Revisitando mendel e analise de ligacao cma 2014 by Henrique Fernandes

Genética CMA

Revisitando Mendel Análise de ligação genética

Da célula ao gene • • • • • • • • • • • • • • • • • •

1665 (Hook) - “célula” 1838 (Schleiden & Schwann) - teoria celular 1858 (Virchow) - divisão celular 1859 (Darwin) - “A Origem das Espécies” 1865 (Mendel) - publicação de Mendel 1869 (Miesher) - isolamento do DNA 1875/1879 (Stasburger/Fleming) - observação mitose (vegetal/animal) 1890 (Hertwig e Boveri) - descoberta a meiose (1905, Farmer&Moore) 1900 (deVries, Correns, Tschermak) - redescoberta das leis de Mendel 1900 (K.Landsteiner) - grupo ABO 1902 (W.Sutton e T.Boveri) - teoria cromossómica da hereditariedade 1902 (Garrod) - alcaptonúria 1903 (Farabee) - família de braquidactilia 1906 (Bateson) - “Genética” ("hereditariedade, variação e evolução”) 1908 (Garrod) - “erros inatos do metabolismo” 1908 (Hardy e Weinberg) - fundação da genética das populações 1909 (Morgan) - estudos com Drosophila (interacções génicas) 1910 (Johannsen) - “gene”

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35 anos de ‘esquecimento’ • Contexto geográfico e cultural • Língua e revista (115 cópias, 40 separatas) Mendel G: Versuche über Pflanzen-Hybriden. Verhandlungen des Naturforschenden Vereines, Brünn 4:3-47, 1866

• História da ciência (mitose e meiose desconhecidas, fertilização mal conhecida)

• Não aplicação a características complexas • Não replicação por outros, nem pelo próprio

O sucesso de Mendel Simplicidade da abordagem experimental: selecção de caracteres bem definidos e separados; exame sistemático dos produtos de cada cruzamento

Análise quantitativa dos resultados: inferência das leis probabilísticas implicadas

Interpretação biológica destas leis:

as células germinais eram as formas constantes deduzidas

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As sete características estudadas por Mendel nas ervilheiras

Resultados das experiências de Mendel com 7 características

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1ª lei de Mendel

Dominância e recessividade: analisando a segregação com quadrado de Punnett:

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Algumas notações Notações usadas para alelos A/a e+/e (e - mutante, e+- wild type ou normal) LM/LN

Cruzamentos e relação genótipo/fenótipo

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Cruzamentos • Acasalamento controlado de dois indivíduos com o objectivo de obter um dado genótipo pretendido deduzir os genótipos dos progenitores

• × símbolo usado para indicar cruzamento acasalamento haplóide: A × a acasalamento diplóide : A/a × A/a

• A/– : – representa alelo A ou a

Cruzamentos diplóides (1) • Os três genótipos diplóides A/A a/a A/a • Os seis possíveis cruzamentos diplóides

Cruzamento

Razão Genotípica

A/A × A/A

A/A

Razão Fenotípica (na descendência) tudo A

a/a × a/a

a/a

tudo a

A/A × a/a

A/a

tudo A

A/a × A/A

1A/A:1A/a

tudo A

A/a × a/a

1A/a:1a/a

1A:1a

A/a × A/a

1A/A:2A/a:1a/a

3A:1a

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Cruzamentos diplóides (2) Os cruzamentos entre indivíduos heterozigóticos para o mesmo gene chamam-se cruzamentos monohíbridos Um heterozigoto para uma característica recessiva é designado por portador O cruzamento teste é o cruzamento entre indivíduos de genótipo desconhecido (ex: A/–) e indivíduos homozigóticos recessivos (a/a)

Cruzamento teste • Com base nos fenótipos da descendência, permite distinguir entre os genótipos A/A e A/a quando cruzados com indivíduos a/a ▫ se todos os descendentes forem de fenótipo dominante, então o genótipo desconhecido é A/A ▫ se pelo menos um descendente for de fenótipo recessivo, então o genótipo desconhecido é A/a

