Biología Molecular by itziar jimenez

BIOLOGÍA MOLECULAR

Itziar Jimenez Aberasturi Modulo: Biología molecular 24/02/2017

ÍNDICE Cronograma……………………………………………3 Manual de pipetas………………………………….....4 Técnicas de Biología Molecular Extracción de ADN de sangre………………….13 Electroforesis en agarosa……………………….17 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)…21 Mapa conceptual………………………………….…...24 Reflexión………………………………………………..25

CRONOGRAMA https://www.tomsplanner.es/?template=new#doc=HyULjydsQXbIOQBrbyoN

CALIBRACIÃ&#x201C;N DE PIPETAS

MANUAL DE USO: ●

●

Preparación Sostenga el instrumento en una posición casi vertical. Presione el émbolo suavemente hasta la posición más alta primero. Aspiración Sumerja unos milímetros la punta de la pipeta en el líquido. Suelte con suavidad el émbolo para que se mueva hacia arriba a la posición de reposo. Estabilización Espere un segundo, para que todo el líquido tenga tiempo de moverse hacia arriba en la punta (ver abajo cuadro con tiempos de estabilización por modelos). Dispensado Coloque la punta de la pipeta en ángulo contra la pared interior del recipiente receptor. Presione el émbolo suavemente hasta la primera posición. Purga Espere un segundo y luego presione el émbolo a la posición de la segunda parada. Este golpe elimina cualquier resto de la muestra de la punta de la pared lateral de deslizamiento hacia arriba por la pared. VIDEO: https://drive.google.com/open?id=0B8As1WLR_HHWeEo1Nm53YWhtTVE

BUENAS PRÁCTICAS ●

No pipetear volúmenes que sobrepasen la capacidad de la micropipeta.

●

Durante el uso y manejo las micropipetas deben permanecer en forma vertical.

●

Ubicar las pipetas en soportes adecuados o en el embalaje original sin puntas.

●

Mantener limpias las micropipetas.

●

Si sus micropipetas son autoclavables y son sometidas a este proceso, estas deberán ser verificadas antes de su uso.

●

Evite autoclavar las micropipetas si esta característica no se encuentra dentro de las especificaciones.

●

Una vez terminado el uso de la micropipeta debe limpiarse el área de acoplamiento con una servilleta para evitar contaminación.

MANTENIMIENTO Se deben realizar rutinas específicas de los diversos modelos, de acuerdo con las instrucciones de los manuales suministrados por los fabricantes. Inspección Frecuencia: Diaria Las pipetas son dispositivos que requieren inspecciones frecuentes para detectar desgastes anormales o daños y/o verificar que las mismas se encuentran en buenas condiciones de funcionamiento. La inspección debe cubrir los siguientes aspectos: 1. Verificar la integridad y ajuste de los mecanismos. Los mismos deben poder moverse de forma suave. El pistón debe desplazarse suavemente. 2. Confirmar que el portapuntas no presenta distorsiones o marcas de desgaste, dado que es esencial para la exactitud de las medidas. 3. Verificar el ajuste de las puntas.Colocar una punta y llenarla con agua destilada. La pipeta no debe presentar ningún tipo de fuga. Limpieza y descontaminación 1. Verificar cada día que la pipeta se encuentra limpia, en sus superficies interiores y exteriores. Si se detecta suciedad, la misma debe limpiarse utilizando un solvente adecuado o una solución jabonosa. Revisar las recomendaciones del fabricante relativas a la compatibilidad que tienen los materiales con que está fabricada la pipeta para seleccionar aquellos solventes que no produzcan efectos dañinos a la integridad de los componentes. 2. Esterilizar la pipeta siguiendo las indicaciones de los fabricantes. Algunas pipetas se pueden esterilizar en un autoclave, utilizando un ciclo de 121 °C y un tiempo estimado de 20 minutos; algunas requieren ser desensambladas para que el vapor esté en contacto con sus componentes internos. El desensamble consiste en liberar o desenroscar el cuerpo central de la pipeta, siguiendo los procedimientos indicados por los fabricantes. Para desensamblar o ensamblar algunas pipetas, se requiere utilizar un conjunto de herramientas –llaves– que normalmente proporcionan los fabricantes, junto con la pipeta en el momento de la venta. La pipeta solo debe ensamblarse de nuevo, cuando el ciclo de esterilización haya terminado y la temperatura se haya estabilizado con la del ambiente. En ese momento se verifica que los componentes se encuentren secos y se procede al ensamble. Algunos fabricantes recomiendan esterilizar la pipeta, utilizando una solución de isopropanol al 60 % y a continuación, lavar los componentes con agua destilada, secar y ensamblar. 3. Si una pipeta ha sido utilizada con sustancias peligrosas para la salud, es responsabilidad del usuario asegurar que está completamente descontaminada, antes de que la misma sea utilizada en otros procedimientos o sea retirada del laboratorio. Es conveniente diligenciar un reporte que indique su marca, modelo, número de serie, sustancias con las que trabajó y sustancias o procedimientos con las que fue tratada o limpiada.

