Методические указания для студентов к практическому занятию № 1. Тема: Основные свойства вирусов и современные методы диагностики вирусных заболеваний. Цель: Изучение свойств вирусов и методов диагностики заболеваний, вызванных вирусами. Модуль 3. Общая и специальная вирусология. Содержательный модуль 10. Общая вирусология. Тема 1: Основные свойства вирусов и современные методы диагностики вирусных заболеваний. Актуальность темы: ВИРУСЫ – особое царство ультрамикроскопических размеров организмов, обладающих только одним типом нуклеиновых кислот, лишенных собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии и являются, поэтому абсолютными внутриклеточными паразитами. В 1892 г. русский ученый-ботаник Д.И. Ивановский, изучая мозаичную болезнь листьев табака, установил, что заболевание это вызывается мельчайшими микроорганизмами, которые проходят через мелкопористые бактериальные фильтры. Эти микроорганизмы получили название вирусов (от лат. Virus – яд). Большой вклад в изучение вирусов внесли русские вирусологи: М.А. Морозов, Н.Ф. Гамалея, Л.А. Зильбер, М.П. Чумаков, А.А. Смородинцев, В.М. Жданов и др. Вирусы - мельчайшие микробы («фильтрующиеся агенты»), не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие один тип нуклеиновой кислоты (только ДНК или РНК). Вирусы, являясь облигатными внутриклеточными паразитами, репродуцируются в цитоплазме или ядре клетки. Они являются автономными генетическими структурами и отличаются особым, разобщенным (дизъюнктивным), способом репликации (репродукции): в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом. Основными свойствами вирусов являются: 1. Ультрамикроскопические размеры; 2. Содержание нуклеиновой кислоты только одного типа (ДНК или РНК); 3. Отсутствие способности к росту и бинарному делению; 4. Репликация путем воспроизводства себя из собственной геномной нуклеиновой кислоты; 5. Отсутствие собственных систем мобилизации энергии; 6. Отсутствие белок-синтезирующих систем; 7. Вирусы - абсолютные внутриклеточные паразиты. Морфологию и структуру вирусов изучают с помощью электронной микроскопии, так как их размеры малы и сравнимы с толщиной оболочки бактерий. Различают просто устроенные вирусы (например, вирусы полиомиелита, гепатита А) и сложно устроенные вирусы (например, вирусы кори, гриппа, герпеса, коронавирусы). У просто устроенных вирусов нуклеиновая кислота связана с белковой оболочкой, называемой капсидом (от лат. capsa — футляр). Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц — капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом и вместе называются нуклеокапсидом. У сложноустроенных вирусов капсид окружен липопротеиновой оболочкой — суперкапсидом, или пеплосом. Оболочка вируса является производной структурой от мембран вирус-инфицированной клетки. На оболочке вируса расположены
гликопротеиновые «шипы», или «шипики» (пепломеры, или суперкапсидные белки). Под оболочкой некоторых вирусов находится М-белок. Таким образом, просто устроенные вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и капсида. Сложно устроенные вирусы состоят из нуклеиновой кислоты, капсида и липопротеиновой оболочки. Вирионы имеют спиральный, икосаэдрический (кубический) или сложный тип симметрии капсида (нуклеокапсида). Спиральный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вирусов гриппа, коронавирусов). Икосаэдрический тип симметрии обусловлен образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту (например, у вируса герпеса). Капсид и оболочка (суперкапсид) защищают вирионы от воздействия окружающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с определенными клетками, а также антигенные и иммуногенные свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов называют сердцевиной. У аденовирусов сердцевина состоит из гистоноподобных белков, связанных с ДНК, у реовирусов — из белков внутреннего капсида. Форма вирионов может быть различной: палочковидной (ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы), пулевидной (рабдовирусы), сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ, аденовирусы), нитевидной (филовирусы), в виде сперматозоида (бактериофаги). Размеры вирусов определяют с помощью электронной микроскопии, методом ультрафильтрации через фильтры с известным диаметром пор, методом ультрацентрифугирования. Наиболее мелкими вирусами являются парвовирусы (18 нм) и вирус полиомиелита (около 20 нм), наиболее крупным - вирус натуральной оспы (около 350 нм). Различают ДНК- и РНК-содержащие вирусы. Они обычно гаплоидны, т. е. имеют один набор генов. Исключением являются ретровирусы, имеющие диплоидный геном. Геном вирусов содержит от шести до нескольких сотен генов и представлен различными видами нуклеиновых кислот: двунитевыми, однонитевыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными. Среди РНК-содержаших вирусов различают вирусы с положительным (плюс-нить РНК) геномом. Плюс-нить РНК этих вирусов выполняет наследственную (геномную) функцию и функцию информационной РНК (иРНК). Имеются также РНК-содержашие вирусы с отрицательным (минус-нить РНК) геномом. Минус-нить РНК этих вирусов выполняет только наследственную функцию. Геном вирусов способен включаться в геном клетки в виде провируса, проявляя себя генетическим паразитом клетки. Нуклеиновые кислоты некоторых вирусов, например, вирусов герпеса, могут находиться в цитоплазме инфицированных клеток, напоминая плазмиды. Химический состав вирусов ● Мелкие РНК-содержащие вирусы имеют простую структуру: белок и нуклеиновую кислоту (вирус полиомиелита, вирус ящура). ● Средние и крупные вирусы (аденовирусы, герпесвирусы, поксвирусы) имеют сложную структуру: содержание белка – 50-80% нуклеиновой кислоты – 1-50% липидов – 1,5-57% углеводов – 2,8-15% ● В составе вирусных белков обнаруживают 16-18 аминокислот. ● рН белка – 3,5-6,0 (кислая или слабокислая). ● Сложные вирусы (миксовирусы) имеют фермент нейраминидазу (разрывает глюкозидиновую связь между нейраминовой кислотой и пептидной частью рецепторов клетки, в результате вирион проникает в клетку. ● У вируса герпеса обнаруживается АТФ-аза – фермент.
