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氨基酸和生物资源

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Am ino A cid s & B io tic R esou rces 1997, 19 (2) : 38～ 43

Ξ

糖基转移酶和去糖基化酶 杨清香 曹军卫 黄国锦 ( 武汉大学生命科学学院 430072)

摘要 在糖基化工程中, 通过酶法对蛋白质进行糖基化修饰和对天然糖蛋白去糖基化是研究糖蛋 白结构与功能的重要手段。 本文综述了近年来所纯化的主要的糖基化转移酶和去糖基化酶的性质和应 用。 关键词 糖蛋白 糖基化 糖基转移酶 去糖基化

近年来, 糖及糖缀合物的研究日益引起生 物学家的重视。 长期以来, 人们投入基因工程 和蛋白质工程的研究热潮之中, 而只认为糖类

也于 1991 年实施 “糖工程前沿计划” , 同时成 立“糖工程研究协议会”并出版《糖锁工学》专 著 和创刊专门杂志 “T rend s in G lyco science

主要是作为生物的能量来源和结构物质。90 年 代后, 特别是发现 E- 选择蛋白 ( E- Select in ) 识别白细胞表面的四糖唾液酸路易斯 X ( Slex , 一种血液抗原) 以来才真正第一次在人体中确

。自 1993 年首届“国际糖 and G lyco techno logy ”

证了糖结合蛋白 E- Select in, P - Select in 和 L - Select in 等 家 族 成 员 与 寡 糖 Slex ( 也 包 括 9 Sle ) 之间的识别功能, 并发现肺癌和大肠癌细 胞表面也存在 Sle 。现在看来, 大多数蛋白质 以糖蛋白形式存在, 它们包括酶、免疫球蛋白、 载体蛋白、激素、毒素、凝集素和结构蛋白, 功 能涉及细胞识别、信息传递、激素调节、受精、 x [1]

发生、 发育、 分化、 神经系统和免疫系统恒态 维持等各个方面[ 2, 3, 4 ]。 而且知道, 病菌、 病毒 的侵染, 癌细胞的增殖及转移, 自身免疫疾病 等都与细胞表面的糖密切相关[ 5, 6 ]。因此, 国际 上掀起了糖及糖缀合物的研究热潮, 生命科学 中有了新的分支—糖生物学 ( G lycob io logy ) [ 7 ]。 在继基因工程和蛋白质工程的技术日趋成熟的 同 时, 糖 基 化 工 程 ( G lyco sy la t ion [ 1, 8 ] eng ineering ) 应运而生 。许多国家成立了专

门的糖生物学研究机构; 牛津大学出版社于 1991 年创刊了“G lycob io logy ”专业杂志; 日本

工程会议”在美国召开以来, 已有多次国际糖 生物学会议召开。可见, “生命化学中最后一个 ‘巨 大 前 沿’ : 糖生物学的时代正在加速来 临! ”[ 1, 3 ] 并将成为二十一世纪的热点。 蛋白质的糖基化修饰和天然糖蛋白的去糖 基化是研究糖蛋白糖链结构和功能的重要手段 之一。 其中糖基转移酶和各种糖苷酶是该手段 中的有用工具。 本文主要介绍蛋白质糖基化和 糖蛋白去糖基化过程中的主要酶性质的研究进 展。 1 蛋白质的糖基化修饰和糖基转移酶

根据蛋白质与糖链连接的方式不同将糖蛋 白分为 N 2连接糖蛋白和 O 2连接糖蛋白[ 4, 9 ]。O 2 连接糖蛋白糖链的生物合成比较简单, 是将单 糖以核苷酸糖的形式逐渐加在多肽的丝氨酸或 苏氨酸上, 主要在高尔基体内进行[ 4 ]。 1. 1 N 2连接糖链生物合成及糖基转移酶 N 2糖链的合成比较复杂, 一般要借助一个 磷 酸 多 萜 醇 形 成 一 个 共 同 的 脂 多 糖 前 体: G lc3M an 9 ( G lcNA c) 2 2P 2P 2Do l, 并将其加在新

