INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CONKAL
MANUAL DE PRÁCTICAS DE TOXICOLOGÍA Y MANEJO DE PLAGUICIDAS
INGENIERÍA EN AGRONOMÍA
M.C. FRANCISCO JAVIER NAVA GUIZAR
JUNIO DE 2010
PRÓLOGO
La necesidad concreta de proporcionar material de apoyo para que realicen prácticas los estudiantes, es de primordial importancia en su formación como futuros profesionales en el ramo de Fitosanidad Tropical, en el conocimiento de la Toxicología y el uso y manejo correcto de plaguicidas empleados en la Agricultura moderna que depende en gran parte para la producción de los agroquímicos convencionales como es el caso de los pesticidas.
La
presente
obra
denominada
MANUAL
DE
PRÁCTICAS
DE
TOXICOLOGÍA Y MANEJO DE PLAGUICIDAS conforma un texto para la materia de Toxicología y Manejo de Plaguicidas, que se imparte a los alumnos de la carrera de Ingeniería en Agronomía de la orientación de Fitosanidad Tropical.
Este manual estará disponible para todos los alumnos que lleven el curso mencionado.
1
PRESENTACIÓN
Ciclo tras ciclo de producción agrícola, se emplean en todo el mundo, más y más cantidades de poderosas sustancias o ingredientes activos denominados plaguicidas para combatir y prevenir o controlar diversas plagas y/o enfermedades catalogadas como dañinas para el ser humano, animales domésticos y los cultivos agrícolas.
El presente manual esta dirigido a los alumnos de la Carrera de Ingeniería en Agronomía de la Orientación de Fitosanidad Tropical. Para reforzar los conocimientos teóricos y sean capaces de dar un mejor uso razonable al empleo de los plaguicidas sin abusar de manera irracional de estas moléculas activas y poder contribuir en lo necesario a mantener el entorno sano; libre de estas sustancias tóxicas.
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ÍNDICE
Nombre de la práctica
Pagina
Prólogo
1
Presentación
2
Práctica 1: Investigación de pesticidas mediante visitas a empresas distribuidoras de productos pesticidas en el área de influencia
4
Práctica 2: Análisis toxicológico de insecticidas en áreas agrícolas de la región
7
Práctica 3: Calibración y dosificación de una mochila manual para aplicación de plaguicidas
10
Práctica 4: Establecimiento y medición de criterios de muerte en una especie tipo de insecto plaga
13
Práctica 5: La curva dosis-mortalidad con paratión metílico en poblaciones de Helycoverpa zea y Heliothis virescens (Lepidoptera: Noctuidae)
en
dos
años,
mediante
impregnación
en
vidrio
(microgramos por frasco)
16
Práctica 6: Sensibilidad in Vitro de fungicidas de contacto y antibióticos para el control de bacterias
21
Práctica 7: Sensibilidad in Vitro de fungicidas de contacto y sistémicos para el control de hongos
25
Práctica 8: Evaluación de plaguicidas con efecto nematicida
29
Bibliografía
32
3
Práctica 01 Investigación de pesticidas mediante visitas a empresas distribuidoras de productos pesticidas en el área de influencia
Introducción
Ante la problemática ecológica que presenta el usos y manejo de pesticidas, una de las mayores dificultades a todos los niveles; es la falta de información
objetiva
sobre
los
productos
disponibles
en
una
región
determinada.
Se hace necesario dejar bien establecidos los parámetros toxicológicos importantes para el registro y formulación de pesticidas, determinar tolerancias y manejar aspectos específicos para su uso mas adecuado y eficaz.
Si se hiciera un uso y manejo más racional de estos productos, con bases científicas y que, aplicándolos cuando fuera estrictamente necesario y ante la ausencia de otra medida de combate, estas moléculas volverían a ser apreciadas como la herramienta de gran valor que son y no como aliados del diablo (Lagunes y Villanueva, 1999).
Objetivos: Conocer los diferentes grupos toxicológicos de pesticidas que se distribuyen en el área de influencia.
Conocer la manera de cómo se encuentran almacenados en las casas (bodegas) comerciales y distribuidoras, veterinarias y centros comerciales.
Determinar si los dependientes manejan y conocen adecuadamente los diferentes pesticidas.
