Методические указания для студентов к практическому занятию № 3. Тема: Лабораторная диагностика аденовирусных инфекций. Цель: Изучение лабораторной диагностики аденовирусных инфекций. Модуль 3. Общая и специальная вирусология. Содержательный модуль 16. Специальная вирусология. Тема 3: Лабораторная диагностика аденовирусных инфекций. Актуальность темы: Актуальность представляет отдельные биологические аспекты аденовирусной инфекции, а именно, способность вызывать онкогенную трансформацию у животных, способность к длительной латенции у некоторых типов клеток хозяина, возможность интерференции с другими вирусами с образованием гибридных вирусов, обладающих особенными биологическими свойствами, в том числе и усиление онкогенности. На модели аденовирусов изучают важные молекулярно-биологические факторы. Аденовирусные заболевания (adenovirosis, pharyngoconjunctival fever- PCF англ.) - острые вирусные болезни, протекающие с преимущественным поражением органов дыхания, глаз и лимфатических узлов. Аденовирусы впервые были выделены американскими учеными Р.Дж. Хюбнером, У.П. Роу, Л. Гилмором, Р. Паррот, Т.Е. Уордом в 1953 году из ткани миндалин, аденоидов и лимфатических узлов, полученных от практически здоровых детей во время операций. Немного позже у лиц с заболеваниями верхних дыхательных путей, сопровождающихся конъюнктивитами, были выделены другие типы аденовирусов. Сам термин "аденовирусы" предложен К. Эндерсом, T. Френсисом в 1956 г. Болезни, вызываемые данной группой вирусов, получили название аденовирусных заболеваний. Аденовирусы относятся к семейству Adenoviridae, в которое входят два рода – аденовирусы млекопитающих (в том числе и человека) и аденовирусы птиц. В настоящее время известны 94 серовара, из них 32 - выделены от человека. Очевидно, аденовирусы – основная группа вирусов, которые можно выделить из лимфатической ткани ротоглотки и испражнений любого, практически здорового человека. Вспышки заболеваний чаще обусловлены типами 3, 4, 7, 8, 14 и 21. Тип 8 вызывает эпидемический кератоконъюнктивит. Диаметр вирионов аденовирусов 60–90 нм, они содержат двунитчатую дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), покрытую капсидом. ДНК формирует сердцевину вируса, видную в электронный микроскоп. В составе всех аденовирусов обнаружены 7 антигенов, но не все они имеют одинаковое значение: Аантиген групповой – общий для всех сероваров аденовирусов, обладает комплементсвязывающей активностью; В-антиген токсический; С-антиген токсический, типоспецифический, способствующий абсорбции вирусов на эритроцитах. Аденовирусы устойчивы к воздействию факторов внешней среды. Так, при температуре 36-37оС они сохраняют активность в течение 7 дней, при 22-23 оС - 14 дней, при 4оС - 70 дней. Инактивируются аденовирусы нагреванием до температуры 56оС в течение 30 мин, а также при воздействии 5% раствора фенола, 1% раствора хлорамина, 3% раствора перекиси водорода - в течение 15-30 мин. Устойчивы к эфиру. Источник инфекции: больные с клинически выраженными или стертыми формами заболевания, меньшее значение в распространении имеют вирусоносители. Заражение может произойти, в том числе, и при купании в природных водоёмах и бассейнах.
Механизм передачи инфекции: вирус выделяется в острый период болезни с носовой и носоглоточной слизью, а в более поздние сроки – с фекалиями. Основной путь передачи инфекции воздушно-капельный и контактный. Не исключена возможность и алиментарного пути передачи инфекции (фекально-оральный механизм заражения). Заболеваемость повышается в холодное время года. Наиболее восприимчивы к инфекции дети от 6 мес до 5 лет. На этот возраст приходится 2/3 всех случаев аденовирусной инфекции. Подавляющее большинство новорожденных и детей до 6 мес не болеют ввиду наличия у них пассивного естественного иммунитета. У 95% взрослого населения в сыворотке крови обнаруживаются антитела к наиболее распространенным сероварам вируса. Среди взрослых высока заболеваемость во вновь сформированных коллективах (в первые 2 -3 мес).
