IASLC Atlas of ALK Testing in Lung Cancer - Chinese Translation

主编： Ming SOUND Tsao, MD, FRCPC Fred R. Hirsch, MD, PhD Yasushi Yatabe, MD, PhD

国际肺癌研究学会(IASLC) 肺癌 ALK检测手册

international Association for the Study of Lung Cancer

国际肺癌研究学会(IASLC) 肺癌 ALK检测手册

国际肺癌研究学会， 美国，科罗拉多州，奥罗拉市 主编： Ming Sound Tsao, MD, FRCPC Fred R. Hirsch, MD, PhD Yasushi Yatabe, MD, PhD 国际肺癌研究学会出版社出版 译者：张莉萍，贾小力，余辉，陈岗 本书封面及排版由Biographics设计。 国际肺癌研究学会（IASLC）出版社地址: IASLC, 13100 East Colfax Ave., Unit 10, Aurora, Colorado 80011, USA www.iaslc.org IASLC 出版社该手册英文版2013年10月第一次印刷。 IASLC 出版社该手册中文文版2014年8月第一次印刷。 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ISBN: 978-1-940488-06-6 版权归国际肺癌研究学会所有 版权所有 保留版权的所有权利，未经书面许可，此出版物的任何部分不能被复制、存储 或引入到检索系统, 或以任何方式传播。 在截止到出版之日，编者认为本书中的信息是正确且准确的。国际肺癌研究学 会及编者、出版者对书中可能的错误和疏忽不承担法律责任。出版者不对书中 的内容做保证及评价。

国际肺癌研究学会(IASLC) 肺癌 ALK检测手册

主编 Ming Sound Tsao, MD, FRCPC Fred R. Hirsch, MD, PhD Yasushi Yatabe, MD, PhD

international Association for the Study of Lung Cancer

致谢

国际肺癌研究学会（IASLC）感谢辉瑞公司肿瘤部对ALK检 测手册项目的慷慨资助和大力支持。所有编者和所有贡献者 同时感谢Lori Alexander、MTPW, ELS在编辑工作中的帮助， 并感谢Deborah A.Whippen、 Editorial Rx,Inc、Rania Gaspo 博士,及辉瑞公司肿瘤部在出版准备工作中的支持。

目录

编者名单. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

缩略词语表 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

试剂生产商 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

序言. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

第一章

应接受ALK检测的患者 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

第二章

标本的获取、处理和基本诊断过程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

第三章

荧光原位杂交（FISH）. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

第四章

免疫组化(IHC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

第五章

反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和多基因检测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

第六章

各种ALK检测方法之间的比较 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

第七章

细胞学标本的ALK检测 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

第8章

ALK的检测报告. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

第九章

指南和标准化研究 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

第十章

总结和未来展望 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

参考文献. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

附录1

已发表的有关肺癌ALK基因重排的研究总结 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

附录2

美国病理医师协会/国际肺癌研究学会/美国分子病理学会共 同发布的选择接受EGFR和ALK酪氨酸激酶抑制剂治疗的患者的 分子检测指南建议总结 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

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编者名单 主编 Ming Sound Tsao, MD, FRCPC

Fred R. Hirsch, MD, PhD

Yasushi Yatabe, MD, PhD

Pathologist and Senior Scientist, Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network Professor, Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto Toronto, Canada

Professor, Department of Medicine Department of Pathology University of Colorado at Denver Denver, Colorado, USA

Chief, Department of Pathology and Molecular Diagnostics, Aichi Cancer Center Nagoya, Japan

编者 Elisabeth Brambilla, MD, PhD

Keith M. Kerr, FRCPath

Erik Thunnissen, MD, PhD

Professor, Département d’Anatomie et Cytologie Pathologiques INSERM U823 Institut Albert Bonniot Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble, Université Joseph Fourier Grenoble, France

Professor, Department of Pathology Aberdeen University Medical School Aberdeen Royal Infirmary Aberdeen, Scotland, United Kingdom

Consultant Pathologist, VU University Medical Center Amsterdam, The Netherlands

Sylvie Lantuéjoul, MD, PhD

Professor, Department of Medicine/ Medical Oncology Department of Pathology University of Colorado at Denver Denver, Colorado, USA

Lukas Bubendorf, MD Professor and Head, Division of Cytopathology Institute for Pathology, University Hospital Basel Basel, Switzerland

Jin-Haeng Chung, MD, PhD Professor, Department of Pathology Seoul National University Bundang Hospital Seoul, South Korea

Professor and Chair, Département d’Anatomie et Cytologie Pathologiques INSERM U 823 Institut Albert Bonniot Centre Hospitalier Universitair A Michallon, Université Joseph Fourier Grenoble, France

Kengo Takeuchi, MD, PhD Pathology Project for Molecular Targets of the Cancer Institute Division of Pathology of the Cancer Institute Hospital Japanese Foundation for Cancer Research Tokyo, Japan

Marileila Varella-Garcia, PhD

Ignacio Wistuba, MD Professor and Chair, Jay and Lori Eisenberg Endowed Professor Department of Translational Molecular Pathology The University of Texas MD Anderson Cancer Center Houston, Texas, USA

Akihiko Yoshida, MD, PhD Attending Pathologist, Department of Pathology National Cancer Center Hospital Tokyo, Japan

2013年在意大利Sorrento市，IASLC 举办 的ALK检测研讨会参加者。前排，从左 到右依次为- Y. Yatabe, M. Varella-Garcia, E. Brambilla, S. Lanteujoul, R. Gaspo (Pfizer Oncology), J-H Chung; 后排，从左到右依 次为–A. Yoshida, I. Wistuba, F. R. Hirsch, M. S. Tsao, E. Thunnissen, L. Bubendorf, K. Kerr.

7 缩略词语表

缩略词语表 以下是文中使用的缩略词语 AEC: 3 - 氨基-9 - 乙基咔唑 ALK: 间变性淋巴瘤激酶 AMP: 美国分子病理学会 ATS: 美国胸科学会 CAP: 美国病理医师协会 CISH: 显色原位杂交 DAB: 3, 3'二氨基联苯胺 EBUS:支气管内超声 EDTA: 乙二胺四乙酸 EGFR: 上皮生长因子受体 EML4: 棘皮动物微管相关类蛋白4 ERS: 欧洲呼吸学会 ETOP: 欧洲胸科肿瘤平台 EUS: 经食管超声 FDA: 美国食品药品管理局 FFPE: 福尔马林固定石蜡包埋 FISH: 荧光原位杂交 FNA: 细针穿刺 H&E: 苏木素和伊红 HER2: 人类表皮生长因子受体2 iAEP: 插抗体增强聚合物 IASLC: 国际肺癌研究学会 IHC: 免疫组织化学 ISH: 原位杂交 KIF5B: 驱动蛋白家族成员5B NOS: 非特殊型 NSCLC: 非小细胞肺癌 NGS: 二代测序 RET: RET原癌基因 ROS1: C-ROS癌基因1 RT-PCR: 逆转录酶聚合酶链反应 SCLC: 小细胞肺癌 TKI: 酪氨酸激酶抑制剂 v: 变异体

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试剂生产商 本手册中提及以下试剂生产商及其产品。以下列出的每个生产商地址不是其唯一地址；多数 生产商在全球拥有办事处。

Abbott Molecular Abbott Park, Illinois, USA Vysis LSI ALK Break Apart FISH Probe Kit, Spectrum Orange Probe, and Spectrum Green Probe

Leica Biosystems Buffalo Grove, Illinois, USA Wetzlar, Germany Bond-Max, Novolink Polymer Detection System

Abcam Cambridge, UK Anti-ALK antibody (5A4)

Nichirei Biosciences, Inc. Tokyo, Japan 5A4 antibody (Histofine ALK Detection Kit)

BD (Becton, Dickinson and Company) Diagnostics Franklin Lakes, New Jersey, USA SurePath

Novocastra Newcastle, UK 5A4 antibody

Cell Signaling Technology Danvers, Massachusetts, USA D5F3 antibody (ALK [D5F3] XP Rabbit mAb) Dako Glostrup, Denmark Carpinteria, California, USA ADVANCE, ALK1 antibody, EnVision, EnVision+, EnVision FLEX, and EnVision FLEX+, PT Link, and Target Retrieval Solution Hologic, Inc. Bedford, Massachusetts, USA ThinPrep Invitrogen, Life Technologies Corporation Carlsbad, California, USA Anti-ALK antibody

NanoString Technologies Seattle, Washington, USA NanoString assay Pfizer Oncology New York, New York, USA XalkoriTM Ventana Medical Systems, Inc. (member of the Roche group)

Tucson, Arizona, USA BenchMark XT, iVIEW DAB Detection Kit, OptiView DAB IHC Detection Kit, OptiView Amplification Kit, and ultraView Universal DAB Kit, and Rabbit Monoclonal Primary Antibody assay ZytoVision GmbH Bremerhaven, Germany ZytoDot 2C SPEC ALK break-apart probe

序言

编者 Ming Sound Tsao, Fred Hirsch, Yasushi Yatabe

近年来，晚期肺癌的诊断和治疗有了突破性进展。当前的成功范例是根据肿瘤中 特定的癌基因异常来选择接受靶向治疗的患者。肺癌靶向治疗中发现的第一个异常 基因是表皮生长因子受体（EGFR）激酶结构域的突变，存在这类突变的肿瘤对EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）治疗敏感。之后，发现了第二个驱动癌基因间变性淋巴瘤 激酶(ALK)基因，并研发出针对该基因的有效的新型靶向药物。位于2号染色体短臂 上编码ALK的基因（2p23.3）与棘皮动物微管相关蛋白4（EML4）基因（2p21）发生 重排，形成新的ALK融合基因。偶尔存在ALK与2号染色体外的其他染色体上的基因发 生融合。因为EML4基因的基本结构域能够形成新的嵌合蛋白二聚体, 新融合基因的蛋 白产物能够持续激活ALK激酶。在肺癌中发现了EML4-ALK融合基因的多种变异类型。 这些融合位点包括EML4编码蛋白质N端的基因片段和ALK编码蛋白质C端激酶结构域的 基因片段。 因为这一基因重排包括大的染色体片段插入和易位,所以选择荧光原位杂交（FISH） 方法来检测所有类型的ALK基因重排。在第一个ALK抑制剂克唑替尼(crizotinib)的临床 研究（Xalkori, Pfizer Oncology）(Bang 2010, Kwak 2010, Camidge 2012)中，也是应用 FISH方法来检测肿瘤的基因异常。因此，使用ALK分离重排探针的FISH成为诊断肺癌ALK 重排的标准方法，美国食品药品管理局（FDA）批准了ALK分离FISH探针试剂盒（Vysis LSI ALK Break Apart FISH Probe Kit , Abbott Molecular公司）。使用这种有明确阳性和阴 性结果判断标准的方法来筛选晚期非小细胞肺癌中ALK重排的患者。在一项临床Ⅰ/Ⅱ 期试验中，接受克唑替尼治疗的患者中有61%获得客观缓解，中位无进展生存期9.7个 月（Camidge 2012）。在一项随机临床Ⅲ期试验中（PROFILE 1007），对化疗后疾病 进展的患者进行克唑替尼加化疗药物联合应用，客观缓解率为65%（化疗组客观缓解 率为20%），无进展生存期7.7个月（化疗组无进展生存期3.0个月）（Shaw 2013）。 已经研发出二代ALK抑制剂并正在进行临床试验。随着各种ALK基因重排变异体的 逐渐发现，建立了使用聚合酶链反应（PCR）和测序方法来检测融合基因。另外，来 自多中心的研究表明，使用带有信号增强系统的免疫组化（IHC）方法检测FISH结果 阳性的肿瘤，几乎全部肿瘤都能检测到ALK蛋白表达。据报道几例FISH结果是不典型

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ALK形态（ALK FISH阴性）但IHC检测ALK蛋白阳性的病例，使用ALK抑制剂治疗有效 （Peled 2012）。根据这些结果，目前正在研发和验证商品化的IHC试剂盒。 随着以上多种诊断方法的发展，使各个实验室可以根据本身具备的实验人员技术能 力和设备来选择可行的检测ALK基因重排或融合蛋白的方法。因为作为临床诊断检测结 果必须要具有很高的可重复性和准确性，这些检测方法必须要进行标准化。为了解决 这一问题，国际肺癌研究学会病理专业委员会召集专家组编写发表这一手册，目的是 帮助病理医生、实验室技术人员及临床医生更好地理解在晚期NSCLC患者中进行ALK检 测的实验背景、操作方法及实验结果的解析判读。

第一章

应接受ALK检测的患者 编者Fred R. Hirsch, Elisabeth Brambilla, and Ming Sound Tsao

ALK基因重排检测对筛选晚期NSCLC中对靶向治疗敏感的患者是十分重要的。然而， 是否能够根据临床病理特征来决定哪些患者应该进行ALK检测的问题，仍然不清楚。肺 癌中ALK基因重排常见于不吸烟者、既往轻度吸烟者、较年轻患者和病理分型为腺癌的 患者。但是要把组织分型为鳞癌的年纪较大和吸烟的患者排除在ALK检测之外吗？答案 尚不明确。已发表的研究发现，ALK阳性的NSCLC中，不吸烟者占70-80%（目前或既往 吸烟者占20-30%）。与总的NSCLC患者 NSCLC-Others A (n=376) （60-70岁）和EGFR突变的NSCLC患者 ADSC (n=78) （60-65岁）相比，ALK阳性者较年轻 SCC （40-50岁）（Rodig 2009, Shaw 2009, (n=1411) NSCLC (n=4025) Bang 2010, Kwak 2010, Shaw 2011.）。 然而，在所有的研究中，都发现了大于 70岁或小于40岁的患者肿瘤也存在ALK ADC (n=6775) 重排。 这些研究结果没有提供依据吸烟史 和年龄就能把某些患者排除在ALK检测 B 11.1 之外的证据。组织学类型看来是更重要 9 的筛选标准；文献报道在超过12000例 5.7 5.2 4.8 肺癌组织样本中，ALK重排主要见于 1.3 非鳞癌和非神经内分泌癌（图1；附录 NSCLC ADC ADC SCC ADSC NSCLC1）。根据以上结果，包括最近刚发表 Others (unselected) (selected) 的美国病理医师协会/国际肺癌研究学 图一 NSCLC中ALK检测研究数据的总结. A 截止到 会/美国分子病理学会联合发布的肺癌 2013年5月，文献中报道的NSCLC中ALK异常的病例 分子检测指南在内的几个指南，建议晚 数。图中“NSCLC”是指研究中没有说明组织亚型的 病例，“NSCLC-其他类型”包括腺鳞癌（ADSC）和大 期NSCLC中组织学分型为鳞癌的患者不 细胞癌/肉瘤样癌。B 根据肿瘤组织学分型估计的ALK 阳性病例的比例。对腺癌来说，有根据临床信息（例 进行常规ALK检测(Lindeman 2013) 如， 吸烟史、EGFR和KRAS突变阴性）选择患者的阳 （见附录2和第九章中对ALK检测指南 性率或没经选择患者的阳性率。这些病例数值来源于 附录1中的数据。 SCC=鳞癌 的讨论）。但是，在对超过1400例鳞

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癌的检测中，发现大约1.3%的病例有ALK基因重排（附录1），并且有几例ALK重排病 例经过IHC证实（Alrifai 2013, An 2013, Ochi 2013）。不同研究之间对鳞癌检测结果的 不一致可能是由NSCLC中仍然存在组织学亚型诊断困难引起的。一个肺癌的诊断常常 是来自小活检组织或细胞学标本等小标本的病理检查。但是根据小标本得到的病理 诊断并不总是能代表整个肿瘤全貌。对这些诊断为鳞癌且不伴有EGFR和KRAS突变的 样本再次检查时发现，16例肿瘤中有15例含有部分腺癌成分（Rekhtman 2012）。因 此，美国病理医师协会/国际肺癌研究学会/美国分子病理学会编写的指南中建议， 在对肺癌标本进行全面病理检查的前提下，可以仅对腺癌或含有腺癌成分的肺癌进 行ALK检测。同时建议对腺癌成分不能完全排除的局限性小标本，比如活检和细胞学 标本等进行ALK检测。 在鳞癌的ALK检测中，用IHC方法进行筛查可能是一个理想的解决办法。因为IHC检 测方法有费用低、重复性高、敏感性特异性高的优点，可以在鳞癌患者中先进行IHC检 测，对阳性病例再用费用较高的FISH进行验证。 对肿瘤局限或局部侵袭的早期NSCLC患者来说，ALK重排检测与目前的治疗方案选 择无关。但是，ALK检测可能是有益的，因为这些患者中的大多数会有后继的疾病复 发，此时先前的检测结果能够节省时间和后面再检测的麻烦。

第二章 标本的获取、处理和基本诊断过程 编者 Keith M. Kerr, Ignacio Wistuba, and Yasushi Yatabe

ALK基因重排检测与其他多种诊断检测一样，要使用含有肺癌的组织标本。对大多 数患者来说，一次标本取样过程只能得到不多的组织，必须用最有效的方式来利用组 织，以便得到尽可能多的诊断信息。使用组织标本要记住两个要点：一是标本中可能 没有肿瘤组织；二是固定和处理组织的机会只有一次。因此，做好标本的获取和处理 过程这些关键步骤，才能保证检测质量，最终达到在一份组织样本上完成所有诊断检 测的目的。

获得用于诊断的组织 在多数晚期肺癌病例中，都是用活检或细胞学小标本来进行ALK检测。少数病例是 患者在肿瘤处于早期时进行了外科手术切除，后来肿瘤复发，这类患者有手术切除的 完整肿瘤组织进行检测。获取标本的原则是，在尽可能安全和尽量少创伤情况下尽可 能获得最大量的用于诊断的肿瘤组织（Thunnissen 2012d）。标本可以是肿瘤原发灶、 胸腔内转移灶或胸腔外转移灶。尽管有原发灶和转移灶的ALK状态不一致的报道（Kim 2013）,但是没有充分的证据表明要选择标本取材部位进行检测。通过内镜（支气管 内或经支气管进行的钳取活检、冷冻活检，或细针穿刺［FNA］）或经皮胸腔穿刺（ 粗针穿刺或FNA）可以获取原发灶标本。现在常规使用支气管内超声（EBUS）或经食 道超声（EUS）来引导胸腔内转移灶的取材，胸膜病变（胸膜活检或胸水细胞学）经常 是有诊断价值标本的来源。当胸腔外的远处转移病灶在某些适合活检的部位时可以获 取标本；在所有病例中，可以通过使用几种影像学技术来帮助准确取样，从而获取更 多的肿瘤组织（Rivera 2007）。在大多数医学中心，如果影像学引导下的取样不能获 取足够的标本量或取样过程不成功，可以进行外科手术来获取组织。

用于ALK检测的组织 活检组织和细胞学标本都适合做ALK检测。关键问题是必须进行适当的标本处理过 程和标本中必须含有足够多的肿瘤细胞（Thunnissen 2012b）。免疫组化检测ALK蛋白 需要多少肿瘤细胞数仍然没有明确定义，但是用FISH方法检测ALK基因重排需要最少50 个可以评估的肿瘤细胞。也可以用细胞学涂片进行检测，但是对细胞学标本来说最合

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适的方法通常是制备细胞包埋蜡块，这样切片后可以进行与组织活检标本一样的检测 流程。总之，要对病理实验室接收的全部组织和细胞学标本进行适当的处理。外科切 除标本是一种例外，尽管作为一般原则，肿瘤直径在3厘米或更小时，可以直接进行标 本处理。当送检胸水量较多时，可以取一部分进行检测；建议保留送检液体直到检测 过程结束。

组织处理过程 建议用10%含缓冲液的中性福尔马林浸泡固定组织，或在合适的条件下灌注固定。 组织在福尔马林固定前用某些含酒精的固定液后，可能会改变组织的抗原性或DNA 的完整性。含骨活检标本经酸性脱钙液处理后可能会影响IHC和FISH检测，导致DNA 降解使检测结果不可靠。避免使用酸性固定液（例如Bouin’s液）和含重金属盐的 固定液。一般来说，建议固定时间在6-48小时，尤其是需要进行生物标志物时检测 时（DNA的完整性对这些检测很重要）（Wolff 2007, Hunt 2007）。固定时间过短或 过长都可能会对DNA和蛋白质抗原决定簇造成破坏性影响（Werner 2000, Atkins 2004, Oyama 2007, Bussolati 2008, Eberhard 2008）。组织处理过程中一个要点是一旦从患者 身上获取组织后，立即把标本浸泡入固定液。从标本离开人体到浸泡入固定液之间的 时间是多少，及经过多少时间送达病理实验室，大多数实验室不能控制这些时间也没 有记录。另外，大多数组织脱水机含有一个标本固定的步骤，这又增加了固定时间。 在实践中，大多数实验室会调整他们在IHC和FISH检测中的某些染色步骤，使之能够适 应他们自己的标本平均固定时间。对那些接收多地点外送标本的实验室来说，因为这 些标本的固定时间互相之间不同，确定这些组织的固定时间和特性是很大的挑战。

进行生物标志物检测前的组织处理 大多数生物标志物检测（IHC、ISH或RNA/DNA研究）都是在得到最初诊断后就开始 进行。这时，应使用新鲜的切片进行生物标志物检测。玻切片上的组织质量在数天或 几周后就会下降，几个月后会改变更大。切片质量下降的程度与贮存条件有关，更可 能与特定的生物标志物本身的性质有关（Atkins 2004）。尚无有关ALK蛋白质在未染色 切片上的稳定性的系统性研究。因此，在ALK检测中，使用与乳腺癌中Her-2检测相似 的要求，未染色切片保存时间超过6周后就不应再用于IHC和FISH检测。如果必须要保存 切片，切片上要涂抹石蜡或类似的物质以免被空气氧化，并且保存于凉爽干燥阴暗的 环境中。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）块中的组织不易受破坏，在大多数情况下， 蜡块保存很长时间后根据需要再切片，样本质量仍然很好。样本的形态学诊断、IHC 染色、及后面的分子检测都需要石蜡切片，有几种的办法可以帮助减少蜡块的切片次 数。例如，因为每次再切片时修平蜡块都会不可避免地浪费一些组织，在第一次切片 时多切几张白片备用可以减少切片次数，尽管这种办法能够减少组织浪费，但也会产 生不必要的切片及要保存这些切片等问题（图一）。

15 第二章 标本的获取、处理和基本诊断过程

Common procedure to date H & E staining for histologic diagnosis Repeat sectioning

For IHC Repeat sectioning

For molecular testing

The procedure in era of molecularly targeted drugs

H & E staining for histologic diagnosis For IHC

For molecular testing

图一 诊断过程中组织切片的准备。目前实践中的常规做法是先进行石蜡切片，制备组织学诊断需要的 苏木素伊红（H & E）染色切片。组织学诊断完成之后再次切片，制备IHC和/或分子检测需要的切片。 每一次切片过程中，必要的蜡块修平会损耗组织，多次对蜡块进行切片会损耗更多的组织。在分子靶向 治疗时代，为了可能的IHC分析和/分子检测的需要，一次性切片并准备额外的未染色切片，能够明显减 少组织标本的损耗并加快检测时间。

检测标本的第一步是确定标本内是否含有肿瘤成分。由于患者情况、取样技术、 操作技巧等的不同，取样标本中是否含有恶性肿瘤细胞的比例不同，但通常较高，比 例大约在60%到大于90%之间（Schreiber 2003）。要知道，即使标本中含有肿瘤细胞， 通常肿瘤成分只占送检组织的一小部分，并不一定所有的组织切片上都有肿瘤细胞存 在（Coghlin 2010）。一旦明确有恶性成分后，下一步是排除非上皮性恶性肿瘤（例 如淋巴瘤或肉瘤）或其他器官的癌尤其是腺癌转移到肺的可能性（Kerr 2013b）。通

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常，根据足够的临床和影像学信息及结合标本的HE染色切片的形态学表现，这一步容 易完成。但是当缺乏临床信息时，为了排除胸腔外来源的腺癌肺转移要进行一些辅助 的IHC检测，这会用去部分样本导致剩余组织过少不够做分子检测。 如果肿瘤是原发性肺癌，下一步是鉴别小细胞肺癌（SCLC）或其他类型的癌，因为 晚期小细胞肺癌的治疗与非小细胞肺癌不同。通常可以根据基本的形态学特征来鉴别 （Burnett 1994）。但是有时需要IHC帮助诊断。大多数非小细胞癌病例能够根据形态 被准确地分类为鳞癌、腺癌或其他少见的非小细胞癌亚型。但是，有25-40%的病例仅 根据形态学特征无法准确分类为具体的非小细胞癌亚型，应当归类为非小细胞癌-非 特殊型（NSCLC-NOS）（Chuang 1984）。可以使用诊断性的IHC检测来提示可能的 NSCLC亚型（Loo 2010, Travis 2011, Travis 2013）。使用一组含有几个IHC抗体的组合帮 助诊断，能使NSCLC-NOS病例的比例降到小于10%，并以80%的准确率使大多数NOS病 例诊断为NSCLC的亚型（Loo 2010）。对于一个没有明显形态学分化的病例，当免疫 组化结果提示腺癌分化时，报告中应该用推荐的术语描述(例如，NSCLC，倾向腺癌) （Travis 2011, Kerr 2013a）。

