biokemija-povzetek

Pripravili: Ana Bernard in Eva Srečnik Dopolnil: Matic Dolinar

Študijsko leto 2011/2012

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

KAZALO: 1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

UVOD V BIOKEMIJO PRENOS BIOLOŠKIH INFORMACIJ: CELIČNA KOMUNIKACIJA BIOLOŠKE MOLEKULE V VODI AMINOKISLINE, PEPTIDI, PROTEINI 3D ZGRADBA PROTEINOV IN NJIHOVA BIOLOŠKA VLOGA ENCIMI I ENCIMI II OGLJIKOVI HIDRATI LIPIDI, BIOLOŠKE MEMBRANE IN TRANSPORT DNA IN RNA PODVOJEVANJE IN PREPISOVANJE DNA PREVAJANJE RNA (škrbina J) CELIČNI METABOLIZEM (škrbina J) METABOLIZEM OH (škrbina J) NASTANEK NADH IN NADPH, CITRATNI CIKEL VERIGE ZA PRENOS ELEKTRONOV, NASTANEK ATP METABOLIZEM MAŠČOBNIH KISLIN IN LIPIDOV METABOLIZEM AMINOKISLIN IN DRUGIH N-­‐SPOJIN (škrbina J)

2

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

1. UVOD V BIOKEMIJO

a) Kemijski elementi v bioloških molekulah: • elementi, ki so v večjih količinah sestavni del vsakega živega bitja in so nujno potrebni za življenje: C, O, N, P, S, H predstavljajo 92 % suhe mase živih bitij • elementi v sledovih, ki so sestavni del večine oganizmov in so najverjetneje tudi nujno potrebni za življenje: Na, K, Ca, Mg, Fe, I, Cl, Mn, Co, Cu, Zn • elementi v sledovih, kot so As, Br, Si, B, Al, Ga, Se, F, Cd, Cr, V, W in molibden, ki jih najdemo le v nekaterih organizmih in so verjetno tem organizmom tudi nujno potrebni za življenje Življenje temelji na C: sposoben je tvorbe najrazličnejših spojin, kot posledica tvorbe do 4 kovalentnih vezi sposoben kovalentne vezave ogljikov relativna stabilnost heteronuklearnih vezi: -­‐C-­‐N-­‐C-­‐, -­‐C-­‐O-­‐C-­‐

Elementi se povezujejo v spojine: v živih bitjih najdemo katione, anione, kovalentne spojine, ionske spojine, kovinske ione, koordinacijske spojine (hem, klorofil), polimere

b) Biološke makromolekule: • molekule, ki sestavljajo živa bitja, so večinoma zelo velike (morajo biti stabilne) • biološke makromolekule razdelimo v 3 skupine: 1.) nukleinske kisline – sestavljene iz nukleotidov à heteropolimeri 2.) proteine – sestavljeni iz 20 različnih AK à heteropolimeri 3.) polisaharide lipidi, ki so tudi pomebne biološke molekule, največkrat niso dovolj veliki, da bi jih prištevali med makromolekule • so polimeri, sestavljeni iz velika števila monomernih enot; kemijski reakciji, pri kateri se povežeta 2 monomerni enoti, odcepi pa se manjša molekula (največkrat voda), imenujemo kondenzacija: -­‐H2O R – COOH + R´-­‐ NH2 R – (CO) – NHR´ • • •

c) Organeli, celice in organizmi: • makromolekule se lahko povezujejo med seboj in oblikujejo nadmolekulske kompleksne strukture, organizirane gruče makromolekul, npr.: - celične membrane: kompleski proteinov in lipidov - kromatin: kompleksi DNA in proteinov - ribosomi: kompleksi RNA in proteinov

1.) Virusi: • vrsta nadmolekulskih kompleksov • večina vsebuje eno molekulo DNA ali RNA, ki je v proteinskem ovoju • ne uvrščamo med živa bitja, saj ne morajo obstajati neodvisno od drugih živih bitij (se ne morejo replicirati, nimajo lastne presnove)

3

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

2.) Prokarionti: • enostavni celični organizmi, večinoma bakterije in modrozelene alge • nimajo celičnega jedra • SO živa bitja • v premeru merijo od 1 do 10 µm • celične komponete so obdane s celično membrano in celično steno • zunanja površina je večkrat prekrita s bički (flageli), ki so izrastki potrebni za premikanje, in manjšimi izrastki piliji, preko katerih si prokarionti izmenjajo DNA med spolnim razmnoževanjem ali pa se z njimi pritrjujejo na razne površine • v notranjosti celice je citoplazma, v kateri so ribosomi in nukleoid (zvita DNA) • vsaka celica ima 1 kromosom, ki je molekula DNA

3.) Evkarionti: • rastline, živali, kvasovke, glive, protozoje in alge • v premeru merijo od 10 do 100 µm • znotraj celice imajo z membrano obdane organele: - jedro: shranjevanje genetske informacije, mesto kjer poteka podvojevanje DNA in prepisovanje v RNA - gladki in zrnati endoplazemski retikulum - Golgijev aparat: izločanje celičnih odpadkov, mesto, kjer poteka zorenje proteinov - mitohondrij: prostor, kjer potekajo metabolični procesi, ki vodijo do nastanka molekul ATP - lizosom (živalska): metabolična razgradnja spojin, ki so prišle v celico v procesu endocitoze - peroksisom (živalska) ali glioksisom (rastlinska): poteka encimsko katalizirana oksidacija nekaterih substratov ob prisotnosti O2 in H2O2 - kloroplast (rastline): mesto, kjer poteka fotosinteza (pretvorba svetlobne energije v kemično – ATP) - citoskelet: daje obliko celici - citosol: prostor, kjer poteka mnogo metaboličnih reakcij

Kdo so uspešni znanstevniki? Darwin, Einstein Kdo so uspešni slovenski znanstevniki? Jožef Štefan, Baltazar

4

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

2. PRENOS BIOLOŠKIH INFORMACIJ: CELIČNA KOMUNIKACIJA

a) Shranjevanje biološke informacije v DNA

1.) Biološka informacija: • DNA, RNA, proteini in nekateri ogljikovi hidrati so informacijske molekule à v svoji kemijski zgradbi nosijo navodila za uravnavanje bioloških procesov • informacije so zapisane z zaporedjem monomernih enot • DNA je osnova nosilka informacij (informacija je shranjena v obliki zaporedja nukleotidov v DNA) • genom zajema celotno količino genetske informacije določene celice, ki je shranjena v DNA • biološke informacije lahko prenašajo tudi prionske bolezni (bolezen norih krav, Creutzfeldt-­‐Jakobova bolezen). Prioni so patološke beljakovine, ki ob stiku povzroči pretvorbo zdravega proteina v patološkega.

• biološko informacijo med generacijami prenaša DNA • informacija, shranjena v molekuli DNA, se prenaša na 2 načina: - z natančnim podvajanjem DNA: informacija se v procesu celične delitve prenese na hčerinsko celico - z sintezo RNA: po njenih navodilih sledi sinteza proteinov à DNA je torej preko informacije za sintezo proteinov, posredno povezana z izvedbo in uravnavanjem tisočih kemijskih reakcij v celici

2.) Molekula DNA: • veriga DNA je dolg, nerazvejan heteropolimer, sestavljen iz 4 vrst monomernih nukleotidnih enot • vsaka monomerna nukleotidna enota je sestavljena iz 3 delov: dušikove organske baze, sladkorja deoksiriboze in fosfata • sestavljena je iz 2 v vijačnico povezanih verig • strukturno ogrodje vsake verige je sestavljeno iz deoksiriboz in fosfatnih skupin, ki so povezane s kovalentnimi fosfodiesterskimi povezavami. Organske baze so obrnjene v notranjost vijačnice. Baze obeh nasprotnih verig so si dovolj blizu, da lahko nastanejo komplementarni bazni pari, v katerih se baze povežejo s specifičnimi dvojnimi vezmi (adenin se poveže s timinom,in sicer z dvojno vezjo, citozin pa z gvaninom, in sicer s trojno vezjo)

• ena enota NUKLEOTID: fosfat + nukleozid (nukleozid = deoksiriboza + baza)

• če ima DNA veriga več A=T, je vezava med koplementarnima verigama šibkejša, kot če imama več parov C≡G à vpliva na topnost

• nukleozid: baza + deoksiroboza

• baze prenašajo genetske inforamcije, sladkor in fosfatne skupine imajo strukturno funkcijo

• kromosom: kondenzirana struktura DNA 5

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

•

kromatin: verige DNA, ovite okoli histona

•

kodogen: zaporedje 3 nukleotidov

3.) DNA à DNA: glej poglavje DNA in RNA • s podvojevanjem DNA verige se dedne informacije prenesejo iz staršev na potomce • DNA narekuje in usmerja sintezo identične molekule DNA za celice naslednje generacije • proces podvajanja/replikacija se prične z odvijanjem krajših sigmentov obeh verig.

Vsaka od obeh veig predstavlja matrico za nastanek nove komplementarne verige.

• semikonzervativno podvojevanje (vsaka od obeh novo nastalih DNA molekul je sestavljena iz ene starševske in ene na novo sintetizirane hčerinske verige)

b) Prenos biološke informacije na RNA

1.) DNA à RNA = prepisovanje ali transkripcija: • gre za prenos informacije iz DNA na RNA • proces prepisovanja lahko sprožijo signalne molekule znotraj (pogosto proteini) ali zunaj celice (hormoni/rastni faktorji, delujejo preko sekundarnih obveščevalcev) • pri transkripciji se iz molekule DNA na RNA prepiše le del informacije, ki jo nosi celotna molekula DNA, v nasprotju z podvojevanjem, kjer se prepiše celotna DNA • genom je sestavljen iz genov (da navodilo/zapis za sintezo 1 peptida) • gen je umestljiva regija genomskega zaporedja in ustreza enoti dedovanja s pridruženimi regijami in/ali drugi regijami funkcionalnega zaporedja • razlike med DNA in RNA: 1. DNA (deoksiribonukleotidi) RNA (ribonuklotidi) – monomerne gradbene enote 2. DNA ima bazo TIMIN, RNA pa namesto timina URACIL 3. Hibrid DNA: RNA se po končanem prepisovanju razdruži, sprosti se enoverižna matrica, medtem ko se DNA poveže nazaj v dvojno vijačnico 4. Encim, ki povezuje nukleotide v molekulo RNA, imenujemo RNA-­‐polimeraza

2.) Vrste RNA: • DNA se prepiše v 3 različne vrste RNA: - ribosmosko RNA (rRNA): skupaj s proteini gradi ribosome, mesta, kjer poteka sinteza proteinov - prenašalna RNA (tRNA): aktivira in prinaša AK za sintezo proteinov. Za vsako od 20 AK, iz katerih so sintetizirani proteini, obstaja najmanj ena tRNA. Je najmanjša.

- informacijska RNA (mRNA): nosi informacijo za sintezo proteinov, zaporedje nukleotidnih baz v mRNA je komplementarno zaporedju baz DNA, ki je služila za matrico; je nestabila (zato mora biti sporočilo hitro dekodirano in večkrat uporabljeno na ribosomih, da lahko v kratkem času nastane več kopij določenega proteina iz ene kopije mRNA) • poleg omenjenih glavnih vrst RNA molekul v celicah obstajajo še druge: - majhne jedrne RNA (snRNA): odgovorne za izrezovanje delov mRNA, ki ne kodira proteinov à zorenje mRNA 6

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

mikro RNA (miRNA): kratke verige, z vezavo na komplementarne regije mRNA preprečijo prepisovanje (vežejo se na mRNA na 3´ koncu, ki ne kodira proteinov, ampak je odgovoren za regulacijo prenašanja teh informacij), povzroči utišanje gena

c) Sinteza proteinov

1.) mRNA à proteini: • proteini so končni produkti izraženja informacije DNA v celici • proteom – celotna množica različnih proteinov, ki se sintetizirajo v organizmu na osnovi kodirane informacije v genomski DNA • najprej se sintetizirana mRNA à je komplementarna kopija delu ene verige DNA, ki ustreza 1 genu • novovezni nukleotidi se s pomočjo RNA-­‐polimeraze povežejo v enojno verigo RNA • ta se nato odcepi od DNA in preide skozi poro jedrnega ovoja v citoplazmo, kjer se veže na ribosome à vezavo omogoča rRNA, ki je sestavni del ribosoma • AK, ki se na ribosomih povežejo v belj., ne prispejo tja same, temveč jih prinese tRNA • tRNA na enem koncu vežejo eno AK, z drugim koncem pa se pritrdijo na določeno mesto na mRNA (mesto je komplementarno kodogenu na DNA à kodon – zaporedje 3 nukleotidov na mRNA) • trojica nukleotidov na tRNA, ki se poveže s kodonom, imenujemo antikodon.

Antikodn je povsem enak kodogenu!

• genski kod – vsi zapisi, ki so kodirani v DNA: - triplenten: 3 nukleotidi na mRNA (kodon) določajo 1 AK - neprekrivajoč: skupine 3 nukleotidov se berejo zaporedoma - neprekinjen: brez presledkov - degeneriran: 1 AK ima lahk več kodonov (običajno razlike v tretji bazi) - univerzalen: isti kod se uporablja pri vseh organizmih (izjeme so mitohondriji in nekatere alge) - vsebuje STOP kodon (UGA, UAG, UAA) in START kodon (AUG)

2.) Eksoni in introni: • eksoni – kodirajoče regije (120–150 nukloetidnih baz à kodira 40 do 50 AK v proteinu) • introni – nekodriajoče regije (50–20000, njihova prisotnost še ni popolnoma pojasnjena)

d) Napake v zorenju DNA

Mutacije DNA: • Mutacije so trajne dedne spremembe genoma, ki jih povzročijo različni dejavniki (mutageni), ki so lahko kemijski (vplivi spojin in elementov, npr. azbest), fizikalni (različna sevanja), biološki (virusi) ... Njihovo bistvo je sprememba zgradbe in količine DNA. • razdelimo jih na 2 skupini glede na mesto, na katerem pride do spremembe: - mutacija na eksonu – spremen se lahko AK zaporedje proteina - mutacija na intronu – najverjetneje nima vpliva, tiha mutacija • genske bolezni (povezane z mutacijami): - cistična fibroza: točkovna mutacija 7q - Downov sindrom: dodaten kromosom 21 -

7

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

hemofilija: točkovna mutacija X anemija srpastih celic: točkovna mutacija 11p fenilketonurija: točkovna mutacija 12q barvna slepota: točkovna mutacija X celiakija: več možnosti nekatere vrste raka

e) Prenos informacij skozi celično membrano

1.) Prenos informacij s pomočjo prenosa signalov: • metabolične aktivnosti in ostali biološki porcesi so pod vplivom zunajceličnih signalov (hormoni, rastni faktorji) • signalne molekule, ki jih izločajo različni tipi celic, se razširjajo po celotnem organizmu. Vsaka signalna molekula ima, ne glede na svoj izvor, značilno kemijsko zgradbo in biološki vpliv. Tarčne celice imajo na površini receptorje, ki prepoznajo samo določene signalne molekule.

• primer: prostagladini – signalne molekule z lokalnim učinkom hormoni – signalne molekule, ki lahko delujejo tudi daleč od mesta nastanka • nepolarne signalne molekule lahko prehajajo celično membrano, medtem ko relativno polarne ali nabite signale molekule ne morejo skozi membrano tarčne celic, zato se je razvil mehanizem prenosa signalov/celično signaliziranje: - preko membrane se namesto snovi prenese le kemično sporočilo, ki povzroči spremembe v celicah - signali, ki jih celica sprejme, vplivajo na uravnavanje metabolizma, razvoj celice, krčenje mišic ali na odziv celice na dražljaje iz okolja

2.) Značilnosti prenosa signalov: • v določenih podrobnostih se razlikuje od organizma do organizma in od hormona do hormona • obstaja pa skupno zaporedje dogodkov, v katerega so vključeni različni hormoni: - hormon po krvem obtoku potuje od celice, ki ga je izločila, do tarčne celice - sporočilo prenese tako, da se veže na specifične receptorje (največkrat proteine), ki so vgrajeni v membrano - receptorji za vodotopne hormone imajo 3 značilne predele: 1) predel na zunanji steni à tu se veže hormon 2) transmembranski predel 3) predel, ki kot rep štrli v citoplazmo celice • eden najpogostejših mehanizmov prenosa signalov: 1) hormon se veže na receptorski protein 2) spremeni se struktura repa 3) rep se poveže z G-­‐proteinom (vsidran je na znotrajcelični strani v membrano) 4) G-­‐proteini vežejo gvaninske nukleotide (GDP, GTP) 5) aktivirani G-­‐proteini nato prenesejo signal do znotraj celičnega encima (največkrat je adenilat-­‐ciklaza, odvisno od G-­‐proteina se adenilat-­‐ciklaza aktivira/inhibira) 6) adenilat-­‐ciklaza katalizira pretvorbo ATP v ciklični adenozin-­‐3',5' monofosfat -­‐ciklični AMP ali cAMP (je primer sekundarnega obveščevalca, znotraj celice prenaša sporočilo hormona) 7) nato se sproži veriga reakcij (zaporedje dogodkov ali kaskada), ki jih uravnavajo encimi protein kinaze (katalizirajo prenos fosforilne skupine – PO32-­‐ z ATP na molekulo substrata) -

8

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

8) kinaze delujejo kot molekulska stikala, ki vključujejo ali izključujejo metabolične procese • prenos informacij s prenosom signala na primeru adrenalina: - izloča ga sredica nadledvične žleže - adrenil je primarni obveščevalec za mišične celice - je relativno polaren, zato ne more prehajati skozi nepolarno membrano mišične celice, zato deluje preko receptorja 1) veže se na receptor na zunanji površini celice 2) prenos signala 3) stimulacija encima, ki katalizira odcepljanje glukoznih enot z glikogena à večja konc. glukoze pospeši metabolizem celice à sprosti se več E (povečana konc. cAMP in glukoze) • receptorji so tesno vezani na membrano • proteini citoskeleta držijo skupaj več receptorskih proteinov, ki sestavljajo mrežo za natančen prenos signalov • na površini celice je več različni skupin receptorjev (proteini citoskeleta (ogrodni in sidrni) organizirajo in pospešujejo prenos signalov, da držijo v eni mreži vse zunaj in znotrajcelične molekulske komponente, ki delujejo skupaj) • primeri sekundarnih obveščevalce: cAMP, cGMP, diacilglicerol • kemični signal se po vezavi hormona ojači (na celici je več receptorjev za isti hormon). Za aktivacijo 1 molekule adenilat-­‐ciklaze je potrebna vezava 1 molekule hormona à aktiviran encim katalizira sintezo mnogih cAMP à vsaka molekula cAMP sodeluje pri aktivaciji 1 molekule protein-­‐kinaze à vsaka aktivirana protein-­‐kinaza pa lahko deluje na več tarčnih encimskih molekul à to vse skupaj omogoča, da je signal ojačan več tisočkrat • hormoni se sprostijo iz žlez z notranjim izločanjem, kadar je to potrebno • obstajajo tudi modeli za deaktivacijo signalne molekule (v njih se signalna molekula razgradi ali kemično modificira)

f) Metode izolacije in karakterizacije bioloških molekul

1.) Obarjanje proteinov: • nekoč glavni način izolacije bioloških molekul • topnost molekul je odvisna od porazdelitve naboja in hidrofilnih skupin • pri obarjanju proteino pride do denaturacije, ki je lahko - reverzibilna: porušita se terciarna in kvartarna struktura proteina, celotno strukturo lahko s spremembo določenih pogojev renaturiramo - ireverzibilna: poruši se sekundarna struktura proteina, nastanejo netopni agregati • topnost uravnavamo s spremembo: pH, ionske moči raztopine, dielektrične lastnosti raztopine

2.) Centrifugiranje: • ločevanje, izoliranje proteinov • tehnika temelji na obnašanju delcev v polju centrifugalne sile • Svedbergova enačba: Mr= RTs/(D(1-­‐ vρ)) à opisuje kako se bodo po velikosti v mediju proteini razporedili R = plinska konstanta T = temperatura s = sedimentacijski koeficient D = difuzijski koeficient 9

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

v = parcialni specifični voluemn molekule ρ = gostota medija • ločimo preparativno (diferecialno, gradientno) in analitsko centrifugiranje

3.) Ultrafiltracija: • ločevanje bioloških molekul • temelji na tem, da nekatere biološke molekule lahko prehajajo preko membrane druge pa ne • pomembna je velikost por • prehod topila in bioloških molekul skozi pore polprepustne membrane pri nadtlaku

4.) Dializa: • uporaba polprepustnih membran z velikostjo por, ki so manjše od makromolekul

5.) Ionska izmenjevalna kroatografija: • ločevanje molekul glede na neto naboj, izberemo bidisi + (vežejo molekule z – neto nabojem) bodisi – nosilec (vežejo molekule z + neto nabojem)

6.) Gelska kromatografija: • ločuje molekule glede na velikost in/ali obliko • stacionarno fazo predstavla gelski nosile, ki ob stiku s topilom nabrekne in tvori gel • molekule, ki so večje od por, ne morajo prodeti v zamreženo strukturo gela, manjše kot so molekule, lažje in globje prodirajo v notranjost (potrebujemo večji elucijski pufer, da jih speremo ven iz kolone)

7.) Elektroforeza: • ločevanje analita v električnem polju • proteini se porazdelijo glede na pI, glede na svoj neto naboj • ločevanje delcev po naboju in zlasti po velikosti • proteine obdamo z detergentom à nevtraliziramo naboj à ločuje se le na podlagi velikosti

8.) Izolektrično fokusiranje: • proteini se razporedijo glede na pI

9.) Proteomika: • kombinacija elektroforeze in fokusiranja • mesebojna odvisnost in delovanje vseh proteinov v celici

10.) Afinitetna kromatografija: • interakcija med molekulo in ligandom, ki se specifično vežeta

11.) Imunske metode: • Western blot • direktna ELISA • indirektna ELISA • princip aglutinacije

