Unidad 1. Biología molecular de ácidos nucleicos by Jazina Ruiz Hernández

Programa de la asignatura:

Biología molecular II

Biología molecular de ácidos nucleicos

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Índice

Presentación de la unidad ......................................................................................................... 2 Propósitos.................................................................................................................................. 3 Competencia específica ............................................................................................................ 3 1.1. Obtención de ácidos nucleicos........................................................................................... 4 1.1.1. Extracción de ácidos nucleicos ....................................................................................... 5 1.1.2. Purificación de ácidos nucleicos ..................................................................................... 9 1.2. Reacción en cadena de la polimerasa ............................................................................. 11 1.2.1. Amplificación de ácidos nucleicos mediante PCR ........................................................ 11 1.2.2. PCR en tiempo real ....................................................................................................... 19 1.3. Análisis de ácidos nucleicos............................................................................................. 22 1.3.1. Electroforesis y su aplicación en el análisis de ácidos nucleicos ................................. 22 1.3.2. Secuenciación de ácidos nucleicos .............................................................................. 25 1.3.3. Genómica ...................................................................................................................... 29 Actividades .............................................................................................................................. 37 Autorreflexiones....................................................................................................................... 37 Cierre de la unidad .................................................................................................................. 37 Para saber más ....................................................................................................................... 38 Fuentes de consulta ................................................................................................................ 39

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Presentación de la unidad El código genético de todos los seres vivos y de los virus está almacenado en el ADN y se compone de una combinación de cuatro nucleótidos: Adenina, Guanina, Citosina y Timina abreviadas internacionalmente como A, G, C y T. Para el caso del ARN la Timina (T), es sustituida por el Uracilo (U). La secuencia de los nucleótidos dentro del ADN no es al azar, existen segmentos con ordenamientos particulares que contienen información extremadamente valiosa, los genes; pequeños paquetes de información que contienen las instrucciones precisas para construir un ser vivo en particular. Esto lo sabemos hoy en día gracias a los avances en las técnicas de biología molecular que han permitido el estudio molecular profundo de los ácidos nucleicos. El ADN, para el caso de las células procariontes, está ubicado en el nucleoide, mientras que para las células eucariontes se almacena en el núcleo. En ambos casos, los ácidos nucleicos están resguardados al interior de una célula. Para poder analizar el material genético; purificarlo, amplificarlo, secuenciarlo, medirlo y cuantificarlo, primero hay que extraerlo sin que se degrade, en este punto inicia nuestra historia. La manipulación de los ácidos nucleicos marcó un hito en la investigación; el esclarecimiento y comprensión a nivel genético de patologías como el cáncer, la manipulación de vegetales comestibles para incrementar su productividad, el mejoramiento de especies animales comestibles, el desarrollo de fármacos transgénicos como la insulina, por mencionar algunos fueron posibles gracias a que los investigadores tuvieron acceso pleno a la información celosamente almacenada en el ADN, anteriormente las técnicas moleculares eran complejas a causa de las limitantes tecnológicas de antaño. Hoy en día; extraer un gen, clonarlo mediante PCR, introducirlo en el genoma de otro organismo para sobre expresarlo o mutarlo para entender su función dentro de una célula son cosa de todos los días en los laboratorios de biología molecular, esto es posible gracias a que ahora conocemos las características de un gen; las secuencias con las que inician y terminan y podemos identificarlos de entre toda la secuencia del genoma, aunado a esto la tecnología actual ha permitido que estas técnicas se lleven a cabo de una manera más ágil y eficiente. Cada día se hacen descubrimientos importantes en diferentes áreas de la ciencia gracias a la biología molecular, el propósito de esta unidad es introducirte en el mundo de la manipulación de los ácidos nucleicos para que pronto, tú puedas descubrir cosas nuevas y contribuir al desarrollo científico de tu país.

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Propósitos

Al término de esta unidad, conocerás algunas de las técnicas más utilizadas en el análisis de los ácidos nucleicos.

Competencia específica

Asociar los procesos genéticos con la manipulación de los ácidos nucleicos a través del estudio de técnicas de biología molecular para identificar sus aplicaciones en el campo de la biotecnología como el aislamiento, caracterización de ácidos nucleicos, clonación y expresión de genes, entre otros.

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1.1. Obtención de ácidos nucleicos El primer paso en el análisis de los ácidos nucleicos es su extracción, el proceso en sí no es complicado; sin embargo, el ambiente extracelular resulta demasiado hostil para ellos. Además del ambiente hostil también hay que luchar contra la contaminación, ya sea con DNA o RNA ajeno a la muestra de interés, sin dejar de tomar en cuenta que es necesario eliminar todo el material celular de desecho producto del proceso de extracción. En este tema abordaremos las consideraciones técnicas necesarias para tener éxito en la obtención de ácidos nucleicos. Como instrumentos básicos en un laboratorio de biología molecular se encuentran las micropipetas, estos instrumentos de alta precisión permiten medir y manejar volúmenes desde 1 hasta 1000µl de una manera muy precisa y práctica, por lo general los volúmenes y muestras se trabajan en tubos Eppendorf, especiales para biología molecular, los tubos más utilizados son los de 1.5 ml de volumen, son capaces de resistir temperaturas superiores a los 100°C y cercanas a los -80°C sin sufrir daño. Otro elemento indispensable son los guantes de nitrilo; este material ofrece protección moderada contra algunos de los solventes y ácidos utilizados en biología molecular protegiendo las manos, pero sobre todo impiden que las muestras se contaminen con el ADN del investigador y que las enzimas degradadoras de ácidos nucleicos presentes en las manos ingresen a la muestra, destruyéndola.

Figura 1. Micropipetas utilizadas comúnmente en Biología molecular, permiten medir volúmenes de 1 a 1000 microlitros (µl). Orestov O (2010) Ensayo químico. Recuperado en abril de 2013, http://lia.unet.edu.ve/ant/Estil oAPA.htm.

Figura 2. Tras la centrifugación, las células o el material genético se concentran en el fondo del tubo Eppendorf formando un pellet, pastilla o paquete celular Awesome inc (2012) Metabloguismo. http://metablogismo.blogspot.mx/2 012/10/uno-de-los-mayoresproblemas-alos-que.html.

Figura 3. Forma correcta de extraer líquidos o fases de un tubo, debe inclinarse al lado opuesto de donde se formó el pellet para evitar su desprendimiento o resuspensión. MIT (20112012) Prepare expression system. http://ocw.mit.edu/courses/ biological-engineering/20109-laboratoryfundamentals-in-biological-

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engineering-spring2010/labs/module-2-day-4prepare-expressionsystem/.

1.1.1. Extracción de ácidos nucleicos Los pasos a considerar en la extracción de ácidos nucleicos a partir de material biológico son, (Lodish, 2006).  Lisis celular  Inactivación de nucleasas  Separación del ácido nucleico deseado del resto de los detritos celulares Elegir el proceso de lisis adecuado es muy importante, ya que debe ser lo suficientemente fuerte para romper las células del tejido con el que se esté trabajando (sangre, tejido muscular, hueso, tejidos vegetales como raíz, tallos, hojas, etc.) y a su vez lo suficientemente gentil para asegurar la preservación del ácido nucleico que se va a analizar. Entre los procedimientos de lisis celular más utilizados encontramos:

Disrupción Mecánica: Se lleva a cabo por medio de la molienda, machacado o licuado del tejido que pretende analizarse; este proceso puede llevarse a cabo por medio de un mortero y un pistilo o con disruptores celulares que son una especie de micro licuadora cuyas aspas muelen finamente el tejido. También es común el uso de sonicadores que rompen el tejido utilizando ondas de alta frecuencia.

Figura 4. Mortero con pistilo: el material a moler se introduce en la cavidad del mortero y se tritura con el pistilo de cerámica.

Figura 5. Disruptor celular: Consiste en un rotor que hace girar pequeñas aspas que muelen el tejido

Figura 6. Sonicador: El aparato administra un pulso de ondas ultrasónicas al tejido induciendo alta vibración que rompe el tejido.

