IASLC Atlas of ALK Testing in Lung Cancer - Japanese Translation

編集者 Ming SOUND Tsao, MD, FRCPC Fred R. Hirsch, MD, PhD Yasushi Yatabe, MD, PhD

肺癌におけるALKテスト IASLC アトラス

international Association for the Study of Lung Cancer

肺癌におけるALKテスト IASLC アトラス

International Association for the Study of Lung Cancer, Aurora, Colorado, USA 編集者： Ming Sound Tsao, MD, FRCPC Fred R. Hirsch, MD, PhD Yasushi Yatabe, MD, PhD IASLC Press によって出版された IASLC 出版物 邦訳にあたって次の方々の協力をいただきました。マークベントン (Intermed English Services)、木村花代子、近藤千晶、柴田典子、尾関順子、太田裕子。 表紙および本のレイアウトは Biographics によるオリジナルデザイン IASLC Press オフィス: IASLC, 13100 East Colfax Ave., Unit 10, Aurora, Colorado 80011, USA www.iaslc.org 2013年10月初版 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ISBN: 978-1-940488-05-9 著作権 c2013 International Association for the Study of Lung Cancer 禁無断転載 著作権法上の例外を除き、書面による事前の承諾無しで出版物の部分的利用、検索シ ステムへの保存あるいは導入、あるいは全ての転載を禁止します。 出版時点における本文の情報は真実かつ正確であると確信していますが、いかなる間 違いや不作為についてIASLC、編集者、および出版者は法的責任を負いません。出版 者は内容に関して明示的にも黙示的にも保証を負いません。

肺癌におけるALKテスト IASLC アトラス 編集者

Ming Sound Tsao, MD, FRCPC Fred R. Hirsch, MD, PhD Yasushi Yatabe, MD, PhD

international Association for the Study of Lung Cancer

謝辞 IASLC はこのALKアトラスのプロジェクトに対する Pfizer Oncology が提供した寛大な資金とサポートに 深く感謝します。また 共編者およびすべての担当者は Lori Alexander, MTPW, ELS, の編集援助、Deborah A. Whippen, Editorial Rx, Inc., および Rania Gaspo, PhD, Pfizer Oncology のサポートに対し感謝致します。

目次

執筆者リスト. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

略語 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

製造業者

前書き . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

第1章

ALKテストの対象

第2章

検体採取、処理、および 診断の手順 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

第3章

蛍光インシチューハイブリダイゼーション法（FISH) . . . . . . . . . . . 17

第4章

免疫組織化学法（IHC）. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

第5章

逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR)およびマルチプ レックス遺伝子解析法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

第6章

ALKテストのための解析プラットホームの比較 . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

第7章

細胞診におけるALKテスト . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

第8章

ALKテストの報告書 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

第9章

ガイドラインおよびテスト標準化の研究 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

第10章

概要および展望. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

参考文献 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

付記1

肺癌におけるALK遺伝子再構成についての報告された研究の 概要再構成 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

付記2

EGFR およびALKチロシンキナーゼ阻害剤で治療を受ける 肺がん患者を選択するためのCAP/IASLC/AMP の遺伝子 検査のガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

List of Contributors 編集者 Ming Sound Tsao, MD, FRCPC Pathologist and Senior Scientist, Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network Professor, Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto Toronto, Canada

Fred R. Hirsch, MD, PhD Professor, Department of Medicine Department of Pathology University of Colorado at Denver Denver, Colorado, USA

Yasushi Yatabe, MD, PhD Chief, Department of Pathology and Molecular Diagnostics, Aichi Cancer Center Nagoya, Japan 担当者リスト

分担執筆者 Elisabeth Brambilla, MD, PhD Professor, Département d’Anatomie et Cytologie Pathologiques INSERM U823 Institut Albert Bonniot Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble, Université Joseph Fourier Grenoble, France Lukas Bubendorf, MD Professor and Head, Division of Cytopathology Institute for Pathology, University Hospital Basel Basel, Switzerland Jin-Haeng Chung, MD, PhD Professor, Department of Pathology Seoul National University Bundang Hospital Seoul, South Korea

Keith M. Kerr, FRCPath Professor, Department of Pathology Aberdeen University Medical School Aberdeen Royal Infirmary Aberdeen, Scotland, United Kingdom Sylvie Lantuéjoul, MD, PhD Professor and Chair, Département d’Anatomie et Cytologie Pathologiques INSERM U 823 Institut Albert Bonniot Centre Hospitalier Universitair A Michallon, Université Joseph Fourier Grenoble, France Kengo Takeuchi, MD, PhD Pathology Project for Molecular Targets of the Cancer Institute Division of Pathology of the Cancer Institute Hospital Japanese Foundation for Cancer Research Tokyo, Japan

Erik Thunnissen, MD, PhD Consultant Pathologist, VU University Medical Center Amsterdam, The Netherlands Marileila Varella-Garcia, PhD Professor, Department of Medicine/ Medical Oncology Department of Pathology University of Colorado at Denver Denver, Colorado, USA Ignacio Wistuba, MD Professor and Chair, Jay and Lori Eisenberg Endowed Professor Department of Translational Molecular Pathology The University of Texas MD Anderson Cancer Center Houston, Texas, USA Akihiko Yoshida, MD, PhD Attending Pathologist, Department of Pathology National Cancer Center Hospital Tokyo, Japan

2013年イタリアのソレントで開催された IASLCALKテストワークショップ参加者。 前例左からY. Yatabe, M. Varella-Garcia, E. Brambilla, S. Lanteujoul, R. Gaspo （Pfizer Oncology）, J-H Chung; 後列左 からA. Yoshida, I. Wistuba, F. R. Hirsch, M. S. Tsao, E. Thunnissen, L. Bubendorf, K. Kerr。

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略語

略語

本文で使用されている略語。 AEC: 3-アミノ-9-エチルカルバゾール ALK: 未分化リンパ腫キナーゼ AMP: Association for Molecular Pathology ATS: American Thoracic Society CAP: College of American Pathologists CISH:クロモゲンインシチューハイブリダイゼーション DAB: 3, 3’ ジアミノベンジジン EBUS: 超音波気管支鏡 EDTA: エチレンジアミン四酢酸 EGFR: 上皮成長因子受容体（Epidermal growth factor receptor） EML4: echinoderm microtubule-associated protein-like 4 ERS: European Respiratory Society ETOP: European Thoracic Oncology Platform EUS: 経食道超音波法 FDA: 米国食品医薬品局 FFPE: ホルマリン固定パラフィン包埋 FISH: 蛍光インシチューハイブリダイゼーション FNA: 細針吸引細胞診 H&E: ヘマトキシリン-エオジン HER2: ヒト上皮成長因子受容体-2 iAEP: intercalated antibody-enhanced polymer IASLC: International Association for the Study of Lung Cancer IHC: 免疫組織化学的検査 ISH: インシチューハイブリダイゼーション KIF5B: kinesin family member 5B NOS: Not otherwise specified NSCLC: 非小細胞肺癌 NGS: 次世代シークエンシング RET: retがん遺伝子 ROS1: c-ros がん遺伝子 1 RT-PCR: 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 SCLC: 小細胞肺癌 TKI: チロシンキナーゼ阻害剤 v: 変形体（variant)

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製造業者

以下の製造業者および製品が本アトラスに記載されています。各製造業者について記載された場所は 唯一のものでは有りません。 多くの製造業者が世界各地にオフィスを持っています。

Abbott Molecular Abbott Park, Illinois, USA Vysis LSI ALK Break Apart FISH Probe Kit, Spectrum Orange Probe, and Spectrum Green Probe

Leica Biosystems Buffalo Grove, Illinois, USA Wetzlar, Germany Bond-Max, Novolink Polymer Detection System

Abcam Cambridge, UK Anti-ALK antibody（5A4）

Nichirei Biosciences, Inc. Tokyo, Japan 5A4 antibody（Histofine ALK Detection Kit）

BD（Becton, Dickinson and Company） Diagnostics Franklin Lakes, New Jersey, USA SurePath Cell Signaling Technology Danvers, Massachusetts, USA D5F3 antibody（ALK [D5F3] XP Rabbit mAb） Dako Glostrup, Denmark Carpinteria, California, USA ADVANCE, ALK1 antibody, EnVision, EnVision+, EnVision FLEX, and EnVision FLEX+, PT Link, and Target Retrieval Solution Hologic, Inc. Bedford, Massachusetts, USA ThinPrep Invitrogen, Life Technologies Corporation Carlsbad, California, USA Anti-ALK antibody

Novocastra Newcastle, UK 5A4 antibody NanoString Technologies Seattle, Washington, USA NanoString assay Pfizer Oncology New York, New York, USA XalkoriTM Ventana Medical Systems, Inc. （member of the Roche group） Tucson, Arizona, USA BenchMark XT, iVIEW DAB Detection Kit, OptiView DAB IHC Detection Kit, OptiView Amplification Kit, and ultraView Universal DAB Kit, and Rabbit Monoclonal Primary Antibody assay ZytoVision GmbH Bremerhaven, Germany ZytoDot 2C SPEC ALK break-apart probe

前書き

執筆担当：Ming Sound Tsao, Fred R. Hirsch, および Yasushi Yatabe

過去数年間にわたって、進行肺癌に罹患する患者の診断および治療はめざましい変化をとげ た。現在は、新規標的療法に対する治療戦略は特定のがん関連遺伝子異常の有無に基づい て決定されている。最初に肺癌で発見されたそのような遺伝子異常は上皮成長因子受容体 （EGFR）キナーゼ領域の突然変異で、この変異のある腫瘍は EGFR チロシンキナーゼ阻害剤 （TKIs）に感受性の高い事が明らかとなった。それ以来、未分化リンパ腫キナーゼ （ALK） 遺伝子が肺癌における2番めのドライバー変異である事が明らかになり、それに対する非常 に効果的な療法が新たに開発された。新しいALK融合遺伝子は 2 番染色体の短腕における再 構成再構成によって形成されるもので、ALK（2p23.2）および echinoderm microtubuleassociated protein-like 4（EML4）（2p21）をコードする遺伝子または、まれに、他の染 色体上の遺伝子と関連している。この新しい融合遺伝子による蛋白質には、EML4 遺伝子の 酸性領域が新しいキメラ蛋白質の二量体形成を促すことによって、ALKキナーゼの恒常的な 活性化をもたらす。再構成遺伝子再構成によるEML4-ALK融合遺伝子として、複数のバリア ントが同定されている。融合体はEML4 遺伝子の N 末端部分そしてALK遺伝子の C 末端キ ナーゼ領域から成り立っている 。 この遺伝子の再構成は大きい染色体の逆位および転座を含むため、FISH（蛍光インシチュ ーハイブリダイゼーション法）によってすべてのALK遺伝子再構成を検出する事ができる。 またこの方法がALK阻害剤である crizotinib（Xalkori®、Pfizer Oncology）の最初の臨床試 験において本遺伝子の異常検出に使用され（Bang 2010, Kwak 2010, Camidge 2012）、 ALKブレイクアパート再構成プローブを使用した FISHがALK再構成 のある肺癌診断の標準 的評価法となるとともに、米国食品医薬品局（FDA）は Vysis LSI ALK Break Apart FISH Probe Kit（Abbott Molecular）を承認した。この解析方法は明確な陽性及び陰性結果の判 定基準をもち、再構成進行非小細胞性肺癌（NSCLC）に罹患するALK再構成陽性の患者を選 別するために使用された 。第I／II相試験では、crizotinib は奏功率 61% と無増悪生存期 間の中央値が9.7か月であることが示された（Camidge 2012年）。無作為化第III相試験 （PROFILE 1007）では従来の化学療法に抵抗性の患者に対して crizotinib治療と標準的化学 療法が比較され、crizotinib による治療は 65% の奏功率（化学療法では 20%）および 7.7 か月の無増悪生存期間の中央値（化学療法では 3.0か月）（Shaw 2013年）が示された。

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肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

新世代 のALK阻害剤が開発され、これらの阻害剤の臨床試験が現在行われている。さま ざまな遺伝子の再構成のパターンが明らかになり、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物の塩 基配列決定を用いた融合遺伝子の検出方法が開発された。さらに、多数の施設での研究によ り、シグナル増強法を用いた免疫組織化学的検査（IHC）を使用して、 FISHでALK陽性で あったほとんどすべての腫瘍にALK蛋白質が検出できたことが明らかとなった。また複数の 症例報告で、非定型FISHパターンでALK陰性とされた NSCLC の腫瘍（ALK FISH 陰性）が IHC 検査でALK陽性となりALK阻害剤が奏功することもあることが報告されている（Peled 2012）。そのため、IHC キットが現在開発および評価中である。 これらの複数の診断プラットホームの開発によってALK遺伝子再構成あるいは融合蛋白 の検出が、検査施設での専門技術や装置の利用可能状況に応じて選択する事が可能になって いる。臨床診断テストは優れた再現性と信頼性が要求されるため、これらの解析方法の標準 化は必須である。この問題を扱うために、IASLCの病理部会（the Pathology Committee of the International Association for the Study of Lung Cancer）は専門委員を招集し、 進行 NSCLC に罹患する患者に対するALKテスト法の背景、プロトコール、そして結果の解 釈についての病理医、検査医、および臨床医の一助となるよう、この指針を出版することに した。

第1章 ALKテストの対象

執筆担当：Fred R. Hirsch, Elisabeth Brambilla, および Ming Sound Tsao

ALK遺伝子再構成 を検出することは進行 NSCLC の患者に対する有効な治療法を選択す る上で重要であることは広く認識されている。しかし、臨床病理学的な特徴によってALK の検査を受けるべき患者を決定できるのかどうかは明白ではない。ALK遺伝子再構成 は 非喫煙者、前軽度喫煙者、若い患者、及び肺腺癌として分類される腫瘍により高頻度に 認められる。だからといって年齢が高い喫煙者の扁平上皮細胞の組織をALKテストから除 外すべきだろうか？ 発表された研究か NSCLC-Others らは、ALK陽性の NSCLC 患者の約 70 (n=376) ADSC (n=78) ～80% は非喫煙者（前喫煙者あるいは 現在喫煙者は 20% から30%）で、また SCC (n=1411) NSCLC 罹患者全体（60から70歳）ある NSCLC (n=4025) いはEGFR 突然変異を伴う NSCLC 罹患 者（60から65歳）よりずっと若い（40 から50歳）と報告されている（Rodig ADC (n=6775) 2009、Shaw 2009、Bang 2010、 Kwak 2010、Shaw 2011）。しかし、 研究全体を見ると、ALK再構成をもつ腫 11.1 瘍は70歳以上、あるいは40歳未満の患者 9 にも認められている。 5.7 5.2 4.8 これらのデータから、喫煙の経験お 1.3 よび年齢によって患者のALKテストをす べきか否かは明確でない。組織学的診断 NSCLC ADC ADC SCC ADSC NSCLCOthers (unselected) (selected) がより重要な選択基準だと考えられる。 文献で報告された12,000以上の肺癌標 図1。NSCLC におけるALK遺伝子再構成に関する研究の概 要。A. 2013年5月までに報告されたALK異常の研究結果。 本の内、ALK再構成は主として非扁平上 ここでは「NSCLC」は腫瘍のタイプを特定せず、「NSCLC 皮および非神経内分泌の肺癌（図1、 付 以外」は 腺扁平上皮癌(ADSC)および大細胞／肉腫様癌を 含んでいる。B. 腫瘍の組織学的ALK陽性例の推定比率。腺 記1）に見られている。これらのデータ に基づいて、the College of American 癌 (ADC)の結果は、臨床選択基準(例えば喫煙経歴、EGFR 陰性または KRAS 突然変異)の有無による有病率を提示して Pathologists（CAP）/International いる。数値は付記1で示されるデータに基づく。SCC = 扁 Association for the Study of Lung 平上皮細胞癌。

A

B

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肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

Cancer（IASLC）/Association for Molecular Pathology（AMP）によって発表された最 新のガイドラインを含むいくつかの公表されたガイドラインでは、進行 NSCLC 患者にはル ーチンに扁平上皮組織によるALKテストを行わない事を推奨している（Lindeman 2013）。 （ALKテスト指針の詳細な議論については付記2 および第9章を参照.） 【訳注: 生検組織や 細胞診検体での検討であれば組織型によらずすべての患者で検査すべきとされている】 し かしながら、ALK再構成は1,400 以上の扁平上皮細胞の肺癌の約 1.3%に検出される（付 録1）とともに、症例によっては IHC でも確認されたALK再構成が報告されている（Alrifai 2013、An 2013、Ochi 2013）。扁平上皮細胞の報告間での違いは、NSCLC の組織学的 サブタイプの診断が難しいことによる可能性がある。肺癌の診断はしばしば生検標本または 細胞診検体によって行われるが、生検標本による病理組織学的な診断は常に腫瘍全体の組織 像を代表するものではない。EGFR やKRAS 突然変異を有する扁平上皮細胞癌を再検査した 結果 16 の腫瘍中 15 に腺癌の成分が確認された（Rekhtman 2012）。そのため、CAP/ IASLC/AMP のガイドラインはALKテストを、完全に切除できた肺癌標本が採取できる場合 にのみ腺癌患者および腺癌の成分をもつ混合型肺癌の症例のみに実施することを提案してい る。ALKテストはまた、腺癌成分の存在が完全に否定できない生検および細胞診検体のよう な限られた標本について実施するよう推奨されている。 ALKテストのためのIHCによるスクリーニングは、扁平上皮細胞性肺癌に対するALKテス トの問題を払拭する理想的な解決策となる可能性がある。低コストと高い再現性、感受性、 および特異性を考慮すると IHC 検査は扁平上皮細胞性肺癌患者に、より高価なFISHによる 確認をするのに悪くない選択といえる。 限局性または限局−局所性 NSCLCを有する患者については現在のところALK再構成検査 と治療介入との関連性は示されていない。しかし、多くの患者は再発するため、ALKテスト は有益と考えられ、結果があれば再発後に実施される治療までの時間と労力を節約すること ができる。

第2章 検体採取、処理、および 診断の手順

執筆担当：Keith M。Kerr、Ignacio Wistuba、および Yasushi Yatabe

ALK遺伝子再構成検査は、肺癌組織検体を使用して行われる診断方法の1つである。多くの 患者では、一回に採取できる組織検体は少量であり、診断に十分な情報を得るには最も効率 のよい方法で検体を使用する必要がある。組織検体について記憶に留めるべき2つの重要な ポイントがある、すなわち 検体が腫瘍細胞を有しない可能性があることと、組織を固定し て処理するのは一回限りだということである。全ての診断が同一検体を使用して行われる ため、検体採取と処理は品質管理の重要な工程である。

診断のための組織採取

多くの場合、ALKテストは進行期患者から採取される生検よって得られる小組織標本また は細胞診用の検体で行われる。頻度は少ないものの、早期の段階で外科的切除が行われ、 その後再発した患者では、その切除腫瘍が利用できる可能性もある。診断のための組織採 取は最も安全で、侵襲性の少なくかつ最大の腫瘍組織が獲得できる方法で施行すべきであ る（Thunnissen 2012d）。検体採取は原発腫瘍、胸腔内転移巣、または胸腔外への転移 性腫瘍についても施行されることがある。原発性と転移性腫瘍の間のALKテスト結果に相 違が報告されたが（Kim 2013年）、それは組織採取方法が原因であるとするにはデータが 不十分である。原発腫瘍は内視鏡検査法（内部気管支あるいは経気管支鉗子による生検、低 温生検、または穿刺吸引 [FNA] による）で、または経皮、経胸アプローチ（針生検あるい は FNA による）で検体採取を行うことがある。現在では胸腔内転移は EBUS （気管支内超 音波検査） または EUS（経食道超音波検査）のガイダンスに基づいた検体採取が一般に行 われているし、胸膜病変（の胸膜生検あるいは体腔液細胞診）はしばしば良い診断材料とな る。胸腔外への遠隔転移症は場所に応じた適切な検体採取が可能である。いずれの場合も、 複数の画像技術を使用して目標を定めて検体採取を行うことがよりよい腫瘍採取につながる （Rivera 2007年）。多くの医療施設では、画像ガイド下で十分な材料が採取されない場 合、またはその方法が好ましく無い場合は外科手術が行われる。

ALKテスト用組織

ALKテストには組織生検と細胞診検体のいずれも用いることができる。重要な点は材料が 適切に処理されて取り扱われるべきこと、および検体が十分な腫瘍細胞を有することであ る（Thunnissen 2012b）。ALK蛋白質を IHC で検出するのに必要な腫瘍細胞の数は決め

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肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

られていないが、ALK遺伝子再構成を FISH で検出するには最低 50個の確認できる腫瘍細 胞が必要である。細胞診塗抹標本に代わるいくつかの作成方法があるが、細胞診検体での 最適な方法はセルブロックの作成であり、組織生検検体と同様に切片を作成し処理するこ とができる。 組織や細胞材料の全ては通常病理検査施設で受付され、処理されるべきもの である。概して直径 3 cm以下の腫瘍検体は生検と同様に処理されるべきであるが、その 他の外科切除検体いの処理は異なる。多量の胸水もまた一部のみ処理される場合がある。 全ての診断作業が完了するまで胸水は保存しておくことが望まれる。

組織の処理

10% の中性緩衝ホルマリン液による浸漬固定、または必要に応じて膨張固定が推奨される。 ある種のアルコールベースの固定液による前処理は組織の抗原性あるいは DNA 断片化状態 を変える可能性がある。骨の生検検体に使用される酸性脱灰液は IHC を阻害する可能性が ありばかりでなく、FISHテストを損ない、 DNA を劣化させ、突然変異検査結果の信頼性 を低下させる。酸性の固定液（例えばブアン液）また重金属塩類をベースとした固定液は 避けるべきである。総じて、特にバイオマーカーを検査する際（DNAの断片化防ぐことが 重要である）には固定時間は6時間以上、48時間以下が推奨される（Wolff 2007年、Hunt 2007年）。固定不足あるいは固定過剰は DNA および蛋白質の抗原エピトープに悪い影響 をもたらす場合がある（Werner 2000年、Atkins 2004年、Oyama 2007年、Bussolati 2008年、Eberhard 2008年）。組織処理における重要点の1つは、患者から検体が切除さ れた直後から保存液の中に移されるまでの時間である。多くの実験室は組織切除から固定液 に浸漬するまでの時間と検査施設へ到着するまでの時間を記録する事ができず、またそのデ ータもないのが実情である。さらに、多くの自動組織処理装置は固定の工程があるため、固 定時間が増加する。実際には、多くの検査施設はそれぞれの平均的な固定時間に見合うよう に IHC および ISH（in situ hybridization）に関連する染色工程を調節している。多くの外 部機関から広範囲の異なる固定方法で処理された検体を受け取る大きい検査施設では、固定 の性質と時間を見極めることが大きな問題となっている。

