Методическое указание для студентов к практическому занятию 9 Тема: Питание бактерий. Простые питательные среды. Посев на МПА и МПБ. Методы стерилизации. Цель: Изучение принципов культивирования бактерий, особенностей транспортирования инфицированного материала, методов стерилизации и дезинфекции. Модуль 1. Морфология и физиология микроорганизмов. Содержательный модуль 3. Физиология микроорганизмов. Тема 9. Питание бактерий. Простые питательные среды. Посев на МПА и МПБ. Методы стерилизации. Актуальность темы: Всем микроорганизмам присущий непрерывный обмен с окружающей средой - метаболизм. Метаболизм состоит из двух противоположных, но взаимозависимых процессов: ассимиляции (анаболизм, конструктивный метаболизм); и диссимиляции (катаболизм, энергетический метаболизм). За типом питания все микроорганизмы разделяют на автотрофы и гетеротрофы. Автотрофы – многочисленная группа свободно существующих микроорганизмов (бактерий, грибов, водорослей), основным (факультативные автотрофы) или единым (облигатные автотрофы) источником углерода или азота для которых есть неорганические вещества. Гетеротрофы – организмы, которые приобретают углерод и азот из органических веществ. За характером использования источника энергии различают три группы бактерий: 1. Фототрофы, как источник энергии используют солнечный свет; 2. Литотрофы – неорганический углерод; 3. Органотрофы – органический углерод (углеводы, жирные кислоты). Важнейшие объекты для медицинской микробиологии хемоорганотрофы, их разделяют на сапрофиты и паразитов. Сапрофиты в процессе своей жизнедеятельности используют органические вещества, которые есть в окружающей среде. Паразиты питаются за счет органических соединений животных и человека. Прототрофы – синтезируют все соединения из глюкозы и солей аммония. Ауксотрофы дополнительно нуждаются в специальных веществах – факторов роста. Поглащение бактериями, грибами, водорослями питательных веществ, осуществляется галофильно (питательные вещества должны быть в растворимом виде) благодаря
1. пассивной диффузии 2. облегченной диффузией 3. активным транспортом (при участии специальных ферментов пермеаз) 4. транслокацией химических групп В лабораторных условиях бактерии выращивают на питательных средах. Питательные среды должны имитировать естественные условия, в которых находятся микроорганизмы, и содержать: 1. источник энергии 2. источник углерода 3. источник азота 4. соли (сульфаты, фосфаты, хлориды и прочие) 5. факторы роста (триптофан для S.typhi, глютатион для гонококков) 6. иметь рН 7,2-7,6 7. быть стерильными Питательные среды разделяют на четыре основных группы: 1. Универсальные (МПА, МПБ) - содержат питательные вещества, в присутствии которых растут много видов патогенных бактерий. 2. Специальные - применяют для выращивания бактерий, которые не размножаются на универсальных средах (кровяной агар, сывороточный бульон, сывороточный агар и др.) 3. Выборочные (элективные) - характеризуются тем, что на них хорошо развиваются только определенные виды бактерий и плохо или совсем не растут другие виды (щелочная пептонная вода - для холерного вибриона). Питательные среды, которые содержат определенные концентрации антибиотиков, элективные для стойких к этим антибиотикам штаммов и вместе с тем селективные для антибиотикочувствительных культур. 4. Дифференциально-диагностические среды (Гисса, Эндо, Плоскирева). МПБ - мясо-пептонный бульон МПА - мясо-пептонный агар Пептон - белок частично переварен пепсином или трипсином Агар-агар - комплексные полисахариды, которые выделено из водорослей. Разрежаются при температуре 80-1000С, уплотняются при температуре 35-420С. Стерилизация – процесс, который сопровождается разрушением всех видов микроорганизмов, включая споры и вирусы. Дезинфекция – процесс разрушения патогенных микроорганизмов, которые могут вызвать инфекцию. Стерилизация может осуществляться двумя методами: Физический (солнечное излучение, сухой жар, пар, фильтрование, влияние радиационного излучения, ультразвука).