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Lisis hipotónica: Las soluciones hipotónicas inducen la entrada masiva de agua hacia los tejidos, el exceso de agua incrementa la presión osmótica de la célula, lo que origina que la membrana celular se rompa, dejando libre el contenido celular. Congelación y descongelación: En este proceso; la muestra se congela ya sea con nitrógeno líquido o hielo seco, cuando la muestra se ha congelado totalmente se rompe mecánicamente utilizando un vórtex, este proceso se repite entre tres y cinco veces liberando el material de interés de una forma rápida y económica. Lisis química: Se lleva a cabo mediante detergentes, estas sustancias tienen la capacidad de disolver la membrana plasmática de las células liberando su contenido, existen soluciones específicas para este fin conocidas como buffer de lisis; su composición puede variar, pero el utilizado con mayor frecuencia está compuesto de: EDTA 100mM, pH 8.0 Tris - Cl 10 mM. pH 8.0 N- lauroylsarcosin de sodio al 1% (peso/volumen) Proteinasa K 100 µg/ml. Para evitar que la proteinasa pierda efecto, debe agregarse justo antes de usarse (Lodish, 2006). Inactivación de nucleasas: El ADN libre (fuera del ambiente celular) es muy susceptible de ser degradado por enzimas llamadas nucleasas; las que degradan el ADN se llaman DNAsas, mientras que las que degradan el ARN se les conoce como RNAsas. Estas enzimas están por todos lados; en las manos, en secreciones como saliva y sudor, en el aire; es por eso que para garantizar que la integridad de los ácidos nucleicos que se están extrayendo se mantenga intacta se inhiba la actividad degradadora de las nucleasas, y para tal efecto se utilizan comúnmente: β-mercaptoetanol; un agente reductor que inactiva a las nucleasas, SDS (dodecilsulfato de sodio); un agente quelante que secuestra iones (magnesio y calcio), necesarios para la actividad catalítica de la enzima. Una vez liberado el DNA e inactivadas las nucleasas, los detritos celulares producto de la lisis pueden ser fácilmente eliminados por filtración o precipitación, dejando una muestra más limpia para poder trabajar. Existen algunas particularidades sobre el tipo celular del que se va a extraer el ADN y el proceso de extracción a seguir: entre una célula vegetal, una de mamífero, protozoario y una bacteria existen diferencias estructurales a considerarse al momento de extraer ácidos nucleicos: las células vegetales tienen una pared celular dura de celulosa, las bacterias gram positivas tienen una pared de peptidoglucano y las gram negativas además de ésta, cuentan con una membrana externa, no así las células animales (Solomon, 2008). Para precipitar el ADN genómico a partir de células animales: si se trata de células adherentes (cómo fibroblastos) es necesario darles un tratamiento con tripsina; una enzima que rompe las uniones celulares que las mantienen adheridas, liberando a las células para que puedan colectarse, para lo que deben centrifugarse por cinco minutos a 500Xg a 4°C, desechando el sobrenadante. El paquete celular obtenido en la

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centrifugación debe lavarse dos veces resuspendiéndolo en 1-10 ml de buffer PBS enfriado con hielo, y debe centrifugarse nuevamente. La pastilla resultante se disuelve nuevamente en un mililitro de buffer de digestión por cada 108 células y almacenándolas en tubos perfectamente tapados por un lapso de entre 12 a 18 horas en agitación constante a 50°C.

Figura 7: Fragmento de un tumor tratado con tripsina; se puede apreciar cómo se desprenden algunas células individuales de la masa celular a causa del tratamiento con tripsina. http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S012202682012000200003&script=sci_arttext.

Por lo general, el ADN de estas fuentes celulares se extrae con una mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico en un volumen equivalente al volumen de la muestra (1:1) Para después centrifugarse e inducir que se separen las fases de la mezcla, conservando la fase superior para transferirla a un tubo en presencia de acetato de amonio y etanol absoluto por 24 hr para evitar la fragmentación del ADN. Pasando ese tiempo, puede retirarse el etanol y cambiarse por buffer Tris EDTA (ambas sustancias son quelantes de iones) y puede almacenarse a 4°C por tiempo indefinido (Lodish, 2006). Cuando la muestra es de origen vegetal, el proceso de extracción de ADN puede llevarse a cabo a partir de una muestra de 50-100 g. de tejido vegetal fresco que debe lavarse con agua desionizada y pulverizada por cualquier método de los descritos anteriormente, referentemente el de congelación-descongelación por ser más rápido y efectivo. El producto de la pulverización debe transferirse en una botella para centrífuga de 250 ml EDTA, pH 8.0, 250 mM NaCl, 100 µg/ml proteinasa K que se agrega al momento de utilizarlo; mientras tanto, el buffer puede almacenarse a temperatura ambiente) por gramo de muestra agitando suavemente. La muestra se centrifuga y se recupera el sobrenadante agregando seis volúmenes de isopropanol mezclando suavemente.

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Figura 8. Botellas para ultracentrífuga, cuentan con una graduación que permite el manejo exacto de volúmenes. ZiberCloud. http://www.denvillescientific.com/catalog/23.

Figura 9. Ultracentrífuga. El rotor puede alcanzar velocidades de 14 000 revoluciones por minuto (RPM) Emory+Children's Pediatric Research Center (2013).

A la muestra se le agregan 9.7 g. de cloruro de cesio (CsCl) útil para separar ácidos nucleicos por gradiente de densidad. La muestra se incuba por 30 minutos en hielo y se centrifuga por 10 minutos a 7500 X g, a 4°C y se recupera el sobrenadante, al que se le agregan 0.5 ml de bromuro de etidio (un agente intercalante de color azul que se une al DNA permitiendo su visualización) incubándose por 30 minutos en hielo. La mezcla se transfiere a tubos y se centrifugan a 525000 x g por 4 horas a 20°C y pasado el tiempo el ADN puede extraerse. Para el caso de las bacterias el protocolo es sencillo; es necesario poner a crecer a las bacterias previamente en medio líquido en tubos de ensayo con tapa de rosca, las condiciones de cultivo y el medio dependerán de la bacteria a crecer, sin embargo; la más utilizada es E. coli: Se inicia tomando 1.5 ml. Del cultivo inicial, que se centrifuga a 1000 rpm por 3 minutos para formar un paquete celular compacto que se resuspende en 567 µl de buffer TE y se agregan 300 µl de SDS al 10% más 3 µl de proteinasa K mezclando vigorosamente para posteriormente incubar a una hora a 37°C. Pasado el tiempo se agregan 100 µl m de cloruro de sodio (NaCl) 5M. para evitar que los ácidos nucleicos se precipiten en este momento, si la solución tiene una molaridad menor, el ADN precipitará. La muestra se lava con cloroformo, alcohol isoamílico y fenol y se centrifuga, la mezcla de alcoholes permitirá que el ADN bacteriano se precipite fácilmente con ayuda de una microcentrífuga. Es necesario dejar secar al aire el botón celular para después resuspenderlo en etanol al 70% o puede almacenarse en 100 µl de buffer TE (Lodish, 2006). Al terminar el proceso, en el tubo ependorff obtendrás algo parecido a lo que se muestra en la siguiente imagen, en el tubo de ensayo que sostiene la mujer se aprecia un líquido transparente en donde se encuentra suspendido otra sustancia inmiscible de color blanco lechoso, esa sustancia es el ADN.

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Figura 10. Científica mostrando DNA recién extraído suspendido en buffer. El material genético se aprecia como una masa blanquecina lechosa suspendida en el líquido transparente. www.sciencephotolibrary.com.

1.1.2. Purificación de ácidos nucleicos Cómo pudiste darte cuenta, el proceso de extracción de ácidos nucleicos, si bien no es complicado, es laborioso; primero tuvimos que reducir el tamaño de la muestra prácticamente hasta obtener células libres, para después romperlas y liberar el material genético. Utilizamos muchas sustancias; como proteínas, solventes, iones, detergentes y agua. Pese a que en este momento ya hemos extraído el ADN de nuestro interés, ahora debemos limpiarlo, quitando todo el material que añadimos para extraerlo, a este proceso se le conoce como purificación. Para remover solventes como fenol, cloroformo o butanol se utiliza comúnmente otro solvente; el éter. Este solvente es altamente inflamable y sus vapores pueden ocasionar malestares como mareos y náuseas, su manipulación debe hacerse en un ambiente bien ventilado o de preferencia en una campana de extracción, o de flujo laminar.