В вирусологии используют следующие таксономические категории: семейство (название оканчивается на viridae), подсемейство (название оканчивается на virinae), род (название оканчивается на virus). Однако названия родов и особенно подсемейств даны не для всех вирусов. Вид вируса не получил биноминального названия, как у бактерий. В основу классификации вирусов положены следующие категории: тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), ее структура, количество нитей (одна или две), особенности воспроизводства вирусного генома, размер и морфология вирионов, количество капсомеров и тип симметрии нуклеокапсида, наличие оболочки (суперкапсида), чувствительность к эфиру и дезоксихолату, место репродукции в клетке, антигенные свойства и др. Вирусы поражают позвоночных и беспозвоночных животных, а также бактерии и растения. Являясь основными возбудителями инфекционных заболеваний человека, они также участвуют в процессах канцерогенеза, могут передаваться различными путями, в том числе через плаценту (вирусы краснухи, цитомегалии и др.), поражая плод человека. Они могут приводить и к постинфекционным осложнениям - развитию миокардитов, панкреатитов, иммунодефицитов и др. Другими необычными агентами, близкими к вирусам, являются вироиды — небольшие молекулы кольцевой, суперспирализованной РНК, не содержащие белка и вызывающие заболевания растений. В вирусинфицированной клетке возможно пребывание вирусов в различных состояниях: • воспроизводство многочисленных новых вирионов; • пребывание нуклеиновой кислоты вируса в интегрированном состоянии с хромосомой клетки (в виде провируса); • существование в цитоплазме клетки в виде кольцевых нуклеиновых кислот, напоминающих плазмиды бактерий. Поэтому диапазон нарушений, вызываемых вирусом, весьма широк: от выраженной продуктивной инфекции, завершающейся гибелью клетки, до продолжительного взаимодействия вируса с клеткой в виде латентной инфекции или злокачественной трансформации клетки. Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивный, абортивный и интегративный. /. Продуктивный тип - завершается образованием нового поколения вирионов и гибелью (лизисом) зараженных клеток (цитолитическая форма). Некоторые вирусы выходят из клеток, не разрушая их (нецитолитическая форма). 2. Абортивный тип - не завершается образованием новых вирионов, поскольку инфекционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов. 3. Интегративный тип, или вирогения - характеризуется встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместным сосуществованием (совместная репликация).
Классификация основных представителей № п/п
Семейство
1.
Пикорнавирусы
2.
Reoviridae
3.
Togaviridae
4. 5. 6. 7.
Flaviviridae Bunyaviridae Orthomyxoviridae Paramyxoviridae
8.
Rabdoviridae
9. 10. 11. 12.
Filoviridae Retroviridae Arenaviridae Coronaviridae
13.
Caliciviridae
14. 15.
Poxviridae Herpesviridae αβγ-
16. 17. 18. 19. 20.
Adenoviridae Hеpadnaviridae Papillomaviridae Рarvoviridae Poliomaviridae
Род
Заболевание
РНК-содержащие вирусы Enterovirus Полиомиелит, гепатит А Cardiovirus Энцефаломиокардит Rinovirus ОРВИ Ящур Reovirus Клещевые лихорадки Rotavirus Гастроэнтерит Alphavirus Карельская лихорадка Rubivirus Краснуха Flavivirus Желтая лихорадка ГЛПС Influenzavirus Грипп Respirivirus Парагрипп Morbillivirus Корь Pneumovirus ОРВИ Rubulavirus Эпидемический паротит Vesiculovirus Везикулярный стоматит Lyssavirus Бешенство Filovirus Лихорадка Марбург и Эбола Lentivirus СПИД Лимфоцитарный хориоменингит Лихорадка Ласса Атипичная пневмония Гастроэнтерит ДНК-содержащие вирусы Натуральная оспа Ветряная оспа, опоясывающий лишай, оральный герпес, генитальный герпес, менингоэнцефалит Цитомегалия, рак предстательной железы Инфекционный мононуклеоз, лимфома Беркита, назофарингеальная карцинома, Саркома Капоши ОРВИ, ОКИ, конъюктивит Гепатит В Папилломы Инфекционная эритема, полиартрит Многоочаговая лейкоэнцефалопатия
Репродукция вирусов І. Продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой, т. е. репродукция вируса (лат. re — повторение, productio — производство), проходит в 6 стадий: 1) адсорбция вирионов на клетке; 2) проникновение вируса в клетку; 3) «раздевание» и высвобождение вирусного генома (депротеинизация вируса); 4) синтез вирусных компонентов; 5) формирование вирионов; 6) выход вирионов из клетки.