结论 目前，检测肿瘤分子驱动基因改变来筛选靶向治疗的患者是一个标准的诊治流程。 不仅前期的形态学诊断、为了对肿瘤进行准确组织分析进行的IHC检测需要标本，后续 的分子检测也需要标本，这些需求使标本的获取、处理、及恰当地使用肿瘤组织这些 步骤变得非常关键。在操作中要尽量为后续的检测保留足够的标本。然而，有些病例 缺乏足够的组织是不可避免的，肿瘤确诊后的分子检测受标本不足的影响最大。当组 织量不足时，需要再次活检。

第三章

荧光原位杂交（FISH） 编者 Akihiko Yoshida, Marileila Varella-Garcia

使用分离探针的FISH方法最开始是应用于检测不同染色体之间易位引起的基因融 合。因为分离FISH检测适用于FFPE标本，且即使在对确切的融合位点未知的情况下 也能检测基因易位，在外科病理中是一种可靠的诊断方法。ALK分离探针FISH已经成 功应用于淋巴瘤和间质肿瘤的诊断中，在少数NSCLC患者中发现的ALK重排拓宽了该 检测的应用范围（Soda 2007）。但是在肺癌ALK重排中，2号染色体内的倒置引起的 ALK（2p23.2）和EML4（2p21）基因融合是最常见的融合变异体，因为这两个基因位 置相距很近使FISH分离检测面临意料之外的挑战；只有在很少见的情况下ALK通过2号 染色体内的易位与除EML4外的其他基因发生融合。因此，分离FISH检测在对ALK重排 肺癌的诊断中，必须特别注意技术细节和对结果的判读解释。

FISH探针的设计 ALK分离探针通常是用一种荧光颜色标记基因融合断裂点的3’(端粒)端，用另一 种荧光颜色标记5’(着丝粒)端。在不同的商品化和订制的试剂中，有针对特异的基 因组区域的其他颜色的荧光标记探针。在雅培分子（Abbot Molecular）公司开发的试 剂盒中（图一；Vysis LSI ALK 分离FISH探针试剂盒），橘红色信号代表3’端（大约 300kb）（橘红色光谱，因为在红色波长滤光片下呈红色，所以在文献中经常被说成 红色，），绿色信号代表5’端 300 kb 442 kb 3' 5' （大约442kb）（绿色光谱）。 2p23.2 这一探针组已经被美国FDA批准 ALK EML4 应用于诊断中，并广泛应用于世 界范围内。 Normal

标本前期处理的要求

~12.5 Mb inversion EML4-ALK fusion

ALK:EML4 作为一种对DNA的检测，FISH ALK:EML4 有显著的优点。但是，检测受许 多因素的影响，尤其是组织何时 图一. 用于检测肺癌中EML4-ALK 融合基因 （ALK重排）的Vysis 开始固定、固定的时间、固定液 LSI ALK 分离 FISH 探针试剂盒 (雅培分子，Abbott Molecular) 。

18 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

作为一种对DNA的检测，FISH有显著的优点。但是，检测受许多因素的影响，尤其是 组织何时开始固定、固定的时间、固定液的类型，所有这些过程处理不好都会导致 DNA降解（表1）(Hunt 2007, Babic 2010)。例如，标本长时间冷缺血或组织离体超过 1小时后才浸入固定液，都可能导致DNA降解和FISH检测的失败(Khoury 2012)。认为 最理想的固定时间是6-48小时(Hunt 2007, Babic 2010)；固定时间过短和过长都可能对 检测过程有明显影响。 表 1.为了FISH检测的成功，对标本前期处理的建议

影响因素

推荐

开始固定的时间

离体后越早固定越好，不要超过1小时

固定液

10% 的含有缓冲液的中性福尔马林

固定时间

6-48 小时

切片要求

石蜡包埋切片，切片厚度5 ±1 μm

样本保存

组织块（最理想）

组织块的保存时间

在合适条件下可长期保存供使用

组织块的保存条件

避光、阴凉、干燥

切片的保存时间

4-6 周（最理想）；使用更长时间的切片时要根据切片情况改变实验操作

脱钙处理

如果必须脱钙，使用EDTA

最佳固定液是10％的含有缓冲液的中性福尔马林；组织如经过Bouin氏液固定后会 干扰杂交过程。组织经过强酸性溶液脱钙处理后基本不能再进行杂交检测；组织经过 EDTA或甲酸溶液轻度脱钙处理后，一般不明显影响检测。当骨转移性病灶是唯一能用 于分子检测的标本时，脱钙处理会影响检测。在这种情况下，可以先观察H＆E染色切 片中组织的形态。根据组织的形态表现来判断是否可以进行FISH检测。 检测成功的另一个相关因素是切片的保存时间和保存条件 。用标准的FISH流程来 检测在室温下保存了很长时间的玻片上的组织时，一般无法得到检测结果，这时需 要根据组织的情况对检测步骤进行特定的修改。因此，最理想的保存方式是石蜡包埋 块。石蜡包埋块可保存的时间受保存条件（例如，温度、是否暴露于光，热，潮湿环 境中）的影响，样本保存在会破坏DNA的环境中可能会导致杂交失败。 杂交前后的很多因素变化也能影响检测。杂交前的过程包括一系列步骤，目的是使 探针穿透进入肿瘤细胞核中。为了增加组织的通透性，要用酶来消化蛋白质大分子结 构，但完全统一的的消化步骤不能使所有的标本都得到满意的消化效果。分化差的肿 瘤对消化酶敏感，含有纤维组织和粘液的肿瘤对消化酶不敏感。杂交后的洗片过程， 必须既能彻底地洗去未结合的探针，又不降低信号强度。多种实验操作流程都可以产 生极好的效果, 因此，实验室应根据组织的特性选择其中一种合适的实验流程。

19 第三章: 荧光原位杂交

杂交标本的质量评估和评分细胞的选择 十分关键的一点是，首先要严格评估组织形态学的质量和杂交信号强度，来决定这 个样本是否适合进行结果分析。当样本有很好的形态学结构和杂交信号强度并且背景 信号很弱时，说明标本适合进行结果分析（图2和图3）。当标本存在染色质消化过度 或探针穿透能力差的表现时不能进行结果分析，必须找到原因并改进后重新检测。例 如，当组织的预处理不足或处理过度时，标本不适合进行分析（图4）。或技术性的人 工假象导致含有成串信号的细胞核互相重叠，无法测量分离的红绿信号之间的距离， 标本也不适合进行结果分析（图5）。 ALK基因重排在肿瘤内均匀分 布，这一现象反映了其关键的致 癌作用（Camidge 2010）。因 此，不需要根据形态学或免疫表 型来选择一个特定的肿瘤区域计 数，建议在几个不同的肿瘤区域 进行细胞计数。只对形态完好的 没有相互重叠的且含有至少一个 A 5’和3’信号的肿瘤细胞进行计 数。因为肺癌组织有多种生长方 式，且肿瘤细胞可以与非肿瘤细 胞（例如肺泡内的巨噬细胞和淋 巴细胞）紧密地混杂在一起，这 使在暗视野下较难准确地识别肿 瘤细胞。建议在计数细胞过程中 C B 一直用一张连续的H＆E染色组织 图2. ALK重排阴性肺癌肿瘤细胞的显微镜下形态。

D

A

B

C

E

图3. ALK重排阳性肺癌肿瘤细胞的显微镜下形态，图示为以3’-5’信号分离为主的形态（3A-3C）及单 个的3’信号形态（3D, 3E）。

20 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

切片作为参照，来帮助识 别肿瘤细胞。

细胞的分类：各种信号 形态 理论上，来自同一个基 因组区域的5' 和3'探针在 分子水平上的位置十分靠 近。因此，在正常细胞中 可以观察到这两个信号融 合、接触，或距离很近。 A B 图4. 不适合进行结果分析样本的显微镜下形态，原因是组织消化过 与此相反，当发生EML4 度（4A）或消化不足（4B）。 ALK基因融合时，ALK基因 5' 端的绿色信号远离ALK基 因的3' 端ALK红色信号（约 12.5MB ），这被看作为信 号分离。实际检测中，在 正常细胞中因为存在不同 程度的DNA折叠和三维结 构的排列，会导致3'端和5' 端的信号表现为分离，两 个信号之间出现或近或远 的距离。同样，因为EML4 A B 和ALK两个基因在染色体 图5. 不适合进行分析样本的显微镜下形态，原因是背景信号过强 上的位置很靠近，当发生 （5A）或信号成串（5B）。 基因重排时，两个信号之 间由于分开的距离太小可能被看作信号融合（图6）。此外，该基因组区域可能非常 不稳定，并且该同源区的一个探针可能会丢失，引起相对应的信号缺失。其结果是， 每一个肿瘤细胞都可以表现为5'-3'共存信号形态及5'或3'单一信号形态的多种组合。 尽管存在多种信号形态，根据细胞中每一种信号的数量和位置可以把细胞分为以下 四种类型。 融合（正常）形态（图7A）。当存在5' 和3' 的信号融合时，细胞被被判读为正常 形态（ALK阴性）（图2）。当分离的5'和3'信号之间的距离小于信号直径两倍时，也 被认为是融合信号。每个肿瘤细胞核中融合信号的数量与信号形态的分类无关。

21 第三章: 荧光原位杂交

分离（阳性）形态 SIGNAL CLASSIFICATION Patterns observed in native ALK Patterns observed in split 3'-5' ALK （图7B）。不管实际存 在的分离信号的数量， 只要存在5' 和3' 的信号 分离，细胞就被判读为 Red and green Red and green Red and green Red and green 分离形态（ALK阳性） separated by separated by separated by separated by ≥2 signal <2 signal <2 signal ≥2 signal （图3）。5' 和3' 信号 diameters diameters diameters diameters Classified Classified Classified Classified 之间的距离必须大于或 as negative as positive as positive as negative 等于最大信号直径的两 SPECIMEN CLASSIFICATION 倍（Camidge 2010）。 Nonrearranged tumors: Rearranged tumors: 单一的5' 和3' 的信号 Rearrangement-positive cell rate Rearrangement-positive cell rate <15% of cells ≥15% of cells 数目不需要相等，例如 图6. 使用ALK分离FISH杂交检测肺癌肿瘤细胞核中的信号形态。 细胞中有两个单一的5' 信号和三个单一的3' 信 号时，判读为信号分离。在细胞中 伴随存在的5'-3' 融合信号的数量与 Patterns Examples 信号形态的分类无关。单一3' 信号 （阳性）形（图7C）。 A. 当存在单一的3' 信号但是没有相应的 Fused 5' 信号时，细胞被解释为单一3' 信 号形态。当一个细胞中同时有单一的 3’ 和5' 信号且3' 信号多于5' 信号 时，正确的分类是分离形态，而不是 B. 单一3' 信号形态。伴随存在的融合信 Split 号的数量与信号形态分类无关。 单一5' 信号（阴性）形态（图 7D）。当存在单一5' 信号但没有单 一3' 信号时，细胞被解释为单一5' 信号形态。当一个细胞中同时有单 一的3' 和5' 信号且5' 信号多于3' 信 号时，正确的分类是分离形态，而不 是单一5' 信号形态。伴随存在的融合 信号的数量与信号形态分类无关 注释：这种分离形态的标准主要 是在使用Vysis LSI ALK分离FISH探针

C. Isolated 3' ALK

D. Isolated 5' ALK

图7. FISH检测中根据ALK信号形态对肿瘤细胞的分类。

22 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

试剂盒对FFPE肿瘤切片的检测中建立的，当使用不同的检测试剂或生物样本时要对这 一标准进行验证。在不同的探针设计中探针的大小可能不同，较大的探针会产生较大 的信号，这时需要一个更短的距离来定 义分离形态。 Fused 5' 3’ Cell

结果评估 当只有一位阅片者时至少要计数50 个肿瘤细胞。当有两位阅片者时至少 要计数100个肿瘤细胞（详见阳性诊断 标准部分）。当组织中含有的肿瘤细胞 数量低于这一最低要求时，标本不适合 进行FISH检测（Camidge 2010）。每一 个肿瘤细胞中的信号形态都应当记录在 一个计分表中（图8）。使用单一滤光 片（红色和绿色）和双色滤光片会使信 号计数更准确。使用采集的图像判读结 果存在局限性，图像必须要能体现切片 的厚度才能避免对分离信 号的错误判读（图9）。 NSCLC中常见ALK 基因拷贝数的增多 （图10），没有证据表明 它与蛋白质的过度表达有 关。目前，我们不建议把 ALK的拷贝数作为结果评 估的常规部分。

signal

signal

signal

Pattern

Cell 1

2

0

0

Fused

Cell 2

2

1

1

Split

Cell 3

2

0

1

Isolated 3'

Cell 4

1

1

0

Isolated 5'

Cell 5

0

1

2

Split

Cell 6

1

0

0

Fused

Cell 50

2

0

0

Fused

Summary of Scoring: Total # of cells scored: 50 Total # of cells with fused pattern: 19 Total # of cells with split pattern: 22 Total # of cells with isolated 3' pattern: 5 Total # of cells with isolated 5' pattern: 4 Total # of cells with rearrangement-positive patterns: 22+5=27 Rearrangement-positive cell rate: 27÷50 x100=54%

图8. 图例为细胞计分表.

注：采集图像中的信 16 planes at 0.4 µm= 号大小往往比荧光显微 A No z-stacking 6.4 µm z-stacking B 镜下实际观察到的信号 图9. 当z轴（多个聚焦平面图像合成为一个平面图像）不能代表切片的 稍大。当使用采集的图 整个厚度时，很难用采集的图像进行结果分析。 像评估结果时，信号之 间的距离可能被低估，这可能会影响结果判读。 图像采集常常把多个聚焦平面上的图像合成为一个平面图像，其结果是位于组织 平面的垂直z轴上两个分离的信号被看作一个融合信号。这是使用采集图像评估结果 的另一个缺点。

23 第三章: 荧光原位杂交

D

A

B

C

E

图10. NSCLC中常见ALK基因拷贝数增多，增多的数量从低（10A）到高（10B）。多个信号聚集在一起形 成的信号簇表示基因扩增（10D，10E）。拷贝数的增多不应该被解释为阳性结果。

标本分类：基因重排阳性细胞的比例 基因重排阳性细胞的比例定义如下： 基因重排阳性细胞的比例（％）= [（分离信号形态的细胞数 + 单一3' 信号分离形态的 细胞数）/计数的总细胞总数]×100 注：因为ALK酪氨酸激酶的激酶结构域是由该基因的3' 部分编码的，所以未成对的 3' 信号表明存在肿瘤相关的融合基因，而未成对的5’信号可能表示一个无功能的融合 基因。因此，除了含有分离信号的细胞归类为阳性细胞外，含有单一3' 信号的细胞也 归类为阳性细胞。含有单一5' 信号的细胞不应该被判读为重排阳性细胞。仅把分离形 态定义为重排，将单一3' 信号形态排除在重排定义之外时，FISH检测的敏感性降低到 60%-70% (Yoshida 2011a, Paik 2011)。

分界值 因为EML4 - ALK融合基因是由位于同一染色体内的相距很近的两个基因在染色体内 部倒置产生的，所以在分离FISH检测中，代表ALK基因重排的分离信号之间的距离通常 很小。由于细胞内的染色质凝集或物理结构分布等原因，有时在技术上无法把相距很 近的两个分离信号与融合信号区别开来（图6），这导致了ALK重排的NSCLC中，重排 阳性细胞的比例降低（40%-70%）(Perner 2008, Camidge 2010, Camidge 2012b)。另 外，在没有ALK重排的NSCLC中，一部分细胞也可以存在重排阳性的形态（即分离形 态或单一3' 信号形态）(Perner 2008, Camidge 2010, Yoshida 2011a)，切片引起的人为 染色体断开或不代表一个特定融合基因的随机性染色体改变（图6）都可能导致这一 现象。因为以上原因，重排阳性细胞的分布比率在非小细胞肺癌中是连续性的，并 且阳性细胞比率在ALK重排与野生型的两类非小细胞肺癌之间的差异是一个统计上的 问题。因此，必须进行准确定量的评估，才能得到最佳检测结果。设置阳性细胞比率 占15%作为分界值标准，能够把ALK重排(ALK阳性）和ALK 野生型（ALK阴性）的两类 非小细胞肺癌区分开来(Camidge 2010, Kwak 2010, Yoshida 2011a)。

24 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

为了最大限度地减少技术上的 1st Reader-50 tumor cells 偏差，我们建议采用两人两步评 分法（图11）。第一位阅片人计 <10% Positive >50% Positive 10%-50% Positive 数50个肿瘤细胞。当重排阳性细 Equivocal 胞的比例低于10% 时（即在50个 2nd Reader-50 tumor cells 细胞中重排细胞的数量少于5个） 1st + 2nd Readers-100 tumor cells 认为是阴性; 当重排阳性细胞的 比例大于50％时（即在50个细胞 <15% Positive ≥15% Positive 中重排细胞的数量大于25个）认 Specimen is Specimen is 为是阳性; 当重排阳性细胞的比 positive for ALK negative for ALK 例在10%-50%之间时（即在50个 rearrangement rearrangement 细胞中重排细胞的数量为5-25个 图11. 推荐的ALK FISH计数流程。 之间），认为是结果不明确，需 要进一步计数。对这类结果不明确病例，由第二位阅片人独立地再计数50个细胞， 将第一位和第二位阅片人计数的细胞加在一起来计算最终的重排阳性细胞比例。如 果最终的比例大于或等于15%，标本判读为ALK基因重排阳性; 如果最终的比例小于 15%，标本判读为ALK基因重排阴性。 注：以15％作为分界值主要是在使用Vysis LSI ALK分离FISH探针试剂盒（雅培分子, Abbott Molecular）进行的检测中建立起来的，当使用不同的试剂时需要对这一分界值 进行验证。

实验室验证 在检测应用于临床诊断之前，要在实验室中对ALK FISH检测进行正确地验证(Halling 2012, Saxe 2012)。结果的准确性—就是对正常（ALK阴性）和异常（ALK阳性）鉴别的 准确程度。结果的准确性要与其他实验室的准确性进行对比，要求参与对比的实验室 已有准确性验证；结果的准确性要和/或与自己实验室中以前已经通过验证的其他实 验方法的准确性进行对比。要求不同的技术人员和/或在不同的时间对同一个标本进 行检测，根据这些结果之间的一致性程度来验证结果的准确性或可重复性。全部分析 过程都要验证。要定期重复对准确性的验证。另外，应当用已知ALK结果的标本来验证 检测的敏感性和特异性。评估真正阳性的分离信号之间的距离（至少是信号直径的两 倍），必须以ALK野生型非小细胞肺癌和良性组织的检测为参考。使用商品化的试剂使 这些验证任务变得容易完成，当使用实验室自己研发的试剂时对细节程度的要求更高。

存在的问题 ALK分离FISH检测存在四个主要问题：假阴性，假阳性，不典型FISH信号，重排阳 性细胞的比例处于分界值附近及部分标本需要重复检测。

25 第三章: 荧光原位杂交

假阴性和假阳性结果

尽管分离FISH检测被作为诊断ALK阳性肺癌的标准方法，评估该检测方法真正的敏 感性和特异性还是存在困难。引起FISH检测和其他检测结果不一致的主要原因是技术 因素。然而，FISH可能产生真正的假阴性和假阳性结果，这会明显影响到疾病治疗方 案的选择。因为已经知道RT-PCR和IHC检测的敏感性不高，所以FISH的假阳性结果尤其 难以被发现。但是，临床结果表明在预测患者对ALK抑制剂的反应时，单纯使用FISH 方法的预测准确率低于FISH、IHC和RT-PCR三种方法联合检测。与临床不一致的病例 可能很少包括真正的FISH假阳性结果（Chihara 2011）。新技术，例如全基因组大规 模平行测序法可能会证明FISH检测存在假阳性结果。相比之下，文献中有报道少量的 FISH假阴性病例(Yoshida 2011a, Murakami 2012, Peled 2012)。在这类病例中，存在或 无不典型信号形态。引起假阴性FISH结果的基因组机制尚未完全阐明，但认为复杂的 基因重排和隐蔽的插入可能都是原因之一。 非典型信号

少数病例中（大约占病例的6%, Camidge 2013），FISH结果表现为不典型信号，这 些信号在细胞中既常见又足够特异易于识别。至少一部分这种信号形态与假阴性结果 有关。例如在一个病例中，大多数肿瘤细胞表现为以单一5' 信号为主的形态，同时有 少量细胞表现为分离信号或单一3' 信号（图12，以5' 为主的形态）。根据列举的常规 判定标准，单一5' 信号形态应当认为是ALK阴性，常常把这些病例错误归类为ALK重排 阴性。但是，有报道这种信号形态的的病例经过RT-PCT检测后，证实有EML4-ALK基因 融合转录（Yoshida 2011a）。 另一种不典型FISH 信号是所谓的双红色信 号，表现为一对3' 信号 与一个5' 信号融合在一起 （图13A）（Peled 2012）。 在含有双红色信号的 ALK阳性非小细胞肺癌 病例中，因为这一信号 簇与常规的融合信号很 像，可能会被错误地判 读为为ALK重排阴性。 A B 有时，可以出现3个或更 多的3' 信号簇与一个5' 信 图12. 肺癌的FISH分离检测中一例以单一5' 信号为主的不典型形态。箭 头所示为单一的绿色信号（5' ALK）。 号融合（根据红色信号 的数量称为三红信号形态等，图13B, 13C）。在另外一些罕见的ALK阳性非小细胞肺 癌中，多数肿瘤细胞中只有单一3' 信号，没有正常的ALK基因信号（图13D）。依据常

26 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

规标准，认为有 这种信号形态的 细胞是不能进行 判读的，因为有 B 可能是5' 探针杂 交失败引起的， 所以这种ALK阳 性的肿瘤可能被 漏诊。尽管目前 A C D 还不清楚这类不 图 13. 肺癌分离FISH检测中的不典型信号. 13A: 3'-5-3' （双红信号形态）; 13B 典型信号与基因 和 13C: 3'-3'-5'-3'（三红信号形态）; 13D: 单一3' 信号(大多数时不伴有正常ALK信 融合一致性的比 号)。箭头指示为ALK重排。 例有多少，至少 出现这类信号时提示高度可疑重排，应该用其他诊断方法（例如RT-PCR, IHC）进一步 检测。未来的研究中可能会发现与假阴性FISH结果相关的其他非典型信号。 重排阳性细胞处于分界值的比例

在大约8%的非小细胞肺癌中，重排阳性细胞的比例在10-20%之间（Camidge 2013）。 尽管在技术上使用目前被接受的15%分界值标准可以把这些病例归为ALK重排阳性或阴 性。这些FISH检测重排信号处于分界值附近的病例，是否准确地代表了融合基因的存 在，对此我们的经验是有限的。我们建议对这些样本重复仔细阅片，尤其要注意鉴别 肿瘤与非肿瘤细胞。计数中包括非肿瘤细胞时，会稀释重排阳性细胞的比例。使用推 荐的两步评分法可以尽量减少这些技术性错误。同样要注意的是，与组织平面垂直的z 轴方向上的分离信号可能会被误认为是融合信号。因为采集的数字化图像是把多个聚 焦平面上的图像合成为一个平面图像（z轴堆叠），当实验室使用采集图像进行评估结 果时，尤其会产生这一错误。 这些处于分界值附近的病例也可能含有如前所述的不典型信号。特别是，双红色信 号可能是造成重排阳性细胞处于分界值附件的重要原因。当两个信号相距很近时，使 用双色（红色和绿色）或三色（蓝色、红色和绿色）滤光片观察可能会误认为是融合 信号，使用单色滤光片分析有助于辨别这类信号。如果经过仔细再次评估后重排阳性 细胞的比例仍然处于分界值附近，根据15%分界值标准可以将病例最终结果解释为阳 性或阴性，同时添加一个建议使用IHC或RT-PCR等其他诊断方法进一步检测的警示性 注解。 再次检测的需要

