REVISTA LATINOMAERICANA DE RECURSOS NATURALES

2017, Vol. 13

Núm. 1

Revista Latinoamericana de

Recursos Naturales UNA REVISTA MULTIDISCIPLINAR

Instituto Tecnológico de Sonora

Revista Latinoamericana de Recursos Naturales

©

Una revista interdisciplinar para el conocimiento científico de los recursos naturales en Latinoamérica.

Consejo Editorial Editores: Fernando Lares Villa (fernando.lares@itson.edu.mx), Instituto Tecnológico de Sonora, México.

Sergio de los Santos Villalobos (sergio.delossantos@itson.edu.mx), Instituto Tecnológico de Sonora, México.

Editor técnico: Roberto Munguía Valencia (roberto.munguia@itson.edu.mx), Instituto Tecnológico de Sonora, México.

REVISTA LATINOMAERICANA DE RECURSOS NATURALES, Año 13, No. 25, enero-junio 2017, es una publicación semestral editada y publicada por el Instituto Tecnológico de Sonora (ITSON), a través de la Dirección de Recursos Naturales, con domicilio en 5 de Febrero No. 818 sur Apdo. 335 C.P. 85000, Ciudad Obregón, Sonora, México. Tel:(644)4100923, www.itson.mx, fernando.lares@itson.edu.mx. Editor responsable: Dr. Fernando Lares Villa. Reserva de Derechos al Uso Exclusivo No. 04-2016-041414023300-203, otorgado por el Instituto Nacional del Derecho de Autor. Responsable de la última actualización de éste número, Ing. Roberto Munguía Valencia, con domicilio en 5 de Febrero 818 Sur, Col. Centro, Ciudad Obregón, Sonora, CP. 85000, fecha de última modificación, 30 de junio de 2017.

Las opiniones expresadas por los autores no necesariamente reflejan la postura del editor de la publicación.

Queda estrictamente prohibida la reproducción total o parcial de los contenidos e imágenes de la publicación sin previa autorización del Instituto Tecnológico de Sonora.

© Todos los derechos reservados.

Prefacio El Instituto Tecnológico de Sonora (ITSON), desde su creación, ha trabajado en el desarrollo de alternativas y sistemas de estudios para el aprovechamiento sustentable de los recursos naturales, creando la Ingeniería en Ciencias Ambientales con el objetivo de formar recursos humanos con la capacidad de solucionar problemas ambientales y gestionar el manejo y aprovechamiento de los recursos naturales, aplicando conocimientos de legislación ambiental, tecnología de descontaminación, diagnóstico y evaluación de impactos ambientales para contribuir al desarrollo sostenible.

Los recursos naturales son bienes materiales y servicios que proporciona la naturaleza sin algún impacto antropogénico, los cuales son valiosos para el bienestar y desarrollo de las sociedades humanas, proveyendo materias primas, minerales, alimentos, servicios ecosistémicos, entre otros.

De esta manera, el entendimiento y aprovechamiento sostenible de estos recursos representa un gran reto debido a la diversidad de enfoques, temas, y ramas de la ciencia que convergen, además de los aspectos teóricos y/o prácticos abordados. Por esta razón, el estudio de los recursos naturales se basa en la interdisciplinaridad, desde el conocimiento de las relaciones bióticas y abióticas en los ecosistemas, hasta el análisis e integración de las ciencias ómicas de cada uno de estos componentes y su impacto sobre la biósfera. Lo anterior con el objetivo de establecer sistemas de estudios integrales con mayor probabilidad de éxito cuando sean adoptados por el sector económico, productivo, privado y/o político.

En este número, se presentan contribuciones científicas que inciden fuertemente en los diversos enfoques y objetivos del ITSON y de nuestra Revista Latinoamericana de Recursos Naturales©. La cual surge como una publicación multidisciplinaria enfocada a describir y aportar conocimiento para la conservación y aprovechamiento sostenible de los recursos naturales. Además, se busca que esta revista sea un vínculo con diversos países para la difusión de los resultados obtenidos en estas áreas, permitiendo así generar colaboraciones fructíferas, independientemente del recurso económico destinado por cada uno de nuestros países a la ciencia y tecnología. De esta manera, en el presente número se presentan cuatro trabajos enfocados a la conservación de los recursos naturales con enfoques teóricos y prácticos, v.gr. a) Evaluación de un sistema de recirculación para producción larvaria de Litopenaeus vannamei; b) Estimación de rendimiento de variedades nativas de maíz; c) Identificación de regiones genómicas asociadas a respuesta a la vacunación contra el PRRS en cerdas; y d) Producción de polihidroxibutirato a partir de la fermentación de suero de leche por Bacillus megaterium TRQ8.

Los Editores: Fernando Lares-Villa Sergio de los Santos Villalobos Roberto Munguía Valencia

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Evaluación de un sistema de recirculación para producción larvaria de Litopenaeus vannamei, utilizando la macroalga Gracilaria vermiculophylla como organismo biorremediador de efluentes C.I. Leyva-Márquez1 *, F. Lares-Villa1,2 *, L.R. Martínez-Córdova3, J.C. Ibarra-Gámez2, R. Casillas-Hernández2 y A. Miranda-Baeza3 1

Programa de Doctorado en Biotecnología, 2 Departamento de Ciencias Agronómicas y Veterinarias, Instituto Tecnológico de Sonora, Cd. Obregón, Sonora, México 3 Departamento de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de la Universidad de Sonora, Hermosillo, Sonora, México 4 Universidad Estatal de Sonora, Navojoa, Sonora, México.

Evaluation of a recirculation system for larval production of Litopenaeus vannamei using the macroalgae Gracilaria vermiculophylla as an effluent bioremediation organism Abstract Looking for sustainable alternatives to larval shrimp production and considering the documented and successfully use of algae as biofilters for the reduction of nutrients in aquaculture effluents, the present study was aimed on evaluating the productive and physiological response of Litopenaeus vannamei postlarvae grown in a recirculating and effluents-bioremediation systems using Gracilaria vermiculophylla. The production system consisted of two-250 l tanks stocked with 36,000 nauplii, and connected to a sedimentation tank, which was followed by three 120 l units stocked with the macroalgae in the case of treatments and three without microalgae for the control. The culture was done for 18 days during which organisms were fed, taking samples to monitor the biometrics and physical-chemical parameters following standard procedures for larval production. Recirculation started at day 9th, and water samples were taken daily for the analysis of ammonium, nitrate and nitrite, as well as for the total heterotrophs and Vibrio spp. counting. The results showed a removal of nitrogen compounds in the system with macroalgae, averaging 59%, whereas the control only removed 12%. The number of total heterotrophic bacteria and Vibrio spp., showed a very similar behavior. The survival of the larvae was 61% in the tanks with G. vermiculophylla and 50% in the control; however, the other productive parameters were not significantly different. The results suggest that the incorporation of G. vermiculophylla can represent an efficient alternative to maintain the permissible levels of ammonium for shrimp larvae cultivation, reducing the water exchange.

Key words: postlarvae, nitrogenous compounds, removal, shrimp culture.

Resumen Ante la necesidad de buscar alternativas sustentables de producción larvaria de camarón que, y considerando el uso exitoso y documentado de algas como biofiltros para la reducción de nutrientes en los efluentes acuícolas, el presente estudio se enfocó en evaluar la respuesta productiva y fisiológica de postlarvas de Litopenaeus vannamei cultivadas en sistemas de recirculación y biorremediación de efluentes, utilizando Gracilaria vermiculophylla. Para este propósito se diseñó un sistema de producción de larvas utilizando dos tanques de 250 l como, mismos que fueron sembrados con 36,000 nauplios, y cada uno se conectó a un tanque de sedimentación seguido de tres tinas de 120 l, inoculados con la macroalga para el tratamiento y tres sin ella

*Autores de correspondencia Email: claudia_leyva79@hotmail.com; fernando.lares@itson.edu.mx; lmtz@guaymas.uson.mx

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para el control. El cultivo se llevó a cabo durante 18 días, tiempo durante el cual los organismos se alimentaron y se tomaron muestras para monitorear los parámetros biométricos y físicos-químicos, de acuerdo a los procedimientos estándar. La recirculación inició el día 9 y diariamente se tomaron muestras para el análisis de amonio, nitratos y nitritos, así como para la cuenta de heterótrofos totales y Vibrio spp. Los resultados mostraron una remoción de compuestos nitrogenados en el sistema integrado con G. vermiculophylla en un promedio de 59%, mientras que el control únicamente removió en promedio el 12%.

En el caso de las cuentas de heterótrofos totales y Vibrio, éstas se comportaron de manera similar. Aunque la sobrevivencia de las larvas fue del 61% en el tanque con agua tratada con G. vermiculophylla y del 50% en la no tratada, las diferencias en los otros parámetros de crecimiento no fueron significativas. Debido a la eficacia en la remoción de N inorgánico en forma de amonio del agua del cultivo larvario de L. vannamei en sistemas de cultivo cerrados, la incorporación de G. vermiculophylla puede representar una eficiente alternativa para mantener los niveles de amonio permisibles para el cultivo, disminuyendo el uso de agua para recambio.

Palabras claves: postlarvas, compuestos nitrogenados, remoción, cultivo de camarón.

lo cual se han buscado herramientas de control, surgiendo como una alternativa el uso sistemas de biorremediación con los cuales se reducen o eliminan efluentes, cargas contaminantes (Jiménez y Balcazar, 2003; Martínez Córdova et al., 2011), y se evita la dispersión de patógenos hacia el medio ambiente. Con este enfoque, se ha impulsado la reducción progresiva del recambio de agua hasta llegar al cultivo sin recambio (Tacon, 2002).

Además, recientemente la biorremediación de agua, sedimentos contaminados y aguas de descarga están involucrando organismos como bacterias, microalgas, macroalgas e invertebrados filtradores (Granada et al., 2015). Por estas razones es necesario buscar alternativas, e implementar medidas de bioseguridad que sean ecológicamente sustentables y económicamente rentables, para impedir continuar con esta espiral de destrucción y permitir reactivar la tan importante actividad acuícola La capacidad de las macroalgas para responder a la disponibilidad de nutrientes antropogénicos (nitrógeno y fosforo), hace que sean un eficiente instrumento para la biorremediación (MarinhoSoriano et al., 2011). El uso de algas como biofiltros para la reducción de nutrientes en los efluentes acuícolas, ha sido descrito como un método efectivo y rentable (Seenivasan et al., 2010), y se ha documentado que también es efectivo para mejorar la calidad del agua en sistemas de recirculación (Chaitanawisuti et al., 2011). Con el presente trabajo se pretende generar la información científica necesaria para ampliar el conocimiento sobre la efectividad de sistemas de recirculación que

Introduccción La camaronicultura es una actividad económica de rápida expansión en todo el mundo como consecuencia de la demanda mundial de alimentos, que ha aumentado considerablemente como resultado del crecimiento de la población humana (Martínez-Córdova, 2009; FAO, 2016). Este acelerado incremento ha traído consigo algunos problemas relacionados con el impacto negativo que la actividad provoca en los ecosistemas receptores de las descargas ricas en nutrientes y actualmente hay una gran preocupación global respecto a los impactos ambientales adversos de tales prácticas (Bardach, 1997; Martínez Córdova et al., 2011; Naylor et al., 2000), así como con la propagación de enfermedades y patógenos del camarón, especialmente aquellos de origen viral. Esto ha ocasionado que en los últimos años, los problemas del sector se agraven debido a la aparición de nuevos patógenos, especialmente virus y bacterias más agresivos, mortales y resistentes a los tratamientos convencionales. Además se han invertido muchos recursos económicos para tratar de combatir estos problemas sin resultados positivos; por lo contrario, se han agravado debido a que se han utilizado toneladas de químicos de síntesis (antibióticos, desinfectantes, insecticidas, viricidas, etc.) para tratar de eliminarlos, aumentando con ello la contaminación de los estuarios y la sobresaturación de los ecosistemas con dichos productos. Esta crisis que vive la industria camaronícola refleja la necesidad de realizar cambios en los sistemas de producción, por

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utilicen macroalgas para la biorremediación, mejorando la calidad del agua así como la respuesta de postlarvas de L. vannamei cultivada en estos sistemas cerrados, considerando la poca información disponible sobre el uso de dichos sistemas para el cultivo de postlarvas.

para análisis bacteriológicos de microorganismos heterótrofos totales y Vibrio de los tanques de cultivo y de la microalga. Después de 18 días, cuando las larvas estuvieron en el estadio de postlarva 12 (PL12), fueron colectadas, medidas y pesadas para estimar crecimiento y sobrevivencia.