Material Empresas y casas distribuidoras, veterinarias y centros comerciales Cuestionario formulado por los estudiantes Libreta de campo 4
Lápiz Equipo Computadora portátil (Lap-top) o de escritorio Memoria USB
Procedimiento
1. Ubicar de preferencia todos los locales que se dedican a la venta y distribución de productos pesticidas formulados destinados a la agricultura, sector pecuario y al sector salud e industrial.
2. Visitar y realizar entrevistas a los propietarios y/o dependientes de las casas distribuidoras para iniciar el análisis acerca de los productos pesticidas que tienen a la venta.
3. Incluir todos los grupos toxicológicos de pesticidas como son insecticidas, fungicidas, antibióticos y/o bactericidas, nematicidas, herbicidas, rodenticidas y productos orgánicos que se apliquen en el sector agropecuario, industria alimentaria y el sector salud e industrial, otros.
4. Dividir el estudio para su respectivo análisis, en apartados como son: productos de uso agrícola, productos de uso pecuario, productos de uso doméstico, productos de uso urbano y del sector salud.
5. Obtener datos de la frecuencia de adquisición de estos productos agroquímicos.
6. El estudio se basa en el cuestionario que a continuación se describe: Nombre empresa y/o casa comercial:_____________ Fecha entrevista:______
Datos del producto formulado pesticida Nombre comercial (N.C)________________________ Ingrediente activo (i.a)__________________________ Tipo de formulación____________________________ 5
Grupo toxicológico___________________________ Compañía formuladora________________________ Modo de acción______________________________ Categoría toxicológica_________________________ Fitotoxicidad_________________________________ Medidas de protección al ambiente_______________ Precio______________________________________
Cultivo
Plaga
Dosis
Intervalo de seguridad
Observaciones:__________________________________________________
Análisis y discusión de resultados
¿Qué problemática surgió de acuerdo a la disponibilidad de la información? ¿Los almacenes cumplen con las normas necesarias de manejo y de salud? Realizar un listado de las casa distribuidoras y su respectiva ubicación. Enlistar
por
grupos
toxicológicos
y
graficar
porcentajes
por
grupos
toxicológicos.
6
Práctica 02
Análisis toxicológico de insecticidas en áreas agrícolas de la región
Introducción
Tener
datos sobre los insecticidas que se emplearon, cuando se
emplearon, volúmenes aplicados, área tratada y principales insectos plaga combatidos, hace posible estimar con que producto o productos es más conveniente iniciar la siguiente temporada y cuales no deben emplearse por algún tiempo.
Objetivo: Realizar un análisis toxicológico del uso de insecticidas en cultivos de interés comercial mediante entrevistas a productores de la región.
Material 5-10 áreas de cultivos hortícolas (chile habanero, tomate y cucurbitáceas) Cuestionario elaborado por los estudiantes Libreta de campo Lápiz Papelería Equipo Computadora portátil (Lap-top) o de escritorio Calculadora Memoria USB
Procedimiento
1. Ubicar de 5 a 10 áreas (parcelas de dimensiones diversa) de cultivo donde se hayan aplicado productos insecticidas con un mínimo de 5 años de antigüedad y determinar contra que plagas y/o cultivos usan y manejan los insecticidas.
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2. Realizar entrevistas a los productores para hacer el análisis acerca de los productos insecticidas que se han aplicado en sus cultivos los últimos 5 años de producción continua.
3. Obtener datos de dosis y frecuencia de aplicaciones.
4. el estudio se basa en el cuestionario que a continuación se describe:
Análisis toxicológico
Nombre del productor:__________________ Período o ciclo:______________ Localidad y municipio:__________________ Cultivo:_____________________ Total hectáreas:_______________________ Fecha entrevista:_____________ Nombre comercial
Plaga Ingrediente activo (i.a)
Grupo
Dosis
Nº
gr. i.a
kg
toxicológico
(L o
aplic.
por lt o
de
kg/ha)
en el
kg de
i.a
período producto total de cultivo
Observaciones:__________________________________________________
Análisis y discusión de los resultados obtenidos
Definir las siguientes cuestiones:
¿Determinar que productos insecticidas utilizan los productores de la región? ¿Qué insecticidas son más comunes? ¿Graficar que porcentaje de productores utilizan insecticidas organosintéticos? ¿Analizar que insecticidas se aplican con más frecuencia por temporada de cultivo?
8
¿Graficar las aplicaciones de insecticidas por temporada que realizan los productores de la región? ¿Qué rangos de dosis manejan y con que frecuencia de aplicación?
