара. Среду нагревают до растворения агара (температура плавления его 100 °С, застывания - 40 °С),устанавливают слабощелочную реакцию среды 20 %-ным раствором Na2COa и через воронки разливают в пробирки (но 10 мл для разливок в чашки - агар столбиком и по 5 мл для получения скошенного, наклонного агара). При разливе агара необходимо следить затем, чтобы края пробирки были сухими, иначе пробки прилипают к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120 °С в течение 20 мин. Мясо-пептонная желатина (МПЖ). В 1 л мясо-пептонного бульона помешают 100-150 г желатины. Температура плавления зависит от процентного содержания в среде. 10 %-ная желатина плавится при 24 °С, 15 %-ная - при 25 °С. В летнее время среды готовят, добавляя 15 % желатины. После растворения желатины при осторожном нагревании в среде устанавливают слабощелочную реакцию (как и для МПБ и МПА), кипятят в течение 5мин, затем охлаждают -до 40-50 °С. Одновременно яичный белок взбивают с небольшим количеством воды, вливают его в охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков становится прозрачной. Ее фильтруют через горячую воронку, разливают в пробирки и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром, прогревая среду по 30 мин через 24 ч 3 раза. Картофельный агар. 200 г очищенного и промытого водой картофеля нарезают ломтиками, заливают 1 л водопроводной воды, варят 30 мин. Отвар фильтруют через вату и доводят до первоначального объема. К полученной жидкости прибавляют 2 % агара, кипятят до его растворения и устанавливают нейтральную реакцию среды (рН 7,0). Среду стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин. Пивное сусло. Зерна ячменя замачивают в холодной воде и проращивают при 35 °С. После того как ростки будут вдвое больше длины зерна, последнее высушивают до воздушно-сухого состояния (можно при слабом подогревании) и получают солод. Для приготовления сусла солод крупно размалывают и 250 г его берут на 1 л воды. Смесь подогревают при 57 °С (для лучшего выделения фермента амилазы) до исчезновения реакции на крахмал (синее окрашивание с йодом). Пробы на осахаривание крахмала 63

проводят в фарфоровой чашке в капле жидкости. Сусло процеживают через вату, затем фильтруют через бумажный фильтр. Такое сусло содержит 10- 20 % сахара. Определив его содержание по плотности раствора с помощью сахариметра, сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6-8%, стерилизуют при 115 °С (давление 0,5 атм) в течение 30 мин. Готовое сусло можно получить на пивоваренном заводе. Сусло-агар. К приготовленному суслу добавляют 2,5-3 % агара, кипятят до его расплавления, фильтруют через вату и стерилизуют таким же способом, как пивное. Обезжиренное молоко. Для приготовления питательных сред употребляют снятое молоко, так называемый обрат (жир в молоке неблагоприятно влияет на рост некоторых микроорганизмов). Обрат получают сепарированием молока, нагретого до 34 °С. Жир можно удалять и при отстаивании молока. При стерилизации молока следует учитывать, что его нельзя длительное время выдерживать в автоклаве, так как лактоза (молочный сахар), содержащаяся в молоке, может карамелизоваться. Обезжиренное молоко разливают в стерильные пробирки и выдерживают при 115 °С (давление 0,5 атм) 15 мин. Перед стерилизацией кислотность обрата не должна превышать 22 °Тернера, иначе молоко свернется. После стерилизации его выдерживают трое суток в термостате при 30 °С, чтобы спровоцировать развитие спорообразующих и других стойких к нагреванию форм. Через 3 дня каждую пробирку с молоком просматривают и пробирки, в которых развились микроорганизмы, выбраковывают. При стерилизации в автоклаве иногда наблюдается побурение молока вследствие карамелизации молочного сахара и пептонизации казеина. При длительной стерилизации на дно пробирки выпадает осадок казеина, который может частично пептонизироваться. Перегретое побуревшее молоко в качестве среды использовать нельзя. Дрожжевые среды. Дрожжевая вода. 50-100 г сухих дрожжей размешивают в 1 л воды, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют текучим паром по полчаса в течение трех дней ежедневно. Дрожжевой автолизат. 200 г прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, добавляют 2 г Na2HPO4, 1 н. раствор NaOH (до рН 6,1) и 5 мл хлороформа, выдерживают при 37 °С двое суток, доводят до рН 7,4, кипятят 30 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют при 115 °С полчаса. Дрожжевой экстракт. 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, смесь кипятят 1 ч, трижды отфильтровывают через бумажный фильтр и стерилизуют при 115 °С 30 мин. Бобовый отвар. 50 г фасоли (лучше белой) заливают 1 л водопроводной воды и варят до готовности так, чтобы бобы не разварились. Полученный отвар фильтруют через вату, добавляют к нему 10 г сахара и доводят до первоначального объема. Устанавливают слабощелочную реакцию среды, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве при давлении пара 1,5 атм в течение 30 мин.

64

10.3 Культивирование микроорганизмов Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной среды, сильно зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболизма каждой группы бактерий. Элективное культивирование. Познанием многообразия микроорганизмов мы обязаны двум обстоятельствам. Некоторые микроорганизмы уже сравнительно давно привлекли к себе внимание вследствие того, что они образуют колонии или скопления или же вызывают какие-либо заметные изменения в окружающей среде. Многие из таких, легко обнаруживаемых микроорганизмов поддаются прямому выделению; относительно нетрудно подобрать условия, которые обеспечивали бы их рост. Существуют, однако, и многие другие микроорганизмы (различных физиологических типов), ставшие доступными для исследования лишь после того, как С.Н. Виноградский и М. Бейеринк разработали технику накопительных культур. И в принципе и на практике метод очень прост. Подбором ряда факторов (источники энергии, углерода и азота; акцептор электронов; свет; температура; рН и т. п.) создают определенные условия и инокулируют среду смешанной популяцией, какая имеется, например, в почве или в иле. В такой среде наиболее хорошо приспособленный к ней тип микроорганизмов растет и вытесняет все остальные, сопутствующие, организмы. Посредством многократных пересевов в жидкую среду такого же состава и рассева по такой же плотной среде можно без труда выделить накопленный штамм. Частый пересев с жидкой среды на жидкую предотвращает рост сопутствующих организмов, которые могли бы использовать продукты выделения или даже автолиза клеток первичной культуры и расти за счет них. Прекрасным материалом для инокуляции служат пробы из тех мест, где уже имеется "естественное обогащение". Так, можно выделять микроорганизмы, использующие окись углерода, из сточных вод газовых заводов; микроорганизмы, использующие гемоглобин, из сточных вод боен и бактерии, окисляющие углеводороды, - из нефтеносных пород, из почв, загрязненных нефтью, и из нефтяных отстойников. Метод накопительных культур позволяет выделять микроорганизмы с любой комбинацией потребностей в питательных веществах при условии, разумеется, что искомый тип вообще существует в природе. Для крайне специализированных микроорганизмов особенно легко создать элективные условия. Так, минеральная среда, не содержащая связанного азота, на свету строго избирательна для "сине-зеленых водорослей, фиксирующих N2. Если ту же среду дополнить органическим источником энергии и углерода, то на ней в темноте в аэробных условиях будет развиваться Azotobacter, а при исключении доступа воздуха - Clostridium. Для успешного получения 65