El cultivo se mantuvo bajo condiciones ambientales, monitoreando periódicamente las variables principales de la calidad del agua: dos veces por día temperatura y el oxígeno, y una vez por día la salinidad, el pH, amonio, nitritos y nitratos, utilizando técnicas estándar.

Del día 1 al 8 se incorporó agua y microalgas a los tanques de cultivo para recuperación y aumento de niveles hasta llegar a los 360 l, y al día 9 se inició la recirculación, drenando inicialmente agua de los tanques de cultivo hacia un tanque sedimentador y posteriormente a los cilindros y réplicas de 120 l que contenían las algas. El agua se retornó a los cultivos con ayuda de cabezas de poder marca Evans, conectadas a la tubería del sistema. Del día 10 al 18 se tomaron muestras para la medición de niveles de nitrógeno amoniacal, nitritos y nitratos tanto a la entrada como a la salida del tratamiento y del control para calcular la remoción de estos compuestos (Figura 1).

Materiales y métodos Las corridas preliminares para evaluar la capacidad de biorremediación de la macroalga se realizaronen las instalaciones del laboratorio de Acuicultura del Instituto Tecnológico de Sonora, Campus Centro, Ciudad Obregón, Sonora y el bioensayo final fue llevado a cabo en el laboratorio de producción de postlarvas BG Almacenes y Servicios, S.A. de C.V. ubicado en la Playa de Camahuiroa, Sonora.

Se colectaron ejemplares de Gracilaria vermiculophylla en el mes de junio, en el área de la escollera de Camahuiroa (26º29’21”N, 109º15’52”O), aprovechando una bajamar y condiciones adecuadas de viento en la zona. Se seleccionaron las algas más brillantes y sanas; se colocaron alrededor de dos kilogramos en bolsas plásticas en seco, dentro de una hielera. En el laboratorio, se lavaron cuidadosamente con abundante agua de mar filtrada, y con ayuda de un cepillo muy fino se eliminaron epicomensales y arena adheridos; fueron pesadas en una báscula analítica y se colocaron 364.67 ± 6.35g en tres cilindros de acrílico transparente (tratamiento) con 120 l de agua marina. La iluminación y temperatura fueron bajo condiciones ambientales de invernadero.

Los nauplios fueron proporcionados por un laboratorio productor de postlarvas en estadio de Nauplio 5; se aclimataron y contaron por método volumétrico. Se colocaron 36,000 nauplios en las tinas de tratamiento y control con 250 l de agua marina y se suministraron 60,000 células por mililitro de la microalga Thalassiosira sp., como alimentación inicial. A partir del estadio Zoea I se tomaron muestras diarias de organismos para observar condición fisiológica en microscopio de campo de campo claro Axiolab (Zeiss) y conteo de células por mililitro de microalga en la Cámara de Neubauer. Basado en estas observaciones se ajustaron diariamente las raciones de alimento teniendo como referencia el protocolo de alimentación de un laboratorio de producción de postlarvas. Se realizaron muestreos diariamente

Resultados y discusión Las algas colectadas (Gracilaria vermiculophylla) fueron encontradas a una profundidad de 60-100 cm. La temperatura a la que se encontraron fue de 28ºC y durante los dos días de aclimatación se mantuvieron a 30.2 ± 0.9°C. Diversos trabajos sobre algas marinas han reportado las actividades antibacterianas in vitro, como una alternativa a los antibióticos comúnmente utilizados, y propiedades nutritivas al co-cultivarlas con organismos marinos, así como mejoradores de la calidad del agua al utilizarlas como biorremediadoras. En estos y otros trabajos se ha demostrado que varias especies del género Gacilaria, poseen dichas actividades (Abreu et al., 2009; Cruz-Suarez, et al., 2008; Han et al., 2013; Lavanya y Veerappan, 2011; Vijayabaskar y Shiyamala, 2011). Especies del género Gracilaria, tienen distribución mundial y su presencia en el ambiente marino obedece a las condiciones climáticas a lo largo del año (Han et al., 2013; Lavanya y Veerappan, 2011; Ríos et al., 2009), predominando su incremento a partir de primavera y finalizando en invierno; según lo reportado por

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Figura 1. Representación esquemática del sistema de biorremediación con macroalgas. Las flechas indican los flujos de agua, (L) Tanque de cultivo de larvas L. vannamei, (S) Tanque de sedimentación, (T) Tratamiento, (C) Control, (1) Punto de muestreo a tanque de cultivo, (2) Punto de muestreo de entrada de agua a tratamiento y control, (3) Punto de muestreo de salida de agua de tratamiento y control.

Saad-Navarro y Riosmena-Rodríguez (2005), para las algas rojas, división a la cual pertenecen el Orden de las Glacilariales y que las encuentran para el área de Baja California Sur, región vecina a dónde se hicieron los aislamientos para este experimento. El uso de Gracilaria vermiculophyla como agente biofiltrador o biorremediador en cultivos multitróficos integrados con diferentes especies acuáticas, y en donde la remoción de nutrientes en cultivos intensivos, es la preocupación contante para lograr una acuacultura sustentable, ha sido bien documentada (Abreu et al., 2011; Sánchez-Romero, 2013; Skriptsova y Miroshnikova, 2011). No existen reportes de este tipo de metodologías aplicadas a la producción de larvas de Litopenaeus vannamei, por lo que el presente estudio adquiere relevancia.

Las variables ambientales de los cultivos larvarios, fueron similares en el tratamiento y en el control, aun cuando no se mantuvieron en condiciones controladas. Durante el desarrollo del cultivo larvario las variables físico químicas se mantuvieron dentro de los valores recomendados para el cultivo de L. vannamei (Tabla 1).

Se encontró diferencia significativa entre tratamiento y control respecto a la concentración de compuestos nitrogenados. En ambos, los valores de TAN se mantuvieron dentro de los límites aceptables para el camarón según Martínez-Córdova (2009). Durante el día 9 se presentó el valor más alto, de 1.35 mg l-1 en el tratamiento y 1.87 mg l-1

en el control, y se inició la recirculación en el sistema en el estadio de PL3. En los próximos tres días, la concentración disminuyó abruptamente tanto en el tratamiento como en el control, y mientras en el tratamiento las concentraciones se mantuvieron bajas hasta el final del experimento, en el control se elevaron de nuevo a partir del día 12 (Figura 2a). Aunque los valores de nitritos NO2 y nitratos NO3 presentaron su valor máximo en el día 8 se mantuvieron dentro de los límites aceptables para L. vannamei. Los valores máximos de nitratos fueron de 8.9 mg l-1 en el tratamiento y 7.1 mg l-1 en el control (Figura 2b) y los valores máximos de nitritos fueron de 0.30 mg l-1 en el tratamiento y 0.23 en el control (Figura 2c). La remoción de TAN en el sistema integrado con G. vermiculophylla fue del 59%, mientras que en el control únicamente se removió en promedio el 12%.

La respuesta productiva de las larvas se resume en la tabla 2. Las postlarvas del tratamiento alcanzaron una ganancia de peso de 0.002 g en promedio, con una talla de 7.6 mm, ligeramente inferior a los 0.003g y 8.12 mm observados en el control. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p>0.05). La sobrevivencia alcanzada por las larvas en el tratamiento y control fue del 61% y 50% respectivamente. De los 364.7 ± 6.4 g colocados inicialmente de macroalgas en el tratamiento, se cosecharon 427.3 ± 41.2 g, es decir que se obtuvo un incremento medio en la biomasa de 62.6 g (17%).

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Tabla 1. Variables fisicoquímicas ambientales durante el cultivo de postlarvas de L. vannamei.

Tratamiento

Control

Media ± DS

Media ± DS

Temperatura (°C)

32.6 ± 1.4

32.5 ± 1.6

Oxígeno (mg l-1)

4.9 ± 1.5

4.9 ± 0.3

Salinidad (ppm)

37.4 ± 1.6

36.7 ± 1.4

pH

8.0 ± 0.2

8.0 ± 0.2

Figura 2. a) Concentración de NH₄+ mg l-1, b) Concentración de NO₂ mg l-1, c) Concentración de NO₃ mg l-1.

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Los máximos crecimientos de Vibrio en el tratamiento fueron en el día 12 con 890 UFC ml-1, mientras que en el control el máximo se observó en el día 11 con 950 UFC ml-1. Los máximos crecimientos de heterótrofos totales fueron de 51,300 UFC ml-1 al segundo día en el tratamiento y 36,300 UFC ml-1 al tercer día en el control (Figura 3). Es importante llevar un seguimiento de los crecimientos bacterianos en los sistemas de cultivo, y principalmente las bacterias del género Vibrio, ya que según Lightner y Redman (1998), los problemas ocasionados por bacterias en los sistemas de cultivo larvario de camarón son considerados

como los principales causantes de mortalidad en todo el mundo por que las comunidades bacterianas son susceptibles a las fluctuación de las variables que ocurren durante el desarrollo del cultivo larvario, y en muchas ocasiones un aumento en el número hace que proliferen patógenos nocivos que provocan mortandad en los organismos cultivados (Morales-Covarrubias, 2010).

Conclusiones Con los estudios realizados se ha demostrado que la macroalga Gracilaria vermiculophylla es eficaz en

Tabla 2. Respuesta productiva de L. vannamei en el cultivo larvario con G. vermiculophylla.

Peso final larvas (g) Talla final larvas (mm) Sobrevivencia

Tratamiento

Control

0.002 ± 0.0001

0.003 ± 0.0001

7.6 ± 0.83

8.1 ± 1.00

61%

50%

Figura 3. Crecimiento bacteriano de Vibrio spp. y heterótrofos totales.

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la remoción de N inorgánico en forma de amonio durante el cultivo larvario de Litopenaeus vannamei y que su integración a los sistemas de cultivo cerrados de cría de postlarvas (en recirculación), puede representar una eficiente alternativa para mantener los niveles de amonio dentro de los límites permisibles para el cultivo, disminuyendo el uso de agua de recambio.

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Maria-Ramírez et al. / Revista Latinoamericana de Recursos Naturales 13 (1): 8-14, 2017

Estimación de rendimiento de variedades nativas de maíz en el estado de Tlaxcala A. Maria-Ramírez2 *, V.H. Volke-Haller2 y M.L. Guevara-Romero3 1 El Colegio de Tlaxcala, A.C. Privada Melchor Ocampo 28, Centro, 90600 Tlaxcala, Tlaxcala.

Colegio de Postgraduados, Montecillo. Carretera México-Texcoco km 36.5, Montecillo, Texcoco 56230, Estado de México.

3 Facultad de Arquitectura, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Boulevard Valsequillo s/n. Ciudad Universitaria, Puebla, Puebla.

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Yield estimation of native corn varieties in the State of Tlaxcala Abstract Crop yield estimation using different models has been generated with different degrees of complexity, in terms of the information considered and their degree of precision, the methodologies and the time. In the present study two mathematical models for the estimation of landraces performance from the State of Tlaxcala were generated based on characteristics, such as: i) weight of ear, percentage of cob and percentage of grain moisture; and ii) weight of ear, percentage of cob, and considered the moisture of dry grain in the shadow. Both models have a good fit (R2 = 0.999), and were valid for estimating performance in landraces of the State of Tlaxcala. It is worth noting that there is little information about the development and use of mathematical models such as those generated in this research, and the usefulness they may have.

Key words: physical characteristics of the ear, mathematical models, rainfed maize, races of native maize.

Resumen Para las estimaciones de rendimiento de cultivos se han generado diversos modelos, con diferentes grados de complejidad en cuanto a la información que consideran y su grado de precisión, a las metodologías y al momento en que se aplican. En la presente investigación se generaron dos modelos matemáticos de estimación de rendimiento de maíces nativos del estado de Tlaxcala, con base en características de la mazorca como: uno, peso de la mazorca, porcentaje de olote y porcentaje de humedad del grano, para cuando se dispone de un medidor de humedad; y, otro, peso de la mazorca, y porcentaje de olote, y considera la humedad del grano seco a la sombra, para cuando no se dispone de un medidor de humedad. Ambos modelos presentan un buen ajuste (R2 = 0.999), y son válidos para estimar el rendimiento en maíces nativos del estado de Tlaxcala. Cabe resaltar que existe escasa información sobre el desarrollo y uso de modelos matemáticos como los generados en esta investigación, y la utilidad que ellos pueden tener.