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Figura 11. Científica trabajando en una campana de flujo laminar en condiciones de esterilidad. Dyrectindustry (2013) http://www.directindustry.es/prod/erlab/campanas-de-flujo-laminar-18111139478.html

Generalmente se mezcla éter, buffer TE pH 8.0 y agua en proporción 1:1, esta mezcla se agrega en proporción 1:1 a la mezcla de ADN que deseamos purificar utilizando un vórtex para homogenizarla y se centrifuga a máxima potencia por cinco segundos descartando la fase superior; este proceso de lavado se realiza tres veces. Al terminar el lavado, el pellet se deja secar en una campana o al vacío por 15 minutos. Pasado este tiempo el ADN está listo para realizar experimentos. Existe otro método muy rápido, para purificar ADN que implica el uso de kits comerciales, que si bien son caros, pero altamente efectivos. Por lo general estos kits contienen todo lo necesario para llevar a cabo el proceso y solo es cuestión de seguir el protocolo incluido en el kit, que básicamente implica la solubilización de ADN en buffer TE y Ioduro de sodio (NaI) 6M, verter la mezcla en las columnas de sílica que proporciona el kit y centrifugar la muestra, al final del proceso el DNA queda concentrado al fondo de la columna y queda listo para utilizarse (Lodish, 2006).

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Figura 12. Columna de sílica para purificar ADN. El sistema se compone de un tubo eppendorf con fondo redondo y una columna que contiene un filtro de sílica en la que se introduce la muestra a purificar; en el proceso de centrifugación, la fuerza centrífuga induce que la muestra se filtre a través del filtro de sílica que atrapa todas las impuresas y permite el paso del ADN que se concentra en el fondo del tubo. Al término del proceso, la columna se desecha y se conserva el tubo con la muestra para su análisis. SBS Genetec Co., Ltd. http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?p=Aplicacion_AN_Purificacion&opc=productosdestacad os&idap=236

1.2. Reacción en cadena de la polimerasa Hace algunos años, uno de los factores limitantes en el estudio de los genes era la falta de material en cantidades suficientes para estudiarlo, se necesitaba extraer una cantidad considerable de ADN en repetidas ocasiones para poder llevar a cabo una investigación. Los científicos soñaban con la posibilidad de duplicar o producir en masa aquellas secuencias de ADN que estaban estudiando (Lodish, 2006). Este sueño fue hecho realidad en 1993 por el científico estadounidense Kary Mullis, quien ganó el premio nobel por esta contribución a la biología molecular. La técnica se conoce como PCR del inglés Polimerase Chain Reaction, o reacción en cadena de la polimerasa. Mullis tuvo la visión de reproducir en un tubo de plástico un proceso que llevan a cabo las células desde que aparecieron sobre la tierra, la replicación; de este modo, la ciencia hora cuenta con una técnica que la hace de fotocopiadora molecular permitiendo sintetizar millones de copias de una secuencia en particular para poder estudiarla (Curtis, 2007). Hoy en día la PCR se utiliza de manera rutinaria en cualquier laboratorio de trabaje con ADN; ahora, con los avances tecnológicos que se han hecho en el campo de la biología molecular, hacer una PCR es casi, una cosa de niños, claro, niños que tengan conocimiento en biología molecular. A continuación abordaremos los fundamentos y requerimientos técnicos de este proceso.

1.2.1. Amplificación de ácidos nucleicos mediante PCR Cuando una célula va a replicar su material genético primero debe romper los puentes de hidrógeno que unen a las cadenas de ADN mediante la acción de la enzima helicasa, posteriormente la enzima ADN polimerasa debe acoplarse a la cadena líder y adicionar Universidad Abierta y a Distancia de México

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los nucleótidos que correspondan a la secuencia que va leyendo. El ambiente celular resulta adecuado para este proceso ya que se cuenta con todo lo que se necesita para llevarlo a cabo: ADN, Iones, nucleótido, Enzimas, energía, etc. (Watson, 2008). Reproducir este proceso en un tubo no es tan sencillo, ya que no es posible replicar dentro de este el ambiente celular, por lo que necesitamos conocer algunos trucos y contar con un poco de ayuda tecnológica: La PCR se lleva a cabo en un termociclador, cómo su nombre lo dice; el aparato tiene una cámara en la que se llevan a cabo fluctuaciones cíclicas de temperatura entre los 4 y 90 °C. La fluctuación entre las temperaturas es un factor crucial para que la PCR se lleve a cabo ya que en primera instancia suple la función de la helicasa; los puentes de hidrógeno pueden romperse por acción de la temperatura, el termociclador incrementa la temperatura de su cámara alrededor de 96°C para abrir la doble hélice (Figura12), posteriormente, una vez abierta; la reduce a unos 50°C para permitir que los cebadores, que son secuencias complementarias a la cadena que se va a amplificar se unan a su secuencia complementaria en el DNA, finalmente, la temperatura debe permitir que la enzima que va a polimerizar las nuevas copias de ADN sea capaz de acoplarse al DNA, mantenerse en su sitio y que la reacción de polimerización de nucleótidos se lleve a cabo (Alberts, 2008).

Figura 13. Alternancia de temperaturas en una PCR estándar. Puede observarse las temperaturas de desnaturalización, alineamiento de cebadores y amplificación, este proceso se repite entre 25 y 40 ciclos. Carr. S. (2010) Recuperado en abril de 2013.http://www.mun.ca/biology/scarr/PCR_simplified.html

Existen muchas polimerasas en el mercado, la que ha resultado predilecta entre los biólogos moleculares es la Taq polimerasa, conocida en el ambiente científico como TAQ, extraída de la bacteria Thermus aquaticus, esta bacteria extremófila vive en los geiseres donde el agua alcanza temperaturas superiores a los 100°C. Esta enzima está perfectamente adaptada para trabajar en condiciones de alta temperatura sin comprometer su integridad molecular y manteniendo un margen de error extremadamente

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bajo al momento de sintetizar las cadenas. Otras enzimas no son capaces de trabajar bajo las condiciones de temperatura del termociclador ya que se desnaturalizan por la acción de la temperatura. La receta para llevar a cabo una PCR se completa adicionando desoxiribonucleótidos, ya que sin estos, la TAQ no tendría material para polimerizar las nuevas cadenas, ATP como fuente de energía; ya que la TAQ emplea la hidrólisis de ATP para llevar a cabo el enlace fosfodiester entre nucleótidos y Magnesio, como un ion aditivo necesario para la enzima, y desde luego; el termociclador (Alberts, 2008).

Figura14. Representación gráfica dela enzima Taqpolimerasa duplicando una cadena de ADN en una reacción de PCR. NewEngland biolabs INC. Recuperada en Mayo de 2013 http://lecahiermichaelien.wordpress.com/2012/01/09/una-tecnicarevolucionaria/.

La reacción se lleva a cabo en tubos Eppendorf especiales para PCR, son hechos de policarbonato de paredes delgadas para que los cambios de temperatura se llevan a cabo de manera rápida, vienen con una tapa que evita que el líquido se pierda por condensación y son muy resistentes ya que resisten rangos de temperatura de -4°C100°C. Sin romperse, los hay en capacidades de 200 y 500 µl.

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Figura 15. Tubos Eppendorf especiales para PCR. Biocomdirect (2006) Recuperado en Abril de 2013. http://www.biocomdirect.com/scripts/productVie w.asp?idproduct=1794

Figura 16. Termociclador: existen muchas marcas y tamaños, sin embargo todos cuentan con una cámara donde se acoplan los tubos para PCR y una tapa que es la que lleva a cabo las fluctuaciones de temperatura, y una pantalla donde uno puede ingresar los ciclos de temperatura y observar el desarrollo de la reacción. Laboratorio de investigación, recuperado en abril de 2013, http://biotecnologia.espe.edu.ec/laboratoriosinvestigacion/laboratorio-de-biotecnologiahumana/termociclador-para-pcr/.

Al proceso de copiar un segmento de ADN se le conoce como clonación, la técnica de PCR permite clonar una secuencia de ADN o ARN de manera fácil y rápida y sobre todo, a gran escala, obteniendo billones de copias de una secuencia seleccionada, este proceso también permite obtener una secuencia purificada (Figura 16), ya que solo se amplifica o se clona un segmento bien delimitado dejando atrás el resto del genoma (Alberts, 2008). Para delimitar la secuencia a amplificar; por lo general un gen, se emplean pequeños fragmentos de DNA que se conocen como cebadores u oligos; tienen un tamaño entre 16 y 24 nucleótidos. Estos cebadores se sintetizan en pares, la secuencia de nucleótidos de uno de ellos es complementaria al extremo 5´del segmento de DNA que se desea amplificar y el otro es complementario al extremo 3´; es decir, recordemos que el ADN es una doble hélice, la cadena denominada comúnmente como líder tiene sentido 3´-5´ por lo que el cebador que hibridará con ella tiene la secuencia complementaria de Esta cadena en sentido 5´-3´y corresponde al inicio del gen, cerca de la secuencia promotora de la transcripción. La cadena rezagada tiene sentido 5´-3´ por lo que el cebador que le corresponde tiene una secuencia complementaria en sentido 3´-5´ y coincide con el final del gen.

