Методические указания для студентов к практическому занятию № 4. Тема: Лабораторная диагностика энтеровирусных инфекций. Цель: Изучение лабораторной диагностики полиомиелита и инфекций, вызванных вирусами Коксаки и ЕСНО. Модуль 3. Общая и специальная вирусология. Содержательный модуль 16. Специальная вирусология. Тема 4: Лабораторная диагностика энтеровирусных инфекций. Актуальность темы: Энтеровирусы (от греч. enteron - кишка) - вирусы, обитающие преимущественно в кишечнике человека и выделяющиеся в окружающую среду с фекалиями. Таксономия и классификация. Энтеровирусы - РНК-содержащие вирусы, относятся к семейству Picornavirus (от лат. рісо - малая величина, rna - РНК), роду Enterovirus. Представителями рода являются вирусы полиомиелита, Коксаки, ECHO, энтеровирусы типов 68-71. Морфология и химический состав. Энтеровирусы - самые мелкие и наиболее просто организованные вирусы сферической формы, диаметром 20-30 нм, состоят из однонитчатой линейной плюс-нитевой РНК и капсида. Капсид построен из 60 белковых субъединиц, уложенных по кубическому типу симметрии. Вирусы не имеют наружной суперкапсидной оболочки. В их составе нет углеводов и липидов, поэтому они нечувствительны к эфиру и другим жирорастворителям. Культивирование. Большинство энтеровирусов, за исключением вирусов Коксаки А, хорошо репродуцируются в первичных и перевиваемых клеточных культурах из тканей человека и обезьяны. Процесс репродукции вирусов происходит в цитоплазме клеток и сопровождается цитопатическим эффектом. В культурах клеток под агаровым покрытием энтеровирусы образуют бляшки. Антигенная структура. Антигенные свойства вирусов связаны с 4 видами капсидных белков. Энтеровирусы имеют общий для рода группоспецифический комплементсвязывающий и типоспецифические антигены. Резистентность. Энтеровирусы устойчивы к факторам окружающей среды, поэтому длительно (месяцами) выживают в воде, почве, некоторых пищевых продуктах и на предметах обихода. Многие дезинфектанты (фенол, спирт, ПАВ) малоэффективны в отношении энтеровирусов, однако последние погибают при действии УФ-лучей, высушивания, окислителей, формалина, температуры 500С в течение 3 мин, при кипячении - в течение нескольких секунд. Восприимчивость животных. Энтеровирусы существенно различаются по патогенности для лабораторных животных. Эпидемиология и патогенез. Заболевания, вызываемые энтеровирусами, распространены повсеместно, отличаются массовым характером с преимущественным поражением детей. Водные, пищевые эпидемические вспышки энтеровирусных инфекций регистрируются в течение всего года, но наиболее часто в летние месяцы. Широко распространено носительство вирусов полиомиелита, Коксаки, ECHO. Источником инфекции являются больные и носители, выделяющие энтеровирусы в большом количестве с фекалиями. Основной механизм передачи - фекально-оральный. Энтеровирусы передаются через воду, почву, пищевые продукты, предметы обихода, загрязненные руки, переносятся мухами. Однако впервые 1-2 нед болезни энтеровирусы кратковременно выделяются из носоглотки, обусловливая воздушно-капельный путь передачи. Энтеровирусы проникают в организм через пищеварительный тракт, репродуцируются в эпителии и лимфатических узлах ротоглотки и тонкой кишки, затем
попадают в кровь, вызывая вирусемию. Дальнейшее распространение вирусов, а также поражение того или иного органа зависит от типа энтеровируса и иммунного статуса человека. Особенности клинических проявлений. Вирус полиомиелита вызывает самостоятельную нозологическую форму - полиомиелит. Другие энтеровирусы вызывают заболевания, характеризующиеся многообразием клинических проявлений, так как могут поражать различные органы и ткани: ЦНС (полиомиелитоподобные заболевания, менингиты и энцефалиты), поперечнополосатую мускулатуру (миалгия, миокардит), органы дыхания (острые респираторные заболевания), пищеварительный тракт (гастроэнтерит, диарея), кожные и слизистые покровы (конъюнктивит, лихорадочные заболевания с сыпью и без нее) и др. Иммунитет. После перенесенной энтеровирусной инфекции в организме формируется стойкий, но типоспецифический иммунитет. Профилактика. При большинстве энтеровирусных заболеваний специфические средства профилактики отсутствуют. Вирусы полиомиелита Полиомиелит - острое лихорадочное заболевание, которое в части случаев сопровождается поражением серого вещества (от греч. polyos - серый) спинного мозга и мозгового ствола, в результате чего развиваются вялые атрофические парезы и параличи мышц ног, рук, туловища. Полиомиелит известен с глубокой древности. В 1909 