Se: A/A × a/a A/a × a/a

resultado genotípico A/a 1A/a:1a/a

resultado fenotípico tudo A 1A:1a

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Processo de inferência mendeliana P1(verde) × P2(amarela) ↓ F1 (amarela)

geração parental

↓

Cruzamento F1 x F1

F2 3 amarela :1 verde

1ª geração de descendentes

2ª geração de descendentes

O desaparecimento do verde na F1 e o seu reaparecimento na F2 significa que o amarelo é dominante. Além disso, uma vez que as razões de 3:1 são típicas dos cruzamentos monohíbridos, então a F1 só pode ser toda ela heterozigótica

2ª lei de Mendel - segregação independente

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Cruzamento dihĂbrido (duplo heterozigoto)

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Cruzamento dihíbrido (duplo heterozigoto) Segregação independente Cada um dos 4 tipos de gâmetas masculinos e femininos tem uma probabilidade de 1/4 As proporções fenotípicas na descendência são 9 : 3 : 3 :1

Segregação independente

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A regra do produto (para segregação independente)

A redescoberta de Mendel Antes dos trabalhos de Mendel, a teoria dominante “blending inheritance” – características dos progenitores misturavam-se num gradiente suave e contínuo que era transmitido à descendência O trabalho de Mendel não foi reconhecido até 1900, quando foi redescoberto por 3 cientistas: Hugo de Vries, Carl Correns, e Erich von Tschermak Mendel foi o 1º a descrever: Segregação independente Distinção entre características dominantes e recessivas Entre homozigótico e heterozigótico Diferença entre genótipo (o material genético de um organismo) e fenótipo (as características visíveis de um organismo)

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Da célula ao gene • • • • • • • • • • • • • • • • • •

O termo “gene” Em1889 Hugo de Vries desconhecia o trabalho de Mendel e descreveu no seu livro ''Intracellular Pangenesis‘’o termo "pangen“: partícula mais pequena que transmitia as características hereditárias A palavra pangenesis vem do grego “pan” (que significa “o todo”) e de “genesis” (nascimento) ou “genos” (origem) O botânico holandês Wilhelm Johannsen usou a palavra gene ("gen" in Danish and German) em 1910 para descrever as unidades funcionais e físicas de hereditariedade A palavra genética foi pela primeira vez usada por William Bateson em 1906

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Revisitando a teoria mendeliana • Estudo de algumas extensões

1) Ligação ao sexo (1ª extensão à teoria mendeliana) 2) Análise de ligação genética e mapeamento de genes (estudo de dois ou mais

genes)

Ligação ao sexo • na Drosophila (T.H. Morgan, 1909) • hemofilia e daltonismo ligado ao sexo (T.H. Morgan e E.B. Wilson, 1911)

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A descoberta de linkage (1) • Em1900´s, Bateson and Punnett estudaram a transmissão de 2 genes nas ervilhas de cheiro (sweet pea). Verificaram que na F2 as proporções eram diferentes de 9:3:3:1 ▫ As combinações gaméticas parentais eram em nº superior aos outros dois tipos

A descoberta de linkage (2) • Morgan encontrou em 2 genes autossómicos em Drosophila o mesmo desvio em relação à lei mendeliana de segregação independente ▫ Morgan postulou que os dois genes se situavam no mesmo par de cromossomas homólogos (linkage)

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T.H. Morgan - linkage na Drosophila

“The Physical Basis of Heredity”, 1919 “alguns genes na Drosophila não segregam “mecanismos da hereditariedade mendeliana” Morgan et al., 1915