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Figura 17. Diagrama de una PCR en donde a través de ocho ciclos se puede apreciar el proceso de purificación del amplificado, conforme avanzan los ciclos el número de cadenas de longitud correcta; es decir, las cadenas delimitadas por los cebadores. Para el ciclo ocho se tienen ocho cadenas de longitud correcta, número que incrementará con el paso del tiempo. http://cmapspublic2.ihmc.us/rid=1HZ6CDY56-1J059V-QF5/PCR.jpg

Los cebadores son esenciales en la PCR, ya que sirven como ancla para que la polimerasa se acople a la cadena que va a amplificar y sintetice la secuencia complementaria. Recordemos que la replicación siempre se realiza en sentido 5´-3´, los cebadores acoplados de esta manera permiten que la síntesis de ambas cadenas se lleve a cabo en este sentido (Alberts, 2008, Watson, 2008). Un factor determinante en el desarrollo de la PCR es la temperatura; inicialmente, la temperatura se incrementa por arriba de los 90°C para inducir la separación de las dos cadenas, el siguiente paso es la hibridación de los cebadores. Para que se lleve a cabo, es necesario reducir la temperatura para permitir que se establezcan los puentes de hidrógeno entre los cebadores y sus secuencias complementarias, una temperatura muy alta impedirá que los cebadores se hibriden con las cadenas, una temperatura muy baja inducirá la formación de puentes de hidrógeno entre las cadenas hermanas. La temperatura ideal para la hibridación de los cebadores se conoce como Tm del inglés Melting temperatura (temperatura de fusión) que es aquella a la cual el 50% de los cebadores presentes en la PCR se encuentran libres. Para calcularla se ocupa la siguiente fórmula: Universidad Abierta y a Distancia de México

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Tm= 2(A+T) + 4(C+G) Esto es: si se tiene la secuencia: 5’-ATTCTAGATACCAGTGACTG-3’ mediante esta fórmula se puede calcular su Tm contando cuantas adeninas, timinas, citosinas y guaninas existen en la secuencias para ingresar los datos en la fórmula y calcular la Tm como sigue:

Tm = 2(6+6) + 4(4+4) = 56°C

Una vez calculada la Tm para ambos cebadores, se programa en el termociclador la temperatura de hibridación más óptima para ese proceso en particular; es importante que la TM de los cebadores sea muy parecida, ya que de existir diferencias importantes de temperatura, jamás se podrá programar una temperatura de alineamiento en el termociclador que permita que los dos cebadores hibriden, en estos casos es necesario valerse de herramientas informáticas de libre acceso en internet; la gran mayoría vienen en idioma inglés, sin embargo, su manejo es tan sencillo que incluso sin dominar el idioma se pueden diseñar fácilmente los cebadores. Reactivo

Volumen a agregar por reacción 10 µl 1 µl

Buffer para PCR 50µM del cebador 1: 50pmol/µl disueltos en agua estéril, biodestilada, desionizada, libre de nucleasas (grado biología molecular) 50µM del cebador 2: 50pmol/µl disueltos 1 µl en agua estéril, biodestilada, desionizada, libre de nucleasas (grado biología molecular) 1 µg de DNA genómico o de 1 a 100 pg 1 volumen (1-10 µl) de DNA plasmídico 25 mM de mix 4dNTP (mix de 0.8 µl desoxiribonucleótidos) 5 U/µl de Taq DNA polimerasa 0.5 µl DMSO 5 µl GLICREOL 10 µl PMPE (perfect match pcr enhancer) 1 µl Agua estéril (grado biología molecular) Suficiente para completar 90 µl Protocolo estándar para PCR. Fredrikson, 2002 Tabla 1. El protocolo general para realizar una PCR requiere los siguientes reactivos (Lodish, 2006).

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Hecha la mezcla en el tubo Eppendorf para PCR, puede introducirse en el termociclador para su amplificación. Por lo general; los termocicladores cuentan con una serie de protocolos precargados para amplificar secuencias estándar, el más utilizado abarca treinta ciclos de: 30 segundos a 94°C (desnaturalización del ADN), 30 segundos a 55°C (para secuencias con un contenido de CG menor al 50%) o 30 segundos a 60°C (para secuencias con contenido de CG mayor al 50%) este ciclo se conoce como ciclo de alineamiento, donde se hibridan los cebadores con las cadenas a amplificar. Y un ciclo de 60 segundos/ kilobase (una kilobase equivale a mil bases) a 70°C para la amplificación de la secuencia (Figura 12). Al terminar los 30 ciclos el producto de PCR puede extraerse del termociclador, o bien, puede programarse un ciclo con duración infinita a 4°C para conservar el producto de PCR dentro del termociclador, por lo general se emplea cuando se corre la PCR por la noche. De esta manera, el producto de PCR se conserva intacto hasta que pueda sacarse del termociclador.

Figura 18. El ciclo de la PCR: Se puede apreciar el momento en que se dan los cambios de temperatura y el papel que juegan dentro del ciclo.

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La amplificación de las secuencias en la PCR es exponencial, esto permite que en un lapso de tiempo muy corto y con poca cantidad de muestra inicial se obtengan grandes cantidades de material genético amplificado. Como el procedimiento se lleva a cabo una y otra vez, los fragmentos recién sintetizados sirven como plantillas para los ciclos siguientes, y al cabo de unos pocos ciclos, la secuencia predominante es idéntica a la secuencia delimitada por los cebadores en la secuencia original, incluyendo los dos cebadores de la cadena original. Es decir, solo se amplifican las secuencias delimitadas por los cebadores, ya que el resto del ADN, sin importar su longitud no se amplifica ya que no está flanqueada por cebadores, esto hace más eficiente la amplificación ya que solo se amplifica la secuencia deseada (Watson, 2008; Alberts, 2008).

Figura 19. En la figura se ilustran tres ciclos de reacción que producen 16 cadenas de ADN, 8 de los cuales (en caja en amarillo) son de la misma longitud y corresponden exactamente a una o la otra hebra de la secuencia original, de color gris. Las otras hebras contienen ADN adicionales que se replican en los primeros ciclos. Después de tres ciclos 240 de las 256 cadenas de ADN corresponden exactamente a la secuencia original entre corchetes, y después de varios ciclos más, esencialmente la totalidad de las cadenas de ADN tienen esta longitud única. (Alberts, B., 2008).

A la PCR estándar, también se le conoce como PCR de punto final, ya que podemos predecir la concentración del amplificado al término de la reacción, sin embargo; no podemos saber cómo se comporta la secuencia que deseamos amplificar a lo largo del tiempo, tampoco podemos amplificar varias secuencias a la vez. Para poder tener una mejor panorámica de lo que sucede con un gen a lo largo del tiempo, podemos recurrir a una variante de la PCR conocida como PCR de tiempo real o RT-PCR (Alberts, B., 2008).

