UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MACHALA. “Calidad, Pertinencia y Calidez” UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICAS Y DE LA SALUD. CARRERA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA. TOXICOLOGÍA. DIARIO DE CAMPO N°1 FECHA: Martes 10 de Noviembre del 2015. NOMBRE: Oswaldo Silva Oyola. CURSO: 5to Bioq. Farm. “B” TEMA: TÓXICOS ORGÁNICOS FIJOS. La investigación toxicológica es el conjunto de procesos analíticos que tienen por objeto el aislamiento, identificación y determinación cuantitativa de los tóxicos, tanto en el vivo como en el cadáver, con el fin de permitir el diagnóstico de la intoxicación los tóxicos orgánicos fijos son aquellos compuestos orgánicos que no pueden ser aislados por destilación. ACIDA
ALCALINA.
MARIHUANA
COCAINA
BARBITURICOS.
ESTRICNINA
CARBAMATOS.
BENZOS
ORGANO CLORADOS.
ARSENICO, PLOMO, MERCURIO, CADMIO.
PESTICIDAS – PLAGUICIDAS.
CAUSTICOS Y CORROSIVOS.
Pesticidas – Plaguicidas: Como DDT, pueden ser biologicas, sintesis quimica y productos naturales como: ( aji-oregano frences). Las plagas son causantes de matar, repeler,y destruyen las plantas. Las drogas de abuso, los plaguicidas y una gran cantidad de sustancias utilizadas en síntesis química y en industria alimentaria. De las intoxicaciones con fármacos, las que involucran a los psicofármacos son las más frecuentes, aunque también son frecuentes las intoxicaciones con aspirina o con paracetamol.
Los tóxicos orgánicos fijos.- En consonancia con el desarrollo industrial y técnico crece el número de estas sustancias químicas. Incluye este grupo los derivados de la destilación del petróleo y muchos hidrocarburos saturados, no saturados y aromáticos entre otros.De todos ellos hay que destacar los que se describen seguidamente: Benzol/ Benceno (liquido incoloro) Empleado en calzado, goma, colorantes, barnices, tintorerías, etc. Produce una anemia importante al inhibir la formación de los hematíes por parte de la médula; pueden transcurrir varios años entre la intoxicación y la aparición de la anemia aplásica. Alcohol metílico (liquido transparente) Es el metanol o alcohol de madera; se emplea como disolvente de resinas, plásticos, grasas y colorantes, y fraudulentamente en la preparación de licores. Su toxicidad es grande, actuando sobre el sistema nerviosoexcitación y depresión- y sobre la retina, hasta la producción de una ceguera total. Tetracloruro de carbono (liquido transparente) Buen disolvente empleado en productos de limpieza, extintores de fuego, insecticidas, industria textil, etc. La intoxicación aguda, más frecuente, cursa con cefalalgia, tos, hipotensión y coma; la necrosis de hígado conduce rápidamente a la muerte. Sulfuro de carbono (solido amarillento) También es buen disolvente y se emplea en la fabricación de fibras textiles artificiales, como la viscosa y el rayón. Los trastornos que origina- son nerviosos: polineuritis, ataxia, pérdida de visión por neuritis óptica, etc. BARBITÚRICOS (DERIVADOS DEL ÁCIDO BARBITÚRICO) Muy empleados con fines criminales, deprimen la actividad del tronco y corteza cerebral hasta la parálisis respiratoria y circulatoria. El intoxicado llega a un estado de coma profundo, con ausencia de reflejos y colapso circulatorio. MORFINA (LIQUIDO/SOLIDO) Es uno de los 20 alcaloides del opio con más alta concentración y mayor capacidad tóxica; sus efectos nocivos no se distinguen de los causados por el opio. Estimula en primer lugar los centros cerebrales -euforia-, sigue después una sedación y analgesia; si la dosis es alta se afectan bulbo y centros cerebrales con sopor, coma, miosis o estrechamiento pupilar, arritmias respiratorias, colapso y parálisis respiratoria y circulatoria.