バイオマーカー検査用組織の取り扱い

多くのバイオマーカー検査 （IHC、ISH、または RNA/DNA の検査） は初回診断過程に行 われる。この場合、 バイオマーカー検査には新たに作成した切片を使用すべきである。ガラ ス上に保存された組織切片は数日あるいは数週間内に劣化してしまい、数ヶ月内には完全に 劣化して使用することができなくなる。劣化の程度は貯蔵条件とバイオマーカーの種類によ って左右される（Atkins 2004年）。未染切片上のALK蛋白質の安定性についてはまだ系統 的な研究が行われていない。従って、乳癌の HER2 検査にならって、 6週間以上保存され た組織切片スライドはALKの IHC 検査に使用すべきではない。貯蔵が必要な場合は、切片 をワックスあるいは同等の素材で被覆して空気酸化を防ぎ、涼しく、乾燥した、暗い条件で 保存すべきである。FFPE（ホルマリン固定パラフィン包埋）ブロックは劣化し難いので、多 くの場合必要に応じて再度切片を作成することができる。さまざまな試みにより、初回の形 態検査、IHC 染色、およびその後の分子解析用にブロックから切片を作成する必要回数を減 らすことができる。例えば、一回目の標本作製時に余分な切片を切って置く場合がある。そ

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第2章: 検体採取、処理、および 診断の手順

のような方法は再度標本を作成するときにつきものの無駄を省くことができるが、一方で、 不必要な標本作成が行われることや作成された切片の保存に関する問題もある。（図1）。

Common procedure to date H & E staining for histologic diagnosis Repeat sectioning

For IHC Repeat sectioning

For molecular testing

The procedure in era of molecularly targeted drugs

H & E staining for histologic diagnosis For IHC

For molecular testing

図1。診断までの過程で行われる組織切片の調整法。現在、通常の方法では組織学的診断のため、切片作成とH&E （ヘマトキシリン-エオジン）染色を行う。IHC 検査および/または分子検査が必要の際には再度切片作成を行っ ている。何回も切片作成を行うことにより、切片作成毎に腫瘍の量が減る可能性がある。分子標的療法の時代で は、予想される IHC の解析や分子検査のために追加未染切片を作成することで組織検体の無駄を減少させるとと もに、所用時間を短縮することができる。

検体評価の第一歩は悪性腫瘍の有無を識別することである。患者、検体採取方法、およ び診断者の技量によるが、およそ腫瘍陽性の検出率は60～90% 以上に及ぶ（Schreiber 2003年）。検体に腫瘍が存在しても、それぞれの組織片全体に存在せず、提出された組織 のごく一部分のみに存在する場合があることは広く知られている（Coghlin 2010年）。 悪 性腫瘍が確認されれば、次のステップは 非上皮細胞悪性腫瘍（リンパ腫あるいは肉腫等） の可能性および/または癌、特に腺癌の場合、別の臓器からの肺転移であるという可能性を

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肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

鑑別することである（Kerr 2013b）。このステップは多くの場合検体とともに提供される 十分な臨床及びレントゲン画像情報と基本的なH&Eによる形態学的評価に基づいて容易に 行う事ができる。しかし臨床情報が不足していると、胸腔外の腫瘍を鑑別するために不必 要なIHC を施行し、その結果残りの検体が遺伝子検査にまわらなくなる可能性がある。 腫瘍が原発肺癌だと仮定すると、次のステップは SCLC（小細胞肺癌）と他の組織型を区 別することである。それは進行 SCLC と NSCLC が異なる方法で治療されるためである。こ の区別は通常形態学上の特徴に基づいて正しく診断することができる（Burnett 1994年） が、IHC が必要となる場合もある。SCLC 以外の多くの症例は扁平上皮細胞癌腫、腺癌ま たは、まれに、他の NSCLC タイプとして形態学的に正確に、再現性をもって分類するこ とができる。しかし 25～40% の症例では、検体のタイプと混合型の症例により、形態学 上の特徴だけで正確な、再現性のある NSCLC のサブタイプに分類できない場合があるのも 知っておかなければならない。そのような症例の初回診断は NSCLC-NOS（not otherwise specified）とすべきである（Chuang 1984年）。NSCLC のサブタイプを推測するために診 断用の IHC を行うことが多い（Loo 2010年、Travis 2011年、Travis 2013年）。このアプ ローチは、限られた IHC パネルを使用して NSCLC-NOS の割合を 10% 以下に減らし、多 くの NOS の NSCLC サブタイプを 80% 以上の精度で推定できる（Loo 2010年）。IHC 検 査で腺癌と推定され、形態学的に分別できない症例は、IHC 検査方法を使用していることと ともに、推奨されている診断用語（例えば、NSCLC、推定腺癌 [favor adenocarcinoma]） を用いて報告すべきである（Travis 2011年、Kerr 2013a）。

まとめ

分子標的治療が可能な腫瘍をもつ患者の選択は、現在では標準的な手法となっている。初回 の形態学的診断と必要に応じた IHC による腫瘍亜型の決定に加えて、遺伝子テストを施行 するには、診断用腫瘍組織の採取、取り扱い、処理、およびよく考えた組織の使用が非常に 重要となる。引き続いて行われる診断過程に利用可能な十分量の腫瘍組織が確保される様に 最善を尽さねばならない。しかし、時として組織量が十分確保できない事態は避けられず、 腫瘍の診断に続く遺伝子テストに大きな影響を及ぼしかねない。組織量が不十分なことによ り、生検が繰り返し行われる例が増加している。

第3章 FISH: 蛍光インシチューハイブリダイゼーション 担当著者：Akihiko Yoshida および Marileila Varella-Garcia

ブレークアパートプローブセットを用いた FISH は染色体間の転座によって形成された融合 遺伝子を検出するために開発された方法である。ブレークアパート FISH は融合パートナー が不明であっても、FFPE 標本を用いて容易に検討できるため、外科病理での信頼できる診 断方法ということができる。ALKテストのためのブレークアパートプローブを用いた FISH はリンパ腫および肉腫の診断に広く用いられており、NSCLC の一群にALK再構成が報告さ れてからは本法の適用が広がっている（Soda 2007）。しかし、肺癌の場合 FISH はこれ までとは異なった課題に直面している。それは主として、ALK（2p23.2）と近接している EML4（2p21）遺伝子の間に形成される染色体逆位による融合遺伝子が多く、他の遺伝子 との染色体転座によって起る融合は非常にまれだからである。従って、ALK再構成を有す る肺癌の診断に施行するブレークアパート FISH はその技術の詳細や結果の解釈に特別な 注意が要求される。

FISH プローブのデザイン

ALKブレークアパートプローブは通常 3ʼ（telomeric）側の融合切断ポイントを一種の蛍光 色素で標識し、そして 5ʼ（centromeric）側を別な蛍光色素で標識して作成される。 特定の 遺伝子領域に対するプローブおよび標識用蛍光試薬には、市販およびカスタムプローブとし ていくつかの種類がある。Abbott Molecular 社が開発したキット(図1、Vysis LSIALKBreak Apart FISH Probe Kit）では、3ʼ 300 kb 442 kb 側 (約 300 kb）はオレンジ色のシ 3' 5' グナル(Spectrum Orange,赤の波 2p23.2 長の干渉フィルターを用いて検出 ALK EML4 されるため、文献ではしばしば赤 Normal と表現されている）で、そして5ʼ 側（約 442 kb）は緑色のシグナル ~12.5 Mb inversion EML4-ALK fusion （Spectrum Green）で表現され ALK:EML4 る。このプローブセットはALK阻害 ALK:EML4 剤使用ためのコンパニオン診断法と して米国のFDAによって承認され、 図1。肺癌におけるEML4-ALK融合遺伝子（ALK再構成）を検査するため の Vysis LSIALKBreak Apart FISH Probe Kit (Abbott Molecular）。 世界的に広く使用されている。

18

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

解析前の必要事項

DNA 解析法として、FISH には代えがたい優れた利点がある。しかし、本解析法は多くの 要因、特に標本を固定するタイミング、固定時間、固定液のタイプ、によって影響を受け、 これらの全てが DNA の分解に繋がる可能性がある（表1）（Hunt 2007, Babic 2010）。 例えば長時間低温下で乏血条件に置かれたり、組織の固定が組織の切除から１時間以上経て 行われたりすることは DNA の断片化により、FISHテストの結果が得られない場合がある （Khoury 2012）。理想的な固定時間は 6 から 48時間の間と考えられている（Hunt 2007、 Babic 2010）。固定時間が短過ぎたり、長過ぎたりすると検査の性能に影響を及ぼすこと が知られている 。 表1。FISH 成功のための解析前の推奨事項

パラメータ

推奨

固定までの時間

1 時間を超えないようにできるだけ短く

固定液

10% の中性緩衝ホルマリン液

固定時間

6-48 時間

切片

パラフィン包埋セクション、5 ±1 μmの厚さに薄切する

標本の保存

組織ブロック（理想としては)

ブロックのための保存時間

適切条件下では考慮する必要がない

ブロックの保存条件

光、熱および湿気を避ける

切片の保存時間

4-6週(理想としては）; 古いスライドには特別なプロトコールが必要

脱灰

EDTA、必要な場合のみ

最適な固定液は 10% の中性緩衝ホルマリン液であり、ブアン液はハイブリダイゼーシ ョンを妨げる。強酸性溶液で脱灰された組織はほとんど確実にハイブリダイゼーションを妨 げる。 EDTA または蟻酸による軽度脱灰は通常検査性能に大きな問題を起こさない。脱灰 操作は、骨に転移した病巣が分子解析に利用可能な唯一の検体である場合は特に注意せねば ならない。そのような場合、骨の脱灰程度を H&E 染色組織の状態から推測できる。この状 態を見ることで標本を FISHテストに堤出する否かを決定できることが多い。 解析がうまくいくためのもう一つの要因は未染スライドの新しさと保存条件である。室 温で長時間保存された未染スライド上の組織は、標準的な FISH 解析で満足できる結果を 得る事はまれで、特別なプロトコールが必要である。従って、組織をブロック内に包埋し ておくことは理想的な保存方法である。パラフィンブロックの許容保存時間は保存条件（ 例えば、温度、光への露出度、熱、湿気）によって左右され、DNA の分断化を起こす条件 に置かれた材料はハイブリダイゼーションに失敗する可能性がある。 ハイブリダイゼーション前後の多くの要素が検査に影響を与える可能性もある。ハイブ リダイゼーション前処理はプローブの腫瘍細胞核への浸透を促進する一連の工程からなっ ている。この透過処理は大きい蛋白質を消化することによってなされるが、全ての標本が 特定のプロトコールに同様に反応するとは限らない。ハイブリダイゼーション前処理に対 し分化の悪い腫瘍はより影響を受けやすく、一方線維性および粘液性腫瘍はより影響を受

19

第 3 章: 蛍光インシチューハイブリダイゼーション

けにくい。ハイブリダイゼーション後の洗浄はシグナル強度を減少すること無く、非結合 プローブを十分に除去するために行われる。多くの代替プロトコールが優れた結果を生む 場合がある。従って、検査ラボは条件が標本の特性に合うように別のプロトコールを選ぶ 事も考えられる。

ハイブリダイズした標本の品質評価と結果の判定可能な細胞の選択

解析を進める上で組織の形態およびシグナル強度の質を厳格に査定することが必要である。 形態がよく保たれ、バックグラウンドノイズが非常に低い、十分なシグナル強度を有する場 合が解析に適切であると言える（図 2および 3）。クロマチンの過剰消化またはプローブの 浸透性の低い標本は評価すべきでな く、トラブルシューティングをした 後で再検査すべきである。例えば、 組織の前処理が不十分または過剰な 場合（図 4）、または切片作成技術 が原因で細胞核上に紐状のシグナル が重複して赤と緑の分離測定が不可 能な時は標本を評価すべきではない （図 5）。 A ALK再構成が腫瘍内に均一に分 布して見えることは、それが腫瘍化 に重要な役割を担っていることを示 す（Camidge 2010）。従って、形 態または免疫染色結果に基づいて、 腫瘍の一部を選択する必要は無く、 複数の異なった腫瘍区域でのスコア リングが推奨される。スコアリング C は 5'側と 3'側の各々のシグナルの

B

図 2。ALK陰性の肺腫瘍のFISH像。

D

A

B

C

E

図 3。主に 3'-5' スプリットパターン（3A-3C）および隔離 3’パターン（3D、3E）を示すALK陽性の肺腫瘍の FISH像。

20

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

A

B

図 4。組織の消化過剰（4A）または消化不十分 （4B）により解析が不 適当な標本。

コピーが少なくとも1つ存在 し、適切に保存されたオーバ ーラップしていない腫瘍細胞 についてのみ施行すべきであ る。肺癌はいろいろな増殖パ ターンを有する場合があり、 また癌細胞が非癌組織成分（ 例えば肺胞マクロファージや リンパ球）と混在する場合が 多いため、暗視野での癌細胞 の正確な同定は難しい場合が ある。適切な形態修正のため には、連続組織切片の H&E 染色スライドを常に参考にす ることが勧められる。

細胞の分類: シグナルパ ターン

A

B

概念的には 5'と 3'プロー ブに相同な遺伝子領域は分 子が非常に近接しており、 これらのシグナルは正常細 胞に融合、接触、あるいは 隣接して認められる。対照 的に、EML4-ALK融合遺伝

子が存在する場合、5' ALK 緑信号は 3'ALK赤信号（約 12.5 Mb）から分断され、 両シグナルが分離して検出される。実際には、3'と5'のシグナルはさまざまな程度の凝縮 および染色体の三次元構造により、正常細胞においても分離して検出される場合と非常に 近接してブレイクが検出される場合がある。同様に、EML4 とALKは近接しているため、 シグナルの分離は非常に狭く、両シグナルがALK再構成内に融合して検出される場合もあ 図 5。高いバックグラウンドノイズ（5A）および紐状シグナル（5B）に より解析が不適当な標本。

る（図6）。さらに、このゲノム領域は非常に不安定で、１つのプローブ領域が損失して、 相応するシグナルが検出不能な場合がある。その結果、各腫瘍細胞は正常5'-3'ALK シグ ナルおよび 単一の5'または 3'ALKシグナルの種々な組み合わせを表示する可能性がある。 これらシグナル特性には多様性が知られているが、それぞれの細胞は各シグナルの数お よび位置に基づいて次の4つのパターンの1つに分類される。

融合（正常）パターン（図 7A）。１つの細胞に 5'そして 3'のシグナルが融合して存在する 場合、正常パターン（ALK陰性）と判定される（図2）。5'そして 3'のシグナルが分離して

いても、分離が 2 つのシグナルの直径以下の場合では融合シグナル（正常シグナル）と分

21

第 3 章: 蛍光インシチューハイブリダイゼーション

類しなければならない。腫 瘍細胞核当たりの 5'-3' の 融合シグナル数はパターン 分類において気にしなくて もよい 。

SIGNAL CLASSIFICATION Patterns observed in native ALK Patterns observed in split 3'-5' ALK

Red and green separated by <2 signal diameters Classified as negative

Red and green separated by ≥2 signal diameters Classified as positive

Red and green separated by ≥2 signal diameters Classified as positive

Red and green separated by <2 signal diameters Classified as negative

スプリット（陽性）パター ン（図 7B）。１つの細胞 において、5'と 3'のシグナ ルが分離して存在している SPECIMEN CLASSIFICATION Nonrearranged tumors: Rearranged tumors: とき、隔離シグナルの数に Rearrangement-positive cell rate Rearrangement-positive cell rate かかわらず、 スプリット <15% of cells ≥15% of cells パターン（ALK陽性）と 図 6。ブレークアパート FISH によるALK融合肺腫瘍細胞核のシグナルパターン。 解釈される（図3）。5'と 3'のシグナルの分離の距離は、最も大きいグナルの直径の 2 倍以上でなければならない （Camidge 2010）。5'と 3'の分離シグナルの数が等しい必要はない。例えば、5'側のシ グナルのコピー数が 2つで、そして 3'側のシグナルのコピー数が 3つの細胞はスプリット として分類される。１細胞当たりの 5'-3' Patterns Examples 融合シグナル数はパターン分類に関与し ない。 単一 3’（陽性）パターン（図 7C）。単 一3'シグナルが、単一5'シグナル無しで 検出された場合、細胞は単一3'パターン を有すると解釈される。１つの細胞で単 一3'シグナルと 単一5'シグナルの両方を 有し、3'シグナルが 5’シグナルより多い 場合、正しい分類はスプリットパターン で、単一3'ではない。シグナル融合数は パターン分類に関与しない。

隔離 5’（陰性）パターン（図7D）。単 一5'シグナルが、単一3'シグナル無しで 検出された場合、細胞は単一5'パターン を有すると解釈される（ALK陰性）。細 胞が単一3'と 単一5’シグナルの両方を有 し、5'シグナルが 3'シグナルより多い 場合、正しい分類はスプリットパターン で、単一 5’ではない。シグナル融合数は パターン分類に関係ない。

A. Fused

B. Split

C. Isolated 3' ALK

D. Isolated 5' ALK 図 7。FISH におけるALKシグナルパターンに基づく腫瘍 細胞の分類。

22

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

注: スプリットパターンの判定規準は Vysis LSIALKBreak Apart FISH Probe Kit を用い た FFPE 腫瘍切片のテストに基づいたもので、異なる解析試薬あるいは生体標本が使用され る場合にはその評価規準の妥当性を確認する必要がある。プローブのサイズはプローブのデ ザインによって異なる場合があり、シグナルサイズの大きいプローブを使用する場合、 よ り小さい分離距離がスプリットの定義に必 Fused 5' 3’ 要となる。 Cell Pattern Cell 1

スコアリング

スコア者が一人の場合は最低 50腫瘍細胞 が、スコア者が二人の場合は最低 100 の 腫瘍細胞が必要とされている（詳細につ いては「カットオフ値」の項を参照）。 評価可能な細胞数が少ない標本は FISH 解析に適さない（Camidge 2010）。各 腫瘍細胞についてのシグナルパターンを スコアリングのワークシートに記録すべ きである（図 8）。スコアリングは単一 （赤と緑）および二重干渉フィルタを用い て組織を評価すると、より正確である。 画像に基づいたスコアリングには限度があ り、分離シグナルの誤った 解釈を避けるためには、画 像はすべての切片深度を代 表するものでなければなら ない（図9）。 正常ALK遺伝子のコピー 数増加は NSCLC（図 10） ではよく認められ、蛋白質 の過剰発現との関連性は示 されていない。現時点で は、ALKのコピー数をルー チンにスコアリングするこ とは推奨されていない。

A

signal

signal

signal

2

0

0

Fused

Cell 2

2

1

1

Split

Cell 3

2

0

1

Isolated 3'

Cell 4

1

1

0

Isolated 5'

Cell 5

0

1

2

Split

Cell 6

1

0

0

Fused

Cell 50

2

0

0

Fused

Summary of Scoring: Total # of cells scored: 50 Total # of cells with fused pattern: 19 Total # of cells with split pattern: 22 Total # of cells with isolated 3' pattern: 5 Total # of cells with isolated 5' pattern: 4 Total # of cells with rearrangement-positive patterns: 22+5=27 Rearrangement-positive cell rate: 27÷50 x100=54%

図 8。細胞スコアリング用ワークシートの例。

No z-stacking

B

16 planes at 0.4 µm= 6.4 µm z-stacking

図 9。画像に基づいた解析は z 軸に沿う重層（一平面上への複数焦点レベル の統合）が切片の全深度を代表しない場合は困難である。

注: 撮影画像のシグナルサ イズは実際の蛍光顕微鏡検査で検出されるよりもわずかに大きい傾向がある。撮影画像に 基づくスコアリングは、シグナル間の距離が過小評価され、解析結果を損なう場合がある。 画像に基づくスコアリングのもう一つの落とし穴は、撮影画像はしばしば一平面上に複 数の焦点レベルを統合することにより、組織平面の z 軸に沿う縦分裂シグナルが融合シグ ナルと見誤られる可能性がある。

23

第 3 章: 蛍光インシチューハイブリダイゼーション

D

A

B

C

E

図 10。正常ALK遺伝子のコピー数は肺癌標本ではしばしば増加し、低（10A）から高（10C）までのレベルにお よぶことがある。クラスター状のコピー数増加は遺伝子増幅（10D、10E）を示唆する。コピー数の増加を陽性 と解釈すべきではない。

標本の分類: 再構成陽性の細胞の比率

ALK再構成陽性の細胞の比率は以下の様に定義される: 再構成陽性細胞率（%）= [（スプリットパターンを有する細胞数 + 単一3'パターンを有す る細胞数）/評価細胞総数] × 100 注:ALKチロシンキナーゼのキナーゼドーメインは遺伝子の 3'側にコードされているため、 腫瘍病理学上妥当な融合遺伝子は単一3'シグナルであり、単一5'シグナルは非機能的な相 互融合産物を代表する可能性が高い。従って、単一3'パターンを有する細胞は,スプリット パターンの認められる細胞と共に再構成陽性細胞として分類される。単一 5'パターンを有 する細胞は再構成陽性細胞として解釈してはいけない。単一3'パターンを無視して再構成 の定義をスプリットパターンのみに限ると、ALK FISH の感受性が 60～70% に減少する （Yoshida 2011a, Paik 2011）。

カットオフ値

EML4-ALK融合遺伝子は近接する二つの遺伝子の小さな染色体内逆位によって形成されるた め、 ブレークアパート FISH で解析するとALK再構成を示す分離したシグナル間の距離は、 （他の転座シグナルに比べて）通常は狭くなる。細胞内の染色体凝縮とその分布の度合いに より、狭い分離は時に 融合シグナルとの識別が技術的に難しく（図 6）、そのためALK-再構 成 NSCLC に置ける再構成陽性細胞の比率低下（40～70%）を引き起こす（Perner 2008, Camidge 2010, Camidge 2012b）。さらに、ALK再構成をもたない NSCLC の一部の細 胞に再構成陽性パターン（すなわち、スプリットパターンあるいは単一3'パターン）が認め られることがある（Perner 2008, Camidge 2010, Yoshida 2011a）。これはおそらく切 片化の際のアーティファクトあるいは確率的に起こるゲノム変化によるもので特定の融合 遺伝子を示唆するものではない（図 6）。その結果、NSCLC における再構成陽性細胞率の 分布は連続的であり、ALK再構成陽性とALK野生型 NSCLC の相違は統計的な問題となって いる。従って、注意深い定量的な評価が、最適な検査を施工するためには必須となる。15% というカットオフ値はALK再構成（ALK陽性）とALK野生型（ALK陰性）NSCLC を最もよく 分別するために設定されたものである（Camidge 2010, Kwak 2010, Yoshida 2011a）。