Ξ 收稿日期: 1996- 09- 18 接受日期: 1997- 01- 12

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杨清香等 糖基转移酶和去糖基化酶

生多肽糖基化位点 A sn 2X 2Serg T h r 中的 A sn 上 (X 为除脯氨酸外的其他任何氨基酸) 。该前 体中寡糖的形成是在内质网膜上相应的糖基转 移酶催化下, 以核苷二磷酸糖为供体按顺序加 上 G lcNA c (N 2乙酰氨基葡萄糖) 、M an ( 甘露

糖) 、G lc ( 葡萄糖) 形成的。然后, 然后再经两 步糖苷酶作用形成 (M an ) 5 ( G lcNA c ) 2 2P 2P 2 Do l2A sn, 并由内质网运至高尔基体中, 经一系 列糖苷酶和糖基转移酶的进一步加工成为最后 的糖蛋白[ 2, 10 ]。 如图 1

G 3M 9N 2 2pp 2Do l M 2M M 2M

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M

M 2N 2N 2A sn 2 2 2 2 2 G G GM M M ↓G luco sida seg ↓G luco sida seg M 2M M M 2M M 2N 2N 2A sn 高甘露糖型 (H igh m anno se typ e ) M 2M 2M ↓M anno sida seg M M M M 2N 2N 2A sn M ↓G lcNA c T ran sfera se g M

M M M 2N 2N 2A sn 杂合型 (H yb rid typ e ) N 2M ↓M anno sida se g M M 2N 2N 2A sn 2 N M ↓G lcNA c T ran sfera se g ↓Fuco sy l T ran sfera se

↓Ga lacto sy l T ran sfera se ↓Sia ly l T ran sfera se SA 2Ga l2N 2M M 2N 2N 2A sn 复合型 (Com p lex typ e ) SA 2Ga l2N 2M Fuc 图 1 N 2糖链的加工过程 F ig 1 T he p rocessing p a thw ay fo r m od ifica tion of the N 2linked suga r cha in s G: 葡萄糖 M : 甘露糖 N : N 2乙酰氨基葡萄糖 ( GlcNA c) SA : 唾液酸 Gal: 半乳糖 Fuc: 果糖 G: Gluco se M : M anno se N : N 2acetylam in ig luco se SA : Sialic acid Gal: Galacto se Fuc: F ructo se

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氨基酸和生物资源

从这个生物合成过程可以看出, 糖基转移 酶是糖基化过程的关键酶。 目前已对多种糖基 转移酶的结构以及编码它们的基因研究清楚, 并认为糖链的合成没有特定的模板, 而是通过

链可以认为是基因的次级产物, 一个基因编码 一个糖基转移酶, 一个糖基转移酶专一地催化 一个糖苷键的合成; 这样一条糖链的合成就需 要一个多酶系统, 也就对应了一个基因组。 不 同个体, 因遗传基因不同, 而使有些糖链结构

糖基转移酶将糖基由其供体转移到受体上。 糖

表现出差异[ 11, 12 ]。

1.

2 糖基转移酶的性质

图 2 不同的糖基转移酶所催化的糖基转移反应 F ig 2 R eaction s ca ta lyzed by d ifferen t g lyco syltran sfera ses

糖基转移酶具有严格的底物专一性, 例如

为分化抗原, 一旦发育成熟, 在细胞表面出现

在 N - 糖链的外周有 6 种不同方式连接的 G lc2 NA c, 分别有 6 种不同的糖基转移酶负责它们

了另一些糖类异质体。 如果糖基转移酶在成熟 细胞中活性很高, 就会产生癌变, 同时出现了

的转移, 甚至连先后次序也非常严格 [ 11 ]。如图 2 在细胞中糖基转移酶的水平和受体专一性为

早期的分化抗原。 因此一些糖基转移酶活性被 视为肿瘤的重要标志。例如: N - 乙酰氨基葡萄 糖转移酶g (Gn- T g ) , 催化 G1cNA c 在甘露

决定复合型糖链外链分子最后结构的主要因 素。 一个寡糖结构可以被一个或几个糖基转移 酶识别, 不同比例的糖基转移酶竞争的结果就 形成不同的糖苷键。例如, 复合型糖链中 Ga1Β1 - 4G lcNA c 既可以被 Α- 2, 6—唾液酰基转移 酶识别形成 SA Α- 2 →6Ga1Β1 →4G1cNA c, 也