Frecuencia: Semestral 1. Desensamblar la pipeta. Normalmente, se desensambla el cuerpo principal de la pipeta del sistema eyector de puntas, desenroscando el cuerpo de la pipeta del cilindro. 2. Limpiar los anillos en O, el émbolo y las paredes interiores del cilindro antes de lubricar. Si los componentes interiores fueron contaminados accidentalmente, todas las superficies deberán ser limpiadas con un detergente y luego con agua destilada. Si los anillos o sellos en O requieren ser cambiados, deberán ser sustituidos por repuestos de las mismas características de los originales. Debe tenerse en cuenta que este tipo de sellos varía dependiendo de la marca, tipo y modelo. 3. Lubricar el émbolo y el pistón con grasa siliconada especial para pipetas. La grasa mencionada ha sido especialmente desarrollada para ser utilizada en las pipetas. Utilizar siempre la recomendada por el fabricante. Retirar cualquier exceso de lubricante con un papel absorbente. 4. Ensamblar siguiendo un proceso inverso al utilizado para desensamblar.

VERIFICACIÓN DE CALIBRACIÓN Principio de calibración El procedimiento se basa en medir el volumen de una muestra de agua, a partir de la masa de agua que dispensa una pipeta de capacidad conocida. (Dividiendo la masa de agua dispensada por la densidad del agua). En la práctica se realiza un grupo de mediciones, a las que se aplican correcciones que compensen cualquier variación que las aparten de las condiciones estándar de temperatura y presión atmosférica y cualquier evaporación que resulte importante durante el tiempo que duren los ensayos.

Procedimiento Este procedimiento es válido para las pipetas que funcionan por desplazamiento de aire. 7

Pasos: 1. Instalar una punta nueva en la pipeta. 2. Succionar con la pipeta agua destilada del recipiente de almacenamiento y desecharla en el recipiente de desperdicio al menos 5 veces, para estabilizar la humedad del volumen de aire en el interior de la pipeta. 3. Añadir agua al recipiente que se utilizará para pesar, hasta que se obtenga una altura del líquido de al menos 3 mm. 4. Registrar la temperatura del agua, la presión ambiental y la humedad relativa. 5. Reemplazar la tapa del recipiente de pesado, si aplica. 6. Registrar el peso que presenta la balanza o efectuar la tara para que la lectura de la misma quede en cero (0). 7. Llenar la pipeta con agua del recipiente de almacenamiento y dispensarla en el recipiente de pesado. Expulsar la totalidad del agua. El trabajo se realiza de la misma forma que se utiliza la pipeta de forma cotidiana. 8. Registrar el nuevo peso detectado por la balanza. 9. Repetir los pasos 7 y 8 por nueve veces adicionales, registrando al final de cada ciclo el peso que registra la balanza. 10. Registrar la temperatura del líquido en el recipiente de pesado, al final del décimo ciclo y medir el tiempo transcurrido desde el inicio de las mediciones. 11. Evaluar si la evaporación ha sido significativa. Si así es, se debe permitir que transcurra un período de tiempo adicional [Ta], igual al utilizado durante las diez mediciones, y cuando se complete, efectuar una nueva lectura del peso que registra la balanza. 12. Dividir la masa de agua perdida por evaporación en el tiempo adicional [Ta] por el número total de muestras analizadas (diez). Esto dará un indicativo promedio de la masa de líquido pérdida, debido a evaporación por ciclo, cifra que debe añadirse a cada una de las lecturas de masa realizadas.

DEFINICIONES BÁSICAS: Desviación estándar [S]. Parámetro estadístico que se utiliza para determinar el error global de una muestra. Coeficiente de variación [CV]. Parámetro estadístico que representa la fracción de la desviación típica con respecto a la media.

