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Rapporto No.: 2010/07 SAM Versione: Italiano Pagina 38 di 42 Data di stampa: 19/02/2010
Rapporto di Sperimentazione SAM2010/07.A5
IMPIANTO OSSEO E SOTTO-CUTANEO
RICERCATORE PRINCIPALE: P. CONSONNI
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PROCEDURA SPERIMENTALE 1. SISTEMA DI SAGGIO 1.1 Caratterizzazione Specie: Conigli albini Razza: New Zealand N°: 2 Sesso: maschi Gamma peso: 3150-3180 g all'inizio del saggio Fornitore: Allevamento Conelli - Arona (NO) 1.2 Alloggiamento Ogni coniglio è stato sistemato individualmente in gabbia NORYL (polifenilenossido) delle dimensioni (cm) 48.2 x 63 x 37 h (area cm2 3037). I locali di stabulazione sono illuminati con lampade fluorescenti e mantenuti con cicli di 12 ore di luce e 12 ore di buio. La temperatura e l’umidità, regolate dall’impianto di condizionamento, sono registrate in continuo. Le registrazioni sono conservate negli archivi Biolab S.p.A. 1.3 Pulizia e disinfezione Le gabbie e il locale di stabulazione sono stati puliti prima dell'alloggiamento degli animali e disinfettati periodicamente. Le lettiere sono state cambiate a giorni alterni. 1.4 Alimentazione Gli animali sono stati alimentati con dieta pellettizzata standard della ditta Harlan Italy. 1.5 Abbeverazione Gli animali sono stati abbeverati con acqua purificata disponibile ad libitum e distribuita mediante sistema di abbeverazione automatico. 1.6 Identificazione degli animali Gli animali selezionati per lo studio sono stati identificati da un contrassegno numerato di plastica applicato all'orecchio destro. Le gabbie sono state identificate con un cartellino.
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1.7 Quarantena Gli animali acquistati, prima di essere utilizzati per questo studio, sono stati tenuti in quarantena per una settimana. Durante il periodo di quarantena essi sono stati osservati giornalmente. Al termine del periodo di quarantena essi hanno subito un accurato esame per verificare la loro idoneità allo studio. 1.8 Selezione degli animali Gli animali utilizzati nello studio sono stati selezionati a caso tra quelli idonei disponibili al momento dello studio. 2. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI SAGGIO La sostanza in esame è stata utilizzata tal quale. 3. DISEGNO SPERIMENTALE Sono stati utilizzati 2 conigli albini maschi. 4. TRATTAMENTO 4.1 Preparazione I conigli sono stati sottoposti ad anestesia generale; si è forato in corrispondenza del femore condilo-laterale in ogni coniglio e si è perforato nelle ossa. La larghezza e la profondità del buco sono state entrambi di 2 mm. Dopo il lavaggio della cavità ossea con normale soluzione salina per rimuovere i detriti, i difetti di femori bilaterali erano pieni della polvere della sostanza in esame fino al livello pre-operatorio macroscopicamente come ben possibile, e la fascia e pelle sono stati poi chiusi. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo la linea guida “Guideline for Animal Experimentation’’ della OLYMPUS CORPRATION. 4.2 Applicazione 0.5 mg del campione di saggio è stato applicato per riempire il buco di ciascun coniglio, quindi l’intero tronco dell’animale è stato protetto da una fasciatura elastica semi-occlusiva. 5. OSSERVAZIONI Beta-TCP è stata riconosciuta come una struttura senza macchia dopo decalcificazione. Il giorno 4, erano evidenziabili grumi di sangue e un numero considerevole di fibroblasti cellulari tra il Beta TCP senza perle di nuova costituzione ossea. Dal giorno 7, la formazione delle ossa Biolab S.p.A. Società per azioni con Socio unico sottoposta a direzione e coordinamento della società Eurofìns Scientific Italia SrI.