24

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

技術的な偏りを最小にするた 1st Reader-50 tumor cells め、二人の独立したスコア者によ る二段階評価が推奨されている（ <10% Positive >50% Positive 10%-50% Positive 図11）。最初のスコア者は 50個 の腫瘍細胞をスコアする。再構成 Equivocal 陽性細胞の比率が 10% 未満（す 2nd Reader-50 tumor cells なわち、再構成を有する細胞数が 1st + 2nd Readers-100 tumor cells 50個の細胞中 5 未満）の場合は陰 <15% Positive ≥15% Positive 性と判定される。50% を超える （すなわち 50個の細胞中 25 より Specimen is Specimen is 多い）場合は陽性と判定される。 positive for ALK negative for ALK そして10～50%（すなわち、50 rearrangement rearrangement 細胞中 5 から 25）の場合は不確 図 11。ALK FISH スコアリングの推奨アルゴリズム。 定で、追加スコアリングの実施を 考慮すべきである。その場合、第二番目の異なるスコア者が別に50個の腫瘍細胞をスコア し、再構成陽性細胞の最終的な比率は第一及び第二スコアの合計を基に計算する。最終的 な陽性率が 15% あるいはそれを超える場合、標本はALK遺伝子再構成陽性として解釈さ れる。比率が 15% より低い場合は、標本はALK遺伝子再構成陰性として解釈される。 注: 15% のカットオフ値は主に Vysis LSIALKBreak Apart FISH Probe Kit（Abbott Molecular）を用いて行う検査に基づいているため、異なる試薬を用いる場合は有効性確 認試験が必要である。

検査施設の有効性確認試験

ALK FISH 解析を臨床的な目的で使用する前に、検査施設で適切な有効性確認試験を施行す る必要がある（Halling 2012、Saxe 2012）。検査精度[正常（ALKの陰性）と異常（ALK の陽性）の判別率]を、他の検査施設で適切に実施された検査の精度と比較するか、同一検

査施設で以前に確認された検査精度と比較すべきである。検査の正確さあるいは再現性は、 同一標本について異なる技術者や異なる時点で施行された解析間の一致の度合いに基づい て決定されるべきである。また解析方法全体についての確認も必要である。精度および正 確さの確認は定期的に繰り返して実施されるべきである。さらに、解析の感受性と特異性 はすでにわかっている遺伝子型の標本を用いて確認されるべきである。ALK野生型 NSCLC および良性組織は、真の陽性スプリットシグナルの間隔（シグナル直径の少なくとも 2倍 の間隔）との違いを知るのに用いられるべきである。これらの作業は、市販されている試 薬を用いる場合は簡単であるが、研究室で開発された試薬を用いる場合は、高いレベルの 詳細なデータが必要である。

課題

ALKブレークアパート FISH は 4 つの主たる課題を抱えている: 偽陰性と偽陽性、非定型 FISHシグナル、ボーダーラインの再構成陽性細胞比、そして反復テストの必要性である。

25

第 3 章: 蛍光インシチューハイブリダイゼーション

偽陰性と偽陽性 ブレークアパート FISH はALK陽性肺癌を診断する標準法として使用されて来たが、テスト の真の感受性および特異性の評価については決着がついていない。FISH と他の手段との不 一致の多くは技術的な理由によるものである。しかし、 FISHにおいても、真の偽陽性また は偽陰性の結果を生じる可能性があるため、疾病管理に重大な影響を及ぼしかねない。偽陽 性の結果は, RT-PCR および IHC 検査に感受性の限界が認められているため、とくに証明 が難しい。にもかかわらず、ALK阻害剤による治療効果予測において、単独のFISH検査結 果は、FISH、IHC、および RT-PCRを組み合わせた結果よりも劣るという報告もある。ま た臨床的な不一致症例にはFISHによる真の偽陽性結果はまれにしか含まれていない可能性 がある（Chihara 2011）。ゲノム全体の次世代シークエンス解析のような新技術が FISH の偽陽性結果の存在を証明する可能性がある。これに対して、いくつかの FISH の偽陰性 結果は文献で十分に裏付けられている（Yoshida 2011a, Murakami 2012, Peled 2012）. このような場合、非定型の FISH シグナルパターンが認められる場合と認められない場合 とがある。FISH の偽陰性結果を引き起こすゲノムメカニズムは明らかでないものの、複 雑な遺伝子再構成および未知の遺伝子挿入（cryptic insertions）が要因と成っていること も考えられる。 非定型シグナルの特徴 FISHテストは、まれに（およそ 6%、[Camidge 2013]）、再現性がありかつ十分認識 可能なシグナルを示す非定型シグナルパターンを示すことがある。このようなパターンの 少なくともいくつかは偽陰性とされている。その 1例は、腫瘍細胞の多くが優勢な単一5' パターンを有し、少数の細胞のみが分離あるいは単一3'パターンを示す場合である（「5' 優勢パターン」、図12）。従来の分類規則では、単一5'パターンはALK陰性として分類さ れるべきで、これらの症例 はALK再構成陰性として見 落とされがちである。それ にもかかわらず、このシグ ナルパターンを有する症例 は EML4-ALK融合転写産物 を保有することが RT-PCR によって確認されている （Yoshida 2011a）。 もう一つの非定型 FISH シグナルはいわゆる赤のダ ブレット（red doublet）パ A B ターンで、2つの 3'シグナ 図 12。ブレークアパート FISH で単一 5' 優勢を示す肺癌の非定型パター ン。矢印は単一の緑信号（5'ALK）を示す。 ルと 5'シグナルが融合した ものである（図 13A）（Peled 2012）。赤のダブレットパターンを有するALK陽性 NSCLC は,そのような集合シグナルが従来の融合シグナルに類似するためにALK再構成陰性として 誤って評価されることがある。時々、3つ以上の 3'シグナルが集合し、一つの 5' シグナ

26

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

ルと融合する場合も ある（コピー数に従っ て、赤のトリプレット パターンなどと呼ばれ B る; 図 13B、13C）。 他のまれな例として は、ALK陽性 NSCLC の腫瘍細胞の多くが 正常なシグナルを示 A D C さず、単一3'シグナ 図 13。ブレークアパート FISHテストによる肺腫瘍に認められる非定型パター ルのみを有する場合 ン。13A: 3'-5-3'（赤のダブレットパターン）、 13B および 13C: 3'-3'-5'-3' がある（図 13D）。 （赤のトリプレットパターン）。 13D: 単一 3' シグナル（正常ALKシグナルが多 く認められない）。矢印はALK再構成を示す。 そのようなパターンを 示す細胞は従来のスコアリング規則により 5' プローブのハイブリダイズ失敗の可能性があ るため評価不能とみなされ、そのようなパターンを示すALK陽性の癌は見落される可能性が ある。このような非定型シグナルパターンが常に融合状態を示唆しているかは明確ではな いが、これらのパターンは少なくとも疑問視する必要があり、他の診断方法（例えば、RTPCR、IHC）による速やかな検査を施行すべきである。将来の研究が FISH 偽陰性となる他 の非定型シグナルを見出す可能性もある。 再構成陽性細胞の比率のボーダーライン NSCLC 症例のおよそ 8% は、再構成陽性細胞の割合が 10～20% の範囲にある（Camidge 2013）。現在受け入れられている 15% のカットオフは、ALK再構成の陽性と陰性を機械的 に分類するものの 、FISHテストでボーダーラインにある再構成シグナルが正確に融合遺伝 子の存在を示しているか否かについて、我々の経験は限られている。そのような標本では、 腫瘍と非腫瘍細胞間の形態学上の区別に特別な注意を払った上で、再度数え直すことを推奨

する。非腫瘍細胞を含んで細胞数を数えることは再構成陽性細胞の比率を減少させる。推 奨されている二段階アルゴリズムはこれらの技術的な間違いを最小限に留めるようにした ものである。組織の平面で z 軸上の縦に分裂したシグナルは、融合シグナルとして誤解さ れる可能性があるため、同様に注意を払う必要がある。特に評価がデジタル撮影画像上で 行われる検査施設では、一つの画像に複数の焦点レベルを統合するため（z軸への重層）、 注意が必要である。 これらのボーダーライン症例は、前述したように、非定型シグナルによる場合もある。 特に、赤のダブレットパターンは再構成陽性細胞の比率がボーダーラインにある症例で頻 度が高い傾向にある。単一色フィルターを使用した解析は、二色（赤および緑）または三色 （青、赤、および緑）フィルターの使用で見落されることもある重なったシグナルの識別 を可能にする場合がある。注意深い再検査の後でも再構成陽性細胞の比率がボーダーライ ンにある場合は、最終的な解釈は 15% のカットオフに基づいた陽性あるいは陰性である が、他の診断方法、例えば IHCまたは RT-PCR、による更なる検討を考慮するようにとの 注記を付すべきである。

27

第 3 章: 蛍光インシチューハイブリダイゼーション

最検査の必要性 少数の研究結果報告によれば、臨床経過に伴うALKのコピー数増加が見られる。特にALK阻 害剤による治療の後で変化することが示唆されている（Doebele 2012）。その頻度やメカ ニズムはまだ明確ではないが、腫瘍がALK阻害剤による治療に抵抗性を獲得し、新規治療方 法を選ぶ際には、最検査が考慮されるべきである。しかし、データは確定的ではなく、さら なる検討および確認が必要である。

色素インシチューハイブリダイゼーション（CISH）

FISH には次の様な限界がある。特別な装置を必要とし、保存期間にしたがってシグナルが

減衰し、また暗視野検査のために組織の構造と細胞形態学的特徴を捉えにくい。肺癌は非腫 瘍細胞と複雑に混在し、複雑な増殖パターンを示すので、後者の要因は特に問題となる。細 胞構造あるいは細胞質などの情報なしで非腫瘍細胞成分から腫瘍細胞を区別することは困難 な場合がある。CISH はこれらの FISH の不利な点を克服するために開発された。CISH で は、各ハイブリダイゼーションプローブを螢光色素よりもむしろ発色色素によって視覚化 する（図 14）。CISH では腫瘍の構造および細胞形態学を維持しながら、ルーチンの明視 野顕微鏡の下で特定の遺伝子の変化を検出できる。ALKブレークアパート CISH の肺癌診 断における実用性についてはすでに報告があり、すべての研究は FISH および／あるいは RT-PCR の結果と優れた一致を実証している（Kim 2011, Yoshida 2011a, Nitta 2013, Schildhaus 2013）。異なったカットオフ（15% および 20%）およびスコアリング規準 （1 直径間隔 および 2 直径間隔）が少数の研究で発表されているが、CISH を肺癌のALK 再構成検出に使用するには検証が必要である。

Substrate

Chromogenic reaction

Enzyme

Primary antibody

Secondary antibody Probe Target DNA

図 14。CISH の原理。 左。個々のプローブは異なるハプテンを用いて標識され IHC に類似した抗体反応によって 視覚化される。ALK陽性腫瘍に適用されたALKブレークアパート CISH を示す（右）。黒い点は正常なALK遺伝子 を示し、そして再構成したALK遺伝子は分離した単一の赤あるいは青シグナルとして可視化される。

まとめ

ブレークアパート FISH はALK再構成 NSCLC 診断のために信頼にたる技術であり、ALK阻害 剤による治療に適切な患者を選択する標準的指標として受け入れられている。しかし、FISH

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肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

テストはガイドラインに厳密に従った注意深い操作と解釈に大きく依存している。さらに、 FISH はまれに不確実かつ誤った結果を生む可能性がある。他の臨床検査と同様に、ALKブ レークアパート FISH は独特な特徴と限度を有するため、適切な診断条件の下で使用される べきである。この方法がルーチン検査として導入される前に各検査施設が既知のコントロー ル材料を使用して内部確認試験を行うことが強く推奨される。さらに、検査施設は他の公認 された臨床検査施設との定期的なスライド交換プログラム、または販売会社が提供する熟達 度調査に参加するべきである。

第4章 IHC: 免疫組織化学

執筆担当者：Erik Thunnissen, Sylvie Lantuéjoul, Jin-Haeng Chung, Keith Kerr, Fred R. Hirsch, Ming Sound Tsao, および Yasushi Yatabe

スクリーニングツールとしてのALK IHC

分子標的療法を実施するにあたり、標的となる遺伝子変化の検出は、検証された検査方法 に大きく依存している。特に遺伝子変化が患者の一部にのみ認められる場合は特にその傾 向が強い。ALK IHC は明視野検査を用いる方法で、迅速でかつ比較的安価なスクリーニン グ方法として期待されている。組織の構造および腫瘍細胞の組織評価が可能であるという 理由で、多くの病理医に好まれる方法である。IHC は FISH に必要とされるより少数の悪 性細胞を用いて結果を判定できることもある。IHC はさまざまな 腫瘍標本を用いて良い結 果を得る事ができる。 少数の腫瘍細胞の集塊が標本に存在しさえすれば FFPE 組織ブロッ ク、液状検体、および FNA の細胞診セルブロック、あるいは塗抹標本による検査が可能で ある。ALK再構成を有するNSCLC のような頻度の低い腫瘍には、経済的なスクリーニング 法に対する期待が高まっている（Soda 2007, Koivunen 2008, Perner 2008, Takeuchi 2008, Palmer 2009）。

ALK IHC の課題

ALK IHC をスクリーニング 法として標準化し、評価規 準を確立することは重要で ある。ALK陽性肺癌の腫瘍細 胞は通常ALKキメラ遺伝子の 産物である蛋白質を発現する （図 1 および 2）。 細胞内 のALKチロシンキナーゼ領域 と、N末端がさまざまに短縮 したパートナー遺伝子との 融合により産生される蛋白 質がALKキナーゼを恒常的に 活性化する（Morris 1994, Allouche 2007）。しか し、NSCLC におけるALK融

A

C

B

D

図 1。ALK強陽性の腺癌 。A および B: H&E 染色した スライド、概観 （A） および x10 拡大のスライド（B）。B の挿入図は x40 拡大。印環 細胞は見られない。C および D: 5A4 抗体を用いたALK IHC でALK遺伝 子産物は細胞質に強陽性を示している（拡大率、C: x20、D: x40）。

30

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

A

B

図 2。ALK強陽性の腺癌 。A: H&E 染色したスライド。B: D5F3 抗体とチラミド増幅を用いたALK IHC はALK遺伝子産物が細胞質に強陽性を示している（拡大率、x40）。

合蛋白の発現量は低いため , 未分化大細胞型リンパ腫（ALCL）の診断に用いられている ALK1 抗体でこの蛋白質の検出をするのは難しい（Mino-Kenudson 2010）。この問題を 克服するために、抗原賦活化、高親和性一次抗体の高濃度での使用、シグナル増強法（た とえばチラミドカスケードや抗体-強化ポリマーによる増幅を使用）、および新抗体の開発 を含む数々の技術的な 試みがなされてきた（表 1）。 表 1。IHC でALK蛋白質の表現を検出するための市販抗体

クローン ALK1

5A4 D5F3 抗-ALK

クローンのタイプ

アイソタイプ

免疫原

マウスモノクロ ーナル

IgG3, kappa

全長ヒトALK蛋白質のアミノ酸番号 1359-1460、キメ ラ NPM-ALKタンパク質のアミノ酸番号 419-520 に 相当

マウスモノクロー ナル ウサギモノクロー ナル ウサギモノクロ ーナル

IgG1 入手不可能 IgG

NPM-ALK転写物(アミノ酸番号 419-520)の C 末端 ヒトALKの C 末端 ヒトALKのアミノ酸番号 426-528 のリコンビナント 蛋白質

肺癌標本のALK IHC 検査のもう一つの重要点は、免疫染色での内部陽性コントロー ルを欠いていることである。そのため IHC 陰性結果はALKの融合蛋白質の表現が真に陰性 であるか否かの判断が困難である。しかしながら、正常な肺組織ではALK発現は見られない ので、 肺癌細胞でのびまん性ALK蛋白質発現は、異常なALK融合蛋白質の表現と常に関連し ている（Takamochi 2013, Takeuchi 2013）。ALK再構成を有する細胞株（H3122 バリア ント 1 および H2228 バリアント 3）を包埋した FFPE セルブロックは、最適な染色条件 を得るコントロールとなり得るが、組織切片と細胞株ブロックの違いは、特にALK IHC の エピトープ濃度が低い場合は、注意しなければならない（図 3）。

固定および切片作成

ALK IHC のための解析前工程は他の IHC 方法と同じである。由来にかかわらず、診断生検 組織あるいは外科標本は十分量（標本の容積の 10倍以上）の 10% の中性緩衝ホルマリン液

31

第 4 章: 免疫組織化学

Intensity (A.U.)

ですぐに固定し、パラフィンで 20 包埋すべきである（FFPE）。 血流を遮断したあとの虚血の影 響（cold ischemia effects） を避けるために、固定はできる 10 だけ早く行うべきである。6 時 間以下の固定時間は、IHC お よび通常の染色に悪影響を及ぼ す可能性があるため推奨されな 0 1 10 80 い。IHCのための抗原の保存性 に関してはエピトープ依存性が Epitope Concentration あり、あるエピトープは 120 図 3。IHC における低（青い円）および高（赤い三角形）シグナル増 時間に及ぶ固定時間でも妨害 幅システムの効果。低エピトープ濃度が高シグナル増幅システムを用 を受けないこともある。具体 いると陽性になるが（細い矢印）、低シグナル増幅システムでは陰性 的には、6 から 48 時間の固 になる場合があることに留意すべきである。さらに、高強度ではプラ トーに達した場合、 一旦陽性となれば、より高濃度のエピトープは 定時間がすべての標本に推奨さ それ以上濃く染色されない。リンパ腫（太い矢印）のエピトープ濃度 れる。パラフィン包埋の後では は、NSCLC （細い矢印）より高く、IHCは低シグナル増幅システムで 腫瘍組織は酸化や他の変性効果 十分である。NSCLC（細い矢印）では、高濃度の高親和性の抗体と高 増幅が必要である。エピトープ濃度は対数目盛で、そしてシグナル強 に対しても安定している。しか 度は線形目盛で示されている（A.U.= 任意単位）。出典: Prinsen CF, し、FFPEブロックから3 から Klaassen CH, Thunnissen FB. Microarray as a model for quantita4-μmの厚さのスライドとして tive visualization chemistry. Appl Immunohistochem Mol Morphol.

2003; 11: 168-173。 いったん薄切されると、顕微鏡 用ガラススライド上に載せられた切片の室温における保存期間は最大 6週に限られる。低温 で保存すれば、スライドはより長時間保たれる。しかし、6 週以上前に調整された組織切片 のスライドは、偽陰性の結果を示すこともあるので注意深く解釈すべきである。

免疫染色

解析方法、例えば実際のALK IHC の検査、には、エピトープ賦活化法、抗体のタイプお よび濃度、インキュベーション時間、インキュベーション温度、および増幅など をよく管 理・最適化する必要がある。 対象となるような標準IHC検査法は NSCLC におけるALK IHCでは、確立されていな い。代りに、抗体のクローンあるいは免疫源、抗原賦活化法 と抗体検出法および増幅技 術は多くの知見が蓄積されている（表 2）。異なった抗体を直接比較すると、ADVANCE system（DAKO、日本ではEnvision FLEX+）を使った D5F3（Cell Signaling Technology） と 5A4（Novocastra）は、 感受性と特異性においてALK1 抗体（Dako）より優れていた （図4）（Conklin 2013）。（さまざまなプラットホームについての議論は第 6 章を参照。） 市販ALK IHC キットが現在開発および評価中である。 種々のシグナル増幅法の使用により、ALK融合蛋白質を検出するための感受性は高くな ってきている（図 5）（Rodig 2009, Sakairi 2010, McLeer-Florin 2012）。市販 IHC キ ットを使用した IHC の自動化に伴い、標準化が行われる可能性がある。自動染色装置を用

32

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

表 2。いくつかの発表された研究に記載されている市販ALK抗体を使用した免疫染色の条件（市販キットは使用せず）

研究

抗体

抗原 賦活化法

希釈

Yi et al., 2011

ALK1

EDTA、pH 8.0、 PT Link 内に30分

1:100

Mino-Kenudson et al., 2010

ALK1

EDTA、pH 8.0、 圧力鍋

1:2

D5F3

インキュベーシ ョン

検出システム

室温 30分

ADVANCE

1:100

オーバーナ イト

EnVision+

1:100

特定無し

OptiView

Minca et al., 2013a

D5F3

熱調整 BenchMark XT

Martinez et al., 2013

D5F3

標準 BenchMark XT

1:50

37°C 16分

ultraView

Paik et al., 2011

5A4

CC1 溶液、100°C、 20分

1:30

42°C 2 時間

iVIEW

Hofman et al., 2011

5A4

標的レトリーバル溶液、 pH 9.0、97°C、40分

1:50

室温 30分

EnVision FLEX

McLeer-Florin et al., 2012

5A4

EDTA 含有 CC1 溶液、 pH 8.4、1 時間

1:50

37°C 2 時間

増幅キット

Kim et al., 2011

5A4

CC1 溶液、100°C、20 分

1:30

42°C 2 時間

iVIEW

Sholl et al., 2013

5A4

クエン酸緩衝液、pH 6.0、 圧力鍋中、122°C、 30-45分

1:50

室温 40分

EnVision FLEX+

クエン酸緩衝液、pH 6.0、 電子レンジ 中、95°C、30分

1:1000

4°C オーバーナ イト

CC1 溶液、95°C、30分

1:500

室温オーバー ナイト

ストレプトアビジン-ビオ チニル化 ホースラディッシュペル オキシダーゼ 複合体

Wong et al., 2009 Anti-ALK

Chen et al., 2012

Anti-ALK

ultraView

抗体:ALK1 は Dako の製品; D5F3 は Cell Signaling Technology の製品; 5A4 は Paik et al., Kim et al., および Sholl et al. による研究で は Novocastra の製品が使用され、Hofman et al. および McLeer-Florin et al による研究では Abcam の製品が使用された。 ; 抗-ALKは

Invitrogen、Life Technologies Corporation の製品。抗原賦活化: PT Link および Target Retrieval Solution は Dako の製品であり、BenchMark