PESTICIDAS pueden ser de origen de síntesis química, biológica o productos naturales, destinadas a matar, repeler, atraer, regular o interrumpir el crecimiento de seres vivos considerados plagas.. Comprende este grupo las sustancias utilizadas para hacer frente a las plagas que pueden afectar a los seres vivos y a las plantas;los insecticidas (v.), fungicidas (v.), raticidas y herbicida s (v.). La intoxicación suele ser consecuencia de errores cometidos en su fabricación y envasado, o de imprudencia por parte de las personas que los manejan. ALCALOIDES Se llaman alcaloides a aquellos metabolitos secundarios de las plantas sintetizados, generalmente, a partir de aminoácidos, que tienen en común su hidrosolubilidad a pH ácido y su solubilidad en solventes orgánicos a pH alcalino. Los alcaloides verdaderos derivan de un aminoácido, son por lo tanto nitrogenados. Todos los que presentan el grupo funcional amina o imina son básicos. La mayoría de los alcaloides poseen acción fisiológica intensa en los animales incluso a bajas dosis con efectos psicoactivos, por lo que son muy usados en medicina para tratar problemas de la mente y calmar el dolor. ANFETAMINAS Las anfetaminas son un tipo de droga estimulante del sistema nervioso central. Se presenta en forma de pastillas o cápsulas de diferente forma y color; produce sensaciones de alerta, confianza, aumenta los niveles de energía y autoestima. Hace desaparecer las sensación de hambre y de sueño. Las anfetaminas son drogas adictivas, capaces de generar dependencia. MARIHUANA Esta droga es un alucinógeno; una sustancia que distorsiona la manera en que la mente percibe el mundo en el que vives.El ingrediente químico del cannabis que crea esta distorsión es conocido como “THC”. La cantidad de THC encontrado en cualquier volumen de marihuana puede variar sustancialmente,
CARBAMATOS Los Carbamatos son compuestos orgánicos derivados del ácido carbámico. Tanto los carbamatos, como los ésteres de carbamato, y los ácidos carbámicos son grupos funcionales se encuentran estructuralmente y pueden ser interconvertidos químicamente.
ORGANOCLORADOS. Un compuesto organoclorado, hidrocarburo clorado, clorocarbono o compuesto orgánico clorado es un compuesto químico orgánico, es decir, compuesto por un esqueleto de átomos de carbono, en el cual, algunos de los átomos de hidrógeno unidos al carbono, han sido reemplazados por átomos de cloro. PLAGUICIDAS Un plaguicida es una combinación de sustancias que se emplea para ahuyentar o eliminar las plagas.
COCAINA. La cocaína es un polvo blanco. Se puede inhalar por la nariz o mezclarse con agua e inyectarse con una aguja. La cocaína también se puede convertir en pequeñas rocas blancas, llamada crack. El crack se fuma en una pipa de vidrio pequeña.La cocaína acelera todo su cuerpo. Usted puede sentirse lleno de energía, feliz y emocionado. Pero luego su estado de ánimo puede cambiar. ESTRICNINA La estricnina es un alcaloide obtenido de la semilla del árbol Strychnos nux-vómica y de otros vegetales del mismo género. Utilizada originalmente como estimulante nervioso, La estricnina es de uso oral. Su absorción es rápida, por lo que el período de latencia de la intoxicación es breve : 30-45 minutos en la mayoría de los casos, pudiendo extenderse hasta 2 horas según la dosis ingerida y el estado de repleción gástrica. BENZOS. Las benzodiazepinas son medicamentos psicotrópicos actúan sobre el sistema nervioso central, con efectos sedantes, hipnóticos, ansiolíticos, anticonvulsivos, amnésicos y miorrelajantes. Por ello las benzodiazepinas en medicina para la terapia de la ansiedad, insomnio y otros estados afectivos, así como las epilepsias, abstinencia alcohólica y espasmos musculares. También se usan procedimientos invasivos como la endoscopia o dentales cuando el paciente presenta ansiedad o para inducir sedación y anestesia.
La mayoría de las veces, la investigación de la presencia de estos compuestos en casos de sospecha de intoxicación, requiere de la aplicación de dos tipos de métodos: A) MÉTODOS DE AISLAMIENTO QUE SEPARAN AL COMPUESTO DEL RESTO DE LOS COMPONENTES DE LA MUESTRA.