Densidad. Relación que existe entre la masa de un cuerpo y el volumen que el mismo ocupa. La densidad promedio de un objeto es igual a su masa total dividida por su volumen total. Se identifica mediante la letra griega Ro [ρ]. En el Sistema Internacional de Unidades, la densidad se mide en kilogramos por metro cúbico [kg/m3]. Error (de una medida). Diferencia que se presenta entre el valor medido y el valor correcto. Exactitud. Concepto relacionado con los errores que presentan las medidas. Se dice que un instrumento es exacto cuando los valores de un grupo de mediciones se acercan bastante al valor real. Masa. Propiedad física de los cuerpos relacionada con la cantidad de materia que estos contienen. En física hay dos cantidades a las que se denomina masa. La masa gravitacional que es una medida de la forma en que un cuerpo interactúa con el campo gravitacional. Si la masa del cuerpo es pequeña, el cuerpo experimenta una fuerza menor que la que experimentará si su masa fuera mayor. Microgramo [μg]. Unidad de peso que equivale a 1 x 10-6 gramos (g).

Miligramo [mg]. Unidad de peso que equivale a 1 x 10-3 gramos (g). Mililitro [ml]. Unidad de capacidad que equivale a 1 x 10-3 litros (l). Un (1) ml de agua pesa exactamente 1 g y tiene un volumen de 1 cm. Precisión. Concepto relacionado con los errores que presentan las medidas. Se dice que un instrumento o método es preciso cuando en ensayos independientes, al repetir una medida, se obtienen resultados similares. Rango. Diferencia entre el máximo y el mínimo valor que lee o mide un instrumento. Volumen. Cantidad de espacio físico que ocupa la masa. Se calcula dividiendo la masa por la densidad promedio.

VIDEO: https://www.youtube.com/watch?v=2g5w3VtdGPg&t=15s

INVENTARIO Y CODIFICACIÓN DE PIPETAS

Excel https://drive.google.com/open?id=1ugFrQw-spgGEXVIeea4KPw0PDQDT-3rZCH-N4zGeo6I Documento de registro de actividades de mantenimiento Documento de verificación de Calibración 1. Documento para apuntar 2. Hoja calculo https://drive.google.com/open?id=1EggKBgkLVWkRwl_IUqyi2rrtXXPJNAdlrTnObVa2nhk

TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

EXTRACCIÓN DE ADN DE SANGRE FUNDAMENTO: Existen diversos métodos para obtener ADN a partir de células humanas. Varios de ellos son muy sencillos y normalmente se usa para recuperar ADN de restos biológicos mínimos (manchas de sangre o muestras criminalísticas). Otros, en cambio, son más elaborados y permiten la obtención de cantidades grandes de ácido nucleico, con un alto grado de pureza, a partir de tejidos abundantes en células, cultivos celulares, etc. PROTOCOLO BÁSICO: ● ● ●

Lisis celular y posterior lisis nuclear. Separación del ADN del contenido celular: protección frente a nucleasas. Purificación del ADN. PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN:

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Partir de 2 ml de sangre periférica en EDTA Añadir 10 ml de Tampón de lisis. Mezclar por inversión. Dejar en la nevera(4ºC) durante 30 minutos. Centrifugar 15 minutos a 2500 rpm. Eliminar el sobrenadante con pipeta pasteur o mediante decantación. Añadir al precipitado NaCl 0,9% hasta 4 ml. Disolver completamente el precipitado. Centrifugar 15 minutos rpm. Eliminar el sobrenadante con pipeta pasteur o mediante decantación. Añadir al precipitado 500 ul de Tampón de lisis, 25 ul de SDS 20% y 2,5 μl de Proteinasa K. Agitar con Vórtex (opcional). 10. Incubar a temperatura ambiente toda la noche. 11. Añadir 160 ul de NaCl saturado. Dar un pulso con vortex. 12. Añadir 2 volúmenes de etanol absoluto frío. Mezclar por inversión muy elegante observando la formación del ovillo de ADN precipitado. 13. Capturar la madeja de ADN con una varilla. 14. Lavar la madeja en un microtubo con 1 ml de etanol 70% 15. Dejar secar el ADN en la varilla durante 30 minutos, apoyado la varilla sobre una gradilla. Pasar la varilla a un microtubo vacío. 16. Resuspender en 300μl agua destilada estéril. Con este procedimiento se obtiene una concentración de ADN promedio de 100- 200 ng/μl.