10

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

3. BIOLOŠKE MOLEKULE V VODI

• predstavlja 70–85 % mase celice • v celici ima veliko različnih vlog, vpliva na strukturo in lastnosti vseh bioloških molekul • pomebna kot topilo (je topilo za večino bioloških molekul) in reaktant (hidroliza, fotosinteza) • medija za skoraj vse metabolične reakcije • uravnava T, pH zunaj celice in v celici à ima vlogo temperaturnega pufra

a) Nekovalentne vezi in interakcije pri bioloških molekulah: • vse bio. molekule so sestavljene iz elementov, ki se kovalentno povezujejo in vzpostavijo C-­‐C, C-­‐H, C-­‐O, C-­‐N in druge močne vezi. Atomi se povežejo v molekule, molekule pa se z šibkimi interakcijami – nekovalentnimi vezmi povežejo med seboj • nekovalentne vezi: - vodikova vez: med H atomom, vezanim na nek elektronegativen atom, in drugim elektronegativni atomom, med nenabitimi skupinami, med atomi, ki so vkjučeni v peptidno vez - Van der Waalsove: med molekulami s stalnimi ali induciranimi začasnimi dipoli, ki so posledica gibanja e-­‐ - ionske: interakcije med nabitimi atomi ali skupinami - hidrofobne: prisotnost vode sili nepolarne molekule, da se uredijo in izognejo stiku z vodo

b) Lastnosti nekovalentnih vezi: • molekule lahko specifično prepoznavajo (molekulsko prepoznavanje – pogosto gre za interakcijo med ligandom in makromolekulo) druge molekule in se z njimi povezujejo

c) Struktura vode: • kot med H atomoma je 104,5⁰ • O atom je 1,5x bolj elektronegativen od H-­‐ja, zato e-­‐ niso enakomerno porazdeljeni (O atom močneje privlači e-­‐ in ima prebitek – naboja à δ-­‐, H atoma pa ostaneta delno + nabita à δ+) • navzven je električno nevtralna (ni neto naboja) • ima velik dipolni moment (zaradi lege vodikovih atomov v vodi) • molekule H2O se lahko povežejo druga z drugo zaradi privlaka med + repom (H) in – glavo (O) à nastane vodikova vez, vodikova vez je najmočnejša, ko so vsi 3 atomi v liniji (α = 180⁰) • funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri nastanku vodikove vezi, vključujejo: - hidroksilno skupino: alkoholov, org. kislin - karbonilno skupino: aldehidov, ketonov, kislin, amidov in estrov - N-­‐H skupine aminov in amidov

d) Fizikalne lastnosti vode: • ima višje vrelišče, tališče in viskoznost kot hidridi ostalih nekovin (posledica visoke notranje kohezivnosti vode ali težnje vodnih molekul, da ostanejo skupaj zaradi velikega števila vodikovih vezi) • vsaka molekula vode se teoretično preko vodikove vezi poveže s 4 sosednjimi molekulami vode (povprečno število vodikovih vezi na molekulo vode je pri 10 ⁰C 3 à število pada z naraščajočo T) 11

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

• vodikove vezi v ledu omogočajo nastanek kristalne mreže e) Voda kot topilo: • v vodi so dobro topne polarne (ionske in nenabite) snovi • veliko nenabitih bio. molekul se v vodi dobro topi, ker imajo polarne funkcionale skupine, ki lahko vstopajo v ugodne dipol-­‐dipol interakcije • hidrofilne spojine (polarne ali ionske) – spojine, ki so topne v vodi • vse substance, ki vsebujejo polarne skupine, niso nujno topne v vodi, tiste z dolgimi alkilnim delom (več kot 4 C atomi) so slabo topne, razen če ne vsebujejo ionske ali več polarnih skupin • ionske skupine so topne v vodi, ker posamezni ioni solvatirajo – hidratirajo s polarnimi H2O • spojine se raztapljajo v vodi zaradi: - dipol-­‐dipol interakcij (H atom z delnim presežkom + naboja v molekuli H2O ali alkohola privlačijo O atom ali alkohol) - ion-­‐dipol interakcija • makromolekule (proteini, NK, lipidi, nekateri OH) so pri in vivo razmerah v obliki hidratiranih ionov • nepolarne skupine običajno niso topne v vodi, nimajo ionskih in polarnih skupin, ki bi vstopale v ugodne interakcije z vodo à so hidrofobne • nekatere pomembne biološke molekule so amfiflne (v svoji strukturi imajo hidrofilni in hidrofobni del) à ko te molekule prenesemo v vodo, ne dobimo prave raztopine, temveč se združjejo v agregate = micele: - hidrofobni del se izogne stiku z H2O, tako da se nepolarni repi pomaknejo v notranjost agregatov, kjer ni H2O à povezovanje nepolarnih repov znotraj micela je definirano kot hidrofobna interakcija in je energetsko boj ugodna - površina micelov pa je zgrajena iz polarnih glav (hidrofilni del), ki so stabilizirane z elektrostatskimi interakcijami z ioni alkalijskih kovin in H2O - micelne raztopine so mila, ki v vodi raztapljajo olja in masti (ujamejo olja v nepolarna območja micelov in istočasno ostanejo razpršena v H2O zaradi hidracije ionskih skupin) - oblikovanje micelov ima kjučen pomen pri nastanku bioloških membran - amfifilne molekule: soli karboksilnih kislin z dolgimi alkilnimi verigami, nekateri lipidi, proteini, NK - zaradi amfifilnosti se bodo molekule proteinov lahko vključile v fosfolipidni dvosloj à receptorji (zunaj celice je aminski konec, v citoplazmi pa karbonilni)

f) Ionizacija vode: • najpomembnejša reakcija vode je reverzibilna disociacija ali ionizacija molekule H2O: H2O ↔ H+ + OH-­‐ K = [H+][OH-­‐]/[H2O] • K je ravnotežna konstanta za reakcijo, K za čisto H2O pri 25 ⁰C je 1,8*10-­‐16 M (vrednost za [H2O] ocenimo tako, da maso 1 l H2O delimo z molsko maso • [H2O] = 55,5 M • vsaka sprememba pH za eno enoto pomeni 10x spremembo [H+] (raztopina s pH 7 ima 10x večjo konc. [H+] kot raztopina s pH 8)

12

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

g) pH in pK • kisline in baze spremenijo ionske lastnosti raztopin • kisline so spojine, ki vodni raztopini oddajo proton (H+), baze pa so spojine, ki sprejmejo proton: HA ↔ H+ + A-­‐ • HA in A-­‐ sta par konjugirane kisline – konjugirane baze • jakost kisline (merilo za njeno težnjo, da odda proton) določimo iz vrednosti konstante disociacije: - čim večja je Ka, tem močnejša in tem bolj disociirana je kislina • pKa vrednost je kvantitativno merilo za jakost kislin: (pKa à od 12 do 13) - nižji pKa pomeni močnejšo kislino! (ravno obratno kot Ka)

h) Trituracijske krivulje: • diagram, ki kaže odvisnost pH od V dodane baze • pKa eksperimentalno določimo z trituracijo (dodajamo bazo v vzorec kisline, ki je raztopljena v vodi, ter merimo spremembo pH)

-

začetni pH, preden dodamo bazo, lahko uporabimo za izračun konc. H+ v raztopini CH3COOH je delno disociirana, večina molekul kisline pred trituracijo je v obliki CH3COOH krivulja ima prevoj na sredini, tam kjer dodamo 0,5 mola baze na vsak mol prisotne kisline (tu disociira polovica molekul CH3COOH à nedisociirane oblike CH3COOH je toliko kot konjugirane baze CH3COO-­‐) à pH = pKa

13

FARMACEVTSKA Â BIOKEMIJA Â

v  konÄ?ni  toÄ?ki  dodamo  1  mol  baze  na  1  mol  kisline  in  reagirata  enaki  koliÄ?ini  ocetne  kisline  in  baze Â Ă ďƒ Â skoraj  vse  molekule  CH3COOH  so  v  disociiranem  stanju  CH3COO-­â€?Na+  ekvivalentna  toÄ?ka  =  mnoĹžina  standardne  raztopine  enaka  mnoĹžini  snovi,  s  katero  reagira  moÄ?na  kislina+  moÄ?no  bazo:  - pred  ekvivalentno  toÄ?ko:  [H3O+]  =  (nkisline  –  nbaze)/Vskupen  - v  ekvivalentni  toÄ?ki:  nkisline  =  nbaze  ,  pH  =  7  - po  ekvivalentni  toÄ?ki:  [OH-­â€?]  =  (nbaze  –  nkisline)/Vskupen  ťibka  kislina  +  moÄ?na  baza:  - zaÄ?etek  titracije:  [H3O+]  =  √(đ??žđ?‘Ž  đ?‘?đ?‘Ž)  - do  ekvivalente  toÄ?ke:  kisline  vedno  manj,  soli  vedno  veÄ?  =  PUFRSKO  OBMOÄŒJE!  [H3O+]  =  ca/cs  *  Ka  ca  =  (na-­â€?  nb)/Vsk  cs  =  nb/Vsk  - ekvivalentna  toÄ?ka:  sol  (raztopina  v  ekvivalentni  toÄ?ki  reagira  baziÄ?no)  [H3O+]  =  đ??žđ?‘¤đ??žđ?‘Ž/đ?‘?đ?‘  pH  =  7  +  0,5pKa  +  logcs  - po  ekvivalentni  toÄ?ki:  prebitek  baze  [OH-­â€?]  =  nprebitek  NaOH/V  - pH  se  spreminja  skladno  z  Henderson-­â€?Hasselbachovo  enaÄ?bo  veÄ?bazne  kisline:  - disociacija  v  veÄ?  stopnjah  - Ä?e  poteÄ?e  v  3  stopnjah Â Ă ďƒ Â 3  ekvivalentne  toÄ?ke  - primer  za  H3PO4  +  NaOH:  1) pred  titracijo:  [H3O+]  =  đ??ž1đ?‘?đ?‘˜  (ker  je  H3PO4  ťibka  kislina)  2) do  ekvivalentne  toÄ?ke:  pufer  (H3PO4  –  kislina  in  NaH2PO4  –  njena  sol)  [H3O+]=K1(ca/cs)  3) 1.  ekvivalentna  toÄ?ka  (kisla  sol  NaH2PO4):  [H3O+]  =  đ??ž1đ??ž2  4) primarna  sol  preide  v  sekundarno  (vedno  manj  NaH2PO4  –  kislina  in  vedno  veÄ?  NaH2PO4)  –  pufer:  [H3O+]  =  K2(ca/cs)  5) 2.  ekvivalentna  toÄ?ka:  [H3O+]  =  đ??ž2đ??ž3  6) sekudarna  sol  gre  v  terciarno  sol:  [H3O+]  =  K3(ca/cs)  7) 3.  ekvivalentna  toÄ?ka:  [H3O+]  =  đ??žđ?‘¤đ??žđ?‘Ž/đ?‘?đ?‘  8) po  ekvivalentni  toÄ?ki  –  prebitek  NaOH:  [OH-­â€?]  =  nprebitek  NaOH/V  pri  trituracijah  uporabimo  indikator,  ki  ima  barvni  preskok  v  ekvivalentni  toÄ?ki  titriranega  vzorca  pKaindikator  =  pHv  ekvivalentni  toÄ?ki  (metilvijoliÄ?no,  timolmodro,  metiloranĹžno,  metilrdeÄ?e Â Ă ďƒ Â kislo,  bromtimolmodro,  fenolftalein Â Ă ďƒ Â baziÄ?no)  -

• •

•

•

•

      14  Â

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

Biokemijsko pomembne kisline:

i)

Henderson-­‐Hasselbalchova enačba: • možno je izračunati konc. kisline in njene konjugirane baze v vsaki točki titracijske krivulje:

j)

Pufrski sistemi: • biološke molekule delujejo le v usteznem ionskem stanju à biti morajo v ustreznih vodnih pufrskih sistemih • pH krvne plazme lahk niha le med +/-­‐ 0,2 • na spremembo pH so zelo občutljivi encimi • kri ohranja konstanten pH, ker vsebuje pufre (nevtralizirajo dodano kislino/bazo) • pufrski sistemi (kislinsko-­‐bazni konjugirani pari) se upirajo spremembi pH po dodatku H+ ali OH-­‐ • najbolj učinkovito pufrsko območje za konjugiran par kislina-­‐baza je okolica prevojne točke, kjer je pH=pKa (konc. kisline = konc. baze) • učinkovito pufrsko območje pH = pKa +/-­‐ 1 15

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

•

• •

•

•

glavni pufrski sistem v krvi in drugih zunajceličnih tekočinah je konjugiran par ogljikova kislina-­‐bikarbonat:

tudi Hb deluje kot pufrski sistem acidoza – vrednost pH v krvi se zniža (povečana [H+] à motnja v metabolizmu ali dihanju) à pride do ketoze à prekomerni nastanek ketonskih teles (so kisla), zvišajo konc. [H+] v krvi. Boleznska stanja, povezana z acidozo: diabetes, stradanje, emfizem, astma.

- respiratorna acidoza à visoka konc. CO2 v pljučih alkaloza – vrednost pH se zviša à povzroči jo hiperventilacija, pretirana uporaba nekaterih soli, histerija, stres - respiratona alkaloza à nizka konc. CO2 v pljučih CO2 nam dodatno uravnava pH, skrbi za dodatno pufrsko kapaciteto bikarbonatnega pufra

16

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

4. AMINOKISLINE, PEPTIDI, PROTEINI

• peptidi so tisti »proteini«, ki so krajši (50–60 AK), daljši so proteini • proteini so biološki polimeri aminokislin (iz 20 AK) • strukturo vsakega proteina določa njegovo zaporedje AK, ki je zapiseno v genih • proteomika = veda, ki se ukvarja z vsem, kar je v zvezi s proteini • protein je lahko sestavljen iz 1 ali večih polipeptidnih verig • kombinacije zaporedja AK določajo lastnosti polipeptidne verige

a) Aminokisline in proteini

1.) Lastnosti AK: • vsaka spojina, ki ima vsaj eno karboksilno kislino (-­‐COOH) in vsaj eno aminsko skupino (-­‐NH2) • 20 AK genetsko kodiranih za vgradnjo v proteine • značilna zgradba: na centralni C atom (α-­‐ogljik) so vezani H atom, COOH skupina, -­‐ NH2 skupina in stranska veriga (R) à funkcionalne skupine so vezane na α-­‐ogljik, te AK pogosto imenujemo α-­‐AK • R določa kem. in bio. lastnosti • α-­‐ogljik predstavlja kiralni center (z izjemo glicina R=H): - ima 2 stereoizomera = enantiomera à D in L AK (zrcalni sliki drug drugega) - raztopine čistih stereoizomerov so optično aktivne - v proteine se vgrajujejo le L-­‐izomeri • vseh 20 α-­‐AK je v čisti obliki bele kristalinične snovi z visokem tališčem, topne v H2O, netopne v org. topilih, v vodni raztopini prevajajo el. tok • pri fiziolškem pH = 7,4 so v dipolarni ionski obliki (so istočasno + in – nabite) = ion dvojček – zwitterion • na AK sta 2 skupini, ki lahko oddata proton: - karbosilna pKa = 2,3 - aminska pKa = 9,7 • ko je stranska veriga (R) brez naboja je neto naboj na celotni molekuli pri nevtralnem pH 0 • è prevladuje v kislem območju pH è ko dodamo bazo najprej reagira bolj kisla skupina in nastane ion dvojček è ima 2 prevojni točki, kjer je pH = pKa - disociacija p+ iz COOH - disociacija p+ iz NH3+ •

17

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

2.) Razvrstitev AK: • trituracijska krivulja alanina (je dvostopenjska, AK so lahko tudi triprotonične, poliprotonične):

• na osnovi preučevanja lastnosti R skupine se je izkazalo, da jih lahko glede na njihovo polarnost razdelimo v več razredov: I. AK z nepolarnimi stranskimi verigami (nepolarne): - vsebujejo aromatske/alifatske R, ki jim dajejo hidrofobni značaj - v proteinih jih najpogosteje najdemo v notranjosti - glicin, alanin, valin, levcin, izolevcin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan II. AK s polarnimi, nenabitimi stranskimi verigami pri fizio. pH: - značilnost je prisotnost heteroatoma (N,O,S) à omogočajo nastanek H vezi z molekulo H2O ali katero drugo - serin, cistein (ima tiolno skupino –SH, ki se v oksidativnih razmerah poveže s –SH skupino drugega cisteina in nastane disulfidna vez, ki ima velik pomen pri stabilizaciji 3D strukture proteina), treonin, tirozin, asparagin, glutamin III. AK s polarnimi, nabitimi R pri fizio. pH: - stranske verige imajo funkcionalne skupine z bazičnimi ali kislimi lastnostmi - aspartat, glutamat, lizin, arginin, histidin - aspartat in glutamat imata pri fizio. pH negativni naboj (COOH odda H+) - lizin in arginin imata na stranski verigah pripeto aminsko/gvanidinsko pri fizio. pH sta + nabita - histidin vsebuje imidazol, ki ima pKa blizu fizio. pH in je zato pretežno v zwitterionski obliki • nepolarne AK z alifatsko str. skupino:

• AK z aromatsko str. skupino:

• polarne AK z nenabito str. verigo:

• AK z negativno nabito str. verigo:

18

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

•

AK z pozitvno nabito str. skupino:

3.) Reaktivnost in analiza AK: • kemična reaktivnost AK je odvisna od funkcionalne skupine (R) • titracijske krivulje AK z polarnimi nabitimi str. skupinami imajo 3 prevojne točke, določajo 3 pKa vrednosti: - pK1 à α-­‐karboksilna skupina - pK2 à α-­‐aminska skupina - pKR à ionizirajoča skupina na R • druge reakcije: - karboksilne skupine vstopajo v rekacije, v katerih nastanejo estri ali amidi, aminska skupina se lahko veže na amid - OH skupina na stranski verigi serina reagira s kislinami in tvori estre - karboksilna skupina ene AK reagira z amino skupino druge AK in nastane amidna oz. peptidna vez • za identifikacijo, separacijo in kvantitativno določanje AK uporabljamo kromatografkse tehnike • s HPLC (tekočinska kromatografija visoke ločljivosti) in kombinacijo ionske izmenjevalne krom., ločujemo AK na osnovi različnih ionskih nabojev • ninhidrin reagira z AK, pri čemer se razvije vijolično obarvanje, izjema je prolin (rumeno obarvanje) • Sangerjev reagent, fluoreskamin in danzilklorid (fluorescenten produkt) à reagira z AK in peptidi • Edmanovo degredacija – določanje aminokislinskega zaporedja: - reagent fenilizotiocianat se veže na prosto aminsko skupino - 1 AK se odcepi in se ciklizira - še enkrat dobimo po korakih odcepljanja aminokisline - problem: če so aminske skupine na stranskih skupinah (te je treba zablokirati), ne gre v nedogled, ker se pri vsakem koraku pojavijo stranski ? à le za kratke proteine

b) Polipeptidi in proteini: • 2 α-­‐AK se povežeta z amidno = peptidno vezjo v reakciji kondenzacije (izstopi voda) • spojita se karboskilna skupina ene AK in aminska skupina druge AK à nastane dipeptid • AK ostanek = to kar ostane od AK, potem, ko se ta vgradi v polipeptid (10–100 AK) • proteini nad 80–100 AK, obstaja več proteinov kot genov • na polipeptidni verigi sta vedno prisotna: - aminski N-­‐konec - karboksilni C-­‐konec - zapis in oštevilčenje AK v peptidu se začne vedno iz aminskega konca in gre v smeri proti karboksilnemu • pri nastanku peptidne verige se spremenijo lastnosti α-­‐aminskih in α-­‐karboksilnih skupin vstopajočih AK (razen tistih na -­‐N in -­‐C koncih) lastnosti R so nespremenjene • cepitev peptidnih vezi je ena najpomembnejših reakcij à izvedemo jo s kislinsko, bazično ali encimsko katalizirano hidrolizo (produkt so proste AK) • fiziološka razgradnja proteinov, ki jih pridobimo iz hrane se odvija v želodcu in črevesju ob delovanju peptidaz oz. proteaz (katalizirajo hidrolizo peptidnih vezi, sprostijo se AK) 19

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

c) Delovanje proteinov: Razvrstitev glede na biološko vlogo: 1.) Encimi: • biološki katalizatorji • ločimo 6 razredov encimov: - oksidoreduktaze: prenos elektronov, navadno v obliki hidridnih ionov ali vodikovih atomov - transferaze: prenos funkcionalnih skupin z ene molekule na drugo - hidrolaze: razcep vezi s hidrolizo - liaze: nastanek dvojnih vezi z odvzemom skupin ali adicije skupin na dvojne vezi - izomeraze: pretvorba enega izomera v drugega s prenosom skupin znotraj molekule - ligaze: z razgradnjo ATP tvorijo kovalentne vezi • fosfofruktokinaza: katalizira prenos fosforilne skupine z ATP na fruktoza-­‐6-­‐fosfat; sodeluje v procesu glikolize pri metabolizmu OH • citrat-­‐sintaza: v pocesu citratnega ciklusa poveže acetil-­‐CoA in oksaloacetat, nastane citrat • tripsin: katalizira hidrolizo proteinov • ribonukleaza: katalizira hidrolizo RNA • RNA-­‐polimeraza: katalizira sintezo RNA, ki jo usmerja DNA • reverzna transkriptaza: katalizira sintezo DNA, ki jo usmerja RNA (virusi)

2.) Strukturni proteini: • številni protenini v celicah namenjeni so mehanski upori • kolagen, elastin, keratin

3.) Obrambni proteini: • selektivno se vežejo na tujke, jih nevtralizirajo in izničijo njihov škodljiv učinek • protitelesa, interferoni (ovirajo podvojevanje virusov)

4.) Transportni in skladiščni proteini: • hemoglobin = globularni protein, vsebuje hem, ki nosi O2 • lipoproteini = za prenos v vodi praktično netopnih biomolekul • albumin, globulin = nosita slabo topne maščobne kisline • kazein = vir AK za mladiče sesalcev • mioglobin = vsebuje hem

5.) Regulatorni in receptorski proteini: • uravnavajo celične in fiziološke aktivnosti • receptorski proteini so vgrajeni v membrane, posredujejo pri prenosu živčnih impulzov in hormonskem signaliziranju • inzulin = izloča se pri povečanih konc. glukoze v krvi • glukagon = izloča se pri zmanjšani konc. glukoze v krvi

6.) Gibalni proteini in proteini, ki omogočajo krčenje mišic: • aktin, miozin, dinein

d) Velikost, sestava in lastnosti proteinov: • sekvenca vsakega proteina je zapisana v genu, torej je del DNA (vse molekule istega proteina bodo imele identično AK sestavo in zaporedje) 20

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

monomerni proteini = zgrejeni so iz 1 polipeptidne verige (citokrom c) oligoproteini = kompleksnejiši, so iz 2 ali več polipetidnih verig (polipetidne verige so povezane z nekovalentnimi interakcijami) • enostavni proteini = sestavljeni so le iz AK ostankov (tripsin) • konjugirani proteini = v svoji strukturi imajo dodatno komponento à prostetično skupino (npr. majhna organska molekula) • fizikalne lastnosti proteinov so odvisne od narave stranskih verig na AK ostankih • pri fiziol. pH določimo električni naboj na proteinu s seštevanjem vseh nabojev na stranskih verigah ( + naboj na N-­‐koncu in – na C-­‐koncu se izničita) à celokupni naboj je pomemben pri elektroforezi in raztapljanju proteinov • na osnovi topnosti in oblike jih razdelimo na: - fibrilarni: netopni, dajejo celici čvrstost in trdnost, AK z nepolarnimi ostanki, urejena in toga konformacija - globularni: večinoma so topni, transport, imunska zaščita in kataliza, raztopljeni so v bioloških tekočinah (kri, citosol), dinamični in fleksibilni, 3D zgradba je urejena

e) 4 ravni proteinske strukture: • nativna konformacija = točno določena 3D struktura, opišemo jo z sekundarno, terciarni in kvartarno ravnjo organizacije • zgradbo proteinov opisujemo na 4 ravneh: 1) primarna struktura = zaporedje AK ostankov v proteinu, ki so med seboj povezani z kovalentno vezjo (zaporedje v proteinu je izpeljano iz zaporedja nukleotidov v mRNA à predstavlja prepis zaporedja nukleotidov, ki so v DNA). Določimo jo z uporabo Edmanovega reagenta, ki označi AK konec, ali pa ga izpeljemo iz nukleotidnega zaporedja gena, ki kodira protein.