накопительных культур требуется ограничиться удовлетворением минимальных потребностей только того микроорганизма, который хотят выделить. Если, например, хотят выделить бактерии, способные окислять метан или водород с нитратом или сульфатом в качестве акцептора водорода, то следует позаботиться об исключении доступа кислорода, иначе будут доминировать аэробные формы, окисляющие метан или водород. Для отбора можно также использовать устойчивость или толерантность микроорганизмов к кислотам и щелочам, к высоким температурам пли излучению. Нередко наряду с "положительной" селекцией проводится и "отрицательная"- при помощи избирательно действующих ингибиторов. На питательной среде, содержащей азид, в аэробных условиях растут, например, молочнокислые бактерии, а рост других аэробных микроорганизмов подавляется. Азид, цианид и H2S оказывают избирательное действие па те аэробные организмы, в дыхании которых участвуют цитохромы. В медицинской диагностике пользуются избирательным подавлением для обнаружения Corynebacterium diphtheriae (применение питательных сред, содержащих теллурит) и патогенных Enterobacteriaceae (агаризованные среды с добавлением висмута). В посевном материале могут присутствовать различные штаммы с одинаковым типом обмена веществ, отличающиеся друг от друга лишь незначительно, например, лишь по оптимальному значению рН или по скорости роста. Если для получения накопительной культуры использовать такой материал, то доминировать будет наиболее адаптированный к данным условиям или наиболее быстро растущий штамм, все же остальные будут подавлены и выделить их не удастся. Поэтому в тех случаях, когда хотят выделить максимальное число штаммов, растущих при определенных элективных условиях, посев следует проводить непосредственно в чашки. На плотных элективных средах штаммы, которым условия благоприятствуют, образуют колонии. При достаточно большом расстоянии между колониями конкуренция за питательные вещества не может иметь места; штаммы, растущие более медленно, не подавляются растущими быстрее, так что те и другие могут быть выделены раздельно. Чистую культуру микроорганизма (последний этап выделения) получают обычно па (или в) плотной питательной среде. Процедура начинается с отделения от популяции клеток одной-единственной клетки. Обязательное требование состоит в том, чтобы вырастающая из клетки колония оставалась изолированной от других клеток или колоний. Аэробные бактерии выделяют либо по методу Коха - рассевая суспензию по поверхности среды в чашках, либо, что легче, размазывая каплю платиновой петлей по агаризованной среде. Анаэробные бактерии суспендируют в расплавленном агаре с температурой 45 °С и проводят инкубацию без доступа воздуха. Тщательное отделение одной колонии, повторное суспендирование в жидкости и повторное нанесение мазка или разведение в агаре позволяют получать чистые культуры большинства микроорганизмов.

66

Можно выделить методы культивирования на твердых и в жидких питательных средах; в аэробных, анаэробных и микроаэрофильных условиях. Характеристики этого процесса устанавливают путем измерения таких показателей как число клеток или их биомасса.

10.3.1 Техника посева микроорганизмов в жидкие питательные среды Посев микроорганизмов осуществляется бактериологической петлей. Отбор клеток микроорганизмов производят следующим образом. В правую руку берут петлю и стерилизуют ее нагреванием в пламени спиртовки. Пробирку с культурой берут в левую руку таким образом, чтобы поверхность питательной среды с выросшими колониями микроорганизмов была хорошо видна. Не выпуская петли, мизинцем и безымянным пальцами правой руки, прижимая пробку к ладони, вынимают ее из пробирки и держат так во время всех дальнейших манипуляций. Края открытой пробирки обжигают в пламени спиртовки и вводят в пробирку стерильную петлю. Петлю охлаждают, прикосновением к внутренней поверхности стекла пробирки или на свободной от микроорганизмов части среды и после этого захватывают небольшое количество микробной биомассы. Осторожно вынимают петлю из пробирки, горлышко пробирки вновь обжигают, ватную пробку проводят над пламенем спиртовки и закрывают ею пробирку. Пробирку с культурой помещают в штатив, а извлеченную культуру переносят в жидкую питательную среду, находящуюся в другой пробирке или колбе. Оставшиеся на петле после пересева клетки микроорганизмов тщательно сжигают в пламени спиртовки.

10.3.2 Техника посева микроорганизмов на агаризованную среду Посев на скошенный агар в пробирках проводят следующим образом. Клетки микроорганизмов отбирают бактериологической петлей (как описано выше) и вводят петлю в пробирку со скошенной агаризованной средой почти до дна. Слегка прикасаясь петлей к поверхности среды, проводят от дна вверх зигзагообразную или прямую черту-штрих. Посев на поверхность агаризованной среды в чашках Петри можно производить с помощью бактериологической петли, микробиологического шпателя или методом реплик. При посеве петлей отбирают клетки микроорганизмов с агаризованной или жидкой среды, приоткрывают крышку чашки Петри и на поверхности среды проводят штрихи, после чего чашку закрывают и помещают в термостат крышкой вниз. При посеве микроорганизмов из жидкой среды с использованием микробиологического шпателя поступают следующим образом. На поверхность среды в чашке наносят с помощью стерильной пипетки заданный объем жидкой культуры. Одновременно вращая чашку и проводя 67