9
Practica 03
Calibraciรณn y dosificaciรณn de una mochila manual para aplicaciรณn de plaguicidas Introducciรณn
La dosificaciรณn y aplicaciรณn de los plaguicidas, se realiza tomando en cuenta como superficie la unidad de รกrea conocida como hectรกrea, pero no se tiene en cuenta que al momento de aplicar, el รกrea vegetativa no es la misma, ya que el cultivo puede estar en etapa de plรกntula, vegetativa, en floraciรณn, decadencia, etc.
Quizรก se comente que la aplicaciรณn se dirige a la plaga y no a la planta. Por tal motivo es de vital importancia la calibraciรณn y dosificaciรณn de productos plaguicidas.
Objetivo: Conocer como se calibra y dosifica un equipo convencional (mochila manual) de aplicaciรณn de plaguicidas para ahorrar gasto de agua y producto comercial.
Material Agua limpia 20 lt. Probeta de 1000 ml Probeta de 50 ml Cinta mรฉtrica (flexรณmetro) ร rea de cultivo (chile habanero, tomate, etc.), 400 m2 (= un mecate), 25 mecates (= 1 ha). Plaguicida (insecticida, fungicida o antibiรณtico) Equipo Mochila convencional de 15 o 20 litros de capacidad. Calculadora
10
Procedimiento
1. Tomar como estándar 400 litros de agua limpia por hectárea para plantas adultas, independientemente de la dosis proporcionada para la plaga y/o enfermedad por la etiqueta del producto comercial o tipo de formulación. 2. Medir con la cinta métrica 400 m2. 3. Calibrar con el fin de saber cuánta agua se necesita para cubrir 400 m2 o una hectárea, dependiendo de la etapa fenológica del cultivo a tratar. Generalmente se calibra por mecate y posteriormente se traspola por hectárea o en si, la cantidad de mochilas (bombas) utilizadas por mecate.
4. Para calibrar un mecate de chile habanero con una bomba de capacidad quince litros de agua, se multiplican los 15 litros por 25 mecates que equivalen a una hectárea; el resultado corresponde a 375 litros de agua por hectárea.
Calibración= (15 lt de agua X 25 mecates) = 375 lt agua/ha
5. Para saber que dosis (dosificación) de pesticida formulado se tiene que utilizar, va ha depender de la calibración que se obtenga. Utilizar la siguiente formula X= litros de agua calibrado por cantidad de insecticida entre 400 litros de agua igual a dosis de producto comercial.
Dosis= (litros de agua calibrados X cantidad de insecticida/400 lt agua)= dosis de producto comercial a aplicar.
Análisis y discusión de los resultados
Definir las siguientes cuestiones: ¿Qué cantidad de agua se requiere para cubrir 10,000 m2 donde la etapa fenológica del cultivo son plántulas y se tiene un problema de mosquita blanca (Bemisia tabaci Genn.)? 11
¿Qué dosis de producto se utilizará si se recomienda 1 lt. por hectárea en plantas adultas para B. tabaci?
Repetir las acciones para otras plagas que causan daños en los diferentes cultivos de solanáceas y cucurbitáceas.
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Práctica 04
Establecimiento y medición de criterios de muerte en una especie tipo de insecto plaga Introducción
Entre los criterios empleados podemos citar ausencia de movimiento, “derribo” (knockdown) definidos por Champ y Dyte (1976) como la incapacidad de ponerse en pie o caminar normalmente, incapacidad de la larva
de
desplazarse al menos una distancia equivalente a la longitud de su cuerpo.
Magaro y Edelson (1990), es una respuesta tan exótica como el hábito tejedor en arañas, Samu y Vollrath (1992), tan compleja como un sistema de clasificación asociado al comportamiento de larvas tratadas. Monke et al., 1985 en el que se incluyen seis categorías que van desde larvas “obviamente” muertas, hasta larvas “normalmente” vivas.
Es siempre de gran importancia antes de realizar un bioensayos, definir correctamente el criterio de muerte de acuerdo a la especie de insecto plaga con que se va ha trabajar y el método de aplicación del tóxico, por ejemplo, “película de residuo o película para inmersión” ya que dicho método que se seleccione debe ser rápido, fácil y eficiente para medir la respuesta y se define antes de corre el bioensayos a realizar.
Objetivo: Establecer la metodología para medir la causa de muerte de una especie tipo de insecto plaga expuesto a un tóxico.