2) sekudarna struktura = zviti, krajši predeli primarne strukture, vsebuje ponavljajoče se elemente, kot sta α-­‐vijačnica β-­‐struktura 3) terciarna struktura = elementi sekundarnih struktur se povezujejo med seboj in zvijejo v globularno enoto, podaja popolno tridimenzionalno ureditev v prostoru 4) kvartarna struktura = povezuje 2 ali več polipeptidnih verig v funkcionalen protein z več podenotami • na zvijanje proteinov ima najpomemebnejši vpliv AK sestava in AK zaporedje (primarna struktura)

• •

21

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

5. 3D STRUKTURA PROTEINOV IN NJIHOVA BIOLOŠKA VLOGA

a) Osnovne zgradbe proteinov

1.) Vpliv primarne strukture: • z rentgensko difrakcijo in analizo s pomočjo jedrske magnetne resonance določajo 3D strukture proteinom • na 3D struturo ima odločujoč vpliv primarna struktura (na 1. stopnji analize proteinov nanatančno določijo AK zaporedje) à določene AK in njihovo zaporedje favorizirajo nastanek specifičnih sekundarnih, terciranih in kvartarnih struktur • odločilne pri zgradbi so stranske verige • vsi proteini imajo enako kovalentno ogrodje, ki ga prestavlja polimer enot –NH-­‐ CH(R)-­‐CO-­‐, razlike so le v R • medsebojni vpliv R je lahko zelo močan àse dobro vidi pri globularnih proteinih (predvsem v njihovi naravni težnji k zvijanju v vodnem mediju, kjer se nepolarni AK ostanki zložijo v hidrofobno jedro, hidrofilno površino pa tvorijo polarni AK ostanki à taka ureditev skrije nepolarne AK ostanke v notranjost strukture in jih zaščiti pred vodo, istočasno pa omogoči stik z vodo polarnim in nabitim ostankom na površini à število stabilizirajočih interakcij med proteinom in vodo je max.)

2.) Nekovalentne interakcije: • naslednji zelo pomemben dejavnik v proteinski strukturi so šibke nekovalnetne interakcije, ki predstavljajo najpomembnejše stabilizirajoče sile v proteinu • posledica zvitja proteinov iz naključnega klobčiča (razvito stanje) v visoko organizirano strukturo je veliko znižanje konformacijske entropije • nativna konformacija je bolj urejena konformacija vendar ni termodinamično manj ugodna, ker zmanjšanje entropije zagotovijo: - vodikove vezi (med atomi AK ostankov / med atomi AK ostankov in vodo) - hidrofobne interakcije (med AK z nepolarnimi stranskimi verigami in osrednjega dela izločijo vodo) - ionske interakcije - Van der Waalsove vezi • za sek. in terciarno strukturo so najpomembnejše vodikove vezi, hidrofobne in ionske interakcije

3.) Zgradba peptidne vezi: • peptidna vez je toga struktura • skupine ob tej vezi so v proteinih zaklenjene v TRANS-­‐ konformaciji (H atom iz amidnega dušika in O atom karbonilne skupine sta na nasportnih straneh) • vse 4 atomi, ki so vključeni v peptidno vez, ležijo v isti ravnini (njihove p orbitale se lahko prekrivajo, vezi med N in C ter med C in O imajo tako delni značaj dvojne vezi) à zato je vrtljivost okrog amdine vezi (vez med C in N) omejena à atomi, ki so vključeni v peptidno vez, tvorijo planarno enoto, imenovano amidna ravnina à povezavi med amidno ravnino in obema α-­‐C pa sta prosto gibljivi • v proteinih najdemo še urejena področja = domene • od predelov s podobnim AK zaporedjem pričakujemo, da se bodo zvili v podobno ali celo identično konformacijo

b) Elementi sekundarne strukture: • pri globularnih proteinih sta glavni vrsti sekudarne strukture α-­‐vijačnice in β-­‐ struktura 22

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

1.) α-­‐vijačnica: • na videz paličasta struktura, ki tvori tesno ovito polipeptidno ogrodje, iz njega pa štrlijo stranske verige (R), strukturo stabilizirajo H vezi à H vezi se vzpostavijo med skupino N-­‐H, ki sodeluje v eni peptidni vezi in skupino C=O, ki sodeluje v drugi in je nameščena 4 AK ostanke naprej v verigi • vodikove vezi ležijo vzporedno z osjo vijačnice in omogočajo, da se polipeptidna veriga precej raztegne (raztezanje oslabi jakost H vezi) • na vsak obrat vijačnice se zvrsti 3,6 AK ostankov • vse skupine –N-­‐H in –C=O polipeptidnega ogrodja so udeležene pri vzpostavitvi H vezi • H vezi med stranskimi verigami AK ni • α-­‐vijačnica je lahka L ali D, vendar se L-­‐AK raje organizirajo v desno obliko • so različno dolge • Zakaj α-­‐vijačnice NE prevladujejo v vseh proteinih? Ker so nekatere AK ugodne za nastanek α-­‐vijačnice, medtem ko jo druge destabilizirajo.

• za stabilnost α-­‐vijačnice predstavljajo največjo omejitev interakcije med stranskimi verigami sosednjih AK (stranske verige štrlijo iz osnovnega ogrodja, če se znajdejo preblizu druga drugi se sterično ovirajo) • AK z velikimi stranskimi verigami, ki destabilizirajo α-­‐vijačnico (zmanjšajo možnost njenega nastanka): asparagin, tirozin, serin, treonin, izolevcin, cistein • podoben vpliv imajo AK z nabitimi stranskimi verigami, ki se bodo odbijale (če so blizu skupaj in imajo enak naboj) à destabilizirajo H vezi znotraj peptidnega ogrodja (lizin in glutamat preprečita nastanek α-­‐vijačnice) • α-­‐vijačnice se lahko med seboj dodatno zvijajo à supervijačnice à ojača se posamezen fibril • prolin je zaradi svoje strukture zelo neugoden za stabilnost α-­‐vijačnice (zato ker je amidni dušik vključen v obroč in ne more sodelovati pri nastanku H vezi à zaradi svoje oblike in togosti spremeni smer peptidnih verig in α-­‐vijačnico upogne) • prisotnost večjega števila glicinksih ostankov je neugodna za stabilnost α-­‐vijačnice, večja je verjetnost, da bo glicin sodeloval pri oblikovanju druge oblike – β-­‐strukture

2.) β-­‐strukture: • polipeptidna veriga je praktično iztegnjena, H vezi pa se lahko tvorijo med predeli iste verige ali med različnimi verigami s tako konformacijo • nastane na 2 različna načina: - polipeptidne verige, ki so enako usmerjene (NàC ali CàN) sestavljajo paralerno β-­‐strukturo - če je pa smer verig nasprotna pa je ureditev antiparalelna (bolj pogosta) • glavno omejitev pri nastanku predstavlja velikost in naboj stranskih verig • proteini, ki so zgrajeni pretežno iz β-­‐struktur (npr. fibroin) vsebujejo veliko alanina in glicina ter imajo v AK zaporedju veliko ponavljajočih se vzorcev

3.) Zavoji in zanke: • naslednji pomemben element sekundarne strukture zaradi 2 razlogov: - spremenijo smer polipeptidni verigi - povezujejo predele urejenih sekundarnih struktur (α-­‐vijačnic in β-­‐struktur) • zavoj najpogosteje povezuje antiparalerne polipeptidne verige v β-­‐strukturi à β-­‐ zavoj / lasnica (iz 4AK, 1. in 4. povezuje vodikova vez, ki stabilizira strukturo) • pri zavojih imata izrazito vlogo glicin in prolin: glicin, ker je zelo fleksibilen, prolin pa zaradi svoje ciklične strukture, ki že sama po sebi sili polipeptidne verige v zavoj • zavoje uvrščamo med neurejne struture sekundarne zgradbe, ker niso ponavljajoči 23

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

široki zavoj je zanka (tvori daljši segment polipeptidne verige od 6-­‐16 AK). Tudi za njih ni značilno periodična ponavljanje.

4.) Strukturni motivi: • α-­‐vijačnica, β-­‐struktura in zavoji se povezujejo v stabilne in geometrijsko urejene strukture à nadsekudarne strukture ali motivi • v motivih se deli polipeptidne verige med seboj povežejo z ugodnimi nekovalentnimi interakcijami med stranskimi verigami • motiv αα: - α-­‐vijačnica-­‐zavoj-­‐α-­‐vijačnica - povezan s specifično biološko vlogo • motiv ββ: - β-­‐zavoj-­‐β - 2 antiparalelni verigi v β strukturi, ki ju povezuje zavoj oz. zanka • motiv grškega ključa: - 4 bližnje β verige • motiv βαβ: - 2 paralelni β-­‐strukturi se povežeta z α-­‐vijačnico - z združevanjem večjega števila βαβ nastane β-­‐sodček

Obravnavane strukturni elementi so prisotni v globularnih proteinih, medtem ko imajo fibrilarni proteini svojevrstno sekundarno strukturo: - najizrazitejši predstavnik je kolagen - ker je bogat s prolinom se ne more zviti v urejeno sekundarno strukturo, kot sta α-­‐ vijačnica oz. β-­‐struktura - 3D struktura kolagna je trojna vijačnica à verige so medseboj stabilizirane z H in kovalentnimi vezmi - askorbinska kislina = kofaktor encima, ki katalizira pretvorbo prolina v hidroksiprolin (pomankanje – skorbut)

c) Terciarna struktura proteinov:

1.) Zvijanje proteinov: • sekundarna struktura globularnega proteina določa ureditev posameznih polipeptidnih verig v motive, ti nastanejo kot posledica stabilizirajočih interakcij med AK ostanki v polipeptidni verigi • terciarna struktura opiše položaj vseh atomov v proteinu, tudi tiste na R (motivi sek. strukture se zložijo v kompaktno strukturo) • glavne sile, ki stabilizirajo terciarno strukturo: - hidrofobne interakcije (med nepolarnimi stranskimi verigami AK v osrednjem delu proteina – jedro) - pri nekaterih proteinih so poleg nekovalentnih prisotne še kovalentne disulfidne vezi • skupne značilnosti terciarnih struktur: izredna fleksibilnost, zaradi proste vrtljivosti okrog vezi, z izjemo peptidnih à omogoča številne različne konformacije v dani proteinski strukturi • temeljno načelo proteinskega zvijanja: primarna struktura določa terciarno - gre za stopenjski proces: najprej se tvorijo lokalne strukture (α-­‐vijačnica in β-­‐ struktura), ki predstavljajo jedro za zvitje (to so αα, ββ, βαβ). Preostali del strukture se zvije okoli jedra.

•

24

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

proces zvijanja je kooperativen (vsaka stopnja zvitja olajša vzpostavitev novih ugodnih inetakcij) - mnogi proteini se lahko sami zvijejo v nativne sek., ter. in kvartarne struture, nekateri pa s pomočjo à šaperonov (vežejo se na razvito ali delno zvito polipeptidno verigo in preprečujejo tiste interakcije, ki ne vodijo do nastanka biološko aktivne strukture) Šaperoni stabilizirajo interakcije, ki bi bile sicer prešibke, prekrijejo nepolarne predele razvitih proteinov in preprečijo neugodne interakcije (= so posledica začasno izpostavljenih hidrofobnih ostankov, kar vodi do agregacije in obarjanja proteinov med njegovo sintezo).

Imajo nizko substratno specifičnost (zato lahko sprejmejo številne razvite proteine). Imenujemo jih tudi proteini toplotnega stresa à pri celicah, ki so pod stresom, preprečujejo agregacijo toplotno denaturiranih polipeptidov

2.) Razvijanje proteinov: • denaturacija: - popolna izguba organizacije proteinske strukture - porušita se sekundarna in tercirana struktura proteina, primarna se ohrani (amidne vezi ostanejo), protein izgubi tudi biološko aktivnost - proteine denaturirajo org. topila, sečnina, detergenti, kisline, baze - denaturanti razbijejo nekovalentne interakcije, kovalentne vezi primarne strukture se ohranijo - kadar se proteini NE more povrniti v svojo nativno obliko, gre za ireverzibilno denaturacijo

• renaturacija = proces, ki protein pretvori iz oblike naključnega klobčiča nazaj v biološki protein. To je najboljši dokaz, da je terciarna struktura določena s primarno.

d) Kvartarna struktura proteinov

1.) Monomeri in oligomerni proteini: • monomerni proteini = zgrajeni so iz 1 polipeptidne verige • oligomerni proteini = iz 2 ali več polipeptidnih verig, ki jih imenujemo podenote • kvartartna struktura pomeni združitev več podenot v funkcionalen protein: - homotipična struktura: med seboj se povežejo identične podenote (glukoza aktivaza) - heterotipična struktura: združijo se identične podenote (hemoglobin) - posamezne podenote imajo svojo primarno, sekundarno in terciarno strukturo • kvartarna struktura določa razporeditev in položaj vsake podenote v nativni proteinski molekuli, razloži nam interakcije med podenotami (podenote se povezujejo s šibkimi nekovalentnimi interakcijami à H, ionske, Van der Waalsove, hidrofobne)

-

25

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

e) Struktura proteinov in njihova biološka vloga

1.) Hemoglobin: • glavni prenašalec O2 • sestavljen je iz 4 polipeptidnih verig in 4 hemov • ima 2α in 2β podenoti (α in β se ne nanašata na sek. strukturo, temveč označujeta različni vrsti podenot; verigi α in β imata homologno sekvenco 60 AK) • mioglobin je zelo podoben posamezni podenoti hemoglobina • preko 75 % polipeptidne je α-­‐vijačnica, med seboj se povezujejo z zavoji (mnogi od teh vsebujejo prolin) • značilnost kvartarne strukture hemoglobina je to, da so vse 4 polipeptidne verige so tetraedrično razporejene (pri stabilizaciji kvarterne strukture imajo pomembno vlogo hidrofobne interakcije, ionske povezave) • med vezavo in sproščanjem O2 se zgodijo majhne konformacijske spremembe, te pa povzročijo večje konf. spremembe, to se pa odraža v spremenjeni afiniteti do O2 • HEM je prostetična skupina (te so namenjen vezavi O2) in se veže z vsako od polipeptidnih verig v Hb: - nameščen je v režo, ki jo tvorijo pretežno hidrofobne AK in je dodatno stabilizirana s koordinacijsko kovalentno vezjo med Fe ionom in atomom N iz stranske verige histidinskega ostanka - 1 molekula Hb lahko reverzibilno veže 4 molekule O2 - Fe mora ohraniti fero-­‐stanje (Fe2+), ker feri-­‐oblika (Fe3+) ni možna vezave O2 • biološka vloga Hb je prenašanje O2 po krvi na daljše razdalje, mioglobin pa deluje lokalno, kot rezerva O2 in je prisoten v mišicah • Hb in mioglobin imata različno afiniteto do O2, oba vežeta O2 reverzibilno preko hema, vendar Hb lahko precizneje uravnava vezavo in prenos O2 • reakcija vezave O2 na Hb: vezava ene molekule O2 na prvo, ta vezava nato omogoči veliko lažjo vezavo druge molekule O2 na druga mesta à kooperativnost

2+ • Fe je v strukturi protoporfirina vezan na histidin iz α-­‐vijačnice F z koordinacijsko kovalentno vezjo à 6. koordinacijska vez Fe je namenjena vezavi O2, v odsotnosti O2 je to mesto zaščiteno s histidniskim ostankom α-­‐vijačnice • krivulji, ki prikazujeta vezavo O2 na mioglobin in Hb:

•

kooperativni efekt vezave O2 na Hb (krivulja sigmoidne oblike): - deoksi Hb (Hb brez O2) ima zelo majhno afiniteto do O2 - ko se na Hb veže prva molekula O2, poteče vezava 2., 3. in 4. molekule O2 z večjo afiniteto (sporočilo o vezavi 1. molekule O2 na hem se preko konformacijskih sprememb prenese do ostalih 3 molekul hema) 26

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

tudi sproščanje O2 je povezano s kooperativnim efektom (1. O2 se sprosti z nekaj truda, ostali lažje) - alosterične interakcije = konformacijske spremembe, ki se prenašajo na razdaljo (drobni premiki polipeptidnih verig) Bohrov efekt - na kooperativno vezavo O2 na Hb vplivata tudi H+ in CO2 - ko se H+ in CO2 vežeta na Hb nastanejo v kvartarni strukturi Hb spremembe, ki stabilizirajo deoksigenirano obliko Hb in destabilizirjo oksigenirano - vezava H+ in CO2 zmajša afiniteto Hb do O2 in olajša sproščanje O2 -

•

•

• • • •

Hb prenaša O2 do perifernih tkiv (mišične celice, možganske celice, celice srčne mišice): - v pljučih je parciarni tlak okoli 15 kPa (najvišji) in je posledično takrat tudi Hb najbolj nasičen z O2 (95 %) - ko mišica miruje je parcirani tlak 5kPa in nasičenost Hb pade na 75 % à Hb je sprostil O2 v mišice v metabolične namene - aktivna mišica pa ima najnižji pariciarni tlak (1–2 kPa) in Hb je najmanj nasičen (10 %) à Hb učinkovito sporšča O2 v okoljno tkivo - mišica pa pri svojih aktivnostih sprošča CO2 in H+ (odpadna produkta), ki še dodatno zmanjšata afiniteto Hb do kisika, sprosti se še nekaj dodatnega kisika à Bohrov efekt vzrok, zakaj mioglobin ni primeren za prenos O2: pri tlaku 15 kPa je 100 % nasičen, če pa se premakne na tlak 5kPa, pa bo zaradi visoke afinitete do O2 oddal le 2 % kisika vloga mioglobina je shraniti O2 le na določenih območjih kvartarna struktura Hb omogoča alosterično delovanje spremembe v primarni strukturi Hb: - HbA à splošni tip Hb (Hb odraslega), pri večini je zamenjana le 1 AK, vendar so te le redko izrazi v spremenjeni strukturi - HbS à prisoten pri obolelih z anemijo srpastih celic, deoksigenirana oblika HbS je slabo topna, zato se v eritrocitih obarja (deformira eritrocite, da postanejo srpasti) in njihovo lizo

27

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

6. ENCIMI I: REAKCIJE, KINETIKA IN INHIBICIJA

so katalizatorji biokemijskih reakcij v živih organizmih

a) Encimi kot biološki katalizatorji

1.) Uvod: • encimi lahko delujejo neodvisno od živih celic • so globularni proteini, ki za svoje nemoteno delovanje potrebujejo ohranjeno primarno, sekundarno, terciarni in kvartarno strukturo à biti morajo v nativni konformaciji • aktivacijska E = energijska bariera, ki jo morajo molekule reaktantov premagati, preden se pretvorijo v produkte. Na vrhu energijske bariere so molekule reaktanotov v prehodnem stanju (kratko živeča, visoko E oblika, enaka vrjetnost, da se pretvorijo v rektante ali pa produkte) • če želimo povečati hitrost reakcije, dvignemo T (s tem povečamo energijo reaktantov) ali pa dodamo katalizator • dodatek katalizatorja zniža aktivacijsko energijo: reakcija poteka po drugi poti z nižjo energijsko bariero, zato je hitrost reakcije večja. Pri tem se ravnotežje reakcije ne spremeni! Hitrost kemijske reakcije je obratno sorazmerna z aktivacijsko E. • lastnosti pravega katalizatorja: 1) poveča hitrost reakcije, tako da zniža aktivacijsko energijo 2) med reakcijo se ne porabi in se trajno ne spremeni 3) ne vpliva na ravnotežje reakcije, ampak le na hitrost, s katero dosežemo ravnotežje 4) z reaktani tvori začasen kompleks in tako stabilizira prehodno stanje • nekateri encimi potrebujejo za pravilno delovanje poleg proteinskega dela še kofaktor (org. ali koordinacijska spojina) ali pa kovinski ion (npr.: Zn2+, Mg2+, Cu2+) • prostetična skupina = kofaktorji oz. koencimi, ki so večinoma kovalentno vezani na protein • holoencim = celoten aktivni encim, torej protein + kofaktor • apoencim = proteinski del encima • alosterčni mesto = ni značilno za vse encime; vezava na alosterično mesto povzroči konfermacijsko spremembo v vezivnem ali aktivnem mestu encima (↑ ali ↓ aktivnost encima)

2.) Poimenovanje encimov: Encime razdelimo v 6 razredov:

28

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

1) oksidoreduktaze: prenos e-­‐, navadno v obliki hidridnih ionov ali vodikovih atomov 2) transferaze: prenos funkcionalnih skupin z ene molekule na drugo (DNA polimeraza) 3) hidrolaze: razcep vezi z hidrolizo (acetil holin esteraza) 4) liaze: nastanek dvojne vezi z odvzemom skupin ali adicij skupin na dvojne vezi (karboanhidraza) 5) izomeraze: pretvorba enega izomera v drugega s prenosom skupin znotraj molekule 6) ligaze: z razgradnjo ATP sklopljen nastanek vezi C-­‐C, C-­‐S, C-­‐O in C-­‐N (piruvat karboksilaza)

b) Kinetične lastnosti encimov

1.) Michaellis-­‐Mentenova enačba:

• Michaelis-­‐Mentenovo enačba:

POTREBNO ZNATI IZPELJAVO!