糖上 Β1- 4 连接, 形成一个平分型结构。它可以 作为肝癌的标志, 从正常肝→慢性肝炎→肝硬 化→肝癌, 随着疾病的进展, Gn- T g 活性成比 例 增 加。 另 外 Gn - TV 、 半 乳 糖 基 转 移 酶 ( GA T ) 等的活性变化都与肿瘤恶化程度及转

可以被 Α- 1, 3- 果糖基转移酶识别形成 Ga1Β1 →4 (Fuca1→3) G1cNA c。因此, 外链的唾液 酰基化和果糖基化的比率就决定于一个细胞中

移情况有关[ 6 ]。

这两种酶活性表达的比例 。

去糖基化的目的有三: ( 一) 检测碳水化合 物在糖蛋白功能中的作用。( 二) 测定糖蛋白中 蛋白质部分的分子量, 尤其在重组 DNA 研究

[4]

1.

3 糖基转移酶的应用

已纯化的糖基转移酶是目前糖基化工程中

2 糖蛋白的去糖基化酶

的重要酶, 为研究糖蛋白糖链的结构与功能的 关系以及细胞表面糖基化修饰提供了极好的方

中, 证明所产生的蛋白质是否为目的蛋白。 ( 三) 制备抗蛋白质抗体。去糖基的方法有几种:

法[ 8 ]。

酶法、化学法、糖基化抑制剂、重组 DNA 技术 和通过某些糖基步骤缺陷的突变细胞。 其中酶

另外, 糖基转移酶的表达和细胞周期密切 相关。 在细胞分化阶段, 许多糖基转移酶的基 因是表达的, 为此出现了一系列糖类异质体作

法被认为是比较理想的方法, 该法能保持蛋白 质的完整性, 并且适宜于许多糖蛋白。

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杨清香等 糖基转移酶和去糖基化酶

常用的去糖基酶有三类: 外切型糖苷酶、内 切型糖苷酶和糖胺酶 (N - 糖肽酶) [ 15 ]。 2. 1 外切型糖苷酶 (Exo - g lyco sida se ) 这类酶是研究最早的一类作用于糖蛋白糖 链的酶。 它们都能从糖链的非还原末端释放寡 糖。例如: 唾液酸酶、Β2半乳糖苷酶、Β2N 2乙酰 氨基葡萄苷酶、Α2L 2果糖苷酶、Α2N 2乙酰氨基半 乳糖苷酶、Α2甘露糖苷酶、Β2甘露糖苷酶等等。

通过这些酶的联合作用可将糖蛋白或糖脂的糖 链完全降解。 这些酶的应用有助于研究糖链的 结构与功能的关系。 例如: 促红细胞生成素的 去糖基化, 当 末 端 的 糖 即 唾 液 酸、 半 乳 糖、 G1cNA c 被专一性的糖苷酶去掉时, 在体外测 其活性逐渐提高, 进一步切去内部糖链则导致 活性丧失。

表 1 几种内切型糖苷酶的特征及应用前景 T ab le 1 T he cha racteristic and the po ten tia l A pp lica tion of severa l Endog lyco sida ses 类 型

目前纯化的种类

Endo D

来 源

Strep tococ2 cu s

作 用 位 点

应 用

( D ip lo 2

coccu s) Pueu 2 m on iae

Endo 2Β2N 2

Endo C I

C lo strid ium

①膜糖蛋白的糖

Pertringen s

链分析,

acetyl2g lu 2 co sam in idase

Endo H

Endo C g

Endo 2Α2N 2 acetlyl2galac2 to sam in idase

C lo strid ium p ertringen s

Endo 2Gal2

D ip lococcas p reum on iae

Endo 2Gal2

Endo 2Gal2 NA Case2S

成中间体的定性。

p licatu s

NA Case2D

NA Caes2A

②N 2糖 链 生 物 合

Strep tom yces

释放二糖 A lcaligenes

GalΒl→3GalNA C

O 2糖链研究

Strep tom yces

①各种糖键合物 分析②糖脂水解 ③硫酸软骨素蛋

E scherich ia

Endo 2Β2 galacto sdaes2

freund ii 等多

识别 GalΒl→4N Βl→

白聚糖中心蛋白 分 离 ④ po ly lac2

种微生物

to sam inogycau s

结构分析 Endog lyco 2

R hodococcu s

ceram idase

sp.