Material Biomaterial: se requiere de insectos plaga vivos para los tratamientos. Frascos gerber, frascos ámbar o viales de vidrio o de plástico (20-100 ml) limpios y esterilizados Acetona Pipetas 1, 5, 10 ml
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Probetas de 50, 100 y 1000 ml Papel aluminio Tela organiza Libreta campo, marcador y lápiz Ligas Jabón detergente Insecticidas piretroides, carbamatos u organofosforados Equipo Olla de presión Calculadora
Procedimiento
1. Se selecciona una población de insectos plaga, expuesta a tres diferentes dosis del tóxico más un testigo sin tóxico.
2. Tomar datos sobre la sintomatología y la respuesta a estímulos a intervalos de 30 minutos, 1, 6, 12, 24 y 48 horas.
3. Exposición en película residual en cuatro frascos Gerber (10 insectos adultos por frasco), limpios, lavados con agua limpia y jabón, esterilizados en olla de presión a 15 libras (lb) de presión durante 15 minutos, tela de organiza para tapar la boca de los frascos y facilitar la aireación y ligas para sostenerla.
4. Usar el insecticida seleccionado de contacto a concentraciones de 10,000, 1000 y 100 ppm (partes por millón), colocadas en frascos ámbar, papel aluminio, acetona como solvente, pipetas de 1, 5 y 10 ml para las diluciones a ppm.
5. Realizar los cálculos para cada dosis a utilizar: Ejemplo: -
1 gramo en 10,000 ml nos da 1000 ppm
-
Preparar 10 ml de Decis al 2.5% a 10000 ppm, diluir a 1000 y 100 ppm
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-
Pipeta de 1 ml de la solución depositado a cada frasco Gerber más un testigo (solo acetona o según el solvente a usar en las diluciones) y distribuirlo en los frascos, rodándolos para formar la película residual, se etiquetan según la dosis correspondiente.
6. Realizar las lecturas a los 30 minutos, 1, 6, 12, 24 y 48 horas para observar individuos muertos. Dosis
% de mortalidad 30 min.
1 hora
6 horas
12 horas
24 horas
48 horas
10000 1000 100 Testigo
7. Concluir, analizar y proponer criterios de muerte y el tiempo de exposición más adecuado.
Análisis y discusión de los resultados
¿Qué criterios de muerte tomará en cuenta para considerar muertos o vivos a los insectos expuestos al tóxico. ¿Qué dosis resultó más efectiva? ¿Qué tiempo y porcentaje de mortalidad?
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Practica 05
La curva dosis-mortalidad con paratión metílico en poblaciones de Helycoverpa zea y Heliothis virescens (Lepidoptera: Noctuidae) en dos años, mediante impregnación en vidrio (microgramos por frasco)
Introducción
El bioensayo, es cualquier método por medio del cual alguna propiedad de una sustancia o material, es medida en términos de la respuesta biológica que produce.
Se emplea para determinar la toxicidad de las sustancias químicas con supuestas propiedades tóxicas, la eficiencia de varios tóxicos contra una población de insectos o ácaros, la susceptibilidad de diferentes razas o especies de artrópodos a un tóxico y la determinación de la cantidad de un tóxico en un sustrato.
El bioensayos fue de utilidad en el análisis de residuos, con el uso de colonias indicadoras de moscas del vinagre Drosophila, tanto susceptibles como resistentes y sus componentes son el estímulo y la respuesta. El estímulo, es el agente que produce una respuesta en el organismo tratado; puede ser químico, físico o eléctrico. La respuesta, es el efecto o manifestación que produce la aplicación del estímulo; puede ser la muerte, el derribo, un nivel enzimático, la frecuencia de los latidos del corazón, la temperatura, etc. (Lagunes-Tejeda, 1994).
Estos componentes se pueden representar en un sistema de coordenadas, en las que el eje de las abscisas, se le asignan los valores del estímulo y al de las ordenadas, los del efecto.
En el caso particular del estudio toxicológico de insecticidas, el estímulo es el insecticida aplicado y la respuesta es la muerte del insecto tratado.
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La toxicidad de los insecticidas o de cualquier tóxico a un organismo, se expresa usualmente en términos de DL50 (dosis letal cincuenta); este valor representa la cantidad de tóxico por unidad de peso que mata el 50% de los animales empleados en la prueba. La DL50 comúnmente se expresa en kg-1 y ocasionalmente en mg por animal.