круговые движения стерильным шпателем, суспензию распределяют по поверхности среды. При пересеве микроорганизмов методом реплик используют стерильные кусочки бархата с коротким, жестким и густым ворсом. Бархат помещают на специальный столик для реплик, диаметр которого меньше диаметра чашки Петри, и закрепляют металлическим кольцом. Чашки Петри с питательной средой и сформировавшимися колониями микроорганизмов накладывают поверхностью среды на бархат и слегка прижимают. На чашке делают отметку, соответствующую той, которая находится на столике для реплик. Чашку осторожно снимают, а бархат с отпечатками колоний после этого может служить исходным штампом для засева других чашек со средой. Возможно снятие отпечатков на серию чашек, содержащих различные среды. В качестве контроля в последнюю очередь производится отпечаток на чашку со средой, на которой находились исходные микроорганизмы. При глубинном посеве микроорганизмов в агаризованную питательную среду ее предварительно разливают по 15 – 20 мл в пробирки и стерилизуют. После охлаждения расплавленной среды до 48 – 50 °С в каждую пробирку стерильной пипеткой вносят по 0,1 – 1,0 мл жидкой культуры микроорганизмов. При необходимости готовят серию разведений культуры микроорганизмов с таким расчетом, чтобы при высеве получить изолированные колонии. Содержимое пробирки перемешивают путем ее вращения между ладонями и быстро выливают в чашку Петри. После застывания среды чашки помещают в термостат. В некоторых особых случаях используют выращивание бактерий в полужидких средах, которые содержат уплотняющее вещество в низкой концентрации и имеют мягкую желеподобную консистенцию. Такая среда пригодна для культивирования микроаэрофильных бактерий, изучения подвижности клеток и хемотаксиса. При использовании 0,1 – 0,4 % агара, гелеобразующие вещества расслаивают среду таким образом, что конвекционные потоки не способны смешивать богатые кислородом верхние слои среды с нижними. Единственным путем для проникновения кислорода в более глубокие слои в данном случае является диффузия, что создает градиент концентрации кислорода. При инокуляции среды в пробирке уколом петлей, микроаэрофилы начинают расти несколько ниже поверхности, где концентрация кислорода для них наиболее благоприятна. Анаэробы начинают расти в нижней части полужидкой среды.

10.3.3 Техника культивирования анаэробных микроорганизмов Граница между аэробными и анаэробными микроорганизмами является относительно условной. Хотя облигатными анаэробами обычно считают бактерии, рост которых невозможен в присутствии растворенного кислорода, на практике к анаэробным относят те бактерии, которые не растут на поверхности твердой или полужидкой среды на воздухе при атмосферном давлении. Аэротолерантные бактерии хорошо растут на поверхности агара и 68

чашках при низком уровне кислорода. Степень анаэробиоза измеряется по окислительно-восстановительному (редокс, Eh) потенциалу среды. При увеличении Eh выше – 100 мВ, обусловленном присутствием растворимого кислорода, подавляется рост всех анаэробных бактерий. Для удаления кислорода и создания соответствующих условий среды можно воспользоваться следующими методами.

1 Культивирование в микроанаэростате – аппарате для выращивания микроорганизмов, в котором воздух замещен газовой смесью. Наиболее часто используемая смесь имеет следующий состав: азот с 5 % СО2 и 10 % Н2.

2 Использование химических веществ, поглощающих молекулярный кислород. В качестве поглотителей молекулярного кислорода в лабораторной практике используют щелочной раствор пирогаллола, дитионит натрия (Na2S2O4), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реактивы. Поглотители помещают на дно химического эксикатора с притертой крышкой, а также анаэробные бактерии, засеянные в колбу, пробирку или чашку Петри. При таком способе создания анаэробных условий необходимо учитывать поглощающую способность реактивов и объем замкнутого пространства, в котором выращиваются бактерии.

3 Использование восстанавливающих агентов, которые добавляют в большинство сред для снижения окислительно-восстановительного потенциала среды: тиогликолат натрия, цистеин, дитиотрейтол, аскорбиновая кислота. Удаления кислорода из среды можно добиться и в результате быстрого нагревания и кипячения среды с последующим быстрым охлаждением. Если в такую среду засеять анаэробные микроорганизмы и наслоить смесь (1:1) масла и парафина, то в таких условиях будет наблюдаться рост нестрогих анаэробов.

4 Выращивание совместно с аэробными или факультативноанаэробными бактериями. В жидкой среде с восстанавливающими агентами перед инокуляцией анаэроба проводят культивирование, например, E.coli, что приводит к удалению из среды остаточного кислорода. Перед инокуляцией анаэробов клетки E.coli убивают нагреванием. Существует и другая модификация метода. На половине чашки Петри засевают какой-либо аэробный микроорганизм, на другой – анаэроб. Края чашки заливают парафином. Рост анаэробного микроорганизма начнется только после полного использования кислорода аэробом.

10.4 Методы стерилизации Цель процесса стерилизации состоит в полном удалении или уничтожении всех живых микроорганизмов и спор внутри или на поверхности предмета. Стерилизации подвергаются питательные среды, лабораторная посуда, инструменты, растворы и т. д. Можно выделить термическую и холодную стерилизацию.