Palabras claves: características físicas de la mazorca, modelos matemáticos, maíz de temporal, razas de maíces nativos.

*Autores de correspondencia Email: anmara1954@gmail.com; Fax (246) 4647726

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mazorcas y peso medio de cinco de ellas, y peso de grano, factor de desgranado y porcentaje de humedad de las cinco mazorcas, para finalmente calcular el rendimiento de la parcela por hectárea considerando el número de plantas por hectárea y el número medio de mazorcas por planta. AguilarÁvila y Ávalos-Gutiérrez (2013) presentan una metodología y modelo para la estimación de rendimientos de maíz a nivel de parcela de productores, que considera el muestreo e información del cultivo como prácticas de producción, presencia de fenómenos climáticos y de plagas y enfermedades, y variables de la mazorca como daños por fenómenos climáticos y por plagas y enfermedades, factor de desgranado, humedad del grano, número de granos por mazorca y peso específico de un grano, además del número de plantas por hectárea y el número medio de mazorcas por planta.

Una vez obtenida la información de las variables de la mazorca consideradas, se podrá obtener un modelo matemático que permita estimar el peso de grano de una mazorca, y con base en la medición del número de plantas por hectárea y el número medio de mazorcas por planta, se obtiene el rendimiento por hectárea.

La precisión del modelo podrá estar afectada por factores de tipo biótico (plagas y enfermedades), abióticos (temperatura, sequías, heladas, suelos y de manejo del cultivo), que afecten el rendimiento, y esto determina que en la información a captar se puedan considerar también estos factores y su variación, a fin de obtener un modelo más preciso.

En el proceso de obtención del modelo matemático estarán involucrados aspectos de muestreo y metodológicos que será necesario considerar para llegar a un modelo adecuado, que pueda ser representativo para la región; por ejemplo, en el aspecto metodológico, para la estimación del modelo normalmente se ha considerado el procedimiento “selección a pasos” (Díaz, 1990) sin embargo, este procedimiento no siempre permite obtener los modelos más adecuados (Volke, 1981).

El objetivo de la presente publicación fue desarrollar un modelo o modelos matemáticos de estimación de rendimiento de maíces nativos del estado de Tlaxcala, a partir de características físicas de la mazorca, bajo condiciones de temporal, con fines de estimación de rendimientos.

Introduccción Las estimaciones de rendimiento de los cultivos resultan de la mayor importancia para la economía de un país, a través de las diferentes actividades en que se encuentran directa o indirectamente involucradas (Díaz, 1990; Tinoco y García, 2009; Aguilar-Ávila y Santoyo-Cortés, 2013). Para estas estimaciones se han generado diversos modelos, con diferentes grados de complejidad en cuanto a la información que consideran y el grado de precisión que dan las estimaciones, de metodologías y del momento en que se aplican (Aguilar-Ávila y Santoyo-Cortés, 2013).

Los modelos más amplios pueden tener sus limitaciones en ámbitos donde predominan parcelas de superficies pequeñas, de variabilidad climática y por tanto de fechas de siembra variables y de prácticas de manejo del cultivo diferentes, o por carencia de la información necesaria (Aguilar-Ávila y Santoyo-Cortés, 2013).

Alguno de los modelos más sencillos es uno basado en la estimación de rendimientos a nivel predial, que, dependiendo de los objetivos que se busquen, puede incluir además de la estimación del rendimiento por superficie, variables como la variedad del cultivo, de manejo del cultivo, de suelo y clima, y de daños por fenómenos climáticos.

En el caso del maíz, se han generado modelos sencillos para realizar estimaciones de rendimiento en regiones de productores pequeños con base en características de la mazorca, en que estas varían en su tamaño y forma y otras de sus características, pudiendo considerar también la variedad y variables de suelo y clima, y de manejo agronómico del cultivo (Díaz, 1990; Ángeles-Gaspar et. al., 2010; Aguilar-Ávila y Santoyo-Cortés, 2013). A este respecto, Díaz (1990) desarrolló y utilizó un modelo matemático para estimar el rendimiento de maíz en regiones del estado de Puebla, basado en información de la mazorca como largo y ancho, el porcentaje de olote de la mazorca y de humedad del grano, y la densidad de población del cultivo, considerando también ajustes por daños de heladas y sequía, con fines de observar cambios en el rendimiento derivados de la transferencia y uso de tecnologías de producción nuevas por los productores. Pérez (2001) presenta una metodología y modelo para la estimación de rendimiento de maíz en parcelas de los productores, que considera el muestreo e información de la variedad, peso de 22

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SECODUVI, 2013). Estos suelos difieren en sus características de textura, profundidad y pendiente, y conjuntamente con las condiciones climáticas y disponibilidad de riego, tienen un uso de praderas y de cultivos, principalmente maíz y hortalizas en las áreas con riego, con algunas superficies menores con bosques.

En 2015, en el estado de Tlaxcala se sembraron 122,326 ha de maíz, donde 106,302 ha (86.9 %) fueron de temporal, con un rendimientopromedio de 2.5 t ha-1, y 16,024 ha (13.1 %) fueron con riego con un rendimiento medio de 2.8 t ha-1 (SIAP, 2017).

Para maíz de temporal se presentan áreas de muy buena productividad (MBP), de buena productividad (BP) y de mediana productividad (MP). Las áreas de MBP presentan una precipitación media anual de 675 a 800 mm en el período de junio a octubre y suelos de más de 1.0 m de profundidad, con rendimientos de hasta 6.0 t ha 1 ; las áreas de BP presentan una precipitación media anual en el período de junio a octubre de 625 a 675 mm y suelos de más de 0.7 m de profundidad, con rendimientos de hasta 4.0 t ha-1; las áreas de MP presentan una precipitación media anual en el período de junio octubre de 475 a 625 mm y una profundidad del suelo mayor a 0.5 m, con rendimientos de hasta 3.0 t ha -1 (María et al., 2002, 2003).

Hernández (2014), menciona que 90 % del maíz sembrado es con semilla nativa o criolla, y que ese alto porcentaje de siembra de maíces nativos muestra el gran interés de las comunidades campesinas por preservar este grano y el esfuerzo que realizan por resistir la introducción de variedades mejoradas.

Materiales y métodos Para desarrollar la presente investigación se usó la información generada en el Proyecto FZ016, Conocimiento de la Diversidad y Distribución Actual del Maíz Nativo y sus Parientes Silvestres en México, Segunda Etapa 2008-2009, que el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) realizó para la Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad (CONABIO), y que comprendió la investigación: Diversidad y Distribución Actual de los Maíces Nativos en Tlaxcala, como parte del Proyecto antes mencionado (María y Hernández, 2010).

Esta información se refiere a 256 muestras de mazorca de maíces nativos en parcelas de productores, obtenidas en el estado de Tlaxcala en los ciclos de producción de 2008-2009 y 20092010.

Región de estudio El estado de Tlaxcala se encuentra ubicado en en centro del pais, con altitudes entre 2200 y 3000 m, y comprende 60 municipios, de los cuales se cubrieron las principales áreas productoras de maíz del estado (María y Hernández, 2010).

Los valores medios de precipitación total anual en la región oscilan entre 262 (Rancho Zoquiapan, Benito Juárez) y 793 mm (ciudad de Tlaxcala), que se distribuyen entre 67.3 y 84.2 % en los meses de junio a octubre, respectivamente (María et al., 20051). Las temperaturas medias anuales van de 13.0 a 14.5 °C en la parte noroeste del estado, de 14.5 a 15.2 °C en la parte sur y de 13.5 a 15.2 °C en la parte sureste (INIFAP, 2012).

Los suelos presentes en el estado de Tlaxcala, según el sistema FAO corresponden a Andosoles (5.20 %), Arenosoles (1.75 %), Cambisoles (9.99 %), Durisoles (11.87 %), Fluvisoles (2.51 %), Gleysoles (0.06 %), Leptosoles (11.50 %), Luvisoles (5.68 %), Phaeozem (33.97 %), Regosoles (13.30 %), Solonchak (0.06 %) , Vertisoles (0.80 %) y Umbrisoles (2.00 %), con una superficie de hacentamientos humanos de 1.35 % (INEGI, 1986;

Razas de maíz María y Hernández (2010), reportan que las razas de maíz identificadas en 256 colectas en 34 municipios del estado de Tlaxcala, fueron: Cacahuacintle (2.7 %), Chalqueño (13.7 %), Chalqueño por Bolita (0.4 %), Chalqueño por Cacahuacintle (0.4 %), Chalqueño por Cónico (4.3 %), Cónico (44.5), Cónico por Elotes Cónicos (0.8 %), Cónico por Cacahuacintle (0.4 %), Cónico por Bolita (3.1 %), Cónico por Chalqueño (9.4 %), Cónico por Pepitilla (0.4 %) y Elotes Cónicos (19.9 %)2. Así, 78.5% de

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La clasificación directa fue de Hernández Casillas, J.M., experto de maíz del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias.

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las muestras colectadas, independientemente del color, están relacionadas con las razas de maíces Cónicos.

El color predominante del grano de las razas de maíz es el blanco, con 91.3 %, y 5.3 % presentan grano de color amarillo y 3.4% de color rojo, azul y negro (Medina, 2016).

determinó el porcentaje de olote, cuyo cálculo es igual a: • Porcentaje de olote = [(peso de mazorca – peso de grano) / (peso de mazorca)] * 100 (%).

Con el porcentaje de humedad del grano se calculó el peso del grano a humedad comercial (14.0 %), como: • Peso del grano a humedad comercial de 14.0 % = (100 – porcentaje de humedad del grano a la cosecha) / 86 (g).

Por otra parte, se realizó una clasificación de las razas de los maíces nativos presentes en la región, con la finalidad de observar si la variación de la forma y tamaño de la mazorca fuere una variable a considerar en la estimación del rendimiento a nivel de la región, de acuerdo a la distribución de ellas en ésta.

Muestreo de mazorcas Las parcelas de los productores en las que se colectaron las muestras, se distribuyeron en la superficie de siembras de maíz considerada, con base en los caminos de acceso, y las muestras se obtuvieron tanto de manera directa en el momento de la cosecha como en las viviendas de los productores cuando la cosecha ya se había realizado, pero no se habían desgranado las mazorcas.

En el ciclo de producción primavera-verano 20082009 se colectaron 204, y en el ciclo primaveraverano de 2009-2010 se colectaron 52 muestras; en algunos casos, se obtuvo más de una muestra por parcela, si a simple vista se consideraba que las mazorcas podían corresponder a diferente raza.

En cada muestra se obtuvieron al azar 50 mazorcas que fueren representativas, y que no estuvieron dañadas; esto, ya sea, al momento de la cosecha en los montones en que se van hacinando o del llenado de bolsas para su transporte, o en los sitios de almacenamiento y/o secado en los hogares. Las mazorcas se secaron al aire y a la sombra, hasta que su estado de humedad permitiese su desgranado manual. De las 50 mazorcas se tomaron al azar 15, se ordenaron según su longitud, y se tomaron las 10 centrales para medir las variables a considerar en cada una de ellas.

Las variables de la mazorca para las cuales se tomó información fueron: longitud, desde la base hasta la punta de la mazorca (cm), diámetro, en la parte central (cm), diámetro del olote, en la parte central (cm), número de hileras, número de granos por hilera, peso del grano (g) y contenido de humedad (%).

El diámetro de la mazorca y del olote se midió con un vernier metálico marca Truper, el peso de la mazorca se registró con una balanza mecánica Ohaus 750 SW, de 2 610 g, y el contenido de humedad se determinó con un medidor portátil de humedad marca Dickey-John Grain Moisture Tester Estados Unidos.

Con el peso de la mazorca y el peso del grano se

Análisis de la información La información se analizó para el peso de grano a humedad comercial (14 %) por mazorca en función de las variables de la mazorca y la humedad del grano, mediante regresión, con fines de obtener uno o más modelos matemáticos. Para esto se siguió el procedimiento propuesto por Volke (2008).