Objetivos: Graficar los datos proporcionados en el Cuadro 1 en tres tipos de papel; aritmético, logarítmico y probit.
Estimar la DL50 y la DL90 Material Hojas de papel aritmético, logarítmico y probit Regla aritmética Equipo Calculadora
Procedimiento
1. Método de contacto o de exposición residual
Consiste en dejar al insecto expuesto al insecticida. En este caso, el insecticida diluido en un solvente, se aplica alas paredes del recipiente que contiene a los insectos, el solvente se evapora y sólo queda el insecticida impregnado en las paredes a la dosificación deseada.
Para expresar la susceptibilidad de cualquier población de insectos a cualquier veneno, se grafican las unidades probit del porcentaje de mortalidad, contra una escala logarítmica de la dosis. En forma empírica, se ha observado que en muchos de los procesos bioquímicos y fisiológicos, incrementos iguales en efectos son producidos sólo cuando el estímulo se incrementa logarítmicamente.
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2. Ley de Weber y Fechner
El cambio en magnitud o intensidad de una respuesta biológica, es proporcionar no al cambio aritmético en el estímulo, sino a su logaritmo.
En un bioensayos con insectos, al graficar en un eje de coordenadas el estímulo contra el efecto, se obtendrá una línea sigmoideo cuyos valores no pueden ser interpretados. Para que esto no suceda se necesita transformar la línea sigmoideo en una línea recta, esto se logra al transformar la respuesta de porcentajes a unidades probit, además de expresar al estímulo en logaritmos. De esta manera se obtiene une recta que facilita la interpretación de los resultados.
Con los datos proporcionados en el cuadro 1 graficar líneas de varios tipos en papel aritmético, logarítmico y probit para posteriormente calcular la DL50 y DL90 para cada una de las dos especies tratadas con paratión metílico, por impregnación de vidrio durante dos años.
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Cuadro 1: Concentración y porcentaje de mortalidad (%) de paratión metílico en dos especies de lepidópteros durante dos años.
Concentración (dosis ppm) 0.5 1.0 2.5 5.0 10.0 25.0 100.0 250.0 500.0 1000.0
% de Mortalidad Helicoverpa zea Heliothis virescens A B 0 0 0 ---17 0 0 ---27 19 0 ---83 36 25 ---55 75 42 0 94 80 75 0 100 100 100 29 ---------79 ---------83 ---------100
A= año 1 B= año 2
Cuadro 2: Respuesta de la DL50 y DL90 de Helicoverpa zea durante dos años.
Gráfica Aritmética Logarítmica Probit
A DL50 4.0 3.8 3.4
Helicoverpa zea B DL90 12.5 12.0 11.0
A DL50 6.5 6.1 6.4
B DL90 23.5 32.0 26.0
Cuadro 3: Respuesta de la DL50 y DL90 de Heliothis virecens durante dos años.
Gráfica Aritmética Logarítmica Probit
A DL50 10.4 10.9 10.2
Heliothis virecens B DL90 70.0 66.0 56.0
A DL50 119.0 130.0 130.0
B DL90 525.0 500.0 540.0
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Análisis y discusión de los resultados proporcionados en los cuadros
1. ¿Calcular la DL50 y DL90 para cada población en forma gráfica (se anexan gráficas).
2. ¿Con que tipo de gráfica se trabaja más fácilmente y por qué?
3. ¿Qué cree que pase con las líneas de regresión dosis mortalidad cuando una población se hace resistente?
4. ¿Cómo interpreta la pendiente de la línea de respuesta dosis mortalidad a través de los dos años?
5. Si usted fuera a diseñar un bioensayos y graficara sus resultados en papel probits de las siguientes series de dosis, ¿Cuál seria la más útil y por qué?
a) 0.0, 1.5, 10, 50, 100. b) 0.3, 1, 3, 10, 30, 100. c) 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100.
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Práctica 6
Sensibilidad in Vitro de fungicidas de contacto y antibióticos para el control de bacterias
Introducción
Las bacterias son células procariotas que carecen de membrana celular, mitocondrias y retículo endoplásmatico. Las bacterias fitopatógenas se clasifican en seis géneros divididos en dos grupos: las Gran negativas Erwinia, Xanthomonas, Pseudomonas, Agrobacterium y Streptomyces; y la Gram positiva Corynebacterium.
