Методические указания для студентов к практическому занятию № 2. Тема: Лабораторная диагностика гриппа и ОРЗ. Цель: Изучение лабораторной диагностики гриппа и ОРЗ. Модуль 3. Общая и специальная вирусология. Содержательный модуль 16. Специальная вирусология. Тема 2: Лабораторная диагностика гриппа. Актуальность темы: В настоящее время грипп является наиболее распространенной инфекцией на земном шаре и регистрируется на всех континентах. Особенностью этой инфекции является быстрота распространения. При эпидемических вспышках болеет до 30-50% населения пораженного региона, что приводит к значительным экономическим затратам. Так грипп остается не контролируемой инфекцией. Во время эпидемии страдают пожилые и ослабленные люди, особенно те, которые имеют хронические заболевания сердца, легких, а также дети, увеличивается количество смертей от сердечно-сосудистых, легочных заболеваний. Выявлены в последние годы новые свойства возбудителя гриппа – способность обмениваться генетической информацией с возбудителями гриппа животных и птиц, длительное время сохраняться в организме человека после выздоровления и даже, как считают, может быть одним из возможных факторов развития у человека медленных инфекций. Все это усиливает значимость этой проблемы и необходимость дальнейшего изучения возбудителя гриппа. Вирусы гриппа и других острых респираторных заболеваний Группа острых респираторных (от лат. respiratio - дыхание) вирусных инфекций (ОРВИ) включает большое количество наиболее распространенных болезней, характеризующихся поражением различных отделов дыхательных путей и аэрогенным механизмом передачи. ОРВИ могут вызывать более 200 вирусов: вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синтициальный вирус, риновирусы, коронавирусы, реовирусы, аденовирусы, некоторые серотипы вирусов Коксаки и ECHO. Все эти вирусы принадлежат к разным семействам и родам, отличаются между собой по биологическим свойствам и поэтому требуют индивидуального подхода при проведении лабораторных исследований. Наибольшее значение в патологии человека имеют вирусы гриппа. Среди других вирусов - возбудителей ОРВИ - наибольший удельный вес занимают риновирусы и коронавирусы; вирусы парагриппа и респираторно-синцитиальный вирус могут вызывать тяжелые воспалительные заболевания нижних отделов дыхательных путей. Вирусы гриппа Грипп - острое респираторное заболевание, характеризующееся поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей, лихорадкой, симптомами общей интоксикации, нарушением деятельности сердечно-сосудистой и нервной систем. Грипп отличается склонностью к эпидемическому и пандемическому распространению благодаря высокой контагиозности и изменчивости возбудителя. В 1933 г. У. Смит, К. Эндрюс и П. Лейдлоу от больных гриппом выделили вирус, названный впоследствии вирусом гриппа типа А. В 1940 г. были открыты вирусы гриппа типа В, а в 1947 г. - типа С. В России первые вирусы гриппа были выделены в 1936 г. А. А. Смородинцевым и отнесены к типу А. Таксономия, классификация. РНК-содержащие вирусы относятся к семейству Orthomyxoviridae (от греч. orthos - правильный, myxa - слизь). Семейство включает два
рода: род Influenzavirus объединяет вирусы гриппа типов А и В, род Influenza С представлен вирусом гриппа типа С. Морфология и химический состав. Вирионы имеют сферическую форму диаметром 80-120 нм, реже палочковидную и нитевидную; состоят из сердцевины и наружной липопротеидной оболочки. Сердцевина содержит однонитчатую линейную фрагментированную минус-нитевую РНК, белковый капсид, окруженный дополнительной мембраной - слоем матриксного белка. Нуклеокапсид имеет спиральный тип симметрии. На поверхности суперкапсидной оболочки имеются шипы гликопротеидной природы, одни из которых являются гемагглютинином, другие - нейраминидазой. Культивирование. Для культивирования используют куриные эмбрионы, культуры клеток, иногда лабораторных животных. Антигенная структура. Вирусы гриппа имеют внутренние и поверхностные антигены. Внутренние сердцевидные антигены являются типоспецифическими, на основании чего вирусы гриппа подразделяются на типы А, В и С, поверхностные представлены гемагглютинином (Н) и нейраминидазой (N). Н - основной специфический антиген, вызывающий образование вирус-нейтрализующих антител и обеспечивающий адсорбцию вируса на клетках, в том числе эритроцитах человека или животных, в результате чего происходит их склеивание (гемагглютинация). N вызывает образование антител, частично нейтрализующих вирусы; являясь ферментом, N участвует в освобождении вирусов из клетки. Характерной особенностью вирусов гриппа, в основном типа А, является изменчивость антигенов Н и N. Известны три разновидности Н и две разновидности N. В зависимости от их сочетания выделяют три подтипа вируса гриппа А человека: H1N1, H2N2, H3N2, соответственно A1, A2, A3. Внутри подтипов имеется множество антигенных вариантов, отличающихся по структуре Н- и N-антигенов. Изменчивость поверхностных антигенов связана с фрагментарным строением РНК вируса и может происходить в виде дрейфа и шифта. Дрейф - постоянно осуществляющиеся незначительные изменения Н- и N-антигенов в результате точечных мутаций, приводящие к возникновению новых антигенных вариантов вируса. Шифт (скачок) - редко встречающиеся значительные изменения Н- и N-антигенов в результате рекомбинаций, приводящие к появлению новых подтипов вируса. По сравнению с вирусами гриппа типа А антигенная структура вирусов гриппа типа В изменяется только по типу дрейфа, а тип С не имеет N-антигена и мало изменчив. Резистентность. В воздухе вирусы гриппа могут сохранять инфекционные свойства при комнатной температуре в течение нескольких часов; чем выше температура и относительная влажность воздуха, тем быстрее инактивируются вирусы. Возбудители гриппа чувствительны к действию УФ-лучей, многим дезинфицирующим средствам (формалину, этиловому спирту, фенолу, хлорамину), жирорастворителям; в жидкой среде инактивируются при температуре 50-600С в течение нескольких минут. Длительное время сохраняются в замороженном состоянии и в глицерине. Восприимчивость животных. В естественных условиях вирусы гриппа типа А поражают как человека, так и животных; вирусы типов В и С . только человека. Среди лабораторных животных к вирусам гриппа чувствительны африканские хорьки, сирийские хомяки, белые мыши. Заболевание характеризуется поражением легких и нередко заканчивается гибелью животных. Эпидемиология. Из всех острых респираторных вирусных инфекций грипп является наиболее массовым и тяжелым заболеванием. Пандемии и эпидемии гриппа охватывают до 30-50 % населения земного шара и более, нанося огромный ущерб здоровью людей и экономике стран. Так, пандемия гриппа «испанки», вызванная вирусом A (H1N1) в 1918-1920 гг., охватила около 1,5 млрд человек и унесла более 20 млн жизней. Восприимчивость людей к гриппу высокая. Болеют все возрастное группы населения, преимущественно в зимнее время года. 2
Возникновение пандемий и крупных эпидемий обычно связано с появлением нового подтипа вируса гриппа А. Ежегодные эпидемические вспышки вызываются новыми антигенными вариантами одного подтипа. В последние годы эпидемии гриппа связаны с вирусом гриппа A (H3N2), хотя среди населения продолжают циркулировать вирусы гриппа A (H1N1) и В. Источником гриппозной инфекции является больной человек с клинически выраженной или бессимптомной формой. Путь передачи - воздушно-капельный (при разговоре, кашле, чиханье). Патогенез и клиническая картина. Вирусы гриппа внедряются и репродуцируются в эпителиальных клетках слизистой оболочки верхних дыхательных