MATERIAL: ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●

Muestra de sangre Tampón de lisis NaCl 0,9% SDS 20% Proteinasa K 20mg/ml NaCl saturado (6M) Etanol absoluto Etanol 70% 2 microtubos 1 Tubo de fondo cónico 15ml 1 Varilla para capturar la madeja de ADN 2 Pipetas pasteur de 3 ml RESULTADOS:

AUTOEVALUACIÓN: 1. Enumera y ordena en función de la cantidad de células presentes, los distintos tipos de muestras humanas a partir de las cuales se puede hacer una extracción de ADN ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●

Hisopos bucales Sangre líquida Cabello de raíces Cera de oído Semen Uñas Tejidos Cordón umbilical Dientes Huesos

2. ¿Qué cantidad de ADN comparten una célula epitelial, un hepatocito y una neurona? No solo una célula hepática, una célula epitelial y una neurona de un mismo individuo tienen el mismo ADN, sino que todas las células del cuerpo lo poseen, ya sea, cardiomiocitos, células gliales, etc.(a excepción del eritrocito maduro que no tiene ADN). Sin embargo, a pesar de poseer el mismo ADN, la célula hepática, la célula epitelial y la neurona van a sintetizar diferentes proteínas, lo que va a provocar que tengan su función específica. 3. ¿A partir de qué células sanguíneas se puede aislar ADN? De leucocitos, pero no en los glóbulos rojos, porque estos carecen de núcleo. 4. ¿En qué parte de la célula está el ADN? Núcleo, mitocondria y cloroplastos son los tres lugares donde se puede encontrar ADN en la célula. 5. En función de la muestra biológica de partida empleada, aproximadamente ¿a partir de cuántos núcleos celulares hemos extraído ADN en esta práctica? En función de cuantos leucocitos tenga en la sangre el individuo. 6. ¿Por qué precipita el ADN en el paso 12? El ADN precipita en etanol porque esta forma una capa visible de lisado e inmediatamente se comienzan a formar burbujas alrededor de las hebras de ADN cosa que en el agua no ocurre. 7. ¿Se podría lavar el ADN en el paso 14 con Etanol al 40%? 15

No. Porque necesitamos lisar más las células, por eso se incrementa el número de alcohol. 8. ¿Cuál es la finalidad de lavar el ADN con etanol 70%? Lisar las células lo máximo posible. 9. ¿Por qué es importante que el Etanol se evapore bien en el paso 15? Para obtener una concentración pura del ADN.

ELECTROFORESIS EN AGAROSA FUNDAMENTO: Los ácidos nucleicos tienen carga negativa, por lo que cuando se someten a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo. Esta migración (electroforesis) se suele llevar a cabo en el interior de un gel (agarosa o poliacrilamida), de manera que los fragmentos de menor tamaño se desplazan con mayor facilidad por la trama del gel que los más largos. Tras la electroforesis, aparecen varias bandas que corresponden a los fragmentos de distinto tamaño. Para visualizar el ADN, el gel se debe teñir con marcadores que tienen una gran afinidad por los ácidos nucleicos y además, bajo la luz ultravioleta, emite fluorescencia cuando se hallan unidos a ADN o ARN; por este motivo, son utilizados para la detección de dichas sustancias en la trama del gel.

PROTOCOLO DE LA ELECTROFORESIS EN AGAROSA

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Preparación del gel de agarosa. Preparar la bandeja con el peine. Pesar la agarosa directamente en el vaso de precipitados. Añadir el TBE 1x. Hervir en horno microondas hasta la disolución total de la agarosa, agitando el vaso con la mano de vez en cuando. Mantener en agitación hasta alcanzar los 65ºC aproximadamente. Añadir 5 ul de Midori Green a la agarosa líquida. Mover para distribuir uniformemente. Servir en la bandeja con el peine colocado. Dejar polimerizar a temperatura ambiente, hasta que la agarosa deje de estar transparente. Quitar el peine levantándolo verticalmente del gel y evitando moverlo hacia los lados para no romper los pocillos. REALIZACIÓN DE LA ELECTROFORESIS