切开各种酸性或中性 g lyco sp h ing go lip id s 的寡 糖 与 ceram ides 间键, 产 生 完 整 的 寡 糖 和 Ce2 ram ides ( 神经酰胺)

表中 M : 甘露糖 N : GlcNA c (N 2乙酰氨基葡萄糖) R: 糖链 Gal: 半乳糖 M : M anno se N : N 2acetylg luco sam ine R: sugar Gal: galacto se

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研究糖鞘脂功能

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氨基酸和生物资源

G lycop ro tein 2.

2 内切型糖苷酶 (Endo - g lyco sida se)

目前纯化的内切型糖苷酶有如下几类 这些酶由于都是从糖链内部专一性切开某 个键, 因此在糖链结构分析以及结构与功能关 [ 15 ]

系研究中非常有用, 也是目前糖基化工程中的 重要酶, 可应用于生物学的多个领域。例如: 近 年来内切型 Β2半乳糖苷酶结合单克隆抗体, 免 疫化学方法检测红细胞表面带有血型 Ii2抗原 的乳糖胺聚糖 ( Po ly lacto sam ino lg lycan s) 以及 由聚乳糖胺 ( Po ly lacto sam ines) 修饰末端的各 种抗原包括 ABH 和 SSEA 21 (L ex ) , 建立了正常 人红细胞聚乳糖胺轮廓 (P rofile ) , 并分析了遗 传性贫血病人的不正常糖基化轮廓。 发现这类 病人的红细胞含增高的聚乳糖胺神经酰胺 ( Po ly lacto sam inyceram ides) 和乳糖系列的糖 脂, 而其中有两条糖蛋白带很少被聚乳糖胺糖 基化。 这是一种糖基化缺陷病, 现已对该病进 行了广泛的分子生物学研究。 2. 3 糖胺酶 ( G lycoam ida se, N - 糖苷酶) 这类酶目前主要有两类: 糖胺酶 A ( 来自 A lm ond ) 和 糖 胺 酶 F ( 来 自 flavobacterium m en ingo sep t icum ) , 都水解寡糖 - G1cNA cA sn- 肽, 释放出完整的寡糖, 并且对寡糖结构

特异性较宽, 甘露糖型、 复合型、 杂合型糖链 均可释放, 包括所有含果糖基, 含二分型 G lc2 NA c、Β2木糖、Ga l- G lcNA c 重复单位以及含唾 液酸基的 N - 乙酰乳糖氨型寡糖。 但对肽分子 专一性较强, 只能释放含 3- 40 个氨基酸的糖 肽分子的糖基, 对肽中氨基酸序列有一定要求。 目前使用较多的为糖胺酶 A , 是分析 N 糖链的有用工具, 结合核磁共振, 甲基化分析 和外切型糖苷酶消化常用来定性分析由二维图 谱分离的寡糖。 如图 3 3 前景及微生物学对这些研究的贡献

目前, 对这些酶的研究还处于起步阶段, 许 多问题有待解决。 纯化的酶种类依然很少。 象 O - 糖链的研究还缺乏适当的酶。另外, 许多酶 的功能特性还有待开发。过去, 微生物学曾经大

↓P ro tea ses G lycop ep t ides G lyco 2am ida ses ↓2H PA EC 2PAD O ligo saccha rides ( N eu t ra l、A cid ic) Sia lida se - 2- Am inop y rid ine ↓N aBH 3CN PYR ID YLAM INO O ligo saccha rides 222D im en siona l Suga r M ap ← 2Exog lyco sida ses 图 3 N 2糖链结构分析模式图 F ig 3 T he ana lyzing m odel of the N 2linked suga r cha in structu re