Con el modelo de regresión obtenido, se determinaron los valores predichos de peso de grano a humedad comercial de una mazorca, considerando las variables que incluyó el modelo en sus valores de interés, medios o de mayor frecuencia. Con el modelo obtenido y, en su caso considerando la distribución en la región de los valores de las variables que incluyese, además de una densidad de población dada o su distribución en la región, se podrá obtener el rendimiento medio en la región, lo cual no fue objetivo de esta investigación.

Resultados En el proceso de obtención de un modelo matemático para el peso de grano a humedad comercial (14 %) de una mazorca, se probaron todas las variables de la mazorca medidas. De estas variables, en todos los modelos probados quedaron incluidas las variables de peso de la mazorca húmeda, porcentaje de humedad de la mazorca y porcentaje de olote de la mazorca. Otras variables asociadas a la forma de la mazorca que pudiesen intervenir en el peso de grano de la mazorca, puesto que en la región, ya que se presentan distintas razas de maíz, como diámetro y longitud de la mazorca,

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diámetro del olote, relación largo/diámetro de la mazorca y las mismas diferentes razas de maíz, no mejoraron el ajuste de un modelo que incluyese a las variables de peso de la mazorca húmeda, porcentaje de humedad de la mazorca y porcentaje de olote de la mazorca.

En estos términos, el modelo matemático obtenido para el peso de grano a humedad comercial (14%) de una mazorca fue el siguiente:

de mazorca a la cosecha, un porcentaje medio de olote y una humedad media del grano.

Para el caso en que no se disponga de un medidor de humedad, se procedió a determinar un modelo que excluyese esta variable, a condición de que las mazorcas se hayan secado a la sombra por cierto tiempo hasta que resultase fácil su desgranado a mano, de modo que tendiesen a tener un contenido de humedad relativamente constante.

Con la presente información, la distribución de mazorcas por contenido de humedad del grano fue la que se indica en el tabla 1.

PG = 45.933 + 0.9065 PM – 1.487 HG – 8.233 PO0.50 (Pr. F = 0.0001, CME = 0.515, CV = 0.566 %, R2 = 0.999)

Tabla 1. Distribución de mazorcas por contenido de humedad del grano.

Contenido de humedad Porcentaje de mazorcas (%) (%) 10.5 – 11.0 0.8 11.1 – 12.0 20.3 12.1 – 13.0 52.7 13.1 – 14.0 19.9 14.1 – 17.5 6.3

Dónde: PG = peso de grano de una mazorca, a 14.0 % de humedad (g); PM = peso medio de 10 mazorcas, a humedad de cosecha (%); PO = porcentaje de olote (%); HG = humedad de la mazorca a la cosecha (%).

Cabe aclarar que en el año 2009 se presentaron heladas en la etapa de llenado del grano en la zona de El Carmen Tequexquitla, en 3.9% de las localidades, que afectaron y disminuyeron la producción de grano de la mazorca. Las colectas de las localidades afectadas se incluyeron en la estimación del modelo matemático como una variable auxiliar; sin embargo, para lo cual no se observó un efecto significativo en el ajuste del modelo, lo que tiene su explicación en que las heladas causaron una disminución del tamaño (diámetro) y peso de la mazorca, y un incremento del porcentaje de olote de la mazorca, con un incremento medio de 5.1%, y fue esta la variable que quedó incluida en el modelo. Este incremento del porcentaje de olote de la mazorca indica que la helada afectó un mayor grado al grano que al olote.

Sin embargo, podrá ocurrir que el efecto de la helada pueda variar según el momento en que ocurra al estado de desarrollo de la mazorca.

Para estimar el rendimiento en un año con daño de heladas a partir del modelo obtenido en esta investigación, se debe considerar el peso medio de las mazorcas muestreadas a su humedad de cosecha, la humedad media de las mazorcas, y el porcentaje de olote sin y con daño de heladas, y con los valores de peso de grano de una mazorca medidos se procede a obtener la media ponderada, según el porcentaje de superficie estimada con daño de helada.

Con el modelo matemático obtenido se calcula el peso medio de grano por mazorca de un productor, introduciendo en él un correspondiente peso medio

Teniendo en cuenta que las mazorcas deban llegar a un contenido de humedad lo más uniforme posible, mediante su secado, se consideraron las mazorcas con humedad entre 12.0 y 13.0, que además comprendieron 52.7 % del total, y con ellas se calculó un modelo.

En este modelo se consideró una humedad del grano en 12.5 %, y a partir de este valor se estimó el modelo a 14.0 % de humedad del grano, que es el siguiente: PG = 28.566 + 0.9052 PM – 8.542 PO0.50 (Pr.F = 0.0001, CME = 0.558, CV = 0.591 %, R 2 = 0.999)

Donde: PG = peso de grano de una mazorca, a 14.0 % de humedad (g), PM = peso medio de 10 mazorcas, secadas a la sombra, en promedio a 12.5 % de humedad (g); PO = porcentaje de olote (%).

El modelo obtenido presenta un buen ajuste, sin embargo, su cuadrado medio del error es ligeramente mayor que el del modelo que incluye el porcentaje de humedad de la mazorca.

Otro modelo de estimación de rendimiento, utilizado por investigadores como Díaz (1990), es el que considera las variables largo y diámetro de la mazorca, al cual se le estaría agregando el peso de la mazorca, e igual que el modelo anterior, consideraría la humedad de la mazorca secada a la sombra hasta que fuese fácil su desgranado a mano.

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No obstante, estando presente la variable peso de la mazorca, de fácil determinación, las variables longitud y diámetro de la mazorca no presentaron significancia, reflejo ello de la alta correlación entre el peso de la mazorca y estas variables, de: • peso – longitud: r = 0.859 (p = 0.0001), • peso – diámetro: r = 0.843 (p = 0.0001), motivo por lo cual no se obtuvo un modelo matemático con estas variables.

Una vez obtenido el modelo matemático que estima el peso medio de grano a humedad comercial (14 %) por mazorca; a nivel de productor, se puede estimar el rendimiento de grano por superficie (hectárea). Para esto se requiere conocer el número de mazorcas por hectárea, igual al número de mazorcas en una superficie muestreada, por un factor para expresar a número de mazorcas por hectárea, donde: • Superficie muestreada = [(largo de los surcos muestreados (m)) * (ancho promedio de los surcos muestreados (m))] (m2) • Factor para expresar por hectárea = 10000 / (superficie cosechada) (m2) • Número de mazorcas por hectárea = (número de mazorcas cosechadas en una superficie) * (factor para expresar por hectárea).

Díaz (1990), propone un procedimiento para el muestreo del número de plantas por superficie, válido también para determinar el número de mazorcas por superficie, que consiste en tomar mediciones del número de mazorcas y ancho de surco en cinco sitios de 10 m lineales distribuidos en la parcela según el formato de muestreo, obteniendo el número promedio de plantas y de mazorcas y calculando el área promedio (largo por ancho) muestreada.

El número de mazorcas por hectárea puede variar entre productores, lo mismo que la superficie de las parcelas; sin embargo, si la muestra es representativa, la estimación del rendimiento a nivel de región corresponderá al producto del número medio de mazorcas por hectárea por las hectáreas totales.

precisión, y además fueran de uso relativamente sencillo, se generaron dos modelos. El primero requiere del peso medio de 10 mazorcas, el porcentaje de olote y la humedad del grano; el segundo considera también estas variables, excepto la humedad del grano por si no se dispone del instrumento para obtenerla, aunque con un ajuste ligeramente menor que el primero.

Estos modelos incluyeron: uno, tres variables de la mazorca, como el peso de la mazorca a humedad de cosecha, la humedad del grano y el porcentaje de olote, y otro, el peso de la mazorca seca a la sombra y el porcentaje de olote, con valores ambos de R2 = 0.999.

En estos términos, los modelos obtenidos presentan un buen ajuste y son de fácil aplicación, considerando que la humedad del grano en su caso y el porcentaje de olote son variables que es necesario determinar, aunque en uno de los modelos se consideró la humedad del grano seco a la sombra.

Díaz (1990) generó modelos matemáticos del peso de grano de la mazorca, ya corregido por porcentaje de olote y porcentaje de humedad del grano, en función de las variables longitud y diámetro de la mazorca: uno, con las variables simples y cuadráticas y las interacciones entre ellas, con un total de ocho variables y un R2 de 0.840; otro, partiendo de las mismas ocho variables y aplicando el procedimiento de “selección a pasos”, que incluyó la variable lineal de diámetro y las interacciones: negativa entre las variables lineal de longitud y diámetro al cuadrado y positiva entre la variable lineal de diámetro y cuadrática de longitud, con un R2 de 0.829.

El modelo con ocho variables puede estar mostrando signos contrarios a los esperados, para una o más variables, por ejemplo, negativo para la longitud de la mazorca, debido a las correlaciones entre las variables, y el modelo obtenido con el procedimiento “selección a pasos” no incluyó la variable lineal de longitud, y en cambio incluyó las interacciones: negativa cuadrática de diámetro por lineal de longitud y positiva lineal de diámetro por cuadrática de longitud, lo que resulta difícil de interpretar en términos del fenómeno.

Este resultado concuerda con el hecho de que el procedimiento de “selección a pasos” no siempre da los mejores modelos, ya sea por exclusión de variables con sentido según el fenómeno o con signos contrarios a los esperados, derivado ello de una alta correlación entre las variables que el

Discusión Dado que el objetivo de la investigación fue generar uno o más modelos matemáticos para estimar el rendimiento de grano de maíz para los maíces nativos del estado de Tlaxcala, que considerasen factores bióticos para tratar de tener mejor

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Por último, cabe resaltar que en la literatura existe escasa información sobre el desarrollo y uso de modelos matemáticos como los generados en el presente caso, y la utilidad que ellos pueden tener.

Conclusiones Se generaron dos modelos matemáticos para la estimación de rendimiento de grano de maíces nativos del estado de Tlaxcala, con base en variables de la mazorca como peso de la mazorca y porcentaje de olote, y porcentaje de humedad del grano, relativamente sencillos y con buen ajuste estadístico (R2 = 0.999, en ambos), cuya validez es solo para este tipo de maíces en el estado de Tlaxcala.

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Identificación de regiones genómicas asociadas a respuesta a la vacunación contra el PRRS en cerdas reproductoras del sur de Sonora, México G. Luna-Nevárez1 *, C.M. Aguilar-Trejo1, R.I. Luna-Ramírez1, R. Zamorano-Algandar1, X. Zheng2, M.E. Enns2, S. Speidel2, M.G. Thomas2 y P. Luna-Nevárez1 1

Departamento de Ciencias Agronómicas y Veterinarias; Instituto Tecnológico de Sonora; C.P. 85000, Ciudad Obregón, Sonora.

2 Department of Animal Sciences; Colorado State University; P.C. 80523-1171, Fort Collins, Colorado.

Identification of Genomic Regions Associated to PRRS Vaccination Response in Replacement Gilts from South of Sonora, Mexico Abstract The porcine respiratory and reproductive syndrome (PRRS) is a viral disease that seriously affects porcine production in Mexico. The most important method to prevent such disease is the vaccination of replacement sows, whose highly-variable response involves a complex genetic component. Therefore, objective of this research project is to discover genetic basis associated to a physiological-clinical indicator of vaccination response (IVR) against PRRS virus, such indicator is composed by the variables rectal temperature (TR) and daily weight gain (GPD). This study included 100 replacement sows with breed composition ¾Landrace and ¼Yorkshire, about 6-month of age, and vaccinated against PRRS using a modified live virus (day 0). Data from rectal temperature and live weight were collected the days -7, 0, 7, 14, 21, 28 and 35 after vaccination.

Blood samples were obtained from each sow at day 40 after vaccination and poured on blood collection cards.

The cards were processed for genomic analyses using a low density device which included 10,000 polymorphisms. A Bayesian model for genomic analysis called Bayes C was implemented in the software GenSel to study the genetic variation of the VRI explained by molecular markers previously associated to VRI. The genomic analysis detected 13 genic windows within chromosomes 3, 4, 5, 9, 12, 15, 16 and 17, which explain about 32% of the total genomic variation associated to IVR. In conclusion, there exist genetic components associated to IVRI, and this assumption is supported by the genomic analyses that suggests the IVR is gene-influenced. Therefore, this study could be proposed as an important strategy for genetic selection to identify sows with favorable response after vaccination against the PRRS virus.