69

К методам термической стерилизации относят: прокаливание и обжигание в пламени спиртовки; кипячение; сухожаровую (горячим паром) стерилизацию; стерилизацию насыщенным паром под давлением (автоклавирование); дробную стерилизацию (тиндализацию), пастеризацию. Прокаливание и обжигание в пламени – наиболее быстрые и доступные методы стерилизации. Однако их использование ограничивается только термоустойчивыми материалами. Такими методами стерилизуют бактериологические петли, иглы, шпатели, пинцеты, предметные и покровные стекла, фарфоровые ступки и другие инструменты. Кипячение – простейший способ стерилизации. Кипячением в дистиллированной воде стерилизуют мембранные фильтры. Режим стерилизации для мембранных фильтров – 30 – 60 мин с момента энергичного закипания воды. Металлические инструменты, мелкие стеклянные детали лучше всего кипятить в специальных закрытых приборах – стерилизаторах. В микробиологической практике таким способом стерилизации пользуются редко в связи с тем, что продолжительное кипячение может повредить обрабатываемый материал, а сокращение времени кипячения может не обеспечить стерильности. Дробная стерилизация (тиндализация или стерилизация текучим паром) используется для стерилизации питательных сред и растворов, которые портятся при использовании температур выше 100 °С. Метод разработан в 1877 году Дж. Тиндалем и согласно этому методу, жидкость доводят до 100 °С и продолжают выдерживать при этой температуре 10 мин. За это время все вегетативные клетки погибают, жизнеспособными остаются только споры. Затем жидкость охлаждают до температуры, оптимальной для прорастания спор (30 °С) и через несколько часов снова пропускают пар. Двух-трех подобных циклов обычно бывает достаточно для уничтожения всех имеющихся спор. Эффективность этого метода особенно велика потому, что нагревание обычно приводит к активации спор. Тиндализацию проводят либо с помощью пара, подаваемого от внешнего источника, либо в специальных аппаратах. Резервуар с кипящей водой расположен в нижней части аппарата, над ним расположена сетка с устанавливаемыми стерилизуемыми растворами. Пастеризация заключается в однократном прогреве материала при температурах ниже 100 °С и направлена на уничтожение вегетативных клеток. Этот метод широко используется в пищевой промышленности для обработки продуктов, которые теряют вкусовую и пищевую ценность при кипячении: молока, ягодных и фруктовых сиропов, соков, вин, пива и т. д. В микробиологической практике пастеризацией пользуются для получения накопительных культур спорообразующих бактерий. В лабораторных условиях пастеризацию проводят либо на водяной бане, либо в ультратермостате при следующих режимах: 60 – 70 °С в течение 15 – 30 мин; 80 °С в течение 10 – 15 мин.

70

Сухожаровая стерилизация или стерилизация сухим горячим воздухом проводится в сушильных шкафах. Режим стерилизации: 160 – 170 °С на протяжении 2 часов. При этом предполагается, что погибают как клетки, так и споры. Таким способом стерилизуют стеклянную посуду, инструменты и др. Стерилизация насыщенным паром под давлением или автоклавирование – один из наиболее эффективных методов стерилизации, так как стерилизуемый объект подвергается одновременному воздействию как высокой температуры, так и повышенному давлению пара. Погибают как вегетативные клетки, так и споры микроорганизмов. Процесс проводится в специальных приборах – автоклавах, закрывающихся герметично. Основные используемые режимы стерилизации следующие: 15 – 30 мин при избыточном давлении 0,5 атм (температура достигает 110 – 112 °С); 15-45 мин при избыточном давлении 1,0 атм. (температура достигает 121 °С); 10 – 30 мин при избыточном давлении 1,5 атм. (температура достигает 126 °С). Таким способом стерилизуют питательные среды, растворы, посуду, инструменты, фильтры и т. д. При холодной стерилизации используют химические вещества или проводят воздействие на объект факторами физической природы. Химические методы подавления жизнедеятельности микроорганизмов предполагают использование дезинфектантов и антисептиков, имеющих неспецифический эффект, либо использование антибиотиков и синтетических антимикробных препаратов с избирательным противомикробным действием. Дезинфицирующие вещества классифицируются по группам: кислоты или щелочи, галогены, тяжелые металлы, четвертичные аммониевые основания, фенольные соединения, альдегиды, кетоны, спирты, амины и перекиси. Устойчивость микроорганизмов к их действию может существенно меняться в зависимости от таких факторов как концентрация активного компонента, длительность контакта, рН, температура, влажность, и присутствие органического вещества. Химические средства неспецифического действия используются для обработки помещений, оборудования, различных предметов. Например, спирты используются в концентрации 60 – 70 % и эффективны в отношении вегетативных клеток. Фенолы и их производные применяются для дезинфекции помещений, дезинсекции. Среди используемых летучих стерилизующих веществ можно указать на окись этилена, окись пропилена, озон, метилбромид, формальдегид, глютаровый альдегид. Указанные вещества могут быть использованы для стерилизации пластмассовых центрифужных пробирок, пластмассовых чашек Петри, оптических инструментов, сыворотки крови и др. Стерилизация фильтрованием используется для веществ, которые не выдерживают термической обработки (растворов белков, углеводов, витаминов, углеводородов, антибиотиков, сыворотки). Способ заключается в пропускании жидкостей и газов через специальные мелкопористые фильтры (бактериальные), диаметр пор которых не превышает 0,45 – 0,2 мкм.

71

Фильтры задерживают микроорганизмы благодаря поровой структуре их матрикса. Для пропускания раствора через фильтр требуется вакуум или давление. Существуют два основных типа фильтров – глубинные и мембранные. Глубинные состоят из волокнистых или гранулированных материалов, которые спрессованы, свиты или связаны в лабиринт проточных каналов. Частицы задерживаются в них в результате адсорбции и механического захвата в матриксе фильтра. Мембранные фильтры имеют непрерывную структуру и захват ими частиц определяется размером пор. Фильтры содержат различные природные (коалин, асбест, целлюлоза) или синтетические (производные целлюлозы) материалы. Различают фильтры: мембранные, получаемые на основе нитроцеллюлозы; асбестовые или фильтры Зейтца, получаемые на основе смеси асбеста и целлюлозы; фарфоровые или свечи Шамберлана, получаемые из смеси кварцевого песка и коалина, сплавленных между собой; стеклянные, полученные из стекла «Пирекс». Стерилизация с использованием облучения пригодна для термолабильных материалов. Ультрафиолетовые лучи (250 – 270 нм) используются для стерилизации центрифужных пробирок, наконечников для пипеток, материалов из термолабильной пластмассы. Время облучения определяется мощностью лампы, временем воздействия, степенью и видовым составом микроорганизмов загрязненного материала. Вегетативные формы более чувствительны к облучению, чем споры, которые в 3 – 10 раз более устойчивы. От УФ-облучения микроорганизмы могут быть защищены органическими веществами, пылью или другими защитными оболочками. Ограничением при использовании данного метода стерилизации является низкая проникающая способность УФ-лучей и высокая поглощающая способность воды и стекла. Рентгеновское и γ-облучение также эффективно для стерилизации пластмасс, пищевых продуктов, но требует строгого соблюдения правил безопасности. Наиболее чувствительны к γ-облучению вегетативные клетки бактерий, затем идут плесневые грибы, дрожжи, бактериальные споры и вирусы. На практике проводят и контроль стерилизации, при котором о работе стерилизующих агентов и аппаратов судят по: 1) эффективности гибели спор в процессе стерилизации; 2) прямым измерением температуры и 3) с помощью химических индикаторов.