几个发表的研究结果表明，在临床ALK抑制剂治疗后，包括ALK基因拷贝数增多在 内的ALK基因状态会发生改变（Doebele2012）。尽管这种改变的确切机制和发生率

27 第三章: 荧光原位杂交

尚不清楚，在ALK抑制剂治疗后肿瘤表现为获得性耐药时，必须要选择一种新的治疗 方案，此时应考虑再次检测。但是，这些数据仍然不充分，还需要进一步的研究和 验证。

显色原位杂交（ CISH ） FISH有一定局限性，其中包括需要高度专业化的设备，染色切片经过长期保存后不 可避免的信号衰退，和可能掩盖组织结构和细胞形态学的暗视野阅片。最后一个因素 尤其重要，因为肺癌组织往往表现为肿瘤细胞与非肿瘤细胞混杂在一起的复杂生长模 式，在没有组织结构或细胞浆信息的情况下要鉴别肿瘤细胞与非肿瘤细胞是十分困难 的。新发展起来的CISH方法能够克服FISH的这些缺点。对CISH来说，每一个杂交探针 是用染料来显色，而不是由荧光标记来显现（图14）。CISH检测保留了完好的组织 结构和细胞形态，在常规光学显微镜下就能观察特异的基因改变。已经对ALK分离探 针的CISH检测结果进行了评估，所有的相关研究都证明其结果与FISH和RT-PCR结果有 非常好的一致性（Kim 2011, Yoshida 2011a, Nitta 2013, Schildhaus 2013）。在肺癌的 ALK重排检测中，CISH结果仍然需要进行验证，并且在几个研究中使用了不同的分界 值（15%和20%）和评分标准（一个信号直径间距与两个信号直径间距）。

Substrate

Chromogenic reaction

Enzyme

Primary antibody

Secondary antibody Probe Target DNA

图14. 左图，CISH的原理；用不同的半抗原分别标记每一种探针，半抗原与抗体反应后显色，与IHC相 似。ALK分离CISH方法检测的ALK阳性的肿瘤细胞（右图）。黑点代表正常的ALK基因，红色和蓝色信号 分离代表ALK基因重排。

结论 在NSCLC中，ALK分离FISH检测是一种可信的诊断ALK重排的方法，并且已经作为 选择接受ALK抑制剂治疗的患者的标准方法。然而，FISH检测的准确性很大程度上依 赖于小心的标本前期处理及严格遵守操作准则情况下的结果判读。而且，FISH检测也

28 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

可以产生意义不明确的结果，甚至是错误的结果。象任何其他的临床检测一样，ALK分 离FISH有独特的优势和局限性，使用中应当结合适当的诊断背景。在将这一方法作为 新项目引进入实验室作为常规检测之前，强烈建议实验室使用已知阳性的对照组织进 行内部验证。另外，实验室应当定期参加与其他已认证实验室之间的交换切片检测活 动，或参加由获得批准的供应商提供的检测准确性调查。

第四章 免疫组化(IHC) 编者 Erik Thunnissen, Sylvie Lantuéjoul, Jin-Haeng Chung, Keith Kerr, Fred R. Hirsch, Ming Sound Tsao, and Yasushi Yatabe

作为筛查工具的ALK IHC 分子靶向治疗极其依靠经过验证的实验来检测相应的分子改变，尤其是当这种分子 改变只存在于小部分患者中时。ALK IHC检测因为是在可以观察组织结构和细胞形态的 明视野下判读结果而受到病理医生的欢迎，并且检测快速且费用相对便宜，使该方法 在应用中很有发展前景。 IHC检测需要的恶性细胞数量可能比FISH少。IHC可以成功 检测多种不同类型的肿瘤标本；对FFPE组织块、体液和FNA细胞包埋块或涂片标本来 说，只要样本中含有几簇肿瘤细胞就可以进行IHC检测。另外，因为NSCLC中ALK重排 的病例比例较低，需要一种经济的筛查方法（Soda 2007, Koivunen 2008, Perner 2008, Takeuchi 2008, Palmer 2009）。

ALK免疫组化中的问题 将ALK IHC检测作为筛查 方法，重要的是要标准化 操作流程和建立结果评判标 准。ALK阳性肺癌的肿瘤细 胞通常表达异常ALK基因的 蛋白质产物（图1和图2）。 ALK的细胞内酪氨酸激酶结 构域与各种伙伴基因（ N端）截断的蛋白质部分形 成融合蛋白质，使ALK激 酶活性增加（Morris 1994, Allouche 2007）。然而，用 于诊断间变性大细胞淋巴瘤 （ALCL）的ALK1抗体，却 很难检测到NSCLC中的ALK 融合蛋白质，原因是NSCLC

A

C

B

D

图1. 一例ALK强阳性的腺癌。A和B: H&E染色切片，低倍镜下形态 （A）和放大10倍的形态（B）。B中的插图放大40倍。未见印戒细 胞。C和D: 使用5A4抗体的ALK IHC, 细胞浆中的ALK基因产物强染色 （放大倍数，C: 0倍，D: 40倍）。

30 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

A

B

图2. 一例ALK强阳性的腺癌。A: H & E染色切片。B: 使用D5F3抗体及酪胺放大法的ALK IHC，细胞浆 中的ALK基因产物强染色（放大40倍）。

中 ALK蛋白质的表达水平一般较低（Mino-Kenudson 2010）。为了克服这个问题，采 用了几个技术步骤，包括抗原修复、使用更高亲和力的一抗及更高的抗体浓度、更强的 信号增强系统（例如，用酪酰胺级联和抗体 - 增强的聚合物）及研发新抗体（表1）。 表1 已有的检测ALK蛋白质表达的商品化抗体 克隆

克隆类型

抗体类型

免疫原

ALK1

单克隆鼠抗

IgG3, kappa

5A4

单克隆鼠抗

IgG1

D5F3

单克隆兔抗

无

人类ALK蛋白质的羧基端

Anti-ALK

单克隆兔抗

IgG

代表位于人类ALK蛋白质426-528位置氨基酸的重组蛋白

人类ALK全长蛋白质的位于1359-1460的氨基酸，对应于 NPM-ALK嵌合蛋白质的位于419-520的氨基酸 NPM-ALK转录的C端(位于419-520的氨基酸)

ALK IHC检测肺癌标本的另一个重要问题是组织缺乏内在的免疫染色阳性对照， 所以 难以判断阴性IHC结果是否是真正的ALK融合蛋白阴性表达。但因为正常肺组织不表达 ALK，肺癌细胞中ALK蛋白的弥漫阳性总是与异常的ALK融合蛋白表达相关（Takamochi 2013, Takeuchi 2013）。在优化染色条件时，可以用ALK重排的细胞株（H3122-变异体 1和H2228-变异体3）制作石蜡包埋细胞块作为阳性对照，但是要考虑到组织切片和细 胞株包埋块之间的差异，特别是ALK免疫组化组织具有较低的抗原表位浓度（图3）。

组织的固定和切片 染色前的步骤与其他免疫组化的程序相同。无论是诊断性活检组织还是手术标本 都应在离体后马上浸泡于足够量（固定液体积大于10倍标本体积）的含有缓冲液的10 ％中性福尔马林中固定，并用石蜡包埋（ FFPE）。为了避免组织冷缺血的影响，必须 尽快固定标本。不建议固定时间少于6小时，因为常规的染色以及IHC都会受到不利影 响。IHC检测的蛋白质的抗原性主要存在于抗原表位，有些表位可以在固定时间长达120

31 第四章: 免疫组化

免疫组化染色

20

Intensity (A.U.)

小时后依然不被破坏。为了 实用的目的，建议所有标本 的固定时间在6-48小时。经 过石蜡包埋后的肿瘤组织性 质稳定，能够抗氧化或其他 退变。但是，一旦FFPE组织 块被切成3-4微米厚的切片， 这些玻片上的组织在室温下 的保存时间最长是6周。如 切片保存在较低温度环境， 可以保存更长时间。但是， 对切片时间超过6周的组织染 色结果判读时要十分小心， 因为可能存在假阴性。

10

0 1

10

80

Epitope Concentration 图3. IHC中低效能（蓝色曲线）和高效能（红色曲线）的信号增 强系统。需要注意的是，抗原低浓度的病例使用高效能信号增强 系统表现为阳性（细箭头），但使用低效能信号增强系统时表现 为阴性。另外，染色的强度较高时会达到平台状态；一旦阳性， 更高的抗原浓度不会导致更深的染色。在ALK IHC中，淋巴瘤的抗 原浓度（粗箭头）高于NSCLC的抗原浓度（细箭头），使用低效能 信号增强系统就足够了。在NSCLC中，需要使用高浓度的高亲和力 抗体及高效能增强系统。抗原浓度与染色强度的关系存在一个对 数关系和线性关系（AU =任意单位）。引用自 Prinsen CF, Klaassen CH, Thunnissen FB. Microarray as a model for quantitative visualization chemistry. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2003;11:168-173.

对于分析过程来说，即实 际的ALK IHC检测中，有几个 问题需要加以控制和优化： 抗原修复，抗体的类型和浓度，孵育时间，孵育温度，以及信号增强系统。 在非小细胞肺癌ALK免疫组化的研究中，目前还没有统一的技术、或操作规范。相 反的是，各实验室使用的抗体类型或来源、抗原修复和抗体检测程序、信号增强技术 等都不同（表2）。当使用ADVANCE系统（Dako公司）来逐一比较不同抗体时，发现 D5F3（Cell Signaling Technology公司）和5A4（Novocastra）两个抗体都比ALK1抗体 （Dako公司）更敏感和更特异（图4）（Conklin 2013）。（见第六章对各种不同操 作的讨论）。目前正在研发和验证商品化的ALK免疫组化试剂盒。 利用几种信号增强系统能提高ALK融合蛋白检测的灵敏度（图5）（Rodig 2009, Sakairi 2010, McLeer-Florin 2012）。使用商品化的IHC试剂盒进行全自动免疫组化染 色，可以使染色过程标准化。通过自动染色机实现的操作标准化能得到更一致的染色 结果，但有时因为检测中需要更高的一抗浓度使检测费用增加。最近研发出一种更敏 感的检测新方法，是利用半抗原（3-羟基-2-喹喔啉; HQ）与酪胺结合的信号增强系统 （Nitta 2013）。使用这一HQ-酪胺IHC检测系统，所有的肿瘤细胞尽管染色强度不同但 都表现为阳性，这表明有些方法中的染色异质性是检测阈值的问题。并且，高敏感的 IHC及明视野的分离原位杂交两种方法联合进行基因-蛋白检测证实了这一推测。

染色结果的评估 染色结束后在显微镜下对切片进行结果评估。在NSCLC中， ALK显色在细胞浆中；

32 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

表2. 部分已发表研究中的免疫组化染色试验条件，这些研究都使用了商品化的ALK抗体，但是没有使 用商品化试剂盒。 研究

研究

抗原修复

稀释比例

抗体孵育时间

检测系统

Yi et al., 2011

ALK1

EDTA, pH 8.0, PT Link 30 分钟

1:100

室温30分钟

ADVANCE

Mino-Kenudson et al., 2010

ALK1

过夜

EnVision+

D5F3

1:2 EDTA, pH 8.0, 高压锅

1:100

Minca et al., 2013a

D5F3

BenchMark XT, 加热

1:100

无特殊

OptiView

Martinez et al., 2013

D5F3

BenchMark XT, 标准流程

1:50

37ºC 16分钟

ultraView

Paik et al., 2011

5A4

CC1 溶液, 100ºC, 20 分钟

1:30

42ºC 2小时

iVIEW

Hofman et al., 2011

5A4

目标修复液 pH 9.0, 97°C, 40 分钟

1:50

室温30分钟

EnVision FLEX

McLeer-Florin et al., 2012

5A4

含有EDTA 的 CC1 溶液, pH 8.4, 1 小时

1:50

37ºC 2小时

Amplification Kit

Kim et al., 2011

5A4

CC1 溶液, 100°C, 20 分钟

1:30

42ºC 2小时

iVIEW

Sholl et al., 2013

5A4

柠檬酸溶液, pH 6.0, 高压 锅,122ºC, 30-45 分钟

1:50

室温40分钟

EnVision FLEX+

Wong et al., 2009

Anti-ALK

柠檬酸溶液, pH 6.0, 微波炉, 95ºC, 30 分钟

1:1000

4ºC 过夜

链亲和素-生物素化 辣根过氧化物酶 复合物

Chen et al., 2012

Anti-ALK

CC1 溶液, 95ºC, 30 分钟

1:500

室温过夜

ultraView

抗体：ALK1是Dako公司的产品;；D5F3是Cell Signaling Technology公司的产品；Paik等、 Kim 等及 Sholl 等的研究中使用的5A4是Novocastra 公司的产品，Hofman 等 和McLeer-Florin 等的研究中使用的5A4是Abcam公司的产品，抗ALK是Invitroge Life Technologies Corporation公司 的产品。抗原修复：PT Link和目标修复液是Dako公司的产品，BenchMark XT是Ventana Medical Systems, Inc的产品。检测系统：ADVANCE, EnVision+, and EnVision FLEX+是Dako公司的产品。OptiView（DAB试剂盒）、Ultraview（ DAB试剂盒）、iVIEW（DAB试剂盒）和扩增试剂 盒是公Ventana Medical Systems, Inc司的产品。

Clone ALK1

Clone D5F3 图4. 使用ALK1和 D5F3两种抗 体对同一个组织进行ALK IHC， 染色强度明显不同

33 第四章: 免疫组化

染色可以呈颗粒状，在有些病例中见细胞膜染色。对染色强度的评估有主观性，但是 建立了一种评分方法，在不同分辨率逐级放大倍数的显微镜物镜下观察，对不同染色 强度进行分级，这一方法首先在HER2检测中应用（Ruschoff 2012）。这种方法提高 了不同阅片者对染色强度评分的一致性。2倍或4倍物镜下清晰可见的染色为强阳性 （ 3 + ）; 10倍或20倍物镜下 Regular Polymer Method Linker-Polymer Method 清晰可见的染色为中度阳性 （ 2 + ）; 40倍物镜下才能看 到的染色为弱阳性（ 1 + ） 。经典H-评分法是阳性肿 瘤细胞百分比乘以强度染色 （0，1，2，或3）计算出来 的，分值范围为0-300。这 种方法更多地考虑了组织 内不同区域染色的异质性。 Polymer with Primary antibody secondary antibodies 在不同研究中使用了不 !"#$%"&'%()*+,&' Antigens Linker 同的ALK阳性和阴性结果的 判定标准。一些作者把染色 图5. 常规聚合物反应和多级连接聚合物反应的示意图 强度分为1+到3+（图6）， 区分1+或2+的标准比较模糊不清，这种方法得到的染色分级结果主要与使用的信号 增强系统和一些抗体的染色背景有关（Mino-Kenudson 2010, Conklin 2013）。其他 作者使用一种更简单的阳性标准，把大于10%的肿瘤细胞染色定义为ALK阳性表达 （Rodig 2009, Mino-Kenudson 2010, McLeer-Florin 2012, Martinez 2013, Sholl 2013）。

3+

2+

1+

0

图6. ALK IHC 染色强度0-3+ 级评分的图例

34 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

然而最近Takeuchi发现，应用5A4抗体及插入抗体增强聚合物（iAEP）方法对300多 例ALK阳性的肺癌进行IHC检测，几乎全部的肿瘤细胞都着色（Takeuchi 2013）。 肿瘤细胞着色的一致性表明在ALK重排肺癌中，所有的肿瘤细胞都有ALK基因的重排。 目前大多数出版物都建议在没有获得更多有关假阳性的研究结果之前，使用高通量ALK IHC方法筛查的阳性病例，病理医生应当用FISH检测进行验证。但是，渐渐发现有IHC 结果阳性FISH结果阴性的病人对克唑替尼治疗敏感（Peled 2012）。 另一个要考虑的问题是，ALK免疫组化结果在不同的实验室和病理医生之间的可重 复性。在撰写本手册时，正在进行两项有关IHC操作流程验证的研究。其中一项研究 中，使用Ventana ALK IHC试剂盒（Ventana Medical Systems公司）进行IHC检测，染 色结果由七位国际病理学家进行判读，比较他们之间的一致性；采用Ventana标准操 作流程和二元分类法，阅片者之间的阳性和阴性结果一致性达到了95%和97%（Hirsch 2013）。另一项研究是采用欧洲胸部肿瘤研究平台（ETOP）操作流程，使用5A4抗体 （Novocastra）（Thunnissen 2012c），由12个实验室使用同样的操作程序对同一组肿 瘤样本进行人工或自动染色机染色（更多信息详见第九章有关标准化的研究）。

ALK免疫组化的实际操作 病理医师应熟知各种可能导致假阳性结果的人工假象：肺泡腔内的巨噬细胞胞浆内 含有色素的吞噬颗粒（图7），神经来源的细胞（神经和神经节细胞），腺上皮染色， 细胞外黏液和肿瘤坏死区域。正常肺实质中很少见背景染色，但是也存在一些染色陷 阱（表3）。 在某些情况下肿瘤没有ALK重排但有ALK蛋白质表达增高，这时IHC结果阳性，FISH 检测阴性（或不典型）（图8）（也见第3章）。另外，有报道存在基因扩增但无ALK

A

B

C

D

图7. 使用D5F3抗体进行IHC 中的非特异性染色。A: ALK 阴性肿瘤的边缘区，肺泡内 的巨噬细胞。B: 肺结节针吸 细胞学包埋块切片，肺泡腔 内的巨噬细胞胞浆含有色素 吞噬颗粒,可能导致结果判 读为假阳性。腺癌的细胞块 （C）和活检（D）细胞中见 斑点状染色，FISH结果为ALK 重排阴性。

35 第四章: 免疫组化

蛋白质表达的情况（Pelosi 2012,Salido 2011） 。 例 如，Pelosi等报道在一组肉瘤 样癌中，有ALK基因扩增，但 使用两种不同的抗体都没有检 测到ALK蛋白质表达。与蛋白 表达相关的ALK基因拷贝数增 加的临床意义有待进一步阐明 （Salido 2011, Kim 2013）。 组织学上，要小心解释含有 粘液的细胞如印戒细胞的ALK免 疫组化染色。ALK免疫组化中， 细胞内的粘液空泡可能会掩盖 较弱的细胞膜染色（图9）， 使印戒细胞中的阳性染色较难 被观察到（Rodig2009, Yoshida 2011b, Popat 2012）。 一些研究人员观察到在FISH 阴性的肺癌中有时存在细胞膜 染色，尤其是在细胞的腔缘 部位（Murakami2012, MinoKenudson [个人通信]）。这 一现象不仅见于肿瘤细胞，也 见于一些非肿瘤细胞，如反应 性II型肺泡上皮细胞。此外，一 些神经内分泌癌也存在阳性反 应（Murakami 2012, Nakamura 2013）。 在一些肿瘤中存在染色的 异质性，特别是在手术标本中 （图10）；但是，如果控制好 标本前期的处理，大多数肿瘤 细胞染色会表现出均一性，与 FISH ALK基因重排检测中肿瘤 细胞染色的均一性相同。染色 的异质性可能与固定的异质性 相关，似乎与组织类型的不同

表3. 免疫组化结果中潜在的陷阱 产生粘液的 细胞

细胞浆内因为充满粘液导致ALK蛋白质缺乏，导致 阴性染色或较弱的细胞膜染色，判读为假阴性

细胞膜染色

偶尔可见非特异性细胞膜染色，尤其是在腔缘部 位。这一现象不仅见于肿瘤细胞，也见于正常的 肺泡细胞

神经内分泌 细胞

部分鳞状细胞癌，大细胞神经内分泌癌，和正常的 神经节细胞表现为阳性反应

非特异性粘液 染色

因使用的信号增强系统而不同，有时会有细胞外粘 液、肺泡巨噬细胞和支气管细胞的细胞浆染色的 背景反应

A

B

图8. 一例病例ALK蛋白质表达（左图）伴有FISH不典型信号 （右图：弥漫的单一绿色信号）。

A

B

C

D

图9. 一例含有多种组织形态及不同染色强度的病例。H＆E染色 显示（A）一个有许多印戒细胞的区域和（B）一个实性形态伴有 少量印戒细胞的区域。 ALK 5A4免疫组化显示（C）少量细胞浆边 缘弱染色（+1）和（D）强染色（+2/+3）（放大倍数，40倍）。

36 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

无关。在活检标本中，延迟固定不影响ALK蛋白质的敏感性。但是当使用存档标本制 作组织芯片进行ALK筛查时，延迟固定对ALK蛋白质敏感性的影响可能会是一个问题。 有报告核旁点状阳性是KIF5B-ALK重排的典型表现，这一表现可能需要进一步的确认（ 图11）（Takeuchi 2009）。

图10. 一例ALK阳性肿瘤中存在染色强度的异质性。左图中的方框对应于右图。印戒细胞癌 成分是阴性染色的潜在陷阱。

A

B

C

D

图11. KIF5B–ALK重排的腺癌中免疫组化染色的特殊表现，呈现为高尔基体区域 强染色（A: H&E染色，B: ALK染色）和核周晕（C: H&E染色，D: ALK染色）。图中 线条长度= 100微米。图片来自Takeuchi K等。KIF5B-ALK, a novel fusion oncokinase identified by an IHC-based diagnostic system for ALK-positive lung cancer. Clin Cancer Res. 2009;15:3143-3149.