XT は Ventana Medical Systems、Inc.の製品である。 検出システム: ADVANCE, EnVision+, および EnVision FLEX+ は Dako の製品; OptiView （DAB Kit）, ultraView （DAB Kit）, iVIEW （DAB Kit）は Ventana Medical Systems、Inc.の製品。

Clone ALK1

Clone D5F3

図 4。ALK1 と D5F3 抗体を用い たALK IHCは同一組織の切片上で きわめて異なる陽性強度を示す。

33

第 4 章: 免疫組織化学

いた標準化は、時には高濃度の一次抗体を必要とするが、安定した染色結果をもたらす。 最近、 新しいハプテン（3-ヒドロキシ-2-キノキサリン; HQ）とチラミド増幅を組み合わ せた高感度の検出方法が開発された（Nitta 2013）。この HQ-チラミド IHC の検出システ ムによって、強度の変化に関わ Regular Polymer Method Linker-Polymer Method らず、すべての腫瘍細胞が陽性 となったことで、別の方法での 不均一な染色パターンは検出限 界が原因であることを示唆して いる。さらに、この仮説は、明 視野ブレークアパート ISH と 高感度 IHC を組み合わせた遺 伝子-蛋白質アッセイによって 確認された。 Polymer with Primary antibody

secondary antibodies

Antigens !"#$%"&'%()*+,&'

染色の評価

Linker

解析工程は染色スライドの顕微 図 5。通常のポリマー法、およびリンカーポリマー方法の模式図。 鏡検査から始まる。NSCLC で はALK染色は細胞質内に認められる。顆粒状の陽性像を示し、時には膜の強調像として認め られる場合がある。染色強度の評価は主観的なものであるが、最初に HER2 検査に用いら れた様に、固有の空間的分解能をもつ顕微鏡の対物レンズを使用することで、染色強度を評 価する一助となる（Ruschoff 2012）。このアプローチにより発現強度のスコアリングに再 現性をもたらすことができる。強い染色（3+）は x2 または x4 の顕微鏡の対物レンズを使 用して明瞭に観察できる程度、中等度の染色（2+）を明瞭に認識するには x10 または x20 対物レンズが必要となる。そして弱い染色（1+）は x40 対物レンズによってのみ観察する ことができる。昔から使われているH-スコアは染色陽性を示す腫瘍の比率に、強度（0、 1、2、あるいは 3）を乗じ た値であり、結果は 0 から 300 の範囲にわたる。この アプローチは染色の不均一 性を示すのに優れている。 IHC のALK陽性および ALK陰性の判定にそれぞれ の研究で異なる基準が適 用されている。ある著者 は 1+ か 2+ かの閾値が 曖昧なままで、強度を 1+ から 3+ のスコアで記録し ている（図6）。このよう なスコアリングのアプロー チは使用された増幅システ

3+

2+

1+

0

図 6。ALK IHC のスコア 0 から 3+ までの例。

34

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

ムおよび, ある種の抗体に認められたバックグラウンドに関連があると思われる（MinoKenudson 2010、Conklin 2013）。別の著者はALK陽性を、強度を問わず、腫瘍細胞の 10% 以上が陽性である場合と定義する簡単な評価法を採用している（Rodig 2009、MinoKenudson 2010、McLeerFlorin 2012、Martinez 2013、Sholl 2013）。最近 Takeuchi は、5A4 抗体および抗体増強ポリマーの挿入（iAEP）方法を用いた IHC で検査された 300 以上のALK-再構成肺癌で、ほとんどすべての癌細胞が染色されたことを報告した（Takeuchi 2013）。この染色の均一性はALK遺伝子再構成肺癌では、全ての腫瘍細胞がALK-遺伝子 再構成を有することを示唆している。IHC 結果の偽陽性に関するより多くのデータが利用 可能になるまで、ALK IHC の高処理スクリーニングに関しては、病理医は標準となってい るFISH を用いた陽性シグナルで確認すべきである。 しかしながら、IHC で陽性で、かつ FISH に陰性（厳しく定義された規準に従って）を示す腫瘍をもつ患者で crizotinib 療法に 良い反応を示す例が次々と報告されている（Peled 2012）。 もう一つ考慮すべき点は、異なる検査施設および病理医間のALK IHC の結果の再現性で ある。本項執筆時に、2 つの IHC プロトコールが検証されていた。ひとつは、VentanaALK IHC kit（Ventana Medical Systems、Inc.）を使用して、7人の国際的な病理医間の再現 性が検討された。Ventana で定義された標準方法での陽性・陰性の区分で、観察者間の再現 性は陽性および陰性結果に対し、それぞれ 95% および 97% であった（Hirsch 2013）。 もう一方では、5A4 抗体（Novocastra）を使用した European Thoracic Oncology Platform（ETOP）プロトコールで、12 の検査施設が手動あるいは自動化された方法を用 いて、一定の方法で同じ腫瘍を染色した（Thunnissen 2012c）。（標準化の詳細情報に ついては第 9 章を参照。）

ALK IHC の実用的な施行

病理医はさまざまなアーティファクトが偽陽性の染色をもたらす可能性があることを熟知す る必要がある: 肺胞マクロファージの軽度の胞体内ドット状反応（図 7）、神経起源の細胞 （神経および神経節の細胞）、腺上皮の染色、細胞外の粘液、および壊死性腫瘍領域。バッ クグラウンド染色は正常な肺実質内ではほとんど観察されないが、いくつかの染色における 注意点が知られている（表 3）。

A

B

C

D

図 7。D5F3 抗体を用いた IHC の非 特異染色。A:ALK陰性腫瘍の境界部 にみられる肺胞マクロファージ。B: NSCLC を示す肺結節から穿刺吸引で 採取された細胞診セルブロック。肺 胞マクロファージの軽度の胞体内ド ット状反応はアーティファクトで、 偽陽性と解釈される可能性がある。 ドット状陽性像のある腺癌のセルブ ロック（C）および生検 組織（D）。 FISHテストでALK再構成が陰性であ った。

35

第 4 章: 免疫組織化学

状況によってALK再構成なし にALK蛋白質の発現が上昇する場 合があり、その場合 IHC の結果 は陽性で、ALK FISH は陰性（あ るいは非定型の）パターンを示す ことがある（図 8）（第 3 章を 参照）。また、遺伝子が増幅し ているにもかかわらずALK蛋白質 発現が認められないことも報告さ れている（Pelosi 2012、Salido 2011）。例えば、Pelosi et al. は肉腫様がんのサブセットに ALK遺伝子の増幅を認めたもの の、ALK蛋白質の発現は 2 つの異 なる抗体を使用しても検出されな かったことを報告している。蛋白 発現を伴うALK遺伝子のコピー数 増加の臨床的意義はさらに明確に される必要がある（Salido 2011,

表 3。IHC の結果解釈で注意すべき点

粘液産生細胞

細胞質は、ALK蛋白質が存在しない細胞内の 粘液で覆い隠され、染色陰性の結果をもたら すか、またはわずかに膜様に染色され、偽陰 性と解釈される。

膜様染色

特に管腔に面した先端部分で顕著な、非特異 的な染色が時折見られる。この知見は腫瘍細 胞に特定ではなく、正常な肺細胞でも認めら れる。

神経内分泌 細胞

ある種の扁平上皮細胞癌、大細胞神経内分泌 癌、および正常な神経節細胞は陽性反応を示 す

非特異的な粘 液染色

使用される増幅システムによっては、ある種 のバックグラウンドが細胞外の粘液や肺胞マ クロファージおよび気管支上皮細胞の胞体で 認められる。

Kim 2013）。

組織学的に、印環細胞のよう

な粘液含有細胞のALKの免疫反

応性には注意深い解釈が要求さ

れる。ALK IHCの薄い膜様の陽

A

B

図 8。 FISHテストで認められる非定型パターン（拡散単一緑シグナ ル：右）をもつALK蛋白質陽性例（左）。

性パターンは胞体内粘液空胞（図 9）によって覆われ、印環細胞内

の陽性パターンが検出しにくい場 合がある（Rodig 2009, Yoshida 2011b, Popat 2012）。

ある研究者は FISH陰性癌

で、 細胞膜が染色されることに

A

B

C

D

注目した（Murakami 2012、

Mino-Kenudson [個人通信]）。 この知見は癌細胞に特有ではな

く、ある種の非腫瘍細胞、例えば

反応性の II 型肺上皮でも認めら れている。さらに、ある種の神経 内分泌の癌腫もまた陽性反応と関

連している（Murakami 2012、 Nakamura 2013）。

図 9。形態および染色の多様性を有する腫瘍。H&E 染色 は（A）印環 細胞が多くある領域、および（B）少数の印環細胞を伴う充実性領域 を示している。ALK 5A4免疫染色で 小さな胞体辺縁に弱い発現（+1、 C）、強陽性（+2/+3、D）を示す（拡大率、x40）。

36

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

ある種の腫瘍、特に外科標本では、陽性像が不均一に認められる場合がある（図 10）。 しかし、解析前の条件が十分に管理されていれば、大部分の腫瘍細胞は、FISH 解析に認め られるALK遺伝子再構成の均一な分布と同様に均一に染色される。不均一性は固定の不均一 性と関連があり、 組織学的パターンの違いとは関連していないことが多い。生検標本では固 定の遅れに対するALK蛋白質の感受性は問題ではないが、保存標本でALKのスクリーニング のために組織マイクロアレイを使用する場合は、これが問題となることもある。核周囲のド ット状パターンは KIF5B-ALK再構成には典型的なものとして報告されているが、さらなる 確認が必要である（図 11）（Takeuchi 2009）。

図 10。ALK陽性腫瘍の不均一な陽性染色の例。左パネルのボックスは右の画像に対応している。印 環細胞成分は陰性染色の潜在的なピットフォールである。

A

B

C

D

図 11。 KIF5B-ALK- 陽性腺癌の IHC における異常な陽性反応。ゴルジ野を強調したような強染色パ ターンを示す（A: H&E 染色, B:ALK染色）、および核周囲のハローパターン（C: H&E 染色, D:ALK 染色）。バー = 100 μm。Takeuchi K, et al. Clin Cancer Res. 2009;15: 3143-3149. から転載。

37

第 4 章: 免疫組織化学

まとめ

ALK IHC 解析は、現在検証および標準化が行われており、NSCLC における費用対効果の高 いALK再構成スクリーニングのための有望な臨床ツールとして期待がもたれている。この方 法によるスクリーニングは既にヨーロッパ、日本およびアジアの研究機構によって推奨され ている。米国では、NSCLC のALK阻害剤による治療は 現在ALK FISH の陽性結果に依存し ている。ALK IHC の陽性結果を基にALK阻害剤療法を行うためにはALK FISH による証明 が必要である。しかし、近い将来に、IHC 検査が米国 FDA によって承認される可能性があ り、ALK IHC 陽性結果を示す患者もまたALK阻害剤療法に適合することになるであろう。 ヨーロッパでは、ALK陽性肺癌はALK FISHテストに制限されていない。

第5章 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) および複数の遺伝子解析 執当担当者：Yasushi Yatabe, Kengo Takeuchi, and Ignacio Wistuba

PCR は NSCLC における EGFR 突然変異の検出に、多くの検査施設で使用されているた め臨床的に施行可能である。しかし、RT-PCRでは実地診療で得にくい高品質の RNA が必 要とされるため、主に血液系腫瘍に使用されている。CAP/IASLC/AMP のガイドラインで は、RT-PCR はALK阻害剤治療のための肺癌患者を選ぶ検査として推奨されていない。そ れは偽陰性の結果を生じる危険があることや、FFPE のサンプルの RNA ベースの解析はう まくいくとは限らないためである。しかしながら、RT-PCR はALK融合パターンについて最 も確実でかつ詳細な情報を提供する。さらに、いくつかの最近開発された技術は高い成功率 で臨床サンプルに適用することができる。

RT-PCR

EML4-ALKは多くの融合バリアントを示す。ALKの切断点は常に エクソン 20 （ENST00000389048）の 5'-末端の前に存在する。そこはキナーゼ領域が始まる位置で、 この一貫性はリンパ腫および肉腫のような他のALK転座を有する腫瘍でも認められる 。 それに対して、EML4 の切断点はさまざまなエクソンに分布している。最初の 2 つの融 合バリアントの発見（Soda 2007）に続いて、13 以上のバリアントおよび 3 つの融合パ ートナーが知られている（図 1）。最も高頻度に見られる 6 つの EML4-ALKバリアント では、EML4とALKのエクソンが挿入あるいは削除なしで直接インフレームに融合してい る。3 つの主要なバリアント（v1: E13; A20、v2: E20; A20 および v3: E6; A20）は EML4-ALKに関連した肺癌の 90% 以上に認められる。マイナーなバリアントのうち、E2; A20（v5）および E18; A20（v5'）は EML4-ALK肺癌の 1～2% に認められる（Takeuchi 2008、Wong 2009）。E21; A20 は直腸結腸癌で認められているが（Lin 2009）、肺癌 ではまだ認められていない。 新鮮あるいは新鮮凍結した腫瘍サンプルを用いた RT-PCR は必要な癌細胞の数の点では 他の方法より感受性が高いことがある。しかし、高い感受性は融合パターンが プライマーで 検出可能な範囲内にある場合にのみ達成される。全ての知られているEML4-ALKバリアント を検出するため、プライマーセットは包括的な方法（表 1）で設計されるべきである。プラ イマーのアニーリングサイトの欠失により、包括的なデザインのプライマーを用いても不規 則なバリアントが検出できない可能性もある。さらに、EML4-ALK検出のためにデザインさ れた RT-PCR システムはALKと他のパートナーとの融合、例えば kinesin family member

39

第 5 章: 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応および複数の遺伝子解析

ALK

e20 e14

EML4-ALK (E14;del49A20), v4

EML4-ALK (E18;A20), v5' KIF5B-ALK (K24;A20) KIF5B-ALK (K15;A20)

del49e20

e2

EML4-ALK (E2;A20), v5

EML4-ALK (E15del19;del20A20), v4'

e20

e6

EML4-ALK (E6;A20), v3

EML4-ALK (E14;del14A20), v7

e20

e20

EML4-ALK (E20;A20), v2

EML4-ALK (E13;ins69A20), v6

e20

e13

EML4-ALK (E13;A20), v1

e20

e13

ins69e20 e14 e15del19

del14e20

e18 del20e20 e20

e24 e15 e17

e20 e20

KIF5B-ALK (K17;A20) KLC1-ALK (K9;A20)

e20 e9 e20

図 1。野生型ALKおよび肺癌におけるさまざまなタイプのALK融合: 5 つの通常認められるバ リアント(v1、v2、 v3、v5 および v5')と 4 つの変則的なEML4-ALKのバリアント(v4、v6 、v7、および v4')、3 つのKIF5B-ALKバリアント 、および KLC1-ALK。融合パートナー遺 伝子 (EML4, KIF5B, and KLC1) の濃い部分はコイルドコイル ドメインを表し、ALK内では それらは膜貫通ドメイン（オレンジ色）とキナーゼドメイン（赤）を表す。

5B（KIF5B) および kinesin light chain 1（KLC1）、は検出できない（Takeuchi 2009、 Togashi 2012）。この限界を克服するために、他の融合パートナーのためのプライマーが

設計され、EML4-ALK、KIF5B-ALK（図 2）、および ret 癌遺伝子（RET）融合の同一試 験管内RT-PCR による検出を可能にしている（Takeuchi 2012）。これらの努力にもかか わらず、未知パートナーとの融合は検出不可能である。従って、RT-PCR はALK阻害剤に よる治療のための患者スクリーニングには推奨されない。しかしながら、L858R 点突然変 異とEGFRエクソン 19 の欠損の細胞株での形質変換能が異なることや、EGFR TKI による 臨床治療効果が異なることが示唆されているように、ALK融合パートナーおよび／または 融合バリアントによってALK阻害剤による治療効果が異なる可能性がある。そのような場 合は、RT-PCR が臨床的に有利な可能性もある。 RT-PCR は気管支洗浄液、痰、血液、体腔液、および他の体液のような組織ブロック を必要としない標本で検査することができ、それらの検体では最適な方法といえる（Soda 2012）。ALK再構成陽性が確認された患者では、液状標本中のセルフリー RNA または循 環血中の腫瘍細胞を用いた RT-PCR は、侵襲性を最小限に止め、病状進行の経過を調べる 強力なツールである。しかし、液状サンプル中の腫瘍細胞（または腫瘍由来の RNA）の検 出はしばしば確認が難しく、腫瘍細胞が含まれていない標本はALK再構成陰性として誤診さ

40

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

表 1。 EML4-ALKスクリーニングのための RT-PCR の設定

研究

頻繁に認められるEML4-ALKバリアントへの適用可 能性 主要なバリアント*

マイナーなバリアント*

標本 タイプ

プライマーの数

E13;A20

E20;A20

E6;A20

E2;A20

E18;A20

E21;A20

Soda et al., 2007

Yes

Yes

No

No

Yes

Yes

凍結

2

Inamura et al., 2008

Yes

Yes

No

No

Yes

Yes

凍結

2

Shinmura et al., 2008

Yes

Yes

No

No

Yes

Yes

凍結

3

Takeuchi et al., 2008

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

凍結

3

Martelli et al., 2009

Yes

Yes

Yes

No

Yes

Yes

凍結

3

Takeuchi et al., 2009

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

凍結

(KIF5B-ALKのための 2つのプライマーを含む)

Wong et al., 2009

Yes

Yes

Yes

No

Yes

Yes

凍結

4

Takahashi et al., 2010

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

凍結

3

Sun Y et al., 2010

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

凍結

4

Sanders et al., 2011

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

FFPE

23

5

6

Takeuchi et al., 2012

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

凍結

Shaozhang et al., 2012

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

凍結

4

Soda et al., 2012

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

凍結

(KIF5B-ALKのための 4つのプライマーを含む)

(KIF5B-ALKと RET 融合物 のための 3 つのプライマー を含む)

9

*主要なバリアントは EML4-ALKをもつ肺癌の 90% 以上に認められる。 マイナーバリアントはEML4-ALKをもつ肺癌の 1～2% に認めら れる。

れる危険がある。原則的には、液状サンプルが第一次スクリーニングに使用される場合、癌 細胞陽性を確認されたサンプルだけが検査されるべきであり、それではRT-PCRの高感度性 が特に優位であるということはできない。

比較定量RT-PCR

ALKは正常な肺組織には発現しないためALK再構成の検出に IHC を使用することができ る。IHCによるALK陽性反応は、通常、肺癌における再構成によって最も高頻度に引き起 こされるALK発現異常を意味している。この原則はALK転写物の発現にも適用することが できる。ALKの切断点は、 キメラ転写が一貫して保持されている発がん性キナーゼ領域 （ エクソン 20）の前に起こる。従って、ALKと EML4または他のパートナーと融合する場

41

第 5 章: 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応および複数の遺伝子解析

EML4 72F; 5'-GTCAGCTCTTGAGTCACGAGTT-3' (EML4 exon 2, forward) !"#$(2-H,(3 %DBC&DCBCBBD&DBC&CD&DBB%+ ()!"#$(;EF>(-0(KFGLMG:/( Fusion-RT-S; 5'-GTGCAGTGTTTAGCATTCTTGGGG-3' (EML4 exon 13, forward), HI?=F>%AB%J,(3 %DBDC&DBDBBB&DC&BBCBBDDDD%+ ()!"#$(;EF>(*+0(KFGLMG:/0(( &#'(+.26AA0(3 %&BCC&DBBCDBCCBDBBC&D&DC%+ ()&#'(;EF>(-.0(G;1;G?;/( ALK 3078RR, 5'-ATCCAGTTCGTCCTGTTCAGAGC-3' (ALK exon 20, reverse)

EML4 72F/ !"#$(2-HN( &#'(+.26AA( ALK 3078RR

Fusion RT-S/ HI?=F>(AB%JN( &#'(+.26AA( ALK 3078RR

!"#$%&#'()!*+,&-./0(1* EML4-ALK (E13;A20), v1 EML4-ALK (E20;A20), v2 !"#$%&#'()!-.,&-./0(1-

(1,735bp) ()*02+345/

(($+-45(432bp

(2,488bp) ()-0$6645/

1,185bp (*0*6345(

EML4-ALK (E6;A20), v3 !"#$%&#'()!7,&-./0(1+

913bp*, 946bp* (8*+4590(8$7459(

EML4-ALK (E14;del49A20), v4 !"#$%&#'()!*$,:;<$8&-./0(1$

(1,849bp) ()*06$845/

EML4-ALK (E2;A20), v5 !"#$%&#'()!-,&-./0(13

($3$45(454bp

EML4-ALK (E13;ins69A20), v6 !"#$%&#'()!*+,=>?78&-./0(17

(1,804bp) ()*06.$45/

(3.*45(501bp

!"#$%&#'()!*$,:;<*$&-./0(12 EML4-ALK (E14;del14A20), v7

()*062+45/ (1,873bp)

(32.45(570bp

!"#$%&#'()!*3:;<*8,:;<-.&-./0(1$@( EML4-ALK (E15del19;del20A20), ()+02+-45/ v4' (3,732bp)

(32845(579bp

!"#$%&#'()!*6,&-./0(13@ EML4-ALK (E18;A20), v5'

(88845(999bp

KIF5B867F 5'-ATTAGGTGGCAACTGTAGAACC-3' (exon 10) 'OH3P672H(3@%&BB&DDBDDC&&CBDB&D&&CC%+@(();EF>(*./( KIF5B2533F'OH3P-3++H((3@%DBDC&C&&&C&DBBDDB&CDBD%+@()!EF>(-+%-$(4FI>:MGQ/( 5'-GTGCACAAACAGTTGGTACGTG-3' (Exon 23-24 boundary)

()-0+.-45/ (2,302bp)

KIF5B867F/

'OH3P672HN( ALK 3078RR &#'(+.26AA(

(3$745(546bp

KIF5B2533F/

'OH3P-3++HN( ALK 3078RR &#'(+.26AA(

'OH3P%&#'()'-$,&-./ KIF5B-ALK (K24;A20)

(3$745546bp

()+07.+45/(( (3,603bp)

'OH3P%&#'()'*3,&-./ KIF5B-ALK (K15;A20)

(

(*0*2745(( 1,176bp

'OH3P%&#'()'*2,&-./ KIF5B-ALK (K17;A20)

(

(*0$6+45( 1,483bp

* The asterisk denotes products of variant 3a and b, respectively 9(BR;(M?S;G=?T(:;>FS;?((5GF:IUS?(FK(1MG=M>S(+M(M>:(40(G;?5;UV1;<Q(