•

Michaelis-­‐Mentenova krivulja: - [S] << Km à graf je premica, saj je v0 = vmax [S]/Km - [S] = Km à v0 = ½ vmax - [S] >> Km à v0 = vmax

29

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

2.) Linearizacija Michaellis-­‐Mentenove enačbe: • Lineweaver –Burkova linearizacija:

•

Eadie-­‐Hofsteejeva metoda:

•

Hanesova metoda:

3.) Značilnosti encimskih reakcij: Na encimsko aktivnost vplivajo: 1) konc. encima: začetna hitrost je premosorazmerna s konc. encima, če T, pH in konc. substrata ostanejo nespremenjeni 2) pH: pH medija vpliva na več načinov - sprememba naboja na stranskih verigah AK, ki sestavljajo aktivno mesto encima, lahko spremeni afiniteto encima za vezavo in pretvorbo substrata - sprememba naboja na skupinah, ki niso udeležene pri katalizi, pa spremeni ionske interakcije, ki so potrebene za stabilizacijo aktivne oblike encima

30

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

pH vpliva na hitrost reakcije (v0, vmax), afiniteto encima do substrata (KM) in odbojnost encima (visok ali prenizek pH lahko ireverzibilno denaturira encim à konc. aktivnega encima se zmanjša) 3) T: zaradi proteinske narave so aktivni le v ozkem T intervalu, T vpliva na: - stabilnost encima - konstante hitrosti reakcij - na stopnjo ionizacije skupin, ki sodelujejo pri reakciji (katalizi) - Toptimum= 25–50 ⁰C 4) efektorji (modulatorji) encimskega delovanja: so snovi, ki povečajo (aktivatorji) ali zmanjšajo (inhbitorji) hitrost encimsko katalizirane reakcije s tem, da se vežejo na substrat, encim ali encimski kompleks (ES) 5) konc. substrata

• vsi encimi NE kažejo značilnosti Michaelis-­‐Mentenove kinetike (hiperbolične krivulje hitrosti), drugače se obnašajo alosterični encimi: - uvrščamo jih med regulatorne encime - v celici so odgovorni za katalizo ter tudi za uravnavanje hitrosti metaboličnih procesov - običajno so večji in so sestavljeni iz 2 ali več podenot - njihova aktivnost je odvisna od enakih dejavnikov kot aktivnost neregulatornih encimov - lahko kažejo še kooperativne pojave pri vezavi S in/ali drugih vrst molekul à modulatorji ali efektorji

c) Vezava substrata in delovanje encimov

1.) Aktivno mesto encima: • encimska kataliza se prične z vezavo substrata na encim, nastane kompleks ES • molekula substrata je običajno manjša od molekul encima • substrat se veže na aktivno mesto • aktivno mesto = žep ali vdolbina v 3D strukturi encima, kjer poteka kataliza • vsaka encimska molekula ima majhno število aktivnih mest, navadno ne več kot 1 na vsaki podenoti • v celici je konc. molekul substrata >> konc. molekul encima, zato morajo posamezne molekule substrata počakati, da pridejo na vrsto za vezavo v aktivnem mestu in pretvorbo v produkt. Tako pride do učinka nasičenja, ki ga odseva Michaelis-­‐Mentenova krivulja: omejeno št. aktivnih mest lahko pretvarja substrat v produkt le z omejeno vmax, zato povečanje konc. substrata ne vpliva več na reakcijsko hitrost.

• lastnosti aktivnega mesta: 1) aktivno mesto je specifično à izmed množice substratov prepozna le nekatere - oblika aktivnega mesta encima je skoraj zrcalna slika substrata - ločimo 2 vrsti sprecifičnosti: § absolutna à katalizirajo pretvorbo le ene vrste molekul, razlikujejo med D in L izomerom substrata § skupinska à delujejo na veliko število podobnih substratov 2) aktivno mesto je majhno 3D področje v stukturi encima 3) substrat se veže na aktivno mesto s šibkimi nekovalentnimi reverzibilnimi interakcijami: - hidrofobne, ionske, vodikove - funkcionalne skupine encima so v tesnem stiku s substratom in omogočajo vzpostavitev interakcij, ki držijo substrat v pravilnem zaporedju -

31

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

•

•

2.)

• • •

3.)

• •

4.)

• • d) 1.)

•

•

model inducirane prilagoditve: - nadomesti teorijo ključa in ključavnice, ki predvideva, da je aktivno mesto toga struktura, pa ni!

- aktivno mesto je v času odsotnosti substrata precej nedoločno področje - vezava substrata inducira točno določene konformacijske spremembe v proteinski zgradbi in še posebno v okolici aktivnega mesta, ki zavzame dokončno zgradbo šele, ko je substrat nanj popolnoma vezan ko je substrat pravilno vezan v aktivno mesto prevzame strukturo prehodnega stanja v reakciji à model analoga prehodnega stanja (encim olajša nastanek visokoenergijskega prehodnega stanja in ga stabilizira)

Kislinsko-­‐bazična kataliza: mnoge reakcije, ki vključujo prenos p+, katalizirajo kisline in baze funkcionalne skupine v aktivnem mestu encima lahko delujejo kot kisline ali baze, ki pomagajo pri prenosu p+ in s tem olajšajo razcep vezi kisle ali bazične funkcionalne skupine so v aktivnem mestu encima usmerjene tako, da vstopajo v ugodne interakcije s substratom (substrat se nahaja ob donorjih ter akceptorjih p+ à olajša prenos p+)

Kataliza s pomočjo kovinskega iona: ioni alkalijskih kovin à Na+, K+ in ioni prehodnih kovin à Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Ni2+ ti ioni lahko pomagajo pri encimskih reakcijah na 3 načine: 1) držijo substrat v pravilni usmeritvi s pomočjo koordinacijskih kovalentnih vezi 2) pospešijo reakcijo s polarizacijo vezi ali pa stabilizirajo – intermediat 3) sodelujejo pri oksoreducijskih reakcijah z reverzibilnim prenosom e-­‐ med kov. ioni in substratom

Kovalenta kataliza: nukleofilna funkcionalna skupina na encimu se kovalentno poveže s substratom à nastane začasni, izredno reaktiven intermediat značilna za serinske proteaze à katalizirajo razcep peptidne vezi

Inhibicija encimov:

Reverzibilni in ireverzibilni inhibitorji: ireverzibilni inhibitorji: - povežejo se z encimom s kovalentnimi ali zelo močnimi nekovalentnimi vezmi - vežejo se na funkcionalno skupino AK, ki sodeluje pri vezavi substrata ali pri katalitičnem delovanju - permanentno inaktivirajo encim à nastane kemično spremenjen encim, ki je katalitično neaktiven - na njih so še posebej občutljive AK serin, cistein in histidin - aspirin je primer ireverzibilnega inhibitorja à kovalentno modificia in inaktivira prostagladin sintetazo reverzibilni inhibitorji: - vežejo se na encim, a se lahko od njega tudi disociirajo, encim je neaktiven le, ko je nanj vezan inhibitor - vežejo se z šibkimi nekovalentnimi interakcijami - razvrščamo jih v 3 skupine: kompetitivne, nekompetitivne in akompetitivne

32

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

2.) Kompetitivna inhibicija: • kompetitiven inhibitor je podoben substratu, veže se na aktivno mesto encima • ko je vezan inhibitor, se ne more vezati substrat in obratno (se med seboj izključujeta)

kvantitativen učinek inhibicije je odvisen od: - razmerja [S] in [I] - afinitete encima za vezavo vsakega od niju • zelo visoka [S] zmanjša učinek [I], razen če je afiniteta inhibitorja za vezavo na encim veliko večja od substratove • molekula inhibitorja se ne more pretvoriti v produkt (nima tistih funkcionalnih skupin, kot jih ima substrat, na katere deluje encim • primer: kompetitivna inhibicija sukcinat dehidrogenaze (encim v citratnem ciklusu) - inhibitroji: malonat, oksalat in pirofosfat à vsi so podobni sukcinatu. Lahko se vežejo v aktivno mesto, ne morejo pa se dehidrogenirati.

-

• najučinkovitejši so analogi prehodnega stanja • pomembno je, da nima amidne vezi, ki bi se lahko hidrolitično razcepila s pomočjo encima

3.) Nekompetitivna inhibicija: • substrat in inhibitor se lahko hkrati vežeta na molekulo encima • vezava inhibitorja ne vpliva na vezavo substrata, vpliva pa na katalitično delovanje encima •

•

4.) Akompetitivna inhibicija: • dopušča vezavo substrata v aktivno mesto, a se od njega razlikuje, ker se veže na kompleks ES • inhibitor vpliva na encim le pri visokih [S], ker se ne veže na E ampak na ES • spremeni se KM in vmax

33

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

7. ENCIMI II: KOENCIMI, URAVNAVANJE, ABCIMI IN RIBOCIMI

Načini uravnavanja encimov: 1) alosterične inhibicije 2) kovalentne interakcije 3) preko izoencimov 4) proteolitična aktivacija 5) prisotnost koencimov, kovinskih ionov

a) Koencimi, sodelavci encimov

1.) Vitamini in koencimi: • pri nekaterih encimih proteinski del ne zadostuje za popolno reaktivnost, za poplno reakativnost potrebujejo še druge vrste molekul, da lahko delujejo kot encimi • pomožne strukture so običajno manjše od proteina, to so: org., koordinacijske spojine ali kovinski ioni • koencim je org. ali koordinacijska spojina, ki pomaga encimu. Lahko je vezan šibko ali močno na encim • prostetična skupina = tisti koencimi, ki so vezani kovalentno ali zelo močno nekovalentno na encim in so z njim stalno združeni. Ostali koencimi so z encimi povezani le začasno med katalizo (povezani so s šibkimi nekovalentnimi vezmi).

• skoraj vsi encimi, ki so vpleteni v oksiredukcijske reakcije potrebujejo org. ali koordinacijsko spojino ali kovinski ion, da jim pomaga pri prenosu e-­‐ • vitamini: - delimo jih na vodotopne in lipidotopne vodotopni vitamini koencim vrsta reakcije bolezen ob pomanjkanju biotin (B7) biotinilirani encimi aktivacija in dermatis prenos CO2 priridoksal (vitamin piridoksal fosfat prenos amino nerološke težave B6) skupine folna kislina (B9) tetrahidrofolat prenos skupin z anemije enim C-­‐atomom kobalamin (B12) 5,-­‐ prenos metilne perniciozna deoksiadenosilkobalamni skupine anemija L-­‐askorbinska L-­‐askorbinska kislina hidroksilacija skorbut kislina (vitamin C) - lipidotopni vitamini: A,D,E, K à so topni v maščobah (kopičijo se v maščobnem tkivu, membranah), ne vemo ali so izhodne snovi za koencime

2.) Kovine v prehrani: • ioni: Mg, Mn, Fe, Co, Cu, Ni, Mb, Zn à nujno potrebni za katalitično delovanje • imajo vlogo kofaktorjev • uvrščamo jih med esencilane elemente v sledovih •

34

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

b) Alosterični encimi • se ne obnašajo v skladu z Michaelis-­‐Mentenovo kinetiko: - ne moremo definirati Km à namesto tega uporabljamo [S], pri kateri je v0= ½ vmax • so tisti regulatorni encimi, ki jih z reverzibilno in nekovalentno vezavo nadzoruje neka regulatorna molekula • v metaboličnih zaporedjih vsaj eno stopnjo katalizira regulatorni encim, ki nadzoruje hitrost celotnega zaporedja. Na delovanje regulatornega encima vplivajo: - konc. končnega produkta - konc. prvega substrata v zaporedju - konc. katerega od intermediatov - konc. zunanjega dejavnika (npr. hormona) • pri mnogih metaboličnih zaporedjih je 1. encim v zaporedju gl. regulatorni encim, na katerega vpliva konc. izhodne spojine ali končnega produkta

1.) Pozitivni in negativni modulatorji: • modulator/efektor = biomolekula, ki vpliva na delovanje alosteričnih encimov • ločimo + (vzpodbujajo delovanje encimov) in – (inhibirajo delovanje encimov) modulatorje • se reverzibilno nekovalentno vežjo na določeno mesto v encimu • lastnosti alosteričnih encimov: - večji in kompleksnejši od nealostatičnih - imajo 2 ali več podenot - poleg katalitičnih mest imajo regulatorna mesta, na katera se specifično vežejo modulatorji • splošno načelo alosterije: vezava liganda (substrata ali modulatorja) na eno mesto, kako tudi kataliza na tem mestu, vplivata na vezavo ali katalizo na drugem mestu. Sporočila se z enega mesta na drugo prenašajo prek konformacijskih sprememb.

• vezava modulatorja spremeni konformacijo proteina • pri alosteričnih encimih se sporočilaprenašajo s konformacijskimi spremembami med vezevanimi mesti, ki so prostorsko ločena • delovanje alosteričnih encimov: - homotropična alosterična regulacija à če je substrat tudi regulator - povezava 1 molekule substrata na aktivno mesto se sporoča preko konf. sprememb in prenese na drugo aktivno mesto na drugi podenoti, kjer pride do lažje vezave substrata in potem do njegove pretvorbe - zaradi alosterije se aktivnost encima poveča à pozitivna kooperativnost, poznani pa so tudi taki alosterični encimi, pri katerih se aktivnost zaradi alosterije zmanjša à negativna kooperativnost - za kooperativnost pri vezavi in aktivnosti je značilna sigmoidna kinetika: pri majhnih [S] ostane encim v manj aktivni obliki, ko se veže več [S] pa encimska aktivnost hitro naraste • heterotropična alosterija: - α-­‐podenota vsebuje aktivno mesto in je katalitična podenota - β-­‐podenota vsebuje mesto za vezavo regulatorja in je regulatorna podenota 1) veže se specifični modulator na regulatorno mesto

35

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

2) sporočilo se preko konformacijskih sprememb prenese na katalitično mesto in povzroči povečanje/zmanjšanje aktivnosti encima, odvisno od vrste modulatorja

2.) Modeli, ki popisujejo alosterično uravnavanje: • MWC model: - encim, 2 enaki podeenoti, na vsaki 1 aktivno mesto - encim je lahko v 2 konformacijskih oblikah (obe enoti sta vedno v enaki konformacijski obliki): 1) napeta (T): majhna afiniteta do S, neaktivna oblika encima 2) sproščena (R): velika afiniteta do S, katalitično so zelo aktivni

- v odsotnosti substrata je ravnotežje v smeri TT, ko narašča konc. S se vedno več S veže na podenoti RR, substrat potiska ravnotežje v smer RR - + modulator daljša pretvorbo T v R in obliko R stabilizira - -­‐ modulator se raje veže na TT in potsika encimsko molekulo v napeto, nereaktivno stanje

• sekvenčni model: - vezava substrata na eno podenoto spremeni konformacijo v R in poveča verjetnost, da ostale enote preidejo v R - to se dogaja po stopnjah

c) Celično uravnavanje encimske aktivnosti

1.) Regulacija encimov s kovalentnimi modifikacijami: • aktivnost encima se spremeni zaradi reverzibilne kovalentene modifikacije določenih AK stranskih verig v encimu • kem. spremembe, ki spremenijo aktivnost encimov: 1) fosforilacija OH skupine serina, teronina ali tirozina 2) vezava adenozilmonofosfata (AMP) na OH skupine serina, teronina ali tirozina 3) redukcija S-­‐S vezi • kemično spreminjanje AK ostankov v encimu katalizirajo drugi encimi • vezava različnih funkcionalnih skupin in druge kemične spremembe na določenih AK ostankih povzročijo pri nekaterih encimih spremembo iz aktivne v neaktivno obliko • npr. kovalentno je uravnan encim glikogen fosforilaza (regulatorni encim, sodeluje v procesu pretvorbe glikogena v glukozo): - v reakciji, ki jo katalizira glikogen fosforilaza kinaza preide glikogen fosforilaza iz manj v bolj aktivno obliko (fosforilira se ostanek serina na podenoti glikogen fosforilaze) -

36

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

2.) Aktivacija s protolitični razcepom: • encimi se sintetizirajo v neaktivni obliki in se z kovalentno modifikacijo spremenijo v aktivno obliko • neaktivni prekurzor je cimogen (spremeni se v aktivno obliko z 1 ali več razcepitvami peptidnih vezi v njegovi strukturi, ta razcep je iireverzibilna reakcija) • s protolitičnim razcepom se uravnavajo: - prebavne peptidaze (kimotripsin, pepsin) - strjevanje krvi - inzulin • npr. kimotripsin: katalizira razgradnjo peptidne vezi na karboksilni strani velikih hidrofobnih AK à fenilalanin, tirozi, levcin

3.) Uravnavanje z izoencimi: • nekatere metabolične procese uravnavajo encimi, ki so v različnih molekulskih oblikah, te encimske oblike so izoencimi: - vse izoencimske oblike so aktivne in katalizirajo isto biokemijsko reakcijo - razlikujejo se v kinetiki (različni KM, vmax), regulatornih lastnostih (drugačni modulatrji), v obliki koencima, ki z njimi sodeluje, ali po legi v celici • v več izoencimskih oblikah je LDH à katalizira reverzibilno pretvorbo laktata v piruvat (kjučna reakcija v mišicah)

d) Usmerjena mutageneza in abcimi

1.) Usmerjena mutageneza: • spreminjamo AK zaporedje poznanih encimov in proteinov in jim spreminjamo aktivnost, specifičnost in konformacijo • načini: 1) obdelava proteina z kemičnim reagentom, ki spremenijo R AK 2) povečamo št. mutacij z ionizirajočim sevanje, UV svetlobi, mutagenimi kemikalijami 3) rekombinantna DNA à lahko spremenimo gene na katerem koli mestu

2.) Abicimi: • so protitelsa z katalitično aktivnostjo • delujejo kot antigeni, a niso toksični • temeljna razlika med encimi in protitelesi: - encimi vežejo S v obliki prehodnega stanja - protitelesa specifično vežejo antigene v osnovnem stanju

e) Ribocimi • nekatere oblike RNA delujejo kot encimi in jih imenujemo ribocimi

1.) Ribonukleaza P: • njegov substrat je vrsta neaktivnih perkurzorskih molekul tRNA • za nastanek funkcionalne tRNA je potrebno s hidrolitičnim razcepom fosfodiestrske vezi odstraniti del ribonukleotidov 37

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

RNA podenota ob pristnosti Mg katalizira hidrolizo perkurzorske tRNA obnaša se v skldau z Micaelis-­‐Mentenovo kinetiko, med reakcijo ostane v nativni terciarni strukturi, iz reakicje izstopa nespremenjena

2.) Samoizrezujoči introni RNA: • RNA cepi sama sebe, brez proteinskega katalizatorja • RNA v tem primeru ne deluje kot encim (ne more katalizirati izrezovanja več kot 1 molekule substrata)

RNA lahko katalizira: • cepitev in spajanje oligonuklotidnih substratov • cepitev fosfodiestrske vezi v DNA • cepitev RNA na določenih mestih v sekvenci • hidroliza estrov • nastanek peptidnih vezi med AK

8. OGLJIKOVI HIDRATI – ZGRADBA IN BIOLOŠKA VLOGA

• najbolj razširjene molekule • imajo ali CHO ali CO skupino in več OH skupin • poleg C, H, O imajo nekateri tudi N, S, F • funkcije: - vloga v energijskem metabolizmu: lahko se uporabljajo kot metabolično gorivo (glukoza, fruktoza) ali pa kot rezervne spojine (škrob, glikogen) - pomembni pri strukturi organizmov (pri nastajanju cel. stene, vezivnega tkiva – hrustanec) - monosaharida riboza in deoksiriboza sta del RNA oz. DNA, pomembni v katalitičnih procesih – ribocimi - če so kovalentno povezani s proteini ali kompleksnimi lipidi, lahko delujejo kot označevalci na površini celic (glikoproteini, glikolipidi) – za prepoznavanje drugih molekul

a) Monosaharidi • (CH2O)n (n = 3–7) • Imajo samo 1 aldehidno (aldoza) ali ketonsko(ketoza) skupino in več OH skupin (interakcije z vodnim okoljem, tvorba vodikovih vezi znotraj in izven verig) • n = 3: najmanjši znani OH: TRIOZE (gliceraldehid – aldehidna sk., dihidroksiaceton – keto sk.)

• gliceraldehid je enantiomer (lahko obstaja v D ali L konfiguraciji(absolutni), a v naravi je večinoma v D). Uporablja se kot standard za določevanje D ali L konfiguracije pri drugih molekulah s kiralnim centrom.

• n = 4: TETROZE: poznamo dve aldozi (eritroza in treoza) in eno ketozo (eritruloza). Imamo 2n izomer, pri čemer je n število kiralnih centrov. D in L oznaka se nanaša na stereokemijsko razporeditev substituenta ob kiralnem ogljiku, ki je najbolj oddaljen od karbonilnega C atoma.

• n=5: PENTOZE: najpogostejši sta D-­‐riboza in D-­‐2-­‐deoksiriboza (aldopentozi), ki sta komponenti RNA in DNA. • •

38

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

•

•

n = 6: HEKSOZE: aldoheksoze: D-­‐glukoza, D-­‐manoza, D-­‐galaktoza so najpogostejše. D-­‐manoza in D-­‐galaktoza se stereokemijsko razlikujeta od D-­‐ glukoze samo pri enem kiralnem centru, zato sta epimera glukoze.

Vse ketoze imajo karbonilni kisik na C2 atomu in po eno OH skupino na ostalih.

Najbolj razširjena je D-­‐fruktoza. (1.slika:D-­‐ketoze,2.:D-­‐aldoze)

b) Ciklične strukture ogljikovih hidratov • v raztopinah se nahajajo predvsem v ciklični obliki, opišemo jo z HAWORTHOVO projekcijo • obroč nastane v reakciji med karbonilno skupino na enem in OH skupino na drugem koncu molekule. Dobimo hemiacetal.

• petčlenski obroč imenujemo furanoza, šestčlenskega pa piranoza.

• Kadar se obroč zapre, postane pri vsakem monosaharidu prejšnji karbonilni ogljik (aldehid/keton) kiralni center (lahko nastaneta 2 stereoizomera). Pri enem je OH skupina na anomernem C atomu (tisti, ki je pripadal karbonilni skupini) pod ravnino obroča (α konfiguracija), pri drugem pa je nad ravnino obroča (β konfiguracija).

Taka izomera imenujemo anomera, ker se ločita le po porazdelitvi OH skupine na anomernem C atomu.

Položaj OH skupine na tem Cju pa vpliva na topnost, tališče in optično rotacijo.

• Mutarotacija: gre za proces pretvarjanja stereoizomerov in α v β. Vedno pride po določenem času do ravnotežja teh dveh oblik v raztopini.

Značilna je le za 5 in 6 členske obroče.

c) Reakcije monosaharidov • OH skupina, ki je nastala iz aldehidnega ali ketonskega kisika je anomerna ali glikozidna OH skupina. Je reaktivnejša od ostalih in rada tvori glikozidno vez z drugo OH skupino .

• Prosta glikozidna OH skupina daje sladkorjem lastnosti reducenta.

39

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

1.) Oksidoredukcijske reakcije • Za oksidacijo je najbolj občutljiva aldehidna skupina.

• Reducirajoči sladkorji so tisti, ki imajo prosto aldehidno skupino, ki je reducent, zato morajo biti sposobni preiti v aciklično obliko.

• Za identifikacijo reducirajočih sladkorjev uporabljamo: Tollensov reagent (Ag(NH3)2+) in Cu2+ ione.

• Redukcija aldehidne ali ketoskupine v OH je biološko pomembna. Encimi, ki v celici katalizirajo redukcijo OH, potrebujejo koencim NADH ali NADPH. Ena od oblik reduciranih OH so deoksisladkorji, ki imajo namesto kakšne od OH skupin vodik. Od teh je najpomembnejša 2-­‐deoksiriboza, ki je sestavni del DNA. Nastane z redukcijo OH skupine na C2 v ribozi v procesu, ki odstrani OH skupino in jo zamenja z vodikom. Ti sladkorji nastajajo v celici pri redukciji s pomočjo NADPH in encimi , ki jih imenujemo oksidoreduktaze ali bolj natančno dehidrogenaze.