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1.2.2. PCR en tiempo real La PCR de tiempo real o cuantitativo, es una variante de la PCR estándar o de punto final, su principio es el mismo que la PCR convencional y se utiliza para cuantificar la amplificación de una secuencia de DNA o RNAm de una muestra. Para esto, la técnica utiliza cebadores específicos para cada secuencia, igual que la PCR, de este modo es posible calcular la cantidad relativa de copias de una secuencia o conjunto de secuencias en particular. La cuantificación se lleva a cabo ciclo a ciclo, mediante la adición de fluoróforos (moléculas que al interactuar con una longitud de onda X reflejan una longitud de onda Y que al ser diferente de la original es cuantificable) que se unen de manera específica a la secuencia que se va a amplificar, cuando pasa la DNA polimerasa (DNA pol) por el sitio donde está hibridado el fluoróforo ocasiona que este se desprenda, emitiendo luz a una longitud de onda específica que es cuantificada por el termociclador de tiempo real (Figura 19). Los fluoróforos se unen en relación 1:1 con la secuencia a amplificar, de tal modo que la intensidad de la longitud de onda emitida por el fluoróforo puede relacionarse directamente con la concentración del material amplificado a lo largo del tiempo. A este método en particular se le conoce como Taqman, y se distribuye comercialmente bajo ese nombre. El sistema se compone de una sonda especial que es complementaria de una secuencia del gen de interés, esta sonda está acoplada a un fluoróforo (R) y a un silenciador (Q), este absorbe o apaga la señal del fluoróforo mientras ambos están acoplados a la sonda e hibridados en la secuencia a amplificar, el paso de la Taq polimerasa induce la desestabilización de la sonda, desacoplando al silenciador y al fluoróforo, cuando este queda libre del efecto del silenciador puede interactuar con el láser que emite el termociclador de tiempo real y emitir una longitud de onda que es captada por el equipo, de este modo se puede cuantificar con extremada precisión la secuencia que se está amplificando (Alberts, 2008; Curtis, 2007)

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Figura 20. Termociclador de tiempo real, este novedoso aparato tiene la capacidad de cuantificar las secuencias que amplifica en cada ciclo de PCR, con esta información puede construirse una gráfica para visualizar y analizar el comportamiento del amplificado en función del tiempo. www.molecularstation.com

La gran ventaja de la PCR en tiempo real es que permite el análisis de varias muestras o secuencias al mismo tiempo, y de esta manera analizar cuantitativamente el patrón de expresión de cada muestra, la adición de cebadores y fluoróforos específicos para cada secuencia permite la amplificación precisa de cada muestra. Los resultados de la PCR se muestran en un gráfico que relaciona la concentración de una amplificación en particular a lo largo del tiempo y de esta forma podemos conocer el patrón de expresión de la misma. Como lo muestran las siguientes figuras.

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Figura 21. Sistema Taqman para PCR de tiempo real.

Figura 22. Gráfico de análisis de PCR de una secuencia en tiempo real en función de los ciclos de amplificación. Davidson College (2003) recuperada en abril de 2013. http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/Molstudent s/spring2003/Pierce/realtimepcr.htm

Figura 23. Mecanismo de emisión-detección de emisión luminosa de los fluoróforos en la PCR de tiempo real. Vinuesa, C. (2008) PCR en tiempo real, recuperado en abril de 2013. http://www.monografias.com/trabajos64/pcr-tiempo-real/pcr-tiempo-real2.shtml

Ésta revolucionaria técnica tiene muchas ventajas y aplicaciones; a continuación se resumen en la siguiente tabla:

Ventajas Simple y rápida Sin manipulación post PCR Cuantificación precisa Alta sensibilidad y especificidad

Aplicaciones Identificación de genes de virulencia o resistencia Genotipificación Identificación de patógenos Detección de mutaciones

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Resolución de más de un producto

Estudio de polimorfismos Detección de la expresión génica

Tabla 2. Ventajas y aplicaciones de la PCR en tiempo real.

En este punto, has tenido oportunidad de conocer las técnicas de extracción, purificación y amplificación de ácidos nucleicos; el siguiente paso es el análisis de los productos de PCR. Para esto, nos valdremos de algunas de las características fisicoquímicas de los ácidos nucleicos.

1.3. Análisis de ácidos nucleicos Hasta este punto, has sido capaz de extraer el ADN de tu interés, lo has limpiado y purificado e incluso lo clonaste mediante PCR o RT-PCR, sin embargo, pese a tanto trabajo que se ha hecho, aún no sabemos nada del ADN con el que estamos trabajando. Justo ahora te encuentras con una gran cantidad de ADN en un tubo, es momento de desenmarañar sus secretos: su peso, estructura, si es un fragmento de ADN estructural o codificante, si es una molécula única de una especie o tiene hermanos o primos evolutivos en otras especies, si hay una o más variantes del mismo, por mencionar algunos. Como biotecnólogo conocerás algunas técnicas que te permitirán extraer más información a las secuencias que acabas de clonar: por medio de la electroforesis podrás determinar su peso, o longitud en pares de bases, lo que te dará una idea de su tamaño y mediante la secuenciación podrás determinar con exactitud su secuencia o el orden en el que están enlazados los nucleótidos, esto te permitirá identificar mutaciones y hacer comparaciones entre el ADN que estás estudiando con el de cualquier grupo étnico o clado filogenético. Esta información constituye el punto de partida para cualquier investigación en el campo de la biología molecular.

1.3.1. Electroforesis y su aplicación en el análisis de ácidos nucleicos En el análisis de DNA es importante determinar la longitud y la pureza de los fragmentos de DNA que se han amplificado, ya que estas características nos darán indicio si estamos trabajando con la secuencia que en verdad nos interesa, el tamaño de la muestra amplificada puede determinarse con precisión utilizando una técnica conocida como electroforesis; se basa en el principio de que todas las moléculas tienen una carga, y dicha carga puede ser atraída hacia su polo opuesto, en presencia del ambiente correcto y de un campo eléctrico En las moléculas de ADN, cada nucleótido tiene una carga negativa que aporta el grupo fosfato, esta carga puede aprovecharse para inducir que el ADN o ARN migre hacia el

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polo positivo dentro de un sistema eléctrico. Para separar estas moléculas de acuerdo a su tamaño se utilizan geles porosos formados por soluciones diluidas de agarosa; un polímero de azúcares que se extrae de algas marinas. (Alberts, 2008) Construir un gel para electroforesis es similar a hacer una gelatina; ésta se hace diluyendo grenetina en agua caliente vertiéndola en un molde para que se solidifique de manera uniforme conforme se enfría. En biología molecular, en lugar de grenetina se emplea agarosa disuelta en buffer, que se solidifica en una cámara para electroforesis; ésta cámara es un recipiente que tiene acoplados dos polos con los que se crea un gradiente eléctrico que se emplea para hacer migrar moléculas hacia el polo opuesto a su carga.

Figura 24. Electroforesis. El gel se posiciona en una cámara para electroforesis en presencia de buffer para cerrar el circuito. Las muestras se cargan en el gel y se aplica una corriente eléctrica, las muestras migrarán a lo largo del gel en función de su carga y de su peso molecular o tamaño. Creationwiki (2013) electroforesis, recuperada en abril de 2013.

Sin una superficie que ofrezca resistencia, las moléculas como ácidos nucleicos migrarían sin restricción hacia el polo positivo; la función del gel es esa; cuando se solidifica forma una red con poros uniformes en tamaño y distribución. Cuando los ácidos nucleicos se cargan dentro del gel, estos migran a través de los poros del gel atraídos hacia el polo positivo. Debido a que los poros del gel son de un solo tamaño ofrecen una resistencia perfecta al avance de las moléculas, de tal suerte que las moléculas más grandes o de mayor peso tardarán más tiempo en migrar y quedarán en la parte superior del gel, mientas que las más pequeñas avanzan con menos resistencia hacia la parte inferior del gel (Watson, 2008; Solomon, 2008). El circuito lo cierra el buffer de corrida para electroforesis, que al contener iones disueltos cierran el circuito entre los dos polos permitiendo que la corriente se distribuya por toda la cámara. La corriente es administrada por una fuente de poder que permite regular el voltaje y el amperaje de la corriente a administrar.

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Al término de la corrida, es necesario teñir el gel con una sustancia que permita visualizar los ácidos nucleicos; el bromuro de etidio cubre esta función ya que cuando es estimulado con luz ultravioleta emite un destello amarillo-naranja que permite observar las bandas del ADN en el gel, aunado a esto, a la par de la muestra, se carga un marcador de peso molecular, son fragmentos de DNA de concentración, peso y tamaño conocidos que migran a la par de las muestras y permiten establecer un punto de referencia entre las muestras y el peso molecular.

Figura 25. Preparación de geles de agarosa: se disuelve en buffer y se calienta, la mezcla se vierte en la cámara de electroforesis para que se solidifique, y se adiciona un peine que formará los pozos para cargar las muestras de ADN una vez solidificado el gel. Para ser cargadas dentro delos pozos, las muestras se mezclan con bromuro de etidio (azul) y se vierte la mezcla en el pozo con ayuda de una micropipeta. http://prysk.yoll.net/medicina/electrodnap/electroforesis.htm.