Sistema de extracción en fase sólida
Pasos de la extracción en fase sólida
B) MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN)
(Y,
IDENTIFICACIÓN
Cromatografía en capa delgada
EN
ALGUNOS
CASOS,
DE
Barrido espectral de algunas benzodiacepinas
DESDE EL PUNTO DE VISTA ANALÍTICO LOS TÓXICOS SE DIVIDEN EN:
Tóxicos volátiles. Tóxicos gaseosos. Tóxicos orgánicos fijos o extraíbles. Tóxicos inorgánicos o minerales.
ANALÍTICA DE LOS TÓXICOS ORGÁNICOS NO VOLÁTILES O TÓXICOS ORGÁNICOS FIJOS. Bajo la denominación de Tóxicos Orgánicos Fijos (TOF) o no volátiles se incluye una gran variedad de sustancias orgánicas, de interés toxicológico, que no pueden aislarse por destilación de las matrices que los contienen, sino que debe recurrirse a la acción de disolventes orgánicos (en medio ácido o alcalino) para su separación y posterior identificación.
La mayoría de estos tóxicos sufren profundos cambios metabólicos en el organismo y, en consecuencia, pueden aparecer en los fluidos o tejidos en su forma original o como productos de biotransformación (metabolitos), libres o conjugados con diferentes compuestos (ácido glucurónico, sulfatos, aminoácidos, etc.). MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE TÓXICOS ORGÁNICOS FIJOS. Clasificación de tóxicos orgánicos en: 1. Ácidos: débiles (por ejemplo barbitúricos) o fuertes (por ejemplo salicilatos), unos y otros extraíbles con disolventes orgánicos en medio ácido. 2. Básicos: extraíbles con disolventes orgánicos en medio básico (alcaloides, antidepresivos tricíclicos, etc.) 3. Neutros: extraíbles con disolventes orgánicos en medio ácido o básico Fármacos: Anfetaminas, Benzodiacepinas, Barbitúricos, Carbamacepinas, Fenotiazinas, Butirofenonas, Antidepresivos tricíclicos, Cumarinas, Meprobamato, Salicilatos, Glutetimida, Hidantoína y sus metabolitos. -
Drogas de abuso en muestras biológicas: Opioides, Cannabinoides, Cocaína; todos ellos con sus respectivos metabolitos
-
Plaguicidas: Carbámicos, Organofosforados, Organoclorados y Piretroides.
-
Otros: Estricnina, alcaloides y sus metabolitos
LAS TÉCNICAS SON:
Método de electrodiálisis: se basa en la propiedad que tiene la corriente eléctrica de descomponer las sales de los tóxicos orgánicos, yendo la base hacia el polo negativo y el resto al polo positivo.
Columnas con rellenos de resinas: las drogas orgánicas son absorbidas por la resina y luego son diluidos con solventes apropiados
Cromatografia de gases: La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte.
La espectrometría de masas (ES). Es una técnica de análisis que permite la medición de moléculas. El espectrómetro de masas es un artefacto que permite analizar con gran precisión la composición de diferentes elementos químicos e isótopos atómicos, separando los núcleos atómicos en función de su relación carga-masa (z/m) identifica los diferentes elementos químicos que forman un compuesto, o para determinar el contenido isotópico de diferentes elementos en un mismo compuesto.
Destilacion por arrastre de vapor. En la destilación por arrastre de vapor de agua se lleva a cabo la vaporización selectiva del componente volátil de una mezcla formada por éste y otros "no volátiles". Lo anterior se logra por medio de la inyección de vapor de agua directamente en el interior de la mezcla, denominándose este "vapor de arrastre", pero en realidad su función no es la de "arrastrar" el componente volátil, sino condensarse en el matraz formando otra fase inmiscible que cederá su calor latente a la mezcla a destilar para lograr suevaporación. En este caso se tendrán la presencia de dos fases insolubles a lo largo de la destilación (orgánica y acuosa), por lo tanto, cada líquido se comportará como si el otro no estuviera presente. Es decir, cada uno de ellos ejercerá su propia presión de vapor y corresponderá a la de un líquido puro a una temperatura de referencia.