2.) Esterifikacija • Nastanejo med alkoholi in kislinami • Biološko najpomembnejši so FOSFATNI ESTRI, ki nastanejo s fosforjevo (V) kislino.

V celici fosf. estri ne nastajajo iz zelo kisle fosforjeve kisline, ampak večinoma s prenosom fosforilne skupine iz adenozintrifosfata (ATP) na OH skupino ogljikovega hidrata v reakciji, ki jo katalizirajo encimi kinaze: ATP + D-­‐glukoza ↔ D-­‐glukoza-­‐6-­‐fosfat + ADP • Fosfatni estri: D-­‐glukoza-­‐6-­‐fosfat (nastane v procesu glikolize), D-­‐riboza-­‐5-­‐fosfat, D-­‐deoksiriboza-­‐5-­‐fosfat.

3.) Aminosladkorji • Zamenjamo OH z NH2 skupino (substitucija največkrat poteče na mestu C2) • Pri nekaterih aminosladkorjih je aminska skupina acetilirana (pretvorjena v amid) • Glukozamin je del bakterijske celične stene • Galaktozamin je del hitina (polimer v oklepu insektov in rakov)

4.) Nastanek glikozidov 40

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

Če ogljikovi hidrati reagirajo s OH skupinami, nastane nova O-­‐glikozidna vez (alkohol reagira z anomerno OH skupino) • Lahko se povežeta 2 monosaharida z OH skupino. Npr. ena glukoza je povezana prek anomerne OH skupine na C1 z OH skupino na C4 druge glukoze. Ker ima anomer glukoze α konfiguracijo in gre za OH skupini na mestu 1. in 4. C atomu, se vez imenuje α(1-­‐4') glikozidna vez.

• Maltoza ima tako vez (α(1-­‐4') glikozidna vez). Lahko jo razgradimo z encimom, ki razgrajuje α(1-­‐4') glikozidno vez. Maltoza je produkt hidrolize škroba.

• Celobioza ima β(1-­‐4) glikozidno vez. Te ne moremo razgraditi, ker nimamo encima za hidrolizo β(1-­‐4) vezi.

• Maltoza se ne more izomerizirati v celobiozo in obratno, ker potem, ko se anomerni C atom poveže v glikozidno vez, na njem ne more več potekati mutarotacija (obroč se ne more odpreti).

• O-­‐glikozidne vezi so tiste, ki povezujejo manjše OH (monosaharide) v večje disaharide, oligosaharide in polisaharide.

• α,β(1-­‐4); α,β(1-­‐6); α,β(1-­‐2); αα,ββ(1-­‐1) • Laktoza (mlečni sladkor): galaktoza in glukoza povezani z β(1-­‐4) vezjo. Galaktoza je C4 epimer glukoze. Prispeva anomerno OH na C1, glukoza pa OH na C4. Razgradnjo laktoze katalizira LAKTAZA β-­‐galaktozidaza.

• Saharoza (namizni sladkor): glukoza in fruktoza povezani z α,β(1-­‐2) vezjo, ker je anomerni C atom glukoze (C1) v α konfiguraciji povezan z anomernim C atomom fruktoze (C2) v β konfiguraciji. Ker sta oba anomerna C atoma povezana z glikozidno vezjo, noben od sodelujočih ne more preiti v aciklično obliko z prosto CHO skupino ali CO skupino.

Zato saharoza NI reducirajoči sladkor.

• N-­‐glikozidna vez: anomerni C atom se poveže z dušikom v aminih in iminih.

Pomembna je pri nastanku nukleotidov (ATP) in nukleinskih kislin (v reakcijo vstopa N atom v purinskim in pirimidinskih bazah).

d) Polisaharidi • Vanje se povezujejo monosaharidi zaradi stabilnosti O-­‐glikozidne vezi • Homopolisaharidi: iz ene vrste monosaharidov (celuloza, škrob, glikogen) • Heteropolisaharidi: 2 ali več vrst monosaharidov (glikozaminglikani, proteoglikani) • Oligosaharidi: polisaharidi iz manjšega števila monosaharidov (3-­‐10) • Najpogostejše monomerne enote so glukoza in njeni derivati.

• Polisaharidi se od proteinov ločijo po tem, da njihova velikost ni točno določena (proteini: točno določeno AK zaporedje, vedno enaka molekulska masa določenega proteina; polisaharidi: za njihovo strukturno in energijsko vlogo, točno določena in vedno enaka molekulska masa nima pomena) • V nekaterih polisaharidih so posamezne verige zamrežene s kratkimi peptidi: PEPTIDOGLIKANI (komponenta cel.stene) • Polisaharidi tvorijo linearne in razvejane polimere. Večina je linearnih.

1.) Rezervni polisaharidi •

41

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

Rastline in živali shranjujeta energijsko molekulo glukozo v obliki škroba oz. glikogena. V celicah sta shranjena v obliki granul. Imata veliko OH skupin in z H vezmi vežeta veliko vode. Glikogen je predvsem v jetrnih in mišičnih celicah.

• Škrob: iz dveh polimerov glukoze: AMILOZA (linearna, nerazvejana veriga D-­‐glukoz, ki so povezane z α(1-­‐4) O-­‐ glikozidnimi vezmi. Zaradi narave vezi sta konca polimera različna: nereducirajoč konec in reducirajoč konec.) in AMILOPEKTIN (ima glavno verigo iz glukoznih enot z α(1-­‐4) O-­‐glikozidnimi vezmi in dve stranski verigi, ki sta z α(1-­‐6) O-­‐glikozidnimi vezmi povezane z glavno verigo. Ima en reducirajoč in mnogo nereducirajočih koncev.). Razgradnja škroba se prične že v ustih, kjer encimi v slini α-­‐amilaza katalizira razgradnjo O-­‐ glikozidnih vezi. (zgoraj:amiloza, spodaj:amilopektin) • Glikogen: močno razvejan polimer (ima več razvejanih mest od amilopektina in večjo maso). Sestavljen je iz D-­‐ glukoznih enot, ki so linearno povezane z α(1-­‐4) vezmi. Na vsakih 8-­‐12 glukoznih enot se pojavi α(1-­‐6) vez, ki glikogen močno razveja v veliko stranskih verig. Ima en reducirajoč konec in mnogo nereducirajočih koncev, kar je pomembno pri sproščanju glukoznih enot v energijskem metabolizmu (razgradnjo glikogena katalizira encim glikogen-­‐fosforilaza). Polisaharidne verige amiloze in nerazvejani deli amilopektina in glikogena se zaradi gibljivosti α(1-­‐4) glikozidne vezi zvijejo v vijačno strukturo. Glikogen je tako v jetrih kot v mišicah.

• V naravi so tudi druge oblike rezervnih polisaharidov: DEKSTRAN (glavna veriga glukoza, α(1-­‐6) vez; razvejitve: α(1-­‐2,1-­‐3,1-­‐4) vezi), ki ga najdemo v kvasovkah in bakterijah (bakterije v ustni votlini sintetizirajo ekstracelularni dekstran, ki se kopiči in je pomembna komponenta zobnih oblog) in INULIN (D-­‐fruktoza, β(2-­‐1) vez), ki ga najdemo v artičokah in drugi zelenjavi.

2.) Strukturni polisaharidi • Celuloza, hitin, mukopolisaharidi • Deloma se sintetizirajo v notranjosti celice, dokončno pa sestavijo zunaj celice, kjer gradijo trdno zaščitno celično steno ali pa oblikujejo želatinozno mazavo zaščitno prevleko.

• Celuloza: glavna strukturna komponenta lesa in rastlinskih vlaken. Je nerazvejan polimer, pri katerem so D-­‐glukozne enote povezane z β(1-­‐4) glikozidnimi vezmi.

Take vezi v beta konfiguraciji omogočajo nastanek zelo dolgih in ravnih verig.

Raztegnjene verige se lahko povežejo v snope vzporednih verig: vlakna, ta pa se lahko sestavijo v močne in toge mreže (ki jih stabilizirajo intra-­‐ in intermolekulske vodikove vezi), ki so osnova ogrodja za rastlinske celične stene. Živali ne morejo uporabljati celuloze kot vir energije (čeprav je iz glukoze), saj ne sintetizirajo encimov, ki bi lahko katalizirali hidrolizo β(1-­‐4) vezi (z razliko od gliv, nekaterih bakterij, prežvekovalcev, termitov,…).

• Pektin: polimer D-­‐galakturonske kisline. Ekstrahiramo ga iz rastlin in uporabljamo kot želirno sredstvo pri izdelavi marmelad, džemov in želejev.

• Hitin: nerazvejan homopolisaharid, sestavljen iz N-­‐ acetilglukozamina, ki se med seboj povezuje z β(1-­‐4) glikozidnimi vezmi. Sestavlja zaščitni oklep členonožcev in je prisoten tudi v celični steni kvasovk, gliv in alg. (na sliki) •

42

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

Mukopolisaharidi: prisoten v želatinozni snovi, ki povezuje celice v vezivnem tkivu (hrustanec in kite) in zunajceličnem matriksu. Najpogostejša je hialuronska kislina (N-­‐acetilglukozamin + D-­‐glukuronska kislina).

e) Glikoproteini • Proteini, ki imajo kovalentno vezan ogljikov hidrat.

• Sodelujejo v mnogih bioloških procesih: imunski odgovor, prepoznavanje med celicami, strjevanje krvi …

1.) Zgradba glikoproteinov • OH, vezani na proteine, so predvsem monosaharidi: manoza, galaktoza, N-­‐ acetilgalaktozamin, sialna kislina, glukoza … Ti sestavljajo razvejane oligosaharide, v katerih je običajno manj kot 15 monosaharidnih molekul.

• Vezi: O-­‐glikozidna vez (med OH skupino serinskih in treoninskih ostankov v proteinu in prvim monosaharidom oligosaharida) ter N-­‐glikozidna vez (med amidnim dušikom v stranski verigi aminokisline asparagina in prvim monosaharidom oligosaharida).

2.) Vloga glikoproteinov • Oligosaharidi, pripeti na proteine, so pomembni pri medsebojnem prepoznavanju celic in molekul • Pogosto so na površini celic, kjer služijo kot markerji za identifikacijo specifičnih vrst celic. Npr. krvne skupine AB0 se pri človeku razlikujejo zaradi različne zgradbe oligosaharidov na membrani eritrocitov (oligosaharid za krvno sk. A ima na nereducirajočem koncu N-­‐acetilgalaktozamin, tisti, ki je značilen za krvno skupino B, pa α-­‐D-­‐galaktozo.

• Ko se celice transformirajo iz normalnih v maligne, pride tudi do sprememb glikoproteinov na celični površini (normalne celice ob stiku ogljikovih hidratov s površino prenehajo rasti, rakave pa zaradi spremenjene površine naprej rastejo) • Oligosaharidi se uporabljajo tudi za označevanje staranja proteinov.

•

43

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

9. LIPIDI, BIOLOŠKE MEMBRANE IN TRANSPORT

• Hidrofobna narava, zato bolj topni v nepolarnih topilih kot v vodi.

• Vsebujejo C in H, nekateri še O, N, P. • Vezi: enojne, dvojne med C atomi ter estrske, fosfoesterske in amidne vezi z ostalimi atomi.

• So najpomembnejše molekule za shranjevanje energije. To vlogo imajo nepolarni lipidi oz. maščobe.

• Polarni lipidi (nekateri vsebujejo N in P) so pomembna sestavina bioloških membran, skupaj s proteini.

• Med lipidi prištevamo tudi steroide (npr. holesterol, ki ga najdemo v bioloških membranah in je pomemben prekurzor mnogih steroidnih hormonov, žolčnih kislin in vitaminaD) • Lipidi so lahko tudi pigmenti, ki absorbirajo svetlobo (β-­‐karoten, retinal), encimski kofaktorji (vitaminK), hormoni (estrogeni, testosteron), signalne molekule (prostaglandini), prenašalci e-­‐ (ubikinon).

• Niso polimerne molekule, lahko pa agregirajo in oblikujejo različne strukture.

a) Maščobne kisline

1.) Struktura maščobnih kislin • Vsebujejo polarno karboksilno skupino (COOH), vezano na nerazvejano alifatsko verigo. Taka struktura jim da dvojno naravo (so amfifilni): en konec je polaren in včasih ionski (COOH), medtem ko ima nasprotni konec (ogljikovodikova veriga) nepolarne lastnosti.

• V celicah in tkivih so redko v prosti obliki, večinoma so povezane v maščobe (triacilglicerole) • pKa karboksilne skupine: 4–5, zato se pri fiziološkem pH pojavljajo v ionizirani obliki (COO-­‐) in tvorijo soli ali mila (dobijo končnico at).

• Glavne značilnosti MK: o Št. C atomov v MK je običajno sodo (4–36, najpogosteje pa 12–18) o CH veriga je praviloma nerazvejana o Večina vezi C-­‐C je enojna, kislina pa lahko vsebuje tudi več dvojnih vezi o Konfiguracija ob dvojni vezi je skoraj vedno cis o Mononenasičene MK imajo dvojno vez med C9 in C10 o Če je prisotna več kot ena dvojna vez, te niso konjugirane, ampak ločene z metilensko skupino • Nasičene MK: o Ne vsebujejo dvojnih vezi (le enojne) o So zelo gibljive o Prosta rotacija okrog C-­‐C vezi o Zavzamejo številne konformacije, energetsko najugodnejša je popolnoma iztegnjena, tu je oviranje sosednjih metilenskih skupin najmanjše.

• Nenasičene MK: o Imajo eno ali več dvojnih vezi.

44

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

2.)

b) 1.)

2.)

3.)

o Običajno so v cis konformaciji (imajo v CH verigi α = 300 in se med seboj tesno prilegajo) o Zmanjšane Van der Waalsove interakcije nenasičenih MK povzročijo znižanje T tališča (ta narašča z naraščajočo molekulsko maso in pada s stopnjo nenasičenosti) o Pri dinenasičenih je druga dvojna vez najpogosteje med C12 in C13 o MK z 2 ali več dvojnimi vezmi imenujemo polinenasičene.

Fizikalne in kemijske lastnosti MK • Vse so dobro topne v org. topilih (alkohol, heksan, dietileter), v vodi pa slabo • Topnost MK v vodi pada z dolžino verige • Nasičene MK z 10 ali več C atomov so podobne voskom, če imajo manj kot 10 C atomov ali če so nenasičene so oljnate tekočine • Na+ in K+ soli MK so mila. Ta se topijo v vodi, vendar ne nastanejo prave raztopine.

Amfifilne molekule se združujejo v nadmolekulske agregate, MICELE. Mila so sposobna odstranjevat maščobe in druge nečistoče, saj s hidrofobnimi repi obdajo hidrofobne molekule v madežih, medtem ko se pa ionske glave obrnejo proti vodi.

• Kemijska reaktivnost CH verige je odvisna od stopnje nenasičenosti (nasičene so precej nereaktivne, pri nenasičenih potekajo adicije na dvojno vez) • AVTOOKSIDACIJA: O2 napade dvojno vez v nenasičenih MK, nastanejo kompleksni produkti rumene barve in neprijetnega vonja.

Triacilgliceroli

Zgradba triacilglicerolov • Nepolarne, hidrofobne molekule • So metabolično gorivo v celicah (zaužijemo jih s hrano ali pa jih sintetiziramo in jih v obliki triacilglicerolov shranjujemo za kasnejšo uporabo v energijskem metabolizmu.

Kadar celice potrebujejo energijo, se MK sprostijo z encimsko katalizirano hidrolizno reakcijo, vežejo se na serumske albumine v krvi in krožijo po organizmu. V srčnih in skeletnih mišicah se oksidirajo do CO2 in H2O, sprosti se energija.)

• Osnovna molekula je glicerol (spojina s 3 OH skupinami; vsaka OH skupina veže MK z estersko vezjo: proces je postopen, nastanejo monoacilgliceroli in diacilgliceroli) • Polarne OH skupine glicerola in polarne COOH skupine (včasih ionske) se vežejo z estrsko vezjo, zato se triacilgliceroli nepolarne, hidrofobne molekule.

Reaktivnost triacilgliceridov • 2 vrsti reaktivnih mest: esterske vezi (hidroliza esterske vezi:umiljenje/saponifikacija) in dvojne vezi med C atomi (pri nenasičenih; dvojna vez lahko reagira z halogenom ali kisikom) • Hidrolizo triacilgliceridov v organizmu katalizirajo LIPAZE (so v prebavilih in adipocitih/maščobnih celicah, sproščajo MK za potrebe energijskega metabolizma) • Trans MK lahko povzročijo povečanje konc. holesterola v krvi.

Biološke lastnosti triacilglicerolov • So vir energije in toplotni izolatorji organizmov. Nahajajo se v obliki oljnih kapljic v citosolu rastlinskih in živalskih celic.

• Adipociti so živalske celice, specializirane za shranjevanje maščob. Encimi lipaze so v adipocitih zato, da katalizirajo sproščanje maščobnih kislin. Adipociti so prisotni tudi v podkožju živali, da jih obvarujejo pred ekstremno nizkimi T.

45

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

• MK so prisotne tudi v obliki drugih derivatov: voski (služijo kot zaščitna prevleka rastlinskih listov, za oljenje kože …)

c) Polarni lipidi • skupaj z beljakovinami gradijo biološke membrane • se ne skladiščijo kot triacilgliceroli • 2 pomembni skupini: glicerofosfolipidi, sfingolipidi • Polarna glava in 2 nepolarna repa. Zaradi steričnih razmer se ne morejo organizirati v micele. Namesto tega se združijo v dvosloj, sestavljen iz dveh plasti polarnih lipidov. Dvosloj je osnovna struktura membran. Obstoj dvosloja omogočajo hidrofobne interakcije.

1.) Glicerofosfolipidi • izhodna molekula: FOSFATIDNA KISLINA: 1,2-­‐diacilglicerol-­‐3-­‐fosfat • sestavljajo biološke membrane • ima glicerolno osnovo: C1-­‐estersko vezane MK (predvsem nasičene), C2-­‐estersko vezane MK (predvsem nenasičene), C3-­‐zaestrena s fosforjevo (V) kislino (ker je triprotična, lahko reagira z 1, 2 ali 3 alkoholnimi enotami, nastanejo mono, di ali tri estri). Pri glicerofosfolipidih je fosfatna skupina zaestrena še z enim alkoholom (aminoalkohol etanolamin, holin, AK serin ali polihidroksialkohol inozitol).

• Glede na te štiri alkohole, dobimo 4 polarne lipide, ki jih poimenujemo tako, da ime alkohola dodamo izrazu fosfatidil (npr.fosfatidilholin). Z izjemo inozitola imajo vsi alkoholi aminsko ali drugo funkcionalno skupino, ki je pri fiziološkem pH ionizirana.

• V molekuli imajo poleg hidrofobnih področij, tudi močno polarne, včasih celo nabite predele (polarna glava, nepolaren rep). Ti značilnosti sta bistveni za strukturo membran.

2.) Sfingolipidi • Polarni, jih najdemo v membranah • Osnovna molekula je SFINGOZIN: 18 C atomov, ima 2 funkcionalni skupini: aminsko in hidroksilno, ki se lahko kemijsko modificirata.

• CERAMID: aminska skupina na C2 sfingozina se poveže z amidno vezjo z MK. Ima polarno glavo (OH skupina na C1) in 2 nepolarna repa. Je izhodna molekula za ostale sfingolipide.

• SFINGOMIELIN: MK je vezana prek aminske skupine; OH skupina je zaestrena z fosfoholinsko enoto (edini sfingolipi, ki vsebuje fosfor). Ima polarno glavo in 2 nepolarna repa. Najdemo jih v plazemski membrani in v mielinskih ovojnicah (izolirajo aksone živčnih celic) • GLIKOSFINGOLIPIDI: na OH skupino C1 so z glikozidno vezjo vezani monosaharidi (glukoza, galaktoza, N-­‐acetilglukozamin). Poleg vloge v membranskih strukturah, so pomembni še za prepoznavanje na cel. površini, prevajanje živčnih impulzov.

46

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

• Gangliozidi so glikosfingolipidi, pri katerih je na sladkorno verigo vezan 1 ali več ostankov sialične kisline (imajo polarno glavo iz več monosaharidov, ki so med seboj povezani z glikozidno vezjo). Najdemo jih v možganskih in živčnih membranah.

d) Steroidi in ostali lipidi

1.) Steroidi • Sistem kondenziranih obročev (3 6-­‐členski (A,B,C) in 1 5-­‐ členski (D)). Pri različnih steroidih se sistemi obročev razlikujejo po številu in položaju dvojnih vezi, stranski verigi in številu ter vrsti funkcionalnih skupin.

• Najbolj poznan je holesterol (OH skupina na obroču A, dvojna vez na obroču B in na več mestih vezane verige ogljikovodikov). Je amfifilna molekula (hidrofilno področje: OH skupina (kem. najbolj reaktiven del holesterola; v fizioloških razmerah je zaestrena z MK), hidrofobno področje: kondenzirani obroči in CH repi).

• Holesterol se sintetizira iz izoprena (2-­‐metil-­‐1,3-­‐butadien).

• Holesterol skupaj z glicerofosfolipidi in sfingolipidi nastopa v bioloških membranah.

Veliko holesterola in njegovih estrov najdemo v plazemskih lipoproteinih, ki jih prenašajo do perifernih tkiv. Tam se holesterol uporabi za izgradnjo bioloških membran ter kot prekurzor pri biosintezi steroidnih hormonov (testosteron, estradiol, kortizol) in žolčnih kislin (nastanejo na obročnem sistemu holesterola z encimsko kataliziranimi oksidacijami).

• Žolčne kisline imajo kisle funk. skupine; pri fiziološkem pH disociirajo in dobimo ionske strukture: soli žolčne kisline. Le-­‐te se skladiščijo v žolčniku in izločajo v črevesje, kjer pomagajo pri emulgiranju, razgradnji in absorpciji zaužitih maščob.

47

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

2.) Terpeni • sem spadajo vse spojine, ki nastanejo iz izoprena (holesterol, β-­‐karoteni (prekurzor vitamina A), likopen, skvalen (intermediat v biosintezi steroidov))

3.) Eikozanoidi • Skupina lipidov, za katere je značilna podobna, a lokalna aktivnost in zelo majhne celične koncentracije.

• Delujejo na celico, v kateri se sintetizirajo, ali na nekaj bližnjih.