путей, откуда проникают в кровь и разносятся по всему организму. Продукты распада поврежденных клеток и некоторые вирусные белки оказывают токсическое действие на различные органы и системы организма. Инкубационный период короткий - от нескольких часов до 1-2 сут. Для гриппа характерны острое начало, высокая температура тела, общая интоксикация, выражающаяся в недомогании, головной боли, боли в глазных яблоках, поражение дыхательных путей различной степени тяжести. Лихорадочное состояние при гриппе без осложнений продолжается не более 5-6 дней. Тяжесть и исход болезни нередко связаны с осложнениями, вызванными самим вирусом гриппа (гриппозная пневмония, острый отек легких) или условно-патогенными бактериями. Развитию осложнений способствует угнетающее действие вирусов гриппа на процессы кроветворения и иммунную систему организма. Иммунитет. После перенесенного заболевания формируется стойкий типо-, подтипе- и вариантоспецифический иммунитет, который обеспечивается клеточными и гуморальными факторами защиты. Большое значение имеют антитела класса IgA. Пассивный естественный иммунитет сохраняется у детей до 8-11 мес жизни. Лабораторная диагностика. Материалом для обнаружения вируса или вирусного антигена служат мазки-отпечатки со слизистой оболочки носовой полости, отделяемое носоглотки, при летальных исходах - кусочки легочной ткани или мозга. Экспрессдиагностика основана на выявлении вирусного антигена с помощью РИФ; разработана тест-система для ИФА. Для выделения вирусов используют куриные эмбрионы. Индикацию вирусов гриппа осуществляют при постановке реакции гемагглютинации. Идентифицируют выделенные вирусы поэтапно: типовую принадлежность определяют с помощью РСК, подтип - РТГА. Серодиагностику проводят с помощью РСК, РТГА, РН в культуре клеток, реакции преципитации в геле, ИФА. Специфическая профилактика и лечение. Для специфической профилактики используют живые и инактивированные вакцины из вирусов гриппа A (H1N1), A (H3N2) и В, культивируемых в куриных эмбрионах. Существует три типа инактивированных вакцин: вирионные (корпускулярные); расщепленные, в которых структурные компоненты вириона разъединены с помощью детергентов; субъединичные, содержащие только гемагглютинин и нейраминидазу. Вакцину из трех вирусов гриппа вводят интраназально в одной прививочной дозе по специальной схеме. Вакцинация показана определенным контингентам, имеющим высокий риск заражения. Проходит испытания культуральная инактивированная вакцина. Ведутся разработки по созданию гриппозных вакцин нового поколения: синтетических, генноинженерных. К сожалению, в отдельные годы отмечается довольно низкая эффективность вакцинации вследствие высокой изменчивости вирусов гриппа. Для лечения, а также экстренной профилактики гриппа применяют химиотерапевтические противовирусные препараты (ремантадин, виразол, арбидол и др.), препараты интерферона и иммуномодуляторы (дибазол, левамизол и др.). При тяжелом течении гриппа, особенно у детей, показано применение донорского противогриппозного
3
иммуноглобулина, а также препаратов, являющихся ингибиторами клеточных протеаз: гордокса, контрикала, аминокапроновой кислоты.
•
Конкретные цели: Трактовать стадии взаимодействия вируса с клеткой. Ознакомиться с методами культивирования вирусов. Ознакомиться со строением куриного эмбриона. Указать специфические изменения в эмбрионе. Ознайомиться с техникой введения вирусосодержащего материала в аллантоисную полость. Ознайомиться с понятием о клеточной культуры и ЦПД вируса гриппа в ней.
● ● ● ● ●
Уметь: Заражать куриные эмбрионы в аллантоисную полость. Вскрывать куриные эмбрионы. Изучить изменения на хорион-аллантоисной оболочке, вызванные вирусом гриппа. Забирать аллантоисную жидкость из куриного эмбриона. Ставить реакцию гемагглютинации и проводить ее учет.