Key words: replacement sows, genome, PRRS, genetic variation.

Resumen El síndrome respiratorio reproductivo porcino (PRRS) es una enfermedad de origen viral que afecta seriamente la producción porcina en México. El principal método para prevenir dicha enfermedad es la vacunación de las hembras de reemplazo, cuya respuesta altamente variable tiene un complejo componente genético. Por lo anterior, el objetivo de la presente investigación fue descubrir bases genéticas asociadas a un indicador fisiológico-clínico de respuesta a la vacunación (IRV) contra el virus del PRRS; dicho indicador está compuesto por los caracteres de ganancia de peso diaria (GPD) y temperatura rectal (TR). El estudio incluyó 100 marranas de reemplazo de raza ¾Landrace y ¼Yorkshire, con edad de 6 meses y vacunadas con el virus vivo modificado del PRRS (día 0). Se recolectaron datos de temperatura rectal y peso vivo de todas *Autores de correspondencia Email: g_luna_n@yahoo.com.mx

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las hembras los días -7, 0, 7, 14, 21, 28 y 35 posteriores a la vacunación. Muestras de sangre fueron obtenidas de cada hembra el día 40 posterior a la vacunación y depositadas en tarjetas de recolección “Blood Cards”.

Las tarjetas fueron procesadas para análisis genómico utilizando un dispositivo de baja densidad de 10,000 polimorfismos. Un modelo bayesiano de análisis genómico Bayes C fue implementado en el software Gensel para estudiar la variación genética del IRV que es explicada por los marcadores moleculares que resultaron previamente asociados a dicho indicador. El análisis genómico detectó 13 ventanas génicas dentro de los cromosomas 3, 4, 5, 9, 19, 12, 15, 16 y 17, que explican cerca del 32% del total de la variación genómica asociada al IRV. Se concluye que existen componentes genético asociado al IRV, ya que el análisis el genómico arrojó resultados que sugieren en forma confiable que el IRV está regulado por genes. Por lo tanto, el presente estudio puede ser propuesto como una potencial estrategia de selección genética de cerdas con respuesta favorable a la vacunación contra el virus del PRRS. Palabras claves: cerdas de reemplazo, genoma, virus del PRRS, variación genética.

del PRRS. Hay dos tipos de vacunas disponibles comercialmente, una es una vacuna con virus vivomodificado (VVM) y la otra es una vacuna con virus muerto (VM). (Charerntantanakul et al., 2010).

Por otro lado, estudios asociativos de genoma completo relacionados con el PRRS en cerdos se han elaborado con anterioridad. Bodicker et al.

(2012) realizaron un estudio asociativo de genoma completo (GWAS) utilizando los caracteres de carga viral y ganancia de peso en cerdos expuestos al PRRSV. Los genotipos obtenidos usando un dispositivo de perfil genómico (chip) de ~60,000 SNPs identificaron regiones genómicas asociadas con carga viral en los cromosomas 4 y X, y con ganancia de peso en los cromosomas 1, 4, 7, y 17.

Por otra parte, Serão et al. (2014) realizaron estudio asociativo en cerdos expuestos a la vacuna del PRRS utilizando los caracteres de ganancia de peso y presencia de anticuerpos; ellos reportaron 61,565 SNPs útiles e identificaron regiones genómicas asociadas a ganancia de peso en el cromosoma 4, y para presencia de anticuerpos en los cromosomas 2, 6, 7, 13, 10 y 18. Hasta el momento, no se ha identificado un estudio considerando sólo los caracteres de temperatura rectal y ganancia de peso asociados con respuesta favorable a la vacuna del PRRS, en el proceso de aclimatación.

Adicionalmente Serão et al. (2016) reportaron la validación de genes asociados a la resistencia a la enfermedad del PRRS, durante el proceso de aclimatación de cerdas de reemplazo expuestas a la vacuna del PRRSV.

Introduccción El síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) es la más significativa enfermedad que afecta comercialmente a la producción porcina en Norteamérica, Europa y Asia (Rowland et al., 2012). El cerdo (Sus scrofa), tanto doméstico como silvestre, es la única especie conocida que resulta naturalmente susceptible al PRRS (AHA, 2004). El PRRS causa problemas reproductivos en animales en crianza, y problemas respiratorios y reducción del desarrollo en animales en crecimiento (Boddicker et al., 2012). El fallo reproductivo se caracteriza por infertilidad, momificación fetal, abortos, agalactia y el nacimiento de lechones muertos, o tan débiles que mueren poco después de nacer, debido a trastornos respiratorios e infecciones secundarias como Salmonella choleraesuis, Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae y virus de la influenza porcina (Hill, 1996). En cerdos en crecimiento el virus del PRSS causa una neumonía intersticial (Collins et al., 1992). El virus del PRRS (PRRSV), pertenece al orden Nidovirales, familia Arteriviridae, género Arterivirus (Zimmerman et al., 2006). El período de incubación oscila entre 4 y 8 días experimentalmente, pero en focos naturales puede durar entre 3 y 37 días (AHA, 2004). Las medidas utilizadas actualmente para controlar el PRRS incluyen despoblación, repoblación y eliminación del hato, bioseguridad, prueba y remoción, y vacunación (Corzo et al., 2010). La estrategia de vacunación es la menos costosa para los porcicultores y es accesible para todos los tamaños de productores (ej. pequeños, medianos y grandes), comparada con otras estrategias de control

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Debido a la relevancia que tiene la vacuna del PRRS como medio para reducir la pérdidas económicas relacionadas con los signos clínicos de la enfermedad (Charerntantanakul et al., 2010), el objetivo del presente estudio es conocer las bases genéticas que propician una reacción favorable a la vacuna del PRRS utilizando un indicador compuesto por dos caracteres de comportamiento: temperatura corporal y ganancia de peso, en marranas expuestas a la vacuna, aplicando una herramienta estadístico-Bayesiana para conducir un estudio asociativo de genoma-completo (GWAS).

Los resultados del estudio son parte de una primera etapa para descubrir las bases genéticas de respuesta de resistencia al virus del PRRS (PRRSV). La identificación de genes asociados con el indicador compuesto de respuesta a la vacuna IRV será útil para implementar posteriormente estudios a nivel molecular.

Fenotipos Siete días antes de la vacunación contra la enfermedad del PRRS, se extrajo una muestra de sangre de cada hembra, las cuales fueron transportadas al Laboratorio de Diagnóstico Integral de Patología Animal (DIPA), México. Con las muestras de ARN identificadas se realizó el análisis de PCR en tiempo real para PRRS utilizando un kit comercial (Tetracore Nextgen Real-Time QT-PCR Target Specific reagents for the detection & differentiation of North American & European PRRSV Viral ARN), que reconoce un segmento del ORF 7, reportándose como número de copias de ARN del virus PRRS por mililitro de muestra (con el equipo: Cepheid Smart Cycler Version 2.0d.).

Esta prueba se realizó para garantizar que todas las hembras a estudiar presentaran un diagnóstico negativo a la presencia del virus del PRRS. Las hembras fueron pesadas semanalmente utilizando una báscula ganadera de corral para pequeñas y medianas especies, para calcular la ganancia de peso diaria (GDP; kg). Antes de pasar a la báscula se les tomó la temperatura rectal (TR; oC) utilizando un termómetro GLA M750 digital (GLA Electrónica agrícolas). Las mediciones de ambas variables se recolectaron los días: -7, 0, 7, 14, 21, 28 y 35, con respecto al día de la aplicación de la vacuna contra el PRRS. Los estadísticos descriptivos de las mediciones de se muestran en la tabla 1.

Todas las hembras fueron categorizadas de acuerdo a las mediciones promedio durante el estudio de GDP y TR, como parte de la preparación de la información para los análisis estadísticomoleculares.

Materiales y métodos Población Se eligieron inicialmente 100 individuos de una granja porcina comercial ubicada en el Valle del Yaqui, al sur del estado de Sonora (LN: 27°17', LO: 109°56', altitud 50 msnm). Los individuos fueron cerdas primerizas en desarrollo con propósito final de producción, con 6 meses de edad y que nacieron el mismo día: 02/11/2012. Su composición racial fue ¼York + ¾Landrace, con un peso inicial de 108.23 ± 10.9 kg Todas las hembras fueron seleccionadas en forma aleatoria, y no presentaban infección al virus del PRRS al inicio del estudio, momento desde el cual fueron alojadas en corrales dentro de un área de cuarentena. Después de un período de adaptación de 7 días, se aplicó la vacuna comercial por vía intra-muscular con la dosis mínima inmunizante propuesta por el fabricante contra el virus del PRRS (virus activo modificado cepa ATCC-VR-2332 del PRRS DICT50 propagado en cultivos celulares, Ingelvac PRRS MLV del laboratorio Boehringer Ingelheim) dando inicio al experimento, por lo que el día de la vacunación se consideró como el día 0. Durante el desarrollo del proyecto fue necesario prescindir de 25 animales, debido a que fueron sujetos a otras pruebas experimentales, siendo 75 cerdas el universo final para estudio.

Para GDP (donde el promedio es igual a 0.467 kg): 1=Debajo del promedio, 2=Por arriba del promedio.

Para TR: 1=Debajo de 39oC, y 2=Arriba de 39oC. Basándose en las categorías antes descritas se generó el indicador compuesto, el cual incorporó los dos caracteres fisiológicos y al cual se le denominó indicador de respuesta a la vacuna (IRV). Se eligieron estos dos fenotipos debido a que el carácter de ganancia de peso ha sido previamente reportado como asociado a la respuesta a la

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Tabla 1. Detalle de estadísticos descriptivos para los caracteres (fenotipos).

Día

n

Min

Media

Max

SD

Ps -7 (kg)

75

85.00

108.30

131.40

11.00

Ps 0 (kg)

75

82.00

109.00

136.00

11.97

Ps 7 (kg)

75

89.00

113.40

137.60

11.54

Ps 14 (kg)

75

93.00

116.60

140.60

11.21

Ps 21 (kg)

75

96.70

121.10

147.20

11.41

Ps 28 (kg)

75

102.20

125.90

155.40

12.33

Ps 35 (kg)

75

100.60

125.30

151.20

12.39

Ps Promedio (kg)

75

93.73

117.09

141.71

10.78

GDP 0 (kg)

75

-3.171

0.875

2.771

0.875

GDP 7 (kg)

75

-2.800

0.733

4.067

1.123

GDP 14 (kg)

75

-1.770

0.461

2.543

0.806

GDP 21 (kg)

75

-1.200

0.634

1.714

0.506

GDP 28 (kg)

75

-1.425

0.602

1.725

0.462

GDP 35 (kg)

75

-1.700

-0.097

1.500

0.621

GDP Promedio (kg)

75

-0.246

0.467

1.247

0.293

TR -7 (°C)

75

38.85

39.63

41.00

0.47

TR 0 (°C)

75

35.29

39.09

42.38

0.67

TR 7 (°C)

75

38.40

39.04

40.04

0.34

TR 14 (°C)

75

31.76

38.62

40.75

1.26

TR 21 (°C)

75

38.16

38.91

40.53

0.33

TR 28 (°C)

75

36.74

39.08

39.95

0.38

TR 35 (°C)

75

38.44

38.89

39.86

0.29

TR Promedio (°C)

75

37.71

38.90

39.62

0.32

Cálculos estadísticos descriptivos (mínima, media, máxima y desviación estándar) para los caracteres de temperatura rectal (TR en °C) y ganancia de peso diaria (GDP en kg) para los días de recolección de datos (-7, 7, 14, 21, 28, 35), así como el promedio del periodo de recolección. GDP fue calculada con el carácter de peso (Ps en kg).

vacunación contra el virus del PRRS (Serão, 2014), así como en estudios asociativos con enfoque productivo (Fontanesi, 2014; Onteru, 2013; Do, 2015), mientras que el carácter de temperatura rectal ha sido medido, evaluado y analizado como un signo clínico en estudios con inoculación del PRRSV (Ladinig, 2014; Bonckaert, 2016; Han, 2011).

TR=2), P=Respuesta Pobremente Favorable (si GDP=1, TR=2).