Para su control se emplean los antibióticos derivados de la estreptomicina que actúan sobre los ribosomas de los procariotas, sin embargo, su uso de manera excesiva propicia la selección de cepas resistentes de bacterias.
Por tal motivo, es importante conocer las características de estos antibióticos, su forma de acción, número de aplicaciones permisibles, entre otros para reducir al máximo estos riesgos.
Objetivo: Evaluar la efectividad in Vitro de fungicidas de contacto y antibióticos en el control de las bacterias Erwinia carotovora y Pseudomonas syringae.
Materiales Equipo: Autoclave u olla de presión Campana de flujo laminar Balanza granataria Mechero Bunsen Cristalería: 1 matraz erlenmeyer de 1L 3 matraz erlenmeyer de 500 mL 21
5 matraz erlenmeyer de 250 mL 30 cajas de petri de 10 cm de diámetro 4 pipetas graduadas de 10 mL Reactivos: Papa-Dextrosa-Agar (PDA) Agua destilada Cepas: Erwinia carotovora Pseudomonas syringae
Procedimiento
1. En un matraz de 1L agregar agua destilada hasta aforar y diluir 39g de PapaDextrosa-Agar (PDA) con ayuda de una placa de calentamiento y agitación.
2. Posteriormente distribuir 300 mL en cada uno de los tres matraces de 500 mL y 100 mL en uno de 250 mL, sellar la boca de los matraces con papel aluminio e introducir al autoclave al igual que las 30 cajas de petri y pipetas de 10 mL (previamente lavadas y envueltas con papel aluminio) para su esterilización por 15 minutos.
3. Encender y limpiar la campana de flujo laminar con algodón humedecido con alcohol al 70% e instalar un mechero bunsen.
4. En cuatro matraces de 250 mL previamente esterilizados se agregan 100 mL de agua destilada estéril y diluir en cada uno la cantidad de fungicida de contacto o antibiótico respectivo de acuerdo a su dosis comercial (Cuadro 2).
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Cuadro 2. Características de fungicidas de contacto y antibióticos a evaluar.
Nombre
Ingrediente activo
Dosis por ha.
comercial
Dosis para 100 mL.
Cupravit
Oxicloruro de cobre
Cuperquim
Sulfato tribásico de cobre
Agrimycin 500
Oxicloruro
de
cobre
+
2-4 kg ha-1
0.3 g
0.5-1-0 kg ha-1
0.1 g
600 g há-1
0.06 g
60 g há-1
0.006 g
Sulfato de estreptomicina + clorhidrato de oxitetraciclina Agrimycin 100
Sulfato de estreptomicina + clorhidrato de oxitetraciclina
5. Terminado el periodo de esterilización del medio de cultivo PDA se espera que baje la presión del autoclave y se saca para llevar el material a la campana de flujo laminar y se deja reposar hasta alcanzar una temperatura en la cual se pueda soportar el calor al tacto.
6. Posteriormente agregar a cada matraz con el medio PDA la cantidad de la solución fungicida o antibiótico y se agita para mezclarlos, y verter 30 mL en cada una de las ocho cajas de petri por tratamiento y dejar reposar hasta que solidifique.
7. Una vez solidificado los medios con los fungicidas y antibióticos, se procede a la siembra dividiendo la caja petri en cuatro partes y estriando en cada parte la cepa de las bacterias respectivas (previamente aisladas y purificadas) de acuerdo a los tratamientos.
8. Concluida la siembra se apagan el mechero y la campana de flujo laminar dejando en el interior las cajas de petri a temperatura ambiente por 72 horas.
9. A las cajas, se les evaluará el número de colonias de bacterias en los diferentes fungicidas y antibióticos cada 24 horas con ayuda de una lupa cuenta colonias para ello se dividirá la caja de petri en cuatro partes para
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obtener la media de número de colonias por repetición por tratamiento (Figura 2).
Figura 2. Esquema para la evaluación del número de colonias bacterianas.
Análisis y discusión de los resultados
1. De acuerdo a tus evaluaciones del número de colonias ¿Cuál fue el fungicida de contacto o antibiótico que tuvo mayor efectividad en la inhibición contra las dos bacterias y/o cuál para cada uno?
2. ¿Por qué un fungicida de contacto o antibiótico no puede ser recomendado para controlar a diferentes bacterias?
3. Menciona cuál es el efecto de los antibióticos sobre la célula bacteriana.
4. ¿Cuál es el riesgo de resistencia de bacterias a los antibióticos?