37 第四章: 免疫组化

结论 目前正在进行对ALK免疫组化方法的验证和标准化。在非小细胞肺癌ALK重排检测 中，免疫组化方法因其高性价比被认为是一种有前途的临床检测工具。欧洲、日本和亚 洲的学术组织都已经推荐使用这一检测方法。在美国，目前在非小细胞肺癌治疗中， 患者要有ALK FISH阳性结果支持才能接受ALK抑制剂治疗，对ALK免疫组化阳性的病例 仍然需要ALK FISH检测来验证结果后才能接受ALK抑制剂治疗。然而，在不久的将来， 免疫组化检测可能会被美国FDA批准，ALK免疫组化阳性的患者也将被同意接受ALK抑 制剂治疗。在欧洲ALK阳性肺癌检测中，不限制使用除ALK FISH检测之外的其他方法。

第五章 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和多基因检测 编者 Yasushi Yatabe, Kengo Takeuchi, and Ignacio Wistuba

PCR方法在临床上是可行的，例如在非小细胞肺癌EGFR突变检测中，大多数检测都 使用了这一技术。然而，反转录酶（RT）-PCR因为需要临床实践中很难获得的高质量 RNA, 所以主要应用于血液系统恶性肿瘤的检测。事实上，在美国病理医师协会/国际 肺癌研究协会/分子病理学协会的指南中，不推荐使用RT-PCR方法来筛选接受ALK抑制 剂的肺癌患者。因为RT-PCR检测存在假阴性的风险，并且使用福尔马林固定石蜡包埋组 织进行RNA检测有较高的失败率。然而，RT-PCR检测能够提供有关ALK融合方式的最丰 富最详细的信息。此外，使用一些最近开发的技术检测临床样品具有较高的成功率。

RT-PCR EML4-ALK融合中包含许多种融合变异体。ALK的断裂点通常位于5’ 末端的20号外 显子（ENST00000389048）前面的位置，该处是激酶结构域起始处。这一恒定的断裂点 也见于其他ALK易位的肿瘤中，如淋巴瘤和肉瘤。相比之下，EML4的断裂点可见于多 个外显子中。在首先发现2种融合变异体后(Soda 2007)，又发现了13种变异体及3个融 合伙伴基因（图1）。在六种最常见的EML4-ALK融合变异体中，EML4和ALK的外显子 直接以框架方式融合，没有任何插入或缺失。在EML4-ALK融合的肺癌中，三种主要的 变异体（v1: E13;A20,v2: E20;A20, 和v3: E6;A20）占90%以上。在次要变异体中，E2;A20 (v5) 和 E18;A20 (v5')占EML4-ALK融合肺癌的1-2%（Takeuchi 2008, Wong 2009）。在 肠癌中发现了E21;A20融合变异体，但肺癌中尚未发现该变异体（Lin 2009）。 在RT-PCR检测需要的肿瘤细胞数量上，新鲜或快速冷冻的肿瘤样本比其他样本有 更高的敏感性。然而，只有当融合模式在引物对可检测的范围内时，该检测方法才 高度敏感。为了检测所有可能的EML4 -ALK变异体，应尽量全面地设计引物（表1）， 但是全面的引物也可能检测不到引物退火部位缺失的不规则变异体。此外，专门为 检测EML4 –ALK基因融合而设计的 RT-PCR检测系统无法检测到ALK与其他伙伴基因的 融合，如驱动蛋白家族成员5B （KIF5B）和驱动蛋白轻链1（KLC1）（Takeuchi 2009, Togashi 2012）。为了克服这一局限性，设计了针对其他融合伙伴基因的引物，可同 时实现单管RT-PCR法检测EML4-ALK, KIF5B-ALK （图2）及与ret原癌基因（RET）的融 合（Takeuchi 2012）。尽管做了这些努力，仍然不能检测与未知伙伴基因的融合。

39 第五章: 反转录聚合酶链反应 和多基因检测

ALK

e20 e14

EML4-ALK (E14;del49A20), v4

EML4-ALK (E18;A20), v5' KIF5B-ALK (K24;A20) KIF5B-ALK (K15;A20)

del49e20

e2

EML4-ALK (E2;A20), v5

EML4-ALK (E15del19;del20A20), v4'

e20

e6

EML4-ALK (E6;A20), v3

EML4-ALK (E14;del14A20), v7

e20

e20

EML4-ALK (E20;A20), v2

EML4-ALK (E13;ins69A20), v6

e20

e13

EML4-ALK (E13;A20), v1

e20

e13

ins69e20 e14 e15del19

del14e20

e18 del20e20 e20

e24 e15 e17

e20 e20

KIF5B-ALK (K17;A20) KLC1-ALK (K9;A20)

e20 e9 e20

图1. 肺癌中的野生型ALK和各种类型的融合ALK: EML4-ALK的5种常见变异体（v1, v2, v3, v5, 和v5'）和4种少见变异体（v4, v6, v7和v4'），KIF5B-ALK和KLC1-ALK的三种变异体。融 合伙伴基因（EML4, KIF5B和KLC1）的深色区代表卷曲螺旋结构域，ALK中的深色区代表 跨膜结构域（橙色）和激酶结构域（红色）。

因此，不建议使用RT-PCR方法来筛查适合接受ALK抑制剂治疗的患者。从另一个角度 看，ALK抑制剂的治疗效果可能会因融合伙伴基因和/或融合变异体的不同而不同， 正如一些研究结果显示，L858R点突变和EGFR外显子19缺失影响了EGFR TKIs在体外实 验和临床治疗的转化活性。如果在ALK阳性肺癌中发现不同融合模式与临床治疗有相 关性，那么使用RT-PCR法可能会对患者有益。 RT-PCR能够并且最适合检测那些不能制作组织蜡块的标本，如支气管灌洗液、痰 液、血液、体腔积液和其他体液（Soda 2012）。对那些已经明确有ALK重排的患者 来说，RT-PCR检测液体样本中的无细胞RNA或循环肿瘤细胞是一种有效、微创的监测 疾病进展情况的工具。然而，由于往往难以确认液体样本中是否含有肿瘤细胞（或肿 瘤来源的RNA），当样本中没有肿瘤细胞时会被误诊为ALK重排阴性。原则上，当液体 样本用于患者的首次重排筛查时，只有在确认样本中含有肿瘤细胞后才应进行检测， 但这种情况下RT-PCR的高敏感性不再具有优势。

比较定量RT-PCR 因为正常肺组织不表达ALK蛋白，所以IHC可以用来检测ALK重排；肺癌中IHC阳性

40 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

图1.检测EML4-ALK 的RT-PCR 研究

是否适合检测常见的 EML4-ALK融合变异体 主要变异体*

样本类型

引物对的数量

次要变异体*

E13;A20

E20;A20

E6;A20

E2;A20

E18;A20

E21;A20

Soda et al., 2007

是

是

否

否

是

是

冷冻标本

2

Inamura et al., 2008

是

是

否

否

是

是

冷冻标本

2

Shinmura et al., 2008

是

是

否

否

是

是

冷冻标本

3

Takeuchi et al., 2008

是

是

是

是

是

是

冷冻标本

3

Martelli et al., 2009

是

是

是

否

是

是

冷冻标本

3

Takeuchi et al., 2009

是

是

是

是

是

是

冷冻标本

(包括2对KIF5B-ALK的 引物)

Wong et al., 2009

是

是

是

否

是

是

冷冻标本

4

Takahashi et al., 2010

是

是

是

是

是

是

冷冻标本

3

Sun Y et al., 2010

是

是

是

是

是

是

冷冻标本

4

Sanders et al., 2011

是

是

是

是

是

是

福尔马林固 定石蜡包埋 标本

23

Takeuchi et al., 2012

是

是

是

是

是

是

冷冻标本

(包括KIF5B-ALK 和 RET f融合的3对引物)

Shaozhang et al., 2012

是

是

是

是

是

是

冷冻标本

4

Soda et al., 2012

是

是

是

是

是

是

冷冻标本

(包括4对KIF5B-ALK的 引物)

5

6

9

*在EML4-ALK融合的肺癌中，主要变异体占90%以上；次要变异体占1-2%。

总是表明ALK异常表达，重排是ALK异常表达最常见的原因。这一原理同样适用于ALK 转录子的表达。ALK断裂点恒定位于保留嵌合转录子的致癌激酶结构域（外显子20） 的前面。因此，当ALK与EML4或其他基因融合时，ALK的3' 和5' 区的转录子是不同的 （图3）。 在这一原理基础上，外显子阵列已经用于检测常见的融合模式和鉴定新的EML4ALK变异体（Lin 2009）。研究也使用实时PCR技术（Wang R 2012a, Wang R 2012b）。 最近开始使用纳米检测（纳米技术）来分析ALK融合基因（Lira 2013）及ROS1和 RET（Suehara 2012）。

41 第五章: 反转录聚合酶链反应 和多基因检测

EML4 72F; 5'-GTCAGCTCTTGAGTCACGAGTT-3' (EML4 exon 2, forward) !"#$(2-H,(3 %DBC&DCBCBBD&DBC&CD&DBB%+ ()!"#$(;EF>(-0(KFGLMG:/( Fusion-RT-S; 5'-GTGCAGTGTTTAGCATTCTTGGGG-3' (EML4 exon 13, forward), HI?=F>%AB%J,(3 %DBDC&DBDBBB&DC&BBCBBDDDD%+ ()!"#$(;EF>(*+0(KFGLMG:/0(( &#'(+.26AA0(3 %&BCC&DBBCDBCCBDBBC&D&DC%+ ()&#'(;EF>(-.0(G;1;G?;/( ALK 3078RR, 5'-ATCCAGTTCGTCCTGTTCAGAGC-3' (ALK exon 20, reverse)

EML4 72F/ !"#$(2-HN( &#'(+.26AA( ALK 3078RR

Fusion RT-S/ HI?=F>(AB%JN( &#'(+.26AA( ALK 3078RR

!"#$%&#'()!*+,&-./0(1* EML4-ALK (E13;A20), v1 EML4-ALK (E20;A20), v2 !"#$%&#'()!-.,&-./0(1-

(1,735bp) ()*02+345/

(($+-45(432bp

(2,488bp) ()-0$6645/

1,185bp (*0*6345(

EML4-ALK (E6;A20), v3 !"#$%&#'()!7,&-./0(1+

913bp*, 946bp* (8*+4590(8$7459(

EML4-ALK (E14;del49A20), v4 !"#$%&#'()!*$,:;<$8&-./0(1$

(1,849bp) ()*06$845/

EML4-ALK (E2;A20), v5 !"#$%&#'()!-,&-./0(13

($3$45(454bp

EML4-ALK (E13;ins69A20), v6 !"#$%&#'()!*+,=>?78&-./0(17

(1,804bp) ()*06.$45/

(3.*45(501bp

!"#$%&#'()!*$,:;<*$&-./0(12 EML4-ALK (E14;del14A20), v7

(3$745(546bp

()*062+45/ (1,873bp)

(32.45(570bp

!"#$%&#'()!*3:;<*8,:;<-.&-./0(1$@( EML4-ALK (E15del19;del20A20), ()+02+-45/ v4' (3,732bp)

(32845(579bp

!"#$%&#'()!*6,&-./0(13@ EML4-ALK (E18;A20), v5'

(88845(999bp

()-0+.-45/ (2,302bp)

KIF5B867F/ 'OH3P672HN( ALK 3078RR &#'(+.26AA(

KIF5B867F 5'-ATTAGGTGGCAACTGTAGAACC-3' (exon 10) 'OH3P672H(3@%&BB&DDBDDC&&CBDB&D&&CC%+@(();EF>(*./( KIF5B2533F'OH3P-3++H((3@%DBDC&C&&&C&DBBDDB&CDBD%+@()!EF>(-+%-$(4FI>:MGQ/( 5'-GTGCACAAACAGTTGGTACGTG-3' (Exon 23-24 boundary)

KIF5B2533F/

'OH3P-3++HN( ALK 3078RR &#'(+.26AA(

'OH3P%&#'()'-$,&-./ KIF5B-ALK (K24;A20)

(3$745546bp

()+07.+45/(( (3,603bp)

'OH3P%&#'()'*3,&-./ KIF5B-ALK (K15;A20)

(

(*0*2745(( 1,176bp

'OH3P%&#'()'*2,&-./ KIF5B-ALK (K17;A20)

(

(*0$6+45( 1,483bp

9(BR;(M?S;G=?T(:;>FS;?((5GF:IUS?(FK(1MG=M>S(+M(M>:(40(G;?5;UV1;<Q( * The asterisk denotes products of variant 3a and b, respectively

图2. 多重RT-PCR中的引物位点及其预期产物的长度。因为ALK激酶结构域能够与EML4及其他伙伴基因例 如KIF5B的各种外显子融合，所以需要多个引物序列才能成功检测ALK的融合。

这些基于mRNA水平 的3’和5’区的比较 检测最大优点是，可 以同时独立检测各种 ALK融合模式。虽然分 离FISH检测也有这一优 点，RT-PCR对3’-和 5’-区域的转录子比较 检测法可以进行高通量 分析，这意味着用一个 RNA样本就能检测包括 ALK、ROS1和RET在内的 全部融合改变。此外， 因为福尔马林固定石蜡 包埋样品中提取RNA技 术的最新进展，使这种 方法能够应用到临床实 践中。因为定量RT-PCR

ALK ALK+ cells cells ALK+ cells +

Normal cells cells Normal Normal cells ALK DNA DNA ALK DNA ALK

EML4 EML4 Coiled Coiled coildomain domain coil

Kinase Kinase domain domain

mRNA mRNA mRNA

mRNA mRNA mRNA

Comparisonbetween between 5' and !"#$%&'(")*+,-.,,)*/0*%)1*20* Comparison 5' and 3' 3' regions of ofALK ALKtranscript transcript regions &,3'")(*"4*567*-&%)(8&'$-*

ALK ALK ALK

Kinase Kinase domain domain

region region 5'5'5’region 10 8>9* 6 =* 4 <* 2 ;* 0 :* 9*

5' region region

5' region

ALK ALK Kinase Kinase domain domain

3' region region

3' region

region 3'3’ region region

10 8 6 4 2 0

>9* =* <* ;* :* 9*

5' region region

5' region

3' region region

3' region

图3. 在正常肺组织细胞中, ALK mRNA表达处于很低或检测不到的水平。 而在ALK阳性肺癌细胞中，存在大量异常的ALK 转录子。在ALK阳性细 胞中，当对ALK的3' 和5' 端分别分析时，可以检测到过量的ALK 5' 端转录 子。这一检测不会因为标本中混合有正常细胞而受到影响，并且不受融 合方式的影响。

ALK DNA DNA ALK DNA ALK

EML4 EML4 Coiled Coiled coildomain domain coil

Kinase Kinase domain domain

42

mRNA 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册 mRNA mRNA

ALK ALK Kinase Kinase domain domain

mRNA mRNA mRNA

通常只需要短链的RNA分子（大约150碱基对），这一长度的RNA分子在样本中通常 能够保留，即使在福尔马林固定石蜡包埋的样品中也能保留（图4）。 ALK ALK ALK

Comparisonbetween between 5' and !"#$%&'(")*+,-.,,)*/0*%)1*20* Comparison 5' and 3' 3' regions of ALK transcript regions of ALK transcript &,3'")(*"4*567*-&%)(8&'$-*

Kinase Kinase domain domain

region region 5'5'5’region

9*

800

5' region region

Fluorescence

10 8>9* 6 =* 4<* 2 ;* 0:*

200 3' region region

B

C

34.83

<* ;* :* 9*

50.0

3' products

=*

5' region region 3' region region 5' products

3' region -200

ALK exon 20

6 4 2 0

400

5' region

A

10

10 5'-3' product comparative RT-PCR8 >9*

600

0

region 3'3’ region region

5' region 20

10

30

40

3' region 50

60

Cycles

EML4 exon 13

D

图4. 一例ALK阳性的肺腺癌（A），使用福尔马林固定石蜡包埋组织中提取的RNA进行比较实时PCR检 测。检测了ALK 3' 和5’区的表达水平（B）。在这例肿瘤中3' 和5' 区的表达水平明显不同，表明存在ALK 重排。融合结果经RT-PCR直接测序法（C）和分离FISH（D）验证。

多基因检测 在肺癌临床治疗中，越来越需要能同时检测包括ALK在内的多种基因突变、重排、 表达的临床实践可行的多重检测方法。多重检测方法对于最大限度地利用小活检肺癌 组织和细胞学样本有重要意义。尽管可以应用一些多基因组检测来分析DNA和RNA水 平的ALK融合，已发表的有关这些方法的文章还很少（Li T 2013）。大规模测序（二 代测序[ NGS ] ）技术的快速发展促进了高通量的分子检测，与传统测序相比有多种 优点，包括能够在一次实验中同时检测许多基因的全序列，还能检测所有已知与癌症 相关基因的缺失、插入、拷贝数改变、重排和外显子的碱基置换（包括已知的热点突 变）（Ross 2011）。目前，包括全基因组、全外显子组和靶向基因测序在内的二代测 序平台代表了新兴的诊断技术，用于检测包括FFPE样本在内的肿瘤样本中癌基因融合 和突变（Lipson 2012, Takeuchi 2012）。在一项研究中，对一例分离FISH检测ALK阴性 的病例进行包括至少5 个不同基因断裂点在内的基因组DNA二代测序，检测到该样品

43 第五章: 反转录聚合酶链反应 和多基因检测

中存在复杂的ALK重排（Peled 2012）。目前对临床肺癌组织样本中ALK基因突变和基 因拷贝数改变的检测经验还很少。研究发现，对13例福尔马林固定石蜡包埋肺癌组织 中提取的DNA进行多重二代测序，其中3例存在与克唑替尼耐药有关的ALK基因突变 （Huang 2013）。

结论 检测EML4 -ALK的RT-PCR引物应尽可能设计得全面，目标是覆盖占EML4-ALK至少 90%的三种主要变体。RT-PCR可以作为一个合适的工具用来验证IHC和FISH检测的阳 性结果，但不太适用于初步筛查ALK重排，特别是当组织样品的量足够多时。新兴的 多基因组分析技术，尤其二代测序，代表了临床应用检测技术发展的新方向，可以 检测包括ALK融合及突变、拷贝数增加和基因表达在内的其他改变。但是，在这些方 面发表的研究数据还较少。

第六章 各种ALK检测方法之间的比较 编者 Sylvie Lantuéjoul, Marileila Varella-Garcia, Erik Thunnissen, and Yasushi Yatabe

如前所述， FISH作为检测ALK基因重排的标准方法已经得到广泛公认，已通过临床 验证并被批准用来筛选接受ALK抑制剂（克唑替尼）治疗患者。FISH可以检测包括各种 基因融合伙伴和融合变异在内的ALK重排，检测可以在存档的石蜡包埋标本上进行。然 而， FISH检测需要样本中至少有50个肿瘤细胞，这一要求可能是多达20%的肺癌患者 的小活检不能进行FISH检测的原因（Camidge 2010, McLeer-Florin 2012）。FISH检测还 有其他一些局限性，它很耗时、检测费用较高，需要荧光显微镜，而且阅片人必须要 接受对结果解释的专门培训。因为这些局限性，FISH检测不适用于所有的常规病理实 验室。研究已经对其他的ALK重排检测方法的实用性进行评估。研究集中对FISH、使用 多种抗体的IHC、多重和定量RT- PCR、CISH等各种方法进行了比较。 IHC在理论上可以检测所有的ALK融合蛋白，但是一些融合变异体和融合伙伴所产 生的蛋白质水平较低，可能很难检测到。因此，现在许多IHC检测中使用信号增强系 统来增强蛋白质的信号。IHC仍然是最常用而且最经济的检测方法。因为它： • 是全球范围内的病理实验室使用的常规检测。 • 可用于常规制备的石蜡包埋标本。 • 价格相对便宜。 • 需要的设备简单。 • 只需要短期培训和检测条件优化。 • 通常只需要少量的肿瘤细胞就可以检测融合蛋白的存在。 尽管ALK免疫组化和ALK FISH结果的相关性非常好，IHC作为ALK抑制剂治疗敏感性 的预测指标还没有在大样本的患者组中得到证实。IHC不能直接检测ALK重排，已经报 道存在一些假阴性和假阳性结果（参照FISH结果）。有些IHC检测ALK阳性但FISH检测 阴性的患者，对克唑替尼治疗敏感（Peled 2012）。 目前正在进行ALK免疫组化检测的标准化研究。然而，很多指南，例如欧洲和日本 的指南，已经建议先用免疫组化方法进行筛查，阳性结果经FISH验证后患者可以接受 克唑替尼治疗。另外，美国的指南中指出ALK免疫组化检测，如果经过认真验证后， 可以考虑用来筛查肺腺癌患者（Lindeman 2013）。

45 第六章: 各种ALK检测方法之间的比较

RT-PCR是一种高度特异性的和可靠的方法，因为它能够精确识别5’端的融合伙伴 基因和断裂点变异体。但是可能检测不到不典型的ALK变异体或融合伙伴基因（例如， 有插入或缺失的不规则变异体）。EML4 -ALK的RT-PCR技术是高度敏感的，因为在正常 细胞中引物不会扩增出产物，但在存档的石蜡包埋标本中很少有完整的mRNA。RT-PCR 技术的成本仍然是要考虑的方面，成本的多少因实验室和使用的试验而不同。 CISH是检测ALK重排的一种新方法，该方法能克服FISH的一些缺点（Kim 2011）。 CISH作为完全自动化的原位杂交检测，它能提供稳定的染色信号，使用传统的明视野 光学显微镜就可以观察ALK基因的重排。

免疫组化与荧光原位杂交的比较 几项研究已经对免疫组化与荧光原位杂交进行了比较。已经有多种抗体应用于免 疫组化，包括两种鼠单克隆抗体，克隆号为ALK1（Dako）和5A4（Novocastra）；一 种兔单克隆抗体，克隆号D5F3（Cell Signaling Technology）；和一种兔多克隆抗体（ Invitrogen, Life Technologies）。在大多数研究中，FISH使用的是ALK分离探针试剂盒 （雅培分子，Abbott Molecular）。这一试剂盒已经通过了美国FDA批准，用于ALK重 排诊断检测，筛选接受克唑替尼治疗的患者。 ALK1抗体免疫组化与荧光原位杂交的比较

ALK1抗体最开始是用于间变性大细胞淋巴瘤的诊断，后来也用于检测非小细胞肺 癌中ALK重排。在三组大样本的肺腺癌或非小细胞肺癌研究中，对ALK1免疫组化和荧 光原位杂交进行了比较（表1）(Rodig 2009, Mino-Kenudson 2010, Yi 2011)。以FISH结 果为对照，发现ALK1 IHC在ALK重排肺癌中的敏感性低于在间变性大细胞淋巴瘤中的敏 感性，可能的原因是在非小细胞肺癌中ALK融合蛋白的表达水平很低。ALK1抗体有良好 的特异性，但是敏感性在67%-100%之间。一些样本FISH检测ALK阳性免疫组化检测ALK 阴性，但是没有样本免疫组化ALK阳性FISH检测ALK阴性（Rodig 2009, Mino-Kenudson 表1. 使用ALK1抗体的免疫组化特点 研究

ALK1 样本数量 稀释比 例

抗原修复

检测和信号增 强系统

Rodig et al., 2009

358

1:2

EDTA (pH 8.0) , 高压锅

Tyramide amplification 和 EnVision

MinoKenudson et al., 2010

153

1:2

EDTA (pH 8.0) , 高压锅

EnVision

Yi et al., 2011

101

1:100

EDTA (pH 8.0) in PT Link

ADVANCE

PT Link, EnVision, 和 ADVANCE 都是 Dako.公司的产品

评分 0 与+

IHC阳性 IHC敏感性 IHC特异性 阈值 （与FISH比较） （与FISH比较） >10% 80%（有信号增 的肿瘤细 强系统）40% 胞阳性 （无信号增强 系统）

0, 1+, 2+, 或 >10% 3+ 和染色的 的肿瘤细 肿瘤细胞百 胞阳性 分比 0, 1+, 2+, 或 3+

>0

100%

67%

97%

90%

97.8%

46 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

2010）。在一项研究中，把免疫组化评分1+定义为ALK阴性，3+ 定义为ALK阳性，2+ 被认为是结果不确定（Yi 2011）。这一分级方法与乳腺癌中HER2检测分级相似。建 议使用酪酰胺信号增强系统来提高检测的敏感性，但有报道使用高浓度的ALK抗体会 引起肿瘤细胞和非肿瘤细胞的非特异染色（Mino-Kenudson 2010）。 D5F3抗体免疫组化与荧光原位杂交的比较

在三项研究中对使用D5F3克隆的免疫组化和荧光原位杂交进行了比较（表2） （Mino-Kenudson 2010, Martinez 2013, Minca 2013）。使用该抗体的敏感性为83%-100%， 特异性为99%和100% 。在一项研究中6例病例FISH检测ALK阳性，其中一例免疫组化 检测ALK阴性，但是没有FISH检测ALK阴性免疫组化阳性的病例（Martinez 2013）。 除了这些研究以外，一个国际病理学家小组对一系列已知ALK基因类型的肺腺癌的D5F3 免疫组化结果进行了评分。总体而言，以FISH结果作为对照，免疫组化检测的敏感 性是90%，特异性是95%，不同阅片者之间的评分结果一致性很高（Hirsch 2013）。 表2. 使用D5F3抗体的免疫组化染色特点 样本数量

D5F3 稀释比 例

MinoKenudson 等, 2010

153

1:100

EDTA (pH 8.0) , 高压锅

EnVision+

Martinez 等, 2013

79

1:50

标准操作 BenchMark XT

ultraView

0 和+

Minca 等, 2013a

231

1:100

热修复 BenchMark XT

OptiView

Hirsch 等, 2013b*

98

工作液

标准操作 BenchMark XT

OptiView 和 OptiView 放大系统

研究

抗原修复

检测和信号增 强系统

评分

免疫组化 阳性标准

0, 1+, 2+, 或 大于10%的 3+ 和占肿 肿瘤细胞 瘤细胞的百 阳性 分比

免疫组化敏 免疫组化 感性 特异性 (以FISH结果 (以FISH结 做参照) 果做参照) 100%

99%

大于等于 10%的肿瘤 细胞阳性

83%

100%

0 和+

阳性

94%**

100%

0 和+

任何细胞浆 强染色

90%

95%

a

有两例石蜡包埋组织的免疫组化结果为假阴性，在随后用ThinPrep染色机检测时得到纠正（阳性结果）。 入选该研究的病例包括FISH检测ALK阳性的43例样本及FISH检测ALK阴性的55例样本。 BenchMark XT, Ultraview（通用的DAB检测试剂盒、OptiView, DAB免疫组化检测试剂盒），和OptiView信号放大试剂盒是Ventana公司的 产品，EnVision+是Dako公司的产品。 b

5A4抗体免疫组化与荧光原位杂交的比较

至少有六项大样本的研究对使用5A4克隆的免疫组化和荧光原位杂交进行了比较 （表3）（Jokoji 2010, Kim 2011, Paik 2011, Lopes 2012, McLeer-Florin 2012, Sholl 2013）。 在所有的研究中，免疫组化的敏感性在93%-100%之间，特异性在96%-100%之间。然 而，一项研究发现存在假阳性和假阴性结果；在一例标本中，FISH检测因切片中没有 肿瘤细胞导致阴性结果，免疫组化ALK阳性。在另一例标本中，FISH检测中含有微弱绿 色探针信号的不对称分离信号被错误得判读为ALK阳性（Sholl 2013）。总之，在这类 研究中，与免疫组化结果对比，FISH的特异性是98.5%。