Figura 26. El gel solidificado se coloca en la cámara, que se llena con buffer de corrida, se conectan los electrodos de la cámara a la fuente de poder y se inicia la corrida. http://www.bioted.es/medio_electroforesis.htm

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Figura 27. Gel de agarosa visto a la luz de un transiluminador UV. Arriba; el carril de la izquierda corresponde al marcador de peso molecular, el resto de los carriles corresponden a las muestras. El color naranja-amarillo de las bandas se debe a la interacción del bromuro de etidio con la luz UV. http://donjjtoro08.blogspot.mx/2010/07/blog-post.html.

Esta técnica permite observar los amplificados de PCR para poder hacer comparaciones con los marcadores de peso molecular, de esta manera se puede observar si el ADN amplificado está integro (una banda bien definida significa que el DNA está íntegro, un barrido de color naranja significa que el ADN está desnaturalizado y no sirve) y podemos determinar si coincide con el peso esperado para así tener la seguridad de que se está trabajando con la secuencia correcta.

Este video te ayudará a comprender mejor el proceso: Electroforesis (2008): https://www.youtube.com/watch?v=6vKLT5mQoBM?v=6vKLT5mQoBM

1.3.2. Secuenciación de ácidos nucleicos Para muchos experimentos de ADN recombinante, es necesario conocer la secuencia del ADN con el que se está trabajando para poder manipularlo, para el caso de un gen; conocer su secuencia permite identificar sus sitios de inicio y término de transcripción, así como predecir la secuencia de aminoácidos que podría tener la proteína producto de su traducción, también permite elegir las enzimas de restricción más apropiadas para manipular el gen en función de su secuencia y así construir un mapa de restricción para

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este gen. El conocer la secuencia del ADN permite también, encontrar y analizar mutaciones (Solomon, 2008; Alberts, 2008; Watson, 2008). EL primer método de secuenciación fue propuesto por el bioquímico británico Frederik Sanger, en 1975. Está basado en dos técnicas que ya conoces; la PCR y la electroforesis. En la PCR se explota la capacidad de la polimerasa para enlazar los nucleótidos por medio de un enlace fosfodiester entre el grupo OH en el extremo 3´de la desoxirribosa de un nucleótido y el grupo fosfato del carbono 5´del nucleótido siguiente (Figura 30) cómo sucede en la naturaleza, en el método de Sanger se emplean nucleótidos modificados; un nucleótido normal está formado por un grupo fosfato, una desoxirribosa y una base nitrogenada (Figura 28), un nucleótido dideoxi, tiene los mismos componentes, con una modificación en el sustituyente del carbono 3´de la desoxirribosa; un nucleótido normal tiene un grupo OH en esa posición, un nucleótido dideoxi tiene sólo un hidrógeno (Figura 30), esta característica impide que se forme el enlace fosfodiester con el siguiente nucleótido; lo que detiene la PCR (Figura 31), y este es el punto central de la técnica que le valió su segundo premio Nobel al descubridor.

Figura 28. Estructura química de un desoxiribonucleótido convencional, nótese el grupo OH en el carbono 3´ del azúcar Marcelo Biologia (2012) recuperado en abril de 2013. http://marcelobiologial.blogspot.mx/2012_03_0 1_archive.html

Figura 29. Dideoxiribonucleótido para secuenciación, nótese la ausencia de grupo OH en el carbono 3´ del azúcar. http://biolizbeth.blogspot.mx/2012/03/441secuenciacion-del-adn.html

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Figura 30. Enlace fosfodiester entre dos nucleótidos. Wilhelmy, C. http://biologiaebuc2012.blogspot.mx/2012/06/c lase-7-acidos-nucleicos.html

Figura 31. Efecto de agregar un Didesoxinucleótido en una PCR, la falta de OH en el azúcar, detiene la reacción. http://www.arrakis.es/~ibrabida/vigdidesoxi.html

Para secuenciar un gen con este método se monta una PCR normal en cuatro tubos Eppendorf. En cada uno se adiciona el segmento de ADN a secuenciar, cebadores, polimerasa, nucleótidos, ATP, y en el tubo 1 además se agrega Adenina dideoxi, en el tubo dos se agrega timina dideoxi, en el tres de esa secuencia se detendrá en ese momento. Supongamos que deseamos secuenciar un fragmento desconocido (cuya cadena líder tiene la secuencia: 3´CTAGATCCGATAACG5´: pero nosotros no la conocemos); tomando como ejemplo el tubo 1, con Adenina dideoxi (A*); Al momento de correr la PCR, la polimerasa incorporará una A* en el lugar de la primera Adenina, deteniendo la reacción, en un segundo evento incorporará otra A* en la segunda posición y otra en la tercera y así sucesivamente. Al término de la PCR tendremos una mezcla de amplificaciones normales y de amplificaciones incompletas porque se agregó en algún momento una A* como sigue: 3´CTAGATCCGATAAGC5´ 5´GA*

cadena molde cadena complementaria sintetizada con dideoxinucleótidos

3´CTAGATCCGATAAGC 5´ 5´GATCTA* 3´CTAGATCCGATAAGC5´ 5´GATCTAGGCTA* El momento en el que se agrega un didesoxinucleótido es azaroso; pero estadísticamente, al término de la PCR se habrá agregado una A* en cada posición posible, originando fragmentos de diferente tamaño, como se puede observar en las secuencias anteriores. Universidad Abierta y a Distancia de México

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Este fenómeno se repite para cada uno de los cuatro tubos de reacción. Al término de la PCR. Los fragmentos amplificados se corren en un gel de agarosa cargando en carriles separados cada uno de los tubos de reacción pasa separarlos de acuerdo a su tamaño, obteniendo el siguiente resultado:

Figura 32. Electroforesis en gel de agarosa de secuencias amplificadas con el método de Sanges. Los fragmentos migran de acuerdo a su peso molecular, en la base del gel se encuentran los fragmentos más ligeros y en la parte superior los más pesados, para identificar la secuencia, los segmentos se leen en orden ascendente. http://www.arrakis.es/~ibrabida/vigdidesoxi.html

En el carril uno se cargó el tubo con A*, en el dos el tubo T*, en el tres el tubo C* y en el cuatro el tubo G* Al término de la electroforesis tendremos separados, de acuerdo a su tamaño, cada uno de los amplificados; y podemos reconstruir la secuencia. Recordemos que la secuencia original es: 3´CTAGATCCGATAAGC5´. El segmento amplificado más ligero, que migró más abajo en el gel corresponde a una G* que es la base complementaria del último nucleótido de la secuencia original. El segundo segmento más ligero corresponde a una C* que es la base complementaria del penúltimo nucleótido de la secuencia original, de esta manera podemos construir en sentido inverso la secuencia complementaria de la cadena original, y por ende inferir después, la secuencia original (Alberts, 2008, Wattson, 2008). Al reconstruir en orden ascendente la secuencia, partiendo desde el fragmento más ligero, hacia el más pesado, la secuencia complementaria tiene este orden:

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5´GCTTATCGGATCTAG 3´, esta es la secuencia arrojada por el método de Sanger, que corresponde a la cadena complementaria, a partir de ésta podemos obtener la secuencia de la cadena líder que sería: 3´CTAGATCCGATAAGC5´. Al alinearlas, observamos que se complementan: 3´CTAGATCCGATAAGC5´ Secuencia inferida a partir del resultado de Sanger. 5´GCTTATCGGATCTAG 3´, Secuencia obtenida mediante el método de Sanger. (Figura24) De este modo se pueden secuenciar genomas enteros; como dato histórico; Sanger probó la efectividad de su método al secuenciar completamente el genoma del bacteriófago PhiX174.