1. Preparar el tampón de electroforesis. 2. Mezclar la muestra de ADN con el tampón de carga y agua para aumentar el volumen de la muestra a cargar. 3. Introducir gel y tampón de electroforesis en la cubeta e insertar las muestras de ADN en los pocillos, anotando el orden de colocación en el gel, con precaución de no dañar el pocillo. 4. Conectar la cubeta a la fuente y poner voltaje constante (100 - 120 V) hasta que el frente de la electroforesis haya recorrido las tres cuartas partes del gel. 5. Desconectar la fuente. VISUALIZACIÓN DE RESULTADOS: 1. Una vez detenida la electroforesis, sacar el gel de la cubeta con cuidado para que no se rompa y, sin la bandeja, colocarlo sobre un transiluminador UV. 2. Analizar el resultado obtenido mediante la visualización del gen, con precaución de proteger cara y ojos de la luz UV, con una pantalla de metacrilato. MATERIAL ● ● ● ● ● ●

Muestras de ADN para cargar en el gel Agarosa Tampón TBE 10x. Se debe diluir hasta tener TBE 1x, del que se necesitan 50 ml para preparar el gel y 250ml para sumergirlo en la cubeta. Midori Green (agente intercalante) Marcador de peso molecular Tampón de carga (5μl para cada muestra)

● Microtubos de 0,6 ml

AUTOEVALUACIÓN: 18

1. Explicar brevemente en qué se basa la electroforesis de ácidos nucléicos. Técnica utilizada para separar moléculas tales como proteínas o ácidos nucléicos a través una matriz sólida (gel de agarosa o poliacrilamida) de acuerdo a su tamaño y carga eléctrica mediante la aplicación de un campo eléctrico. Se aplica una corriente eléctrica a un medio electrolítico que contiene moléculas cargadas y provoca que se desplacen hacia el polo contrario. 2. ¿Que función tiene el tampón de carga? Las muestras se preparan con un tampón de carga que contiene glicerol para darles densidad y de esta forma se mantienen en el pocillo sin salirse, también da color

3. ¿Por qué aparecen bandas con distinta intensidad? Depende del peso molecular es decir las moléculas de ADN que son más grandes, generalmente migran más retardadamente que las moléculas de menor peso. Depende también de la purificación de la muestra de ADN. 4. ¿Por qué no se hace la electroforesis en agua en vez de en tampón TBE? El tampón sirve como conductor de la electricidad y controla el pH, lo cual es importante para la estabilidad de las moléculas. 5. Interpretar los resultados obtenidos al analizar el ADN Genómico y/o el producto de PCR y la restricción enzimática mediante electroforesis en agarosa. Para interpretar la imagen del gel de agarosa con DNA, lo primero es entender cualitativamente cómo las bandas que se ven en el gel se relacionan con los fragmentos de DNA. LA imagen también indica la ubicación de los sitios de corte mediante la restricción enzimática determina el tamaño de los fragmentos producidos. Las moléculas de DNA grandes viajan despacio a través del gel, mientras que las moléculas pequeñas viajan más aprisa.

6. ¿Por qué la electroforesis en agarosa es sumergida? Porque el contacto de la muestra con el TBE en fase líquida hace que la muestra migrar desde un extremo del gel hacia el opuesto. .ES decir El DNA, atraído por la carga positiva del electrodo, avanza a través del gel hacia el otro extremo. Sumergida también evita que el gel se seque durante el experimento.

PCR - REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA FUNDAMENTO:

● ● ●

La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN: el ADN bicatenario se desarrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a enrollar. Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de: Desnaturalización de ADN por someterlo a temperatura elevada, a fin de convertir el ADN bicatenario en ADN monocatenario. Unión (amarillento) de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores, al ADN diana. Extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos a partir de los cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones Mg 2+. Los oligonucleótidos (cebadores / primers) consisten normalmente en secuencias relativas cortas, que son diferentes entre sí y complementarias de los sitios de reconocimiento que flaquean el segmento de ADN diana que debe amplificarse. Las fases de desnaturalización del ADN molde, anillamiento del cebador y extensión del cebador y extensión del cebador constituyen un “ciclo” del método de amplificación por PCR. MATERIAL:

● ● ● ● ● ● ●

Muestra de ADN Enzima Taq polimerasa Tampón de actividad 5x Cebadores o Primers: Forward y Reverse Microtubo de 0,2 ml Gradilla Guantes PROTOCOLO DE LA PCR

1. Mezclar en un tubo eppendorf de 0,2ml los siguientes reactivos, para un volumen total de 25 ul. Mezclar siempre por pipeteo (no emplear el vortex). 2. Efectuar la PCR en el termociclador con el siguiente programa: (foto) 3. Comprobar el resultado de la reacción mediante una electroforesis en agarosa y explicar los patrones de bandas obtenidos.