У различных вирусов эти стадии отличаются. 1. Адсорбция вирусов. Первая стадия репродукции вирусов — адсорбция, т.е. прикрепление вириона к поверхности клетки. Она протекает в две фазы. Первая фаза — неспецифическая, обусловленная ионным притяжением между вирусом и клеткой, включая и другие механизмы. Вторая фаза адсорбции — высокоспецифическая, обусловленная гомологией, комплементарностью рецепторов чувствительных клеток и «узнающих» их белковых лигандов вирусов. Белки на поверхности вирусов, узнающие специфические клеточные рецепторы и взаимодействующие с ними, называются прикрепительными белками (в основном это гликопротеины) в составе липопротеиновой оболочки. Специфические рецепторы клеток имеют различную природу, являясь белками, липидами, углеводными компонентами белков, липидов и др. Так, рецепторами для вируса гриппа является сиаловая кислота в составе гликопротеинов и гликолипидов (ганглиозидов) клеток дыхательных путей. Вирусы бешенства адсорбируются на ацетилхолиновых рецепторах нервной ткани, а вирусы иммунодефицита человека — на СD4-рецепторах Т-хелперов, моноцитов и дендритных клеток. На одной клетке находится от десяти до ста тысяч специфических рецепторов, поэтому на ней могут адсорбироваться десятки и сотни вирионов. Наличие специфических рецепторов лежит в основе избирательности поражения вирусами определенных клеток, тканей и органов. Это так называемый тропизм (греч. tropos — поворот, направление). Например, вирусы, репродуцирующиеся преимущественно в клетках печени, называются гепатотропными, в нервных клетках — нейротропными, иммунокомпетентных клетках — иммунотропными и т. д. 2. Проникновение вирусов в клетку. Вирусы проникают в клетку путем рецепторзависимого эндоцитоза (виропексиса), или слияния оболочки вируса с клеточной мембраной, или же в результате сочетания этих механизмов. 1. Рецепторзависимый эндоцитоз происходит в результате захватывания и поглощения вириона клеткой: клеточная мембрана с прикрепленным вирионом впячивается с образованием внутриклеточной вакуоли (эндосомы), содержащей вирус. За счет АТФзависимого «протонного» насоса содержимое эдосомы закисляется, что приводит к слиянию липопротеиновой оболочки сложно организованного вируса с мембраной эндосомы и выходу вирусного нуклеокапсида в цитозоль клетки. Эндосомы объединяются с лизосомами, которые разрушают оставшиеся вирусные компоненты. Процесс выхода безоболочечных (просто организованных) вирусов из эндосомы в цитозоль остается малоизученным. 2. Слияние оболочки вириона с клеточной мембраной характерно только для некоторых оболочечных вирусов (парамиксовирусов, ретровирусов, герпесвирусов), в составе которых имеются белки слияния. Происходит точечное взаимодействие вирусного белка слияния с липидами клеточной мембраны, в результате чего вирусная липопротеиновая оболочка интегрирует с клеточной мембраной, а внутренний компонент вируса попадает в цитозоль клетки. 3. «Раздевание» (депротеинизация) вирусов. В результате депротеинизации удаляются поверхностные структуры вируса и высвобождается его внутренний компонент, способный вызывать инфекционный процесс. Первые этапы «раздевания» вируса начинаются в процессе его проникновения в клетку путем слияния вирусных и клеточных мембран или же при выходе вируса из эндосомы в цитозоль. Последующие этапы «раздевания» вируса тесно взаимосвязаны с их внутриклеточным транспортом к местам депротеинизации. Для разных вирусов существуют свои специализированные участки «раздевания» в клетке: для пикорнавирусов - в цитоплазме с участием лизосом, аппарата Гольджи; для герпесвирусов - околоядерное пространство или поры ядерной мембраны; для аденовирусов - сначала структуры цитоплазмы, а затем ядро клетки. Конечными продуктами «раздевания» могут быть нуклеиновая кислота, нуклеопротеин
(нуклеокапсид) или сердцевина вириона. Так, конечным продуктом «раздевания» пикорнавирусов является нуклеиновая кислота, ковалентно связанная с одним из внутренних белков. А у многих оболочечных РНК-содержащих вирусов конечными продуктами «раздевания» могут быть нуклеокапсиды или сердцевины, которые не только не препятствуют экспрессии вирусного генома, а, более того, защищают его от клеточных протеаз и регулируют последующие биосинтетические процессы. 4. Синтез вирусных компонентов. Следующей стадией репродукции является синтез белков и нуклеиновых кислот вируса, который разобщен во времени и пространстве. Синтез осуществляется в разных частях клетки, поэтому такой способ размножения вирусов называется дизъюнктивным (от лат. disjunctus — разобщенный). Синтез вирусных белков. В зараженной клетке вирусный геном кодирует синтез двух групп белков: неструктурных белков, обслуживающих внутриклеточную репродукцию вируса на разных его этапах; структурных белков, которые входят в состав вириона (геномные, связанные с геномом вируса, капсидные и суперкапсидные белки). К неструктурным белкам относятся: 1) ферменты синтеза РНК или ДНК (РНК- или ДНК-полимеразы), обеспечивающие транскрипцию и репликацию вирусного генома; 2) белки-регуляторы; 3) предшественники вирусных белков, отличающиеся своей нестабильностью в результате быстрого нарезания на структурные белки; 4) ферменты, модифицирующие вирусные белки, например, протеиназы и протеинкиназы. Синтез белков в клетке осуществляется в соответствии с хорошо известными процессами транскрипции (от лат. transcriptio — переписывание) путем «переписывания» генетической информации с нуклеиновой кислоты в нуклеотидную последовательность информационной РНК (иРНК) и трансляции (от лат. translatio — передача) - считывания иРНК на рибосомах с образованием белков. Передача наследственной информации в отношении синтеза иРНК у разных групп вирусов неодинакова. ДНК-содержащие вирусы реализуют генетическую информацию так же, как и клеточный геном, по схеме: геномная ДНК вируса → транскрипция иРНК → трансляция белка вируса. Причем ДНК-содержащие вирусы используют для этого процесса клеточную полимеразу (вирусы, геномы которых транскрибируются в ядре клетки - аденовирусы, паповавирусы, герпесвирусы) или собственную РНК-полимеразу (вирусы, геномы которых транскрибируются в цитоплазме, например поксвирусы). Плюс-нитевые РНК-содержащие вирусы (например, пикорнавирусы, флавивирусы, тогавирусы) имеют геном, выполняющий функцию иРНК; он распознается и транслируется рибосомами. Синтез белков у этих вирусов осуществляется без акта транскрипции по схеме: геномная РНК вируса → трансляция белка вируса. Геном минус-однонитевых РНК-содержащих вирусов (ортомиксовирусов, парамиксовирусов, рабдовирусов) и двунитевых (реовирусов) служит матрицей, с которой транскрибируется иРНК, при участии РНК-полимеразы, связанной с нуклеиновой кислотой вируса. Синтез белка у них происходит по схеме: геномная РНК вируса → транскрипция иРНК -→ трансляция белка вируса. Ретровирусы (ВИЧ, онкогенные ретровирусы) имеют уникальный путь передачи генетической информации. Геном ретровирусов состоит из двух идентичных молекул РНК, т.