г. К. Ландштейнер и Э. Поппер доказали вирусную этиологию полиомиелита. Антигенная структура. Известны три серологических типа вирусов полиомиелита - I, II, III, которые не вызывают перекрестного иммунитета. Все три серотипа в эксперименте патогенны для обезьян, у которых возникает заболевание, сходное по клиническим проявлениям с полиомиелитом у человека. Патогенез и клиническая картина. Входными воротами инфекции являются слизистые оболочки верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта. Первичная репродукция вирусов происходит в лимфатических узлах глоточного кольца и тонкой кишки. Это обусловливает обильное выделение вирусов из носоглотки и с фекалиями еще до появления клинических симптомов заболевания. Из лимфатической системы вирусы проникают в кровь (вирусемия), а затем в ЦНС, где они избирательно поражают клетки передних рогов спинного мозга (двигательные нейроны), в результате чего возникают параличи. В случае накопления в крови вируснейтрализующих антител, блокирующих проникновение вируса в ЦНС, поражения ЦНС не наблюдается. Инкубационный период продолжается в среднем 7-14 дней. Различают три клинические формы полиомиелита: паралитическую (1 % случаев), менингеальную (без параличей), абортивную (легкая форма). Заболевание начинается с повышения температуры тела, общего недомогания, головных болей, рвоты, болей в горле. Полиомиелит нередко имеет двухволновое течение, когда после легкой формы и наступившего значительного улучшения развивается тяжелая форма болезни. Паралитическую форму чаще вызывает вирус полиомиелита серотипа I. Иммунитет. После перенесенного заболевания остается пожизненным типоспецифический иммунитет, обусловленный антителами и местной резистентностью слизистой оболочки глотки и кишечника. Пассивный естественный иммунитет сохраняется в течение 3-5 нед жизни ребенка. Лабораторная диагностика. Материалом для исследования являются фекалии больных, отделяемое носоглотки, при летальных исходах - кусочки головного и спинного мозга, лимфатические узлы. Выделение вирусов полиомиелита проводят путем заражения исследуемым материалом первичных (клетки почек обезьян) и перевиваемых культур клеток. О репродукции вирусов судят по цитопатическому эффекту. Идентифицируют (типируют)
выделенный вирус с помощью типоспецифических сывороток в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток. Внутритиповая дифференциация «диких» (вирулентных) и вакцинных вариантов вируса полиомиелита проводится с помощью ИФА, РН цитопатического эффекта вируса в культуре клеток специфическими сыворотками, а также ПЦР. Серодиагностика включает РСК, РН с парными сыворотками больных с помощью эталонных штаммов вируса. Специфическая профилактика и лечение. Эпидемии полиомиелита охватывали в 40-50-х годах тысячи и десятки тысяч человек, из которых 10 % умирали и примерно 40 % становились инвалидами. Массовое применение вакцины против полиомиелита привело к резкому снижению заболеваемости в мире, в том числе и в нашей стране. Разработанная Дж. Солком (1953) инактивированная вакцина против полиомиелита не предотвращала циркуляцию полиовирусов среди населения, поскольку не обеспечивала местную резистентность пищеварительного тракта. А. Сэбин (1956) получил аттенуированные штаммы вируса полиомиелита трех типов и предложил использовать их в качестве живой вакцины. В 1958 г. отечественные вирусологи А. А. Смородинцев и М. П. Чумаков разработали пероральную живую культуральную вакцину из штаммов Сэбина (выпускается в жидком виде), которую используют для прививок детям с трехмесячного возраста. Вакцина создает стойкий гуморальный и местный иммунитет. Лечение полиомиелита симптоматическое. Применение гомологичного иммуноглобулина для предупреждения развития паралитических форм весьма ограничено. Вирусы Коксаки, ECHO и энтеровирусы типов 68-71 Вирусы Коксаки выделены в 1948 г. в США в местечке Коксаки из испражнений больных полиомиелитоподобным заболеванием. Вирусы Коксаки по степени патогенности для новорожденных мышей разделены на 2 группы - Коксаки А (поражают скелетную мускулатуру с развитием вялых параличей) и Коксаки В (поражают ЦНС с развитием спастических параличей; вызывают гибель мышей). Группа А представлена 23 серотипами, группа В - 6 серотипами, отличающимися по антигенным свойствам. Вирусы обладают гемагглютинирующей активностью. Вирусы ECHO получили название по начальным буквам слов: enteric cytopathogenic human orphans viruses (дословно: кишечные цитопатогенные человеческие вирусысироты). Вирусы выделены в 1951-1953 гг. от