AUTOEVALUACIÓN: 1. ¿Qué particularidad tiene el ADN polimerasa para que pueda emplearse en este procedimiento? Se trata de una polimerasa que es termoestable y la polimerasa taq tiene la característica de ser una extremoenzima capaz de soportar temperaturas altas a las que serán sometidas en el proceso de PCR sin desnaturalizarse. 2. ¿Cuál es el factor limitante del proceso? Factor limitante son la cantidad de los cebadores que hay disponibles y la actividad de la polimerasa taq. 3. ¿Que sucede en cada etapa de un ciclo de temperaturas: desnaturalización, anillamiento, elongación? Desnaturalización: Para que pueda iniciarse la reacción es preciso que las moléculas de ADN molde se encuentren en forma de cadena simple. Esto se consigue calentando a temperatura de 90 a 95ºC para que produzca la rotura de los enlaces puente de hidrógeno intercatenarios y la separación de ambas cadenas, para asegurar la completa separación de la doble cadena del ADN esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN sólo se desnaturaliza parcialmente éste tenderá a renaturalizarse muy rápidamente dificultando con esto el proceso de hibridación. Anillamiento: Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la temperatura de la reacción hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se pueda producir la hibridación específica de los cebadores a las secuencias flanqueantes del fragmento que se desea amplificar, la temperatura a la que se realiza esta etapa debe establecerse para cada reacción en función de la longitud de los cebadores y su secuencia (Temperaturas inferiores a la óptima nos producirán hibridaciones inespecíficas de los cebadores y temperaturas superiores nos dificultará la eficiencia de la misma. Elongación: Durante esta etapa la ADN polimerasa termorresistente incorpora nucleótidos en el extremo 3´ del cebador utilizado como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se realiza esta etapa de la reacción suele ser de 72ºC ya que es la temperatura a la que la “Taq polimerasa” alcanza su máxima actividad.Al finalizar cada uno de los ciclos el número de copias obtenidas se duplica y después de 20 ciclos ya tenemos aproximadamente 1 millón de copias de cada una de las moléculas molde iniciales ADN. 4. ¿Cómo podemos asegurar que estamos amplificando el gen que necesitamos analizar? Porque nosotros sabemos cuál es el fragmento que hemos utilizado o cogido y a la hora de hacer la electroforesis hay un marcador que te va a indicar el número de pares de bases que tienen ese gen y ese número de pares de bases tiene que corresponder con la parte del gen que hemos extraído. 22

5. Enumera los motivos por los que no se produciría amplificación por PCR. ¿Qué ocurre si hay una mutación en la secuencia complementaria de unión de los cebadores? Al haber una mutación en la secuencia complementaria ésta no comenzará el proceso de anillamiento y por lo tanto, tampoco dará lugar al proceso de elongación. Por esta razón si hay una mutación en la secuencia complementaria de unión de los cebadores no se podrá realizar la PCR. 1- No dará paso al proceso de anillamiento. 2- Si no hay anillamiento no hay elongación. 3- No se producirá la PCR por ese motivo.

MAPA CONCEPTUAL http://prezi.com/m62ypz3a1elp/?utm_campaign=share&utm_medium=copy

REFLEXIÓN Después de finalizar estos trabajos y este curso me he dado cuenta que he aprendido bastantes cosas acerca de las técnicas de biología molecular. Concretamente sobre la PCR, sus usos y cómo se realizan. También para qué casos podemos usarla. Con el mapa conceptual llegue a afianzar mejor los conceptos, porque tenía más técnicas con la que compara la PCR y ver qué tienen en común entre ellas (clonación, hibridación y secuenciación). Por otro lado, me hubiera gustado poder hacer alguna práctica más o realizar algún ejercicio de cara a cada técnica, focalizarnos en cada técnica un poco más (clonación, PCR …) En conclusión, puedo decir que la PCR es una técnica muy importante y muy utilizada, al igual que las micropipetas que emplean una función imprescindible en un laboratorio. Ambos los hemos tratado bastante, pues he aprendido a calibrar las micropipetas y a realizar una PCR, por lo tanto, esa parte práctica ya la tengo aprendida.