10.5 Задание к лабораторной работе 1 Приготовить необходимые для работы питательные среды. Наиболее распространенным способом количественного учета микроорганизмов является метод Коха. Сущность метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на твердую среду в чашки Петри и последующем подсчете числа выросших колоний. При этом принимают, что каждая колония образуется при размножении из одной клетки – колониеобразующей единицы (КОЕ). Этот 72

метод позволяет вести учет не только жизнеспособных клеток микроорганизмов. В зависимости от объекта исследования может производиться его специальная подготовка: измельчение, растворение, приготовление смыва, разбавление и т.д. Приготовление плотной питательной среды. К 300-500 мл горячей воды добавить сухую питательную среду и агар. Количество сухой среды зависит от её конкретного вида и указывается на упаковке. Агар вносится в количестве 2-3 % от общей массы питательной среды. Смесь нагревают на плитке при постоянном помешивании до полного растворения агара и далее стерилизуют. Одним из способов стерилизации питательных сред, который не требует использования специального оборудования, является метод дробной стерилизации. В основе метода положен следующий принцип: при нагревании до 100 оС в течение 30-60 мин погибают все вегетативные формы микроорганизмов, споры остаются жизнеспособными, а в промежутке между стерилизацией прорастают вегетативную форму. Через сутки проводят повторную стерилизацию. Обычно после третьей стерилизации достигается полное обеспложивание объекта. После стерилизации питательную среду при необходимости фильтруют через вату и разливают по чашкам Петри по 15-20 мл при этом крышки чашки только поднимают и после внесения среды сразу закрывают. Слой среды должен быть тонким и покрывать все дно чашки. Чашки оставляют на ровной поверхности до полного застывания среды.

2 Произвести посевы микроорганизмов на плотные среды в чашки Петри. Подготовка проб для исследования и посев микроорганизмов Отобранные навески по 10 г (1 г) исследуемого объекта вносят в стерильные колбочки без потерь, смывают 90 мл (99 мл) стерильной воды (разведение 1:10). Колбы закрывают ватными пробками и тщательно перемешивают не менее 10 мин. Далее берут стерильно 1 мл суспензии и помещают в 9 мл стерильной воды или физиологического раствора, затем последовательно новой пипеткой переносят по 1 мл раствора в ряд пробирок с 9 мл стерильной воды (см. схему). Степень разведения определяется предполагаемым количеством микроорганизмов в образце, и соответственно число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном образце.

73

10 г

1 мл

1 мл

1 мл

1 мл

1 мл

Рисунок 21 - Схема приготовления разведений и посева Из пробирки с последним разведением, после тщательного перемешивания, производят высев на поверхность питательной среды. Посев производят пипеткой. Объём внесённой суспензии распределяют по поверхности стерильным шпателем. Чашки Петри с засеянными средами помещают в термостат при определенной температуре, благоприятной для развития учитываемых микроорганизмов. Подсчет выросших колоний проводят через 3-5 суток после посева. Колонии, как правило, считают, не открывая чашки Петри, повернув их кверху дном. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы, подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты суммируют. Зная число выросших колоний и степень разбавления, легко определить количество микроорганизмов в 1 мл исследуемой суспензии, пользуясь формулой: a∙K

N=

V∙b

,

где N – количество микроорганизмов в 1 г продукта; а – количество колоний в чашке Петри; К – разведение, из которого был проведен высев; V – объем суспензии, взятый для посева, мл; b – масса навеки продукта, взятой для приготовления смыва. Точность метода зависит от числа подсчитанных колоний: лучшим разведением считают то, при высеве из которого на плотной питательной среде вырастает от 50 до 150 колоний. Для получения более надёжных результатов количество параллельно засеваемых чашек должно быть не менее 2.

3 Произвести посев воздуха методом осаждения Посев воздуха.

74

Для микробиологического исследования воздуха пользуются методами, в основу которых положены оседание (седиментация), аспирация и фильтрация. Фильтрационный метод основан на прохождении воздуха через стерилизованную жидкую или плотные (ватные фильтры) среды, удерживающие все проходящие через них взвешенные частицы, в том числе и микробов, и последующем высеве 1 мл жидкости или смыва с фильтров на плотную питательную среду. Для этого используют прибор Дьяконова. Удобным является метод с использованием мембранных ультрафильтров, основанный на пропуске определённого объёма воздуха через фильтр с последующим его посевом на поверхность плотных питательных сред. Аспирационный метод заключается в том, что определённый объём воздуха пропускают через специальные приборы, например прибор Кротова. Механизм улавливания микрофлоры основывается на ударно-прибивном действии струи воздуха, который проходит через узкую клиновидную щель и с большой скоростью ударяется о влажную поверхность питательной среды. Метод оседания – простейший метод бактериологического исследования воздуха, который основан на оседании бактериальных частиц и капель под влиянием силы тяжести на поверхности агара открытой чашки Петри. Чашки со средой экспонируют 5-10-15 мин в зависимости от предлагаемого бактериального загрязнения. Посев воздуха следует производить на уровне дыхания сидящего или стоящего человека. Для расчета микробного числа воздуха по Омелянскому, используют следующую формулу: а∙100∙1000∙5

Х=

b∙10∙t

,

где Х – количество микробов в 1 м3 воздуха; а – количество колоний в чашке; b – площадь чашки, см2; t – время экспозиции; 10 – объём воздуха, из которого происходит оседание микробов за 5мин., л; 100 – площадь на которую происходит оседание, см2; 1000 – объём воздуха, л. Этот метод дает только приблизительные результаты. На открытых чашках плохо улавливается тонкодисперсные фракции бактериальных капель и пылевых частиц, а задерживаются главным образом крупные пылевые частицы, которые оседают и прибиваются токами воздуха к поверхности среды. Метод не учитывает скорости движения воздуха и других факторов. Тем не менее, метод может быть использован в тех случаях, когда 75

отсутствуют более совершенные приборы и методы, и когда нет источника электроэнергии. Если в среднем в одной чашке Петри (при экспозиции в течение 5 мин) выросло до 200 колоний, воздух считается чистым, свыше 200 колоний – загрязненным. Для точного количественного определения микроорганизмов в 1 м 3 воздуха используют фильтрационный и аспирационный методы.