1.3.3. Genómica En 1865 un monje austriaco llamado Gregorio Mendel, observó un patrón de aparición y desaparición, y combinación de caracteres como el color de la vaina y de las flores, la altura de los tallos y la textura de la cubierta de las semillas de chícharo que cultivaba en el huerto de su monasterio. Sus observaciones, producto de cientos de cruzas sistemáticas realizadas por el propio monje, son ahora conocidas como las leyes de Mendel, las cuales sentaron las bases de la genética, por lo que se le reconoce como el padre de dicha ciencia. La genética estudia las leyes de la herencia; la forma en la que los caracteres, ahora conocidos como genes, se heredan de generación en generación y el efecto que estos tienen sobre un individuo. A la carga genética de un individuo en particular se le conoce como genotipo, a la expresión de estos genes se les conoce como fenotipo (Solomon, 2008). Ahora sabemos que dichos caracteres son los genes y están almacenados en la secuencia del ADN, cuya estructura fue dilucidada por Rosalind Franklin, James Watson, Francis Crick y Maurice Wilkins (aunque por las cuestiones discriminativas de género de mediados del siglo pasado, el crédito de tal descubrimiento y el premio Novel por el mismo sólo se le otorgó a los tres últimos, pese a que sin las investigaciones de Franklin no hubiese sido posible determinar la estructura de la doble hélice). Gracias a la PCR de Kary Mullis, es posible clonar fragmentos de ADN y a Frederik Sanger le debemos la capacidad de secuenciarlos. Sin estos descubrimientos ni la biología molecular, ni la genética tendrían el avance que presentan hasta hoy. De la aplicación de estas ciencias en conjunto con las matemáticas, informática, bioquímica entre otras, nace la Genómica. Para poder comprender su funcionamiento dentro de un organismo, la genética y la biología molecular estudian a los genes de manera individual, sin embargo esta estrategia con frecuencia no brinda una panorámica clara sobre la relación estructura-función de un gen (o de las proteínas que este codifica) dentro del genoma. Esto se debe a que en realidad, un gen no funciona como una entidad, sino como parte de una red perfectamente coordinada y dinámica que responde de manera inmediata ente las Universidad Abierta y a Distancia de México

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necesidades de una célula, y en suma, de un individuo. Aunado a esto, debemos tener en cuenta que dentro de una especie o una población puede existir una o varias variantes de un gen producto de mutaciones selectivas. Estas variantes evidentemente responden de manera diferente y su efecto sobre el organismo lo es también. Es precisamente por esta situación que para entender el funcionamiento de un gen dentro de un sistema biológico es necesario analizarlo en conjunto, de esto se encarga la genómica, abarcando la caracterización molecular de genomas completos para determinar los patrones globales de expresión génica de una especie en particular. En la actualidad se han completado la secuenciación genómica de más de 80 especies bacterianas, protozoarios y animales como el ratón y desde luego el genoma humano, esta información provee evidencia contundente sobre los procesos evolutivos que nos han hecho lo que somos (Lodish, 2004). Los métodos genómicos permiten comparar los genomas de cientos de especies, o individuos entre sí para determinar el curso evolutivo de un gen en particular o para detectar diferencias o mutaciones entre las secuencias genéticas que pueden reflejarse en deficiencias metabólicas o de desarrollo o alteraciones congénitas de los individuos afectados, por mencionar algunos ejemplos. El mejoramiento de las técnicas de ADN recombinante ha permitido concentrar la secuencias de cientos de genomas en mega bases de datos genéticos, la base de datos más grande y ampliamente usada es el GeneBank del NCBI en Estados Unidos. La información contenida en esta y otras bases de datos a nivel internacional permiten accesar libremente a la información que resguardan. Las bases de datos permiten hacer comparaciones de una secuencia X con las almacenadas en la misma mediante una aplicación conocida como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool o herramienta de alineamiento básico local). Los algoritmos de BLAST dividen en fragmentos la secuencia del gen en fragmentos pequeños que compara con las secuencias existentes en la base de datos para identificar coincidencias significativas entre la secuencia que queremos estudiar y cualquier secuencia de la base de datos. El programa asigna un valor conocido como Match score que relaciona que tanto se parece la secuencia estudiada con cualquier secuencia de la base de datos, entre más alto sea el match score, más se parecen las secuencias, de tal suerte que si el match score es igual a cien, significa que hay una coincidencia con una secuencia en particular, lo contrario sucede con un match score bajo. En estos casos las coincidencias con scores bajos se descartan por defecto. Por ejemplo: Supongamos que trabajas en el laboratorio de biología molecular de un hospital del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) y se te pide que analices la muestra de un fragmento de DNA de un paciente que presenta problemas musculares serios. Decides secuenciarlo por el método de Sanger y la secuencia que obtienes es la siguiente: CACCGCAGCGGACAGCGCCAAGTGAAGCCTCGCTTCCCCTCCGCGGCGACCAGGG CCCGAGCCGAGAGTAGCAGTTGTAGCTACCCGCCCAGGTAGGGCAGGAGTTGGGAG

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GGGACAGGGGGACAGGGCACTACCGAGGGGAACCTGAAGGACTCCGGGGCAGAAC CCAGTCGGTTCACCTGGTCAGCCCCAGGCCTGCGCCCTGAGCGCTGTGCCTCGTCT CCGGAGCCACACGCGCTTTAAAAAGGAGGCAAGACAGTCAGCCTCTGGAAATTAGAC TTCTCCAAATTTTTCTCTAGCCCCTTTGGGCTCCTTTACCTGGCATGTAGGATGTGCC TAGGGAGATAAACGGTTTTGCTTTAGTTGTCGCCAAGGCAGTTCCCTTCCAAACTAGC GCTAGAGCGAATGAGCGAGCAGCCAGGACCACCCATTCTGGGTTTCCAACAGGCGA AAAGGCCCTTTCTGAGTTTGAAATGTCACAGGGTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAA AAAAAAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGCCCATGGGCATCTCCTTCCACCCTCACGCTGGCCCAGCAAGCAGGCAGTGCTGA GGCCTTATCTCCCTAGGTGACAGATGTGGTCAGGGAGGCGCAGAGAGGATGGGCAC TAGCGTCCAGCTCCTGGAACAGGTGTCAGGCAGGGAGGGCAGACAGGTCTTGGGGA ACATGTTCCCCTGGCTATGTGGACAGAGGACTTCTCAGTGGGGTCTCGCGACCCTGT GCCCCTTTTCCTGGTTCAGGGCAGCCCTTAGCCGGGGCAAAGGTCGAGAAGAGAAC CCCTGGTCGCCGCCCTGGCAGAATTTGAGTGGCTCCGGCAGGAGATGTCCCTAGGT TCCTGGGGAGGGAGGACGTCGGGGCCAGCCAGGCTTACCCCCCCCTGCCGCTGAG ACTTCTGCGCTGATGCACCGCGCCTCTTCGCGGTCTCCCTGTCCTTGCAGAAACTAG ACACAATGTGCGACGAAGACGAGACCACCGCCCTCGTGTGCGACAATGGCTCCGGC CTGGTG A continuación se presentan todos los pasos que se necesitarían realizar para codificar dicho fragmento de ADN, mediante la herramienta online conocida como BLAST: 1. En primer lugar, debes ingresar al sitio WEB del NCBI y seleccionar la opción BLAST.

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2. La página te direcciona a la sección BLAST, donde debes de accesar a la sección Nucleotide BLAST (BLAST de nucleótidos).

3. Debes alimentar el buscador con la secuencia de ADN (tal como la que se señala al inicio) que deseas comparar con las existentes en la base de datos del NCBI.

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4. Después de haberla ingresado, debes hacer clic en el botón BLAST ubicado en la parte inferior de la sección.

5. El análisis BLAST te entregará un cuadro con los alineamientos que encontró ordenados de mayor a menor en función del match score de cada secuencia. Las barras rojas representan las secuencias de la base de datos con mayor coincidencia, notarás que a la mitad de las franjas rojas hay una delgada línea gris, indicando que en esa zona se ubica una región donde no son compatibles, puede deberse a un cambio radical en la secuencia o a una deleción de nucleótidos.

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6. Seguido del cuadro con los alineamientos encontrarás un listado de todas las secuencias con las que tu secuencia problema hizo match, el programa te arrojará datos sobre la especie a la que pertenece la secuencia, qué es lo que codifica dicha secuencia y el porcentaje de coincidencia entre ellos.