больных с заболеванием, напоминающим полиомиелит. В отличие от вирусов полиомиелита и Коксаки вирусы ECHO непатогенны для всех видов лабораторных животных. Известно более 30 серотипов вирусов ECHO, отличающихся по антигенным свойствам. Многие серотипы обладают гемагглютинирующими свойствами. Энтеровирусы серотипов 68-71 выделены в 70-х годах. Наибольшее значение в патологии человека имеют вирус типа 70 (выделен во время пандемии острого геморрагического конъюнктивита) и вирус типа 71 (выделен во время эпидемии от больных менингитами и энцефалитами). По биологическим свойствам эти вирусы занимают промежуточное положение среди других энтеровирусов. Лабораторная диагностика. Исследуемым материалом служат фекалии, носоглоточный смыв, кровь, спинномозговая жидкость. Вирусы выделяют в культуре клеток и на новорожденных мышах. Выделенный вирус идентифицируют с помощью РН на соответствующих биологических объектах, а также РТГА (для энтеровирусов, обладающих гемагглютинирующей активностью). Серодиагностика такая же, как при полиомиелите. Специфическая профилактика и лечение. Отечественными учеными разработана инактивированная вакцина против энтеровируса серотипа 71. В отношении других энтеровирусов вакцинопрофилактика отсутствует. Лечение симптоматическое.
Конкретные цели: 1. Изучить общую характеристику семейства Picornaviridae. 2. Изучить морфологию и антигенные свойства вируса полиомиелита. 3. Ознакомиться с основными клиническими формами полиомиелита. 4. Изучить методы лабораторной диагностики полиомиелита. 5. Ознакомится с профилактикой, лечением и осложнениями полиомиелита. 6. Изучить морфологию и антигенные свойства вирусов Коксаки. 7. Изучить методы лабораторной диагностики заболеваний, вызванных вирусами Коксаки. 8. Изучить морфологию и антигенные свойства вирусов ЕСНО. 9. Ознакомиться с основными клиническими формами заболеваний, вызванных ЕСНОвирусами. 10. Изучить методы лабораторной диагностики заболеваний, вызванных ЕСНО-вирусами. 11. Ознакомиться со средствами специфической и неспецифической профилактики ЕСНО-инфекций. Уметь: 1. Отличать здоровую культуру клеток от культуры, которая заражена вирусами. 2. Определять цитопатическое действие вирусов на культуру клеток. 3. Методика постановки РТГА. Теоретические вопросы: 1. Общая характеристика семейства Picornaviridae. 2. Морфология и антигенные свойства вируса полиомиелита. 3. Клинические проявления полиомиелита, осложнения. 4. Лабораторная диагностика полиомиелита. 5. Лечение полиомиелита и специфическая профилактика. 6. Преимущества и недостатки живой и убитой вакцин. 7. Морфология и антигенные свойства вирусов Коксаки и ЕСНО. 8. Варианты клинического течения заболеваний, вызванных вирусами Коксаки и ЕСНО. 9. Методы лабораторной диагностики заболеваний вызванных вирусами Коксаки. 10. Особенности лабораторной диагностики заболеваний, вызванных ЕСНО-вирусами. 11. Методы специфической и неспецифической профилактики. Практические задания, которые выполняются на занятии: 1. Изучение и зарисовка демонстрационных препаратов. 2. Разбор схемы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. 3. Заполнение протокола. Литература: 1. Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією.– Київ: Вища школа, 1992.– 431 с. 2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашкола Е.П., Рибакова А.М. Микробиология.– М.: Медицина, 1998.– 336 с. 3. Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.– М.: ГЄОТАР-МЕД, 2001.– 768 с. 4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология /Под редакцией академика А.А. Воробьева, М.: Медицинское информационное агентство, 2004.– 691 с. 5. Гайдаш І.С., Флегонтова В.В. Медична вірологія.– Луганськ, 2002.– 357 с. 6. Конспект лекции.
Дополнительная литература: 1. Збірник завдань для підготовки до тестового екзамену Крок-1. Загальна лікарська підготовка.– Київ.: Медицина, 2004.- С. 300-333. 2. Методические указания для преподавателей к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии.– Харьков,1986.– 125 с. 3. Сборник тестовых заданий для самоподготовки по медицинской микробиологии и вирусологии.– Харьков, 2005.– 28 с. Краткие методические указания к работе на практическом занятии. В начале занятия проводится проверка уровня подготовки студентов к занятию. Самостоятельная работа состоит из изучения демонстрационных препаратов и разбора схем лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций, заполения протокола. В конце занятия проводится тестовый контроль и анализ итоговых результатов самостоятельной работы каждого студента. № п\п 1.