Ligação genética Bateson & Punnet, 1906: “linkage” e “interacção génica” ligação crom.X na Drosophila olhos brancos, corpo amarelo e asas vestigiais (Morgan, 1911) primeiro mapa genético (Sturtevant, 1913) 6 “factores” ligados no cromossoma X hemofilia e daltonismo (Bell & Haldane, 1937)

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O início da genética experimental: o “grupo da Drosophila”

Thomas Hunt Morgan Herman Joseph Muller C.B. Bridges Alfred H. Sturtevant

Princípios da Análise de Ligação Genética (genetic linkage)

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Mapa genĂŠtico da Drosophila

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Genes ligados Dois genes próximos no mesmo par cromossómico não segregam independentemente na meiose Recombinação produz genótipos com novas combinações em relação aos alelos parentais Dois cromossomas homólogos podem trocar segmentos por crossing-over (quiasmas)

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Crossing-over Não há perda de material genético, apenas formação de novos cromatídeos Cromatídeos parentais não são produto de crossingover Cromatídeos recombinantes são sempre resultantes de crossing-over

Meiose

Na meiose o genoma diplóide passa a haplóide

D5S818

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Recombinação Quando os cromossomas recombinam, são criadas novas combinações de alelos. Cromossomas parentais têm os alelos na mesma configuração original Cromossomas recombinantes têm novas combinações de alelos

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Segregação independente de dois loci

Sintenia, sem ligação

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Genes completamente ligados

Gâmetas parentais e gâmetas recombinantes Taxa de recombinação de 20%

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Recombinação A recombinação pode resultar quer da segregação independente (50% de taxa de recombinação) quer da ocorrência de crossing-over (taxa de recombinação entre 0 e 50%)

Relação entre probabilidade de recombinação e distância genética

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Recombinação e distância genética A probabilidade de ocorrência de recombinação (devido a crossing-over) entre dois loci é uma medida da distância entre esses dois loci Quanto mais perto estiverem os loci, menor a probabilidade de recombinação entre eles A taxa de recombinação varia entre 0 (loci completamente ligados) e 0.5 (segregação independente) Qualquer valor da taxa de recombinação entre 0 e 0.5 indica ligação genética entre os dois loci

Relação (não-linear) entre distância genética e % recombinação

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2 genes ligados

Fase: alelos em cis (acoplamento) ou trans (repulsĂŁo)

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Os indivíduos de tipo a ou de tipo b têm o mesmo fenótipo e o mesmo genótipo para cada um dos dois loci , mas os alelos estão em fases diferentes, o que implica que as combinações alélicas nos seus gâmetas (e portanto na sua descendência) terão diferentes probabilidades

Gâmetas: PL ou pl - mais frequentes Pl ou pL - menos frequentes (recombinantes)

Gâmetas: Pl ou pL - mais frequentes PL ou pl - menos frequentes (recombinantes)

A distância genética entre o locus P e o locus L é a mesma em ambos os casos: apenas as combinações alélicas são diferentes, tanto nos indivíduos a e b como as suas frequências nos gâmetas que cada um produz LINKAGE (ligação genética) é uma relação entre loci, NÃO entre alelos

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Fase: alelos em cis (acoplamento) ou trans (repulsĂŁo) P1: PPLL X ppll F1: PpLl x PpLl Bateson and Punnett experiment Phenotype and genotype

Observed

Expected from 9:3:3:1 ratio

Purple, long (PpLl)

284

216

Purple, round (Ppll)

Red, long (ppLl)

Red, round (ppll)

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Metodologias de estudo da análise de ligação genética Como averiguar se 2 (ou mais) genes estão ligados? ▫ Análise das frequências fenotípicas de um cruzamento teste dihíbrido

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Cruzamento teste Dihíbrido (1) • Permite determinar o genótipo do dihíbrido por cruzamento com homozigoto recessivo Parental F1 Gâmetas na F1