10.6 Вопросы к защите лабораторной работы 1 Что означает понятие «культивирование микроорганизмов», «культура», «колония», «штамм»?

2 Перечислите виды питательных сред по их происхождению.

3 Перечислите виды питательных сред по их назначению.

4 Перечислите виды питательных сред по их составу.

5 Перечислите виды питательных сред по их физическому состоянию.

6 Какие техники посева микроорганизмов на питательные среды вы знаете?

7 Виды культивирования микроорганизмов.

8 Стерилизация, её виды и назначение.

11 Лабораторная работа № 10. Количественный учет и идентификация микроорганизмов. Выделение чистых культур микроорганизмов Цель работы – выяснение систематического положения микроорганизмов, получение навыков количественного учета микроорганизмов и выделения чистых культур.

10.1 Задание к лабораторной работе 1 Провести количественный учет микрофлоры исследуемого объекта и воздуха. Количественный учет. Для определения количества микоорганизмов в 1 г исследуемого объекта (КОЕ/г) используются формулы и рекомендации, представленные в работе 9. При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста называется сплошным или газонным. В таком случае для осуществления количественного учета необходимо производить посев более разбавленной суспензии микроорганизмов.

76

2 Зарисовать чашки с выросшими колониями. Описать культуральные признаки колоний. Культуральные признаки. Выяснение систематического положения микроорганизмов является необходимым условием для проведения с ними дальнейшей работы. Однако определение видовой принадлежности у многих микробов представляет собой достаточно трудную исследовательскую задачу, которая требует определённого навыка. Она включает изучение ряда особенностей микроорганизмов: морфологии клеток, характера роста культуры на различных средах, отношения к температуре, кислотности среды, кислороду. Кроме того, для определения вида необходимо проведение значительного количества сложных биохимических анализов. Поэтому в данной работе задача определения микроорганизмов до вида не ставится. Рост микроорганизмов на плотных питательных средах. Предварительно на плотных средах выращиваются накопительные культуры. Наиболее существенной особенностью роста на плотной питательной среде является характер роста колонии. Различают поверхностные, глубинные и донные колонии, в зависимости от того, где они развивались. Обычно изучают и описывают колонии, выросшие на поверхности среды, так как именно эти колонии отличаются большим разнообразием. При описании колонии необходимо указывать возраст культуры, состав среды, температуру культивирования. Описание поверхностных колоний проводят по следующей схеме: - форма клони – округлая, ризоидная, неправильная, эллипсовидная, амебовидная, складчатая, концентрическая и т.д.; - поверхность колонии – гладкая, шероховатая, складчатая, бугристая и т.д.; - цвет колонии – бесцветная (грязно-белые колонии относятся к бесцветным колониям) или пигментированная – желтая, золотистая, сиреневая, красная, черная и т.д.; - профиль колонии – плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и т.д. (рисунок 22);

а – изогнутый, б – кратерообразный, в – бугристый, г – врастающий в субстрат, д – плоский, е – выпуклый, ж - каплевидный, з- конусовидный. Рисунок 22 - Профиль колонии 77

- край колонии – ровный, волнистый, лопастной, ризоидный и т.д. определяют при малом увеличении микроскопа х8; - размер колонии (диаметр) определяют с помощью обычной линейки. Точечными или росинчатыми называют колонии менее 1 мм в диаметре, но видимые невооруженным глазом; мелкие колонии имеют 1-2 мм в диаметре; средние, крупные; - структура колонии – однородная, мелко или крупнозенистая, струйчвтая и т.д. определяют при малом увеличении микроскопа х8 (рисунок 23); - консистенция колонии – может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар, слизистой (прилипает к петле), тягучей, волокнистой (снимается целиком), хрупкой (легко ломается при прикосновении петли); - блеск поверхности – блестящая, матовая, гладкая, тусклая и т.д.; - прозрачность колонии – прозрачная, непрозрачная, полупрозрачная, мучнистая и др.

3 Приготовить препараты, описать морфологические признаки и провести идентификацию (частичную) микроорганизмов. Зарисовать микроскопические картинки. При изучении морфологии клеток (бактерии на фиксированных препаратах, окраска по Граму, объективы с масляной иммерсией, грибы, дрожжи – на препарате «раздавленная капля») определяют форму клеток, их взаимное расположение, наличие спор, капсул, почкующихся клеток и др. при исследовании грибных культур определяют род гриба. Зарисовать все микроскопические картинки.

78

а – круглая; б – круглая с фестончатым краем; в – круглая с валиком по краю; г, д – ризоидные; е – с ризоидным краем; ж – амебовидная; з – нитевидная; и – складчатая; к – неправильная; л – концентрическая; м – сложная. Рисунок 23 - Форма колоний 4 Сделать выводы о количественном и качественном составе микрофлоры исследуемых объектов. При обобщении полученных результатов сравнить количественный и качественный состав микрофлоры исследуемых объектов с литературными данными и нормативами. Указать преимущественно содержащиеся формы микроорганизмов. Указать возможные причины повышения норм и способы снижения микробиологической обсемененности исследуемых объектов.

5 Произвести выделение чистой культуры микроорганизмов. Основным методом выделения чистой культуры микроорганизмов является метод Коха с помощью твердых питательных сред. В данной работе, выбирают хорошо изолированную колонию с морфологически однородными клетками. Пересевают культуру из колонии в пробирку со скошенной плотной питательной средой (косяк). Посев проводят следующим образом: - зажигают спиртовку; 79

- зажимают пробирку средним пальцем левой руки (скошенная поверхность агара должна быть обращенной вверх); - вынимают пробку, прижимая её мизинцем и безымянным пальцем правой руки к ладони, не касаясь той части пробки, которая входить внутрь пробирки; - края открытой пробирки обжигают в пламени спиртовки; - берут иглу в правую руку, держат как писчее перо; - иглу прокаливают в пламени спиртовки; - приоткрывают чашку Петри левой рукой, берут иглой материал из колонии и закрывают крышку. Чтобы не повредить клетки, иглу вначале охлаждают о среду, свободную от микробов; - быстро делают посев скользящим движением по скошенной поверхности среды непрерывным зигзагообразным штрихом от одной стенки пробирки к другой снизу вверх; - иглу обжигают в пламени спиртовки и ставят в штатив; - пробирку закрывают, предварительно профламбировав их края и ту часть пробки, которая входит в пробирку; 11.2 Вопросы к защите лабораторной работы 1 Какие условия нужны для культивирования микроорганизмов?