2. 3. 4. 5.
Технологическая карта проведения практического занятия Этапы Время Способы Оборудования Место мин. обучения проведения Проверка и кор20’ Тестовые Таблицы, коллекция рекция выходного задания вакцин, демонстрауровня подготовисходного ционные препараты ки к занятию уровня Самостоятельная 35’ Граф логичес- Иммерсионный микработа кой структуры роскоп. Самоконтроль и 15’ Целевые Учебная коррекция усвоенобучающие комната ного материала программы Тестовый 15’ Тесты контроль Анализ резуль5’ татов работы
Целевые обучающие задания: 1. У ребенка с острой диарей из содержимого кишечника были выделены вирусы Коксаки группы А. Какую серологическую реакцию следует применить для определения серовара вируса? A. РСК; B. РП в геле; C. реакция кольцепреципитации; D. РА; E. РГА. 2. При культивировании вируса полиомиелита на культуре ткани лаборант отметил изменение цвета среды культивирования (так называемая цветная проба). О чем это свидетельствует? A. Культура тканей не пригодна для последующих пассажей; B. Исходный материал содержал другие вирусы; C. Кроме вирусов в культуре вирусов выросли бактерии; D. Вирус полиомиелита нормально репродуцируется; E. Вирус полиомиелита не репродуцируется. 3. В детскую поликлинику для проведения плановых прививок мать принесла 3-х месячного ребенка. Какая из приведенных ниже вакцин используется для профилактики полиомиелита?
A. БЦЖ; B. АКДС; C. АДС-М D. Себина E. вакцина Чумакова и Смородинцева. 4. У ребенка, заболевшего 3 дня назад, врач заподозрил полиомиелит. Какой материал необходимо взять у больного и, какой метод диагностики использовать для подтверждения диагноза? A. Испражнения для вирусологического метода (заражение мышей-сосунков); B. Испражнения для вирусологического метода (заражение культуры клеток); C. Смыв из носоглотки для вирусологического метода (заражение мышей-сосунков); D. Сыворотку для вирусологического метода (заражение мышей-сосунков); E. Сыворотку для серологического метода. 5. В детское инфекционное отделение поступил больной ребенок с предварительным диагнозом «асептический менингит», вызванный ЕСНО-вирусом. Применением какой серологической реакции можно подтвердить или опровергнуть диагноз? A. РН; B. РСК; C. РТГА; D. все вышеперечисленное; E. только А и С. 6. От больного острой кишечной инфекцией выделен вирус, принадлежащий к роду энтеровирусов. Для установления серотипа вируса используют диагностические сыворотки. Какие антитела должны содержать эти сыворотки? A. К белкам суперкапсидной оболочки; B. К белкам капсида; C. К неструктурированным белкам вируса; D. К вирусным ферментам; E. К вирусным гемагглютинимам. 7. Первую прививку против полиомиелита проводят в 3-х месячном возрасте с использованием вакцины Себина. Какой класс иммуноглобулинов не отвечает в данном случае за образование поствакцинального иммунитета? A. Ig G; B. Ig E; C. Ig А секреторные; D. Ig М; E. Ig А сывороточные. 8. Для серологической диагностики полиомиелита исследуют парные сыворотки больного. Что используют в качестве антигена в реакции вируснейтрализации? A. Антиген белков капсида вируса; B. Комплементсвязывающие антигены вируса; C. Антигены, инактивированные формалином; D. Антигены-гемагглютинины; E. Живые вирусы. Алгоритм лабораторной работы: 1. Изучение характеристики семейства Picornaviridae. 2. Изучение таксономии, морфологии и антигенной структуры энтеровирусов. 3. Изучение схемы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. 4. Методы специфической профилактики 5. Просмотр демонстрационных препаратов. 6. Оформление протокола.
СХЕМА ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭНТЕРОВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСА
ОБНАРУЖЕНИЕ АНТИТЕЛ
Отделяемое носоглотки, ликвор, фекалии Обработка (добавляются антибиотики на 1-2 часа при комнатной температуре; замораживается на 24 час; после оттаивания – посев на стерильность).
Кровь (сыворотка) Реакция нейтрализации 1. для Полиовируса и ЕСНО на культуре ткани. 2. для вируса Коксаки – на мышах.
При отсутствии бактериальной флоры Заражение культуры ткани
Заражение мышей (при отсутствии роста на культуре ткани или, если вирус не типируется как полиовирус).
Проверка специфичности ЦПД в реакции нейтрализации