е. является диплоидным. В составе ретровирусов есть особый вирусоспецифический фермент — обратная транскриптаза, или ревертаза, с помощью которой осуществляется процесс обратной транскрипции, т. е. на матрице геномной РНК синтезируется комплементарная однонитевая ДНК (кДНК). Комплементарная нить ДНК
копируется с образованием двунитевой комплементарной ДНК, которая интегрирует в клеточный геном и в его составе транскрибируется в иРНК с помощью клеточной ДНКзависимой РНК-полимеразы. Синтез белков для этих вирусов осуществляется по схеме: геномная РНК вируса → комплементарная ДНК → транскрипция иРНК → трансляция белка вируса. Репликация вирусных геномов, т.е. синтез вирусных нуклеиновых кислот, приводит к накоплению в клетке копий исходных вирусных геномов, которые используются при сборке вирионов. Способ репликации генома зависит от типа нуклеиновой кислоты вируса, наличия вирусоспецифических или клеточных полимераз, а также от способности вирусов индуцировать образование полимераз в клетке. Механизм репликации отличается у вирусов, имеющих: 1) двунитевую ДНК; 2) однонитевую ДНК; 3) плюс-однонитевую РНК; 4) минус-однонитевую РНК; 5) двунитевую РНК; 6) идентичные плюс-нитевые РНК (ретровирусы). 1. Двунитевые ДНК-вирусы. Репликация двунитевых вирусных ДНК происходит обычным полуконсервативным механизмом: после расплетения нитей ДНК к ним комплементарно достраиваются новые нити. Каждая вновь синтезированная молекула ДНК состоит из одной родительской и одной вновь синтезированной нити. К этим вирусам относится большая группа вирусов, которые содержат двунитевую ДНК в линейной (например, герпесвирусы, аденовирусы и поксвирусы) или в кольцевой форме, как папилломавирусы. У всех вирусов, кроме поксвирусов, транскрипция вирусного генома происходит в ядре. Уникальный механизм репликации характерен для гепаднавирусов (вируса гепатита В). Геном гепаднавирусов представлен двунитевой кольцевой ДНК, одна нить которой короче (неполная плюс-нить) другой нити. Первоначально достраивается. Затем полная двунитевая ДНК с помощью клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразы транскрибируется с образованием небольших молекул иРНК и полной однонитевой плюс-РНК. Последняя называется прегеномной РНК; она является матрицей для репликации генома вируса. Синтезированные иРНК участвуют в процессе трансляции белков, в том числе вирусной РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). С помощью этого фермента мигрирующая в цитоплазму прегеномная РНК обратно транскрибируется в минус-нить ДНК, которая, в свою очередь, служит матрицей для синтеза плюс-нити ДНК. Этот процесс заканчивается образованием двунитевой ДНК, содержащей неполную плюс-нить ДНК. 2. Однонитевые ДНК-вирусы. Единственными представителями однонитевых ДНК-вирусов являются парвовирусы. Парвовирусы используют клеточные ДНК-полимеразы для создания двунитевого вирусного генома, так называемой репликативной формы последнего. При этом на исходной вирусной ДНК (плюс-нить) комплементарно синтезируется минус-нить ДНК, служащая матрицей для синтеза плюс-нити ДНК нового вириона. Параллельно синтезируется и РНК, происходит трансляция вирусных пептидов. 3. Плюс-однонитевые РНК-вирусы. Эти вирусы включают большую группу вирусов — пикорнавирусы, флавивирусы, тогавирусы, у которых геномная плюс-нить РНК выполняет функцию иРНК. Например, РНК полиовирусов после проникновения в клетку связывается с рибосомами, работая как иРНК, и на ее основе синтезируется большой полипептид, который расщепляется на фрагменты: РНК-зависимую РНК-полимеразу, вирусные протеазы и капсидные белки. Полимераза на основе геномной плюс-нити РНК синтезирует минус-нить РНК; формируется временно двойная РНК, названная промежуточным репликативным звеном. Это промежуточное репликативное звено состоит из полной плюс-нити РНК и многочисленных частично завершенных минус-нитей. Когда образованы все минус-нити, они используются как шаблоны для синтеза новых плюс-нитей РНК. Этот механизм используется как для размножения геномной РНК вируса, так и для синтеза большого количества вирусных белков. 4. Минус-однонитевые РНК-вирусы. Минус-однонитевые РНК-вирусы (рабдовирусы, парамиксовирусы, ортомиксовирусы) имеют в своем составе РНК-зависимую РНК-полимеразу. Проникшая в клетку геномная минус-нить РНК трансформируется вирусной РНК-зависимой РНКполимеразой в неполные и полные плюс-нити РНК. Неполные копии выполняют роль иРНК для синтеза вирусных белков. Полные копии являются матрицей (промежуточная стадия) для синтеза минус-нитей геномной РНК потомства. 5. Двунитевые РНК-вирусы. Механизм репликации этих вирусов (реовирусов и ротавирусов) сходен с репликацией минус-однонитевых РНК-вирусов. Отличие состоит в том, что
образовавшиеся в процессе транскрипции плюс-нити функционируют не только как иРНК, но и участвуют в репликации: они являются матрицами для синтеза минус-нитей РНК. Последние в комплексе с плюс-нитями РНК образуют геномные двунитевые РНК вирионов. Репликация вирусных нуклеиновых кислот этих вирусов происходит в цитоплазме клеток. 6. Ретровирусы (плюс-нитевые диплоидные РНК-содержащие вирусы). Обратная транскриптаза ретровирусов синтезирует (на матрице РНК-вируса) минус-нить ДНК, с которой копируется плюснить ДНК с образованием (двойной нити ДНК, замкнутой в кольцо. Далее двойная нить ДНК, интегрируя с хромосомой клетки, образуя провирус. Многочисленные вирионные РНК образуются в результате транскрипции одной из нитей интегрированной ДНК при участии клеточной ЦНК-зависимой РНК-полимеразы.