Después de la aplicación de criterios en las 75 cerdas de reemplazo para obtener el IRV, la distribución de individuos en cada sub-universo fue:

El IRV permitió clasificar a las hembras de la siguiente forma:

28 se identificaron como “Pobremente Favorables”, 18 como “Medianamente Favorables” y, 29 como “Altamente Favorables”.

A=Respuesta Altamente Favorable (si GDP=2, TR=1), M=Respuesta Medianamente Favorable (si GDP=2,

Genotipos El día 40 posterior a la vacunación, de cada una de las 75 hembras se extrajo de la parte trasera-inferior

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de la oreja 3 ml de sangre, mediante punción con jeringa comercial estéril, la cual fue depositada en tarjetas recolectoras con filtro separador de componentes sanguíneos “blood cards”. Las tarjetas fueron transportadas al Laboratorio de Biotecnología de Reproducción del ITSON y almacenadas en cajas especiales a temperatura ambiente (32 oC) durante una semana.

Posteriormente, las tarjetas fueron enviadas al Laboratorio Neogen/GeneSeek Inc. (Nebraska USA), donde se procesaron para la extracción y cuantificación del ADN. Para identificar los genotipos se utilizó un dispositivo de perfil genómico de baja densidad (GeneSeek Genomic Profiler for Porcine Low Density BeadChip, versión GSGT 1.9.4) con aproximadamente 10,000 polimorfismos de nucleótido simple (SNPs), de acuerdo al protocolo definido por el proveedor. Este chip, o circuito integrado en una pequeña tableta, es comúnmente utilizado por la USDA (Departamento de Agricultura de los Estados Unidos) por que contiene SNPs que permiten identificar marcadores de crianza que están asociados con un desarrollo estructural robusto y sano del animal. Algunos de los principales marcadores incluidos son: Gen del síndrome de estrés porcino, gen de rendimiento Napole, gen de resistencia a E. coli (F4 ab/ac), y el gen de resistencia o tolerancia al virus del PRRS (WUR10000125).

En la tabla 2 se presentan los estadísticos descriptivos sobre la ubicación de los SNPs identificados en el análisis genómico.

menor de alelo (MAF) > 0.03, valores de P > 10-6 para la prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg y porcentaje de error Mendeliano < 0.1, fueron incluidos en el estudio (Yang et al., 2013).

Un total de 8,826 SNPs útiles resultaron después de aplicar el procedimiento de calidad, para ser incluidos en el análisis asociativo, en los 75 individuos.

Estudio Asociativo de Genoma Completo (GWAS) La asociación de los genotipos de cada SNP con el fenotipo IRV fue analizada considerando todos los SNP en forma simultánea usando el método bayesiano para selección genómica llamado Bayes C (Habier et al., 2011), el cual se implementó con el software GenSel versión 3.04 (Fernando y Garrick et al., 2009). Se obtuvo la variación genética explicada por cada SNP en cada ventana genómica de un mega base (1 Mb). La ecuación del modelo estadístico usado fue: y = Xb + Σ zi αi δi + e; la sumatoria es, de i hasta n número de SNP. donde: y = vector de fenotipos (respuesta a la vacuna del PRRS, IRV); X = matriz de incidencias relacionadas con los efectos fijos de los fenotipos; b = vector de efectos fijos; z = vector de covariables del genotipo del SNP (10/0/10), basado en el número de alelos B usando la nomenclatura del proveedor del Chip (GeneSeek); α = efecto aleatorio de la sustitución alélica para cada SNP ; δ = indicador de inclusión/exclusión del SNP (inclusión=1, exclusión=0); e = vector de efectos aleatorios del error residual.

Control de Calidad Para el análisis de calidad y depuración de los genotipos se utilizó el software PLINK v1.07 (Purcell et al., 2007).

Los criterios de control de calidad implementados con PLINK y que fueron aplicados a los datos de cada SNP de la población fueron: Los animales que presentaron una frecuencia (call rate) >0.9 y porcentaje de error Mendeliano <0.05, sólo los SNPs con frecuencia >0.9, frecuencia

Cuando el valor aleatorio de la variable independiente δ indicó ausencia (exclusión) del SNP se consideró probabilidad π, y cuando indicó presencia (inclusión) se consideró probabilidad 1-π.

El efecto residual e se asumió que está normalmente distribuido, es decir N(0, σ2e). El método Bayes C

Tabla 2. Estadísticos Descriptivos de Distancias entre SNPs Concepto Distancia (bp)

No. SNPs

Min

Mean

Max

SD

8,826

45

342,842

2,749,313

269,757

Estadísticos descriptivos (tamaño de la muestra, valor mínimo, valor máximo, media y desviación estándar) sobre las distancias entre los marcadores identificados, obtenidos de las muestras de sangre enviadas para análisis genómico del ADN. La unidad de medición de la distancia es bp (pares de bases).

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asume que el efecto aleatorio de la sustitución alélica de los SNPs (α) es diferente de cero (con δ=1 y probabilidad 1-π), y la varianza es la misma para el análisis conjunto de todos los SNPs. Las distribuciones previas para las varianzas (σ2α y σ2e) fueron asumidas bajo una distribución de probabilidad χ² (ji-cuadrada) inversa con 4 o 10 grados de libertad. La probabilidad previa de que δi = 0 se consideró como igual 0.98, es decir π = 0.98, buscando identificar alta variación. Un total de 40,000 iteraciones de Cadena de Markov fueron consideradas para el análisis, con 1,000 iteraciones como máximo para cada eslabón para obtener la media posterior del efecto de cada SNP. La varianza genética fue registrada cada 100 iteraciones (frecuencia de salida a los resultados) para cada fragmento de 1 Mb de genoma y expresado como un porcentaje del total de la varianza explicada en el genoma completa en esa iteración (Zeng et al., 2014).

existieron genotipos, identificaron.

y

cuáles

genotipos

se

Estudio Genómico Los resultados del GWAS para IRV usando Bayes C se muestran en la figura 1. Se identificaron 13 ventanas genómicas con distancia de 1 Mb con alta representación que explican un 32% de variación genómica para el IRV. Los 13 locus de caracteres cuantitativos (QTL) fueron seleccionados por el criterio de mayor variación genómica por ventana, para cada cromosoma, y se eligieron los SNPs más representativos para los cuales la suma conjunta de su variación genómica supera el 1%. Un resumen sobre los QTLs se muestra en la tabla 5.

El genoma del cerdo mide aproximadamente 143 432 695 Mb, por lo que incluye 16,251 ventanas de 1 Mb no sobrepuestas basándonos en 8,826 marcadores genotipificados (Onteru et al., 2013).

La ventana 1618 del cromosoma 12 (SSC12, o Sus Scrofa Chromosome 12 por sus siglas en inglés; acrónimo para mencionar un cromosoma del genoma del cerdo), con una distancia de 2 Mb, e integrada por 8 polimorfismos, fue la que presentó mayor variación genómica. El QTL correspondiente a la ventana 1618 inicia en la posición 2 097 504 terminando en la posición 2 979 580 del genoma porcino. La ventana 499 del cromosoma 3 (SSC3) con una distancia de 30 Mb, conformada por 3 SNPs fue la que presentó la menor variación genómica del grupo presentado.

Los tres SNPs con mayor variación genómica en el análisis fueron: ASGA0088990 con 7.70% de variación, en la ventana 1618, en SSC12, en la posición 2,979,580 Mb del genoma;

Ubicación de Genes Candidatos La versión de genoma porcino 10.2 (Pig Sscrofa 10.2) fue utilizada para caracterizar a los genes en la página web “e!Ensembl”. La página fue consultada con el navegador de páginas web Firefox versión 40.0.3 (http://useast.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index).

Resultados Control de Calidad Se presentan dos cuadros de resúmenes (Tablas 3 y 4) sobre los resultados del proceso de control de calidad, y corresponden a los animales en los que

Tabla 3. Estadísticos Descriptivos de las Muestras Genotipificadas Concepto

n

Min

Mean

Max

SD

Call rate

75

0.939

0.983

0.988

0.006

Het rate

75

0.343

0.4

0.436

0.016

Estadísticos descriptivos sobre el porcentaje de existencia del grupo de marcadores del Chip, en la muestra. El concepto “Call rate” es el indicador de existencia, y “Het rate” es indicador de inexistencia.

Tabla 4. Estadísticos Descriptivos para los Marcadores Moleculares Concepto

n

Min

Mean

Max

SD

Call rate

8,826

0

0.983

1

0.101

MAF

8,520

0.006

0.306

0.5

0.133

Presentación de cálculos de estadísticos descriptivos para porcentaje de existencia del total de los 10,000 SNPs en el ADN de los individuos. El concepto “Call rate” es el indicador de existencia, y “MAF” es la frecuencia del alelo menor.

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Figura 1. Gráfico “Manhattan Plot” que presenta en ventanas con distancia de 1 Mb la ubicación de los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) para cada cromosoma, por porcentaje de variación genómica. La variación fue calculada en base a su grado de asociación con el indicador de respuesta a la vacuna (IRV) mediante el modelo estadístico-matemático Bayes C del software GenSel. Tabla 5. Resultados del Análisis Genómico Ventana

SNP Inicial

SNP Final

#SNPs %Var

Pos. Inicial

Pos. Final

Cromosoma Mb

1618

ASGA0052479

ASGA0088990

8

7.82

2,097,504

2,979,580

12

2

2295

ALGA0092682

ASGA0100169

6

3.30

3,153,062

3,751,012

17

3

2264

ALGA0090848

H3GA0046792

4

3.18

59,182,785

59,930,060

16

59

614

ALGA0022165 M1GA0005374

5

2.87

3,078,372

3,961,749

4

3

799

ALGA0031834 ALGA0031841

3

2.37

47,148,878

47,782,626

5

47

42

DRGA0000604 DRGA0000615

4

2.34

42,106,831

42,826,453

1

42

1308

ASGA0102944

ALGA0051011

2

2.15

8,381,215

8,780,883

9

8

656

MARC0036045 ASGA0019569

3

2.06

45,255,747

45,908,536

4

45

655

SIRI0000030

ASGA0019551

4

1.56

44,003,320

44,916,881

4

44

2111

ALGA0085492

ASGA0069687

3

1.24

62,062,684

62,506,865

15

62

1300

ASGA0091563 M1GA0026290

9

1.08

70,220

974,310

9

0

1527

ASGA0094517

ASGA0090294

5

1.04

77,141,165

77,708,236

10

77

499

ASGA0014064

H3GA0009179

3

1.03

30,120,718

30,781,487

3

30

Total SNPs 59 Resumen sobre los resultados del análisis genómico. Se presentan los SNPs con su correspondiente variación genómica, agrupados en ventanas dentro de un mismo cromosoma, indicando el SNP Inicial y Final del grupo. Adicionalmente se muestra la ubicación de inicio de los SNPs en el genoma del cerdo, así como como la distancia ocupada conjuntamente (Mb).

ALGA0092677 con 3.27% de variación, en la ventana 2295, en SSC17, en la posición 3,264,239 Mb; y ASGA0073565 con 3.16% de variación, en la ventana 2264, en SSC16 ubicado en la posición 59,713,601 Mb.

Discusión Estudio Genómico En el estudio GWAS realizado por Serão et al.

(2014) en donde se analizaron los caracteres ganancia de peso diaria (ADG) y respuesta de anticuerpos (indicador S/P-Acc.) en individuos

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vacunados contra el PRRSV, para el carácter de ganancia de peso diaria se identificó una región en las posiciones 77-81 Mb del SSC4, explicando un 1.8 % del total de la varianza genética, y para respuesta de anticuerpos en el proceso de aclimatación se identificaron las regiones: 27-30 Mb del SSC7, y 82-83 Mb del SSC13, explicando 1.3% y 1.2% de total de la varianza genética, respectivamente. En el estudio GWAS para identificar bases genéticas de resistencia a la enfermedad del PRRS (Boddicker et al., 2012), donde se analizaron los caracteres de ganancia de peso (WG) y carga viral (VL), para ganancia de peso se identificaron regiones genómicas en las posiciones 139-140 Mb del SSC4 y 45 Mb del SSCX explicando el 15.7% y 1.8% de varianza genética, y para carga viral en las posiciones: 123124 Mb del SSC1, 139-140 Mb del SSC4, 24 Mb del SSC7, y 32-33 Mb del SSC8, explicando del total de varianza genética 2.1%, 11.2%, 2.6% y 1.0%, respectivamente.