2 Какие признаки колоний учитывают при изучении культуральных свойств бактерии?

3 Что представляют собой смешанная и чистая культуры микроорганизмов?

4 С какой целью микроорганизмы выделяют в виде чистых культур?

12 Лабораторная работа № 11. Определение чистоты выделенной культуры микроорганизмов Цель работы – получение навыков по определению чистоты выделенной культуры при помощи визуального и микроскопического методов контроля.

12.1 Задание к лабораторной работе 1 Определить чистоту выделенной культуры микроорганизма. Чистота культуры выделенного микроорганизма должна быть обязательно проверена. Это осуществляется несколькими способами: визуальным, микроскопическим контролем, последовательным пересевом на дифференциальные питательные среды.

80

Визуальный контроль проводят, когда выделенная культура микроорганизмов высеяна на поверхность скошенного агара. Если культура чистая, то характер её роста равномерен по всему штриху. Если штрих неоднороден, культура считается загрязненной. Проверка чистоты выделенной культуры обязательно включает микроскопический контроль. Для этого следует приготовить препарат фиксированных окрашенных клеток и исследовать его с иммерсионной системой, или препарат живых клеток и просмотреть его, используя фазовоконтрастное устройство. Чистая культура микроорганизмов как правило, морфологически однородна, допустимо лишь незначительное варьирование размеров клеток.

2 Определить количественный и видовой состав микрофлоры.

3 Оформить итоговый отчёт по определению микрофлоры пищевых продуктов.

4 Оформить лабораторный журнал по всему циклу лабораторных работ. Зарисовать полученные результаты и сделать соответствующие выводы.

Список использованных источников 1 Вербина, Н.М. Микробиология пищевых производств / Н.М. Вербина, Ю.В. Каптерева. – М.: Агропромиздат, 1988. – 256с. - ISBN – 5-10000191-7.

2 Германов, Н.И. Микробиология / Н.И. Германов; под ред. П.А. Генкеля. - М., Просвещение, 1969, - 227с.

3 Гусев, М.В. Микробиология / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. – М.: Академия, 2003. – 464 с. - ISBN – 5-7695-1403-5 4 Градова, Н.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии / Н.Б. Градова [и др.].– М.: ДеЛи принт, 2001. – 131с.

5 Ежов, Г.И. Руководство к практическим занятиям по сельскохозяйственной микробиологии / Г.И. Ежов. - М.: Высшая школа, 1974, - 288с.

6 Карпова, Г.В. Техническая микробиология: методические указания / Г.В Карпова. - Оренбург: ОГУ, 2001.- 47с. - ISBN – 5-7410-0412-1. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии. / А.И. Нетрусов – М., Изд. Центр «Академия», 2005.

7 Мирошникова, Е.П. Микробиология молока и молочных продуктов / Е.П. Мирошникова. – Оренбург: ИПК ГОУ ОГУ, 2006.- 135 с. ISBN – 5-7410-0559-4.

8 Мишустин, Е.Н. Микробиология / Е.Н. Мишустин, В.П. Емцев. – М.: Агропромиздат, 1987, - 368с.

81

9 Мудрецова-Висс, К.А. Микробиология, санитария, гигиена / К.А. Мудрецова-Висс, А.А. Кудряшова, В.П. Дедюхина. – М.: ДеЛи, 2001.- 388 с. ISBN – 5-93211-010-4.

10 Нетрусов, А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов. – М.: Изд. Центр «Академия», 2005.

11 Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии: учебное пособие для вузов / Е.З. Теппер, В.К Шильникова, Г.И. Переверзева; под. ред. В.К. Шильниковой. – М.: Дрофа, 2004. – 256 с.: ил. - ISBN – 5-7107-7437-5.

12 Трушина, Т.П. Микробиология, гигиена и санитария в торговле / Т.П. Трушина. – Ростов н/Д: Феникс, 2000. – 320с. - ISBN – 5-222-01417-7.

13 Чурбанова, И.Н. Микробиология: учеб. для вузов. / И.Н. Чурбанова. – М.: Высшая школа, 1987. – 239 с: ил.

Приложение А (справочное) Вопросы для подготовки к экзамену по дисциплине «Микробиология» для специальностей 260201– ТХПЗ; 260202 – ТХМК; 260204 – ТБПиВ 1 Предмет и задачи микробиологии.

2 Основные этапы и направления развития микробиологии как науки.

3 Устройство, назначение и принцип работы микроскопа.

4 Основные виды микроскопирования.

5 Исследование микроорганизмов в живом состоянии.

6 Цель, методика приготовления препарата «Висячая капля».

7 Методика приготовления препарата «Раздавленная капля». Цель приготовления препарата.

82

8 Общее представление о микроорганизмах.

9 Классификация микроорганизмов. Значение микроорганизмов.

10 Основные признаки микроорганизмов 11 Строение прокариотической клетки 12 Общая характеристика бактерий.

13 Морфология бактерий.

14 Основные типы передвижения бактерий.

15 Способы размножения бактерий.

16 Спорообразование бактерий.

17 Этапы приготовления окрашенных препаратов. Цель и методика простого окрашивания.

18 Сложное окрашивание микроорганизмов. Цель, методика.

19 Строение эукариотической клетки.

20 Морфология мицелиальных грибов.

21 Размножение грибов.

22 Бесполое размножение грибов.

23 Половое размножение мицелиальных грибов.

24 Общая характеристика, строение дрожжевой клетки.

25 Морфология, нахождение в природе, обмен веществ дрожжевой клетки.

26 Основные классы дрожжей.