47 第六章: 各种ALK检测方法之间的比较

表3. 使用5A4抗体的免疫组化染色特点 研究

SA4 样本数量 稀释比 例

抗原修复

检测和信号增 强系统

染色评分

免疫组化的 免疫组化 免疫组化结果 敏感性 的特异性 阳性判定 （与FISH结果对 （与FISH结 照） 果对照）

Jokoji 等, 2010

254

1:100

目标修复液 高 PH值

EnVision FLEX+ 和 iAEP

0和 +

无评分

100%（仅对免疫 组化阳性的样本 进行FISH检测）

100%

Paik 等, 2011

640

1:30

CC1 液

i-VIEW

0, 1+, 2+, 或3+

0, or 1+:阴性 2+: 结果不 明确 3+: 阳性

100%

96%

Kim 等, 2011

465

1:30

CC1 液

i-VIEW

0, 1+, 2+, 或3+

0, or 1+:阴性 100% 2+: 结果不 （将评分为2+认 明确 定为阳性时） 3+: 阳性

McLeerFlorin 等, 2012

441

1:50

CC1 液

ultraView

Lopes 等, 2012

62

1:200

微波修复

Novolink

Sholl 等, 2013

186

1:50

PH值为6的柠檬 酸盐缓冲液， 高压锅修复

EnVision FLEX+

98%

0, 1+, 2+, 或 >10% 的肿瘤 3+ 和阳性 细胞染色为 肿瘤细胞的 阳性 百分比

95%

100%

无评分

>10% 的肿瘤 细胞染色为 阳性

100%

100%

0, 1+, 或2+

1+, 2+

93%

100%

a McLeer-Florin, Jokoji, Lopes等的研究使用的5A4抗体是Abcam 公司的产品；其他研究中使用的5A4抗体是诺华（Novocastra）公司的产品. iView（DAB检测试剂盒）和OptiView（DAB免疫组化检测试剂盒）是Ventana医疗系统的产品。Novolink（聚合物检测系统）是徕卡 （Leica）生物系统公司的产品。

兔多克隆抗体免疫组化与RT-PCR的比较

至少有两项针对兔多克隆抗体免疫组化用的研究（表4）（Wong 2009, Chen 2012）。 在一项研究中，对免疫组化结果与EML4 -ALK RT-PCR检测结果进行了比较，二者符合 率高（Chen 2012）。在另一项研究中，11例腺癌和一例腺鳞癌RT-PCR检测ALK阳性， 免疫组化结果也阳性（Wong et al 2009）。 表4. 兔多克隆抗体ALK免疫组化染色的特点 研究

样本数量 ALK1 (ALK+的百 稀释比 分比) 例

抗原修复

免疫组化的 检测和信号增 染色结果 免疫组化阳 敏感性 强系统 评分 性判读 （与RT-PCR 结果对照）

免疫组化的 特异性（与 RT-PCR结 果对照）

Wong 等, 2009

266 (4.9%)

1:1000

柠檬酸盐缓冲液 （(pH 6.0)，微 波修复

HRP 复合物

无

无特定

100%

无特定

Chen 等, 2012

64 (4.7%)

1:500

CC1 液

ultraView

0, 1+, 2+, 或 3+

≥2+

100%

90%

CC1液（Tris /硼酸/ EDTA）是罗氏（Roche）公司（产地瑞士巴塞尔）的产品。Ultraview （通用型DAB检测试剂盒）是Ventana医疗系统 公司的产品，HRP（辣根过氧化物酶）复合物是Dako公司的产品。

抗体的多个克隆之间的比较

有研究者用ALK抗体的多个克隆直接检测同一组样本，观察它们之间结果的符合 率，符合率因抗体而不同（表5）（Rodig 2009, Takeuchi 2009, Mino-Kenudson 2010,

48 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

表5. 免疫组化中抗体不同克隆之间的比较 研究 Takeuchi 等, 2009

评分

标准

免疫组化敏 感性 （与标准对 照）

免疫组化特 异性 （与标准对 照）

0和 + （用于全 部）

RT-PCR

100%

100%

EnVision+

27%

100%

ALK1

iAEP

100%

100%

ALK1

EnVision+

9%

100%

SP8

iAEP

20%

100%

SP8

EnVision+

100%

18%

40%

100%

80%

100%

67%

97%

100%

99%

81%

100%

EnVision FLEX+

100%

100%

EnVision FLEX+

100%

99.7%

100%

62.5%

66%

100%

样本数量 抗体克 （ALK+的百 隆号 分比） 21 (52%)

5A4

抗原修复 目标修复液 （pH 9.0） （用于全部）

5A4

Rodig 等, 2009

239 (4%)

ALK1

EDTA，高压锅 （用于全部）

ALK1 MinoKenudson 等, 2010

37 (59%)

ALK1

检测和信号增 强系统 iAEP

EnVision+

0和 + （用于部）

FISH

Tyramide amplification EDTA，高压锅 （用于全部）

EnVision+ (for both)

图像评分 >2.7 为阳性

FISH

D5F3 Murakami 等, 2011

a

361 (5%)

ALK1

目标修复液 （pH 9.0） （用于全部）

5A4

Conklin 等, 2013

377 (3%)

5A4

根据产品操作手册 （用于全部）

a

594 (11%)

iAEP

0, 1+, 2+, 或3+ （用于部）

FISH

ALK1

EnVision FLEX

ALK1

ADVANCE

66%

87.5%

5A4

ADVANCE

100%

87.5%

D5F3 Selinger 等, 2013

ABC (no 0和 + RT-PCR/ enhancement) （用于部） FISH

ADVANCE

100%

75%

100%

99%

ultraView和 ultraView 信号放大

100%

98%

OptiView和 OptiView 信号放大

100%

99%

ALK1

缓冲液 (pH 9.0)， 高压锅

EnVision FLEX+

5A4

根据产品操作手册

D5F3

根据产品操作手册

0, 1+, 2+, 或3+ （用于部）

FISH

有356例样本使用了D5F3克隆进行检测。 SP8是Abcom公司的产品。目标修复液、缓冲液、EnVision, EnVision FLEX+和 ADVANCE都是Dako公司的产品。ultraView（通用型DAB检测 试剂盒） 、OptiView（DAB免疫组化检测试剂盒）, ultraView 和OptiView 信号增强试剂盒是Ventana医疗系统公司的产品 ABC=抗生物素蛋白生物素复合物。

49 第六章: 各种ALK检测方法之间的比较

Murakami 2011, Conklin 2013, Selinger 2013）。Takeuchi等报道了对ALK1和5A4两种克 隆比较的结果，染色中采用了插入抗体增强聚合物（IAEP）的信号增强系统（Takeuchi 2009）。然而，在其他研究中发现使用不同克隆得到的结果不同。例如，Murakami等 报道12例ALK重排的样本中，存在一例免疫组化结果不一致，该样本用5A4进行免疫组 化结果阴性，用D5F3进行免疫组化结果阳性（Murakami 2012）。Conklin等比较了五 种克隆和检测系统的组合，结果一致性最高的是5A4和D5F3两种克隆与ADVANCE检测 系统的组合（Dako公司），但是在一例FISH检测ALK阴性的样本中，发现有异质性的 阳性反应（Conklin 2013）。

多重或定量RT-PCR与FISH的比较（有或无免疫组化结果） 只有一项研究中，在9例非小细胞肺癌的肿瘤细胞中检测到EML4-ALK转录子，但在 正常肺组织中也检测到该转录子（Martelli 2008）。其他研究者在正常肺组织中没有 检测到EML4-ALK转录子，导致了对该试验结果的质疑（Mano 2010, Sasaki 2010）。 RT-PCR是具有高度特异性、高度敏感性且没有假阳性的检测方法；然而存在假阴性的 风险，原因是从石蜡包埋样本中提取到高质量的RNA较困难。虽然RT-PCR的假阴性率 没有详细报道，已经有报道在前瞻性研究中成功地检测到ALK转录子（Soda 2012）。 在这项研究中，916例样本中有108例（12%）因为RNA质量差被排除在检测之外。在 36例样本中检测到EML4-ALK转录子，其中15例可以做免疫组化，这15例样本免疫组 化结果均阳性。 总之，与免疫组化和FISH对照，RT-PCR在检测ALK转录子上有较好的敏感性和特 异性，范围从94%-100%（表6）（Takeuchi 2008, Inamura 2008, Takeuchi 2009, Soda 2013）。 表6. RT-PCR结果与其他ALK检测方法结果的比较 研究 Inamura 等, 2008

RT-PCR类型

免疫组化 抗体

FISH

RT-PCR 敏感性（与 FISH和/或IHC对照）

RT-PCR 特异性（与 FISH和/或IHC对照）

多重 RT- PCR

ALK1

无

100% (与IHC对照)

100% (与IHC对照)

Takeuchi 等, 2008

多重 RT-PCR

–

基于FISH的融合检测

100% (与FISH对照)

100% (与FISH对照)

Takeuchi 等, 2009

逆转录和多重 RT-PCR

5A4 ALK1

EML4 和KIF5B 的融合检测

100% (与IHC对照)

100% (与IHC对照)

多重 RT-PCR

5A4

ALK 分离探针试剂盒

100% (与IHC对照) 94% (与FISH对照)

100% (与IHC对照) 100% (与FISH对照)

Soda 等, 2012

Inamura, Takeuchi 等 (2009) 的研究中用的ALK1抗体是Dako公司的产品。Takeuchi等的研究（2009）中用的5A4抗体是Abcom公司的产品，Soda 等的研究中用的5A4抗体是Nichirei生物科学公司的产品。Soda等的研究中用的分离探针是雅培公司（Abbott Molecular）的产品。

CISH与其他方法的比较 与FISH相比，CISH 具有一定的优势，研究表明，CISH结果与ALK重排的其他检测方 法结果相似（表7）（Kim 2011, Yoshida 2011a, Schildhaus 2013）。在一项研究中，CISH 检测使用了与FISH相同的阳性标准。但在另一项研究中，研究人员发现，在CISH中使

50 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

用一种与FISH不同的阳性标准能更好地区分ALK阳性和阴性的肿瘤(Schildhaus 2013, Yoshida 2011a )。已经研发出一种双染色的新技术，在同一个细胞中检测ALK拷贝数 和ALK蛋白表达（Ventana Medical Systems, Inc.）（Nitta 2013），已证实该方法比传 统的免疫组化敏感性更高，能提供对ALK状态的更精确的评估。然而，该方法在技术 操作上难度很高。正在进行对该技术的进一步验证。 表7.CISH与其他ALK检测方法的比较 CISH

FISH

IHC

RT-PCR

样本数量 (ALK+百分 比)

阳性标准

敏感性

特异性

敏感性

特异性

敏感性

特异性

Kim 等, 2011 双色ALK分离 检测 CISH

431 (4%)

Not stated

94%

100%

66.7%

100%

NA

NA

Yoshida 等, 2011a

双色ALK分离 检测 CISH

45 (31%)

≥20% cells with split signals

100%

100%

93%

100%

93%

100%

Schildhaus 等, 2013

ZytoDot 2C SPEC ALK分离 探针

100 (16%)

≥15% cells with split signals

100%

100%

NA

NA

NA

NA

研究

试剂盒

Kim和Yoshida 等研究中使用的试剂盒是Ventana Medical Systems, Inc的产品。Schildhaus等研究中使用的试剂盒是ZytoVision GmbH 的产品。 NA=没有提供

ALK检测的诊断流程实例 多个研究组织根据每一种ALK检测的优势及特点，提出了ALK检测的诊断流程（图1-6） （日本肺癌学会2011, Kim 2011, Paik 2011, Thunnissen 2012b, Conklin 2013, Marchetti 2013）。 Lung Cancer Samples

Cytology samples, frozen

RT-PCR IHC

Negative

Negative

Positive

Positive

FISH

Negative

Positive

(rare) ALK inhibitor

图1. 日本肺癌学会推荐的诊断流程 是，先用免疫组化来筛选再用FISH进 行验证；细胞学样本使用RT-PCR方 法。虚线代表根据患者临床病理特 征可能会重复进行的检测。经日本肺 癌学会生物标志物委员会同意，此图 做了部分修改。来源：肺癌患者ALK 基因检测指南，1.0版本,2011年8月 1日(Guidance for ALK Gene Testing in Lung Cancer Patients. Version 1.0 August 1, 2011.)，可通过以下网址获得信 息，http://www.haigan.gr.jp/uploads/ photos/641.pdf.

51 第六章: 各种ALK检测方法之间的比较

IHC

Negative 0/1+

Equivocal 2+

Positive 3+

Reported as ALK negative

CISH/FISH

Reported as ALK positive

IHC

Negative 0/1+

Equivocal 2+

Positive 3+

Reported as ALK negative

FISH

Reported as ALK positive

ALK testing IHC

Positive 1+, 2+, 3+

FISH

Negative

No ALK rearrangement

图3.使用免疫组化和FISH检测非小 细胞肺癌中ALK的诊断流程。经Paik J, Choe G, Kim H等同意后对此图做了 修改。来源：Screening of anaplastic lymphoma kinase rearrangement by immunohistochemistry in non-small cell lung cancer: correlation with fluorescence in situ hybridization. J Thorac Oncol. 2011;6(3):466-472.

图4.在对免疫组化检测进行充分验证 基础上的非小细胞肺癌ALK检测的推 荐流程。经Thunnissen E, Bubendorf L, Dietel M等同意后对此图做了修改。 来源：EML4-ALK testing in non-small cell carcinomas of the lung: a review with recommendations. Virchows Arch.

2012;461(3):245-257.

NSCLC

Negative

图2. 使用免疫组化和显色原位杂交 或荧光原位杂交来预测ALK基因重排 的流程。此图经KimH, Yoo S-B, Choe J-Y,等同意后修改。来源：Detection of ALK gene rearrangement in nonsmall cell lungcancer. J Thorac Oncol.

2011;6(8):1359-1366.

Positive

ALK rearrangement

52 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

ALK IHC

(5A4 by Novocastra or DSF3 by Cell Signaling with ADVANCE detection)

Negative

Positive

(No ALK expression)

(Any ALK expression)

FISH ALK negative

ALK positive

NSCLC

(adenocarcinoma, large cell carcinoma, mixed tumors with adenocarcinoma, NOS)

ALK IHC

1-2 working days

Negative

Positive

FISH test

Negative No ALK rearrangement

图5.在ALK检测中用免疫组化法筛 查后FISH进行结果验证的诊断流 程。经Conklin C, Craddock KJ, Have C等同意后对此图做了修改。来 源：Immunohistochemistry is a reliable screening tool for identification of ALK rearrangement in non-small cell lung carcinoma and is antibody dependent.

J Thorac Oncol. 2013;8(1):45-51.

2-3 working days

Positive ALK rearrangement

图6. 意大利肿瘤专业协会和意大利 病理与细胞病理协会推荐的非小细 胞肺癌中ALK可能的检测流程。虚线 框和虚线对应的是假设免疫组化筛 查结果后选择患者进行FISH验证。 注明了检测需要的时间和对免疫组 化和FISH结果的解释。NOS=非特殊 型。经Marchetti A, Ardizzoni A, Papotti M等同意后对此图做了修改。来源：l.

Recommendations for the analysis of ALK gene rearrangements in non-small-cell lung cancer: a consensus of the Italian Association of Medical Oncology and the Italian Society of Pathology and Cytopathology. J Thorac Oncol. 2013; 8(3):352-358.

结论 因为成本-效益方面的考虑，建议在多数情况下用ALK免疫组化先对样本进行筛查， 免疫组化ALK阳性的样本用FISH进行结果验证。然而，尚需免疫组化阳性结果与ALK酪 氨酸激酶抑制剂治疗有显著相关性的临床资料来进一步验证免疫组化检测方法的有效 性。此外，要继续对FISH进行评估，来决定目前判读为不典型或处于交界值的FISH结 果的临床意义。目前已经有几个推荐的ALK检测流程。

第七章

细胞学标本的ALK检测 编者 Lukas Bubendorf

NSCLC中细胞学的作用 非小细胞肺癌中FISH检测ALK重排的有效性验证最开始就是通过对活检组织实验完 成的（Kwak 2010）。制作组织石蜡包埋块是病理实验室的常规工作，这些蜡块可以进 行多次切片以供各种试验检测分析使用，所以在临床实验中一般都使用活检组织进行 转化医学研究。然而，有接近40%的进展期NSCLC仅有细胞学诊断，没有同时进行组织 学检查，不具备活检组织。因此，将组织标本做为ALK检测的唯一标本来源将导致很大 部分的患者重复活检取材，这也强调了在细胞学标本中开展ALK检测的必要性。 在细胞样本中开展FISH检测已经有很长时间。在FISH能应用于组织标本前，已经用 于检测细胞株或从肿瘤组织样本中分离的完整细胞核。FISH也是在诊断细胞学的几个 领域被使用的一种方法。从分析的角度来看，在细胞样本中应用FISH检测ALK并无不妥 之处。事实上，细胞样本具有很多优点；如，与组织切片相比，细胞涂片上的细胞核 没有被截断，这使得细胞核内FISH信号的检测更加真实可信。 对于肿瘤复发或转移的患者来说，采集细胞学标本用来检测生物标记物是一种吸 引人的创伤性小的收集肿瘤细胞的方法。诊断非小细胞癌的细胞学标本来源有超声引 导下支气管内细针穿刺、经胸壁细针穿刺、气管分泌物或刷检、支气管肺泡灌洗液、 胸腔积液，或者其他转移部位的细针穿刺。许多实验室都喜欢将这些细胞样本处理成 福尔马林固定石蜡包埋的细胞块，因为这样在分子标记物检测中，这些细胞包埋块可 以和组织包埋块进行同 样的处理及使用相同的 操作步骤（图1）（Alici 2013, Kalhor 2013）。 除了可以重复切片提供 更多检测样本外，细胞 50 µm 50 µm 块还可以长期保存蛋白 A B 质及DNA。除了商品化 图1. 肺腺癌引起的胸腔积液. 1A: 传统的细胞涂片，巴氏染色. 1B: 细胞 试剂外，有已发表的细 包埋块切片，HE染色（x400）.

54 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

胞包埋块制作方法，最常用的三种方法是所谓的细胞纽扣法、海藻酸钠法和血浆凝 血酶法(见文框 1) (Orell 2011, Kalhor 2013, Noda 2010, Jing 2013)。

肺部细胞学标本的ALK FISH检测

文框 1.细胞包埋块制作方法

细胞纽扣法 (Orell 2011, Kalhor 2013)

方法 3

方法 2

方法 1

a. 轻轻地将一滴细胞液或离心后沉淀物滴于玻片上，不要 FISH是一种应用范围广泛的 涂抹。 技术，它几乎适用于所有类型 b. 几秒钟后待细胞粘附于玻片上，小心浸入酒精中固定 c. 用手术刀片轻柔将固定物（象一粒纽扣）从玻片上剥离， 或形式的细胞样本。在细胞学 之后的处理过程与小活检相同。 样本中，FISH检测ALK的操作 步骤及结果评判标准与组织 海藻酸钠法 (Noda 2010) 学样本相同。然而在FISH的检 a. 将液体离心后收集悬浮液体，浸入含有缓冲液的福尔马林

2-3小时。 测中，有相当一部分细胞块 b. 离心后收集沉淀物，弃掉上清液福尔马林，用去离子水 含有太少甚至不没有肿瘤细 清洗。 c. 离心后，用0.5mL of 1%海藻酸钠制成悬浮液。 胞(Knoepp 2013)。与传统细 d. 加入钙盐 (1M)，制成凝胶。 胞片相比，鉴别细胞块切片中 e. 用镊子收集凝胶物，之后的处理过程与小活检相同。 的肿瘤细胞与邻近的反应性细 胞也更加困难，尤其是在FISH 血浆凝血酶法（瑞士的巴塞尔市和苏黎世市的大学 检测中。因此，很多实验室 附属医院使用的操作流程） 选择用细胞学涂片进行ALK检 a. 将细胞学样本离心，2500转/分钟，10分钟。 b. 弃上清液。 测，这也是一种好的选择(图 c. 用吸管取2滴沉淀物放入一个小锥形管中。 2)(Betz 2013, Savic 2013)。使 d. 加入200 μl血浆，简单振荡。 e. 加入50 μl凝血酶，轻微振荡 。 用传统细胞涂片进行FISH检测 f . 样本孵育5分钟。 的一个重要优点是，可以在所 g. 把凝固块放入包埋盒（包在2层滤纸之间）。 h. 将材料放入10%的含缓冲液的福尔马林中固定。 有已染色的涂片中选用最佳的 i . 取出固定物，之后的处理过程与小活检相同。 涂片，无需额外的未染色片。 除了可以避免核截断及其他相 关人工因素干扰，空气中风干或酒精固定的涂片中的细胞核DNA质量也优于福尔马林 固定过的样本，因后者会引发交联反应及核酸的化学修饰效应。上述事实也解释了在 ALK FISH检测中，为何传统细胞涂片的检测成功率近乎100%，而组织学样本却有19% 的检测失败率(McLeer-Florin 2011, Savic 2013)。 FISH几乎可以应用于所有类型的细胞学样本，包括传统的细胞涂片，细胞离心涂 片，及液基细胞制片（例如新柏氏或BD公司），且不必考虑其固定方式（风干法或酒 精固定法）。推荐使用涂胶片或者阳离子玻片制作肺部细胞涂片，因为这类玻片提高 了细胞的粘附性并可防止在FISH的操作过程中脱片。在未染色片、巴氏染色片，HE染 色片及改良Giemsa染色片上都可进行FISH检测，通常也并不需要额外的处理程序，但 在改良的Giemsa染色中，推荐在FISH检测前使用盐酸酒精脱色(Betz 2013)。值得注意 的是，使用3-氨基-9-乙基咔唑 (AEC)显色的免疫组织化学片仍然可以进行FISH检测，

55 第七章: 细胞学标本的ALK检测

A

B

C

D

图2. 传统细胞学涂片或经巴氏染色后的细胞片中ALK FISH检测的代表性图像（显示完整 细胞核中所有FISH信号的压缩Z型层叠图像）.2A和2B: 2例ALK阴性的肿瘤，每个肿瘤细胞 核中具有3个正常（融合）ALK信号（2A），每个肿瘤细胞核中具有更多数目的正常ALK 信号（2B）。2C和2D：具有1或2个分离信号的ALK阳性肿瘤（红色和绿色信号间距离至 少是信号直径的2倍以上）（2C），或者每个肿瘤细胞核中除几个正常信号外，单一的 红色信号无相应的绿色信号（2D）。

但DAB显色剂的使用则会因为自发荧光反应而干扰FISH信号。在已染色的细胞学样本中 进行FISH检测的操作流程已经出版 (Thunnissen 2012b)。因为法律上要求细胞学实验 室必须保存诊断细胞片数年，且一些罕见病例诊断几年后可能仍需复查细胞片，这些 因素可能导致使用诊断细胞片进行FISH检测的顾虑。解决这个问题的办法是可以在使 用这些细胞片进行FISH检测前，拍摄典型病变图像或将整张切片扫描保存。也可以在 完成FISH检测后重新将该片染色保存(Betz 2013)。 ALK FISH检测阳性结果的阈值是建立在对组织样本分析基础上（在至少15％的肿 瘤细胞中出现典型ALK重排信号），但是在形成统一共识推荐的阈值确立以前，各实 验室应制定自己的细胞样本ALK阴性标准(参见第三章中有关临界值的内容)。应选取 没有重叠的肿瘤细胞进行ALK FISH结果分析，但是大多数的三维细胞簇仍可用于ALK

56 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

分析，这是因为重排信号检测不受三维结构的影响。对于含有较低比例肿瘤细胞的样 本，使用自动分析软件重新定位肿瘤细胞，这样可提高分析的准确性及方便FISH结果 分析。

细胞学中的ALK免疫组化检测 最近，使用免疫组化法先筛查出NSCLC中ALK蛋白过表达病例，再进行随后的FISH检 测及进一步帮助评估FISH结果不明确的病例，这已成为一种有价值的方法（详情参见 第4章）。ALK 免疫组化在包括细胞块和传统细胞涂片、液基细胞涂片在内的细胞学标 本中具有与在组织学标本中一样的应用前景（Moreira 2012, Martinez 2013, Savic 2013, Tanaka 2013）。与ALK FISH结果相比，在巴氏染色细胞片上进行ALK 免疫组化检测的 准确性很高，具有近乎100%的敏感性及特异性（Savic 2013, Tanaka 2013）。以上试验 中使用的是5A4抗体（Novocastra, 见第6章）及自动免疫组化染色机(Bond-Max; Leica Biosystems)(图 3 和 4)。仍需要一些研究结果来证实5A4抗体在其他操作平台上的效 果，并要检测在细胞学样本中使用D5F3抗体(Ventana Medical Systems, Inc.)的标准化 ALK免疫组化检测的性能。 因为IHC的广泛应用，使用IHC做为ALK检测首选方法的病理实验室会越来越多，而 FISH检测将被局限应用于对IHC阳性或结果不明确的验证。需要适当的外部质控项目为 组织和细胞样本提供标准化分析

A

B

C

D

图3.在肺腺癌患者恶性胸水传统涂片上的免疫组化染色，ALK 阴性（3A），ALK 阳性（3B, 3C），使用ALK重排的H2228细胞株做为阳性对照（3D）。使用5A4 抗体(Novocastra)和自动免疫组化染色机(Bond-Max; Leica Biosystems)，所有结 果都已经FISH验证。

57 第七章: 细胞学标本的ALK检测

RT-PCR 可以使用RT-PCR方法检测细胞标本(Betz 2013, Mitiushkina 2013)。如第6章所述，RT-PCR可以用 于验证ALK IHC或FISH检测结果，但并不太适用于 对ALK重排的初筛

结论 A

B

C 图4.免疫组化染色ALK阳性的肺腺癌 （x200）。使用5A4抗体(Novocastra)检测 经过巴氏染色的细胞片（4A），使用5A4 抗体检测对应的细胞块切片（4B），使用 D5F3抗体(Ventana Medical Systems, Inc.)检 测对应的细胞块切片(4C).