Развитие аденовирусной инфекции: Воротами инфекции являются преимущественно слизистые оболочки верхних дыхательных путей, реже – глаз (конъюнктива). Аденовирусы размножаются в слизистой оболочке с постепенным последовательным распространение инфекции на нижележащие отделы дыхательного тракта (трахея, бронхи). Размножение аденовирусов может происходить в ткани кишечника, лимфатических узлах. При этом лимфатические узлы различных групп увеличиваются в размерах. Помимо местных изменений, аденовирусы оказывают общее токсическое воздействие на организм в виде лихорадки и симптомов общей интоксикации. Выход аденовирусов из зараженной клетки приводит к её гибели. За один цикл размножения образуется от 10000 до 1млн. новых вирусов. К счастью человека, только 1-5% новых возбудителей способны проникать в здоровые клетки. В том случае, если размножение аденовирусов протекает медленно, окружающие здоровые клетки успевают нормально делиться и выполнять свои обычные функции. В таком случае явных признаков заболевания не обнаруживается и человек не чувствует себя больным. Так протекает персистирующая (бессимптомная) аденовирусная инфекция. Симптомы и течение заболевания: Инкубационный период колеблется от 4 до 14 дней (чаще 5-7 дней). Основными клиническими формами являются: ринофарингиты, ринофаринготонзиллиты, фарингоконъюнктивальная лихорадка, конъюнктивиты и кератоконъюнктивиты, аденовирусная пневмония. Аденовирусы могут вызывать и иные клинические формы – диарею, острый неспецифический мезаденит и др. Для любой из клинических форм аденовирусной инфекции характерна сочетание признаков поражения респираторного тракта и других симптомов (конъюнктивит, диарея, мезаденит и др.). Исключение составляет кератоконъюнктивит, который может протекать изолированно, без поражения дыхательных путей. Аденовирусные заболевания начинаются остро с повышения температуры тела, симптомов интоксикации (познабливание, головная боль, слабость, снижение аппетита, мышечные боли и др.). Но даже при высокой лихорадке общее состояние больных остается удовлетворительным и не ухудшается в той мере, которая свойственна гриппу. Лихорадка, как правило, продолжается до 6-14 дней. При аденовирусных заболеваниях, протекающих только с поражением верхних дыхательных путей, температура сохраняется 2-3 дня и нередко не превышает субфебрильных цифр. Чаще всего появляется насморк и першение в горле (ринофарингит), у некоторых больных присоединятся боль в горле при глотании (ринофаринготонзиллит). Редко возникают признаки ларингита, трахеита и бронхита. Острый ларинготрахеобронхит наблюдается у детей младшего возраста. Основные его признаки: осиплость голоса, появление грубого "лающего" кашля, развитие стенотического дыхания (затруднённое, шумное, свистящее). Нередко возникает синдром ложного крупа без нарушения речи. Воспалительные проявления со стороны дыхательных путей могут сочетаться с воспалением конъюнктив (слезотечение, чувство песка в глазу, светобоязнь и т.