La Cromatografía líquida, Es una técnica de separación y no debe confundirse con una técnica cuantitativa o cualitativa de análisis. Es una de las técnicas analíticas ampliamente utilizadas, la cual permite separar físicamente los distintos componentes de una solución por la adsorción selectiva de los constituyentes de una mezcla.
METODOS DE EXTRACCION DE TOXICOS ORGANICOS FIJOS
El analista toxicólogo ha experimentado un crecimiento paulatino en el número de técnicas a su disposición. En la actualidad la clásica metodología convencional ha sido reemplazada por la introducción de métodos instrumentales más sofisticados, de gran sensibilidad y precisión pero cuyo costo elevado limita su disponibilidad en la mayoría de los laboratorios de nuestro medio. Los TOF tienen en común el uso de metodologías similares para su aislamiento, caracterización y cuantificación. Por lo tanto, se describirá someramente el fundamento delos equipos empleados en su investigación de acuerdo con el siguiente esquema:
A) INMUNOENSAYOS: Existen en el comercio numerosos tipos de inmunoensayos con aplicaciones en Toxicología. En su mayoría están diseñados para el análisis de muestras líquidas, como orina, agua y suero debido a que estas matrices presentan poca cantidad de interferencias. Estas muestras se emplean en forma directa, evitando por lo tanto el paso previo de extracción aislamiento de los analitos y logrando una reducción importantísima en el tiempo de obtención de los resultados (10 minutos – 1 hora). Los inmunoensayos se basan en la reacción específica que se produce cuando un antígeno se enfrenta con un anticuerpo. La técnica tradicional consiste en mezclar un volumen de muestra conteniendo la droga a ensayar, con una cantidad fija de un anticuerpo específico (monoclonal o policlonal), y una cantidad fija de la misma droga marcada sintéticamente común radioisótopo, una enzima activa o una sustancia fluorescente, por ejemplo. De este modo se establece una competencia entre la droga marcada (Droga*) y la presente en la muestra (Droga) por los sitios de unión del anticuerpo. En forma simple se esquematiza esta competencia: Droga* + Droga + Anticuerpo
Droga*-Anticuerpo + Droga –Anticuerpo
La probabilidad de que una molécula marcada o sin marcar se una al anticuerpo depende de su concentración. Se requieren instrumentos capaces de evaluar el punto final de la reacción y comparar la respuesta del test contra estándares conocidos. De acuerdo al tipo de marca es el método analítico de medida empleado. En algunos casos no puede diferenciarse la señal producida por la droga marcada unida al anticuerpo y la droga macada libre, siendo necesario separarlas antes de efectuar la medida. Estos ensayos se conocen como heterogéneos, e involucran principalmente a los radioinmunoensayos. Cuando esta separación no es necesaria, porque la señal producida por la droga marcada se diferencia si está libre o unida, el ensayo se llama homogéneo. Esta diferencia ocurre porque la señal es suprimida, alterada o producida en la unión con el anticuerpo. Los inmunoensayos ópticos (donde la señal medida es un cambio óptico, como absorbancia UV, fluorescencia o luminiscencia) pertenecen a este tipo. Pero esta ventaja se logra a costa de una menor sensibilidad debido a que la señal óptica es medida en presencia del fluido biológico original. Para aumentar la sensibilidad se crearon inmunoensayos ópticos heterogéneos. Es importante definir dos parámetros para los ensayos inmunológicos: la sensibilidad y el límite de detección.
La sensibilidad del ensayo es el cambio en la respuesta por cada cambio en la cantidad de reactante. En un gráfico de dosis respuesta, la sensibilidad es la pendiente dela curva en un punto determinado; debido a que muchas veces las curvas dosis-respuesta son sigmoideas, la sensibilidad no es constante. El límite de detección se define como la mínima cantidad de inmunorreactante que puede detectar el sistema. Un elemento esencial es establecer el valor de discriminación entre una muestra positiva y una muestra negativa. Este valor se denomina valor de corte o “cut-off”. En los inmunoensayos, los sueros negativos muestran un comportamiento que se asemeja a una distribución normal, pero presentan un sesgo positivo o tendencia a producir valores de absorbancia o títulos más altos que los esperados si siguieran una distribución normal.