Химический (кислоты, щелочи, галогены, редуцирующие агенты, формальдегид, фенол, мыла, краски и др.) 1. 2. 3. 4.
Конкретные цели: Студенты должны знать химический состав бактерий, и как он влияет на нужды бактерий в питательных веществах. Студенты должны знать классификацию бактерий за типом питания и классификацию питательных сред. Студенты должны привести состав МПБ и МПА, и знать технику посева бактерий на эти питательные среды. Студенты должны продемонстрировать фундаментальные знания методов стерилизации и дезинфекции, и оценить их роль в предупреждении инфекционных болезней и гнойно-септических осложнений.
Уметь: 1. Приготовить мазки из чистых культур E.coli, S.epidermidis, B.anthracoides и красить их по Граму. 2. Микроскопировать мазки, окрашенные по Граму, пользуясь иммерсионным микроскопом. 3. Сеять чистые культуры E.coli, S.epidermidis, B.anthracoides на питательные среды МПБ и МПА. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Теоретические вопросы: Метаболизм микроорганизмов: анаболизм, катаболизм. Химическое строение бактериальной клетки: органические и неорганические составляющие. Нужды бактерий в питательных веществах: водовод, кислород, углерод, азот, органические факторы роста. Классификация бактерий на основании источников для конструктивного и энергетического метаболизма. Классификация питательных сред. Состав универсальных питательных сред. Методы стерилизации и дезинфекции. Практические задачи, которые выполняют на занятии: Микроскопировать демонстрационные препараты E.coli, S.epidermidis, B.anthracoides Приготовить мазки из чистых культур E.coli, S.epidermidis, B.anthracoides Покрасить и промикроскопировать приготовленные мазки. Сравнить приготовленные препараты с демонстрационными, описать их и идентифицировать. Пересеять чистые культуры E.coli, S.epidermidis, B.anthracoides на МПБ или МПА. Зарисовать все препараты. Оформить протокол практического занятия.
1. 2. 3. 4. 5.
Литература: Коротяев А.И., Бабичев С.О. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология.- С-Пб.: «Специальная литература», 1998.- 579с. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбаков А.М. Микробиология.М.: Медицина, 1998.- 336с. Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.- М.: ГЕОТАФ-МЕД, 2001.- 768с. Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія.- Київ.: "Вища школа", 1992.– 431с. Конспект лекцій
Краткие методические указания к работе на практическом занятии: В начале практического занятия преподаватель проверяет уровень подготовки студентов, используя тесты входного контроля. Самостоятельная работа студентов состоит из приготовления мазков из чистых культур Э.coli, S.epidermidis, B.anthracoides и окраска их по Граму. Студенты микроскопируют демонстрационные и собственноручно приготовленные препараты, зарисовывают их в протокол. Лабораторная работа завершается посевом чистых культур Е.coli, S.epidermidis, B.anthracoides на МПБ и МПА. Каждый студент оформляет протокол работы. В конце практического занятия преподаватель проводит исходный контроль и анализ результатов самостоятельной работы каждого студента. Технологическая карта проведения практического занятия № п/п 1
2
3 4 5
Этапы
Врем яв мин. Проверка и кор20' рекция исходного уровня подготовки к занятию Самостоятель25' ная работа
Самоконтроль и коррекция усвоения материала Тестовый контроль Анализ результатов работы
Средства обучения
Оснащение
Тестовые задачи исходного уровня
Таблицы, атласы, рисунки
Графологические структуры. Коллекция селективных питательных сред, чашки с МПА с изолированными колониями 3-х типов
Смесь бактерий: кишечная палочка, стафилококк, антракоид. Иммерсионный микроскоп, краски для окраски мазков по Граму.