д.). У многих больных увеличиваются периферические лимфатические узлы, особенно передне- и заднешейные, иногда - подмышечные и паховые. Гастроэнтериты наблюдаются обычно у детей младшего возраста. Аденовирусная инфекция протекает более тяжело и длительно у детей раннего возраста с наличием повторных волн заболевания, сравнительно частым присоединением пневмонии. Лица пожилого возраста болеют аденовирусной инфекцией редко. Осложнения могут возникнуть на любом сроке аденовирусного заболевания и зависят от присоединения бактериальной флоры. Наиболее часто встречаются пневмония, тонзиллит (ангина), реже - гайморит, фронтит. Диагностика: Для раннего лабораторного подтверждения диагноза используют обнаружение вирусного антигена в эпителиальных клетках слизистой оболочки носоглотки с помощью иммунофлуоресцентного метода. Применяют и серологический
метод (РСК с аденовирусным антигеном). Диагностическим считается нарастание титра антител в парных сыворотках в 4 раза и больше. Лечение и профилактика: Лечение неосложненных форм аденовирусной инфекции проводится также, как и при гриппе и других ОРЗ. В том случае, если у больного развился конъюнктивит, кератит или кератоконъюнктивит, используют: дезоксирибонуклеазу 0,05% раствор по 1-2 капли в конъюнктивальную складку; полудан в виде глазных капель и/или инъекций под конъюнктиву. Закапывают в конъюнктивальный мешок больного глаза 6-8 раз в день. По мере стихания воспалительных явлений - 3-4 раз в день; бонафтан в виде таблеток для приема внутрь и 0,05% глазной мази в тубах по 10г; теброфен (0,25-0,5% глазная мазь в тубах); флореналь (0,25-0,5% глазная мазь в тубах). Глазные мази закладывают за веки 3 раза в день, к концу лечения – 1-2 раза в день. Длительность лечения 10-14 дней. Для профилактики заболеваний дыхательных путей разработаны эффективные живые вакцины, включающие в себя ослабленные вирусы наиболее часто вызывающие заболевания человека. Их широкое применение останавливают имеющиеся в распоряжении ученых данные о возможной способности аденовирусов вызывать злокачественное перерождение клеток организма человека. • • • • • •
Конкретные цели: Изучить возбудителей аденовирусных инфекций. Ознакомиться с методами культивирования аденовирусов. Делать выводы по микроскопии препаратов (ЦПД вирусов). Изучить лабораторную диагностику аденовирусов. Ознайомиться с техникой заражения тканевых культур. Ознайомиться с ЦПД аденовирусов и их идентификацией.
Уметь: ● Определять цитопатическое действие аденовирусов при микроскопии микропрепаратов. ● Проводить дифференциальную диагностику аденовирусов. ● Делать учет серологических реакций, используемые при диагностике аденовирусов. 1. 2. 3. 4. 5.
Теоретические вопросы: Характеристика аденовирусов. Особенности репродукции. Методы культивирования аденовирусов. Идентификация и типирование. Пути передачи и патогенез аденовирусных инфекций. Проявление аденовирусных заболеваний и выбор материала для исследования. Серологическая диагностика аденовирусных инфекций.
Практические задания, которые выполняются на занятии: 1. Изучение ЦПД аденовирусов на культуре ткани на демонстрационных препаратах. 2. Студенты просматривают культуру ткани в пробирках под малым увеличением и определяют состояние клетки. 3. Разбор и запись в протокол схемы лабораторной диагностики аденовирусных инфекций. 4. Микроскопия и зарисовка демонстрационных препаратов в протокол занятия. 5. Оформление протокола. Литература: 1. Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією.– Київ: Вища школа, 1992.– 431 с.