5. Формирование вирусов. Вирионы формируются путем самосборки: составные части вириона транспортируются в места сборки вируса — участки ядра или цитоплазмы клетки. Соединение компонентов вириона обусловлено наличием гидрофобных, ионных, водородных связей и стерического соответствия. Существуют следующие общие принципы сборки вирусов: - Формирование вирусов — многоступенчатый процесс с образованием промежуточных форм, отличающихся от зрелых вирионов по составу полипептидов. - Сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодействии вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и в образовании нуклеокапсидов. - У сложноустроенных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, которые взаимодействуют с модифицированными мембранами клеток (будущей липопротеиновой оболочкой вируса). Причем сборка вирусов, реплицирующихся в ядре клетки, происходит с участием к мембраны ядра, а сборка вирусов, репликация которых идет в цитоплазме, осуществляется с участием мембран эндоплазматической сети или плазматической мембраны, куда встраиваются гликопротеины и другие белки оболочки вируса. - У ряда сложноустроенных вирусов минус-нитевых РНК-вирусов (ортомиксовирусов, парамиксовирусов) в сборку вовлекается так называемый матриксный белок (М-белок), который расположен под модифицированной клеточной мембраной. Обладая гидрофобными свойствами, он выполняет роль посредника между нуклеокапсидом и вирусной липопротеиновой оболочкой. - Сложноустроенные вирусы в процессе формирования включают в свой состав некоторые компоненты клетки хозяина, например липиды и углеводы. 6. Выход вирусов из клетки. Полный цикл репродукции вирусов завершается через 5-6 ч (вирус гриппа и др.) или через несколько суток (гепатовирусы, вирус кори и др.). Процесс репродукции вирусов заканчивается выходом их из клетки, который происходит взрывным путем или почкованием, экзоцитозом. □ Взрывной путь: из погибающей клетки одновременно выходит большое количество вирионов. По взрывному пути выходят из клетки просто устроенные вирусы, не имеющие липопротеиновой оболочки. □ Почкование, экзоцитоз - присущи вирусам, имеющим липопротеиновую оболочку, которая является производной от клеточных мембран. Сначала образовавшийся нуклеокапсид или сердцевина вириона транспортируется к клеточным мембранам, в которые уже встроены вирусоспецифические белки. Затем в области контакта нуклеокапсида или сердцевины вириона с клеточной мембраной начинается выпячивание этих участков. Сформировавшаяся почка отделяется от клетки в виде сложно устроенного вируса. При этом клетка способна длительно сохранять жизнеспособность и продуцировать вирусное потомство. Почкование вирусов, формирующихся в цитоплазме, может происходить либо через плазматическую мембрану (например, пара-миксовирусы, тогавирусы), либо через мембраны эндоплазматической сети с последующим их выходом на поверхность клетки (например, буньявирусы).
Вирусы, формирующиеся в ядре клетки (например, герпесвирусы), почкуются в перинуклеарное пространство через модифицированную ядерную мембрану, приобретая таким образом липопротеиновую оболочку. Затем они транспортируются в составе цитоплазматических везикул на поверхность клетки. ІІ. Абортивный тип взаимодействия вирусов с клеткой. Этот тип взаимодействия не завершается образованием вирусного потомства и может возникать при следующих обстоятельствах: 1) заражение чувствительных клеток дефектными вирусами или дефектными вирионами; 2) заражение стандартным вирусом генетически резистентных к нему клеток; 3) заражение стандартным вирусом чувствительных клеток в непермиссивных (неразрешающих) условиях. Различают дефектные вирусы, дефектные вирионы и псевдовирионы. Дефектные вирусы существуют как самостоятельные виды, которые репродуцируются лишь при наличии вируса-помощника (например, вирус гепатита D репродуцируется только в присутствии вируса гепатита В). Дефектные вирионы обычно лишены части генетического материала и могут накапливаться в популяции многих вирусов при множественном заражении клеток. Псевдовирионы – это вирусы, в капсид которых заключена нуклеиновая кислота клетки хозяина, а не вирусная нуклеиновая кислота. Абортивный тип взаимодействия чаще наблюдается при заражении нечувствительных клеток стандартным вирусом. Механизм генетически обусловленной резистентности клеток к вирусам широко варьирует. Он может быть связан: с отсутствием на плазматической мембране специфических рецепторов для вирусов; с неспособностью данного вида клеток инициировать трансляцию вирусной иРНК; с отсутствием специфических протеаз или нуклеаз, необходимых для синтеза вирусных макромолекул, и т. д. Абортивный тип взаимодействия может также возникать при изменении условий, в которых происходит репродукция вирусов: повышение температуры организма, изменение рН в очаге воспаления, введение в организм противовирусных препаратов и др. При устранении неразрешающих условий абортивный тип переходит в продуктивный тип взаимодействия вирусов с клеткой. ІІІ. Интегративный тип взаимодействия вирусов с клеткой (вирогения). Это взаимное сосуществование вируса и клетки в результате интеграции (встраивания) нуклеиновой кислоты вируса в хромосому клетки хозяина. При этом интегрированный геном вируса реплицируется и функционирует как составная часть генома клетки. Интегративный тип взаимодействия характерен для умеренных ДНК-содержащих бактериофагов, онкогенных вирусов и некоторых инфекционных вирусов как ДНКсодержащих (например, вируса гепатита В), так и РНК-содержащих (например, вируса иммунодефицита человека). Для интеграции с геномом клетки необходимо наличие кольцевой формы двунитевой ДНК-вируса. Геном ДНК-содержащих вирусов в кольцевой форме прикрепляется к клеточной ДНК в месте гомологии нуклеотидных последовательностей и встраивается в определенный участок хромосомы при участии ряда ферментов (рестриктаз, эндонуклеаз, лигаз). У РНК-содержащих вирусов процесс интеграции более сложный. Он начинается с механизма обратной транскрипции, который заключается в синтезе комплементарной нити ДНК на матрице вирусной РНК с помощью вирусоспецифического фермента обратной транскриптазы (ревертазы). После образования двунитевой ДНК и замыкания ее в кольцо происходит интеграция ДНК-транскрипта в хромосому клетки. Встроенная в хромосому клетки ДНК вируса называется провирусом, или провирусной ДНК. Провирус реплицируется в составе хромосомы и переходит в геном дочерних клеток, т.е. состояние вирогении наследуется. Однако под влиянием некоторых физических или химических факторов провирус может исключаться из хромосомы клетки и переходить в автономное состояние с развитием продуктивного типа взаимодействия с клеткой.