Realizando un comparativo entre las regiones genómicas del presente estudio y las mencionadas anteriormente, para el carácter de ganancia de peso Serão et al. (2014) encontraron en el SSC4 una variación genómica de 1.8%, Boddicker et al.

(2012) obtuvieron 15.7% y el análisis realizado en el presente estudio sobre IRV (GPD y TR) arrojó 7.08%. Las posiciones de las regiones de los cromosomas comparados no son coincidentes. El resto de los caracteres no son comparables (S/PAcc. y VL).

El resultado total de variación genómica identificada para el IRV de 32%, en regiones no consecutivas, se puede considerar bueno, más no excelente, ya que los resultados más altos de los otros autores fueron de 17.5% (Boddicker et al.

2012) y 60.1% (Serão et al. 2014).

El marcador molecular WUR10000125, el cual fue identificado por Bodicker et al. (2012) como gen con alto potencial para resistencia a la enfermedad del PRRSV, en el presente estudio no se encontró asociado genéticamente de manera significativa con el IRV, aun cuando este SNP se presentó en el 100% de los individuos.

PRRSV, explica cerca de 32% de la variación genómica del indicador compuesto IRV. Estos resultados genómicos sugieren que durante el proceso de aclimatación a la vacunación del PRRSV se favorece la ganancia de peso diaria (GDP) y el control de temperatura corporal (TR); por lo que el estudio puede ser utilizado como estrategia complementaria de selección genética de hembras porcinas con respuesta favorable a la vacunación en contra del virus del PRRS. En el estudio se ejemplificó el potencial de un análisis extensivo del genoma para identificar las bases que propician superioridad genética en caracteres de impacto económico como: respuesta favorable a la vacuna de enfermedades (nuestro caso), resistencia a enfermedades, adaptación a condiciones climáticas adversas, o alto desempeño reproductivo o productivo. Se sugiere dar continuidad a investigaciones a nivel molecular para las regiones genómicas encontradas.

Agradecimientos Al laboratorio DIPA-ITSON por su apoyo en la realización de las pruebas de laboratorio y a la Unión Ganadera Regional de Porcicultores de Sonora por el financiamiento de los análisis de genoma completo.

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Conclusiones La identificación de 59 marcadores moleculares incluidos en las 13 ventanas genómicas en los animales expuestos a la vacuna en contra del

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Production of polyhydroxybutyrate from milk whey fermentation by Bacillus megaterium TRQ8 J. B. Ruiz Aguirre1, L. Z. Oliver Gómez 1, S. de los Santos Villalobos3, M. L. Sánchez1, 2* 1 2

Tecnológico de Monterrey, Escuela de Ingeniería y Ciencia. Vía Atlixcayotl 2301, Reserva Territorial Atlixcayotl, 72453 Puebla, Pue. Universidad Nacional de Quilmes, Dpto de Ciencia y Tecnología, Laboratorio de Ingeniería Genética y Biología Celular y Molecular Area Virosis de Insectos.

3 CONACYT- Instituto Tecnológico de Sonora. 5 de Febrero 818 Sur, Col. Centro, Ciudad Obregón, Sonora, México, CP. 85000

Producción de polihidroxibutirato a partir de la fermentación de suero de leche por Bacillus megaterium TRQ8.

Abstract Plastics derived from oil represent a major environmental problem, due to their long period of degradation, high emissions of CO2 and consumption of non-renewable resources. Thus, it is necessary to generate sustainable alternatives to produce natural polymers, such as polyhydroxybutyrate (PHB), a biopolymer produced from the fermentation of agro-industrial wastes by some microorganisms.

The aim of this work was to analyze the optimum culture medium composition and culture conditions to improve the yield of PHB production in Bacillus megaterium TRQ8. Milk whey was used as the carbon source and the fermentation was performed inside a bioreactor under controlled conditions. In order to achieve this purpose an initial conditioning pretreatment to remove the nutrients from the whey was implemented, afterwards, the fermentation and extraction of PHB were carried out; furthermore, different culture media containing ethanol and sodium acetate at different concentrations were tested to enhance the synthesis of PHB. As a result of the tests performed it was concluded that the medium with ethanol 1% v/v was the one that increased significantly the PHB production.

Key words: Bacillus megaterium, milk whey, fermentation, polyhydroxybutyrate (PHB), biofilms.

Resumen Los plásticos que son producidos a partir del petróleo representan un problema ambiental importante, debido a su largo periodo de degradación, altas emisiones de CO2 y por el consumo de recursos no renovables. Por lo tanto, es necesario generar alternativas sostenibles para producir polímeros naturales, como el polihidroxibutirato (PHB), que es un biopolímero producido a partir de la fermentación de residuos agroindustriales llevada a cabo por algunos microorganismos.

El objetivo de este trabajo fue analizar la composición óptima del medio de cultivo y las condiciones de cultivo para mejorar el rendimiento de la síntesis de PHB en Bacillus megaterium TRQ8. La fermentación se realizó dentro de un biorreactor con condiciones controladas y se utilizó suero de leche como fuente de carbono. Inicialmente se hizo un pretratamiento con la finalidad de eliminar los nutrientes del suero y posteriormente se llevó a cabo la fermentación y extracción del PHB; además, diferentes medios de cultivo que contenían etanol y acetato de sodio a distintas concentraciones fueron analizados con el objetivo de incrementar la producción de polihidroxibutirato. Con base en los resultados obtenidos se concluyó que el medio con etanol al 1% v / v fue el que aumentó significativamente la producción de PHB. Palabras claves: Bacillus megaterium, Suero de leche, fermentación, Polihidroxibutirato (PHB), biopelículas. *Autores de correspondencia Email: mirna.sanchez@itesm.mx

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to be toxic (Thompson et al, 2009). It has been proven that the chemicals used in the manufacture of plastics are present in human population through ingestion, inhalation or dermal contact (Talsness et al, 2009), this toxic substances, like the bisphenol A, polybrominated diphenyl ether (PBDE) and tetrabromobisphenol A (TBBPA), affect the reproductive system, disrupt thyroid hormone homeostasis, generate an anti-androgen action and cardiovascular diseases (Stahlhut et al, 2009).

However the most concerning problem is the current unsustainable production and high consumption of natural resources like oil to satisfy the immense demand of plastic items (North and Halden, 2013).

Thus, the generation or production of other kind of sustainable and biodegradable materials using renewable sources to mitigate the high fossil energy consumption (Gautam, 2009) and CO2 emissions is required (Naranjo, 2010). Natural polymers, such as polyhydroxybutyrate (PHB), represent a feasible and sustainable alternative for the fabrication of different biodegradable plastics (Getachew and Woldesenbet, 2016). One of the most important characteristics of this kind of polymers is their production using renewable carbon sources like milk whey, which is generated as an agro-industrial waste (GonzĂĄlez et al, 2013).

PHB is a polyester belonging to the polyhydroxyalkanoates family (Figure 1) that can be produced by several bacterial strains growing under stress culture conditions like nutrient depletion and an excess carbon source (Campuzano and Vasquez, 2013). Under these conditions, bacterial cells store PHB intracellularly as a reserve of carbon and energy in the form of granules (Babruwad et al, 2015).

Introduction Synthetic polymers include a wide range of materials synthetized by the polymerization of monomers derived from oil or gas, such as: polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, polystyrene and polyethylene terephthalate (Andrady and Neal, 2009). Likewise, plastics are usually made from these polymers using different chemical additives. These materials are costeffective, durable, lightweight and corrosionresistant materials with high thermal and electrical insulation properties that can be extruded, molded and casted (Thompson et al, 2009b). They are used in the manufacture of everyday items that generate social benefits and comfort; many aspects of daily life involve the use of plastics in many different areas like transportation, telecommunications, clothing, footwear and especially for packaging (Thompson et al, 2009b).

The great variety of today´s polymers and the versatility of their properties provide an ideal raw material for the manufacture of many different plastic products that facilitate the transportation of food, beverages and other goods (Thompson et al, 2009b). Packaging is the most used application for these polymers and accounts for about 40.1% of the overall consumption (Lambert, 2013), however, most of them are non-biodegradable, and their increasing accumulation in the environment is generating several environmental problems (Tokiwa et al, 2009). Each year, an estimated 500 billion plastic bags are consumed worldwide (Myint et al, 2012), in addition, the global demand for these polymers has increased, which negatively impacts the economy around these products, because the crude oil is limited (North and Halden, 2013) and it has been estimated that 260 million tons of plastic are used per year, accounting for approximately 8% of world oil production (Thompson et al, 2009).

Among the most significant problems are that plastic pollution and accumulation in the environment (natural habitats, shores, oceans, etc.) affects wildlife due to entanglement and ingestion of plastic residues by animals, causing serious injuries, restriction of movement, breathing, lacerations, ulcers, reproductive problems and death (Webb et al, 2013). Also, many of the chemicals that are used in the fabrication of plastics are known

Figure 1. Chemical structure of Polyhydroxyalkanoates

PHB is considered as one of the main alternatives to replace traditional plastics because it has favorable physicochemical characteristics such as being a completely biodegradable, strong and highly hydrophobic material (Wang et al, 2007). The

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chemical structure and physical properties of PHB are similar to that of polypropylene; however, its high melting temperature of 177°C makes the processing of this polymer difficult (Table 1) (Seoane et al, 2013).

The polymerization of the hydroxyalkanoic acids occurs by the action of intracellular enzymes forming an ester bond between the carboxyl group of one monomer with the hydroxyl group of the following (Figure 1) (Lemos and Mina, 2015).

There are two ways for the synthesis of polyhydroxyalkanoates, the first is the in vitro production performed through a cell-free system from monomers just as lactones, hydroxyalkanoic acids or thioesters, which are not naturally synthesized, the second form, the in vivo production, is given by the genetic modification of plants or by the fermentation of substrates through microorganisms in order to induce the metabolic pathways of production of polyhydroxyalkanoates (Martínez, 2013).

The monomeric composition of these biopolymers depends on the metabolic pathways by which they are synthesized and the external carbon source used as raw material (Peña et al, 2014). The three metabolic pathways by which PHAs are synthesized to obtain their derivatives is through the degradation of fatty acids, fatty acid biosynthesis and the degradation of sugars to obtain Acetyl-CoA (Serrano, 2010). PHB is a derivative of PHAs and its metabolic pathway has been generally studied, as shown in figure 2. This explains how keto-thiolase enzyme catalyzes the reversible addition of an acetyl group to an acetyl-CoA molecule, the Acetoacetyl-CoA reductase reduces the Acetoacetyl-CoA molecules into 3 hydroxybutyrylCoA and finally, the PHB synthetase catalyzes the polymerization reaction between the hydroxybutyrate molecules (Rivera, 2009).

Figure 2. Metabolic pathway for the PHB synthesis (Rivera, 2009).

PHB is synthesized by more than 300 microorganisms, but not all of them accumulate enough to be used in large-scale production, the best producing bacteria that are capable of accumulating large amounts are: C. necator, Azohydromonas, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, Aeromonas hydrophila, Paracoccus denitrificans, Methylobacterium extorquens, Bacillus spp., Azotobacter vinelandii and recombinant E. coli (Peña et al, 2014).

The required microbial characteristics for selecting a promissory strain is its short duplication time, high yield of PHB synthesis, consumption of a cheap carbon source, and the quality of the PHB produced (Lemos and Mina, 2015). Thus, the species Bacillus megaterium, a Gram-positive bacilli, aerobic and sporulated bacteria presents all the characteristics previously mentioned (Vary et al, 2007). The macroscopic characteristics of this species are large and convex colonies with uniform borders, they are also moist and non-hemolytic (Forbes, 2009). In addition, the PHB is produced by this bacterial species by the fermentation of raw materials like agro-industrial wastes, as it is the case

Table 1. Comparison between polyhydroxybutyrate and polypropylene properties (Singh, 2015).