在进行ALK检测时，包括传统细胞涂片和细胞 块在内的细胞标本，都可做为除活检标本外的另 一种选择。

第8章

ALK的检测报告 编者 Elisabeth Brambilla, Erik Thunnissen, Marileila Varella-Garcia, and Yasushi Yatabe

不管使用FISH、免疫组化或RT-PCR中的哪一种方法，作为标准的肿瘤分子病理诊断 报告，ALK报告都应包括四个部分：检测前、检测、结果和解释/结论。

检测前部分 当分子诊断结果没有作为病理报告的一部分随其同时发出时，作为一份标准的报 告，这一部分应包括患者的标识编号、样本的类型和诊断。报告中应包括以下细节： 样本特征 • 样本的大小和类型：手术切除标本（肺叶切除，肺切除，肺段切除，楔形切 除），活检（气管/支气管活检，穿刺组织活检，细针穿刺细胞学），体液（胸 腹水，脑脊液）。 • 组织的保存方式：快速冷冻（贮存温度）或福尔马林固定石蜡包埋。 • 组织的固定方式：组织离体后到浸入固定液的时间和固定持续的时间，使用的固 定液（对石蜡包埋组织只推荐使用含缓冲液的福尔马林）；如果组织已经经过脱 钙液处理，要记录该过程及使用的试剂。 肿瘤的组织学诊断

对肺腺癌来说，要按照国际肺癌研究学会/美国胸科学会/欧洲呼吸学会在2011年 联合发布的肺腺癌分类（Travis 2011）进行组织学及亚型分类。例如对含有一种以上 类型的肿瘤应描述为：腺鳞癌，复合性小细胞肺癌含腺癌成分，大细胞神经内分泌癌 （纯的或合并有腺癌成分）。如果在同一个肿瘤内有一种以上的组织学类型，要注明 所检测样本中占主要成分的组织类型，如果没有，应记录所检测的类型。 肿瘤的评估

• 估计整张切片中肿瘤细胞的数量（肿瘤细胞核的数量占切片中全部细胞核的百分 比），来判断样本是否含有足够多的肿瘤细胞进行免疫组化、FISH和/或RT-PCR。 • 原先的切片/组织块中肿瘤细胞的百分比，及进行微切割等肿瘤细胞富集后的肿

59 第8章: ALK的检测报告

瘤百分比，来估计样本中用于DNA/RNA提取的肿瘤细胞量。 • 坏死、炎症细胞的浸润、炭末沉积和组织人工假象的程度。 • 列出能得到的与诊断相关的免疫组化结果，例如甲状腺转录因子-1（TTF-1）, p63/ p40和粘液染色（Thunnissen 2012a）。 总的样本量

• 记录为“足够用于检测”（在这里指出，包括ALK检测及其他检测），或者“欠 佳”（注明原因）。 其他信息

• 可能有的既往药物治疗史（非必须）。

检测部分 这一部分要包括检测的基本方法、敏感性和阳性结果的阈值。提供的这些信息应当 足够详细，以便在不同实验室间结果不一致或要求重复检测时，其他的实验室能够明 白对标本进行了哪些操作。 • ALK FISH: 探针组（制造商，产品型号） 和阳性定义的阈值。 • ALK IHC：抗体类型（来源），抗体浓度，孵育时间和温度，信号增强系统。 • ALK RT-PCR: 使用的方法，引物，探针及相关信息，及检测敏感性。

结果部分 这一部分应报告检测结果，包括意义不明确的偶然性发现和变异体。无确切结论 的结果也要明确报告为此类。结果应报告为ALK重排阳性或阴性，这样可以使肿瘤医 生及非分子病理专业的病理医生都能容易地理解检测结果。此外，要报告所使用检测 方法的特殊性要素。 ALK FISH: 分析的细胞数量，阳性表现的细胞数量和百分比；如观察到不典型形 态时，要注明（例如，“ALK重排阴性，参见注释”）；如果使用国际系统的人 类细胞基因术语，应当同时使用容易理解的不连续结果。 ALK 免疫组化: 结果应报告为阳性、阴性或无明确结果；当无明确结果时，应进行解 释（例如，肿瘤组织已经用完，肿瘤细胞数量不足）；其他可以选择的结果是用改 良的H评分法（着色的细胞百分比，染色强度及着色位置[细胞浆和/或细胞膜]）， 及染色的均匀性。为了保证检测的有效性，所有试验都要有阳性对照。ALK重排阳 性的细胞株包埋块或ALK阳性的肿瘤标本都可以用作阳性对照。 ALK RT-PCR: 任何检测到的已经明确的有临床意义的突变名；融合方式，例如 尽管“变异体1”这一名称已经被使用，但建议使用更详细的描述(Soda 2012)，

60 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

如用 “EML4-ALK (E13;A20)”代替变异体1，用“EML4-ALK (E14; A20 E14; ins 11 del49A20)”代替变异体4。（更多信息请见http: //atlasgeneticsoncology.org/ Tumors/ inv2p21p23NSCCLungID5667.html.）

解释/结论部分 这部分应包括以下部分： • 样本类型和诊断（未用药的或ALK抑制剂治疗后）。 • 易于理解的临床解释，包括分子检测的结果和肿瘤对ALK抑制剂治疗会敏感或耐 药的可能性的总说明（也要考虑临床依据）。 • 对无明确结果或多个检测不一致结果的解释 （是已知最好的），无论引起这样结 果的原因是试验失败、样本量太少，或其他原因（例如FISH不典型形态）。建议 用该患者的另一份样本进行检测，可能会检测成功得到结果。

结论 ALK检测报告应包括足够多的信息，这样实验室医师及临床医师能了解样本的来源 和特点、试验的特性及准确性，和检测结果的潜在临床应用价值。

第九章

指南和标准化研究 编者 Yasushi Yatabe, Sylvie Lantuejoul, Erik Thunnissen, Keith Kerr, and Ming Sound Tsao

随着对非小细胞肺癌靶向治疗中ALK基因研究的不断深入，世界各国的肿瘤医生和 病理医生建立了单独的或作为多分子检测一部分的ALK检测推荐流程，可作为ALK分子 检测的指南。另外，多个国家和国际多中心研究已建立了实验室间的ALK标准化的检 测步骤。

指南 肺癌样本的分子检测指南包括临床和方法学建议。在2011年，欧洲医学肿瘤学会 （ESMO）不建议把ALK作为常规检测，但是认识到越来越多的新数据出现可能会支持 该检测的临床意义（Felip 2011）。后来，几个专家组发表了肺癌分子检测的共识，其 中包括ALK重排检测（见表1）。美国病理医师学会(CAP)、国际肺癌研究学会(IASLC) 和美国分子病理学学会(AMP)三大学术机构合作发布了最全面的指南。这一指南是在 对2012年2月之前已发表的文献进行系统性回顾的基础上形成的（见附录2，该指南推 荐内容的总结）。该指南建议，组织学类型是腺癌或含腺癌成分的晚期NSCLC患者都 要进行ALK基因重排检测。如果是小标本且不能排除含腺癌成分，也要进行ALK检测 （Lindeman 2013）。与EGFR突变检测一样，病理医生必须先要选择组织以保证有足 够的肿瘤细胞进行检测。目前选择的标准检测法是ALK荧光原位杂交分离检测法（Vysis LSI分离探针试剂盒，雅培分子），这是目前唯一被FDA批准的用来决定患者是否应接 受ALK抑制剂治疗的检测方法。但是，指南提出，可以使用有效的ALK免疫组化方法进 行ALK筛查。

标准化研究 在美国，克唑替尼的药物说明中指出，必须用美国FDA批准的ALK方法进行检测。 目前，ALK FISH分离检测（雅培分子）是唯一被FDA批准的方法。在世界其他国家， 相关机构没有强制要求使用某一特定的检测方法，但是要求使用经过确认的方法。 在这些国家，其他的方法或检测在经过ALK重排检测标准化后可以应用。CAP/IASLC/ AMP 指南中的专家共识认为，ALK检测方法的确认要遵循与其他分子诊断检测一样

62 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

表1. 各专家组对肺癌ALK检测的推荐或建议 文献作者, 发表年份

Mitsudomi et al., 2011 Garrido et al., 2012

研究机构

JLCS

SEOM 和 SEAP

检测方法

FISH, IHC, 和 RT-PCR FISH

检测流程

细胞学标本检测

免疫组化（IHC）

先用IHC筛选后用FISH方

适用，建议制作细

建议把标本送到有合适的抗

法确认

胞包埋蜡块后进行

体克隆号和检测系统的实

FISH和IHC检测

验室去做

没有说明

没有说明

先用IHC筛选后用FISH方

组织和细胞学标本

很有可能可作为筛查工具

法确认

都可能适用

对EGFR阴性的肿瘤标本进 行FISH检测

Thunnissen 欧洲专家 et al., 2012b

FISH, IHC, 和 RT-PCR

Yi et al., 2012

专家

FISH 和 IHC 先用IHC筛选后用FISH方 法确认

没有说明

Marchetti et al., 2013

AIOM 和

FISH, IHC, 和 RT-PCR

SIAPEC-IAP

可能是一个实用可靠的筛 查工具

对IIIB期和IV期的非小细胞

包括涂片在内适用

可能能用于筛查，但是没有

肺癌患者进行FISH检测

于FISH

充足的数据得到最终结论

（冷冻组织）

Lindeman et al., 2013

CAP-IASLCAMP

FISH

FISH用于检测晚期肺腺癌

适用，

恰当的经认证的方法可作为

病例(或含有腺癌成分的

细胞包埋蜡块优于

筛查工具来筛选标本是否进

非小细胞肺癌）; 应鼓励

涂片

行后续的FISH检测；如果优

检测I-III期的非小细胞肺癌

化的IHC检测结果是阴性，

病例，但应由当地多学科

不需要进行FISH检测

组决定

Ettinger et al., 2013

NCCN

FISH

FISH 是标准方法；可以用 没有说明 IHC进行筛查，阳性结果用 FISH确认；PCR检测方法正 在评估中

可以作为筛查工具；用于 淋巴瘤的IHC不能用于检测 大多数ALK重排的非小细 胞肺癌

ESMO =欧洲肿瘤学会，SEOM =西班牙肿瘤学会，SEAP:西班牙病理学会，AIOM =意大利肿瘤学会,SIAPEC-IAP =意大利解剖病理学和细 胞病理诊断学会-国际病理协会，NCCN = 美国国立综合癌症网络,ALCL =间变性大细胞淋巴瘤

的规则和质量控制/保证。为了制定各实验室通用的标准化检测方法，世界不同的地 区和国家的几个多中心研究组进行了这方面的工作（表2）。 欧洲

为了研究肺癌中的生物标记物，设计了ETOP肺癌项目。该项目第一步是进行一组 回顾性研究，对欧洲手术切除的I-III期肺腺癌标本进行ALK重排检测，先用IHC筛查， 再用FISH方法进行结果确认，获得ALK阳性的比率（Blackhall 2012）。经过15个实验室 的轮流检测，证实一种ALK免疫组化方案是有效的检测方法。尽管使用的抗体克隆号是 5A4，同时使用的是Novolink检测系统(莱卡生物)，有的实验室使用的是Bond-Max自动 染色机(莱卡生物)，还有的实验室是手工染色。结果显示1099腺癌中有69例（6.3%） ALK阳性；其中23例（33.3%）3+, 8例（11%）2+, 38例（55%）1＋。为了检测FISH与 IHC的一致性，207例标本进行FISH检测，其中IHC阳性和阴性病例比例为1：2。结果

63 第九章: 指南和标准化研究

表 2. ALK检测方法的多中心标准化研究 国家 欧洲

评估方法

参与者

样本数

研究类型

IHC 和 FISH

15 个 实验室

1,099 例 (69 例ALK阳性)

轮流检测；回顾性分析

IHC 和 FISH

12 个加拿大病理 实验室

28 例 (22例ALK阳性)

每个实验室按照各自的试验操作手册

(ETOP) 加拿大

进行检测，然后经过会议达成共识对 操作手册进行修改，重复检测进一步 验证结果

日本

法国

德国

IHC, FISH, 和 定量RT-PCR

在全国范围内

IHC, FISH, 和 RT-PCR

15 个胸科病理科

IHC 和 FISH

8 位德国的病理系 专家

IHC, FISH, (欧洲病理 和FISH 数字 学会) 化图像 欧洲

2,884 例 (213例ALK阳性)

有希望的筛查方法

459 例(85例ALK阳性)

在中心实验室评估不同检测方法间的

筛查3个月 一致性

10 (5例ALK阳性)

6 例手术切除标本(2例ALK阳 别有80个和150个实 性), 6例培养的细胞系 (2例 验室8 ALK阳性标本) 和 4例 数字 第一轮和第二轮分

对已知ALK结果的病例进行轮流检测 对已知ALK结果的病例进行轮流检测

图像(2 例ALK阳性)

显示60例IHC阳性的标本中有22例(37%)FISH检测阳性，138例IHC阴性的标本中有137 例(99%)FISH检测阴性（图1）。该研究表明对IHC阳性标准明确定义的重要性，并且 IHC阳性的水平可能能预测ALK重排状态。使用5A4抗体，染色强度显示1+, 2+的标本 ALK重排的可能性小。同样，样本IHC检测阴性，提示没有ALK重排的可能性很大。 加拿大

加拿大ALK研究(CALK)项目是一个覆盖全国的多中心研究，该研究的目的对ALK IHC 和FISH检测方法进行优化和标准化。该研究使用的样本经过了FISH检测的验证（包括 22例ALK阳性和6例ALK阴性的肿瘤样本）（Tsao 2013）。收集近2000例手术切除的 肺腺癌标本，制作组织芯片后经过IHC及FISH检测，选出研究用的样本。不告知结果 的样本切片送到参加研究的各实验室进行免疫组化及FISH检测，FISH检测使用分离探 针（雅培分子）；使用的免疫组化抗体有AK1抗体（Dako公司，一个研究中心用） ，5A4（Novocastra; 12个研究中心用）和D5F3（Cell Signaling Technology, 一个研究 中心用）；有的实验室使用自动染色机（Dako, Leica Biosystems, 或Ventana Medical Systems, Inc.）。收集了12家中心独立的免疫组化染色评分来对5A4抗体进行评估，收 集了11家中心的FISH结果进行分析。研究结果显示，IHC在不同实验室间的组间相关系 数（ICC）为0.84。 经过对IHC结果的初步分析和执业病理医生对切片的重复评分会议后，各实验室对 试验操作步骤进行了调整。对同一批样本进行了第二轮检测，免疫组化结果在不同实 验室间的组间相关系数提高到了0.94。FISH的组间相关系数是0.68，各中心FISH的敏

64 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

Adenocarcinoma patients with available ALK IHC data N=1099 100

ALK IHC– N=1030

ALK IHC 1:2 Matched Cohort N=207 Matching factors in order of importance: stage, gender/smoking status, center/ year of surgery/age ALK IHC+ N=69* 38 FISH–

22 FISH+

ALK IHC– N=138 1 FISH+

137 FISH–

99.3%

93.5%

87.5%

9.5% 90.5%

80

Percent

ALK IHC+ N=69

60 40 20 0

6.5% IHC result 0+ IHC result 1+

FISH ALK

12.5% IHC result 2+

FISH Negative

IHC result 3+

FISH Positive

*9, FISH not done

图1. ETOP 肺癌项目的研究结果. 1,099例肺腺癌中,69例IHC检测ALK阳性.IHC和FISH检测结果的一致性比 较见右图.

感性和特异性分别为88％-100%和100％。该研究的作者认为，多中心研究实现了ALK IHC和FISH检测的标准化；只有一例病例免疫组化与FISH结果不一致，免疫组化结果 为阴性，FISH检测为基因异常及临床意义不明的不典型表现。除这一例外，所有FISH 阳性的病例免疫组化都阳性。然而，研究结果也提示偶尔的FISH假阴性结果发生的 可能。 日本

2012年3月30日，日本药物医学委员会批准了克罗替尼上市，但该药在被列入国家 医疗健康保险药物价格表之前因报销问题不能应用于临床。在药物列入保险药物价 格表之前3个月，辉瑞日本基于伦理原因开展了药物资助项目，在一个注册医学机构 中当发现ALK阳性的肿瘤患者时，制药公司提供免费的克罗替尼进行治疗。在该项目 中，对福尔马林固定石蜡包埋样本同时进行FISH（Vysis LSI ALK分离FISH探针试剂盒， 雅培分子）和免疫组化检测（5A4抗体和EnVision FLEX+系统[Dako]及iAEP检测试剂盒 [Nichirei Biosystems]），细胞标本如胸水用RT-PCR的方法检测。共进行了5514次检 测： 2,630例进行了FISH检测， 2,631例进行了IHC检测，253例进行了RT-PCR.检测。 检测的成功率分别为93%、96%和94%。尽管FISH和IHC的一致性为98%，IHC的敏感性 只有为86%。有213例FISH和IHC结果均为阳性； 36例FISH阳性IHC阴性，12例FISH阴性 IHC阳性。2076例FISH和IHC结果均阴性。基于以上结果，日本肺癌学会在2011年的指 南中添加了一个特别说明，即使患者根据IHC和FISH检测结果认为适于接受ALK抑制剂 治疗，2种检测方法结果可能不一致，治疗前应慎重考虑利益风险(Mitsudomi 2011)。

65 第九章: 指南和标准化研究

法国

2007年法国国家癌症研究所(INCa)启动了一项前瞻性研究，由28家医院组成分子 基因检测平台，检测肺癌、肠癌和黑色素瘤中出现的生物标志物。作为该研究项目 一部分的法国多中心ALK检测确认研究，对500例手术切除的福尔马林固定石蜡包埋 组织进行检测，对使用5A4（Novocastra）和D5F3抗体（Cell Signaling Technology） 的IHC、FISH及定量RT-PCR方法进行了比较（Lantuéjoul 2013）。结果显示，459例 中340例FISH和IHC结果均阴性，85例FISH和IHC结果均阳性。2种检测结果不一致的病 例中，15例FISH阴性而IHC阳性(但染色很弱)；12例FISH阳性而IHC阴性。7例FISH检测 无法得到结果，但是其中5例IHC检测阳性。总之，以FISH结果做对照，IHC的敏感性为 87%，特异性为96%。用RT-PCR方法检测，ALK阳性病例中50%为变异体1型，30%为变 异体3a/b型，不到5%病例为变异体2或7型；20%为结果阴性或无法得到结果。研究者认 为，用5A4抗体进行IHC检测是一种可靠方便的检测方法，可用来常规检测ALK异常，而 FISH和定量RT-PCR方法仍依赖于检测前标本处理条件及技术上的专业性。然而，没有 一种方法是完全准确的，当临床特点提示一个病例的ALK是阳性的但检测结果是阴性 时，要用其他方法重复检测，以防止对ALK阳性患者漏诊。 德国

为了验证各个实验室的检测结果，德国病理学会(Deutsche Gesellschaft fur Pathologie; DGP)和德国病理医师协会(Berufsverband Deutscher Pathologie; BDP)组织 了多个实验室参加的轮流ALK融合检测。在该研究检测开始前阶段，10例肺癌样本进 行了FISH和IHC方法检测，结果由来自8个大学病理系的专家进行评估，判断样本的ALK 状态（V Laffert，2013）。然后将确定结果的样本制成组织芯片。各实验室应用不同公 司的FISH探针(Abbott或Zytovision GmbH公司)和抗体(ALK1, 5A4和 D5F3)、稀释浓度 （(1:20 到1:200）及检测系统（手工染色或Ventana、Leica和Dako公司的自动染色机） 进行检测。研究发现，每一种方法（FISH和IHC）对ALK阴性的病例均得到了正确的检 测结果，但是对ALK阳性病例的结果却不一致，尤其是IHC检测。这个研究说明，建立 检测ALK融合基因的标准检测步骤非常重要。 欧洲

为了确保检测结果的准确性，2013年van Krieken等发表了分子病理检测指南(van Krieken 2013)。.欧洲病理学会进行了一项检测非小细胞肺癌生物标记物突变的欧洲 外部质量评估项目，目的是提供生物标记物检测的准确性。该项目包括2轮评估ALK 检测的外部质量评估，分别有80和150个实验室参加。项目提供石蜡组织制作的组织 芯片和FISH检测结果的数字图像。2013年年底将获得2轮的检测结果。 对Ventana ALK免疫组化试剂盒的可重复性国际研究

为了研究IHC和FISH检测结果的相关性及Ventana ALK D5F3 免疫组化抗体（Ventana

66 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

Medical Systems, Inc.）的可重复性，7位国际学者对100例病例进行了阅片及结果评估。 数据显示免疫组化结果与ALK FISH相对照，IHC检测的敏感性为90%，特异性为95%，相 对于FISH其准确性为93%。在对免疫组化染色结果的判读上，在7位阅片者之间对95% 的病例判读结果一致，在其中6位阅片者之间对97%病例判读结果一致(Hirsch 2013)。 该研究作者认为，使用Ventana ALK 免疫组化试剂盒检测与ALK FISH 检测结果一致性 很高，并且阅片者之间及同一阅片者内部的判读结果一致性很高。

结论 虽然应用FISH分离探针检测ALK基因重排是公认的接受ALK TKI治疗的标准,但肺癌 ALK重排的检测方案仍在发展中。世界各国正在进行多个研究来制定国家或地区的ALK 检测指南；这些研究的重点是评估IHC作为筛查工具的的敏感性和特异性，并对IHC和 FISH检测进行标准化。随着这些研究结果的发表，有关ALK检测方案的国际共识将会在 未来几年内出现。

第十章

总结和未来展望 编者 Fred R. Hirsch, Yasushi Yatabe, and Ming Sound Tsao

有ALK重排的晚期非小细胞肺癌患者的靶向治疗效果在继续发展中，但ALK重排的诊 断仍具有挑战性。建立行之有效的ALK重排检测方法对晚期非小细胞肺癌患者治疗选择 非常关键,尤其当肿瘤是腺癌或含有腺癌成分。然而,一些问题还未有明确的答案。 1.哪些患者应进行ALK重排检测？ 2.最经济有效的ALK重排检测方法是什么？ 3.为了筛选出所有的可能从ALK抑制剂治疗中受益的患者，最佳的ALK诊断筛查 流程是什么？ 4.基于当前临床研究数据，最佳的治疗方案是什么？ 虽然最后一个问题超出了本书的范围,但前三个问题要重点讨论。

哪些患者应进行 ALK基因重排检测？ 已经达成的共识是，至少所有晚期非小细胞肺癌中的腺癌或有腺癌成分的患者都 应进行ALK重排检测。根据资源情况和学术兴趣，其它组织类型的晚期非小细胞肺癌 患者也应进行ALK检测，尤其是患者有一个或多个以下特征：年轻、不吸烟/轻度吸烟 史，EGFR和KRAS突变检测阴性。偶尔，ALK基因重排也见于非腺癌的组织学类型，尽 管这种情况很少见。 如果诊断标本是小标本或者不能排除含有腺癌成分，建议进行 ALK重排检测。 尽管目前对早期（I-III A期）非小细胞肺癌患者不建议用ALK抑制剂治疗，如果患者 肿瘤复发或进展为晚期，建议对手术标本进行包括ALK在内的分子检测。

最经济有效的筛查方法是什么? 在美国只有进行了ALK重排诊断的患者才能接受克唑替尼治疗，该检测经过了美国 FDA批准。目前只有一种检测方法通过了美国FDA批准：ALK FISH分离探针检测(雅培 分子)。但是,还没有一个特异的ALK筛查检测法。许多研究已经证实与ALK FISH相比 较，IHC方法有很高的特异性和灵敏度，许多指南已经推荐用IHC对晚期非小细胞肺

68 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

癌的大规模人群进行ALK基因重排筛查，对其中的阳性结果用FISH方法验证后进行靶 向治疗。目前不建议用RT-PCR方法进行ALK重排筛查。

最佳的用于ALK抑制剂治疗的诊断筛查流程是什么？ 虽然 IHC方法已被许多国家用来筛查，目前仍不清楚哪种检测结果应当用FISH进 行验证。一些指南建议所有IHC检测阳性的样本都需用FISH验证，而有些学者认为只 有IHC染色为1+和2+的样本需用FISH验证。只有获得样本检测结果与ALK抑制剂治疗 的反应性和治疗效果相关性的很多详细的临床及诊断资料后，才能确定最佳ALK诊断 筛查流程。在获得这些详细的相关性分析结果之前，作者建议所有IHC阳性的肿瘤应 进行FISH验证。然而逐渐有病例报道发现有的肿瘤患者ALK FISH阴性IHC阳性，用克 唑替尼治疗有效。在这种情况下,这些阴性的FISH结果可能是真阴性，也可能是因结 果处于临界值或FISH表现为非典型形态而判读为假阴性。对这些病例目前在进行更深 入的分析，将有助于寻找重要的问题的答案。

未来的发展方向在那里？ 从治疗的角度来看，几种二代ALK抑制剂例如双重ALK/EGFR抑制剂，目前处于临床 研发中，并有非常令人鼓舞的结果。未来的研究将探明什么诊断检测与最佳临床结果 相关。目前，FISH检测方法是决定患者能否用克唑替尼治疗的标准方法，并应用于二 代ALK抑制剂的临床研究中。然而，其他检测方法如IHC和PCR检测结果与治疗的相关 性正在研究中，未来的诊断筛查流程可能会有所改变。同样，新的多重检测法尤其 是二代测序技术，需要验证后才能应用于筛查及对选择接受ALK抑制剂治疗的非小细 胞肺癌患者。

结论 如本手册所述，ALK基因重排的诊断技术仍在发展中。在未来的几年中，诊断模式 可能会发生变化，并且新的靶向药物的出现可能促进其转变。然而，我们相信，现在 可以对ALK基因改变的这部分非小细胞肺癌患者进行合适的治疗。在这一领域的所有 专业人士应该确保所有可能受益于ALK靶向治疗的患者得到最佳的治疗。

69 参考文献

参考文献 Alici I, Demirci NY, Yilmaz A, et al. The combination of cytological smears and cell blocks on endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspirates allows a higher diagnostic yield. Virchows Arch. 2013;462(3):323-327.