5. Menciona como se clasifican los antibióticos.
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Práctica 07
Sensibilidad in Vitro de fungicidas de contacto y sistémicos para el control de hongos
Introducción
Entre los principales agentes causantes de enfermedades en hortalizas, se encuentran los hongos Fito-patógenos, los cuales presentan una gran variación morfológica, patogénica y de adaptación a diversas condiciones climáticas; por lo cual tienen la capacidad de atacar a los cultivos en sus diferentes etapas de desarrollo (Mendoza, 1996).
El control de los hongos, se basa principalmente en el uso de fungicidas de contacto o sistémicos para reducir su incidencia y severidad en los cultivos y evitar pérdidas importantes en rendimiento.
Sin embargo, el uso excesivo e inadecuado de estos fungicidas han propiciado la selección de cepas de hongos resistentes que día con día son más difíciles de controlar y para lo cual se requieren fungicidas cada vez más tóxicos. Por tal motivo, es importante conocer las características de los fungicidas como son su modo de acción, dosis recomendada, toxicidad, grupo toxicológico, patógenos que controla, entre otros.
Objetivo: Evaluar la efectividad in Vitro de fungicidas de contacto y sistémicos de diferentes grupos toxicológicos en el control de hongos de Fusarium oxysporum (Deuteromyceto) y Mycosphaerella citri (Ascomyceto).
Material Equipo: Autoclave Campana de flujo laminar Balanza granataria Mechero bunsen 25
Cristalería: 1 matraz erlenmeyer de 1 L. 3 matraz erlenmeyer de 500 mL 5 matraz erlenmeyer de 250 mL 30 cajas de petri de 10 cm de diámetro 4 pipetas graduadas de 10 Ml Reactivos: Papa-Dextrosa-Agar (PDA) Agua destilada Cepas: Fusarium oxysporum (Deuteromyceto) Mycospherella citri (Ascomyceto)
Procedimiento
1. En un matraz de 1L agregar agua destilada hasta aforar y diluir 39g de PapaDextrosa-Agar (PDA) con ayuda de una placa de calentamiento y agitación. Posteriormente distribuir 300 mL en cada uno de los tres matraces de 500 Ml y 100 mL en uno de 250 mL, sellar la boca de los matraces con papel aluminio e introducir a la autoclave al igual que las 30 cajas petri y pipetas de 10 mL (previamente lavadas y envueltas con papel aluminio) para su esterilización por 15 minutos.
2. Encender y limpiar la campana de flujo laminar con algodón humedecido con alcohol al 70% e instalar un mechero bunsen.
3. En cuatro matraces de 250 mL previamente esterilizados se agregan 100 mL de agua destilada estéril y diluir en cada una la cantidad de fungicida respectivo de acuerdo a su dosis comercial (Cuadro 1).
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Cuadro 1. Características de los fungicidas a evaluar.
Nombre
Ingrediente
Grupo
comercial
activo
toxicológico
Dosis por ha.
Dosis para 100 mL
Benlate 50PH Benomyl (S)
Bencimidazol
500 g ha-1
0.05 g
Ridomil MZ72
Metalaxyl (S)
Fenilaminas
3.5 kg ha-1
0.35 g
Bravo 720
Clorotalonil
Cloronitrilos
1.5-2.5 kg ha-1
0.20 g
Ditiocarbamato
1-1.5 kg ha-1
0.15 g
(C) Quifolatán 4F
Captafol (C)
(S) fungicida sistémico
(C) fungicida de contacto
4. Terminado el período de esterilización del medio de cultivo PDA se espera que baje la presión del autoclave y se saca para llevar el material a la campana de flujo laminar y se deja reposar hasta alcanzar una temperatura en la cual se pueda soportar el calor al tacto.
5. Posteriormente agregar a cada matraz con el medio PDA la cantidad de la solución fungicida y se agita para mezclarlos, y verter 30 mL en cada una de las ocho cajas de petri por tratamiento y dejar reposar hasta que solidifique.
6. Una vez solidificado los medios con los fungicidas, se procede a la siembra de un disco de 1 cm de diámetro de la cepa de los hongos respectivos (previamente aislados y purificados) y se depositan en cada caja de petri de acuerdo a los tratamientos.
7. Concluida la siembra se apagan el mechero y la campana de flujo laminar dejando en el interior las cajas de petri a temperatura ambiente por 72 horas.