• Biološki učinki: o Vplivajo na reproduktivne funkcije o Uravnavajo strjevanje krvi in krvni tlak o Ob poškodbah in boleznih povzročajo vnetje, povišano T in bolečino o Uravnavajo T ter ciklus budnosti in spanja pri ljudeh in živalih • 3 podrazredi: (vsi izvirajo iz arahidonske kisline: polinenasičena MK; 20 C atomov) o TROMBOKSANI: šestčlenski obroč, ki vsebuje kisik. Prvič so jih izolirali iz trombocitov (olajšajo nastanek krvnih strdkov). o LEVKOTRIENI: izolirali iz levkocitov. Nimajo obroča (linearna veriga) in imajo tri konjugirane dvojne vezi. Povzročajo krčenje gladkih mišic, zlasti v pljučih. o PROSTAGLANDINI: izolirali iz prostate. Vsebuje petčlenski obroč, substituiran z dvema stranskima verigama in različnimi funkcionalnimi skupinami (COOH, OH, CO, dvojne vezi). Izzovejo številne in raznolike biološke učinke: vplivajo na budnost/spanje, povzročijo povišano T, vnetje in bolečino (aspirin in ibuprofen zmanjšujeta celično koncentracijo prostaglandinov, ker inhibirata encim prostaglandin-­‐ sintazo, ki je odgovorna za pretvarjanje arahidonata v prostaglandine).

4.) Vitamini, topni v lipidih • Lahko jih opredelimo kot terpene (derivate izoprena), vendar jih zaradi njihovega pomena za zdravje ljudi obravnavamo kot posebno kategorijo lipidov.

• D, E, K, A

VITAMIN SPLOŠNO IME KEMIJSKE ZNAČILNOSTI BIOLOŠKA VLOGA A Retinol Terpen z 20 C Absorpcija svetlobe D več oblik Nastane iz holesterola s Regulacija pomočjo UV metabolizma Ca in P E α-­‐tokoferol Aromatski obroč z dolgo Antioksidant CH verigo K Vitamin K Biciklični sistem z dolgo Regulira strjevanje CH verigo krvi, nastajanje kosti

5.) Feromoni • Nekateri organizmi izločajo v okolje snovi (FEROMONI), ki spremenijo vedenje drugih organizmov iste vrste (najpogosteje je vedenje povezano s spolno privlačnostjo)

6.) Prenašalci elektronov • Sodelujejo kot prenašalci elektronov pri oksidoredukcijskih reakcijah v energijskem metabolizmu • UBIKINON (koencim Q): osnovna sestavina verige za prenos elektronov v mitohondriju • Delujejo kot encimski kofaktorji 48

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

e) Biološke membrane

1.) Biološka vloga membran • Glavne sestavine: proteini in polarni lipidi • Ločujejo vsebino celice in organela od okolja • Omogočajo organizacijo in lokalno porazdelitev biokemijskih procesov v različnih delih tkiv/celic • Selektivni filter: dopušča vstop hranilnih snovi in izstop odpadnih produktov.

• Vsebujejo proteinske kanale, črpalke in pore, ki uravnavajo prehod ionov in molekul • Proteinski receptorji: na zunanji strani vežejo hormone in tako omogočajo prenos kem. signalov, ki uravnavajo procese znotraj celice.

• Mitohondrijske membrane vsebujejo encime in druge proteine, ki omogočajo, da se energija, ki se sprosti pri oksidaciji maščob in OH, porabi za sintezo ATP.

2.) Membranske sestavine in zgradba • Lipidi, proteini in ogljikovi hidrati • Ne vsebujejo prostih OH, ampak so ti kovalentno vezani na lipide (glikolipidi) in proteine (glikoproteini) • Osnovno strukturno ogrodje membran je lipidni dvosloj.

• Skupna značilnost membranskih lipidov je amfifilnost, ki omogoča njihovo združevanje v vodnem okolju v lipidni dvosloj, ki ga vzdržujejo nekovalentne hidrofobne interakcije (dvojna plast nastane spontano) • Lipidni dvosloj je prepusten (prek njega prehajajo nepolarne molekule npr. ogljikov dioksid, ogljikovodiki … ali polarne molekule npr. aminokisline, sladkorji, proteini, a z navadno difuzijo te ne morejo prehajati) in fluiden (dvosloj se obnaša kot tekočina z gostoto, kakršno imajo rastlinska olja).

• Holesterol lahko močno vpliva na lastnosti membrane (je tog in bolj negibljiv kot ostali polarni lipidi, zato zmanjša fluidnost membran).

3.) Membranski proteini • če bi bile membrane sestavljene le iz lipidov, bi skozi membrano lahko prehajale le nepolarne molekule.

• Za dinamiko membran skrbijo proteini (encimi, receptorski proteini ali transportni proteini).

• V membrani so asimetrično razporejeni lipidi in proteini.

• Delimo jih na: o PERIFERNI PROTEINI: so polarni in vodotopni. Lahko jih odstranimo enostavno z obdelovanjem membran z vodno raztopino soli (1M NaCl).

Običajno so vezani na membrano z nekovalentnimi, ionskimi ali H vezmi med AK ostanki in ustreznimi AK ostanki integralnega proteina, ki sega na površino membrane. V svoji strukturi imajo velik del iz hidrofobnih AK, omogočajo jim, da se z njimi potopijo v nepolarno področje lipidnega

49

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

dvosloja. Na notranji in zunanji strani membrane so različni periferni proteini. o INTERGRALNI PROTEINI: odstranimo jih le z raztopinami detergentov (NaDS).

Potopljeni so v notranjost lipidnega dvosloja. Sprostimo jih le z razbitjem membrane, tako da prekinemo hidrofobne interakcije med proteini in lipidi.

4.) Model tekočega mozaika • Membrana je sestavljena iz lipidnega dvosloja, v katerega so vgrajeni proteini, od katerih so nekateri periferni, nekateri pa integralni.

• Proteini lahko do neke mere prosto plavajo v in na dvosloju ter oblikujejo mozaičen vzorec.

• Ločimo 2 polarni površini dvosloja in osrednje področje – hidrofobni repi lipidov • Nepolarne molekule lahko difundirajo prek membrane zaradi hidrofobne narave njenega osrednjega dela.

• Polarne hidrofilne molekule pa potrebujejo pomoč proteinov v membrani.

• Membrane so fluidne in se neprestano spreminjajo zaradi lateralnega gibanja proteinov in lipidov.

f)

Transport preko membrane • Majhne, nepolarne molekule zlahka difundirajo skozi lipidni dvosloj, medtem ko velike polarne potrebujejo pomoč proteinskih kanalov, prenašalcev in črpalk.

• Pretok molekul regulirajo integralni proteini • Transport delimo na: o PASIVNI: molekule topljenca se gibljejo s področja večje koncentracije na področje z manjšo koncentracijo (koncentracijski gradient). Energija se pri tem procesu ne porablja, entropija pa narašča (termodinamsko ugodno).

Npr. difuzija. o AKTIVNI: snovi se prenašajo z manjše koncentracije na večjo. To omogoča kopičenje snovi na eni strani membrane, zato proces potrebuje energijo, entropija se zmanjšuje. Na tak način se prenašajo npr. AK, OH, ioni … Viri energije: hidroliza ATP, svetlobna E

50

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

1.) Pasivni transport: enostavna in olajšana difuzija • ENOSTAVNA: energijsko ugoden proces, entropija sistema narašča, prosta entalpija pa se zmanjšuje. Snov potuje iz večje na manjšo konc. do izenačitve konc. na obeh straneh membrane. Tako prehajajo majhne in nepolarne molekule: MK, CO2, N2, O2, CH4.

Voda prehaja z akvaporini.

• OLAJŠANA: sodelujejo membranski proteini.

Transportni proteini se organizirajo v transmembranske kanale ali pa omogočajo prenos molekul s specifično vezavo in konformacijsko spremembo. Pri oblikovanju kanalov se proteini pogosto zvijejo v več vzporednih α vijačnic, ki segajo prek obeh plasti lipidnega dvosloja, v sredini pa so razmaknjene v kanal. Ker se energija ne porablja, gre za pasivni transport. Na tak način prehajajo sladkorji, aminokisline, ker so polarne in prevelike za enostavno difuzijo. PERMEAZE: proteini, ki specifično vežejo molekule in s konformacijsko spremembo omogočajo njihov prenos, veljajo ista termodinamična pravila kot pri navadni difuziji (pretok molekul topljenca z večje konc. na manjšo).

Poznamo UNIPORT: proteini prenašajo samo 1 vrsto molekul in KOTRANSPORT: prenašata se 2 vrsti molekul topljenca. Slednjega delimo na simport (obe molekuli topljenca potujeta v isto smer) in antiport (molekuli se gibljeta v nasprotno smer).

2.) Aktivni transport: črpanje ionov • Energija se porablja. Z takim transportom lahko dosežemo kopičenje topljenca na eni strani prepustne membrane.

• Omogoča ga energija kemijskih reakcij (npr. cepitev fosfoanhidridne vezi v ATP) ali absorpcija svetlobne energije.

• Neto pretok je nasproten koncentracijskemu gradientu.

51

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

g) Primeri membranskih proteinov

1.) Glikoforin A v eritrocitni membrani • Je vrsta glikoproteina.

• Glikoforin A ima 131 aminokislinskih ostankov in 16 oligosaharidnih skupin, ki skupaj vsebujejo 100 monosaharidov.

• Je integralni membranski protein (del je na zunanji strani plazmaleme, del pa v citoplazmi). Tako sega skozi membrano; ker prečka lipidni dvosloj ima hidrofobno domeno in 2 hidrofilni področji.

2.) Glukoza-­‐permeaza v membrani eritrocita • Je transportni protein za glukozo.

• Glukoza prehaja v eritrocite z olajšano difuzijo prek transportnega proteina: glukoza-­‐ permeaza • Ima eno polipeptidno verigo, ki vsebuje skoraj 500 aminokislinskih preostankov z 12 hidrofobnimi področji, ki segajo preko membrane.

• Transportni mehanizem je podoben delovanju encimov (glej Michaelis-­‐Mentenovo krivuljo). Pri večji koncentraciji glukoze, so vse molekule permeaze zasedene, takrat je dosežena Vmax. Kadar je koncentracija glukoze enaka Kt (pri encimih Km), je hitrost prenosa ½ Vmax.

• Je specifična: največjo hitrost prenosa doseže samo pri glukozi, medtem ko pri epimerih glukoze (manoza, galaktoza) doseže le 20 % Vmax.

+ 3.) Na /K+-­‐ATPazna črpalka • Koncentracija kalija in natrija v celici je drugačna od tiste zunaj celice. Da se to doseže, morajo z aktivnim antiportom ves čas črpati Na iz celice in K v celico. Za ta proces vsebuje plazemska membrana Na/K-­‐ATPazno črpalko (proteinska črpalka).

• Transportni protein ima ATPazno aktivnost (katalizira hidrolizo ATP), saj mu to omogoča sklopitev aktivnega transporta Na in K s cepitvijo fosfoanhidridnih vezi v ATP.

52

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

10. DNA IN RNA: ZGRADBA IN VLOGA

a) Kemijska zgradba RNA in DNA

1.) Sestavine nukleotidov: • 1 nukleotid je sestavljen iz 3 enot: 1) iz aromatske ciklične spojine, ki vsebuje amtome C in N à dušikova baza 2) iz ogljikoveha hidrata s 5 C-­‐atomi (aldopentoze) 3) iz 1, 2 ali 3 fosfatnih skupin • dušikove baze:

• aldopentoze: v DNA je 2-­‐deoksiriboza, v RNA pa riboza

• s povezavo N-­‐baze in aldopentoze z N-­‐glikozidno vezjo dobimo nukleozid

•

nukleotid nastane, ko se fosforilna skupina (-­‐PO32-­‐) veže na hidroksilno skupino aldopentoze v nukleozidu à to je možno na 3 OH skupinah v ribozi in na 2 v pentozi.

Najpogosteje pride do fosforilacije na mestu 5, à dobimo nukleozid-­‐5;-­‐monofosfat

53

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

2.) Nukleinske kisline: • nukleotidi se med seboj povežejo s fosfatnimi skupinami tako, da se 5,-­‐fosfatna skupina enega nukleotida poveže s 3'-­‐OH skupino naslednjega nukleotida in dobimo 3', 5'-­‐ fosfodiesterska povezava • ta vez nam omogoči nastanek kovalentnega ogrodja nukleinskih kislin

3.) DNA in RNA: • DNA je v celičnem jedru evkariontskih celic povezan z bazičnimi beljakovinami histoni • nukleinske kisline imajo kisla in bazična področja: - fosfatne skupine ogrodja (izhajajo iz fosforjeve (V) kisline) imajo – naboj - zaradi ionske narave fosfatnih skupin in polarnosti sladkornih komponent je kovalentno ogrodje hidrofilno - hidrofobni del pa sestavljajo purinske in pirimidinske baze - razlike v polarnosti med ogrodjem in bazami so pomembne za zvitje DNA in RNA v 3D strkture • na zvitje nukeinskih kislin vplivajo tudi druge pomembne interakcije: - več funkcionalnih skupin na N-­‐bazah omogoča nastanek vodikove vezi: N-­‐H skupine v obročih in aminske skupine (-­‐NH2) so lahko donorji Hja, možni akceptorji pa so C=O in N-­‐atomi v obročih (=N-­‐) - specifične vodikove vezi se vzpostavijo med N-­‐bazami ene verige in N-­‐bazami druge verige

b) Strukturni elementi DNA: • primarno strukturo DNA in RNA predstavlja nespremenljivo kovalentno ogrodje in spremenljivo zaporedje dušikovih baz • sekundarno strukturo nukleinskih kislin opisuje pravilno, ponavljajoče se ureditev polinukelotidnih verig

1.) Dvojna vijačnica DNA: • sestavljena je iz 2 komplementarnih polinukleotidnih verig, ki sta oviti druga okli druge • značilnosti dvojne vijačnice: 1) dve polinukleotidni verigi, oviti okoli skupne osi, sestavljata dvojno desno vijačnico 2) verigi tečeta v nasprotnih smereh à sta antipararelni, to pomeni, da v nasprotnih smereh tečejo njune 3', 5'-­‐fosfodiestrske povezave 3) v vodnem okolju je polarno in nabito kovalentno ogrodje iz izmenjujočih se deoksiriboz in fosfatnih skupin na zunanji starni vijačnice, kjer lahko polarne skupine vstopajajo v interakcije s H2O. Hidrofobne purinske in pirimidinske baze se vodi izognejo tako, da se obrnejo v notranjost stukture 4) dvojno vijačnico stabilizirata 2 vrsti vezi oz. interakcij: a. vodikove vezi med pari komplementarnih baz, ki so na nasprotnih verigh (A-­‐T, G-­‐C). Med A in T sta 2 močni H-­‐vezi, med G in C pa tri. Vsaka baza v verigi lahko vzpostavi specifične vezi s komplementarno bazo, ki je neposredno na nasprotni strani v drugi verigi. b. Van der Waalsove in hidrofobne interakcije à baze pridejo dovolj blizu skupaj, da lahko delujejo privlačne sile med e-­‐, ki so v orbitalah ∏ • najpomembnješa lastnost dvojne vijačnice je komplementarno parjenje baz à omogoča ji shranjevanje in prenaša genetsko info.

54

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

2.) Fizikalne in biološke lastnosti dvojne vijačnice: • če so molekule DNA v dvojni vijačnici izpostavljene segrevanju, kislina, baza ali org. topilu, se verigi ločita à dvojna vijačnica je denaturirana • taljenje DNA à do denaturacije pride zaradi povišane T, reverzibilni proces • denaturirana DNA absorbira več UV-­‐svetlobe kot nativna DNA à hiperkromni učinek • vzrok za povečanje absorpcije: ob pretrganju vezi med verigama, se s tem spremeni tudi razoreditev ∏-­‐elektronov v aromatskih obročih, to pa povzroči povečanje adsorpcije UV-­‐ svetlobe • renaturacija/prileganje à ponovno povezovanje obeh prostih verig v prvotno dvojno vijačnico

3.) Terciarna struktura DNA: • sekundarna struktura = dvojna vijačnica • ločimo linearno in krožno DNA • zaprta, krožna dvojna vijačnica je zvita v novo konformacijo à dodatno zvita DNA: - manj stabilna - obstaja in vivo - dodatno zvijanje ima biološki pomen = molekula DNA postane bolj kompaktna in zato zavzame manj prostora v celici, lahko pa bi vplivala tudi na uravnavanje podvajanja in prepisovanja DNA

c) Strukturni elementi RNA • razlike med DNA in RNA: - v sladkorju: RNA vsebuje ribozo, DNA deoksiribozo - v N-­‐bazah: RNA vsebuje uracil (U) namesto timina (T) - RNA je bolj občutljiva na hidrolizo kot DNA, vzrok je v prisotnosti dodatne OH skupine à najpomembnejši razlog, zakaj so genetske info. običajno shranjene v DNA - DNA je dvojna vijačnica, medtem ko je RNA enoverižna molekula • najpomembnejši strukturni elementi v RNA: - lasnične zanke à približajo komplementarne dele, da se baze lahko sparijo - desne dvojne vijačnice RNA nastanejo zaradi obstoja dovolj dolgih komplementarnih odsekov na verigi RNA. Dvojno vijačna področja v RNA so antiparalelna in jih stabilizirajo iste interakcije kot v DNA, H-­‐vezi med komplementranimi bazami in interakcije med naloženimi bazami. Za parjenje baz v RNA veljajo ista pravila kot za DNA, le da je T zamenjan z U. - notranje zanke/izbokline so strukturne oblike, ki prekinejo področja dvojne vijačnice

1.) Struktura tRNA: • tRNA so najmanjše, so prenašalke točno določenih AK, ki so potrebne za sinetzo beljakovin. Vsaka od 20 AK ima najmanj 1 ustrezno tRNA. • imajo 74–93 nukleotidov v eni verigi

d) Rezanje DNA in RNA z nukleazami

1.) Nukleaze: • so encimi, ki katalizirajo hidrolizo fosfoestrskih vezi • njihova biokemijska vloga: kataliza razgradnje poškodovanih ali postaranih nukelinskih kislin v procesih, ki so potrebni za splošno vzdrževanje reda v celici

55

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

• • •

2.)

• • • e) • 1.)

• • • • •

2.)

• •

• 3.)

• • 4.)

•

nekatere delujejo na RNA IN DNA, ene pa so substratno specifične (deoksiribonukleaze, Dnaze, ribonukleaze, Rnaze) eksonukleaze (5,-­‐eksonukelaze in 3,-­‐eksonukelaze) katalizirajo hidrolitično odcepljanje končnih nukleotidov endonukleaze hidrolitično cepijo notranje fosfoestrske vezi

Restrikcijske endonukleaze: najbolj specifični encimi za rezanje DNA prepoznajo specifična zaporedja baz v dvoverižni DNA in katalizirajo hidrolizo obeh verig na vezavnem mestu ali v njegovi bližini cepijo vedno na komplementranih mestih à dobimo lepljive konce

Kompleksi med nukleinskimi kislinami in proteini nadmolekulski kompleksi so skupki makromolekul, ki imajo določeno biokemijsko vlogo à npr. nukleoproteini

Kromosomi: funkcionale enote, v katere je v jedru evkarionstkih celic spravljena genomska DNA so zvitki iz DNA in beljakovni v človeških celici jih je 46 kromatin = nukleoproteinski kompleks v jedru evkariontskih celic. Sestavljen je iz molekule DNA in 2 vrst beljakovin, histoni in nehistonski kromosomski proteini da se genomska DNA stisne v dovolj majhen zvitek, mora biti molekula DNA natančno urejena in strnjena. Proces stiskanja se začne s sestavljanjem kompleksa DNA-­‐histoni = nukleosomi.

Mali jedrni ribonukleoproteinski delci (snRNP): sestavljeni so iz iz malih jedrnih ribonukleinskih kislin (snRNA) in beljakovin imajo zelo pomembno vlogo pri zorenju mRNA. Katalizirajo specifične reakcije pri izrezovanju intronov, ki spremenijo genske prepise v zrelo mRNA, še preden se ta prenese iz jedra k ribosomom v citosolu. iz RNA izrežejo nekodirajpča zaporedja = introni, da se kodirajoča = eksoni povežejo v aktivno mRNA

Ribosomi: nadmolekulski kompleksi, sestavljeni iz RNA in beljakovin, ki delujejo v celici kot mesta za sintezo beljakovin sestavljeni so iz 2 podenot, ki se ločita, ko je prevajanje končano

Ribonukleoproteinski encimi: encimi, ki so sestavljeni iz beljakovin in nukleinskih kislin (ribonukleaza R, telomeraza) 56

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

11. PODVOJEVANJE IN PREPISOVANJE DNA: BIOSINTEZA DNA IN RNA

• molekula, zadolžena za shranjevanje in prenos genetskih informacij, je DNA • DNA ima obliko dovojne vijačnice iz dveh polideoksiribounkleotidnih verig, ki nastane s povezovanjem komplementarnih baz

a) Podvojevanje DNA • DNA ima dinamično zgradbo, saj obstajajo najmanj 3 sekundarne konformacije (A, B, Z) in ima zapleteno tercirano strukturo • prenos genetskih informacij mora biti na vseh stopnjah natančen in zanesljiv

1.) Značilnosti procesa podvojevanja

1) Podvojevanje DNA je semikonzervativno: • semikonzervativna replikacija: vse molekule DNA bodo v prvi generaciji imele 1 starševsko verigo (zelena) in eno novo verigo (rdeča) à dokazali s centrifugiranjem • konzervativna replikacija: starševski verigi ostaneta skupaj (zelena), hčerinska DNA prve generacije pa ima 2 novi verigi (rdeča)

2) Podvajanje se začne na točno določenih mestih DNA: • replikacija DNA se začne na točno določenem mestu, izhodišču podvajanja, in se nadaljuje v obe smeri, tako da se podvojita ob polinukleotidni verigi • naprej nastanejo dvojne replikacijske vilice, to vodi do razvoja replikacijskega mehurčka, ki se veča, ko replikacija napreduje. Dvoje replikacijskih vilic napreduje v nasprotnih smereh, proces pa se zaključi, ko se srečajo na drugi strani krožne DNA.

b) Delovanje DNA-­‐polimeraz

1.) DNA-­‐polimeraza I: • DNA služi kot matrica, ki nosi sporočilo, ki se bo podvojilo. Sporočilo se bere po Watsonovih in Crickovih pravilih za parjenje baz.

• kratka veriga, komplementarna matrici DNA, deluje kot začetni oligonukleotid s prosto OH skupino na koncu 3', ki omogoča kovalentno vezavo nukelotida, ki vstopa v reakcijo • DNA-­‐polimeraza I namreč ni sposobna katalizirati sinteze nove polinukleotidne verige od začetka, ampak lahko katalizira le njeno podalševanje • reakcija poteka tako, da prosta 3'-­‐OH skupina verige, ki se podaljšuje, deluje kot nukelofil, ki napade vstopajoči nukelotid, ta pa se izbere in obdrži na mestu zaradi specifičnega parjenja baze z matrično verigo.