Allouche M. ALK is a novel dependence receptor: potential implications in development and cancer. Cell Cycle.

2007;6:1533-1538.

Alrifai D, Popat S, Ahmed M, et al. A rare case of squamous cell carcinoma of the lung harbouring ALK and BRAF activating mutations. Lung Cancer. 2013;80(3):339-340.

An S, Chen ZH, Su J, et al. Identification of enriched driver gene alterations in subgroups of non-small cell lung cancer patients based on histology and smoking status. PLoS One. 2012;7(6):e40109.

Atkins D, Reiffen K-A, Tegtmeier CL, et al. Immunohistochemical detection of EGFR in paraffin-embedded tumor tissues: variation in staining intensity due to choice of fixative and storage time of tissue sections. J Histochem Cytochem.

2004;52(7):893-901.

Babic A, Loftin IR, Stanislaw S, et al. The impact of preanalytical processing on staining quality for H&E, dual hapten, dual color in situ hybridization and fluorescent in situ hybridization assays. Methods. 2010;52(4):287-300.

Bang Y, Kwak EL, Shaw AT, et al. Clinical activity of the oral ALK inhibitor PF-02341066 in ALK-positive patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) J Clin Oncol. 2010;28(18s):(suppl; abstr 3).

Betz B, Dixon CA, Weigelin HC, et al. The use of stained cytologic direct smears for ALK gene rearrangement analysis of lung adenocarcinoma. Cancer Cytopathol. 2013 Mar 27 [Epub ahead of print].

Biomarker Committee, Japanese Lung Cancer Society.

Guidance for ALK Gene Testing in Lung Cancer Patients. Version 1.0 August 1, 2011. Available at http://www.haigan.gr.jp/ uploads/photos/641.pdf.

Blackhall F, Peters S, Kerr KM, et al. Prevalence and clinical outcomes for patients with ALK gene rearrangement in Europe: preliminary results from the European Thoracic Oncology Platform Lungscape project. Ann Oncol.

2013;23(Suppl 9):ix73.

Boland J, Erdogan S, Vasmatzis G, et al. Anaplastic lymphoma kinase immunoreactivity correlates with ALK gene rearrangement and transcriptional up-regulation in nonsmall cell lung carcinomas. Hum Pathol. 2009;40(8):1152-1158.

Burnett R, Swanson Beck J, Howatson SR, et al. Observer variability in histopathological reporting of malignant bronchial biopsy specimens. J Clin Pathol. 1994;47(8):711-713.

Bussolati G, Leonardo E. Technical pitfalls potentially affecting diagnoses in immunohistochemistry. J Clin Pathol.

2008;61(11):1184-1192.

Camidge D, Bang YJ, Kwak EL, et al. Activity and safety of crizotinib in patients with ALK-positive non-small-cell lung

cancer: updated results from a phase 1 study. Lancet Oncol.

2012;13(10):1011-1019. (a) Camidge D, Kono SA, Flacco A, et al. Optimizing the detection of lung cancer patients harboring anaplastic lymphoma kinase (ALK) gene rearrangements potentially suitable for ALK inhibitor treatment. Clin Cancer Res. 2010;16(22):5581-5590.

Camidge DR, Skokan M, Kiatsimkul P, et al. Native and rearranged ALK copy number and rearranged cell count in non-small cell lung cancer. Implications for ALK inhibitor therapy. Cancer. 2013 Sept 10 [Epub ahead of print].

Camidge D, Theodoro M, Maxson DA, et al. Correlations between the percentage of tumor cells showing an anaplastic lymphoma kinase (ALK) gene rearrangement, ALK signal copy number, and response to crizotinib therapy in ALK fluorescence in situ hybridization-positive nonsmall cell lung cancer. Cancer. 2012;118(18):4486-4494. (b) Chen T, Chang IC, Liu HP, et al. Correlation of anaplastic lymphoma kinase overexpression and the EML4-ALK fusion gene in non-small cell lung cancer by immunohistochemical study. Chang Gung Med J. 2012;35(4):309-317.

Chihara D, Suzuki R. More on crizotinib [letter]. N Engl J Med. 2011;364(8):776-778.

Chuang M, Marchevsky A, Teirstein AS, et al. Diagnosis of lung cancer by fibreoptic bronchoscopy: problems in the histological classification of non-small cell carcinomas.

Thorax. 1984;39(3):175-178.

Coghlin C, Smith LJ, Bakar S, et al. Quantitative analysis of tumour in bronchial biopsy specimens. J Thorac Oncol.

2010;5(4):448-452.

Conklin C, Craddock KJ, Have C, et al. Immunohistochemistry is a reliable screening tool for identification of ALK rearrangement in non-small-cell lung carcinoma and is antibody dependent. J Thorac Oncol. 2013;8(1):45-51.

Dai Z, Kelly JC, Meloni-Ehrig A, et al. Incidence and patterns of ALK FISH abnormalities seen in a large unselected series of lung carcinomas. Molec Cytogenetics. 2012;5(1):44.

DiVito K, Charette LA, Rimm DL, Camp RL. Long-term preservation of antigenicity in tissue microarrays. Lab Invest.

2004;84(8):1071-1078.

Doebele R, Pilling AB, Aisner DL, et al. Mechanisms of resistance to crizotinib in patients with ALK gene rearranged non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2012;18(5):1472-1482.

Eberhard D, Giaccone G, Johnson BE; Non-Small-Cell Lung Cancer Working Group. Biomarkers of response to epidermal growth factor receptor inhibitors in Non-Small-Cell Lung Cancer Working Group: standardization for use in the clinical trial setting. J Clin Oncol. 2008;26(6):983-994.

Edwards S, Roberts C, McKean ME, et al. Preoperative histological classification of primary lung cancer: accuracy of diagnosis and use of the non-small cell category. J Clin Pathol. 2000;53(7):537-540.

70 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

Felip E, Gridelli C, Baas P, et al. Metastatic non-small-cell lung cancer: consensus on pathology and molecular tests, first-line, second-line, and third-line therapy: 1st ESMO Consensus Conference in Lung Cancer; Lugano 2010. Ann Oncol. 2011;22:1507-1519.

Gainor J, Varghese AM, Ou SH, et al. ALK rearrangements are mutually exclusive with mutations in EGFR or KRAS: an analysis of 1,683 patients with non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2013;19(15):4273-4281.

Garrido P, de Castro J, Concha Á et al. Guidelines for biomarker testing in advanced non-small-cell lung cancer. A national consensus of the Spanish Society of Medical Oncology (SEOM) and the Spanish Society of Pathology (SEAP). Clin Transl Oncol. 2012;14(5):338-339.

Halling K, Schrijver I, Persons DL. Test verification and validation for molecular diagnostic assays. Arch Pathol Lab Med. 2012;136(1):11-13.

Hirsch F, Yatabe Y, Dietel M, et al. ALK-immunohistochemistry (IHC) standardization with D5F3 antibody in non-small cell lung carcinoma (NSCLC): an international consensus study.

J Clin Oncol. 2013;31(May 20 Supplement):e22042.

Huang D KD, Kotsakis A, et al. Multiplexed deep sequencing analysis of ALK kinase domain identifies resistance mutations in relapsed patients following crizotinib treatment. Genomics.

2013 Feb 20 [Epub ahead of print].

Hunt J. Molecular pathology in anatomic pathology practice: a review of basic principles. Arch Pathol Lab Med. 2007; 132(2):248-260.

Inamura K, Takeuchi K, Togashi Y, et al. EML4-ALK fusion is linked to histological characteristics in a subset of lung cancers. J Thorac Oncol. 2008;3:13-17.

Jin G, Jeon HS, Lee EB, et al. EML4-ALK fusion gene in Korean non-small cell lung cancer. J Korean Med Sci. 2012; 27(2):228-230.

Jing X, Li QK, Bedrossian U, Michael CW. Morphologic and immunocytochemical performances of effusion cell blocks prepared using 3 different methods Am J Clin Pathol. 2013; 139(2):177-182.

Jokoji R, Yamasaki T, Minami S, et al. Combination of morphological feature analysis and immunohistochemistry is useful for screening of EML4-ALK-positive lung adenocarcinoma.

J Clin Pathol. 2010;63(12):1066-1070.

Kalhor N, Wistuba, II. Perfecting the fine-needle aspirate cell block. Cancer Cytopathol. 2013;121(3):109-110.

Kerr K. Clinical relevance of the new IASLC/ERS/ATS adenocarcinoma classification. J Clin Pathol. 2013 Apr 6 [Epub ahead of print]. (a) Kerr K, Loo PS, Nicolson MC. Pathology and personalized medicine in lung cancer. Lung Cancer Mange. 2013;2(1):35-46. (b) Khoury T. Delay to formalin fixation alters morphology and immunohistochemistry for breast carcinoma. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2012;20(6):531-542.

Kim H, Xu X, Yoo SB, et al. Discordance between anaplastic lymphoma kinase status in primary non-small-cell lung cancers and their corresponding metastases. Histopathology.

2013;62(2):305-314.

Kim H, Yoo S-B, Choe J-Y, et al. Detection of ALK gene rearrangement in non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol.

2011;6(8):1359-1366.

Knoepp S, Roh MH. Ancillary techniques on direct-smear aspirate slides: a significant evolution for cytopathology techniques. Cancer Cytopathol. 2013;121(3):120-128.

Koivunen J, Mermel C, Zejnullahu K, et al. EML4-ALK fusion gene and efficacy of an ALK kinase inhibitor in lung cancer.

Clin Cancer Res. 2008;14(13):4275-4283.

Kwak E, Bang YJ, Camidge DR, et al. Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 2010;363(18):1693-1703.

Lantuéjoul S, Rouquette I, Begueret H, et al. A French multicentric and prospective validation study for ALK translocation diagnosis in lung adenocarcinomas J Clin Oncol. 2013;31 (May 20 Supplement):8100.

Li T, Kung HJ, Mack PC, Gandara DR. Genotyping and genomic profiling of non-small-cell lung cancer: implications for current and future therapies. J Clin Oncol. 2013;31:1039-1049.

Li Y, Li Y, Yang T, et al. Clinical significance of EML4-ALK fusion gene and association with EGFR and KRAS gene mutations in 208 Chinese patients with non-small cell lung cancer. PLoS One. 2013;8(1):e52093.

Lin E, Li L, Guan Y, et al. Exon array profiling detects EML4-ALK fusion in breast, colorectal, and non-small cell lung cancers.

Mol Cancer Res. 2009;7:1466-1476.

Lindeman N, Cagle PT, Beasley MB, et al. Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors: guideline from the College of American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer, and Association for Molecular Pathology. J Thorac Oncol. 2013;8(7):823-859.

Lipson D, Capelletti M, Yelensky R, et al. Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies. Nature Med. 2012;18:382-384.

Lira M, Kim TM, Huang D, et al. Multiplexed gene expression and fusion transcript analysis to detect ALK fusions in lung cancer. J Molec Diag. 2013;15:51-61.

Loo P, Thomas SC, Nicolson MC, et al. Subtyping of undifferentiated non-small cell carcinomas in bronchial biopsy specimens. J Thorac Oncol. 2010;5(4):442-447.

Lopes L, Bacchi CE. Anaplastic lymphoma kinase gene rearrangement in non-small-cell lung cancer in a Brazilian population. Clinics (Sao Paulo). 2012;67:845-847.

Mano H, Takeuchi K. EML4-ALK fusion in lung [letter]. Am J Pathol. 2010;176(3):1552-1553.

Marchetti A, Ardizzoni A, Papotti M, et al. Recommendations for the analysis of ALK gene rearrangements in non-smallcell lung cancer: a consensus of the Italian Association of Medical Oncology and the Italian Society of Pathology and Cytopathology. J Thorac Oncol. 2013;8(3):352-358.

Martelli M, Sozzi G, Hernandez L, et al. EML4-ALK rearrangement in non-small cell lung cancer and non-tumor lung tissues. Am J Pathol. 2009;174(2):661-670.

71 参考文献

Martinez P, Hernandez-Losa J, Montero MA, et al. Fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry as diagnostic methods for ALK positive non-small cell lung cancer patients.

PLoS One. 2013;8(2):e52261.

Paik J, Choi CM, Kim H, et al. Clinicopathologic implication of ALK rearrangement in surgically resected lung cancer: a proposal of diagnostic algorithm for ALK-rearranged adenocarcinoma. Lung Cancer. 2012;76:403-409.

McLeer-Florin A, Moro-Sibilot D, Melis A, et al. Dual IHC and FISH testing for ALK gene rearrangement in lung adenocarcinomas in a routine practice: a French study. J Thorac Oncol. 2012;7(2):348-354.

Palmer R, Vernersson E, Grabbe C, Hallberg B. Anaplastic lymphoma kinase: signalling in development and disease.

Biochem J. 2009;420:345-361.

Minca E, Portier BP, Wang Z, et al. ALK status testing in nonsmall cell lung carcinoma: correlation between ultrasensitive IHC and FISH. J Mol Diagn. 2013;15(3):341-346.

Mino-Kenudson M, Chirieac LR, Law K, et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clin Cancer Res. 2010;16(5):1561-1571.

Mitiushkina N, Iyevleva AG, Poltoratskiy AN, et al. Detection of EGFR mutations and EML4-ALK rearrangements in lung adenocarcinomas using archived cytological slides. Cancer Cytopathol. 2013;121(7):370-376.

Moreira A, Hasanovic A. Molecular characterization by immunocytochemistry of lung adenocarcinoma on cytology specimens. Acta Cytol. 2012;56(6):603-610.

Morris S, Kirstein MN, Valentine MB, et al. Fusion of a kinase gene, ALK, to a nucleolar protein gene, NPM, in non-Hodgkin’s lymphoma. Science. 1994;263:1281-1284.

Murakami Y, Mitsudomi T, Yatabe Y. A screening method for the ALK fusion gene in NSCLC. Front Oncol. 2012;2:24.

Nakamura H, Tsuta K, Yoshida A, et al. Aberrant anaplastic lymphoma kinase expression in high-grade pulmonary neuroendocrine carcinoma. J Clin Pathol. 2013;66:705-707.

National Comprehensive Cancer Network. Non-small cell lung cancer. Version 2.2013. Available at www.nccn.org.

Nitta H, Tsuta K, Yoshida A, et al. New methods for ALK status diagnosis in non-small-cell lung cancer: an improved ALK immunohistochemical assay and a new, brightfield, dual ALK IHC-in situ hybridization assay. J Thorac Oncol. 2013; 8(8):1019-1031.

Noda Y, Fujita N, Kobayashi G, et al. Diagnostic efficacy of the cell block method in comparison with smear cytology of tissue samples obtained by endoscopic ultrasound-guided fine-needle aspiration. J Gastroenterol. 2010;45(8):868-875.

Ochi N, Yamane H, Yamagishi T, et al. Can we eliminate squamous cell carcinoma of the lung from testing of EML4ALK fusion gene? Lung Cancer. 2013;79(1):94-95.

Orell S, Sterrett GF (eds). Orell and Sterrett’s Fine Needle Aspiration Cytology, 5th ed. New York: Churchill Livingstone; 2011.

Oyama T, Ishikawa Y, Hayashi Y, et al. The effects of fixation, processing and evaluation criteria of immunohistochemical detection of hormone receptors in breast cancer. Breast Cancer. 2007;12(2):182-188.

Paik J, Choe G, Kim H, et al. Screening of anaplastic lymphoma kinase rearrangement by immunohistochemistry in nonsmall cell lung cancer: correlation with fluorescence in situ hybridization. J Thorac Oncol. 2011;6(3):466-472.

Park H, Lee JK, Kim DW, et al. Immunohistochemical screening for anaplastic lymphoma kinase (ALK) rearrangement in advanced non-small cell lung cancer patients. Lung Cancer.

2012;77:288-292.

Peled N, Palmer G, Hirsch FR, et al. Next-generation sequencing identifies and immunohistochemistry confirms a novel crizotinib-sensitive ALK rearrangement in a patient with metastatic non-small-cell lung cancer. J Thorac Oncol.

2012;7(9):e14-16.

Pelosi G, Gasparini P, Cavazza A, et al. Multiparametric molecular characterization of pulmonary sarcomatoid carcinoma reveals a nonrandom amplification of anaplastic lymphoma kinase (ALK) gene. Lung Cancer. 2012;77:507-514.

Perner S, Wagner PL, Demichelis F, et al. EML4-ALK fusion lung cancer: a rare acquired event. Neoplasia. 2008;10(3):298-302.

Popat S, Gonzalez D, Min T, et al. ALK translocation is associated with ALK immunoreactivity and extensive signetring morphology in primary lung adenocarcinoma. Lung Cancer. 2012;75:300-305.

Prinsen C, Klaassen CH, Thunnissen FB. Microarray as a model for quantitative visualization chemistry. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2003;11:168-173.

Rekhtman N, Paik PK, Arcila ME, et al. Clarifying the spectrum of driver oncogene mutations in biomarker-verified squamous carcinoma of lung: lack of EGFR/KRAS and presence of PIK3CA/AKT1 mutations. Clin Cancer Res. 2012; 18(4):1167-1176.

Rikova K, Guo A, Zeng Q, et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer.

Cell. 2007;131:1190-1203.

Rivera M, Mehta AC, American College of Chest Physicians.

Initial diagnosis of lung cancer: ACCP evidence-based clinical practice guidelines (2nd edition). Chest. 2007;132(3 Supple):131S-148S. Rodig S, Mino-Kenudson M, Dacic S, et al. Unique clinicopathologic features characterize ALK-rearranged lung adenocarcinoma in the western population. Clin Cancer Res. 2009;15(16):5216-5223.

Ross J, Cronin M. Whole cancer genome sequencing by nextgeneration methods. Am J Clin Pathol. 2011;136:527-539.

Rothschild S, Zippelius A, Betticher DC, et al. Neue Therapiekonzepte beim Bronchuskarzinom. Schweiz Med Forum. 2011;11:7.

Ruschoff J, Kerr KM, Grote HJ, et al. Reproducibility of immunohistochemical scoring for epidermal growth factor receptor expression in non-small cell lung cancer. Arch Pathol Lab Med. 2012 Dec 27 [Epub ahead of print].

72 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

Sakairi Y, Nakajima T, Yasufuku K, et al. EML4-ALK fusion gene assessment using metastatic lymph node samples obtained by endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration. Clin Cancer Res. 2010;16(20):4938-4945.

Salido M, Pijuan L, Martinez-Aviles L, et al. Increased ALK gene copy number and amplification are frequent in non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol. 2011;6(1):21-27.

Sanders H, Li HR, Bruey JM, et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genet. 2011;204:45-52.

Sasaki T, Rodig SJ, Chirieac LR, et al. The biology and treatment of EML4-ALK non-small cell lung cancer. Eur J Cancer. 2010;46:1773-1780.

Savic S, Bode B, Diebold J, et al. Detection of ALK-positive non-small-cell lung cancers on cytological specimens: high accuracy of immunocytochemistry with the 5A4 clone. J Thorac Oncol. 2013;8(8):1004-1011.

Saxe D, Persons DL, Wolff DJ, et al. Validation of fluorescence in situ hybridization using an analyte-specific reagent for detection of abnormalities involving the mixed lineage leukemia gene. Arch Pathol Lab Med. 2012;136(1):47-52.

Schildhaus H, Deml KF, Schmitz K, et al. Chromogenic in situ hybridization is a reliable assay for detection of ALK rearrangements in adenocarcinomas of the lung. Mod Pathol.

2013 Jun 7 [Epub ahead of print].

Schreiber G, McCrory DC. Performance characteristics of different modalities for diagnosis of suspected lung cancer: summary of published evidence. Chest. 2003;123(1 Suppl):115S-128S. Selinger C, Rogers TM, Russell PA, et al. Testing for ALK rearrangement in lung adenocarcinoma: a multicenter comparison of immunohistochemistry and fluorescent in situ hybridization. Mol Pathol. 2013 Jun 7 [Epub ahead of print].

Shaozhang Z, Xiaomei L, Aiping Z, et al. Detection of EML4ALK fusion genes in non-small cell lung cancer patients with clinical features associated with EGFR mutations. Genes Chromsomes Cancer. 2012;51(10):925-932.

Shaw A, Kim DW, Nakagawa K, et al. Crizotinib versus chemotherapy in advanced ALK-positive lung cancer. N Engl J Med. 2013;368(25):2385-2394.

Shaw A, Yeap BY, Mino-Kenudson M, et al. Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK. J Clin Oncol. 2009;27(26):4247-4253.

Shaw A, Yeap BY, Solomon BJ, et al. Effect of crizotinib on overall survival in patients with advanced non-small-cell lung cancer harbouring ALK gene rearrangement: a retrospective analysis. Lancet Oncol. 2011;12(11):1004-1012.

Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature. 2007;448(7153):561-566.

Soda M, Isobe K, Inoue A, et al. A prospective PCR-based screening for the EML4-ALK oncogene in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2012;18(20):5682-5689.

Sun J, Choi YL, Won JK, et al. A dramatic response to crizotinib in a non-small-cell lung cancer patient with IHC-positive and FISH-negative ALK. J Thorac Oncol. 2012;7:e36-e38.

Sun Y, Ren Y, Fang Z, et al. Lung adenocarcinoma from East Asian never-smokers is a disease largely defined by targetable oncogenic mutant kinases. J Clin Oncol.

2010;28(30):4616-4620.