Дополнительная генетическая информация провируса при вирогении сообщает клетке новые свойства, что может быть причиной онкогенной трансформации клеток и развития опухолей, а также развития аутоиммунных и хронических заболеваний. Сохранение вирусной информации в виде провируса в составе клеточного генома и передача ее потомству лежит в основе персистенции (лат. persistentia — упорство, постоянство) вирусов в организме и развития латентных (скрытых) вирусных инфекций. Культивировать вирусы можно только на биологических моделях: в организме лабораторных животных, в развивающихся куриных эмбрионах и культурах клеток. Методы культивирования и индикации вирусов 1. Культивирование вирусов в организме лабораторных животных. Выбор экспериментальных животных определяется целью работы и видовой чувствительностью к изучаемому вирусу. Для заражения используют обезьян, кроликов, морских свинок, хомячков, белых крыс и мышей. Лабораторных животных заражают различными способами в зависимости от тропизма вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) - путем накожного и внутрикожного заражения. Наиболее часто используются накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное и внутримозговое заражение. При первичном заражении животные могут не заболеть, поэтому через 5-7 дней внешне здоровых животных выводят из эксперимента, а из их органов готовят суспензии, которыми заражают следующие партии животных. Эти последовательные заражения называются «пассажами». Индикацию, т.е. обнаружение факта репликации вируса, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет поверхностного вирусного белка - гемагглютинина. В настоящее время использование животных для культивирования вирусов ограничено, в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных научных целях. 2. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах. Большинство известных вирусов обладают способностью реплицироваться в курином эмбрионе. Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, осповакцины - в 12, паротита - в 7-дневных куриных эмбрионах. Репродукция вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса. Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании. 3. Культивирование вирусов в тканевых культурах. Клеточная культура – система клеток, получаемая из ткани, находящаяся в виде слоя клеток, прикрепленных к стеклу, или в виде суспензии. Наиболее практическое применение получили однослойные культуры первичнотрипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Сущность методов при приготовлении первичных культур тканей заключается в разрушении межклеточной ткани и разобщения клеток для последующего получения монослоя. Разобщение клеток проводится путём воздействияна ткань протеолитических ферментов (трипсина). Для культивирования культуры клеток применяют синтетические питательные среды – 199, Игла, Хенкса, Эрла (эти среды имеют аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли). Смена питательной среды проводится через 2-3 дня.