Property Polyhydroxybutyrate Polypropylene Melting temperature (°C)

177

176

Glass transition temperature (°C)

2

-10

Crystallinity (%)

60

50-70

Tensile Strength (MPa)

43

38

Extension to break (%)

5

400

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of the milk whey, which is the liquid obtained during cheese production by coagulating and separating casein proteins from milk (Naranjo, 2010). Whey contains a large amount of nutrients such as proteins, lipids and minerals, since it retains 55% of the total milk nutrients it also has a high lactose content close to 5% or 94 g l-1 (Bovo, 2014).

It is estimated that 1 or 2 kg of cheese can be produced from every 10 liters of cow's milk, and an approximate from 8 to 9 kg of milk whey is produced in this industrial process. Thus, this product is the most viable alternative to be used as substrate for the production of PHB (Naranjo, 2010). The milk whey composition is characterized by the origin of the milk, generally 70% of crude proteins (beta-lactoglobulin, alpha-lactoglobulin, and immunoglobulin), protease-peptones, and native enzymes remains in the serum (Valencia, 2009).

Therefore, the synthesis of PHB by the bacterial fermentation of milk whey is a promissory alternative to replace the plastics derived from petroleum, such as propylene and polypropylene (Naranjo, 2010). In addition, the use of milk whey as a carbon source in this process mitigates the environmental problems caused when it is discarded to the environment without any treatment (Valencia, 2009). PHB can also be used in 3D printing, tissue repair and polymer-based depots for controlled drug release or implants (Luef et al, 2015).

The objective of this work is to present the PHB as a new alternative polymer for the production of biofilms and to determine the optimum culture conditions to enhance its synthesis in B. megaterium TRQ8.

whey was sterilized at 115 °C for 15 minutes, causing the precipitation of a fraction of proteins (Bell et al, 1983). The supernatant obtained from the sterilization was filtered using a celluloseacetate fiber membrane, then the pH of the supernatant was adjusted to 7.0 using a 12N NaOH solution. Finally the solution was centrifuged at 4,400 rpm for 15 minutes and the supernatant obtained in this step was used to prepare the culture medium. (Campuzano et al., 2013).

Growth Conditions for Fermentation For the fermentation of B. megaterium TRQ8 were used 1.0 x 103 Unit Forming Colonies ml-1, which was carried out in a bioreactor with a capacity of 5 l during 48 hours at 32 °C and 200 rpm. The total volume of whey and culture medium were 2 l, with 10% v/v of the culture medium composed by KH2PO4, 1.5 g l-1; Na2 PO4, 9 g l-1; MgSO4 7H4O, 0.2 g l-1; and 1 ml l-1 of a solution of trace elements composed of: FeSO4 7H2O, 10 g l-1; ZnSO4 7H2O, 2.25 g l-1; CuSO4 5H2O, 1 g l-1; MnSO4 4H2O, 0.5 g l-1; CaCl2 2H2O, 2 g l-1; H3BO4, 0.23 g l-1; (NH4)Mo7O24, 0.2 g l-1; and 35% HCl, 10 ml.

(Heinrich et al, 2012; Campuzano et al., 2013).

PHB Extraction, Quantification and Production of the Biofilms After 48 hours of fermentation, the culture was centrifuged at 4,400 rpm during 30 minutes, the supernatant was discarded and the dry weight of the cells in g/ml was measured from the obtained pellet.

Then, it was digested with a 4% sodium hypochlorite solution at a temperature of 37 °C for 20 minutes, the solution was centrifuged again at 4,400 rpm for 30 minutes. The pellet was then washed with acetone, water and ethanol 70%. Once the PHB was obtained, its weight was measured and the percentage of accumulation, in g/ml, was calculated using the following formula (Mikkili et al, 2014):

Materials and methods Bacterial strain The strain Bacillus megaterium TRQ8 used in this work was isolated from wheat rhizosphere in the Yaqui Valley, Sonora, MĂŠxico. This strain belongs to ColecciĂłn de Microorganismos EdĂĄficos y EndĂłfitos Nativos del Instituto TecnolĂłgico de Sonora (www.itson.mx/COLMENA) (de los Santos-Villalobos et al., 2017).

Pre-treatment of the Milk Whey To be able to use the milk whey as a substrate for the production of PHB by B. megaterium TRQ8 fermentation, it was necessary to sterilize and to remove the proteins present in the serum. The milk

% đ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;&#x201C; đ?&#x2018;&#x192;đ??ťđ??ľ đ?&#x2018;?đ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;&#x2018;đ?&#x2018;˘đ?&#x2018;?đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x2013;đ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;&#x203A; =

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Finally, 100 ml of chloroform were added at 60 °C during 15 minutes for each 3 g of PHB obtained, the mixture was placed on a cellulose paper inside a Petri dish and the solvent was evaporated at room temperature in a vacuum for 24 hours (Cyras et al, 2007).

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Optimization of PHB Production The experiment was carried out with the same inoculation, culture medium, and conditions previously mentioned, however, 3 modifications were evaluated with the aim of improving the yield of the PHB, such as the addition of: i) 1% v/v of ethanol, ii) 3% v/v of ethanol, iii) 1% v/v of sodium acetate, and iv) 3% v/v of sodium acetate, 27 hours after incubation, when the bacteria was in the stationary phase. In addition, the amount of oxygen available in a flask was increased to quantify its effect on the PHB synthesis (Table 2) All the samples were done by duplicate. After 48 hours of fermentation, the amount of PHB was quantified, according to the protocol mentioned before.

Results and discussion All the treatments, evaluated by duplicate, allowed the synthesis of PHB from the milk whey fermentation by B. megaterium TRQ8, since all of them had the required conditions aforementioned.

The application of external stress has been reported as an efficient strategy to improve the production of PHB (Obruca et al, 2011). Thus the culture medium containing 1% of ethanol increased the production of polyhydroxybutyrate to 46% (control treatment: 28%) (Figure 3).

In this case, the strain TRQ8 oxidized the ethanol present in the medium and transformed it to AcetylCoA, which is the main substrate of the PHB pathway (Obruca et al, 2011). As it is shown in figure 4, also during these oxidative reactions, reduced coenzymes NAD(P)H are produced, stimulating the flux of acetyl-CoA towards the PHB biosynthetic pathway (Obruca et al, 2010c).

Statistics analysis Data were analyzed by ANOVA analysis of variance, using Fisher LSD test (P= 0.5), using the Statgraphics Plus 5.1 software.

Table 2. Composition of the culture medium inside the flasks.

Milk Whey Buffer Solution of trace Ethanol

Acetate

(ml)

(ml)

elements (Âľl)

(ml)

(g)

Control

189

21

210

0

0

Ethanol 1%

189

21

210

2.19

0

Ethanol 3%

189

21

210

6.57

0

Acetate 1%

189

21

210

0

3.076

Acetate 3%

189

21

210

0

9.23

Oxygen

54

6

60

0

0

Figure 3. Percentage of PHB accumulation in Bacillus megaterium TRQ8, growing under different compositions of culture media.

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Figure 4. Metabolic pathway of ethanol oxidation and PHB fermentation.

Reduced coenzymes suppress the TCA cycle, furthermore, it has been proven that the accumulation of reduced coenzymes during ethanol oxidation stimulates the activity of the 3ketothiolase and acetoacetyl-CoA reductase enzymes from the PHB pathway resulting in an overproduction of the polymer (Figure 4) (Oeding and Schlegen, 1973). Hence, less free CoA, which inhibits PHB biosynthesis, is formed as a result of TCA cycle inhibition and instead it is used to build acetyl-CoA (Obruca et al, 2010b). For this reason the concentration of NAD(P)H is considered to be the major regulatory factor determining the flux of acetyl-CoA to either TCA cycle or PHB Pathway (Obruca et al, 2010c).

However, the production of PHB diminished with 3% of ethanol in the culture medium, which suggests the toxic effect of high ethanol concentration for the strain, affecting its growth, viability, and metabolism, due to ethanol-induced leakage of the plasma membrane (Ingram, 1990).

Ethanol causes an increase in membrane fluidity and can alter its integrity because it interacts with membrane proteins, causing conformational changes and thereby influencing their function (Tรณth et al, 2014). For this reason, it is possible that a concentration of 3% of ethanol in the medium killed a large number of bacteria, and therefore caused a decrease in the synthesis of PHB. On the other hand, the culture media containing sodium acetate did not show higher production. It is known that a large number of bacteria use acetate for the synthesis of lipids and other compounds

(Guifang et al, 2002), therefore, there is a high probability that B. megaterium TRQ8 has used the sodium acetate available in the culture medium to produce lipids instead of PHB (Fei et al, 2016), since the percentage of accumulation at both concentrations were lower in comparison with the control (Figure 3).

The production of PHB was lower in the flask with a higher amount of oxygen because the carbon flux was bigger towards the Krebs cycle than the fermentation pathway (Nath et al, 2008). A limited amount of dissolved oxygen concentration increases the fluxes of acetyl CoA towards PHB. The shortage of oxygen prevents the electron transport chain to work due to the absence of an electron acceptor, consequently, an alternative pathway involving the production of an organic compound, in this case, PHB is promoted to regenerate the electron carrier NAD+ (Baron, 1996). Therefore, a limited dissolved amount of oxygen increases the flux of acetyl-CoA, the common precursor of both polyhydroxybutyrate and TCA pathways, towards PHB accumulation instead of TCA cycle (Nath et al, 2008).

Conclusions Bacillus megaterium TRQ8 is able to produce high quantities of PHB under exogenous stress conditions, such as a culture medium containing 1% of ethanol. Thus, it is possible to increase the yield of PHB synthesis by adding a volume of 1% of ethanol to the culture medium for this strain. The

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other media did not have the expected results due to various factors like alternative metabolic pathways or inhibition of the development and death of the microbial population. Also the amount of available oxygen is another important factor to take into account, since the PHB production is stimulated by oxygen limitation.

However the high cost of production is the main drawback of this kind of plastics and has prevented the PHB from being used in different items, thus the reduction of the manufacturing costs is the main aspect to be improved.

The application of an external stress, like ethanol, is a promising strategy to enhance the production of PHB from cheese whey using B. megaterium.

Nevertheless many other strategies can be applied in order to obtain better results. For instance, the utilization of a recombinant bacterium with better growth characteristics will require less time to produce the polymer. Moreover, the deletion of other metabolic pathways (fermentation) and the overexpression of the 3-ketothiolase enzyme can redirect the carbon flux towards the desired pathway and hence increase the yield of synthesis thereby reducing the costs of production to obtain similar values to those of synthetic polymers.

Acknowledgements We express our thanks to Guillermo A. Ocegueda Pintado and Marysol Ramírez Santacruz for their suggestions and support, which improved the experimental design.

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Contenido Volumen 13, Número 1 Consejo Editorial Prefacio

Evaluación de un sistema de recirculación para producción larvaria de Litopenaeus vannamei,

utilizando

la

macroalga

Gracilaria

vermiculophylla

como

organismo

biorremediador de efluentes / (Evaluation of a recirculation system for larval production of Litopenaeus

vannamei

using

the

macroalgae

Gracilaria

vermiculophylla

as

an

effluent

bioremediation organism) C.I. Leyva-Márquez F. Lares-Villa, L.R. Martínez-Córdova, J.C. IbarraGámez, R. Casillas-Hernández y A. Miranda-Baeza............................................................................... 1 Estimación de rendimiento de variedades nativas de maíz en el estado de Tlaxcala / (Yield estimation of native corn varieties in the State of Tlaxcala) A. Maria-Ramírez, V.H. VolkeHaller y M.L. Guevara-Romero........................................................................................................... 8 Identificación de regiones genómicas asociadas a respuesta a la vacunación contra el PRRS en cerdas reproductoras del sur de Sonora, México / (Identification of Genomic Regions Associated to PRRS Vaccination Response in Replacement Gilts from South of Sonora, Mexico) G. Luna-Nevárez. C.M. Aguilar-Trejo, R.I. Luna-Ramírez, R. Zamorano-Algandar, X. Zheng, M.E. Enns, S. Speidel, M.G. Thomas y P. Luna-Nevárez .............................................................................. 15 Production

of

polyhydroxybutyrate

from

milk

whey

fermentation

by

Bacillus

megaterium TRQ8 / (Producción de polihidroxibutirato a partir de la fermentación de suero de leche por Bacillus megaterium TRQ8) J. B. Ruiz Aguirre, L. Z. Oliver Gómez, S. de los Santos Villalobos y M. L. Sánchez ................................................................................................................. 24

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