27 Размножение дрожжей.

28 Систематика грибов.

29 Вирусы.

30 Способы передачи наследственной информации микроорганизмами.

31 Метаболизм микроорганизмов.

32 Конструктивный обмен.

33 Химический состав клеток микроорганизмов.

34 Элементный состав клеток микроорганизмов.

35 Содержание воды в клетках микроорганизмов и её формы.

36 Потребности микроорганизмов в питательных веществах. Типы питания.

37 Факторы роста микроорганизмов.

38 Механизм поступления питательных веществ в клетку микроорганизмов.

39 Энергетический обмен микроорганизмов 40 Основные типы обмена веществ у микроорганизмов.

41 Экология микроорганизмов.

42 Основные факторы, влияющие на рост и развитие микроорганизмов. Физические факторы.

43 Основные факторы, влияющие на рост и развитие микроорганизмов. Химические факторы.

44 Основные факторы, влияющие на рост и развитие микроорганизмов. Биологические факторы Основные виды брожений 83

45 Основные факторы, влияющие на рост и развитие микроорганизмов. Антропогенные факторы.

46 Масляно-кислое брожение.

47 Условия культивирования микроорганизмов.

48 Виды питательных сред для выращивания микроорганизмов 49 Стерилизация. Её назначение и виды.

50 Основные виды брожений, их промышленное использование.

51 Спиртовое брожение: химизм, возбудители, характеристика, промышленное использование.

52 Молочно-кислое брожение. Химизм, возбудители, характеристика, промышленное использование.

53 Пропионово-кислое брожение. Химизм, возбудители, характеристика, промышленное использование.

54 Ацетоно-бутиловое брожение. Химизм, возбудители, характеристика, промышленное использование.

55 Уксуснокислое брожение. Химизм, возбудители, характеристика, промышленное использование.

56 Лимонно-кислое брожение. Химизм, возбудители, промышленное использование.

57 Пищевые инфекции и отравления.

58 Основы микробиологического и санитарно-гигиенического контроля пищевых производств.

59 Источники посторонних микроорганизмов в пищевых производствах.

60 Санитарно-показательные микроорганизмы.

Приложение Б (справочное) Вопросы для подготовки к экзамену по дисциплине «Микробиология продовольственных товаров, санитария, гигиена» для студентов специальностей 080401 – Товароведение и экспертиза товаров (в сфере производства и обращения сельскохозяйственного сырья и продовольственных товаров) 1 История развития микробиологии как науки.

2 Общее представление о микроорганизмах.

3 Структурная организация прокариотической клетки.

4 Строение бактериальной клетки.

5 Морфология бактерий 6 Общая характеристика бактерий.

84

7 Спорообразование бактерий.

8 Передвижение бактерий.

9 Способы размножения бактерий.

10 Спорообразование.

11 Методы получения окрашенных препаратов 12 Основные этапы сложного окрашивания микроорганизмов по Граму.

13 Строение эукариотической клетки.

14 Морфология и размножение грибов.

15 Систематика грибов.

16 Морфология и размножение дрожжей.

17 Вирусы.

18 Физиология микроорганизмов.

19 Обмен веществ (метаболизм) микроорганизмов.

20 Химический состав клетки микроорганизма. Белки, жиры, углеводы.

21 Элементарный состав клеток микроорганизмов.

22 Типы питания: гетеротрофный и автотрофный. Факторы роста.

23 Механизмы проникновения питательных веществ в клетку.

24 Основные виды брожений 25 Спиртовое брожение. Химизм, возбудители, характеристика, промышленное использование.

26 Молочно-кислое брожение.

27 Пропионово-кислое брожение.

28 Масляно-кислое брожение.

29 Ацетоно-бутиловое брожение.

30 Усусно-кислое брожение.

31 Лимонно-кислое брожение.

32 Влияние условий окружающей среды на развитие микроорганизмов. Физические факторы.

33 Влияние условий окружающей среды на развитие микроорганизмов. Химические факторы.

34 Роль биологических факторов в развитии микроорганизма.

35 Антропогенные факторы в жизнедеятельности микроорганизмов 36 Микробиология молока и (сгущенное молоко, стерилизованное молоко, сухое молоко, сливки).

37 Микробиология молочных продуктов (сметана, творог, масло, сыр).

38 Микробиология яиц и яичных продуктов.

39 Микробиология мяса (фарш, мясо птиц, колбасные изделия).

40 Микробиология рыбы (рыба свежая, охлажденная, мороженная, соленая, маринованная, сушеная и вяленная, копчёная).

41 Микробиология рыбопродуктов (пресервы, икра).

42 Микробиология промысловых беспозвоночных (ракообразные, моллюски).

43 Микробиология зерна и продуктов его переработки.

44 Болезни хлеба.

85

45 Микробиология плодов и овощей.

46 Болезни картофеля.

47 Болезни кочанной капусты.

48 Болезни корнеплодов.

49 Болезни лука.

50 Болезни плодовых овощей.

51 Болезни косточковых, семечковых культур.

52 Болезни ягод.

53 Микрофлора квашенных и солёных подов и овощей.

54 Микробиология кондитерских товаров.

55 Пищевые инфекции: брюшной тиф, паратифы, дизентерия, туберкулез. Их профилактика.

56 Пищевые инфекции: сибирская язва, туляремия, ящур. Их профилактика.

57 Пищевые отравления. Интоксикации. Ботулизм. Стафилококковые отравления. Микотоксикозы.

58 Пищевые токсикоинфекции. Паратифозные токсикоинфекции. Токсикоинфекции, вызываемые протеем и кишечной палочкой.

59 Профилактика пищевых заболеваний, вызываемых микроорганизмами. Понятие о коли-титре и коли-индексе.

60 Санитарно-гигиенические требования, предъявляемые к продовольственным товарам, и товарным предприятиям, хранению, транспортированию и реализации.

61 Правила поведения в микробиологической лаборатории 62 Устройство, назначение и принцип работы микроскопа.

63 Виды микроскопирования.

64 Методика приготовления препаратов «Раздавленная капля» и «Висячая капля» 65 Условия культивирования микроорганизмов.

66 Виды питательных сред для культивирования микроорганизмов.

67 Стерилизация. Её назначение и виды.

86