Takahashi T, Sonobe M, Kobayashi M, et al. Clinicopathologic features of non-small-cell lung cancer with EML4-ALK fusion gene. Ann Surg Oncol. 2010;17(3):889-897.

Takamochi K, Takeuchi K, Hayashi T, et al. A rational diagnostic algorithm for the identification of ALK rearrangement in lung cancer: a comprehensive study of surgically treated Japanese patients. PLoS One. 2013;8(8):e69794.

Takeuchi K. Interpretation of anti-ALK immunohistochemistry results [letter]. J Thorac Oncol. 2013;8(7):e67-e68.

Takeuchi K, Choi YL, Soda M, et al. Multiplex reverse transcription-PCR screening for EML4-ALK fusion transcripts.

Clin Cancer Res. 2008;14(20):6618-6624.

Takeuchi K, Choi YL, Togashi Y, et al. KIF5B-ALK, a novel fusion oncokinase identified by an immunohistochemistry-based diagnostic system for ALK-positive lung cancer. Clin Cancer Res. 2009;15(9):3143-3149.

Takeuchi K, Soda M, Togashi Y, et al. RET, ROS1 and ALK fusions in lung cancer. Nature Med. 2012;18:378-381.

Tanaka H, Tone K, Hayashi A, et al. Clinical application of immunocytochemical detection of ALK rearrangement on cytology slides for detection or screening of lung adenocarcinoma. Lung Cancer. 2013;80(3):289-292.

Thomas J, Lamb D, Ashcroft T, et al. How reliable is the diagnosis of lung cancer using small biopsy specimens?

Report of a UKCCCR Lung Cancer Working Party. Thorax. 1993; 48(11):1135-1139.

Thunnissen E, Boers E, Heideman DA, et al. Correlation of immunohistochemical staining p63 and TTF-1 with EGFR and K-ras mutational spectrum and diagnostic reproducibility in non small cell lung carcinoma. Virchows Arch. 2012;461(6):629-638. (a) Thunnissen E, Bubendorf L, Dietel M, et al. EML4-ALK testing in non-small cell carcinomas of the lung: a review with recommendations. Virchows Arch 2012;461(3):245-257. (b)

Shinmura K, Kageyama S, Tao H, et al. EML4-ALK fusion transcripts, but no NPM-, TPM3-, CLTC-, ATIC-, or TFG-ALK fusion transcripts, in non-small cell lung carcinomas. Lung Cancer.

2008;61(2):163-169.

Thunnissen E, Kerr KM, Bubendorf L, et al. External quality assessment for ALK immunohistochemistry testing in lung adenocarcinoma within the European Thoracic Oncology Platform Lungscape Project. Ann Oncol. 2012;23(suppl 9):2932. (c)

Sholl L, Weremowicz S, Gray SW, et al. Combined use of ALK immunohistochemistry and FISH for optimal detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas. J Thorac Oncol.

2013;8(3):322-328.

Thunnissen E, Kerr KM, Herth FJ, et al. The challenge of NSCLC diagnosis and predictive analysis on small samples. Practical approach of a working group. Lung Cancer. 2012;76(1):1-18. (d)

73 参考文献

To KF, Tong JH, Yeung KS, et al. Detection of ALK rearrangement by immunohistochemistry in lung adenocarcinoma and the identification of a novel EML4-ALK variant. J Thorac Oncol.

2013;8(7):883-891.

Wong D, Leung EL, So KK, et al. The EML4-ALK fusion gene is involved in various histologic types of lung cancers from nonsmokers with wild-type EGFR and KRAS. Cancer.

2009;115(8):1723-1733.

Togashi Y, Soda M, Sakata S, et al. KLC1-ALK: a novel fusion in lung cancer identified using a formalin-fixed paraffinembedded tissue only. PLoS One. 2012;7:e31323.

Wu S, Kuo YY, Chang YL, et al. EML4-ALK translocation predicts better outcome in lung adenocarcinoma patients with wildtype EGFR. J Thorac Oncol. 2012;7(1):98-104.

Travis W, Brambilla E, Noguchi M, et al. International Association for the Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/ European Respiratory Society international multidisciplinary classification of lung adenocarcinoma. J Thorac Oncol. 2011; 6(2):244-285.

Yang P, Kulig K, Boland JM, et al. Worse disease-free survival in never-smokers with ALK+ lung adenocarcinoma. J Thorac Oncol. 2012;7(1):90-97.

Travis W, Brambilla E, Noguchi M, et al. Diagnosis of lung cancer in small biopsies and cytology: implications of the 2011 International Association for the Study of Lung Cancer/ American Thoracic Society/European Respiratory Society classification. Arch Pathol Lab Med. 2013;137(5):668-684.

Tsao M, Craddock K, Brandao G, et al. Canadian ALK (CALK): A pan-Canadian multicenter study to optimize and standardize ALK immunohistochemistry (IHC) and fluorescence in situ hybridization (FISH) for ALK gene rearrangements. J Clin Oncol. 2013;31(May 20 Supplement):8096.

V Laffert M, Warth A, Penzel R, et al. Anaplastic lymphoma kinase (ALK) gene rearrangement in non-small cell lung cancer (NSCLC): results of a multi-centre ALK-testing. Lung Cancer. 2013;81:200-206. van Krieken J, Normanno N, Blackhall F, et al. Guideline on the requirements of external quality assessment programs in molecular pathology. Virchows Arch. 2013;462:27-37.

Wang R, Hu H, Pan Y, et al. RET fusions define a unique molecular and clinicopathologic subtype of non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2012;30:4352-4359. (a) Wang R, Pan Y, Li C, et al. The use of quantitative real-time reverse transcriptase PCR for 5’ and 3’ portions of ALK transcripts to detect ALK rearrangements in lung cancers.

Clin Cancer Res. 2012;18(4725-4732. (b)

Yi E, Boland JM, Maleszewski JJ, et al. Correlation of IHC and FISH for ALK gene rearrangement in non-small cell lung carcinoma: IHC score algorithm for FISH. J Thorac Oncol 2011;6:459-465.

Yi E, Chung JH, Kulig K, Kerr KM. Detection of anaplastic lymphoma kinase (ALK) gene rearrangement in non-small cell lung cancer and related issues in ALK inhibitor therapy: a literature review. Mol Diagn Ther. 2012;16:143-150.

Yoshida A, Tsuta K, Nitta H, et al. Bright-field dual-color chromogenic in situ hybridization for diagnosing echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase-positive lung adenocarcinomas. J Thorac Oncol.

2011;6(10):1677-1686. (a) Yoshida A, Tsuta K, Watanabe S, et al. Frequent ALK rearrangement and TTF-1/p63 co-expression in lung adenocarcinoma with signet-ring cell component. Lung Cancer. 2011;72:309315. (b) Zhang X, Zhang S, Yang X, et al. Fusion of EML4 and ALK is associated with development of lung adenocarcinomas lacking EGFR and KRAS mutations and is correlated with ALK expression. Mol Cancer. 2010;9:188.

Zhang Y-G, Jin M-L, Li L, et al. Evaluation of ALK rearrangement in Chinese non-small cell lung cancer using FISH, immunohistochemistry, and real-time quantitative RT-PCR on paraffin-embedded tissues. PLOS One. 2013;8(5):e64821.

Wang Z, Zhang X, Bai H, et al. EML4-ALK rearrangement and its clinical significance in Chinese patients with advanced non-small cell lung cancer. Oncology. 2012;83(5):248-256.

Zhang Y, Sun Y, Pan Y, et al. Frequency of driver mutations in lung adenocarcinoma from female never-smokers varies with histologic subtypes and age at diagnosis. Clin Cancer Res. 2012;18(7):1947-1953.

Werner M, Chott A, Fabiano A, Battifora H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. Am J Surg Pathol. 2000;24(7):1016-1019.

Zhou J, Yang H, Deng Q, et al. Oncogenic driver mutations in patients with non-small-cell lung cancer at various clinical stages. Ann Oncol. 2013;24(5):1319-1325.

Wolff A, Hammond ME, Schwartz JN, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 2007;131(1):18-43.

Japan

US/Korea

US/Switzerland FISH/RT-PCR

Japan

Japan

US

Soda et al., 2007

Koivunen et al., 2008

Perner et al., 2008

Shinmura et al., 2008

Takeuchi et al., 2008

Boland et al., 2009

IHC/FISH

US

US

Japan

China (HK)

Japan

Japan

Spain

China

Japan

Rodig et al., 2009

Shaw et al., 2009

Takeuchi et al., 2009

Wong et al., 2009

Jokoji et al., 2010

Sakairi et al., 2010

Salido et al., 2010

Sun Y et al., 2010

Takahashi et al., 2010

IHC/FISH

Korea

US

Paik et al., 2011

Yi et al., 2011

FISH/IHC

RACE/ RT-PCR

Zhang X et al., 2010 China

RT-PCR/Direct Seq

RT-PCR

FISH/IHC

IHC/FISH & RT-PCR

IHC

RT-PCR

IHC/RT-PCR & FISH

FISH

RT-PCR/FISH/IHC

Martelli et al., 2009 Italy/Spain

IHC/FISH/RT-PCR

RT-PCR/FISH/Gen Seq

RT-PCR/Gen Seq

RT-PCR

RT-PCR

RT-PCR

China

Rikova et al., 2007

Test Platform

Country

Study

101

735

103

313

52

107

109

254

266

130

141

358

120

335

340

77

603

305

75

103

No. of NSCLC*

10 (9.9%)

28 (3.8%)

12 (11.7%)

5 (1.6%)

3 (5.8%)

3 (2.8%)

7 (6.4%)

8 (3.1%)

13 (4.9%)

4 (3.1%)

19 (13.5%)

20 (5.6%)

9 (7.5%)

6 (1.8%)

11 (3.2%)

2 (2.6%)

16 (2.7%)

8 (2.6%)

5 (6.7%)

4 (4%)

No. (%) ALK+

20 (5.6%)

3 (4.8%)

5 (2.7%)

11 (4.3%)

2 (4.0%)

-

8 (3.8%)

2 (10.0%)

-

No. (%) ALK+

101

395

62

211

52

69

82

254

209

130

10 (9.9%)

27(6.8%)

10 (16.1%)

5 (2.4%)

3 (5.8%)

3 (4.3%)

7 (8.5%)

8 (3.1%)

11 (5.3%)

4 (3.1%)

130 18 (12.8%)

358

63

185

253

50

-

208

20

-

No. of ADC

0

292

29

75

0

30

18

0

34

0

2

0

48

150

71

20

-

88

11

-

No. of SCC

0

0

2 (6.9%)

0

0

0

0

0

0

0

0

0

4 (8.3%)

1 (0.7%)

0

0

-

0

1 (9.1%)

-

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

4

0

2

0

7

3

-

9

2

No. (%) No. ALK+ ADSC

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1 (25%)

0

2 (100%)

0

0

0

-

0

0

-

No (%) ALK+

附录1 已发表的有关肺癌ALK基因重排的研究总结

0

48

12

27

0

8

9

0

23

0

5

0

7

0

9

4

-

0

42

-

No. NSCLC, others

0

1 (2.1%)

0

0

0

0

0

0

2 (8.7%)

0

0

0

0

0

0

0

-

0

0

-

No. (%) ALK+

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

24

0

-

0

0

-

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

-

0

0

-

Never-smokers with adenocarcinoma

Never-smokers

Non/light smokers, Asian, women

NE Ca included SCLC + LCNEC

No. No (%) Patient NE Ca ALK+ Selection

国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

74

China

China

Zhang Y-G et al., 2013

Zhou et al., 2013

ARMS RT-PCR

RT-PCR/IHC/FISH

IHC/FISH/RT-PCR

IHC/FISH

IHC/FISH

FISH/IHC

239

15 (6.3%)

28 (5.7%)

20 (4.2%)

22 (5.9%)

12 (6.5%)

32 (12.8%)

7 (7.1%)

7 (3.4%)

75 (4.4%)

15 (4.3%)

34 (11.3%)

39 (34%)

11 (9.7%)

8(7.8%)

25 (9.7%)

31 (3.8%)

29 (6.6%)

10 (6.0%)

49 (3.7%)

39 (34%)

10 (10.5%)

5 (6.2%)

17 (9.3%)

30 (4.2%)

29 (6.6%)

9 (7.4%)

-

10 (7.7%)

349

341

373

186

-

79

95

-

349

25 (7.2%)

19 (2.6%)

22 (5.9%)

12 (6.5%)

-

5 (6.3%)

6 (6.3%)

-

15 (4.3%)

300 34 (11.3%)

116

95

73

182

713

441

121

-

130

101

112

0

-

7

96

-

0

0

0

18

14

0

52

0

46

-

97

2 (2.0%)

0

0

-

0

0

-

0

0

0

1 (5.6%)

1 (7.1%)

0

1 (1.9%)

0

1 (0.2%)

-

4 (4.1%)

12665 662 (5.2%) 6775 444 (6.6%) 1411 18 (1.3%)

488

469

373

186

249

99

208

1683

349

300

116

113

102

258

811

441

167

1387

-

78

18

4

0

-

0

7

-

0

0

0

0

14

0

8

0

0

-

-

7 (9.0%)

1 (5.6%)

0

0

-

0

1 (14.3%)

-

0

0

0

0

2 (14.3%)

0

0

0

0

-

376

20

12

0

-

13

10

-

0

0

0

0

1

76

38

0

0

-

12

17 (4.5%)

0

1 (8.3%)

0

-

2 (15.4%)

0

-

0

0

0

0

0

8 (10.5%)

0

0

0

-

1 (8.3%)

28

0

0

0

-

0

0

-

0

0

0

0

0

4

0

0

0

-

0

0

0

0

0

-

0

0

-

0

0

0

0

0

0

0

0

0

-

0

Female neversmokers

Never-smokers

EGFR wild-type, pleural effusion

Women, non/ light smokers, and/or adenocarcinoma

EGFR wild-type or nonresponse to previous EGFR TKIs

*Excludes neuroendocrine cancers (NE Ca); NSCLC = non-small cell lung carcinoma, ADC = adenocarcinoma, SCC = squamous cell carcinoma, ADSC = mixed adenocarcinoma/squamous cell carcinoma, SCLC = small cell lung carcinoma LCNEC = large cell neuroendocrine carcinoma, EGFR = epidermal growth factor receptor, TKIs = tyrosine kinase inhibitors, RT-PCR = reverse transcriptase polymerase chain reaction, FISH = fluorescence in situ hybridization, Gen seq = genetic sequencing, IHC = immunohistochemistry, RACE = rapid amplification of cDNA ends, and ARMS amplification-refractory mutation system.

Total

US

US

Minca et al., 2013

China (HK)

Spain

Martinez et al., 2013

Sholl et al., 2013

China

Li Y et al., 2013

To et al., 2013

FISH

US

Gainor et al., 2013

RT-PCR/IHC

RACE-PCR

Zhang Y et al., 2012 China

IHC/FISH

US

RT-PCR

Yang et al., 2012

China

Shaozhang et al., 2012

IHC/FISH

RT-PCR/FISH

Korea

Park et al., 2012

RT-PCR/IHC/FISH

Taiwan

Japan

Murakami et al., 2012

IHC/FISH

RT-PCR

Wu et al., 2012

France

McLeer-Florin et al., 2012

FISH/IHC

Korea

Jin et al., 2012

RACE-PCR

FISH

Wang Z et al., 2012 China

China

US

An et al., 2012

Dai et al., 2012

附录1

75

76 国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册

附录2 美国病理医师协会/国际肺癌研究学会/美国分子病理学会共同发布的 选择接受EGFR和ALK酪氨酸激酶抑制剂治疗的 患者的分子检测指南建议总结

第1部分. 肺癌患者何时应进行分子标志物检测？ 问题1. 那些患者应该进行EGFR突变和ALK重排检测？

1.1a: 推荐：EGFR分子检测用于选择接受EGFR为靶点的酪氨酸激酶抑制剂治疗的患者，不能 根据临床特征把肺腺癌患者排除在检测之外。 1.1b: 建议：ALK分子检测用于选择接受ALK为靶点的酪氨酸激酶抑制剂治疗的患者，不能根 据临床特征把肺腺癌患者排除在检测之外。 1.2: 推荐：在肺癌切除样本中，不管组织学分级程度，建议对肺腺癌或含有腺癌成分的 混合性癌样本进行EGFR和ALK检测。在完整切除的肺癌样本中，不建议对缺乏任何 腺癌成分的样本进行EGFR和ALK检测，例如“纯”鳞癌、“纯”小细胞癌，或免疫组 化证实没有腺癌分化的大细胞癌。 1.3: 推荐：对于小活检样本（活检组织，细胞学），因取材局限不能完全排除患者存在 腺癌成分的可能。小活检是鳞癌或小细胞癌的病例，但临床信息（例如年轻，无吸烟 史）可能在选择是否进行EGFR和ALK检测时有价值。 1.4: 推荐：初次治疗时，肿瘤原发灶或转移灶肿瘤组织同样适合进行EGFR和ALK检测。 1.5: 专家共识：多原发灶肺腺癌，可以对每个病灶进行检测，但没有必要对于单一肿瘤的 不同部位取材进行检测。

问题2. 何时对患者进行EGFR突变或ALK 重排检测?

2.1a: 推荐：适合接受靶向治疗的晚期（IV期，根据第7版TNM分期系统）肺腺癌患者在确 诊时就应进行EGFR检测，或分期较早且以前没有进行过EGFR检测的患者在肿瘤复发 或疾病进展时要进行EGFR检测。 2.1b: 建议：适合接受靶向治疗的晚期（IV期，根据第7版TNM分期系统）肺腺癌患者在确诊 时就应进行ALK重排检测，或分期较早且以前没有进行过ALK检测的患者在肿瘤复发或 疾病进展时要进行ALK检测。 2.2a: 专家共识：鼓励I、II、III期的肺腺癌患者在确诊时接受EGFR检测，但是否检测要根据 每个实验室的情况并与肿瘤科医师协商决定。 2.2b: 专家共识：鼓励I、II、III期的肺腺癌患者在确诊时接受ALK检测，但是否检测要根据每 个实验室的情况并与肿瘤科医师协商决定。 2.3: 推荐：组织应优先用于EGFR 和ALK检测，而不是其它基因检测。

问题3.应该几天完成检测报告？ 3.1: 3.2:

3.3:

专家共识：EGFR和ALK检测应在实验室收到标本后2周内(10个工作日)完成。 专家共识：平均检测时间超过2周的实验室，当临床急需检测结果时要提供更快速的 检测，可以是内部的改进或将样本送到其他实验室。 专家共识：实验室应当建立一个病理诊断流程，在标本完成组织学诊断后3个工作日

内送达外部分子病理实验室，24小时内送达内部分子病理实验室。

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第2部分 如何进行EGFR检测？ 问题4.应如何处理进行EGFR突变检测的标本？ 4.1: 专家共识：福尔马林固定石蜡包埋样本、新鲜样本、冷冻、酒精固定样本均可用于 基于PCR的EGFR突变检测。进行EGFR检测的样本要避免经酸、重金属固定剂或脱钙 液处理。 4.2: 专家共识：细胞学样本可进行EGFR和ALK检测，细胞学蜡块比涂片更适合检测。 问题5.EGFR突变检测对标本有什么要求？ 5.1: 专家共识：病理医师应对每例样本的肿瘤细胞量及提取的DNA的质和量进行评估，来 判断样本是否足够进行EGFR检测。 5.2: 专家共识：实验室应经过试验后，制定保证突变检测有效所需的最小肿瘤细胞数量的 标准。 5.3: 专家共识：病理学家应评估每个标本的肿瘤细胞数量，并亲自操作或指导经过培训的 技师用微切割方法进行肿瘤细胞的富集。 问题6.如何进行EGFR检测？ 6.1: 推荐：实验室可以使用任何具有足够性能特点的有效测试方法。 6.2: 专家共识：实验室使用的EGFR检测方法要能够对含有至少50%肿瘤细胞的样本进行 检测，尽管强烈鼓励实验室使用更敏感的能检测只含10%肿瘤细胞标本的检测方法， 或将标本送到使用更敏感方法的外部实验室检测。 6.3: 专家共识：临床的EGFR检测应能检测到肺腺癌中所有已报道的只占1%的突变类型。 6.4 : 推荐：不建议用EGFR免疫组化方法筛选接受EGFR抑制剂治疗的患者。 6.5: 推荐：不建议用EGFR基因拷贝数分析（例如FISH或CISH）筛选接受EGFR抑制剂治疗 的患者。 问题7.在选择接受EGFR抑制剂靶向治疗的患者时，KRAS检测的作用是什么？ 7.1: 推荐：不建议用KRAS突变检测作为是否接受EGFR抑制剂治疗的唯一决定因素。 问题8.对EGFR TKI获得性（继发性）耐药患者进行用药调整时，还有哪些其他分子标志物检 测是可以考虑的？ 8.1: 推荐：对获得性耐药患者的样本进行EGFR检测时，使用的检测方法应能够在低至5% 的肿瘤细胞中检测出二次突变EGFR T790M突变。

第3部分

如何进行ALK检测？

问题9. 应使用哪种方法进行ALK检测？ 9.1: 推荐：实验室应使用含有双色标记分离探针的ALK FISH检测方法来选择接受ALK

TKI治疗的患者；可以用经过仔细验证的免疫组化方法作为筛查工具，来筛选进行ALK

FISH检测的标本。

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9.2: 推荐：不建议用RT-PCR方法替代FISH检测来筛选接受ALK TKI治疗的患者。 9.3: 专家共识：病理医师应参与评估肿瘤的组织结构、细胞形态和标本质量，选择合适的 切片进行ALK FISH检测。 9.4: 专家共识：病理医师应参与ALK FISH 染色结果的判读，要么由病理医师直接阅片分 析结果，要么由接受过专业的实体肿瘤FISH分析培训的细胞遗传研究员或技师阅片分 析结果，然后由病理医师审核结果。 9.5: 专家共识：目前不建议在临床实践中进行ALK抑制剂获得性耐药的ALK基因突变检测。

第4部分 应常规检测腺癌中的其它基因吗？ 问题10. 要检测肺癌中其它分子标志物么？ 10.1a: 推荐：肺腺癌中应优先进行EGFR检测。 10.1b: 建议：肺腺癌患者经EGFR检测后应，与其他推荐的分子标记物相比应优先进行ALK检 测。目前已发表的数据尚不足以支持进行其他基因检测。

第5部分

应该如何实施和操作肺腺癌的分子测试？

问题11．所有肺腺癌都必须检测EGFR和ALK吗？ 11.1: 专家共识：在保证检测时间的前提下，采取序贯检测法可提高肺腺癌分子检测的效率。

问题12．怎样报告EGFR和ALK检测结果？ 12.1: 专家共识：EGFR突变检测报告和ALK FISH报告都应包括结果和解释部分，报告要使 肿瘤专业医师和非该专业的病理医师能够容易理解。

问题13. 怎样验证EGFR和ALK检测的结果？ 13.1: 专家共识： EGFR和ALK检测应遵循与其它分子诊断和FISH检测同样的准则。 问题14. 如何保证检测的质量？ 14.1: 专家共识： 实验室应建立与其他临床实验室同样的肺癌EGFR和ALK的质量控制和 和质量保证措施。尤其是进行EGFR和ALK检测来指导TKI用药的实验室在条件允许时 要参加质量控制测试。 缩写：CISH: 显色原位杂交；EGFR: 表皮生长因子受体；FISH: 荧光原位杂交；PCR: 聚合酶链反应；RT-PCR: 逆转录聚合酶链反应； TKI: 酪氨酸激酶抑制剂；TNM: 肿瘤淋巴结转移分期。

经Lindeman NI, Cagle PT, Beasley MB等允许后引用. Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors: Guideline from the College of American Pathologists (CAP), International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC), Association for Molecular Pathology (AMP). J Thorac Oncol 2013;8:823-859.

编写国际肺癌研究学会（IASLC）肺癌ALK检测手册的目的是，帮 助病理医生、实验室人员及临床医生更好得了解各种ALK检测方法 及理解检测结果。对晚期非小细胞肺癌患者进行ALK重排检测，选 择适合接受ALK抑制剂治疗的患者。在美国，已经批准FISH用于该 检测，但其他检测方法也有应用。在晚期非小细胞肺癌患者选择 最佳治疗方案时，ALK基因重排的分子检测是极其重要的。本手册 的内容包括选择合适的患者进行ALK检测，介绍几种不同的检测方 法并比较它们的不同之处，讨论及推荐合理的检测流程。

国际肺癌研究学会（IASLC）感谢辉瑞公司肿瘤部对ALK检测手册 项目的慷慨资助和大力支持。

www.iaslc.org