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si è verificata nella regione periferica di Beta TCP. Tuttavia, ci sono stati ancora globuli rossi e dei fibroblasti, come le cellule nella zona centrale del Beta-TCP impiantato. Il giorno 14, la formazione ossea è stata osservata nella regione centrale del Beta-TCP. I vasi sanguigni sono stati anche identificati tra i grani. Il giorno 28, alcune zone della superficie impiantata sono state sostituite con l'osso normale. Il perimetro complessivo di nuovo osso aderito a Beta-TCP il giorno 28 è stata significativamente più lunga oltre che il giorno 7. Il giorno 56, la maggior parte delle superfici di Beta-TCP è stato coperto con tessuto osseo formatosi di recente, e l'area di Beta-TCP è stata significativamente inferiore a quelle nei giorni 4, 7 e 14. La immunoistochimica della proteina ha mostrato la presenza di ED1-cellule positive circa il Beta-TCP a tutte le fasi. Al 4 ° giorno, la maggior parte delle cellule positive ED1 sono state cellule mononucleate in tutto il Beta-TCP. Anche se ci sono state alcune cellule multinucleate positive a ED1 in tutto il Beta-TCP, il numero di queste cellule era molto inferiore a quello delle cellule mononucleate positive a ED1. Dopo il giorno 7, cellule positive a ED1 multinucleate sono diventate dominanti in Beta-TCP e cellule giganti multinucleate sono state rilevate il giorno 14. Impianto in osso con BETA FOSFATO TRI-CALCICO a 30 giorni L’analisi microradiologica delle sezioni ha mostrato che già dopo 30 giorni d’impianto, BETA FOSFATO TRI-CALCICO tipo polvere ha stimolato la comparsa di isole ossee neo-formate, che si sono accresciute, a partire dalle linee osteo-tomiche, tentando di colmare il difetto. Tali isole non si notavano nel difetto lasciato vuoto per controllo. L’analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM) condotta sulle sezioni lucidate e carbonate ha evidenziato un certo grado di rimaneggiamento osseo già a 30 giorni d’impianto. Impianto in osso con BETA FOSFATO TRI-CALCICO a 60 giorni All’analisi micro-radiologica delle sezioni, dopo 60 giorni d’impianto, gran parte del difetto è stata sostituita da osso neo-formato; l’osso corticale, infatti, è quasi completamente ricostruito. All’analisi SEM condotta sulle sezioni di diafisi di coniglio dopo 60 giorni d’impianto, è evidente la crescita di osso nuovo, a partire dalla linea osteotomica che procede verso il centro del difetto, tentando di chiuderlo. L’osso neo-formato ha struttura corticale e ha un ottimo grado di mineralizzazione, avendo lo stesso livello di grigio dell’osso esistente.
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RISULTATI Da un punto di vista istologico si assiste alla comparsa di avvenimenti di rigenerazione ossea con ritmi e architettura variabili. A 8 giorni si assiste ad una buona integrazione dei granuli di Beta-TCP tra trabecole di osso neoformato con chiari aspetti di neo-mineralizzazione e sono presenti osteociti. A 18 giorni l’istologia evidenzia una integrazione del Beta-TCP con l’osso trasecolare neoformato, un riassorbimento dei granuli di Beta-TCP e la loro sostituzione con osso mineralizzato, sono presenti osteociti. In conclusione la istologia ha evidenziato aspetti che sembrano confermare che gli innesti sembrano aver raggiunto uno step di maturazione più avanzato per la maggiore presenza di tessuto osseo neoformato, per la struttura delle trabecole che in alcuni casi assumono aspetti lamellari. Il test d’impianto osseo e in sottocute ha mostrato che BETA FOSFATO TRI-CALCICO ha indotto una momentanea risposta infiammatoria, che rimaneva localizzata attorno al materiale stesso e che era imputabile alla sua veloce metabolizzazione. Il risultato è in linea con quanto riportato in letteratura e dimostra che l’iniziale reazione infiammatoria può essere in qualche modo responsabile di un richiamo cellulare che promuove la neogenesi ossea.
CONCLUSIONI Il test d’impianto in osso di coniglio ha valutato a tempi brevi la biocompatibilità di BETA FOSFATO TRI-CALCICO messo a contatto con tessuti duri, in modo da studiare la reale integrazione tra biomateriale e tessuto osseo, destinazione finale dell’impianto, e per verificare l’azione osteogenica. I test sono stati eseguiti in conformità con le normative UNI EN 10993-6 e UNI 9582/3. Sulla base dei risultati ottenuti la sostanza in esame deve essere considerata BIOIMPIANTABILE.
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