• podaljšavanje poteka na 3'-­‐koncu, sinteza se nadaljuje v smeri 5'à3' 57

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

• 2.)

• • • •

3.)

•

• 4.)

1)

ker sta verigi antiparalelni, se sporočilo v matrici DNA bere v smeri 3'à5'

DNA-­‐polimerazi II in III: DNA-­‐polimeraza III je glavni podvojevalni encim v vseh celicah E.coli DNA-­‐poilmerazi I in II služita kontroliranemu branju in popravljanju in tako zagotovita varnost sinteze DNA à delujeta kot nukleazi in katalizirata hidrolizo fosfoestrskih vezi DNA-­‐polimeraza I je eksonukleaza 3'à5', lahko pa katalizira hidrolizo DNA tudi tako, da začne na koncu 5, (to pomeni da je tudi eksonukleaza 5'à3') DNA-­‐polmeraza I ima 3 katalitične aktivnosti: 1) DNA-­‐polimerazno 2) eksonukleaza 3'à5' 3) eksonukleaza 5'à3' à ima pomembno vlogo v prcesu replikacije

Okazakijevi fragmenti: Kako se lahko kopira starševska veriga 5'à3', če lahko sinteza poteka samo v smeri 5'à3'? Starševska veriga 5'à3' se podvojuje v krajših, ločenih fagmentih à OKAZAKIJEVI fragmenti ti se v kasnejših korakih replikacije kovalentno povežejo in tako oblikujejo popolno hčerinsko verigo

Podvojevanje DNA: Helikaza prepozna in se veže na izhodišče replikacije ter katalizira ločevanje 2 verig DNA tako, da prekine vodikove vezi v baznih parih. DNA-­‐giraza (topoizomeraza), ki katalizira uvajanje dodatnega zvitja pomaga pri odvijanju verig DNA tako, da omogoča zmanjšanje napetosti. Kot rezultat obeh procesov se oblikujejo podvojevalne vilice.

2) Izpostavljene enojne verige DNA je potrebno stabilizirati in zavarovati pred hidrolitično cepitvijo fosfoestrskih vezi. To varovalno vlogo igrajo proteini, ki se vežejo na enoverižno DNA (proteini SSB). Ločeni polinukleotidni verigi se uporabita kot matrici za sintezo komplementraih verig.

3) Začetek sinteze DNA, predstavlja težavo za DNA-­‐polimerazo III. Za delovanje vseh DNA-­‐ polimeraz je namerč potreben začetni oligonukleotid s prosto OH skupino na koncu 3'.

Ker tega na replikacijskih vilicah ni, se sinteza DNA ne more takoj začeti. Ta problem reši sinteza kratkega dela RNA, komplementarnega matrici DNA, ki ga imenujemo začetni oligonukleotid. Sintezo RNA katalizira primaza. Za začetek sinteze vodilne verige DNA je delovanje primaze potrebno samo enkrat. Pri sintezi zaostajoče verige pa mora primaza sodelovati pri sintezi vsakega od Okazakijevih fragmentov.

58

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

4) Ko je na voljo prosta 3'-­‐OH skupina na začetnem oligonukleotidu se začne sinteza DNA, ki jo katalizira DNA-­‐polimeraza III. Na ta način se podaljšujeta tako vodila, kot zaostajajoča veriga. Vodilna veriga se podaljšuje v smeri napredujočih replikacijskih vilic. Sinteza zaostajajoče verige pa se nadaljuje v obratni smeri, dokler ne doseže prehodno sintetiziranega fragmenta.

5) Začetni oligonukleotidi RNA se odstranijo z DNA-­‐polimerazo v smeri 5'à3'. Ostanejo majhni vrzeli, ki se zapolnijo s pomočjo polimerazne aktivnosti DNA-­‐polimeraze I.

6) DNA-­‐polimeraza I lahko katalizira vezavo vseh potrebnih deoksiribonukleotidov za zapolnitev vrzeli, vendar more za dokončno zapolnitev vrzeli nastati še zadnja fosfoestrska vez, katere sintezo omogoči dodatni encim DNA-­‐ligaza. Ta encim katalizira od ATP odvisni nastanek fosfatnega estra med prosto OH skupino na koncu 3' enega in fosfatno skupino na 5'-­‐koncu drugega fragmenta. Proces podvojevanja se konča, ko se sreča dvoje replikacijskih vilic na krožnem kromosomu.

POVZETEK:

5.) Evkariontski kromosomi in telomeri: • evkariontska DNA je linearna, zaradi česar vsebuje proste konce, ki jih imenujemo telomeri • 3'-­‐konec DNA predstavlja ponavljajoče zaporedje AGGGTT, katerega sintezo katalizira encim telomeraza • telomere se med normalnim celični ciklusom skrajšajo • ko so prekratke, do delitve ne pride več in kromosomi niso več aktivni

c) Okvare DNA in njihovo popravljanje • mutacije so spremembe zaporedja baz v DNA • večina mutacij je škodljivih, za celice so lahko celo smrtnonosne 59

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

tihe mutacije so spremembe v zaporedju baz DNA, ki ne vplivajo na AK zaporedje proizvedenih proteionov • mutacije delimo na spontane in inducirane

1.) Spontane mutacije: • nastanejo med običajnimi genetskimi in metaboličnimi procesi v celici • glavna tipa sta: - napake pri vključevanju deoksiribonukleotidov (nastanek nekomplementarnih baznih parov) med podvajanjem DNA - spremembe baz, ki jih povzročijo hidrolitične reakcije • večina mutacij vodi do nezaželenih sprememb v genih • poznamo 3 napake pri podvajanju: - zamenjava enega baznega para z drugim à točkovna mutacija - vrinjenje enega ali več baznih parov à insercija - izločitev enega ali več baznih parov à delecija • osnovni mehanizem popravljanja nekomplementarnih baznih parov v DNA: - endonukleaza katalizira hidrolizo fosfoestrske vezi ob napačno vgrajenem nukleotidu - eksonukelaza katalizira hidrolitično odcepitev mononukleotida - DNA-­‐polimeraza katalizira vezavo pravega nukleotida na prosto 3, OH - dokončno zapolnitec vrzeli katalizira DNA-­‐ligaza

2.) Inducirane mutacije: • so mutacije, ki jih povzročijo zunanji, mutageni dejavniki: ionizirajoče sevanje, kemikalije (delimo jih na analoge heterocikličnih baz, reaktivni kemijski mutageni, interkalirajoča sredstva)

d) Sinteza RNA: • veriga dvoverižne DNA, ki se porabi za sintezo RNA, se imenuje matrična veriga in se bere v smeri 3'à5' • nastajajočo molekulo RNA imenujemo prepis ali transkript, sintetizirana je v smeri 5'à3', njeno zaporedje je komplementarno matični verigi • neprepisano verigo DNA imenujemo kodirajoča veriga, ker ima enako zaporedje kot prepis, razlika je le v T in U

1.) Sinteza RNA, ki jo usmerja DNA: • RNA-­‐polimeraza je encim, ki nadzoruje in katalizira vse biokemijske korake v postopku prepisovanja • kratek povzetek sinteze RNA: RNA-­‐polimeraza poišče vezavno mesto na matrici DNA in se nanj veže. Kratek del dvoverižne DNA se razpre, matrična veriga pa se prepiše v RNA. RNA-­‐polimeraza prinese ustrezen ribonukleozidtrifosfat in ga poveže s sosednjim ribonukleotidom s fosfoestrsko vezjo. Postopek podaljševanja se nadaljuje, dokler RNA-­‐polimeraza ne zazna znaka za konec prepisovanja v matrici DNA. Takrat se postopek sinteze konča, novonastala RNA pa se sprosti • sinteza RNA poteka v poteka v 3 korakih: 1) začetek/inciacija: Prepisovanje gena se prične s prepoznavanjem promotorske regije in začetkom sinteze RNA. Holoencim RNA-­‐polimeraze se veže na večino regij matrične DNA, vendar je interakcija močnejša na določenih področjih, ki jim pravimo promotorske regije. Holoencim RNA-­‐polimeraza se na matrico DNA veže nespacifično in potuje navzdol (v smeri 3'à5' po matrični verigi), dokler ne •

60

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

prepozna promotorske regije. Močnejša vezava na promotorsko zaporedje upočasni napredovanje RNA-­‐polimeraze in povzroči razprtje dvojne vijačnice DNA. Za razliko od sinteze DNA začetni ribonukleotid ni potreben in 5,-­‐ trifosfatna skupina ostane na prvem ribonukleotidu.

2) podaljševanje/elongacija: Podaljševanje verige RNA poteka v smeri 3'à5'. RNA-­‐polimeraza se pomika po matrici DNA in dodaja nukleotide rastoči verigi RNA. Nastja transkript (RNA), komplementaren matrični verigi DNA. Za razliko od DNA-­‐polimeraze, RNA-­‐ polimeraza ne more prepoznati in poraviti napak, zato je njeno delovanje zelo natančno.

3) zaključek/terminacija: Konec sinteze RNA nadzoruje posebno zaporedje DNA. Osrednji encim RNA-­‐ polimeraze se pomika naprej po matrici DNA, dokler ne naleti na zaporedje, ki označuje konec.

• evkariontske celice se pri procesu prepisovanja ločijo od prokariontskih po tem, da imajo 3 vrste RNA-­‐polimeraz (I à prepisuje dolge gene ribosomskih RNA, II à prepisuje gene, ki kodirajo proteine, IIIà prepisuje kratke RNA, vključno s tRNA in rRNA)

2.) Sinteza RNA, ki jo usmerja RNA: • najdemo pri RNA-­‐virusih • ti virusi v gost. celici inducirajo sintezo encima RNA-­‐polimeraze, ki jo usmerja RNA-­‐ replikaza (zapis za ta encim je na virusni RNA)

e) Posttranskripcijske spremembe RNA • novo sintetizirane molekule RNA = primarni transkripti običajno niso biološko aktivne, zato jih je potrebno predelati v zrele, biološko funkcionalne molekule

1.) Zorenje tRNA in rRNA: • tRNA se biokemijsko spremeni s 4 procesi: 1) krajšanje koncev s cepitvijo fosfoestrskih vezi 2) izrezovanje introna 3) dodajanje končnih zaporedij 4) spreminjanje heterocikličnih baz, običajno gre za metiliranje • rRNA zori z rezanjem perkurzorja na ustrezno velikost in z metiliranjem baz

2.) Zorenje mRNA: • zorenje poteka v 3 biokemijskih procesih: 1) pokrivanje: 5'-­‐konec mRNA se modificira s hidrolizno odstranitvijo fosfatne skupine s trifosfatne funkcionalne skupine. Sledi vezava ostanka GMP na konec 5' ter metiliranje N7 gvanina in 2'-­‐hidroksilnih skupin riboze.

Pokrivanje je potrebno za označevanje zrelih mRNA ter za njihovo zaščito pred razgradnjo, ki jo katalizirajo eksonukleaze.

2) dodajanje poli-­‐A: 3'-­‐konec mRNA se modificira z dodajanjem repa poli-­‐A. Repi poli-­‐A stabilizirajo mRNA tako, da povečajo njeno odpornost proti celičnim nukelazam.

3) spajanje kodirajočih zaporedij: končna oblika mRNA, ki se uporabi za prevajanje, je rezultat obsežnih in zapletenih kemijskih procesov, ki jih imenujemo spajnaje eksonov. Introni se izrežejo iz primarnega transkripta, eksonski fragmenti pa se povežejo v zrelo, funkcionalno mRNA. Kemijsko

61

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

gledano ti procesi predstvaljajo cepitev in preoblikovanje fosfodiesterskih povezav.

12. PREVAJANJE RNA: GENETSKI KOD IN METABOLIZEM PROTEINOV

• prevajanje/translacija = prenos info. z zaporedja v obliki mRNA v zaporedje AK v proteinih. 4-­‐črkovni jezik RNA se pretvori v 20-­‐črkovni jezik AK • triplet = niz 3 zaporednih nukleotidnih baz na mRNA, ki določajo 1 AK • neprekrivanje = niz 3 zaporednih baz deluje kot celota. Triplet baz, ki ga imenujemo kodon, se na vsaki stopnji translacije uporabi samo enkrat • odsotnost ločil = med tripleti ni nobenih ločil (vmesnih baz). Tako se mRNA prebere od začetka do konca brez vejic ali drugih presledkov.

• degeneriranost = posamezno AK lahko kodira več kot 1 tripletni kod • univerzalnost = enak genetski kod uporabljajo vsi organizmi. Nekaj izjem v kodu je le pri mitohondrijih in kloroplastih ter pri nekaterih algah.

a) Tri stopnje v sintezi proteinov

1.) Začetek sinteze, podaljševanje in zaključevanje verige: Proteini se sintetizirajo v procesu translacije, ko se zapis na mRNA prevede v zaporedje AK. Translacijo delimo v 3 stopnje: 1. stopnja: iniciacija Sinteza proteinov se začne s tem, da ribosom prepozna začetno mesto na mRNA in da v ribosom vstopi fMet, aktiviran s tRNA. Iniciacijski faktor 1 (= IF-­‐1)in iniciacijski fakotr 3 ločita malo in veliko podenoto ribosoma. mRNA se pripne na manjšo podenoti. Na začetni kodon AUG se s pomočjo IF-­‐2 veže fMet, mali podenoti se priključi še velika, inciacijski faktorji pa se oddisociirajo. tRNA se z fMet preseli n P mesto.

2. stopnja: elongacija Elongacijski faktorji priključujejo nove tRNA. tRNA se pripne na prosto mesto A na ribosomu. V procesu transpeptidacije nastane med fMet in novo AK peptidna vez.

3. stopnja: translokacija tRNA na mestu P se oddisociira, njeno mesto pa zavzame tRNA, ki zdaj nosi dipeptid.

Proces se ponavlja dokler na mesto A ne pride stop kodon. Takrat se na mRNA namesto tRNA vežejo terminacijski faktorji, ki aktivirajo peptidiltransferazo, ki katalizira hidrolizo estrske vezi med tRNA in peptidom. Peptid se sprosti, s P mesta pa oddisociira tudi tRNA. Ena mRNA se lahko hkrati prevaja na več ribosomih.

62

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

13. NASTANEK NADH IN NADPH: CITRATNI CIKLUS, GLIOKSILATNI CIKLUS IN FOSFOGLUKONATNA POT • Prejšno poglavje: glikoliza • Osredotočimo se na metabolične poti, ki omogočajo aerobno oksidacijo ogljikovega ogrodja-­‐ piruvata do CO2. Te poti se začnejo z encimskim kompleksom piruvat-­‐dehidrogenaza, ki katalizira pretvorbo piruvata v acetil-­‐CoA in tako služi kot most med glikolizo in nadaljnjo aerobno razgradnjo. Nato sledi centralna in univerzalna pot aerobnega metabolizma – citratni ciklus, v katerem se acetil CoA oksidira do CO2, pri čemer nastajajo energijsko bogate spojine ATP, NADH, FADH2.

• Citratni ciklus ima zelo pomembno vlogo v katabolizmu in pa njegovi intermediati so pomembne izhodne spojine za anabolične procese, kot so sinteza AK, nukleotidnih baz in porfirinov. Poteka v vseh oblikah aerobnega življenja, vendar pri rastlinah in nekaterih MO obstaja še dodatna pot: glioksilatni ciklus, ki tem organizmom omogoča, da izkoristijo acetat kot vir ogljikovih atomov za biosintezo (npr. glukoze). Pri živalih pa dodatna pot oksidacije glukoze predstavlja fosfoglukonatna pot (pentozafosfatna pot). Pomembna je zato, ker v njej nastajata reducirani koencim NADPH in riboza-­‐5-­‐fosfat, ki vstopata v biosinteze.

a) Kompleks piruvat-­‐dehidrogenaza

1.) Piruvat in mitohondrij • Celotna oksidacija piruvata in pretvarjanje energije , ki se pri tem sprosti, poteka v mitohondrijih.

• Mitohondriji: v vsaki evkariontski celici (pri živalih jih je največ v mišičnih celicah, ker potrebujejo veliko ATPA). Ima dva membranska sistema: zunanja membrana je prepustna za večino majhnih metabolitov, preko notranje pa lahko prehajajo samo tiste molekule, ki jim prehod omogočajo specifični membranski proteini. Vmes je medmembranski prostor. Notranja membrana obdaja matriks (s tekočino napolnjeno področje), ki vsebuje encime za nadaljnjo razgradnjo piruvata (kompleks piruvat-­‐ dehidrogenaza, encime citratnega ciklusa ter dihalne verige). Proteini, ki sodelujejo pri aerobnem metabolizmu so topni v matriksu ali pa vezani v notranji membrani.

• Piruvat lahko prehaja skozi pore zunanje membrane z difuzijo, skozi notranjo se pa lahko prenaša s pomočjo piruvat-­‐translokaze (permeaza, ki po antiportnem mehanizmu izmenjuje piruvat in hidroksidni ion).

63

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

2.) Oksidacija piruvata • pred vstopom piruvata v citratni ciklus, morajo na njem poteči 3 kemijske reakcije: dekarboksilacija (izguba CO2), oksidacija ketoskupine na C2 v karboksilno skupino in pa aktivacija z vezavo na koencimA s tioestersko vezjo.

• Encimski kompleks, ki katalizira oksidacijo piruvata do acetil-­‐CoA, se imenuje kompleks piruvat-­‐dehidrogenaza in je primer multiencimskega kompleksa (v kompleksu so trije encimi).

3.) Delovanje kompleksa piruvat-­‐dehidrogenaza

• • •

V ciklus vstopajo piruvat, NAD+ in koencimA, izstopajo pa acetil-­‐CoA, NADH, CO2.

Intermediati, ki nastajajo pri reakcijah, prehajajo iz enega encima neposredno na drugega, potem ko vsak encim opravi svojo katalitično vlogo.

1.stopnjo, dekarboksilacijo katalizira encim piruvat-­‐dehidrogenaza, na katero je vezan tiaminpirofosfat (TPP). V 2. reakciji se enota C2 (acetilna skupina) oksidira in prenese kot acetilna skupina na lipoamid, ki je vezan na E2. Končni produkt, acetil-­‐CoA, nastane v 3.reakciji pri prenosu acetilne skupine z E2-­‐lipoamida na skupino SH koencimaA. Sedaj ta lahko vstopi v citratni cikel.

64

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

Po končanih reakcijah, se mora piruvat-­‐dehidrogenaza vrniti v prvotno obliko, da lahko katalizira oksidacijo nove molekule piruvata. Pri tem mora poteči oksidacija tiolnih skupin lipoamida. V dveh oksidoredukcijskih reakcijah (4. in 5. reakcija), se 2 elektrona in 2 protona preneseta iz reduciranega E2-­‐lipoamida na E3-­‐FAD in končno na NAD+ (nastane NADH in H+). Ti dve reakciji pa katalizira E3.

• FAD/NAD+ sta koencima encimov E (to pomeni, da sta v reducirani ali oksidirani obliki).

b) Citratni ciklus/ciklus citronske kisline/Krebsov ciklus • 2 osnovna namena: oksidacija enot C2 acetil-­‐CoA do CO2. Pri tem se sproščena energija shranjuje v obliki ATP, GTP, NADH, FADH2. Drugi namen je zagotavljanje izhodnih spojin za biosintezo AK, porfirinov, pirimidinskih in purinskih baz.

• Glikoliza poteka po linearni, citratni cikel pa po ciklični poti. Za prvo imamo encime v citosolu, za citratni cikel pa v mitohondriju.

1.) Reakcije citratnega ciklusa • 1. REAKCIJA: vezava acetil-­‐CoA na oksaloacetat (adicija enote C2 na ketoskupino C4 kisline, pri čemer nastane C6 spojina, citrat). Encim, ki katalizira to adicijo, se imenuje citat-­‐sintaza.

• 2. REAKCIJA: izomerizacija in premestitev (eliminacija vode in nastanek dvojne vezi ter nato adicija vode na dvojno vez). za to reakcijo je potrebna liaza (trivialno: akonitaza). Ta encim ima posebno prostetično skupino železo-­‐žveplov kompleks.

• 3.REAKCIJA: oksidacija izocitrata (nastal po premestitvi iz citrata) oz. hidroksilne skupine le tega. Nastane nestabilen intermediat, ki po dekarboksilaciji preide v C5 kislino, α-­‐ ketoglutarat. Encim izocitrat-­‐dehidrogenaza potrebuje NAD+ kot akceptor elektronov.

• 4.REAKCIJA: oksidacija α-­‐ketoglutarata. Kompleks α-­‐ketoglutarat-­‐dehidrogenaza deluje ne enak način kot piruvat-­‐dehidrogenaza, samo da je acilna skupina, aktivirana s CoA-­‐SH, zgrajena iz štirih namesto dveh C atomov. Namen te reakcije je zbrati energijo iz dekarboksilacije α-­‐ketoglutarata v enerijsko bogati spojin sukcinil-­‐CoA. • 5.REAKCIJA: energija iz tioesterske vezi (v sukcinilkoencimuA) se pretvori v ATP/GTP. Encim, ki je potreben: sukcinil-­‐CoA-­‐sintetaza. Ta reakcija je primer nastanka ATP v procesu fosforilacije na ravni substrata (večina ATP v celici nastane pri oksidativni fosforilaciji).

• 6.REAKCIJA: sukcinat iz prejšnje reakcije, se oksidira do fumarata v reakciji, ki jo katalizira sukcinat-­‐dehidrogenaza (ima FAD kot prostetično skupino in železo-­‐žveplo kompleks).

• 7.REAKCIJA: fumarat, anion nenasičene dikarboksilne kisline, postane substrat za adicijo vode na dvojno vez. Reakcijo katalizira fumarat-­‐hidrataza/fumaraza. Nastane L-­‐malat.

• 8.REAKCIJA: oksidacija hidroksilne skupine L-­‐malata. Nastane oksaloacetat. Encim: malat-­‐ dehidrogenaza (potrebuje koencim NAD+).

•

65

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

66

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

c) Vloga citratnega ciklusa pri uravnavanju in biosintezi

1.) Uravnavanje aerobnega metabolizma piruvata • Vstop piruvata in acetil-­‐CoA je strogo nadzorovan.

Ta nadzor izvajajo encimi: piruvat-­‐dehidrogenaza, citrat-­‐sintaza, izocitrat-­‐dehidrogenaza, α-­‐ ketoglunat-­‐dehidrogenaza.

• Kompleks piruvat-­‐dehidrogenaza je natančno uravnan. Njegovo aktivnost inhibirata NADH in ATP, spodbudijo jo pa povečane koncentracije AMP, NAD+, CoASH.

2.) Anabolična vloga citratnega ciklusa • Citratni cikel je amfiboličen, kar pomeni, da deluje pri razgradnji in biosintezi.

• Ciklus je pomemben vir izhodnih spojin za biosinteze (intermediati se preusmerijo iz cikla in njihovi C atomi se uporabijo za začetek sinteze važnih biomolekul, kot so AK, nukleotidi in porfirini) • Anaplerotične (oskrbovalne reakcije): reakcije, ki so se razvile, da nadomeščajo manjkajoče intermediate, če se ti usmerijo v biosintezo drugih molekul.