2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашкола Е.П., Рибакова А.М. Микробиология.– М.: Медицина, 1998.– 336 с. 3. Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.– М.: ГЄОТАРМЕД, 2001.– 768 с. 4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология /Под редакцией академика А.А. Воробьева, М.: Медицинское информационное агентство, 2004.– 691 с. 5. Конспект лекции. Дополнительная литература: 1. Збірник завдань для підготовки до тестового екзамену Крок-1. Загальна лікарська підготовка.– Київ.: Медицина, 2004.- С. 300-333. 2. Методические указания для преподавателей к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии.– Харьков,1986.– 125 с. 3. Сборник тестовых заданий для самоподготовки по медицинской микробиологии и вирусологии.– Харьков, 2005.– 28 с. Краткие методические указания к работе на практическом занятии. В начале занятия проводится проверка уровня подготовки студентов к занятию. Самостоятельная работа состоит из микроскопии демонстрационных препаратов. Студенты зарисовывают микропрепараты в альбом и дают необходимые пояснения. Записывают схемы лабораторной диагностики. В конце занятия проводится тестовый контроль и анализ итоговых результатов самостоятельной работы каждого студента. Технологическая карта проведения практического занятия № Этапы Время Способы Оборудования Место п\п мин. обучения проведения 1. Проверка и кор20’ Тестовые Таблицы, атлас рекция выходного задания уровня подготовисходного ки к занятию уровня 2. Самостоятельная 35’ Граф логичес- Иммерсионный микработа кой структуры роскоп, пробирки с культурой ткани, пиУчебная тательные среды для комната поддержания жизнедеятельности культуры ткани, таблицы, рисунки 3. Самоконтроль и 15’ Целевые коррекция усвоенобучающие ного материала программы 4. Тестовый 15’ Тесты контроль 5. Анализ резуль5’ татов работы Целевые обучающие задания: 1. У больного острым катаральным фолликулярным конъюнктивитом выделили аденовирус серотипа 8. Какое из пересчитанных лекарственных средств можно применить для лечения этого больного? А. Антибиотики B. Бактериофаг C. РНКазу D. Сульфаниламиды
Е. Интерферон 2. От больного острым кератоконъюнктивитом в вирусологической лаборатории был выделен аденовирус. Какую из приведенных форм имеет этот вирус? А. Сферическую B. Палочковидную C. Икосаэдр D. Сперматозоидную Е. Нитевидную 3. В одном из дошкольных детских коллективов, где находились дети в возрасте 1-2 года, зарегистрирован вспышка вирусного гастроэнтерита, которой предшествовал высокий уровень заболеваемости острыми респираторными заболеваниями этих детей. Назовите наиболее вероятных возбудителей вирусного гастроэнтерита, возникшего на фоне предыдущей респираторной инфекции. А. Орбивирусы B. Ротавирусы C. Энтеровирусы D. Аденовирусы Е. Коронавирусы 4. Среди школьников младших классов была зарегистрирована вспышка ОРЗ. Каким из приведенных методов экспресс-диагностики можно подтвердить предположение, что эта вспышка обусловлена аденовирусами? А. Постановкой реакции иммунной флюоресценции B. Выделение вируса C. Постановкой реакции связывания комплемента D. Постановкой кожно-аллергической пробы Е. Заражением лабораторных животных 5. В лабораторной диагностики аденовирусных инфекций тип вируса определяется в: A. Реакция иммунофлюоресцентции B. РСК C. Реакция гемадсорбции D. Реакция нейтрализации E. ИФА 1. 2. 3. 4. 5.
Алгоритм лабораторной работы: Техника приготовления препаратов для определения ЦПД аденовирусов в культуре ткани, окраска их гематоксилинеозином. Изучение ЦПД аденовирусов на культуре ткани (на стеклах, окрашенных гематоксилинеозином), в пробирках. Микроскопия и анализ демонстрационных препаратов. Зарисовка препаратов в протокол. Оформление протокола.
СХЕМА ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ АДЕНОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ I.
ОБНАРУЖЕНИЕ ВИРУСА
Слизь из носа и зева
Отделяемое конъюнктивы
Собирается сухим ватным тампоном с нажимом на ткань. Тампон погружается в питательную среду. Хранится на холоду. Перед посевом повторно замораживается и оттаивается.
Фекалии В стерильный пенициллиновый флакон
Заражение культуры ткани (наблюдение 10-12 дней)
Контроль ткани
ЦПД Заморозить при –700С и оттаять 3х-кратно 2й пассаж
Типирование вируса РСК
реакция нейтрализации с иммунными типоспецифическими сыворотками от кроликов
I.
ОБНАРУЖЕНИЕ АНТИТЕЛ Исследование парных сывороток
Реакция нейтрализации 1 час при комнатной температуре
Заражение культуры ткани Учет Через 72 часа после начала ЦПД в контроле вируса. Определяется титр сыворотки 1й и 2й. Достоверное нарастание антител в 4 р.
РСК