1:1:1:1 razão

AAbb × aaBB

Cruzamento teste

AaBb × aabb gâmetas do homozigoto ab

proporções na fenótipos na descendência descendência

¼ AB

AaBb

¼ Ab

Aabb

¼ aB

aaBb

¼ ab

aabb

Cruzamento teste Dihíbrido (2) • Melhor processo para estudar recombinação é cruzamento teste dihíbrido ▫ Só dihíbridos produzem gâmetas recombinantes ▫ Gâmetas produzidos pelo homozigoto recessivo são todos do mesmo tipo • Cada fenótipo de tipo diferente nos descendentes (F2) corresponde a um único genótipo • Se houver segregação independente no dihíbrido, espera-se uma razão de 1:1:1:1 na descendência

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Segregação independente de 2 genes (= genes não ligados) Se houver segregação independente, cada um dos 4 tipos de gâmetas são igualmente prováveis, ou seja, têm uma probabilidade de 1/4

⇒½ são do tipo parental ⇒½ são recombinantes

Segregação independente Para genes situados em pares de cromossomas diferentes (nãohomólogos), a frequência de recombinação é sempre 50% AABB × aabb

AAbb × aaBB

AaBb

¼AB

P R

50%

¼aB

recombinantes

¼ab

¼Ab

¼AB

¼Ab

¼aB

¼ab

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Como testar segregação independente ? Faça o teste do qui-quadrado para averiguar se no caso descrito no slide anterior os loci A e B segregam ou não independentemente

Genes ligados: gâmetas recombinantes e gâmetas não-recombinantes Recombinantes produzidos por crossing-over. Se os genes estiverem ligados, a soma das frequências dos dois tipos de recombinantes é < 50%

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Gâmetas recombinantes e não-recombinantes

Como deduzir os genótipos a partir das proporções fenotípicas da descendência? A Análise Genética funciona em dois sentidos prever (predizer) genótipos nos descendentes determinar os genótipos dos progenitores no cruzamento

Valores esperados concretos, por ex., 1:1:1:1 podem ser usados para deduzir genótipos Exemplo de um cruzamento teste

Fenótipo A/– B/– A/– b/b a/a B/– a/a b/b

# observado 310 295 305 290

Os resultados observados são próximos de 1:1:1:1, permitindo concluir que o progenitor testado era dihíbrido (heterozigoto)

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Consequências do crossing-over Frequência de gâmetas recombinantes varia entre 050%, dependendo da frequência de meioses em que ocorreu crossing-over Resulta no desvio das razões 1:1:1:1 num cruzamento teste combinações parentais são as mais frequentes combinações recombinantes são as mais raras

Permite o estabelecimento de mapas de ligação baseados nas frequências de recombinação

Genes ligados Dois ou mais loci podem ser mapeados cromossomicamente, observando a frequência de recombinantes produzidos por crossing-over (estimando estimando a taxa de recombinação recombina ão) ão

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Fracção de recombinação Experimentalmente calcula-se através da frequência de fenótipos recombinantes observados num cruzamento teste Aproximadamente proporcional ao comprimento físico de DNA entre os loci Quanto maior a distância física entre os 2 loci, maior a probabilidade de que ocorra recombinação por crossing-over 1% recombinação = 1 unidade mapa (u.m.) 1 u.m. = 1 centiMorgan (cM)

Mapas de ligação genética A

observados P

140

150

Fracção de recombinação é (60+50)/400=27.5%, claramente < 50% Mapa é dado por A

27.5 u.m.