67

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

d) Glioksilatni ciklus • Višje rastline in nekateri mikrobi ter alge lahko izkoriščajo spojino acetat, CH3COO-­‐, kot metabolično gorivo in kot izhodno spojino za biosintezo glukoze.

• V ciklu nastane iz dveh molekul acetil-­‐CoA sukcinata kislina s štirimi ogljikovimi atomi in dvema karboksilnima skupinama.

Posebej pomemben v semenih višje razvitih rastlin. Ta niz reakcij jih omogoča izkoriščanje energije, uskladiščene v olju semen. Ta imajo specializirane celične organele, imenovane glioksisome, ki poleg večine encimov citratnega ciklusa, vsebuje še encima izocitrat-­‐liazo in malat-­‐sintazo.

e) Fosfoglukonatna pot • Nekatere živalske celice imajo za metabolizem glukoze še drugo pot, ki vodi do posebnih produktov.

• Ta pot oksidira glukozo do pentoze riboza-­‐5-­‐fosfata (prekurzor za sintero nukleotidov) in pri tem nastane reduciran koencim NADPH (potreben za redukcijske reakcije biosinteznih procesih, še posebej v tkivih, kjer nastajajo MK in steroidi) •

68

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

•

Taka sekundarna pot je pomembna tudi pri eritrocitih, katerih pravilno delovanje je odvisno od NADPH. fosfoglukonatna pot ne poteka v skeletenih mišicah.

69

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

14. VERIGE ZA PRENOS ELEKTRONOV IN NASTANEK ATP •

V prejšnjih stopnjah metabolizma se le manjši del energije preveden v obliko ATP. Ostanek energije iz hranilnih snovi se je zbral v obliki elektronov z velikim energijskim potencialom, vezanim v reduciranih koencimih (NADH, FADH2). Prosta entalpija, ki jo imajo ti koencimi, se lahko porabi, če je na razpolago molekulski kisik kot končni akceptor elektronov. Elektroni se iz koencimov ne prenesejo neposredno, pač pa potujejo preko vrste prenašalcev elektronov, ki se ob sprejetju elektronov reducirajo in ponovno oksidirajo, ko elektrone oddajo naslednjemu členu v prenašalni verigi. Pri rastlinah in živalih je VERIGA ZA PRENOS ELEKTRONOV umeščena v notranjo mitohondrijsko membrano. Del energije, ki se sprosti v verigi, se porabi za črpanje protonov skozi notranjo mitohondrijsko membrano, s čimer nastaja transmembranski protonski gradient. Energija protonskega gradienta se porabi za sintezo ATP (ADP + P ↔ ATP + H2O). To reakcijo katalizira encimski kompleks ATP-­‐sintaza.

• Veriga za prenos elektronov in sinteza ATP sta končni stopnji aerobnega metabolizma.

a) Prenos elektronov v mitohondrijih •

•

Pomembni integralni membranski proteini, ki so vsajeni v notranjo mitohondrijsko membrano ali periferni membranski proteini, so na membrano vezani.

ki

Notranja membrana mitohondrija je močno zgubana, kar zagotavlja veliko površino za namestitev potrebnih molekulskih sistemov, ki omogočajo nastanek velikega števila molekul ATP. Sestavni deli verige za prenos elektronov so v membrano nameščeni v obliki RESPIRATORNIH KOMPLEKSOV. Notranja mit. membrana vsebuje tudi strukture, ki štrlijo v mitohondrijsko sredico. Te tvorbe so del kompleksa ATP-­‐sintaze, kjer poteka sinteza ATP.

1) Prenos elektronov in oksidativna fosforilacija •

Elektroni, ki jih z oksidacijo dobimo iz molekul hranil in intermediatov metabolizma, dehidrogenaze prenesejo na koencime NAD+ in FAD.

•

Splošna reakcija: AH2 + NAD+ ↔ A + NADH + H+ (AH, A je reduciran oz. oksidiran intermediat, ki nastane ali v glikolizi ali z oksidacijo piruvata ali v citratnem ciklu)

•

Ker celice vsebujejo le omejeno količino oksidiranih koencimov NADH/FAD, so morajo reducirani koencimi neprestano obnavljati (reoksidirati).

To se dogaja v procesu prenosa elektronov na končni akceptor elektronov, ki je v tem primeru kisik.

70

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

2) Veriga za prenos elektronov •

Elektroni se od NADH/FADH2 prenašajo na kisik preko vrste prenašalcev elektronov, ki skupaj predstavljajo verigo za prenos elektronov.

•

Glavni del verige za prenos elektronov so štirje veliki beljakovinski kompleksi: NADH: ubikinon-­‐oksidoreduktaza ali krajše NADH-­‐dehidrogenaza oz. KOMPLEKS I, sukcinat: ubikinon-­‐oksidoreduktaza ali krajše sukcinat-­‐dehidrogenaza oz. KOMPLEKS II, ubikinol: (feri)citokrom c-­‐oksidoreduktaza ali krajše citokrom c-­‐reduktaza oz. KOMPLEKS III in (fero)citokrom c: kisik-­‐oksidoreduktaza ali krajše citokrom c-­‐oksidaza oz. KOMPLEKS IV.

•

Večina prenašalcev v teh kompleksih je integralnih membranskih proteinov z različnimi prostetičnimi skupinami, ki lahko sprejemajo ali oddajajo elektrone (lahko delujejo kot reducenti ali oksidanti)

•

V verigi sta pomembna vrstni red prenašalcev elektronov in količina energije, ki se sprosti ob oksidaciji koencimov.

•

Prenašalci so v verigi nameščeni tako, da njihova afiniteta do elektronov vzdolž verige narašča. To omogoča, da je toliko elektronov od dajalca do sprejemnika elektronov nemoten in ne rabi dodatne energije.

•

Elektroni z NADH potujejo na kompleks I, ki ga sestavljajo proteini, ki vsebujejo prostetično skupino FMN (flavinmononukleotid) in Fe – S kompleks. FADH2 oksidirajo ti Fe – S kompleksi, ki so del kompleksa II in tudi acil – CoA – dehidrogenaze. Elektroni iz NADH in FADH2 vstopajo v verigo za prenos elektronov na 2 različnih mestih, obe njihove poti pa se srečata na CoQ. Elektroni z reducirane oblike CoQ potujejo na kompleks III, od tu pa se prek citokrom c – reduktaze prenesejo na citokrom c. Ta jih posreduje citokrom c – oksidazi (kompleks IV), prek katere se nato prenesejo na končni akceptor O2, ki se tako reducira v vodo.

71

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

•

Relativne energijske ravni posameznih prenašalcev v verigi kvantitativno ponazorimo s standardnimi oksidoredukcijskimi potenciali, E0 . So merilo, ki nam pove kako rada se neka snov reducira (kako rada sprejme elektrone, kako dober oksidant je). Snovi, ki imajo pozitiven E0, imajo večjo afiniteto do elektronov kot H+. Končni in najboljši sprejemnik elektronov v mitohondrijski verigi za prenos elektronov je kisik, ki ima v tej verigi največjo vrednost E0.

•

Druga pomembna značilnost verige je količina energije, ki se sprosti med prenosom elektronov od enega do naslednjega prenašalnega člena v verigi. To energijo lahko izračunamo in podamo v obliki spremembe standardne proste entalpije, ∆G0, s pomočjo enačbe: ∆G0 = -­‐ nF∆E0, kjer je n število elektronov, ki se prenašajo iz enega na drugi prenašalec, F = Faradayeva konstanta, ki je 96, 5 kJ/V mol in ∆E0 razlika med oksidoredukcijskima potencialoma prejemnika in dajalca elektronov.

•

Vsa energija se ne sprosti naenkrat, temveč postopoma ob vsaki oksidoredukcijski reakciji v verigi. Energija, ki se sprosti v teh reakcijah se pretvori v energijo transmembranskega protonskega gradienta, ki poganja sintezo ATP.

b) Sestavni deli verige za prenos elektronov

1) Kompleks I •

elektroni se iz NADH prenesejo na prvi prenašalni člen kompleksa – flavinmononukleotid (FMN). Ta se reducira tako, da iz NADH sprejme 2 elektrona. Nato se reoksidira, ko odda elektrona prostetični skupini s kompleksom Fe – S atomov. Pot elektronov po kompleksu I se smiselno zaključi s prenosom elektronov na ubikinon (= koencim Q ali krajše CoQ). Najdemo ga praktično v vseh verigah za prenos elektronov. Je najmanjši in najbolj hidrofoben od vseh prenašalcev. Ima dolgo alifatsko stransko verigo s katero je trdno ujet v nepolarni del notranje mitohondrijske membrane. Ko CoQ sprejme 2 elektrona in 2 protona se reducira v ubikinol (CoQH2)

2) Kompleks II •

Preko CoQ vstopajo v verigo tudi elektroni iz koencima FADH2. V mitohondrijski membrani sta vsaj 2 različici tega kompleksa. Encim sukcinat – dehidrogenaza in acil – CoA – dehidrogenaza usmerjata prenos elektronov iz substratov, ki jih oksidirata (sukcinat in acil CoA), preko FADH2 na CoQ. Oba vsebujeta Fe – S komplekse in sta integralna membranska proteina, vsajena v notranjo mitohondrijsko membrano.

72

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

3) Kompleks III •

Elektroni se prenesejo iz ubikinola na citokrom c. Prenašalci elektronov v tem kompleksu so Fe-­‐S proteini in citokromi (so proteinski prenašalci elektronov, ki imajo za prostetično skupino hem in spominjajo na proteina, ki prenašata kisik, torej na mioglobin in hemoglobin). Hem lahko naenkrat sprejme ali odda po en elektron.

•

Do zapletov pride zato, ker CoQH2 lahko odda 2 elektrona hkrati, citokromi pa lahko naenkrat sprejmejo le en elektron. Zaradi tega se elektroni razdelijo na 2 ločeni a vseeno povezani poti, ki sestavljata Q-­‐ciklus.

4) Kompleks IV •

Celoten kompleks sestavlja 10 proteinskih podenot z dvema vrstama prostetičnih skupin: hem in 2 bakrova iona. Elektroni, ki se prenašajo od citokroma C do O2 potujejo preko železovih ionov v obeh hemih in preko bakrovih ionov.

•

Toliko elektronov od koencimov preko naštetih kompleksov na kisik ustvarja tudi tok protonov skozi notranjo mitohondrijsko membrano. Nastali protonski gradient zagotavlja potrebno energijo za sintezo ATP.

c) Oksidativna fosforilacija •

Je kombinacija dveh različnih procesov: tok elektronov od koencimov do kisika po verigi za prenos elektronov in fosforilacije ADP z anorganskim fosfatom v ATP. To drugo stopnjo katalizira ATP sintaza, ki je vsajen v notranjo mitohondrijsko membrano. Energija, ki se sprosti pri transportu elektronov, se zbere in pretvori v najprimernejšo obliko, ki omogoča sintezo ATP. V nepoškodovanih mitohondrijih sta oba procesa povezana drug z drugim in soodvisna. Molekule hranil se oksidirajo le takrat, ko celice potrebujejo ATP. Po drugi strani pa ATP ne more nastati z oksidativno fosforilacijo, če ni energije, ki jo ustvarja transport elektronov.

•

Predvidimo 3 posebna mesta vzdolž verige za prenos elektronov, kjer pride do sklopitve s sintezo ATP. To pa velja le za tiste elektrone ki vstopajo v prenašalno verigo iz NADH. Prenos 2 elektronov preko sklopitvenih mest vodi k nastanku ATP.

•

Prvo sklopitveno mesto je na kompleksu I (NADH-­‐dehidrogenaza), drugo na kompleksu III (citokrom c – reduktaza), tretje pa na kompleksu IV (citokrom c-­‐ oksidaza)

•

Načini sklopitve: KEMIOSMOZNA SKLOPITEV: pri prenosu elektronov po členih verige pride do usmerjenega črpanja protonov prek notranje mitohondrijske membrane iz matriksa v medmembranski prostor. Pri tem se ustvari protonski gradient (razlika v elektrokemijskem potencialu). V termodinamičnem smislu je protonski gradient zelo nestabilen sistem za visoko energijo.

Porušenje takega gradienta sprosti energijo, ki se porabi za nastanek 73

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

ATP iz ADP v procesu fosforilacije. Reakcijo katalizira encimski kompleks ATP – sintaza.

•

ATP sintaza štrli iz notranje mitoh. membrane v matriks. Sestavljata jo 2 osnovni enoti (F0 in F1). Slednja vsebuje katalitične podenote ATP sintaze, tu iz ADP in protonskega gradienta nastaja ATP. F0 je integralni membranski proteinski kompleks in deluje kot transmembranski kanalček, skozi katerega potujejo protoni.

15. METABOLIZEM MAŠČOBNIH KISLIN IN LIPIDOV

• maščobne kisline so pomembne kot metabolično goriv • uskladiščene so v oblik triacilglicerolov • primerne so za dolgoročno energijsko zalogo, saj dajejo več energije na enoto mase kot OH • so močno reducirane in morajo za to skozi več oksidacijskih stopen, da se popolnoma razdradijo • triacilgliceroli so nepolarne molekule in so v maščobnem tkivu uskladiščene v brezvodni obliki, medtem ko so OH povezani z molekulami vode • razgradnja MK poteka v procesu β-­‐oksidacije, pri katerem po 4 reakcijah nastane acetil-­‐CoA, ta pa se običajno razgrajuje v citratnem ciklusu • sinteza in β-­‐oksidacija MK imata podoben kemizem, vendar so pri obeh procesih udeleženi različni encimski sistemi in različni celični razdelki. β-­‐oksidacija poteka v mitohondriju, sinteza pa v citosolu.

a) Metabolizem triacilglicerolov iz hrane

• MK se morajo prinesti do celice, kjer poteka β-­‐oksidacija (jetra, srce, skeletne mišice), da jih lahko uporabimo kot vir E • poznamo 3 glavne vire MK za energijski metabolizem človeka in živali: 1) triacilgliceroli iz hrane 74

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

1.)

•

•

• • •

• • 2.)

•

• • •

b) 1.)

• •

•

• • • •

2) v jetrih sintetizirani triacilgliceroli 3) v adipocitih v obliki kapljic uskladiščeni triacilgliceroli

Prebava maščob: triacilgliceroli se iz hrane pred vstop v tanko črevo le malo spremenijo, zato se iz žolčnika sprostijo žolčne kisline (npr. holat in glikoholat), ki maščobe razpršijo v manjše kapljice. Tako se površina poveča in maščobe postanejo bolj dostopne za encime, kot je pankreasna lipaza. pankreasna lipaza katalizira reakcijo hidrolize estrske vezi med glicerolom in MK in razgradi triacilglicerol do produktov, med katerimi je poleg glicerola in diacilglicerolov največ prostih MK in monoacilglicerolov iz produktov maščob in žolčnih kislin nastanejo miceli, v katere se vključijo holesterol, produkti prebave fosfolipidov in vitamini D,E,K,A miceli omogočijo prenos produktov prebave do celic črevesne sluznice, kjer poteka njihova absorpcija, v celicah pa pride do ponove sinteze triacilglicerolov hilomikroni = lipoproteini v krvi in limfi, ki nastanejo s povezavo triacilglicerolov s proteini, omogočajo prenos zaužitih maščob po organizmu. V notranjosti imajo triacilglicerole, zaestren holesterol, na površini pa holesterol, fosfolipide in proteine, ki hilomikronom povečajo topnost. lipoprotein-­‐lipaza (encim na stenah kapilar) s hidrolizo cepi triacilglicerole, ki so del hilomikronov. Ob tem se sprostijo MK. adrenil in glukagon = hormona, ki uravnavata sproščanje MK iz zalog v maščobnih celicah

Maščobne kisline v mišičnih celicah MK se po krvi prenesejo do maščobnega tkiva, preidejo preko membrane v citosol, kjer se aktivirajo à s tioestrsko vezjo se povežajo s koencimom A (potrebna je ATP), reakcijo katalizira acil-­‐CoA-­‐sintetaza med aktivacijo nastane intermediat – aciladenilat ali acil-­‐AMP estri MK s CoASH se morajo prenesti iz citosola v mitohondrijski matriks, kjer se začne razgradnja aktivirane MK lahko nemoteno preidejo zunanjo membrano mitohondrija, pri prehodu skozi notranjo pa jim pomagajo molekule karnitina (acilkarnitin/karnitintranslokaza – integralni protein v notranji membrani predstavlja kanal za prehod kemično modificiranih MK)

Razgradnja MK

Reakcije β-­‐oksidacije začne se po vstopu nasičenih MK v matriks mitohondrija β-­‐oksidacija acil-­‐CoA poteka s ponavljajočim zaporedjem 4 reakcij: 1) oksidacija enojne vezi med dvema C-­‐atomoma do dvojne vezi, v sodelovanju s FAD 2) adicija vode na dvojno vez z uvedbo hidroksilne skupine na enega od Cjev 3) oksidacija hidroksilne skupine v prisotnosti NAD+ do ketoskupine 4) razcep vezi C-­‐C in sprostitev acetil-­‐CoA metabolična pot je spiralna, vsak popoln obrat spirale vključuje 4 encimsko katalizirane reakcije, ki vodijo do sprostitve acetil-­‐CoA in verige MK, krajše za 2 C-­‐atoma. Število obratov ne ustreza neposrednemu številu nastalih acetil-­‐CoA glej tabelo na strani 497 razgradnjo MK predstavljajo predvsem oksidacijske reakcije (2 od 4ih), drugi 2 sta reakciji nehidrolitične cepitve ob adiciji na dvojno vez acil-­‐CoA à nenasičen acil-­‐CoA à hidroskiacil-­‐CoA à ketoacil-­‐CoA v zadnji stopnji β-­‐oksidacije (reakcija 8, tabela str. 497) se od estra 3-­‐ketoacil-­‐CoA odcepi enota z dvema C-­‐atomoma in skrajšan acil-­‐CoA je pripravljen za naslednji obrat β-­‐oksidacije 75

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

2.) Pomen β-­‐oksidacije • nastanejo produkti, ki so za metabolizem zelo pomembni • neto reakcija za palimtinsko kislino: palmitinska kislina + ATP +7FAD + 7NAD+ + 8CoASH + 8H2O à 8acetil-­‐CoA + AMP + 2Pi + 7FADH2 + 7NADH + 7H+

3.) β-­‐oksidacije nenasičenih MK • za popolno razgradnjo nenasičenih MK potrebujemo poleg 4 encimov β-­‐oksidacije še 2 pomožna encima (enoil-­‐CoA-­‐izomeraza, 2,4-­‐dienoil-­‐CoA-­‐reduktaza) • nenasičene MK se absorbirajo, prensejo in aktivirajo na isti način kot nasičene • adicije vode, hidrataza ne more katalizirati, ker je dvojna vez cis namesto trans + na napačnem mestu à enoil-­‐CoA-­‐izomeraza katalizira preureditev dvojne vezi • končni produkt je tako kot pri nasičenih acetil-­‐CoA

4.) β-­‐oksidacija MK z lihim številom ogljikovih atomov • razgrajujejo se običajno z β-­‐oksidacijo • ob zadnji cepitvi poleg acetil-­‐CoA nastane še fragment s 3 C-­‐atomami à propionil-­‐CoA -­‐ ne vstopa v citratni ciklus, kot acetil-­‐CoA, ampak se pretvori v sukcinil-­‐CoA. Za to so potreben 3 reakcije: 1) karboksilacija do D-­‐metilmalonil-­‐CoA 2) izomeracija do L-­‐metilmalonil-­‐CoA 3) preureditev do sukcinil-­‐CoA

c) Biosinteza MK • količina maščob, ki se lahko skladiščijo je neomejena • encimi za biosintezo MK so v citosolu, izhodna spojina pri biosintezi MK ima 3 C-­‐atome (malonilna skupina malonil-­‐CoA) à to so razlike od β-­‐oksidacije (tu je končni produk acetil-­‐ CoA in ne malonil-­‐CoA( 1.) Stopnje v biosintezi MK • MK se sintetizirajo iz acetil-­‐CoA v citosolu, vse metabolične poti, v katerih acetil-­‐CoA nastaja pa potekajo v matrikus mitohondrija • acetil-­‐CoA ne more preiti skozi notranjo membrano mitohondrija, zato se pretvori v citrat (acetil-­‐CoA reagira s oksaloacetatom in nastane citrat, reakcijo katalizira citrat-­‐sintaza) • citrat se prenese s pomočjo integralnega proteina (trikarboksilat-­‐translokaze) v citosol), kjer se razcepu v acetil-­‐CoA in oksaloacetat (se vrne v mitohondrij) • končni produkt sinteze MK je palmitat • glej tabelo stran 505 • MK z daljšo verigo se sintetizirajo z elongacijskim encimskim sistemom na endoplazemskem retikulumu

2.) Biosinteza nenasičenih MK • sintetizirajo se na endoplazemskem retikulumu z encimi acil-­‐CoA-­‐desaturaze

d) Holesterol • v organizmu ima več vlog: - je pomembna komponenta membran živalskih celic, kjer uravnava fluidnost - izhodna spojina večjega števila pomembnih biomolekul, med njimi steroidnih hormonov, žolčnih kislin in vitamina D

1.) Biosinteza holesterola 76

FARMACEVTSKA BIOKEMIJA

•

poteka v 4 stopnjah: 1) 3 molekule acetil-­‐CoA se združijo v 2 zaporednih reakcijah in nastane 3-­‐hidroksi-­‐3-­‐ metiglutaril-­‐CoA (HMG-­‐CoA). Te reakcije lahko potekajo v vseh celicah, najbolj intenzivno pa v jetrih. Encimi, ki katalizirajo te reakcije, so del membrame endoplazemskega retikuluma, vendar produkti nastajajo v citosolu. Encim endoplazemskega retikuluma HMG-­‐CoA-­‐reduktaza katalizira nastanek mevalonata, pri tem se uporabi NADPH kot koencim.

2) Naslednje 4 reakcije pretvorijo mevalonat (= spojina s 6 C-­‐atomi, ki nastane iz acetil-­‐ CoA in vstopa v sintezo holesterola) v aktivirana izoprena (molekula s 5 C-­‐atomi, iz kateih se v celicah sintetizirajo terpeni in steroidi). V prvih 3 zaporednih reakcijah mevalonat sprejem 3 fosforilne skupine, vsako iz druge molekule ATP. Nato poteče dekarboksilacija produkta do izopentenilpirofosfata (= ena od 2 aktiviranih spojih, imenovanih izopreni).

3) Sinteza skvalena (= necikični ogljikovodik, terpen s 30 ogljikovimi atomi, ki je intermediat v biosintezi holesterola) poteče z zaporedno kondenzacijo več izoprenskih enot.

4) Ciklizacija skvalena in pretvorba do holesterola.

77