8. A las cajas de evaluará el crecimiento micelial de los hongos en los diferentes fungicidas cada 24 horas con ayuda de una regla registrando la medida de dos puntos de crecimiento para de ello obtener la media (Figura 1).
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Figura 1. Esquema para la evaluación del crecimiento radial
Análisis y discusión de los resultados
1. De acuerdo a tus evaluaciones de crecimiento radical ¿Cuál fue el fungicida que tuvo mayor efectividad en la inhibición contra los dos hongos y/o cuál para cada uno?
2. ¿Por qué un fungicida no puede ser recomendado para controlar a diferentes hongos?
3. Mencione las diferencias entre un fungicida de contacto y uno sistémico (mínimo cinco).
4. ¿Qué es la resistencia cruzada y resistencia múltiple a fungicidas?
5. ¿Cuáles son los mecanismos de resistencia que tienen los hongos contra los fungicidas?
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Práctica 08
Evaluación de plaguicidas con efecto nematicida
Introducción
Con frecuencia, los síntomas inducidos por nematodos en las plantas se asocia con poco crecimiento, clorosis, marchitez, ramificaciones excesivas, lesiones en raíces y partes aéreas, agallas y poca producción y calidad de rendimiento.
Por otra parte, las especies del género Meloidogyne, conocido como nematodo agallador es un factor importante en la disminución del rendimiento de los cultivos. Las estimaciones en regiones tropicales sobre la estimación de pérdidas de este nematodo van del 18-38% en melón y del 24-38% en tomate.
El termino plaguicida agrícola se aplica a cualquier producto químico destinado a controlar los parásitos animales o vegetales que afectan a los cultivos. Por su acción tóxica contra nematodos, los nematicidas se incluyen dentro de estos tóxicos y se utilizan para el manejo de estos organismos, principalmente en el suelo antes de la siembra o transplante según sea el caso.
Debido a sus propiedades físicas, existen dos grupos de nematicidas: los fumigantes y los no fumigantes, en los primeros se incluyen aquellos productos que después de su aplicación se gasifican por efecto de su alta presión de vapor y en los segundos están ubicados los nematicidas derivados de los organofosforados y carbamatos, que son compuestos que se aplican ya sea como granulados o como soluciones en emulsiones.
Objetivo general: Conocer el uso de nematicidas no fumigantes y su efecto en nematodos agalladores.
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Objetivos específicos: Evaluar en condiciones de invernadero en suelo infestado con Meloidogyne incognita dosis de Vydate y Furadan para su control, en plantas de tomate (Lycopersicon sculentum Mill.).
Estimar el daño de M. incognita, en plantas de tomate (L. sculentum Mill.) con base a la efectividad de Vydate y Furadan.
Procedimiento
1. Dejar crecer plántulas de tomate (L. sculentum Mill.) cv. Maya en macetas con suelo esterilizado, hasta que las dos primeras hojas verdaderas se encuentren completamente extendidas.
2. Preparar una solución nematicida en recipientes independientes y hacer una inmersión de raíces de las plántulas de tomate en las dosis y tiempos indicados en el Cuadro 1.
Cuadro 1. Nematicidas, dosis e intervalos de inmersión de raíces. Nematicidas
Dosis (mL/L de agua)
Tiempo de inmersión de raíces (minutos)
Vydate
Furadan
0
1,2,3
1
1,2,3
2
1,2,3
3
1,2,3
0
1,2,3
1
1,2,3
2
1,2,3
3
1,2,3
3. De acuerdo al Cuadro 1, se tendrá un experimento factorial de 2X4X4,es decir un total de 32 tratamientos o macetas con suelo de 1 kg de capacidad, las cuales contendrán suelo infestado previamente homogenizado con M. incognita.
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4. Cada tratamiento tendrá tres repeticiones por lo que se tendrán 96 macetas o unidades experimentales.
5. Después de cuatro semanas de establecimiento del bioensayos, se evaluarán en los tratamientos las siguientes variables respuesta: número de agallas, altura de planta y peso seco de follaje y raíz (biomasa).
6. Con los datos obtenidos, hacer un análisis de varianza y comparación múltiple de medias (Tukey P=0.05).
Análisis y discusión de los resultados
1. Presentar los resultados en el que se indiquen: mejor nematicidas, dosis efectiva y el tiempo para controlar a M. incognita.
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BIBLIOGRAFÍA
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