1. первичные (трипсинизированные) культуры клеток – у которых межклеточные связи разрушают ферментами (трипсином, панкреатином) и получают монослой клеток на стекле. 2. Перевиваемые (стабильные): а) нормальные (ПКБ – почки барана; СОЦ – сердце обезьяны циномольгус); б) опухолевые – Hela – рак шейки матки; Hep – 1 – эпидермоидный рак гортани; Дейтройт 6 – костный мозг больного раком легкого. О наличии вируса в зараженной культуре клеток можно судить по цитопатическому действию (ЦПД) – патологические изменения морфологии клеток, вплоть до их гибели, возникающие в результате репродукции вирусов, и наблюдаемые под микроскопом: 1. дегенерация клеток (округление, изменение формы, разрушение); 2. появление включений (Липшются – вирус герпеса; Гварниери – вирус натуральной оспы) и телец (Бабеша-Негри – вирус бешенства); 3. разрушение пласта клеток (парамиксовирусы); 4. образование гигантских многоядерных клеток - симпластов (вирус кори). 5. Образование «негативных колоний», или «бляшкообразование» – ограниченные участки разрушенных вирусами клеток в сплошном монослое культуре клеток. Они видны невооруженным глазом в виде светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Добавление агара в питательную среду ограничивает распространение вирусов по всему монослою после выхода их из разрушенной клетки и обеспечивает взаимодействие вирусов только с соседними клетками. Каждая «бляшка» образуется потомством одного вириона. Основные методы индикации вирусов в культуре тканей: 1. “+” гемагглютинация; 2.“+” гемадсорбция; 3.реакция нейтрализации вирусов в культуре тканей; 4.цветная реакция Солка. Реакция гемагглютинации – склеивание эритроцитов при добавлении вирусосодержащего материала (есть вирус – эритроциты оседают в виде “зонтика”; нет вируса – в виде “диска”). Реакция гемадсорбции – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток и образуют характерные скопления (вирус гриппа– вызывает агглютинацию эритроцитов островкового типа). Цветная реакция Солка – основана на изменении цвета питательной среды. В результате жизнедеятельности клеток в питательную среду выделяются продукты клеточного метаболизма и происходит сдвиг рН в кислую сторону, о чем свидетельствует изменение цвета среды из красного в желтый. Если вирус присутствует и реплицируется в культуре, то вследствие разрушающего действия вируса клетки дегенерируются, и подавляется их метаболизм, т.е. цвет среды не изменяется. Основные пути передачи вирусов: воздушно-капельный (вирус гриппа, вирус натуральной оспы); пищевой (вирус полиомиелита, вирус гепатита А); контактно-бытовой (вирус бешенства, герпесвирусы); трансмиссивный (вирус клещевого энцефалита); гематогенный (ВИЧ, вирус гепатита В, С). Методы диагностики вирусных заболеваний. 1. Вирусоскопический – в исследуемом материале с помощью электронной микроскопии обнаруживаются вирионы, а с помощью светооптической – внутриклеточные включения (недостаток светооптической микроскопии – не специфичность). 2. Метод иммунной электронной микроскопии – специфичный, чувствительный и надежный метод. В основе лежит взаимодействие антител (Ат) с вирусами при смешивании материала со специфической сывороткой. В результате образуются
микропреципитаты, состоящие из вирусных частиц, покрытых «венчиком» (метод громоздкий и не применяется для массовых исследований). 3. Вирусологический – выделение и идентификация вирусов с использованием клеточных культур или куриных эмбрионов, заражением лабораторных животных. Методы идентификации вирусов: (a) нейтрализации цитопатического действия (ЦПД); (b) нейтрализация реакции гемадсорбции; (c) торможение реакции гемагглютинации; (d) нейтрализация в опытах на животных. Для идентификации применяется типоспецифические сыворотки. 4. Серологические – для обнаружения как специфических Ат, так и вирусных Аг: (a) РСК; (b) РПГА; (c) РТГА; (d) реакция гемагглютинации иммунного прилипания (Аг+Ат в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах); (e) РН вирусов; (f) радиоиммунный метод; (g) ИФА. 5. Иммунофлуоресцентный метод (ускоренная диагностика). 6. Биологический метод. 7. Иммунохроматографический анализ. 8. Метод ДНК-зондов (гибридизация) в основе лежит способность однонитевых молекул нуклеиновых кислот вступать во взаимодействие с комплементарными нитями и образовывать двунитевые гибридные молекулы. Гибридизация осуществляется на нитроцеллюлозной мембране (твердая подложка). Исследуемую клеточную суспензию лизируют для высвобождения нуклеиновых кислот. ДНК денатурируют, а образовавшиеся одноцепочечные молекулы переносят на мембрану, где они ковалентно связываются с ДНК-зондом, который представляет собой меченные изотопом или ферментом денатурированные молекулы нуклеиновой кислоты. Гибридизация (спаривание) произойдет, если между зондом и нитью ДНК есть гомология. 9. ПЦР (полимеразная цепная реакция) - данный метод основан на выявлении в исследуемом образце специфического фрагмента ДНК возбудителя и на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное достраивание обеих нитей.
Конкретные цели: Трактовать морфологию и ультраструктуру вирусов. Ознакомиться с классификацией вирусов. Анализировать особенности взаимодействия вирусов с живыми системами. Оценивать результаты репликации вирусов в живых системах. Анализировать методы культивирования вирусов в лабораторных условиях. Трактовать современные методы лабораторной диагностики вирусных заболеваний.
Уметь: ● Проводить алгоритм репликации вирусов с различными типами взаимодействия их с живыми системами. ● Оценить цветную пробу Солка, реакцию гемагглютинации и гемадсорбции. ● Проводить микроскопию препаратов культуры клеток с разными видами ЦПД вирусов с помощью иммерсионного микроскопа.
1. 2. 3. 4. 5. 6.
Теоретические вопросы: Общая характеристика вирусов, их основные свойства. Морфология и ультраструктура вириона. Классификация вирусов. Принципы, положенные в основу. Методы культивирование вирусов. Методы индикации и идентификации вирусов (характер ЦПД в культуре ткани, реакция гемадсорбции и гемагглютинации и др.) Современные методы лабораторной диагностики вирусных заболеваний.