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Mapeamento (1) A análise baseada na fracção de recombinação permite determinar a ordem relativa dos genes A fracção de recombinação entre os mesmos dois loci pode ser diferente entre os sexos ou entre estirpes As fracções de recombinação são aproximadamente aditivas

Mapeamento (2) A existência de múltiplos crossing-over pode simular segregação independente Mapas baseados na fracção de recombinação podem ser combinados com análises moleculares e citológicas para encontrar uma localização mais precisa para os genes

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Cruzamento teste trihíbrido Permite determinar a ordem dos genes e as suas distâncias relativas 8 classes fenotípicas de de descendentes Se os genes estiverem ligados, haverá desvios significativos das razões 1:1:1:1:1:1:1:1

Resultados tanto mais fiáveis quanto maior for o nº de descendentes (como nos fungos, na Drosophila…)

Os oito tipos diferentes de gâmetas originados por indivíduos trihíbridos Quando se cruzam indivíduos trihíbridos com indivíduos triplos homozigotos recessivos (cruzamento teste), o resultado são oito fenótipos distintos na descendência

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Como analisar os resultados de um cruzamento teste trihíbrido? (1) Identificar descendentes parentais e recombinantes parentais (sem crossover) são os mais abundantes Duplos recombinantes; menos abundantes de todos Recombinantes simples; abundância intermédia

Determinar ordem dos genes por inspecção (a ordem dos genes parental leva a duplos recombinantes diferentes mudando os genes intermédios)

Como analisar os resultados de um cruzamento teste trihíbrido? (2) • Calcular a distância entre o gene intermédio e cada um dos extremos utilizando, em cada caso, os respectivos recombinantes simples e adicionando de cada vez os duplos recombinantes • Calcular a distância entre os genes extremos somando as duas distâncias anteriormente calculadas Desenhar o mapa

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Duplos recombinantes

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Genótipo

Observado

Gâmetas

ABC

390

Parental

abc

374

Parental

AbC

Single-crossover (genes C e B )

aBc

Single-crossover (genes C e B)

ABc

Double-crossover

abC

Double-crossover

Abc

Single-crossover (genes A e C)

aBC

Single-crossover (genes A e C)

Total

1000

Gene intermédio C

d(A,C ) =17.9 cM (81+85+5+8)/1000 d(C,B) = 7.0 cM (27+30+5+8)/1000

Genótipo

Observado

Gâmetas

v cv+ ct+

580

Parental

v+ cv

592

Parental

v cv ct+

Single-crossover (genes ct e cv )

v+ cv+ ct

Single-crossover (genes ct e cv)

v cv ct

Single-crossover (genes v e ct)

v+ cv+ ct+

Single-crossover (genes v e ct)

v cv+ ct

Double-crossover

v+ cv ct+

Total

1448

Gene intermédio ct

d(v,ct ) =? d(ct,cv) = ?

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v - ct 100*((89+94+3+5)/1448) = 13.2 cM ct - cv 100*((45+40+3+5)/1448) = 6.4 cM

Interferência Crossing-over numa região cromossómica por vezes influencia crossing-over em regiões adjacentes Interferência = 1 – (coeficiente de coincidência)

Valor varia entre 0 e 1 c. c. =

# observado de duplos recombinantes # esperado de duplos recombinantes

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c. c. =

# observado de duplos recombinantes # esperado de duplos recombinantes

0.132 x 0.064= 0.0084 0.0084 x1448 = 12,2 c.c = 8/12 = 66% Interferência = 33%

Mapas genéticos Mapas baseados na fracção de recombinação são complementados com mapas baseados em marcadores moleculares, segmentos de cromossomas com diferentes sequências de nucleotídeos

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Relação entre probabilidade de recombinação e distância genética

Mapa de ligação genética Mapa de ligação é um diagrama que indica a distância relativa entre os genes, medida em % recombinação 1% recombinação = 1 unidade mapa = 1 centiMorgan (cM) As distâncias são aproximadamente aditivas

X e Y X e Z Y e Z

% recombinação entre os genes 10 4 6

X 4 cM

Y 6 cM

10 cM

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Mapeamento basedo na recombinação

Diferentes tipos de mapas Mapa físico (em pares de bases - pb) Mapa genético (em centi-Morgans (cM) ou percentagem de recombinação) Mapa citogenético

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Mapa genético e mapa físico

Relação (não-linear) entre distância genética e % recombinação

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