• • • • •
Теоретические вопросы: Классификация вирусов, вызывающих острые респираторные заболевания. Характеристика вирусов гриппа. Строение вириона. Строение генома (взаимодействие вируса с клеткой). Антигенная структура вирусов гриппа. Изменчивость вирусов гриппа. Основные методы культивирования вируса гриппа (заражение куриного эмбриона, культуры клеток). 8. Патогенез гриппа. 9. Микробиологическая диагностика гриппа. 10. Особенности противогриппозного иммунитета. Антитела. Интерферон. Механизм их действия. 11. Вакцины и профилактические препараты. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. 2. 3. 4. 5.
Практические задания, которые выполняются на занятии: Вскрытие куриного эмбриона. Забор аллантоисной жидкости. Постановка и учет РГА. Разбор и запись схемы лабораторной диагностики гриппа. Микроскопия и зарисовка демонстрационных препаратов в протокол занятия. Оформление протокола. Литература: Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією.– Київ: Вища школа, 1992.– 431 с. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашкола Е.П., Рибакова А.М. Микробиология.– М.: Медицина, 1998.– 336 с. Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.– М.: ГЄОТАР-МЕД, 2001.– 768 с. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология /Под редакцией академика А.А. Воробьева, М.: Медицинское информационное агентство, 2004.– 691 с. Конспект лекции. 4
Дополнительная литература: 1. Збірник завдань для підготовки до тестового екзамену Крок-1. Загальна лікарська підготовка.– Київ.: Медицина, 2004.- С. 300-333. 2. Методические указания для преподавателей к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии.– Харьков,1986.– 125 с. 3. Сборник тестовых заданий для самоподготовки по медицинской микробиологии и вирусологии.– Харьков, 2005.– 28 с. Краткие методические указания к работе на практическом занятии. В начале занятия проводится проверка уровня подготовки студентов к занятию. Самостоятельная работа состоит из заражения куриного эмбриона в хорионалантоисную оболочку. Студенты проводят вскрытия куриного эмбриона, забирают алантоисную жидкость, выполняют РГА и проводят ее учет. Студенты проводят микроскопию демонстрационных препаратов, зарисовывают их в альбом и дают необходимые пояснения. Записывают схемы лабораторной диагностики гриппа. В конце занятия проводится тестовый контроль и анализ итоговых результатов самостоятельной работы каждого студента.
№ п\п 1.
2.
3. 4. 5.
Технологическая карта проведения практического занятия Этапы Время Способы Оборудования Место мин. обучения проведения Проверка и кор20’ Тестовые Таблицы, атлас рекция выходного задания уровня подготовисходного ки к занятию уровня Самостоятельная 35’ Граф логичес- Куриные эмбрионы, работа кой структуры необходимые компоненты для постановУчебная ки РГА, демонстракомната ционные препараты, иммерсионный микроскоп. Самоконтроль и 15’ Целевые коррекция усвоенобучающие ного материала программы Тестовый 15’ Тесты контроль Анализ резуль5’ татов работы
Целевые обучающие задания: 1. С приближением эпидемии гриппа районный эпидемиолог составляет заявку на профилактические препараты. Какой из них будет содействовать формированию активного иммунитета и будит наименее реактогенным? А. Субединичная вакцина В. Живая вакцина С. Убитая вакцина D. Донорський γ-глобулин Е. Лейкоцитарный интерферон 5