図 2。多重 RT-PCRのプライマーサイトおよび予想産物の長さ。ALKキナーゼ領域は さまざまな EML4 のエクソ ン、例えば KIF5B、および他のパートナー遺伝子と融合するため、うまくALK融合を検出するためには複数のプ ライマーセットが必要である。 Normal cells cells Normal Normal cells

ALK ALK+ cells cells ALK+ cells +

合、3' そして 5' 領域のALK ALK DNA DNA ALK DNA ALK EML4 Coiled ALK Kinase Kinase coil domain domain domain 転写産物の発現量は異なる mRNA mRNA mRNA （図 3）。 mRNA mRNA mRNA この原則に基づいて、共 通の融合パターンに加えて EML4-ALKの新しいバリアン トの同定を伴う融合遺伝子 ALK ALK ALK Kinase Comparisonbetween between 5' and !"#$%&'(")*+,-.,,)*/0*%)1*20* Comparison 5' and 3' 3' domain の検出に、エクソンアレイ regions of ofALK ALKtranscript transcript regions &,3'")(*"4*567*-&%)(8&'$-* region 3' region 3’ region region 5'5'5’region region を使用した報告がある（Lin 10 10 2009）。また、リアルタイ 8>9* 8 >9* 6 =* 6 =* ムPCR も使用した報告があ 4 <* 4 <* 2 ;* 2 ;* る（Wang R 2012a、Wang 0:* 0 :* 5' region region 3' region region 5' region region 3' region region 9* 9* R 2012b）。NanoString 解 5' region 3' region 5' region 3' region 析（NanoString Techno- 図 3。正常な肺細胞では、ALK mRNA の発現は非常に低いか検出不可能 なレベルであるが、ALK陽性の腫瘍細胞は多くのキメラALK転写物を産生 logies）は、ROS1 そして する。3'そして5'領域のALKを別々に解析すると、ALK陽性細胞ではALK5' RET（Suehara 2012）と同 領域の転写物のみが検出される。この方法を用いれば混合された正常細胞 に影響されず、融合パートナーに依存しない。 様、ALK融合遺伝子を検出す る方法として近年報告されている（Lira 2013）。 これらの 3'および 5' -比較 mRNA をベースとしたアレイの最大利点は、同時にかつ独 自にさまざまなALK融合パートナーが検出できることである。ブレークアパート FISH は同 Kinase domain

EML4 Coiled coil domain

Kinase domain

ALK Kinase domain

ALK ALK+ cells cells ALK+ cells

Normal cells cells Normal Normal cells42

+

ALK DNA DNA ALK DNA肺癌におけるALKテストIASLC アトラス ALK

EML4 EML4 Coiled Coiled coildomain domain coil

Kinase Kinase domain domain

ALK ALK Kinase Kinase domain domain

mRNA mRNA mRNA mRNA mRNA 様な利点を持つが、3' -および 5' -領域の転写物比較解析も効率のよい解析が可能である。 mRNA これにより一つのRNA サンプルを解析することで、ALK, ROS1、および RETを含む全ての 融合タイプの変化が探索可能である。さらに、FFPE のサンプルから RNA を抽出する技術 が進歩し、実地診療への応用が可能になっている。定量的RT-PCR は通常短い産物（およそ 150 bp）が必要とされるため、FFPE サンプルにおいても十分施行可能である（図 4）。

ALK ALK ALK

Comparisonbetween between 5' and !"#$%&'(")*+,-.,,)*/0*%)1*20* Comparison 5' and 3' 3' regions of ALK transcript regions of ALK transcript &,3'")(*"4*567*-&%)(8&'$-*

Kinase Kinase domain domain

region region 5'5'5’region

9*

800

5' region region

Fluorescence

10 8>9* 6 =* 4 <* 2 ;* 0 :*

200 3' region region

34.83

<* ;* :* 9*

50.0

B

3' products

=*

5' region region 3' region region 5' products

3' region -200

ALK exon 20

6 4 2 0

400

5' region

A

10

10 5'-3' product comparative RT-PCR8 >9*

600

0

region 3'3’ region region

5' region 20

10

30

40

3' region 50

60

Cycles

EML4 exon 13

C

D

図 4。FFPE 標本に RNA の比較リアルタイム PCR を応用し、ALK陽性を検出した肺腺癌の例（A）。 RNA は FFPE から抽出され、3' そして 5' 領域のALK発現レベルが解析された（B）。この腫瘍では、2 つの領域間のmRNA発 現の相違は明白で、ALK再構成を示唆している。融合産物は RT-PCR の直接シークエンシング（C）と、ブレーク アパート FISH により確認された（D）。

マルチプレックス遺伝子解析

肺癌領域のALKを含む多くの遺伝子の突然変異、再構成、および発現状態を同時に検出で き、また臨床に応用可能な解析方法について開発への要望が高まっている。少量の肺腫瘍 の組織および細胞診標本を最大限に使用するために、これらのマルチプレックス解析法は 重要である。ALK融合を DNA および RNA のレベルで決定するためには、複数の多重遺 伝子解析が適用できるが、報告論文は限られている（Li T 2013）。大規模なシークエン シング技術の急速な発展（次世代のシークエンシング [NGS]）は従来のシークエンシング に勝るさまざまな利点を提供してきた。単一検査による多数の遺伝子の全シークエンシン グ、そして全ての既知の癌関連遺伝子における欠失、挿入、 コピー数変化、再構成、およ びエクソーム全体の塩基置換（既知のホットスポット突然変異を含む）の検出がそれらで 可能である（Ross 2011）。

43

第 5 章: 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応および複数の遺伝子解析

現在、全ゲノム、全エクソーム、および標的遺伝子のシークエンシングを含む NGS プラ ットホームは、発癌遺伝子の融合、そして FFPE を含む腫瘍組織標本における突然変異を検 出するための新規診断方法を代表するものである（Lipson 2012, Takeuchi 2012）。ある 研究は、少なくとも 5 つの異なる遺伝子座で切断する遺伝子 DNA を解析したNGSは、ブレ ークアパート FISH でALK陰性だったサンプルで、複合的なALK再構成が検出できたことを 立証している。 肺腫瘍組織標本のALK突然変異や遺伝子のコピー数変化の検出報告は限られ ているが、肺腫瘍組織の FFPE サンプルから抽出された DNA を使用して、肺癌患者13 人 の うち 3 例で、crizotinib 治療に対する耐性ALK遺伝子突然変異を多重型 NGS 解析で検 出することができた（Huang 2013）。

まとめ

EML4-ALK検出のための RT-PCR は 、EML4-ALK肺癌の 90% 以上を占める 3 つの主要な バリアントに標的を絞って、できるだけ包括的に設計されるべきである. RT-PCR は、組織 サンプルの量が十分である場合は特に、 IHC および FISH の解析結果を確認するためには 十分な方法であるが、ALK再構成の第一次スクリーニングには適していない。新規多重遺 伝子解析、特にNGSは、突然変異、コピー数の増加、および遺伝子発現を含む他の遺伝子 の異常とALK融合検出のために臨床応用が期待されている。しかし、これらの解析方法に 関する報告データは限られている。

第6章 ALKテストのための異なった解析プラットホームの比較 執筆担当：Sylvie Lantuéjoul, Marileila Varella-Garcia, Erik Thunnissen, and Yasushi Yatabe

前述したように、 FISH はALK再構成を同定する参照標準として一般に受け入れられて おり、ALK阻害剤（crizotinib）による治療の患者選択のための検査として臨床的に確認さ れ、認可されている。FISH は遺伝子パートナーおよびバリアントの種類にかかわらず、 また保存されているFFPE の標本を用いてALK再構成を検出できる 。しかし、 FISH は最 低 50 の腫瘍細胞を必要とし、この理由で肺癌生検組織の 20% ものサンプルが FISH 使 用不可能となっている（Camidge 2010, McLeer-Florin 2012）。FISH には他にも多くの 限界がある。時間がかかり、検査費用が高く、蛍光顕微鏡を必要とし、そして結果の解釈に 専門的な技術を要する。その限界により、FISH はすべての病理検査施設で施行することが できない。 NSCLC におけるALK検出のために、他の解析プラットホームの実用性が評価さ れてきている。さまざまな抗体を用いた IHC、マルチプレックスおよび定量的RT-PCR、お よび CISHなどと、FISH を比較することに焦点を合わせた研究が行われてきた。 理論的には IHC は、すべてのALKの融合蛋白質を検出する可能性があるが、いくつか のバリアントおよび融合パートナーは蛋白発現レベルが低く検出が難しい場合がある。従 って、多くの IHC 解析には 蛋白質シグナルを高めるよう増幅工程が含まれている。IHC は最も普及した、最も費用対効果が高いプラットホームである • 病理検査施設で世界的に使用されている • ルーチンに利用されたFFPE の標本で使用することができる • 比較的安価 • 必要機器が少ない • 訓練および最適化が迅速 • 融合蛋白質の存在を検出するのに多くは少量の腫瘍細胞ですむ ALK IHC およびALK FISH の結果には優れた相関関係があるが、ALK阻害剤治療への反 応を予測するマーカーとしての IHC の価値は複数の患者グループで確認されていない。IHC はまたALK再構成を直接立証する物ではなく、ある種の偽陰性および偽陽性結果（FISH の 結果と比較して）が報告されている。また、IHC でALK陽性、 FISH でALK陰性となった標 本のいくつかは crizotinib への良い反応を示している（Peled 2012）。 ALKテストのための IHC 解析の標準化は現在進行中である。しかし、多くのガイドライ ン、たとえばヨーロッパおよび日本で作成されたものは、crizotinib 療法の患者選択につい

45

第 6 章: ALKテストのための異なった解析プラットホームの比較

て、 FISH で陽性の確認を行うためにALK IHC を スクリーニング検査として既に推奨して いる。また、米国のガイドラインは、注意深い検証を実施すればALK IHCを肺腺癌を持つ患 者のスクリーニングとして考慮してもよいことを記している。 RT-PCR は 5' パートナーおよび切断バリアントの精密な同定が可能な、特異性の高い信 頼できる技術である。しかし非定型ALKバリアントあるいは融合パートナー（挿入または欠 失を伴う変則的なバリアント）は検出されない場合がある。EML4-ALKの RT-PCR プライマ ーは正常細胞の産物を増幅しないため非常に感度が高いが、既存のFFPE 標本では、mRNA が保たれた状態にない。RT-PCRにかかる費用はまだ評価の途中であり、検査施設および使 用される検査によって異なる。 CISHは 、FISH の不利な点のいくつかを克服することを目的に開発されたALK再構成検 出の新しい方法である（Kim 2011）。CISH は完全に自動化した ISH 解析で、安定した染 色を提供し、通常の明視野光学顕微鏡を使用してALK遺伝子再構成を検出する事ができる。

IHC 対 FISH

いくつかの研究で FISH と IHC が比較された。2 つのマウスモノクローナル抗体のクロ ーン、ALK1（Dako）および 5A4（Novocastra）、を含めた種々の抗体、ウサギのモノ クローナル抗体のクローン D5F3（Cell Signaling Technology）、およびウサギのポリク ローナル抗体（Invitrogen, Life Technologies） がIHC に用いられてきた。多くの研究で は、FISH はALKブレークアパート再構成プローブキット（Abbott Molecular）を用いて施 行された。これは crizotinib 治療の患者選択のためにALKテストのコンパニオン診断キット として米国の FDA によって承認されている。 ALK1 IHC 対 FISH

未分化大細胞型リンパ腫を診断するために使用されたALK1 抗体が、はじめにNSCLC のALK 再構成検出のために評価された。ALK1 IHC および FISH は肺腺癌または NSCLC 患者を用い た 3 つの研究で比較検討された（表 1）（Rodig 2009, Mino-Kenudson 2010, Yi 2011）。 FISH と比較して、ALK1 IHC は未分化大細胞型リンパ腫よりもALK-再構成肺癌検出の感 受性が低く、これはおそらく NSCLC ではALKの融合蛋白質の発現レベルが低いことによる 思われる。ALK1 は特異性は高いものの、感受性は 67～100% の範囲にとどまっていた。 表 1。ALK1 抗体を用いた IHC 染色の特徴 研究

標本の ALK1 数 希釈

抗原賦活化法

検出と 増幅

スコアリング

IHC 陽性

IHC 感受性

IHC 特異性

Rodig et al., 2009

358

1:2

EDTA (pH 8.0) 圧力鍋

チラミド増 幅および EnVision

0対+

>10% 陽性 腫瘍細胞

増幅有りで 80% (無し 40%)

100%

MinoKenudson et al., 2010

153

1:2

EDTA (pH 8.0) 圧力鍋

EnVision

0、1+、2+、 または 3+ 腫瘍細胞 染色陽性％

>10% 陽性 腫瘍細胞

67%

97%

>0

90%

97.8%

Yi et al., 2011

101

1:100 EDTA (pH 8.0) PT link

PT Link, EnVision, および ADVANCE は Dako の製品。

ADVANCE

0、1+、 2+、 または 3+

46

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

ある標本は FISH でALK陽性で、IHCでALK陰性であったが、IHCでALK陽性、FISHでALK 陰性となった標本は無かった（Rodig 2009, Mino-Kenudson 2010）。その報告の一つで は、ALK IHC スコア1+ を陰性、 3+ の IHC スコアを 陽性とし、そして 2+ を判定不明 と判定した（Yi 2011）。この分類は乳癌のHER2 検査の評価法に類似している。チラミド 増幅の使用は検出の感受性を高めるために推奨されたが、腫瘍および非腫瘍細胞の非特異染 色が高濃度ALK1 抗体で報告されている（Mino-Kenudson 2010）。 D5F3 IHC 対 FISH

3 つの研究で D5F3 クローンを用いた IHC と FISH が比較された（表 2）（MinoKenudson 2010, Martinez 2013, Minca 2013）。感受性は 83～100% であり、特異性 は 99% および 100% であった。その中の研究の1つでは、FISHでALK陽性であった 6 標 本のうち、1 検体は IHC によってALK陰性であったが、FISH によってALK陰性であった標 本で IHC でALK陽性のものは無かった（Martinez 2013）。これらの研究に加えて、 国際 的な病理医パネルは、既知のALK遺伝子型による一連の肺腺癌を D5F3 IHC を用いて評価 した 。全体的にみて、 FISH と比較した IHC の感受性は 90% で、特異性は 95% であ り、観察者間のスコアリングの一致率は高かった（Hirsch 2013）。 表 2。D5F3 抗体を用いた IHC 染色の特徴

研究

MinoKenudson et al., 2010

Martinez et al., 2013

Minca et al., 2013a Hirsch et al., 2013b* a

標本の 標本の 数 数

抗原 賦活化法

検出と 増幅 システム

IHC 陽性 閾値

IHC 感受性 (対 FISH)

IHC 特異性 (対 FISH)

0対+

≥10% 陽性 腫瘍細胞

83%

100%

スコアリング

153

1:100

EDTA (pH 8.0) 圧力鍋

EnVision+

0、1+、2+、 >10% または 陽性 3+ および 腫瘍細胞 腫瘍細胞 %

100%

99%

79

1:50

標準 BenchMark XT

ultraView

231

1:100

温度調整 BenchMark XT

OptiView

0対+

陽性

94%**

100%

98

前希釈

標準 BenchMark XT

OptiView と OptiView 増幅

0対+

強い 細胞質 染色

90%

95%

FFPE 標本を用いた IHC 検査の 2 つの偽陰性結果は ThinPrep プロセッサー(陽性の結果)を用いた検討で修正された。

b

研究に選ばれた症例のうち、43 検体は FISHテストによってALK陽性で、55 検体は FISH によってALK陰性であった。

BenchMark XT, ultraView（Universal DAB Detection Kit）, OptiView（DAB IHC Detection Kit）, および OptiView Amplification Kit は Ventana Medical Systems、Inc.の製品。 EnVision+ は Dako の製品。

5A4 IHC 対 FISH

少なくとも 6 つの大きなシリーズの研究で 5A4 クローンを用いた IHC と FISH が比較さ れた（表 3）（Jokoji 2010, Kim 2011, Paik 2011, Lopes 2012, McLeer-Florin 2012, Sholl 2013）。すべての研究を通して、感受性および特異性はそれぞれ 93～100% まで, および 96～100% に及んだ。しかし、その中の研究で、偽陽性あるいは偽陰性の結果が報 告されている。1 例は、悪性腫瘍細胞が FISH で検出されず、結果は IHC ALK陽性であっ

47

第 6 章: ALKテストのための異なった解析プラットホームの比較

表 3。5A4 抗体を用いた IHC 染色の特徴 研究

5A4 標本 希釈倍 数 率

抗原 賦活化法

検出と 増幅 システム

254

1:100

標的賦活化法 溶液、 高いPH

EnVision FLEX+ お よび IAEP

Paik et al. 2011

640

1:30

CC1 溶液

i-VIEW

Kim et al., 2011

465

1:30

CC1 溶液

i-VIEW

McLeerFlorin et al., 2012

441

1:50

CC1 溶液

ultraView

Lopes et al., 2012

62

1:200

電子レンジ

Novolink

Sholl et al., 2013

186

1:50

クエン酸緩衝 液、(pH 6) 圧力鍋中

EnVision FLEX+

Jokoji et al., 2010

IHC 陽性 閾値

スコアリング 0対+

スコア無し

IHC 感受性 (対 FISH) 100%

(FISH は IHC+ 標本 でのみ行 われた）

IHC 特異性 (対 FISH) 100%

100%

96%

100%

98%

>10% 腫瘍細胞 陽性

95%

100%

スコア無し

>10% 腫瘍細胞陽性

100%

100%

0、1+、また は 2+

1+, 2+

93%

100%

0、1+、2+、 0、または 1+: または 3+ 陰性 2+: 陰陽不明 3+: 陽性

0、1+、2+、 0、または 1+: または 3+ 陰性 2+: 陰陽不明 3+: 陽性

0、1+、2+、 または 3+ およ び 腫瘍細胞 陽性 ％

スコアが 2+ の場合,陽性と 判定

a McLeer-Florin et al., Jokoji et al., および Lopes et al.の研究に使用された 5A4 抗体は Abcam の製品; 他の研究で使用された抗体は Novocastra の製品。 iView (DAB Detection Kit) および OptiView (DAB IHC Detection Kit) は Ventana Medical Systems の製品。Novolink (Polymer Detection System) は Leica Biosystems の製品。

た。別の例では、弱い緑のプローブシグナルをもつ非対称的なスプリットシグナルが FISH ALK陽性と誤って解釈されていた（Sholl 2013）。全体的にみて、その研究では、FISH と 比較した IHC の特異性は 98.5% であった。 ウサギポリクローナル抗体 IHC 対 RT-PCR

少なくとも 2 つの研究では、ウサギのポリクローナル抗体を用いた IHC が行われている （表 4）（Wong 2009, Chen 2012）。その内の１つの研究では、結果は EML4-ALK RT-PCR で得られた結果と比較され、一致率は高かった（Chen 2012）。他の研究では、RTPCR でALK陽性の 11 の腺癌と 1 つの腺扁平上皮癌が IHC でも陽性と判定された（Wong et al 2009）。 表 4。ALKウサギポリクローナル抗体を用いた IHC 染色の特徴

研究

Wong et al., 2009 Chen et al., 2012

標本の数 (ALK+ ALK1 の %) 希釈倍率 266 (4.9%)

64 (4.7%)

抗原 賦活化法

1:1000 クエン酸緩衝液 (pH 6.0) 電子レンジ 1:500

CC1 溶液

検出と 増幅 システム

HRP コンプレックス ultraView

スコアリ ング

IHC 陽性 閾値

無し

特定無し

0、1+、 2+、 または 3+

≥2+

IHC IHC 感受性 特異性 (対 RT-PCR) (対 RT-PCR) 100%

特定無し

100%

90%

CC1 (TTris/borate/ EDTA) は Roche (バーゼル、スイス連邦共和国)の製品で。ultraView (Universal DAB Detection Kit) は Ventana Medical Systems, Inc. , そして HRP (horseradish peroxidase) complex は Dako の製品。

48

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

表 5。IHC で使用される抗体クローンの比較

研究

Takeuchi et al., 2009

Rodig et al., 2009

標本の数 (ALK+ 抗体 の %) クローン

21 (52%)

239 (4%)

361a (5%)

標的賦活化 溶液（pH 9.0) （全て)

Selinger et al., 2013

377 (3%)

594 (11%)

iAEP

スコアリング 0対+ (全て)

標準

RT-PCR

IHC IHC 感受性 特異性 (対 標準) (対 標準) 100%

100%

5A4

EnVision+

27%

100%

iAEP

100%

100%

ALK1

EnVision+

9%

100%

SP8

iAEP

20%

100%

SP8

EnVision+

100%

18%

40%

100%

80%

100%

67%

97%

100%

99%

81%

100%

EnVision FLEX+

100%

100%

EnVision FLEX+

100%

99.7%

100%

62.5%

ALK1

ALK1

EDTA 圧力鍋中（両 方）

EnVision+

EDTA 圧力鍋中（両方

EnVision+ (両方)

チラミド 増幅

D5F3 ALK1

標的賦活化法 溶液（pH 9.0) (全て)

5A4

Conklin et al., 2013

検出と 増幅 システム

ALK1

ALK1

37 (59%) MinoKenudson et al., 2010 Murakami et al., 2011

5A4

抗原 賦活化法

5A4

製造元の 使用説明に 準拠（全て）

ABC (増幅無し)

iAEP

0対 + (両方)

FISH

スコア >2.7 画像上 解析は 陽性

FISH

0対+ (全て)

RT-PCR/ FISH

0、1+、2+、 または 3+ (全て)

FISH

ALK1

EnVision FLEX

66%

100%

ALK1

ADVANCE

66%

87.5%

5A4

ADVANCE

100%

87.5%

D5F3

ADVANCE

100%

75%

100%

99%

0、1+、2+、 または 3+ (全て)

FISH

ALK1

緩衝液（pH 9.0) 圧力鍋中

EnVision FLEX+

5A4

製造元の 使用説明書に 準拠

ultraView と ultraView 増幅

100%

98%

D5F3

製造元の 使用説明書に 準拠

OptiView と OptiView 増幅

100%

99%

a D5F3 抗体検査のための標本数は 356 であった。 SP8 は Abcam の製品。Target Retrieval Solution, buffer, EnVision, EnVision FLEX+, および ADVANCE は Dako の製品。であ る。ultraView (Universal DAB Detection Kit) , OptiView（DAB IHC Detection Kit), および ultraView and OptiView Amplification

kits は Ventana Medical Systems、Inc.の製品である。 ABC=avidin biotin complex.