Otro aspecto es la confiabilidad de un resultado, ya sea positivo o negativo. Para muestras positivas se define la sensibilidad como la habilidad de un ensayo de mostrar como positiva a una muestra que realmente es positiva (este término no debe confundirse con la “sensibilidad del ensayo “definida anteriormente). La especificidad es la habilidad del ensayo de mostrar como negativa a una muestra que realmente es negativa. En términos matemáticos se pueden escribir como:
B) TÉCNICAS CROMATOGRAFICAS La búsqueda de TOF mediante técnicas cromatográficas, como TLC (Thin Layer Chromatography), HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography), HPLC (HighPressure Liquid Chromatography), GC (Gas Chromatography), etc. se caracteriza porque antes de aplicarlas es necesario separar las drogas de la matriz en la que se encuentran inmersas mediante alguna técnica de extracción. En la práctica esto se logra siguiendo una serie de pasos, como los que se describen a continuación. 1- Preparación de la muestra: es un paso crucial en los análisis. Involucra la homogenización de la muestra, ajustes de pH, pesaje, procedimientos de hidrólisis
(ácida, básica o enzimática), precipitación, centrifugación, etc. de modo tal que se facilite el aislamiento de la sustancia de interés. 2- Aislamiento del analito: se puede llevar a cabo mediante extracción líquidolíquido (en tubos, en ampollas de decantación o en columnas de tierra de diatomeas) o extracción en fase sólida (columnas de SPE) de acuerdo a las disponibilidades del laboratorio. En este paso se mueve el analito de su matriz original para obtenerlo en la mayor concentración posible, estabilizarlo (ya que en su matriz original puede degradarse química o enzimáticamente) y eliminar interferencias. 3- Concentración del extracto: el objetivo de este paso es colocar el analito en el menor volumen posible para aumentar la sensibilidad del análisis. Se deben usar condiciones controladas, idealmente una temperatura menor de 40ºC y corriente de nitrógeno. Durante las operaciones antes mencionadas se debe tener sumo cuidado para evitar pérdidas por volatilización, oxidación o absorción en los precipitados, ya que frecuentemente los productos a identificar están presentes en cantidades menores del g/ ml. Las pérdidas por volatilización de sustancias básicas como anfetaminas puede prevenirse cuidando la temperatura y salificando el extracto con ácido clorhídrico al 1 % en metanol. 4- Identificación del analito: existen diferentes niveles de complejidad dependiendo de las técnicas que se utilicen para su identificación. Así existe un nivel primario que utiliza técnicas como Cromatografía en Capa Delgada (TLC), Espectrofotometría UV, además de reacciones de coloración para la orientación, etc. Un nivel secundario involucra técnicas tales como la Cromatografía de Gases (GC) y la Líquida de Alta Resolución (HPLC) tanto para Screening como para la determinación de una droga en particular y un nivel terciario que utiliza la Espectrometría de Masas acoplada a un a Cromatografía separativa como la de Gases o Líquida de Alta Resolución (GC/MS o HPLC/MS). 5- Cuantificación del analito: una vez identificado el analito la cuantificación del mismo se puede realizar por una técnica directa, bien ajustada y utilizando patrones de referencia puros para análisis. Esta técnica directa generalmente es una técnica cromatográfica gas-líquido o líquido-líquido y la espectrometría acoplada a estas dos anteriores. Cada uno de estos pasos merece un capítulo aparte dentro de la Toxicología. Por ende sólo se pretende citar sus características principales haciendo hincapié en los detalles técnicos más relevantes. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA:
Guía de Trabajos Prácticos de Toxicología y Química Legal. Facultad de Ciencias Exactas. Universidad Nacional de La Plata. 2002 L. LÓPEZ GÓMEZ y J. A. GISBERT CALABUIG, Tratado de Medicina legal, III, Valencia 1967. http://pendientedemigracion.ucm.es/info/medlegal/2%20Grado/Medicina/M edLegal_Toxi/Hosp_12_octubre/clases/06toxicologia.pdf