2. В городе - эпидемия гриппа. Какой из перечисленных ниже препаратов можно рекомендовать людям для неспецифической профилактики заболевания? А. Ремантадин В. Противогриппозную вакцину С. Пенициллин D. Противогриппозный иммуноглобулин Е. Противогриппозную сыворотку 3. Вирус гриппа содержит внутренние антигены – нуклеопротеидный (NP), полимеразные (Р1, Р2, Р3), матриксный белок (М) и внешние антигены - гемагглютинин (Н) и нейраминидазу (N). Какие из них играют основную роль в создании иммунитета к гриппозной инфекции? А. Гемагглютинин и нейраминидаза В. Нуклеопротеидные антигены С. Матриксный белок D. Полимеразные белки Е. Нейраминидаза и нуклеопротеид 4. В паталогоанатомическом отделении инфекционной больницы доставлен труп человека с предварительным диагнозом: «Грипп?». Какие исследования необходимо применить для подтверждения этого диагноза? А. Выявление антител в реакции связывания комплемента В. Электронно-микроскопическое выявление вируса С. Выявление внутриклеточных включений при световой микроскопии D. Выявление высоких титров антител в реакции торможения гемагглютинации Е. Выделение и серологическая идентификация вируса 5. Заражение куриных эмбрионов - основной метод выделения вируса гриппа. При введении в куриный эмбрион исследуемого материала (смыва из носоглотки) с целью деконтаминации к нему предварительно добавляют: А. Формалин В. Калийперйодат С. Раствор Игло D. Стрептомицин и пенициллин Е. Эфир 6. Для выделения вируса гриппа из доставленного материала в лаборатории использовали куриные эмбрионы. Какой из перечисленных показателей является основным для определения накопления вируса через 48-72 часа? А. РА В. РГА с аллантоисной жидкостью С. Гибель куриного эмбриона D. Наличие крови в аллантоисной оболочке Е. Образование бляшек на хорион-аллантоисной оболочке 7. В период острой респираторной инфекции для экспресс-диагностики гриппа проводится выявление специфического вирусного антигена в исследуемом материале (слизь из носоглотки). Какую серологическую реакцию используют для этого? А. Связывание комплемента B. Иммунофлюоресценции C. Агглютинации D. Преципитации Е. Оксопитации 8. От больного с подозрением на грипп был взят патологический материал (носоглоточный смыв), которым заразили куриные эмбрионы в хорион-аллантоисную полость. С помощью какой реакции можно подтвердить, что в хорион-аллантоисной жидкости действительно накапливается вирус гриппа? 6
А. Преципитации B. Агглютинации C. Гемадсорбции D. Гемагглютинации Е. Торможения гемагглютинации 9. С целью определения типа и подтипа вируса, вызвавшего грипп, были проведены вирусологические исследования. Какая из перечисленных реакций может быть использована для идентификации вируса гриппа? А. РА B. РП C. РГГА D. РГА Е. Реакция гемадсорбции 10. Исскуственный пассивный иммунитет против гриппа создается: A. Введеним живой вакцины B. Введеним интерферона C. Трансплацентарным переходом антител D. Введением убитой вакцины E. Введеним гамма-глобулина 11. Какие из приведенных антигенов определяют подтип вируса гриппа А? A. РНК B. Матриксный белок C. Полимераза D. Нуклеопротеид E. Гемагглютинин и нейраминидаза
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Алгоритм лабораторной работы: Изучение методов культивирования вирусов гриппа. Заражение куриного эмбриона в хорион-аллантоисную оболочку. Постановка и учт реакции гемагглютинаци. Освоение реакции торможения гемагглютинации. Вскрытие куриных эмбрионов зараженных смывом из зева больного гриппом, забор алантоисной жидкости. Микроскопия и анализ демонстрационных препаратов. Зарисовка препаратов в протокол. Оформление протокола.
7
Граф логической структуры темы
«ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА РЕСПИРАТОРНЫХ ИНФЕКЦИЙ» Мазки, смывы из носоглотки, мокрота и др. 1-й этап
Экспресс-методы Риноцитоскопия
ИФМ
Парные сыворотки крови Вирусологическое исследование
Серологические сыворотки крови
Заражение куриных эмбрионов
Заражение культур клеток
Реакция нейтрализации (аденовирусная инфекция, парагрипп)
2-й этап
Индикация в РГА
3-й этап
Идентификация РСК, РТГА и реакции нейтрализации
Индикация по ЦПД ИФМ, методы гемадсорбции
РСК РТГА (грипп, парагрипп, аденовирусная инфекция)
Идентификация в ИФМ, РТГА, РСК, реакции нейтрализации
Окончательный ответ
Ориентировочный ответ через 2-3 часа
Окончательный ответ через 3-21 день
8