49

第 6 章: ALKテストのための異なった解析プラットホームの比較

抗体クローンの比較

同じサンプルセットを使用して抗体クローン間の一致率を検討した研究もある。一致率は抗 体によって異なっていた（表 5）（Rodig 2009, Takeuchi 2009, Mino-Kenudson 2010, Murakami 2011, Conklin 2013, Selinger 2013）。Takeuchi et al.はシグナル増幅のため に抗体増強ポリマーの挿入（iAEP）方法を用いてALK1 および 5A4 抗体の結果の同等性を報 告した（Takeuchi 2009）。しかし、 不一致が認められた検討もある。例えば、Murakami et al. はALK再構成をもつ 12 の標本間で 1 つの不一致例を報告した。その結果は 5A4 IHC で陰性で, D5F3 IHC で陽性であった（Murakami 2012）。Conklin et al. は 抗体クロー ンと検出システムの 5 つの組合せを比較した。ADVANCE system（Dako）を用いた場合 5A4 と D5F3 が最も高い一致率を示したが、 FISHでALK陰性だった標本では不均一な陽 性反応が検出された（Conklin 2013）。

マルチプレックスあるいは定量的な RT-PCR 対 FISH（IHC の有無を問わず）

ある研究では、EML4-ALK転写物が 9 人の NSCLC 患者から採取した腫瘍細胞で認められ たうえ、正常な肺でも認められた（Martelli 2008）。正常な肺組織にそのような転写物が認 められたことは他の研究者によって追認されていないため、データに疑いが持たれた（Mano 2010, Sasaki 2010）。RT-PCR は高い特異性と感受性をもつ方法で、偽陽性は認められな い。しかし、FFPE 標本から良質の RNA を取得することが難しいため,偽陰性をもたらす危 険がある。RT-PCR の偽陰性率について詳しい報告は無いが、前向き研究でのALK転写物の 検出成功が報告されている（Soda 2012）。その研究では、916 の検体中 108（12%）は RNAが分解しており解析から除外された。EML4-ALK転写物は 36 検体で検出され、そのう ち 15 に IHC を施行でき、 15例すべてがALK IHC陽性であった。 一般に、ALK転写物検出のための RT-PCR の感受性と特異性はIHC および FISH と比較し て満足できるものであり、94～100% におよんでいる（表 6）（Takeuchi 2008, Inamura 2008, Takeuchi 2009, Soda 2013）。 表 6。他のALKテスト方法の結果と RT-PCR 結果の比較

研究

タイプ RT-PCR

IHC 抗体

FISH

Inamura et al., 2008

マルチプレック スRT- PCR

ALK1

Takeuchi et al., 2008

マルチプレック ス RT- PCR

–

Takeuchi et al., 2009

インバースおよ び マルチプレック スRT- PCR

Soda et al., 2012

マルチプレック スRT- PCR

無し

RT-PCR の感受性 RT-PCR の特異性 (対 FISH および/ま (対 FISH および/ たは IHC) または IHC) 100% (対 IHC)

100% (対 IHC)

FISH-ベースの融合解析

100% (対 FISH)

100% (対 FISH)

5A4 ALK1

EML4 そして KIF5B

100% (対 IHC)

100% (対 IHC)

5A4

ALKブレークアパート プローブキット

100% (対 IHC) 94% (対 FISH)

100% (対 FISH) 100% (対 FISH)

融合解析

Inamura et al. および Takeuchi et al.(2009) による研究に用いられたALK1 抗体は Dako 製品である。Takeuchi et al.(2009) の研究で

使用された5A4 抗体は Abcam の製品で、 Soda et al.の研究で使用された物は Nichirei Biosciences, Inc. の製品である。Soda et al.の 研究で使用されたブレークアパートプローブキットは Abbott Molecular の製品である。

50

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

CISH 対 他の方法

CISH には FISH に勝る利点があり、ALK再構成検出における CISH の結果が他の方法のそれら と同等であることが示されている（表 7）（Kim 2011, Yoshida 2011a, Schildhaus 2013）。 CISH のためのALK陽性の規準は FISH の基準と同じ報告もあれば、 CISH のために別のカッ トオフ値を用いる事により、ALK陽性とALK陰性の腫瘍をより良く分けることができたとする 報告もある（Schildhaus 2013, Yoshida 2011a）。新しい技術が開発され、ALKコピー数お よびALK蛋白質表現が同一細胞で評価される技術もある（Ventana Medical Systems、Inc.） （Ventana Medical Systems、Inc.）。この方法はより正確なALK状態を示し、従来の IHC よりも優れた感受性を証明している。しかし、この解析は技術的に難しく、この技術の検証 作業が進行している。 表 7。ALKテストの他の方法と CISH の比較 CISH

研究

解析キット

Kim et al., ALK二色 2011 ブレークアパート CISH Yoshida et al., 2011a

ALK二色 ブレークアパート CISH

Schildhaus ZytoDot 2C SPEC et al., ALKブレークアパ 2013 ートプローブ

標本の数 (ALK+ の %)

陽性の 基準

431 (4%)

記述無し

FISH

IHC

RT-PCR

感受性 特異性 感受性 特異性 感受性 特異性 94%

100% 66.7% 100%

NA

NA

45 (31%)

≥20% 100% 100% スプリット シグナル伴う

93%

100%

93%

100%

100 (16%)

≥15% の細胞 100% 100% スプリット シグナル伴う

NA

NA

NA

NA

Kim et al. および Yoshida et al.の研究に使用した解析キットは Ventana Medical Systems、Inc.の製品。 Schildhaus et al. が研究で使用 したキットは Gmbh ZytoVision の製品。 NA =利用できない。

ALKテストのための診断アルゴリズムの例

ALK検出のための個々の方法の利点と特徴に基づいて、いくつかの研究グループはALKテス トの診断アルゴリズムを提案している（図 1-6）（Japanese Lung Cancer Society 2011, Kim 2011, Paik 2011, Thunnissen 2012b, Conklin 2013, Marchetti 2013）。 Lung Cancer Samples

Cytology samples, frozen

RT-PCR Negative

IHC

Positive

Positive

Negative

FISH

Negative (rare)

Positive ALK inhibitor

図 1。IHC によるスクリーニングと FISH に よる確認からなる 、日本肺癌協会が提案する アルゴリズム; RT-PCR は細胞診の標本に使用 される。点線は臨床病理学的特徴に従って施行 可能な検査を表す。 Biomarker Committee, Japanese Lung Cancer Societyによる肺癌患 者のALK遺伝子検査のためのガイダンス。第 1.0 版 2011年8月1日。http://www haigan. gr.jp/uploads/photos/641.pdf で参照可能。

51

第 6 章: ALKテストのための異なった解析プラットホームの比較

図 2。IHC および CISH または FISH を用いたALK遺伝子再構成を予測するア ルゴリズム 。Kim H, Yoo S-B, Choe J-Y, et al の許可を得て修正。 J Thorac Oncol. 2011; 6 (8): 1359-1366。

IHC

Negative 0/1+

Equivocal 2+

Positive 3+

Reported as ALK negative

CISH/FISH

Reported as ALK positive

図 3。NSCLC のALK IHC およ び FISH を使用した診断アルゴリズ ム。Paik J, Choe G, Kim H, et al の 許可を得て修正。 J Thorac Oncol.

2011;6(3):466-472.

IHC

Negative 0/1+

Equivocal 2+

Positive 3+

Reported as ALK negative

FISH

Reported as ALK positive

図 4。ALK IHC が十分に確認され た場合での NSCLCALKテストのた めのアルゴリズム。Thunnissen E, Bubendorf L, Dietel M, et al の 許可を得て修正。 Virchows Arch.

2012;461(3):245-257.

NSCLC ALK testing IHC

Positive 1+, 2+, 3+

Negative

FISH

Negative

No ALK rearrangement

Positive

ALK rearrangement

52

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

図 5。IHC によるALKテストと FISH に よる確認からなる診断スクリーニング のアルゴリズム。Conklin C, Craddock KJ, Have C, et al の許可を得て修正。 J Thorac Oncol. 2013;8(1):45-51.

ALK IHC

(5A4 by Novocastra or DSF3 by Cell Signaling with ADVANCE detection)

Negative

Positive

(No ALK expression)

(Any ALK expression)

FISH ALK negative

ALK positive

NSCLC

(adenocarcinoma, large cell carcinoma, mixed tumors with adenocarcinoma, NOS)

ALK IHC

1-2 working days

Negative

Positive

FISH test

Negative No ALK rearrangement

まとめ

2-3 working days

図 6。the Italian Association of Medical Oncology and the Italian Society of Pathology and Cytopathology による NSCLCALKテストのアルゴリズム。点線 で書かれたボックスおよび点線は、IHC によるスクリーニングの後で FISH に回 す仮説的な方法を示している。IHC およ び FISHテストと結果の解釈に必要な時 間も記載されている。NOS=not otherwise specified. Marchetti A, Ardizzoni A, Papotti M et al の許可を得て修正。 J Thorac Oncol. 2013;8(3):352-358.

Positive ALK rearrangement

IHC を用いたALKスクリーニングが多くの地域で推奨されている。それはスクリーニングの 費用対効果が高いこと、および FISH によってALK陽性結果が確認されることによる。IHCの みの結果ではALKチロシンキナーゼ阻害剤の臨床的効果反応性との関連を示す検証が必要と される。さらに、非定型あるいはボーダーライン例の臨床的意義を知るため、 FISH による 評価を続ける必要がある。ALKテストのための複数の診断アルゴリズムが提案されている。

第7章 細胞診におけるALKテスト 執筆担当：Lukas Bubendorf

NSCLC における細胞学の役割

NSCLC における予測マーカーとしてのALK再構成検出のFISH検査法は、当初、生検材料で 承認された（Kwak 2010）。パラフィンブロックは病理検査施設でルーチンに処理され、 これらのブロックから多数の切片をさまざまな解析に利用できるため、生検材料はトランス レーショナル研究でしばしば用いられている。しかし、40% におよぶ進行非小細胞癌 は、 生検材料による組織検査無しで、細胞診単独で診断されている。従って、組織診がALKテ ストの唯一の検体であるということにとらわれ過ぎると、多くの患者で生検が繰り返し行 われる事にもつながるため、細胞診検体でのALKテストの重要性が強調されてきている。 細胞診標本による FISH 解析には長い伝統があり、組織切片に適用できる以前には、細 胞株あるいは腫瘍組織標本から単離した核を用いた FISH 解析が行われていた。 FISH は また細胞診の分野で確立された方法でもある。技術的な面からは、細胞診標本にALK FISH を施行することを非とする理論的根拠はない。実際は、細胞診標本には複数の利点がある。 例えば、組織切片と対照的に、細胞スメアの細胞核は断片化されず、真の細胞核の FISH シ グナル数検出を可能にする。 再発あるいは転移症例において、バイオマーカー解析を繰り返して行うために腫瘍材料 を採取するには、細胞診は侵襲性の少ない、好ましい方法と言える。NSCLC の細胞診は 通常 EBUS-FNA、経胸 FNA、気管支分泌物または擦過、気管肺胞洗浄液、および胸膜の FNA あるいは他の転移場所のFNA をもとに施行される。セルブロックは組織標本と同様に 扱うことができ、またバイオマーカー解析と同じプロトコールを適用できることもあるた め、そのような標本で FFPE セルブロックを作成することは多くの検査施設で好まれるよ うになっている。（図1） （Alici 2013, Kalhor 2013）。セルブロック は、繰り返し切片をカッ トして多くの材料が得ら れる上に 蛋白質や DNA 50 µm 50 µm の質を長期間保持できる A B 利点がある。市販製品に 図 1。肺腺癌の胸水。1A: 通常スメアのパパニコロウ染色。1B: セルブロッ ク切片の H&E 染色（x 400）。 加えて、セルブロック作

54

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

成のためのプロトコールが報告されている。一般的に使用されるプロトコールは、いわゆ る細胞ボタン法、アルギン酸ナトリウム法、および血漿トロンビン法である（ボックス 1） （Orell 2011, Kalhor 2013, Noda 2010, Jing 2013）。

方法 1

細胞ボタン方法（Orell 2011, Kalhor 2013）

a. 吸引サンプル またはサイトスピン検体を、拡散したり塗り付け

たりしない様に、スライドグラス上に静かに1滴滴下する。

b. 数秒間付着させた後に、スライドを注意深くエタノールに浸漬 して固定する。

c. c. 固定が終わったボタン様の滴下物を静かにメスの刃で剥が し、生検標本と同様に処理する。

アルギン酸ナトリウム法（Noda 2010） a. 液状検体の遠心沈澱物を、10% 緩衝ホルマリン液内で溶

解、浮遊させ 2-3 時間固定する。

方法 2

FISH はほとんどあらゆるタ イプ、構成成分の細胞診標 本に適用可能な手堅い技術 である。ALK FISH 解析のた めのプロトコールや規準は 組織検査と同一である。しか し、少なからずのセルブロ ックは分子解析に不十分か、 または全く癌細胞を含んで いない（Knoepp 2013）。 また、特に FISH 解析では、 通常の細胞診に比べて、隣接し た反応細胞から腫瘍細胞を区別 することが難しい。従って、い くつかの検査施設では、細胞診 標本によるALK解析は有効では あるがオプションの一つとされ ている（図 2）（Betz 2013、 Savic 2013）。細胞診の重要な 利点は、追加未染色スライドを

ボックス 1。細胞診セルブロック作成プロトコール

b. 遠心分離機によって固定細胞のペレットを集め、ホルマリン上 清を注ぎ落とし、蒸留水で洗浄する。

c. 遠心分離機にかけ、ペレットを 0.5mLの 1% アルギン酸ナトリ ウムで再浮遊させる。

d. ナトリウムカルシウム（1M）を溶液に加え、ゲル化させる。

e. ゲル化した材料を鉗子で採取し、生検の小標本と同様に処理する。

血漿トロンビン法（the University Hospitals of Basel and Zurich, Switzerland で使用されるプロトコール）

a. 細胞診材料を 2,500rpm で 10 分間遠心分離機にかける。

b. 上清を取除く。

c. 2滴の沈殿物をピペットで先細の小チューブ（エッペンドルフチ

方法 3

肺細胞診におけるALK FISH の解析

ューブなど）へ移す。

d. 200 μl の血漿を加えて、標本を短時間ミキサーで混和する。

e. 50 μl のトロンビンを加えて、標本を短時間ミキサーで混和する。 f . 標本を 5 分間インキュベートする。

g. ゲル化した細胞塊を埋め込みカセット（2 つのフィルターパッドの 必要とせず、 FISH 解析用にす 間）に入れ、カセットを閉じる。 でに染色されたスライドの中か h. 10% 緩衝ホルマリン液中で材料を固定する。 ら最適な細胞診スライドを選択 i . 固定標本を取り出し、生検の小標本と同様に処理する。 できることである。核分断およ びそれに関連したアーティファ クトがないことに加え、空気乾燥またはアルコール固定した細胞診標本の DNAは、ヌクレ オチドの架橋 および化学修正をもたらすホルムアルデヒドによる固定標本に比べて、品質的 に勝っている。この事実は、従来の細胞診のALK FISH 解析の成功率は 100% で、組織標 本での失敗率は 19% におよぶ理由を説明している（McLeerFlorin 2011、Savic 2013）。 FISH は、従来のスメア、サイトスピン、あるいは液状化細胞診（ThinPrep[Hologic] または SurePath [BD Diagnostics]）を含むほとんどすべての細胞診標本に、固定方法（ 空気乾燥およびアルコールベースの固定液）に関わらず 適用することができる。肺細胞診 に、粘着剤塗布あるいは正荷電のスライドを使用することは、これらのスライドが細胞の脱 落を防ぎ、 FISH の技術的な操作の間に剥がれ落ちるのを防ぐのに有用である。FISH は、

55

第 7 章: 細胞診におけるALKテスト

A

B

C

D

図 2。通常の細胞診スライド、あるいは以前にパパニコロウ染色された組織を用いたALK FISH の代表的な所見（ z 軸に沿う圧縮重層画像は全細胞核の FISH 全シグナルの投影図を示す）。2A および 2B: 3つの正常（融合）ALKシグナル（2A）、および 腫瘍細胞核当たり多数の正常ALK シグナル（2B） を伴うALK陰性の癌。2C および 2D: 1 つあるいは 2 つのブレークアパートシ グナルを伴うALK陽性な癌（緑と赤のシグナルの間隔が少なくともシグナルの２倍）（2C）、 あるいは腫瘍細胞核当たりいくつかの正常シグナルに加えて、対応する緑シグナルを欠く単一 の赤シグナル（2D）。

パパニコロウ、ヘマトキシリン、または変法ギムザ染色と同様に、未染色の標本でも十分 に機能し、追加処理は通常必要としない。変法ギムザ染色は例外で、FISH 解析の前に、酸 アルコール技術による脱染色が推奨される（Betz 2013）。3-アミノ-9-エチルカルバゾル （AEC）がクロモゲンとして使用される場合、 FISH は免疫組織化学染色標本にも応用でき る。3, 3' ジアミノベンチジン（DAB）は自己蛍光のために FISH シグナルと干渉する。染 色済み細胞診標本の FISH のプロトコールが発表されている（Thunnissen 2012b）。細 胞診検査施設では診断で用いたスライドを数年間保存する法的義務があると同時に、診断 後数年経ってまれな症例を見直すこともある。そのため、診断で用いた細胞診標本をFISH 解析に使うことに抵抗があるかもしれないが、代表的な画像を保存し、または解析前に全 てのスライドをスキャンすることでそのような懸念は対処できる。 FISH 解析後のスライ ドを再染色することもまた可能である（Betz 2013）。

56

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

ALK FISH 陽性評価の閾値は組織標本の解析をもとに確立された（癌細胞の少なくとも 15%にALK再構成の典型的なシグナルパターンが存在する）。しかしながら、 推奨コンセ ンサスが利用可能になるまでは、個々の検査施設でALK陰性細胞診標本について独自の閾 値を定める必要がある（カットオフ 値の詳細については蛍光インシチューハイブリダイゼ ーションの項を参照）。オーバーラップしていない腫瘍細胞がALK FISHの検査に選ばれ るべきである。しかし、再構成シグナルの検出は三次元構造によって阻害されないため、 多くの三次元 クラスターはALK解析に用いる事ができる。腫瘍細胞比率の低い標本には、 癌細胞の位置を記憶する適切なソフトウェアによる自動化ステージを使用することにより 解析の精度を高め、迅速にFISH の結果を得ることができる。

細胞診断におけるALK IHC 検査

ALK蛋白質の過剰発現を検出する免疫組織化学は最近開発された有用性の高い解析方法で あり、FISH 解析のための NSCLC のスクリーニングおよび FISH判定不能例を評価するた めに用いられる（詳細は 免疫組織化学 の項に記載)。組織標本と同様に、ALK IHC は、セ ルブロックおよび通常あるいは液状細胞検体を含む細胞診標本に施行可能である（Moreira 2012、Martinez 2013、Savic 2013、Tanaka 2013）。パパニコロウ染色された細胞診ス ライドのALK IHC の精度は非常に高く、ALK FISH と比較した感受性および特異性はほぼ 100% である（Savic 2013, Tanaka 2013）。この精度は 5A4 抗体（Novocastra、ALK テストのための解析プラットホームの項 を参照）を用いた自動免疫染色装置を用いて得 られた（Bond-Max、Leica Biosystems）（図 3および 4）。この抗体の他のプラットフ

A

B

C

D

図 3。肺腺癌の悪性胸水に対する通常細胞診スライドを用いた IHC（x 200）にお ける、ALK陰性（3A）、そしてALK陽性（3B、3C）の腫瘍を示す。ALK-再構成 を有する H2228 株化細胞を陽性コントロールとして使用（3D）した。5A4 抗体 （Novocastra）そして自動免疫染色装置（Bond-Max、Leica Biosystems）を用 い、すべての結果は FISH によって確認した。

57

第 7 章: 細胞診におけるALKテスト

A

ォームでの結果や、D5F3 抗体（Ventana Medical Systems、Inc.）を用いて新しく標準化されたALK IHC 細胞診解析の検証には追加研究が必要である。 IHC は広く施行可能であることから、ALKテス トの最初の手段として IHC を使用する病理検査施 設の数が増加し、IHC の結果が評価困難あるいは 陽性の時に限ってFISHが施行されている。ただし、 組織および細胞診標本のための標準化した方法を用 い、適切な外部品質管理プログラムが行われる必要 がある。

RT-PCR

B

RT-PCR が細胞診標本の解析に使用される場合があ る（Betz 2013, Mitiushkina 2013）。ALKテスト のための 解析プラットホームに記述されているよう に、RT-PCR はALK IHC あるいは FISH の結果を 確認するためには適切かもしれないが、ALK再構成 検出の一次スクリーニングには適切とはいえない。

まとめ

通常の細胞診スライドおよびセルブロック標本は、 予測ALK解析のための生検標本を十分代替する方法 といえる。

C 図 4。ALK陽性の肺腺癌（x 200）。 パパニ コロウ染色が施されたスライド上で 5A4 抗 体（Novocastra）を用いたALK IHC（4A） 、それに対応するセルブロック切片での 5A4 抗体（4B）、および D5F3 抗体（Ventana Medical Systems、Inc.）での染色（4D）。

第8章 ALKテストの報告

執筆担当：Elisabeth Brambilla、Erik Thunnissen、Marileila Varella-Garcia、および Yasushi Yatabe

腫瘍の分子病理診断の標準的な報告と同様に、ALKテスト報告書は、解析前（preanalytic）、 解析（analytic）、結果（results）、および解釈／結論（interpretation/conclusion）の４ つの成分から成り立っており、これはFISH, IHC, あるいは RT-PCR の診断方法を問わない。

解析前セクション

同時に提出される病理レポートに分子診断が含まれていない場合、このセクションの標準 的なレポートは、患者情報に加えて、標本の種類および診断の概要を含むべきである。 報 告されるべきは次の情報である。 標本の特徴

•

• •

標本のサイズおよび種類: 外科切除（肺葉切除、肺切除、区域切除、楔状切除）、生検 （気管支／経気管支生検、針生検）、FNA細胞診、液体検体（胸膜、 脊髄液) 組織の保存方法: 急速凍結（保存温度も）または FFPE 組織の固定法: 固定のタイミングおよび固定時間および使用した固定液（FFPE には緩 衝ホルマリンが推奨される）。組織が脱灰溶液で処理された場合は、使用された脱灰試 薬と共に記録すべきである