20'
Целевые задания
15'
Тесты
учебные
10'
Целевые учебные задания:
Место проведения У Ч Е Б Н А Я К О М Н А Т А
1. Микроорганизмы, способные синтезировать все соединения из глюкозы как единственного источника углерода и из солей аммония как единственного источника азота, являются: A. Автотрофами D. Фототрофами B. Прототрофами E. Хемотрофами C. Литотрофами 2. Агар-агар является комплексным полисахаридом из морских водорослей, который используется для придания питательной среде плотности. В какой концентрации агар-агар добавляется к питательной среде, чтобы она стала полужидкой: A. 0,1% - 0,5% D. 2,0% - 3,0% B. 0,5% - 1,0% E. 3,0% - 4,0% C. 1,0% - 2,0% 3. Одним из важных требований к питательным средам является создание оптимальных значений рН. При каких оптимальных рН наблюдается наибольший рост подавляющего большинства бактерий. A. 6,2-6,6 C. 7,2-7,6 E. 8,1-8,5 B. 6,7-7,1 D. 7,7-8,1 4. В лаборатории с целью ускорения процесса стерилизации провели стерилизацию сахаросодержащих сред текучим паром в один день: утром, днём и вечером по 30 мин. как правильно надо провести стерилизацию питательных сред? A. Стерилизовать 1ч D. Стерилизовать трижды с B. Стерилизовать 15 мин интервалом 24 часа C. Стерилизовать 45мин E. Стерилизовать дважды на пару 5. Для культивирования кишечной палочки в бактериологической лаборатории приготовили простые питательные среды МПБ и МПА. Какой режим стерилизации необходимо использовать для этих сред? A. Сухожаровой метод при температуре 160˚С B. Фильтрацию C. Кипячение D. Паром под давлением в автоклаве E. УФ-облучение 6. После окончания работы в лаборатории студент должен убрать свое рабочее место, продезинфицировать стол, инструменты. Какие химические вещества он должен для этого использовать? A. Хлоруксусную кислоту D. Хлороформ B. Хлорамин E. Эфир C. Формалин
Алгоритм практического занятия 1. Микроскопия демонстрационных препаратов E.coli, S.epidermidis, B.anthracoides - 4мин a) E.coli - грамотрицательная мелкая палочка (2-4µм×0,4-0,7µм); b) S.epidermidis - овоидные или шарообразные грамположительные бактерии (0,8-0,9µм); c) B.anthracoides - грамположительная большая палочка (1×3-4µм), может быть расположенная в виде коротких цепей. 2. Приготавливание мазков из чистых культур: a) Е.coli - 2мин. b) S.epidermidis - 2мин. c) B.anthracoides - 2мин. 3. Окраска мазков по Граму - 5мин. 4. Микроскопия мазков в иммерсионном микроскопе - 4мин. 5. Сравнение приготовленных препаратов с демонстрационными, их описание и идентификация - 6мин. 6. Высев чистых культур Е.coli, S.epidermidis, B.anthracoides на МПБ или МПА - 3мин. 7. Зарисовка препаратов к альбому - 3мин. 8. Оформление протокола - 4мин.
Граф логической структуры темы: «ПИТАНИЕ БАКТЕРИЙ. ПРОСТЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ. ПОСЕВ НА МПА И МПБ. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ» МЕТАБОЛИЗМ АНАБОЛИЗМ (конструктивный метаболизм)
КАТАБОЛИЗМ (энергетический метаболизм)
СОСТАВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ органическая часть неорганическая часть -белки, нуклеиновые кислоты водород, азот, углерод, -углеводы, липиды; - полисахариды кислород, натрий, калий и др..
автотрофы
гетеротроф
Потребность в питательных веществах - для анаболизма для катаболизма
фототрофы
хемотрофы
литотрофы органотрофы
СТЕРИЛИЗАЦИЯ (дезинфекция)
физические факторы -сухой жар -пар -радиация -фильтрация
ЖИДКИЕ -МПБ
химические факторы
-спирты -фенолы -галогены -альдегиды -поверхностноактивные вещества
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ -аэробные -анаэробные
УНИВЕРСАЛЬНЫЕ -МПБ -МПА
ЭЛЕКТИВНЫЕ СПЕЦИАЛЬНЫЕ
-кровяной агар -сывороточный агар
-щелочная пептонная вода -щелочной МПА
ПЛОТНЫЕ
-МПА
-Гисса -Эндо -Плоскирева