大推动了酶工程的发展, 那么今天糖生物学中 这些酶的主要来源仍是微生物, 目前购买到的 糖苷酶几乎都是由微生物产生, 而且有些微生 物 还可产生特殊作用的糖苷酶。 例如: T ry 2 p ano som a cruzi 产生的唾液酸酶可以转移唾液 酰基形成 Α2 ( 2, 3) 唾液酰键, 在复合型 N 2糖 键合物的构建中很有用, 又如, 由 A rth robacter p ro top ho rm iae 产生的内切型2Β2N 2乙酰葡萄糖 苷酶 ( Endo 2A ) 能切开高甘露型糖和杂合型糖 的中心 G lcNA cΒ124G1cNA c 残基, 但目前发现 它还有转糖基的活性, 已被用于人工合成 N 2糖 键合物研究之中[ 18 ]。因此从微生物中开发有价 值的酶将会大大加快糖生物学研究步伐。 另外, 对微生物本身糖蛋白、糖脂的研究, 还很不够, 特别是病原微生物与宿主细胞之间 的识别、 感染都与细胞表面的糖密切相关。 对 这些问题的深入研究将会有助于许多病理的研 究并为制造高效低毒药物开辟新路[ 19, 20 ]。 总之, 糖生物学的发展将会促进各门学科 的发展, 而对这些酶的开发与研究又将会大大 加快糖生物学和糖基化工程研究的进展。 参考文献 1 金城, 张树政. 生物工程进展, 1995, V o l. 15, N o. 3: 12 - 17 2 张旭, 生物工程进展, 1995, V o l. 15, N o. 2: 30- 35

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杨清香等 糖基转移酶和去糖基化酶 3 V ark i, A , Glycob io logy 1993, V o l. 3 N o. 2 97- 130 4 Kobata, A , Eu r. J. B iochem. 1992, 709, 483- 501 5 M A SANO R I BABA , et al, AN T IM ICROB IAL A GEN T S AND CH EM O TH ERA PY, 1988, VO l. 32, N o. 11, 1742 - 1745

193 14 V icto r Gin sbu rg & Ph illip s W. Robb in s Ed. N ew Yo rk B IOLO GY O F CA RBO H YDRA T ES1991, V o l. 3 15 N o riko T akahash i, T akash i M u ram atsu, Ed. H andbook of Endog lyco sidases and Glycoam idases CRC P ress 1992

6 张 哲. 生命的化学, 1996, 16 (1) : 35—36

16 穆小民. 生物技术, 1995, 5 (4) : 5—8

7 M icheal J. Geisow , T IBT ECH JU L Y, 1991, V o l9 221-

17 Y. C. L ee Som e A sp ects of Glyco techno logy: M icrob ial

225

A ng les, In ternational Sym po sium on M icrob io logy of the

8 Stan ley, P. Glycob io logy, 1992, 2 (2) : 99- 107

21st Cen tu ry - A Cen tenn ial T ribu te to L ou is Pasteu r,

9 孙册, 莫汉庆. 《代谢》 . ( 二) 科学出版社, 28—57

A b stracts and P rog ram , O ctober 10- 13, 1995. Beijing,

10 A lan D. E lbein T IBT ECHO CTOBER , 1991, V o l9: 346

Ch ina. 10- 11 18 J ian- Q iang Fan, et al. T he Jou rnal of B io log ical Chem 2

- 352 11 王克夷. 生物化学与生物物理进展, 1994, 21 (1) : 9— 13

istry, V o l. 270, N o. 30, Issue of J u ly 28, pp 17730 17735, 1995.

12 Beyer T A , Sad ler J E, et al. A dvances Enzym o l, 1981,

19 廖文胜, 陆德培. 生命的化学, 1995 年 15 卷 1 期 20 T akao M ukai and Keizo A rihara, B io sci.

52, 23 13 V icto r Gin sbu rg & Ph illip s W. Robb in s, Ed. N ew Yo rk

B io tech.

B iochem. 1994, 58 (10) : 1851- 1854

B IOLO GY O F CA RBO H YDRA T ES. 1984, V o l. 2: 163-

G lyco sy lt ran sfe ra se s and the Enzym e s of D eg lyco sy la t ion Yang Q ingx iang Cao J unw e i H uang Guo jin (S chool of L if e S ciences , W uhan U n iv ersity , W uhan , 430072) Abstract In g lyco sy la t ion eng ineering, g lycop ro tein s a re m od ified by g lyco sy la t ion and deg 2 lyco sy la t ion. G lyco sy lt ran sfera ses and the enzym es of deg lyco sy la t ion p lay im po rtan t ro les in the p rocesses. T he m a in cha racterist ics and app lica t ion s of these enzym es p u rified in recen t yea rs w ere review ed.

Keywords g lycop ro tein g lyco sy la t ion g lyco sy lt ran sfera se deg lyco sy la t ion

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