腫瘍の組織学的診断

腺癌のタイプおよびサブタイプの分類については the 2011 IASLC/American Thoracic Society/ European Respiratory Society lung adenocarcinoma classification に従うべ きである（Travis 2011）。1つ以上の腫瘍型が含まれる場合、次の様に記述すべきである: 腺扁平上皮癌、小細胞肺癌と腺癌の混合、および 神経内分泌大細胞癌（単独あるいは腺癌と 混在）。1 つ以上の増殖パターンあるいは組織学的サブタイプが同一の腫瘍に認められた場 合、検体での優勢な組織学的サブタイプが記載されるべきであり、採取された成分がわかれ ば、検査された組織型的サブタイプが記録されるべきである。 腫瘍細胞の評価

• IHC、FISH、および/または RT-PCR のためにサンプルに十分量の腫瘍細胞があるか否 かを評価するための、切片内での推定される腫瘍の細胞密度（切片内のすべての核と比

59

第 8 章: ALKテストの報告

•

• •

較した腫瘍細胞の核のパーセント） そのままの切片もしくはブロックにおける腫瘍細胞比（％）および、マイクロダイセク ションなどの腫瘍細胞に富んだ領域を選択した場合はその後のDNA/RNAが抽出される 組織での腫瘍細胞比 壊死の範囲、炎症性細胞浸潤、炭肺、および組織のアーティファクト 情報があれば、追加診断用免疫組織化学マーカー、例えばTTF-1、p63/p40、および 粘液染色による検査結果（Thunnissen 2012a）

総合的な標本の適切性

• 「検査に最適（関連する所見およびALKテストの所見をここに記載する）あるいは「不 適（suboptimal） 」（理由を記述）として記録 他の情報

• 情報があれば、 薬剤治療歴（オプション）

解析セクション

このセクションには使用されたそれぞれの解析方法の感受性および診断基準と共に、基本的 な操作手順が含まれるべきである。再検査や検査施設間の結果の相違に備えて、別の検査施 設が何を行ったのか理解できるように十分な情報を提供すべきである。 • ALK FISH: プローブセット（製造元、タイプ）および陽性結果判定に使用される診断 基準 • ALK IHC: 抗体のクローン （由来）、抗体の濃度、インキュベーション時間および温 度、 および二次シグナルの増強システム • ALKRT-PCR: 方法、プライマー、プローブおよびその陽性コントロール、解析法の感 受性

結果セクション

このセクションでは検査結果について報告すべきで、偶然見つかった所見やその意義がわ からないバリアントなども含まれる。 結果が不確定である場合は、それを明確に記載すべ きである。結果は、腫瘍医および専門外の病理医が容易に結果を理解できるようにALK再 構成陽性または陰性として報告されるべきである。加えて、使用された解析方法に関する 特別な情報が報告されるべきである。 ALK FISH: 解析された細胞の数および 陽性パターンを示した細胞の数とパーセント。非 定型パターンが見られたら、注記すべきである（例えば、「ALK再構成は陰性、解釈の項 を参照」）; International Systems for Human Cytogenetic Nomenclature（ISCN） をもちいれば、容易に理解しやすい明確な結果を示すことができる。 ALK IHC: 結果は陽性、陰性または評価不能として報告されるべきである。結果が 評 価不能の場合、その理由を説明をすべきである（例えば、腫瘍組織がなくなってしまっ

60

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

た、 腫瘍細胞数が足りないなど）。他の任意に付け加える結果としては修正 H スコア （染色した核のパーセント、染色強度、および染色パターン [細胞質/細胞膜]）および 染色の均一性などがある。技術の妥当性を保つために、外部の陽性コントロールはすべ ての検査で必要である。この陽性コントロールとしてはALK再構成のある細胞株あるい はALK陽性の腫瘍標本のセルブロックが使用可能である。 ALK RT-PCR: 認められた臨床的に意味のある遺伝子変異の名称が報告されるべきであ る。 融合パターン、例えば「バリアント 1」など。ただし、現在はバリアント 1の代わり に「EML4-ALK（E13; A20）」およびバリアント 4の代わりに「EML4-ALK（E14; A20 E14; ins11del49A20）」と記述する事が推奨されている（Soda 2012）。（詳細な命 名法は http://atlasgeneticsoncology.org/Tumors/ inv2p21p23NSCCLungID5667. html で入手可能。）

解釈／結論セクション

本セクションでは以下の項目が含まれるべきである。 • 標本の種類および診断（未治療またはALKの阻害剤療法後） • 容易で理解しやすい臨床的解釈。これは遺伝子検査結果や腫瘍が、ALK阻害剤治療に反 応するかもしくは抵抗するかの可能性（臨床的エビデンスを考慮しながら）も含まれる。 • 評価不能であった説明や複数の検査間の相違についての説明（分かる範囲での）。解析 の失敗、不十分な標本、または他の理由（例えば、非定型の FISH パターン）に起因す るの かなど。また、より良い結果をもたらす可能性のある他の標本での再検査の検査 の必要性なども含まれる。

まとめ

ALKテストの結果報告は検査医および臨床医の両方が、検体の由来と特徴、検査の性質お よび精度、そして結果の臨床的意義を理解するために十分な情報が含まれるべきである。

第9章 ガイドラインおよび標準化の研究

執筆担当：Yasushi Yatabe、Sylvie Lantuéjoul、Erik Thunnissen、Keith Kerr、 および Ming Sound Tsao

NSCLCに対するALK標的療法の発展に伴い、世界中で多くの腫瘍および病理検査機関が 、 単独の文書もしくは広い分野にわたる遺伝子検査ガイドラインの一部としてALKテストの推 奨事項を発表した。さらに検査機関間のALKテストプロトコールを標準化するために、 地域 あるいは国際的な多施設共同研究が行なわれている。

ガイドライン

肺癌標本における遺伝子検査ガイドラインは臨床および方法論についての推奨を含んでい る。2011年、the European Society for Medical Oncology（ESMO）はルーチン でのALKテ ストはその当時推奨できなかったと記載しているが、新たに発表されるデータがこの検査に おける臨床的意義を指し示す可能性を認めていた（Felip 2011）。それ以来、いくつかの専 門家グループはALK遺伝子再構成を含む肺癌の遺伝子検査のためのコンセンサスと推奨を出 版してきた（表 1）。最も総合的なガイドラインは CAP･ IASLC, および AMP を代表する専 門家の協力と努力の成果の賜物である。この成果は 2012年2月以前に出版された研究の総括 的な評価に基づいたものである。（このガイドラインの推奨概要については付記2を参照）。 このガイドラインは、もし腫瘍が腺癌もしくは腺癌成分を有する場合は、進行 NSCLC のす べての患者がALK遺伝子再構成の検査を受けることを推奨している。ALK遺伝子再構成の検 査はまた、標本が小さく、腺癌成分が存在する疑いが否定できない場合にも施行されるべき である。（Lindeman 2013）。EGFR 突然変異の検査と同様に、標本の適切さを決定するた めに病理医が組織検体の選択に関わることが必要である。現在の推奨検査方法はALK FISH ブレークアパート解析（Vysis LSI Break Apart FISH Probe Kit, Abbott Molecular）で、 これは現在、米国 FDA で承認されたALK阻害剤療法の適格性を決定する唯一の方法である。 しかし、ガイドラインは、もし検証された IHC 解析が使用されれば、ALK IHC をALKのス クリーニングに使用することができると記述している。

標準化の研究

米国では、crizotinib の使用には米国の FDAで認可された解析方法によるALKテストが必要 と注記している。現在、ALK FISH break-apart assay（Abbott Molecular）が唯一の公認 ALK FISH 解析である。他の国では、それぞれの保険統制機関は特定方法の使用を強制しな いが、検証された解析方法の使用を要求している。これらの国では、ALK遺伝子再構成検出

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肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

表 1。肺癌におけるALKテストに関するさまざまな専門家グループが出版したガイドラインあるいは推奨 著者、 年

機関

Mitsudomi et al., 2011

JLCS

Garrido et al., 2012

SEOM お よび SEAP

Thunnissen et al., 2012b Yi et al., 2012 Marchetti et al., 2013

ヨーロッ パの Europe 専門家

AIOM お よび SIAPECIAP

言及された 方法

診断 アルゴリズム

細胞診検体の 検査

FISH, IHC, IHC によるスクリーニン 適切、FISH およ および グ FISH による確認 び IHC のための RT-PCR を伴う セルプロック構築 を推奨 FISH

患者のための FISHテス 論議されず ト EGFR-陰性腫瘍を使用

免疫組織化学 (IHC)

検体を、認可された商業 検査施設で適切なクロー ンと検出システムが使用 されている場所に送るこ とを推奨 論議されず

FISH, IHC, IHC によるスクリーニン 組織学および細胞 スクリーニングのツール および グ FISH による 診標本はともに使 として考慮される可能 RT-PCR 確認を伴う 用できる可能性 性あり がある FISH お よび IHC

IHC によるスクリーニ ング FISH による確認 を伴う

FISH, IHC, FISH for selection of および patients with stage RT-PCR IIIB and IV NSCLC (凍結組織)

論議されず

実用的で信頼性のある スクリーニングツール

FISH が利用可 スクリーニングに使用の 能。スメアを含む 可能性、決定的結論には データ不十分

Lindeman CAPet al., 2013 IASLCAMP

FISH

FISH による診断 適切。セルブロッ 適切に確認された方法 進行肺腺癌患者（あるい クがスメア調整よ スクリーニングツール は腺癌の成分を有する りも好ましい ALK FISHテスト用の NSCLS)；ステージ I-III 標本選択： もし最適化 の患者の検査 NSCLC が された IHC 結果が陰性 推奨されるが地域の多分 の場合 FISHは必要し、 野専門チーム の決定を仰 ぐべきである

Ettinger NCCN et al., 2013

FISH

FISH が標準; IHC でス 論議されず クリーニングし陽性結果 をFISH で確認； PCR の 評価済み

スクリーニングツールと して使用の可能性； IHC 解析はリンパ腫の大部分 のALK-再構成 NSCLC検 出には不十分

ESMO=European Society for Medical Oncology, SEOM=Spanish Society of Medical Oncology, SEAP=Spanish Society of Pathology,

AIOM=Italian Association of Medical Oncology, SIAPEC-IAP=Italian Society of Anatomic Pathology and Diagnostic CytopathologyInternational Academy of Pathology, NCCN=National Comprehensive Cancer Network, ALCL=anaplastic large cell lymphoma.

に、標準化されている限り、他の解析方法の使用が可能である 。 CAP/IASLC/AMPのガイ ドラインの専門家の一致した意見は、ALKテストの確認は他の分子診断検査と同じガイドラ インそして同様の品質管理／保証方針に従うべきだということにある。検査施設間の標準化 を実行するために、他施設共同研究が世界各国および各地で実施された（表2）。 ヨーロッパ

ETOP Lungscape プロジェクトは肺癌のバイオマーカーに関する研究のために計画された ものである。最初のプロトコールはALK遺伝子再構成をしらべる後向きコホート研究であっ た。この研究は IHC とそれに続いた FISH による確認試験を用いて、ヨーロッパにおける 切除されたステージ I-IIIの肺腺癌のALK陽性率を調査するためのものであった（Blackhall

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第 9 章: ガイドラインおよび標準化の研究

表 2。ALKテスト方法標準化のための他施設共同研究 国

方法 評価済み

参加者

標本の数

研究のタイプ

Europe (ETOP)

IHC および FISH

15 検査施設

1,099 (ALK-陽性 69)

ラウンドロビンテスト; 回顧 解析

カナダ

IHC および FISH

12 のカナダの 病理検査施設

28 (ALK陽性 22)

日本

IHC, FISH, および定量的 RT-PCR

全国的な ３ヶ月にわたる スクリーニング

2,884 (ALK陽性 213)

個々の検査施設のプロトコールを 用いて検査、コンセンサス会議の 後でプロトコール調整を行いさら に繰り返し検査で確認

フランス

IHC, FISH, および RT-PCR

15 のフランス胸 部病理部門

459 (ALK陽性 85)

ドイツ

IHC および FISH

ドイツの 8 つの病 10 (ALK陽性 5) 理機関の専門家

ヨーロッパ (European Society of Pathology)

IHC, FISH, および FISH のデジタル 画像

一次および二次 ラウンドのそれ ぞれに、80 およ び 150検査施設 が参加

予想スクリーニング

中央検査施設で検査方法間の一 致を確認 既知のALK状態のラウンドロビ ンテスト

6 再カット標本 (ALK陽性 既知のALK状態のラウンドロビ 2）,6 細胞株 (ALK陽性 ンテスト 2)および 4 つのデジタル 画像（ALK陽性 2)

2012）。ALK IHC プロトコールは 15 の検査施設においてラウンドロビンテストで確認 された。Novolink detection system（Leica Biosystems）と共に抗体クローン 5A4 が使 用されたが、ある検査施設では Bond-Max autostainer platform（Leica Biosystems） が使用され、他は手動染色を行った。中間解析では、ALK IHC で 腺癌の 1,099標本中 69 が陽性（6.3%）であった スコアは 23 標本（33.3%） が 3+、8 標本（11%）が2+、お よび 38 標本（55%）が 1+ であった。一致した条件となるようALK IHC 陽性/陰性比率 が 1:2 のコホート（n = 207）を作り、FISH で確認を行った。FISH の結果は 60 のALK IHC 陽性腫瘍の 22（37%）および 138 のALK IHC 陰性腫瘍の 137（99%）で一致が認 められた（図 1）。この研究では IHC 陽性の定義と、どのレベルの IHC 陽性がALK遺伝子 再構成を予測するかを明確にすることの重要性を示している。これらの解析条件を 5A4 抗 体に適用すると、1+ または 2+ のスコアをもつ標本はALK再構成を示す確率は低く、IHC 検査陰性の標本は非常に高い確率でALK再構成を示さない。 カナダ

Canadian Anaplastic Lymphoma Kinase（CALK）の研究は、FISH で確認された腫瘍（22 のALK-陽性腫瘍 と６つのALK-陰性腫瘍）を用いて、カナダ国内の他施設研究としてALK IHC と FISHテストの最適化と標準化を行った（Tsao 2013）。まず、約 2,000 の肺腺癌か らなる組織マイクロアレイについて IHC と FISH の両方でスクリーニングしALK陽性検体を 抽出した。それをもとにした匿名化切片を参加検査施設に送付し、ALK FISH break-apart assay（Abbott Molecular）を用いた FISH 解析および IHC と FISHテストが施行された。 抗体としてはALK1（Dako; one center）, clone 5A4（Novocastra; 12 centers）, およ

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肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

Adenocarcinoma patients with available ALK IHC data N=1099 100

ALK IHC– N=1030

ALK IHC 1:2 Matched Cohort N=207 Matching factors in order of importance: stage, gender/smoking status, center/ year of surgery/age ALK IHC+ N=69* 38 FISH–

22 FISH+

ALK IHC– N=138 1 FISH+

137 FISH–

99.3%

93.5%

87.5%

9.5% 90.5%

80

Percent

ALK IHC+ N=69

60 40 20 0

6.5% IHC result 0+ IHC result 1+

FISH ALK

12.5% IHC result 2+

FISH Negative

IHC result 3+

FISH Positive

*9, FISH not done

図 1。ETOP Lungscape プロジェクトの結果。1,099 の肺腺癌のうち、69 は IHC でALK陽性と同定された。IHC と FISH 間の一致については対応するコホートで解析された（右）。

び clone D5F3（Cell Signaling Technology; one center）が使用され、またその施設に既 存の自動染色装置（Dako、Leica Biosystems、or Ventana Medical Systems、Inc.）が 用いられた。5A4 抗体を評価した 12 施設からIHC のスコアと 11 施設から FISH スコア が集められ解析された。IHC の施設間のクラス内相関係数（ICC）は 0.84 であった。IHC 結果の初期解析および参加病理医のスライド評価の会合の後、個々の施設でプロトコール の調整が行われた。第二ラウンドの研究は同じ検体セットを用いて行われ、ICC はかなり 上昇した（0.94）。FISH の ICC は 0.68 であり、医療センター全体の FISH 結果の感受 性および特異性はそれぞれ、88～100% および 100% であった。この結果から、多くの

施設で、ALKテストのための IHC および FISHを標準化することは可能であると結論付け られた。異常および臨床解釈が不明の非定型 FISH 像を示した不一致例を除いて、IHC は FISH によってALK陽性のすべての腫瘍を検出した。しかし、本結果は、また FISH で偽 陰性をもたらす場合があることも示唆している。 日本

Crizotinib は2012年3月30日に日本の医薬品医療機器総合機構によって承認されたが、国 民健康保険の薬価基準に収載されるまで薬剤は実臨床に使用できなかった。薬価が収載さ れるまでの 3 か月間に、倫理的な理由から日本 Pfizer は、 腫瘍がALK陽性であると判定さ れたは場合には登録した医療機関に crizotinib を提供するという償還前プログラムを施行し た。このプログラムでは、FFPE 検体は FISH（Vysis LSIALKBreak Apart FISH Probe Kit, Abbott Molecular）と IHC（5A4 抗体のクローンを EnVision FLEX+ system [Dako] お よび iAEP detection kit [Nichirei Biosystems]と共に使用）を用いて同時に検査された。 また、胸水のような細胞診検体に対してはRT-PCRが用いられた。合計 5,514 の検査が行

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第 9 章: ガイドラインおよび標準化の研究

われ、その内訳は 2,630 が FISH法で、2,631 は IHC法、および 253 は RT-PCR法であ った。検査成功率はそれぞれ 93%、96%、および 94%、であった。FISH と IHC 間の 一致は 98% であったが、ALK IHC の感受性は 86% に留まった。結果は 213 の標本で FISH および IHC の両方で陽性であったが、36 標本は FISH 陽性でIHC 陰性、12 の標本 は FISH 陰性で IHC 陽性であった。2,076 の標本で FISH および IHC の両方で陰性であ った。これらの結果に基づいて、日本肺癌学会は2011年にALKテストのガイダンスに次の 様な注記を加えた。 「たとえ、患者が IHC および FISH 両方の結果に基づいてALK阻害剤療法に適切な候補者 であっても、2 つの検査結果に矛盾が存在する可能性があるため、治療実施にあたっては 効果とリスクのプロフィールについて注意深い考慮が必要とされる」（Mitsudomi 2011）。 フランス

2007年に開始した French National Cancer Institute（INCa）プログラムは、28 施設で の悪性腫瘍を対象とした遺伝子解析を基にした、肺癌、結腸直腸癌、およびメラノーマの 新規バイオマーカーの検出を目的としたものである。このプログラムの一部として、500 のFFPE 外科標本シリーズを用いた 5A4 および D5F3 抗体（それぞれ Novocastra, およ び Cell Signaling Technology の製品）による IHC と FISH そして定量的 RT-PCR を比 較するALK検証研究が、フランスの多施設研究として行なわれた（Lantuéjoul 2013）。 これまで検査された 459 の標本の内、340 は FISH と IHC の両方でALK陰性であり、85 はFISH と IHC の両方でALK陽性であった。不一致の検査結果のうち、15 は FISH 陰性で IHC 陽性（しかし染色スコアは低い）、12 は FISH 陽性で IHC 陰性であった。7 サンプ ルは FISH による解釈が行われず、それらのうち 5 つは IHC でALK陽性を示した。全体的 にみて、 FISH と比較した IHC の感受性は 87% であり、特異性は 96% であった。定量 的 RT-PCR による検査では、ALK陽性標本のほぼ 50% にバリアント 1、30% にバリアン ト 3a/b、5% 以下にバリアント 2 または 7 が検出された。 20% は陰性または解釈不能 であった。この研究から、5A4 を用いた IHC はルーチンのALK 異常を診断するのに信頼で き、容易な技術であると結論付けられた。しかし FISH および定量的 RT-PCR は未だに解 析前の条件および、 技術的専門知識に左右されるとも指摘している。いずれの方法も完璧で はなく、臨床像としてALK陽性が疑われる場合、検査結果が陰性であっても、別な方法で検 査を繰り返し、ALK陽性腫瘍を有する患者を見逃さないようにすべきである。 ドイツ

The German Society of Pathology（Deutsche Gesellschaft für Pathologie; DGP）およ び the Professional Association of German Pathologists（Berufsverband Deutscher Pathologie; BDP）はそれぞれの医療機関の技術を認定するためにALK融合検出のラウンド ロビン検査を行なっている。検査前段階に付いての研究では、肺癌症例から採取された 10 標本が FISH および IHC 検査を用いて8つの病理検査施設の専門家によってALK変異状況が 評価された（V Laffert 2013）。確認された肺癌検体を組織のマイクロアレイ切片として配 付し、参加医療機関は異なった FISH プローブ（Abbott Molecular あるいは Zytovision GmbH の製品）、抗体クローン（ALK1、5A4 および D5F3）、希釈（1:20 から 1:200

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肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

）、および検出システム（手動あるいは Ventana Medical Systems, Leica Biosystems, あるいは Dako の自動染色装置を使用）を用いて検討した。ALK陰性腫瘍はいずれの方法 （FISH およびIHC）でも正しく診断されたが、ALK陽性腫瘍では異なる結果が、特に IHC を用いた検査で認められた。研究はALK融合遺伝子を検出するには、標準化されたプロトコ ールを確立することが重要であることを明らかにした。 ヨーロッパ

分子病理医のための外部品質評価プログラムに関するガイドラインが近年報告された（van Krieken 2013）。The European Society of Pathology は、バイオマーカー検査の精度と 熟練度を保証するために、NSCLC のバイオマーカー変異の検査についてヨーロッパの外部 品質評価プログラムを実施している。プログラムはALKテストについて 2 つの外部品質評価 が、80 および 150 の検査施設が参加して実施された。FFPE の組織コアとして採取された 組織のマイクロアレイのスライドおよび FISH のデジタル画像が提供された。両方のラウン ドからのデータは 2013年の年末に公開予定となっている。 VentanaALK IHC キットの国際的な再現性の研究

D5F3 抗体を用いた VentanaALK IHC（Ventana Medical Systems、Inc.）の再現性お よび、IHCと FISH 間の相関性を評価するために、7 人の国際評価者が 100例について検 討した。ALK IHC と FISH の相関をみると、 FISH と比較した感受性は 90%、特異性は 93%、一致率は 95% であった。IHC の解釈に関しては、7 人すべての評価者が一致した 症例は 95% 、7 人の内 6 人の IHC 解釈が一致した症例は97% であった（Hirsch 2013） 。 Ventana IHC のキットを用いて、優れた観察者内および観察者間の一致とともに、ALK FISHとの優れた相関性があると結論づけている 。