Практические задания, которые выполняются на занятии: 1. Микроскопия интактных пробирочных культур фибробластов и пораженных различными вирусами клеток. 2. Овоскопия куриных эмбрионов. 3. Зарисовка демонстрационных препаратов с ЦПД вирусов в протокол занятия. 4.Оформление протокола. Литература: 1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник /Под ред. А.А. Воробьёва.– М.: МИА, 2004.– 691с.: ил. 2. Букринская А.Г. Вирусология.– М.: Медицина, 1986.– 336 с.: ил. 3. Коротяев А.И., Бабичев С.А., Медицинская микробиология, иммунология и вирусология /Учебник для медицинских ВУЗов, СанктПетербург «Специальная литература», 1998. - 592с. 4. Тимаков В.Д., ЛевашевВ.С., Борисов Л.Б. Микробиология /Учебник.-2-е изд., перераб. и доп.-М.:Медицина, 1983,- 512с. 5. Пяткин К.Д. Кривошеин Ю.С. Микробиология с вирусологией и иммунологией.- Киев: Вища школа, 1992.- 431с. 6. Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.- М.: ГЕОТАР-МЕД, 2001.- 768с. 7. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, иммунологии и вирусологии. /Под ред. М.П. Зыкова.- М.: «Медицина», 1977.– 288 с. 8. Черкес Ф.К., Богоявленская Л.Б., Бельскан Н.А. Микробиология. /Под ред. Ф.К. Черкес.– М.: Медицина, 1986.– 512 с. 9. Конспект лекции. Дополнительная литература: 1. Макияров К.А. Микробиология, вирусология и иммунология. Алма-Ата: «Казахстан», 1974.– 372 с. 2. Тiтов М.В. Iнфекцiйнi хвороби.- К., 1995.– 321с. 3. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни.- М.: Медицина, 1990.- 559 с. 4. Павлович С.А. Медицинская микробиология в графах: Учеб. пособие для мед. ин-тов.– Мн.: Выш. шк., 1986.– 255 с. Краткие методические указания к работе на практическом занятии. В начале занятия проводится проверка уровня подготовки студентов к занятию. Самостоятельная работа состоит из изучения основных свойств, молекулярногенетической организации, классификации вирусов, разбора схемы репликации различных вирусов. Изучение современных методов лабораторной диагностики вирусных заболеваний. Студенты проводят микроскопию демонстрационных препаратов, зарисовывают микропрепараты и дают необходимые пояснения. В состав самостоятельной работы входит также анализ и оценка методов индикации вирусов.
В конце занятия проводится тестовый контроль и анализ итоговых результатов самостоятельной работы каждого студента. № п\п 1.
2.
3. 4. 5.
Технологическая карта проведения практического занятия Этапы Время Способы Оборудования Место мин. обучения проведения Проверка и кор20’ Тестовые Таблицы, атлас рекция выходного задания уровня подготовисходного ки к занятию уровня Самостоятельная 35’ Граф логичес- Иммерсионный микработа кой структуры роскоп, демонстрационные препараты; Учебная цветная реакция комната Солка. Самоконтроль и 15’ Целевые коррекция усвоенобучающие ного материала программы Тестовый 15’ Тесты контроль Анализ резуль5’ татов работы
Целевые обучающие задания: 1. Среди школьников младших классов была зарегистрирована вспышка ОРЗ. Каким из приведенных методов эксресс-диагностики можно подтвердить допущения, что эта вспышка обусловлена аденовирусом? А. РИФ. В. Выделением вируса. С. РСК. D. Кожно-аллергической пробой. Е. Заражением лабораторных животных. 2. В вирусологической лаборатории при заражении куриных эмбрионов смывом из зева и носа, взятым от больного гриппом, выделили вирусы, которые вызывали гемагглютинацию 1% смеси эритроцитов. В какой из перечисленных серологических реакций можно определить тип вируса гриппа? А. РП. В. РГА. С. РТГА. D. РН. Е. РА. 3. В инфекционную детскую больницу поступил больной 3-х лет с признаками паралича. Клинико-лабораторное обследование позволило поставить диагноз полиомиелит. Каким путем произошло заражение? А. Фекально-оральный. В. Трансмиссивный. С. Воздушно-пылевой. D. Инфузионный. Е. Аэрогенный. 4. При культивировании вируса полиомиелита на культуре ткани лаборант отметил изменение цвета среды культивирования (так называемая цветная проба). О чем это свидетельствует?
А. Культура ткани не пригодна для последующих пассажей. В. Исходный материал содержал другие вирусы. С. Кроме вирусов в культуре клеток выросли бактерии. D. Вирус нормально репродуцируется. Е. Вирус не репродуцируется. 5. В лабораторию прислали мазки-отпечатки от больного ОРВИ. Какой из перечисленных иммунологических тестов можно применить как экспресс-диагностику? А. РИФ. В. Реакцию иммобилизации. С. РГА. D. РСК. Е. Реакцию иммунного прилипания. 6. Смыв с носовой части глотки больного с подозрением на грипп ввели в аллантоисную полость куриного эмбриона. Через 72 часа инкубации для обнаружения вируса гриппа взяли аллантоисную жидкость для исследования. С помощью какой из приведенных реакций можно найти вирус гриппа в аллантоисной жидкости? А. РГА. В. РП. С. РН. D. РА. Е. РСК. 7. Президент США Ф. Рузвельт перенес паралитическую форму полиомиелита, будучи уже взрослым. Какой из приведенных путей заражения является наиболее вероятным? А. Парентеральный. В. Половой. С. Трансмиссивный. D. Через укус животных. Е. Фекально-оральный. 8. В вирусологическую лабораторию поступил материал (ткань мозга) для исследования от человека, умершего от бешенства. С помощью какой из приведенных реакций можно обнаружить антиген вируса бешенства в мазках-отпечатках срезов мозга? А. РИФ. В. РСК. С. РГА. D. РП. Е. РА. 9. В населенном пункте Основа зарегистрирована эпидемия гриппа. Какой материал из перечисленных необходимо использовать для исследования на куриных эмбрионах? А. Смыв с зева и носа. В. Смыв с рук. С. Кровь. D. Промывные воды желудка. Е. Содержимое пустул. 10. В хирургический кабинет обратился потерпевший, которого покусала собака. В каких из приведенных ниже тканях происходит репродукция вируса бешенства? А. В лимфатических органах. В. В паренхиматозных органах. С. В нервных клетках. D. В кишечнике. Е. В крови.
Алгоритм лабораторной работы: 1. Изучение основных свойств вирусов. 2. Ознакомление с классификацией вирусов. 3. Разбор схемы репликации вирусов в соответствии с типом взаимодействия вируса с живыми системами. 4. Изучение современных методов лабораторной диагностики вирусов. 5. Микроскопия, анализ и зарисовка демонстрационных препаратов. 6. Оформление протокола.