まとめ

ブレークアパートALK FISH プローブを使用したALK遺伝子再構成の検査は、ALK TKI 療

法のための標準的な診断規準として一般に認められているが、ALK陽性肺癌検出のためのス クリーニングのアルゴリズムは未だに開発中である。世界全体のグループが世界的あるいは 地域的なガイドラインを確立するための 研究を行っている。 これらの多くは、スクリーニ ングツールとしての IHC の感受性そして特異性の評価とともに、 IHC および FISH 両方に よる検査の標準化に焦点をおいた研究となっている。これらの研究結果が報告され、数年以 内にALKスクリーニングのアルゴリズムに関するグローバルなコンセンサスが得られるもの と期待される。

第 10 章 概要および展望

執筆担当：Fred R. Hirsch, Yasushi Yatabe, および Ming Sound Tsao

ALK遺伝子再構成を有する進行 NSCLC 患者の治療成績は引き続いて期待がもたれるが、ALK 再構成の診断としては課題を抱えている。ALK遺伝子再構成の遺伝子検査が、進行 NSCLC の患者、特に腺癌または腺癌成分を有する腫瘍のための最適療法を選択する上で非常に重 要であることはすでに確立している。しかし、いくつかの疑問には未だに明確な回答が得 られていない。 1. どの患者のためにALK遺伝子再構成スクリーニングを行うべきか？ 2. 費用対効果が最も高いスクリーニング法は何か？ 3. ALK阻害剤治療に適した患者を選び、この治療により恩恵を受ける可能性のある患者を 選択できる最適なスクリーニング診断法は何か？ 4. 現在の臨床的根拠に基づく最適な治療方法は何か？ 最後の質問はこのアトラスの範疇を超えるが、最初の 3 つの問題については既に言及した。

どの患者のためにALK遺伝子再構成スクリーニングを行うべきか？

ALK遺伝子再構成のスクリーニングは腺癌または腺癌成分を有する NSCLC の患者のすべ てに施行すべきであるというのが少なくともコンセンサスとなっている。サンプルの大き さや学術的興味もよるが、相対的に年齢の低い患者や、EGFR および KRAS 突然変異検査 結果が陰性の場合は、他の組織学的特徴を有する進行 NSCLCであっても、患者のスクリ ーニングが考慮されるべきである 。時折、ALK遺伝子再構成が非腺癌組織型に認められる が、これはまれである。診断標本が小さく、腺癌成分の可能性が否定できない場合、ALK テストが推奨される。 ALK阻害剤による治療は現在早期のNSCLC（I-IIIA）を有する患者には推奨されていな いが、腫瘍の再発あるいは進行に備えて、外科標本を用いたALKテストを含む遺伝子テス トが推奨されている。

最も費用効果が大きいスクリーニング法は何か？

米国では、crizotinib 治療には、米国の FDA によって承認されたALK遺伝子再構成解析を 用いたALK診断が必要とされている。現在、唯一の診断法、ALK FISH break-apart assay （Abbott Molecular）、 が認可を得ている。しかし、ALKスクリーニングには特定の検査

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肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

方法は指定されていない。多くの研究で、ALK FISHと比較したALK IHC の高い診断特異 性および感受性が確認されており、すでに多くのガイドラインは NSCLC を有する多くの 人に対してALKスクリーニングとしてALK IHC を使用した後、治療承認を得るためにALK FISH で確認することを推奨している。RT-PCR によるALKのスクリーニングは現在推奨さ れていない。

ALK阻害剤による治療のための最適なスクリーニング-診断方法は何か？

ALK IHC によるスクリーニングは多くの国で採用されているが、どの検査結果がALK FISH で確認されるべきかは未だに明白でない。いくつかの指針ではALK IHC で陽性の腫瘍の全 てがALK FISH で検査されるべきであると推奨し、一方他のガイドラインは IHC の結果が 1+ および 2+ の場合のみに,確認のために FISH を使用することを勧めている。最適のス クリーニング診断方法を決定するためには、ALK阻害剤治療への反応性や治療結果との関 連を示す詳細なデータが必要である。そのような詳しい関連性についての解析結果が得ら れるまでは、すべての IHC 陽性腫瘍をALK FISH で確認することが推奨される。しかしな がら、ALK FISH で陰性であるが IHC が陽性で、crizotinib 治療で良好な効果を示す患者 の報告も増えている。このような症例では、FISH陰性結果が、本当に陰性であるか、ボー ダーラインあるいは非定型 FISH パターンのために偽陰性を示している可能性が否定でき ない。これらの症例についての詳細な解析が進行中であり、その結果がこの問題を解く助 けとなるであろう。

将来の展望は何か？

治療上の視点からは、現在、複数の第二世代ALK阻害剤がALK/EGFR の同時阻害剤ととも に臨床開発中であり、有望な結果が得られている。将来的な研究こそが、どの診断法が最も よい臨床結果と関連性があるかを証明する事ができる。ALK FISH 解析は今日の crizotinib による治療の基準となっており、また次世代ALK阻害剤の臨床試験で使用されている。しか し、IHC および PCR のような他の解析と治療の関連は、研究中であり、スクリーニングー 診断法が将来的に変わる可能性がある。また、新しいマルチプレックス解析、特に NGS 技 術の導入については、NSCLC の患者に対するALK標的療法のスクリーニングおよび治療認 可の両方に対してその有用性を確認する必要がある。

まとめ

このアトラスで解説されたごとく、ALK遺伝子再構成の診断法はまだ開発途中である。2、3 年以内に診断スキーマは変わり、新しい標的薬剤の出現によってその移行が促される可能性 がある。しかし、我々は少数のこの遺伝子異常を有する NSCLC 患者 を適切に治療できる ことを確信している。この分野のすべての関係者はALK標的治療の恩恵を受ける可能性のあ るすべての患者が、最適な治療を受けられるようにしなければならない。

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米国/韓国

米国/スイス FISH/RT-PCR

日本

日本

米国

Koivunen et al., 2008

Perner et al., 2008

Shinmura et al., 2008

Takeuchi et al., 2008

Boland et al., 2009

IHC/FISH

米国

米国

日本

中国(HK)

日本

日本

スペイン

中国

日本

Rodig et al., 2009

Shaw et al., 2009

Takeuchi et al., 2009

Wong et al., 2009

Jokoji et al., 2010

Sakairi et al., 2010

Salido et al., 2010

Sun Y et al., 2010

Takahashi et al., 2010

IHC/FISH

韓国

米国

Paik et al., 2011

Yi et al., 2011

FISH/IHC

RACE/ RT-PCR

Zhang X et al., 2010 中国

RT-PCR/Direct Seq

RT-PCR

FISH/IHC

IHC/FISH & RT-PCR

IHC

RT-PCR

IHC/RT-PCR & FISH

FISH

RT-PCR/FISH/IHC

イタリア／ Martelli et al., 2009 スペイン

IHC/FISH/RTPCR

RT-PCR/FISH/ Gen Seq

RT-PCR/Gen Seq

RT-PCR

RT-PCR

日本

RT-PCR

中国

検査方法

Soda et al., 2007

国

Rikova et al., 2007

研究

101

735

103

313

52

107

109

254

266

130

141

358

120

335

340

77

603

305

75

103

NSCLC* 数

50

-

208

20

-

ADC 数

63

185

130

62

12 (11.7%)

10 (9.9%) 101

28 (3.8%) 395

211

52

69

82

254

5 (1.6%)

3 (5.8%)

3 (2.8%)

7 (6.4%)

8 (3.1%)

20 (5.6%)

3 (4.8%)

5 (2.7%)

11 (4.3%)

2 (4.0%)

-

8 (3.8%)

2 (10.0%)

-

ALK+ 数 (%)

10 (9.9%)

27(6.8%)

10 (16.1%)

5 (2.4%)

3 (5.8%)

3 (4.3%)

7 (8.5%)

8 (3.1%)

11 (5.3%)

4 (3.1%)

130 18 (12.8%)

13 (4.9%) 209

4 (3.1%)

19 (13.5%)

20 (5.6%) 358

9 (7.5%)

6 (1.8%)

11 (3.2%) 253

2 (2.6%)

16 (2.7%)

8 (2.6%)

5 (6.7%)

4 (4%)

ALK+ 数 (%)

SCC 数

-

-

0

0

-

0

1 (9.1%)

0

292

29

75

0

30

18

0

34

0

2

0

48

0

0

2 (6.9%)

0

0

0

0

0

0

0

0

0

4 (8.3%)

150 1 (0.7%)

71

20

-

88

11

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

4

0

2

0

7

3

-

9

2

-

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1 (25%)

0

2 (100%)

0

0

0

-

0

0

-

0

48

12

27

0

8

9

0

23

0

5

0

7

0

9

4

-

0

42

0

1 (2.1%)

0

0

0

0

0

0

2 (8.7%)

0

0

0

0

0

0

0

-

0

0

-

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

24

0

-

0

0

-

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

-

0

0

-

ALK+ ADSC ALK+ NSCLC、 ALK+ NECa ALK+ 数 (%) 数 数 (%) 他数 数 (%) 数 数 (%)

報告された肺癌におけるALK遺伝子再構成検査に関する研究の概要

付記 1

非喫煙者腺癌

非喫煙者

非／軽度 喫煙者、アジ ア人、女性

SCLC LCNEC などの神経内 分泌癌を含む

患者の 選択

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

74

米国

韓国

Dai et al., 2012

Jin et al., 2012

中国

スペイン

米国

米国

中国(HK)

中国

中国

Li Y et al., 2013

Martinez et al., 2013

Minca et al., 2013

Sholl et al., 2013

To et al., 2013

Zhang Y-G et al., 2013

Zhou et al., 2013

ARMS RT-PCR

RT-PCR/IHC/FISH

IHC/FISH/RT-PCR

IHC/FISH

IHC/FISH

FISH/IHC

12665

488

469

373

186

249

99

208

1683

349

300

116

113

102

258

811

441

167

1387

239 -

-

79

95

-

662 (5.2%)

6775

28 (5.7%) 349

20 (4.2%) 341

22 (5.9%) 373

12 (6.5%) 186

32(12.8%)

7 (7.1%)

7 (3.4%)

75 (4.4%)

15 (4.3%) 349

444 (6.6%)

25 (7.2%)

19 (2.6%)

22 (5.9%)

12 (6.5%)

-

5 (6.3%)

6 (6.3%)

-

15 (4.3%)

0

0

-

0

0

-

0

0

0

1 (5.6%)

1 (7.1%)

0

1 (1.9%)

0

1 (0.2%)

-

4 (4.1%)

18 1411 (1.3%)

101 2 (2.0%)

112

0

-

7

96

-

0

0

18

14

34 (11.3%) 300 34 (11.3%)

10 (10.5%)

5 (6.2%)

0

52

0

46

-

97

0

116

95

73

17 (9.3%)

30 (4.2%)

29 (6.6%)

9 (7.4%)

-

10 (7.7%)

39 (34%)

39 (34%)

11 (9.7%)

8(7.8%)

25 (9.7%) 182

31 (3.8%) 713

29 (6.6%) 441

10 (6.0%) 121

49 (3.7%)

15 (6.3%) 130

78

18

4

0

-

0

7

-

0

0

0

0

14

0

8

0

0

-

-

7 (9.0%)

1(5.6%)

0

0

-

376

20

12

0

-

13

10 0

-

-

0

0

0

0

1

76

38

0

0

-

12

1 (14.3%)

0

0

0

0

2 (14.3%)

0

0

0

0

-

-

17 (4.5%)

0

1 (8.3%)

0

-

2 (15.4%)

0

-

0

0

0

0

28

0

0

0

-

0

0

-

0

0

0

0

0

4

8 (10.5%) 0

0

0

0

-

0

0

0

0

-

1 (8.3%)

0

0

0

0

-

0

0

-

0

0

0

0

0

0

0

0

0

-

0

女性非喫煙者

非喫煙者

EGFR 野生型 胸水

女性、非～軽 度喫煙者腺癌

EGFR 野生型 または以前の EGFR TKI 治 療が無効

cDNA ends, および ARMS amplification-refractory mutation system.

キナーゼ阻害剤, RT-PCR = 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応, FISH=蛍光インシチューハイブリダイゼーション, Gen seq=遺伝子シークエンシング, IHC = 免疫組織化学, RACE=rapid amplification of

*神経内分泌癌を除く (NE Ca）; NSCLC=非小細胞肺癌, ADC=腺癌, SCC=扁平上皮, ADSC=腺扁平上皮癌, SCLC=小細胞肺癌 LCNEC=神経内分泌大細胞癌, EGFR=上皮成長因子受容体, TKIs=チロシン

Total

FISH

U米国

Gainor et al., 2013

RT-PCR/IHC

IHC/FISH

RACE-PCR

米国

Yang et al., 2012

Zhang Y et al., 2012 中国

RT-PCR/FISH

台湾

RT-PCR

Wu et al., 2012

中国

Shaozhang et al., 2012

IHC/FISH

FISH/IHC

韓国

Park et al., 2012

RT-PCR/IHC/FISH

IHC/FISH

RT-PCR

FISH

RACE-PCR

Wang Z et al., 2012 中国

日本

Murakami et al., 2012

McLeer-Florin et al., フランス 2012

中国

An et al., 2012

付記 1

75

76

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

付記 2

CAP/IASLC/AMPによる EGFRおよびALK阻害剤治療に対する患者選択のための遺 伝子テストガイドライン 推奨概要

Section I .肺癌遺伝子検査をいつ行うべきか？

論点1 EGFR、ALK変異検査をどのような患者に行うべきか？

1.1.a推奨： EGFR-TKI治療を行うための患者選択にはEGFR変異検査を用いるべきである。癌 患者は臨床的因子で遺伝子検査を省くべきではない。

1.1.b推奨： ALK-TKI治療を行うための患者選択にはALKテストを用いるべきである。腺癌患者 は臨床的因子で遺伝子検査を省くべきではない。

1.2推奨： 切除検体では、組織学的な悪性度によらず、腺癌もしくは腺癌の成分を含む混合型 肺癌に対してEGFR･ALKテストが行われるべきである。完全に切除され、腺癌の成 分をまったく含まない場合（すべて扁平上皮癌、小細胞癌、免疫染色で腺癌のマー カーが完全に陰性の大細胞癌の成分のみ）はEGFR･ALKテストは推奨されない。

1.3推奨： 腺癌の可能性を完全に否定できない生検や細胞診などの部分的な検体の場合は、扁 平上皮癌や小細胞癌の診断であっても、EGFR･ALKテストは施行してもよいが、そ の際には臨床情報（例えば、若めの年齢、非喫煙者）が役立つことがある。

1.4推奨： 初回治療でEGFR･ALK変異の有無を決定する際に、原発巣でも転移巣でも同等に遺 伝子検査に適している。 1.5専門家統一見解： 多発性で明らかに別々の肺腺癌に対しては、それぞれの腫瘍について検討してもよ いが、1つの腫瘤の異なった領域を検討する必要はない。

論点2いつ患者検体をEGFR･ALKテストすべきか？

2.1a推奨： 患者が進行癌（第7版TNMで、stage IV）で発症し、治療が適切と考えられる場合 で診断された時や、低いステージで以前にテストしていない腫瘍でも再発や病状の 進行をきたした際に は、EGFR変異検査をオーダーすべきである。

2.1a推奨： 患者が進行癌（第7版TNMで、stage IV）で発症し、治療が適切と考えられる場 合で診断された時や、低いステージで以前にテストしていない腫瘍でも再発や病状 の進行をきたした際には、ALK融合遺伝子検査をオーダーすべきである。 2.2a専門家統一見解: Stage I, II, IIIで発症した患者が診断された際にはEGFR変異検査が勧められる が、 その決定は、それぞれの施設でオンコロジーチームで協議して決めるべきで ある。 2.2b専門家統一見解: Stage I, II, IIIで発症した患者が診断された際にはALK融合遺伝子検査が勧められ るが、その決定は、それぞれの施設でオンコロジーチームで協議して決めるべきで ある。

2.3推奨： 組織はEGFR･ALKテストに優先的に持ちられるべきである。

論点3：どの程度でテスト結果が得られるべきか？

3.1専門家統一見解： EGFR･ALKの結果は、テストを行う検査部が標本を受け取ってから2週間（10労働 日数）以内に結果が閲覧できるようになるべきである。 3.2専門家統一見解： 返却時間が平均で2週間を超える検査部は、臨床的な緊急性に応じて、院内でもし くは提携検査所で、より迅速なテストができるようにすべきである。 3.3専門家統一見解： 検査部は、依頼を受けてから3実労働日以内に外部の遺伝子検査所に、院内の場合 では24時間以内に最終病理診断がなされた検体が届くプロセスを構築すべきで ある。

77

付記 2

Section II. どのようにEGFRテストを行うべきか？ 論点4 EGFRテストをいかに進めていくべきか？

4.1専門家統一見解： 病理医は、ホルマリン固定パラフィン包埋標本、新鮮凍結標本もしくはアルコール 固定標本を、PCRベースのEGFR変異テストに用いるべきである。他の固定（酸性 もしくは重金属製の固定液もしくは脱灰標本）はEGFR変異テスト用には避けるべ きである。 4.2専門家統一見解： 細胞診検体はEGFRおよびALKテストに適している。セルブロック標本がスメア標 本よりも望ましい。

論点5 EGFR変異検査の検体必要条件とは？

5.1専門家統一見解： 病理医は、EGFRテストのための検体の適正を、癌細胞の割合、DNAの質および量 にもとづいて決定すべきである。 5.2専門家統一見解： それぞれの検査ラボでは、変位検出の際の最低含有量および細胞数を検証実験の際 に決定する必要がある。 5.3専門家統一見解： 病理医は、それぞれの検体における腫瘍成分を取り出せるようにすべきで、必要に 応じて病理医自ら、もしくはよく指導された技師によって腫瘍に富んだ部分をマイ クロダイセクトすべきである。

論点6 どのようにEGFRテストは行われるべきか？

6.1推奨 ： 検査ラボは、十分な性能特性を持ったと確認されたEGFRテストを用いることがで きる。 6.2専門家統一見解： 検査施設は、少なくとも50%の腫瘍細胞を有する検体で変異を検出可能な方法を 用いるべきであり、10%程度の腫瘍細胞でも検出可能なより感度の高い方法（も しくはそれが可能なレフェレンスラボを持つこと）を用いることが推奨される。 6.3専門家統一見解： 臨床的なEGFRテストは、少なくともEGFR変異肺腺癌で1%以上の頻度と報告され ているすべての変異を検出可能である必要がある。

6.5推奨： 通常のEGFRの免疫染色はEGFR阻害剤治療の患者選択に用いるべきではない。

6.6推奨： EGFRコピー数解析（FISHもしくはCISHいずれも）は、EGFR阻害剤治療の患者選 択に用いるべきではない。

論点7 EGFR阻害剤の患者選択におけるKRAS遺伝子変異の役割とは？

7.1推奨： KRAS変異テストは、EGFR阻害剤を決定づける唯一の因子であると推奨され ない。 論点8 二次性もしくは獲得耐性の場合に、どんな追加的な検査を考慮するのが重要か？

8.1推奨： EGFR阻害剤に対する獲得耐性を有する患者からの検体でテストを行う場 合、5%足らずの細胞で二次性EGFRT790M変異が検出できる必要がある。

78

肺癌におけるALKテストIASLC アトラス

Section III: どのようにALKテストを行うべきか？ 論点9 どのような方法をALKテストでは用いるべきか？

9.1推奨： 検査施設は、ALK阻害剤治療の患者選択のためには、2色でラベルされた分離プ ローブ式のALK FISHアッセイを用いるべきである。注意深く検証された場合 には、免疫染色もALK FISHのスクリーニング方法として考慮してもよいと思 われる。

9.2推奨： ALK阻害剤の患者選択に、FISHに変わるものとしてRT-PCRは推奨されない。 9.3専門家コンセンサス： 病理医は、腫瘍構築、細胞像、標本品質を評価することで、ALK FISHテスト のための標本選択に関与すべきである。 9.4専門家コンセンサス： 病理医は、直接解析を行ったり、固形がんのFISH解析の特別トレーニングを受 けた遺伝子検査士もしくは技術者の評価をレビューすることで、ALK FISHス ライドの解釈に参加すべきである。 9.5専門家コンセンサス： ALK阻害剤に対する獲得耐性に関連した二次性遺伝子変異に対する検査は、臨 床的なマネージメントに現在は必要ではない。

Section IV：他の遺伝子変異も肺腺癌でルーチンにテストすべきであるか？ 論点10 他の分子マーカーは肺癌でテストするのに適しているか？

10.1a推奨： 肺腺癌においては、EGFRテストは他の分子マーカーよりも優先的に扱われる べきである。

10.1b提言： EGFRテストの次に、ALKテストは肺腺癌では優先的に扱われねばならないが、 現状では十分なエビデンスは発表されていない。

Section V: 肺腺癌の遺伝子テストはいかに実施され、運用されるべきか？ 論点11 すべての腺癌が、EGFRとALKの両方のテストをされるべきであるか？

11.1専門家統一見解: 検査施設は、全体の結果レポート返却時間要件を満たしつつ、腺癌の遺伝子テ ストの効率を最大化する検査アルゴリズムを実施すると思われる。

論点12 EGFRとALKの結果はいかに報告されるべきか？

12.1専門家統一見解： EGFR変異テストとALK FISHの報告書には、腫瘍内科医や非専門家病理医にも 容易に理解できる結果と解釈の項目が含まれている必要がある。

論点13 EGFRとALK検出法はいかに有効性が確認されるべきか？

13.1専門家統一見解: EGFRとALKテストの有効性の実証については、他の遺伝子診断やFISHテスト と同様のガイドラインを用いるべきである。

論点14 いかにして精度管理を行うべきであるか？

14.1専門家統一見解: 検査施設は、肺癌のEGFR、ALKテストも他の臨床検査で用いられる精度管理ポ リシーに従うべきである。特に、治療のためのEGFR,ALKテストを行う検査所 は、技能調査に参加すべきである。 Abbreviations: CISH, chromogenic in situ hybridization; EGFR, epidermal growth factor receptor; FISH, fluorescence in situ hybridization; PCR, polymerase chain reaction; RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction; TKI, tyrosine kinase inhibitor; TNM, tumor node metastasis. 次の論文から許可をえて転載: Lindeman NI, Cagle PT, Beasley MB, et al. Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors: Guideline from the College of American Pathologists (CAP), International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC), Association for Molecular Pathology (AMP). J Thorac Oncol 2013;8:823-859.

IASLC はこのALKアトラスのプロジェクトに対する Pfizer Oncology が提供した寛大な資金とサポートに深く感謝します

www.iaslc.org