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7. En las columnas de la derecha se observan el Max score y Total score que corresponden al grado de compatibilidad entre las secuencias comparadas; entre más grande sea el número existe mayor confiabilidad. A los scores le sigue el porcentaje de cobertura o query cover que indica el porcentaje de concordancia entre la secuencia problema y las secuencias de la base de datos, aparecen ordenadas de mayor a menor, de tal suerte que las primeras cuatro o cinco concordancias son las más parecidas. En el caso de este ejemplo, la primera tiene un porcentaje de 92% y corresponde a la alfaactina de humano. Finalmente, el e-value es un parámetro estadístico que le da validez al análisis, es de tipo logarítmico, por lo que entre menor sea “e” los resultados son más sólidos, en el ejemplo los primeros datos tiene una e = 0. De acuerdo con los datos de la búsqueda, la muestra de ADN que se analizó corresponde a la alfa-actina, una proteína presente en el músculo de humano. Lo cual concuerda con los síntomas reportados por el área médica, que hace mención de problemas musculares serios. Este paciente no puede formar adecuadamente la proteína muscular porque se encuentra mutada. De este modo pueden diagnosticarse de manera preliminar muchas patologías. La secuencia del gen que codifica para la actina 1 de Homo sapiens tiene la siguiente secuencia de ADN:

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CACCGCAGCGGACAGCGCCAAGTGAAGCCTCGCTTCCCCTCCGCGGCGACCAGGG CCCGAGCCGAGAGTAGCAGTTGTAGCTACCCGCCCAGGTAGGGCAGGAGTTGGGAG GGGACAGGGGGACAGGGCACTACCGAGGGGAACCTGAAGGACTCCGGGGCAGAAC CCAGTCGGTTCACCTGGTCAGCCCCAGGCCTGCGCCCTGAGCGCTGTGCCTCGTCT CCGGAGCCACACGCGCTTTAAAAAGGAGGCAAGACAGTCAGCCTCTGGAAATTAGAC TTCTCCAAATTTTTCTCTAGCCCCTTTGGGCTCCTTTACCTGGCATGTAGGATGTGCC TAGGGAGATAAACGGTTTTGCTTTAGTTGTCGCCAAGGCAGTTCCCTTCCAAACTAGC GCTAGAGCGAATGAGCGAGCAGCCAGGACCACCCATTCTGGGTTTCCAACAGGCGA AAAGGCCCTTTCTGAGTTTGAAATGTCACAGGGTTCCTAACAGGCCACTCTTCCCTGG ATGGGGTGCCAACGCCTTTCCCATGGGCATCTCCTTCCACCCTCACGCTGGCCCAGC AAGCAGGCAGTGCTGAGGCCTTATCTCCCTAGGTGACAGATGTGGTCAGGGAGGCG CAGAGAGGATGGGCACTAGCGTCCAGCTCCTGGAACAGGTGTCAGGCAGGGAGGG CAGACAGGTCTTGGGGAACATGTTCCCCTGGCTATGTGGACAGAGGACTTCTCAGTG GGGTCTCGCGACCCTGTGCCCCTTTTCCTGGTTCAGGGCAGCCCTTAGCCGGGGCA AAGGTCGAGAAGAGAACCCCTGGTCGCCGCCCTGGCAGAATTTGAGTGGCTCCGGC AGGAGATGTCCCTAGGTTCCTGGGGAGGGAGGACGTCGGGGCCAGCCAGGCTTACC CCCCCCTGCCGCTGAGACTTCTGCGCTGATGCACCGCGCCTCTTCGCGGTCTCCCT GTCCTTGCAGAAACTAGACACAATGTGCGACGAAGACGAGACCACCGCCCTCGTGTG CGACAATGGCTCCGGCCTGGTGAAAGCCGGCTTCGCCGGGGATGACGCCCCTAGG GCCGTGTTCCCGTCCATCGTGGGCCGCCCCCGACACCAGGTCAGGCTGC Recordarás que en la secuencia de ADN del paciente aparecen una serie de nucleótidos marcados en rojo, estos corresponden a una mutación que origina la patología del paciente. Como podrás darte cuenta, la bioinformática es un componente primordial de la genómica. Las bases de datos que hoy en día pueden consultarse de manera gratuita son producto del esfuerzo en conjunto de una enorme red de investigadores a nivel internacional que con sus aportaciones contribuyen al desarrollo de la ciencia global. En la página web del NCBI encontrarás gran número de aplicaciones que te permitirán profundizar en tus análisis genómicos tanto como tú quieras.

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Actividades La elaboración de las actividades estará guiada por tu docente en línea, mismo que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como los envíos que tendrán que realizar. Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BBM2_U1_A1_XXYZ, donde BB2 corresponde a las siglas de la asignatura, U1 es la unidad temática, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Autorreflexiones Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación. Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BBM2_U1_ATR _XXYZ, donde BBM2 corresponde a las siglas de la asignatura, U1 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno

Cierre de la unidad Como sabes, el ADN contiene toda la información necesaria para construir un organismo, es un polímero muy sencillo solo compuesto de cuatro nucleótidos en cuyo orden se centran las grandes diferencias entre una planta y un mamífero. Para poder descifrar los secretos del ADN primero debes tenerlo en tus manos, ahora ya conoces una serie de técnicas que te permiten extraerlo sin importar su origen, puedes también purificarlo para poder estudiarlo libre de detritos y así poder realizar análisis claros y precisos. Aprendiste también la técnica que revolucionó la biología molecular; la PCR, con la que puedes clorar millones y millones de secuencias hasta donde necesites e incluso puedes secuenciarlo, algo increíblemente útil para poder llevar a cabo análisis genómicos y detectar diferencias, variantes o anomalías genéticas. En este momento te encuentras listo para iniciarte en el campo de la biología molecular ¡felicidades!

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En la unidad siguiente podrás introducirte en el análisis de proteínas, las principales reguladoras de los procesos vitales de un organismo. No podemos separar completamente el estudio del ADN y el de las proteínas ya que estas últimas son producto de la doble hélice, si el ADN se ve afectado de alguna manera, lo estarán también las proteínas. Es por eso que ambas moléculas se encuentran ligadas y por lo tanto, a partir del análisis de una, podemos obtener información indirecta de la otra. Cuando abordes la segunda unidad podrás darte cuenta de que esta asociación tiene muchas implicaciones en la ciencia. Te exhortamos a que continúes avanzando con mucho empeño. ¡Éxito!

Para saber más

Para ahondar más en tus conocimientos sobre la biología molecular de los ácidos nucleicos se te recomiendan las siguientes lecturas de libre acceso para que identifiques las posibles aplicaciones de lo que has aprendido en esta unidad. 

Campuzano, V., González, A., Hernández, R., Suárez, F., Trigo, F. y Jaramillo, C. “Caracterización fenotípica y molecular de cepas de Pasteurella multocida aisladas de exudado nasal de bovinos, en dos cuencas lecheras de México”. Veterinaria México. 2011: 42 (1). En este artículo se aborda un problema de salud veterinaria mediante una variante de PCR con fines diagnósticos y de caracterización de elementos virales. Conocer las posibles aplicaciones de las técnicas que acabas de aprender te abrirá el panorama sobre los alcances de la biología molecular en la ciencia. Lo puedes consultar en: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S030150922011000100001&script=sci_arttext



González, U., Delfín, H., De la Cruz, M., Rojas, R. y Zamudio, M. “Protocolo para la extracción de ADN metagenómico bacteriano del langostino Macrobrachium carcinus L”. Tropical and Subtropical Agroecosystems. 2011: 14. 875-883. En esta

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publicación se presenta una forma alternativa para la extracción de ADN con fines comerciales y de diagnóstico. Lo puedes consultar en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=93921493015 

López, A., Maya, Y. y García, J. “Diversidad filogenética de especies de Microcoleus de costras biológicas de suelo de la península de Baja California, México”. Revista Mexicana de Biodiversidad. 2010: 81 (1). 1-7. Las técnicas de biología molecular son ampliamente utilizadas en el campo de la evolución y la filogenia, esta publicación es un ejemplo interesante de ello. Lo puedes consultar en: http://www.ejournal.unam.mx/bio/BIO81-01/BIO081000120.pdf

Fuentes de consulta

Bibliografía básica: 

  

Lodish, H. Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C., Krieger, M., Scott, M., Zipursky y Darnell, J. (2006). Biología Celular y Molecular. 5ª edición. México: Panamericana. ISBN: 10:950-06-1374-3 Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K y Walter, P. (2008). Biología Molecular de la Célula. 5ª edición. España: Omega. ISBN: 9788428215077 Solomon, E., Berg, L.R. y Martin, D.W. (2008). Biología. 8ª Edición. México: McGraw-Hill. ISBN: 978-84-282-1507-7 Curtis S., Barnes M. 2007. Biología. 7ª edición. México: Panamericana.ISBN: 978950-06-0447-5

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Bibliografía alternativa:  

Watson, J., Baker, T., Bell, S., Gann, A., Levine, M. y Losick, R. (2008). Molecular biology of the gene. 7ª edition. USA: Pearson. ISBN: 0-321-22368-3 Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R., Moore, D., Seidman, J., Smith, J. y Struhl, K. (2002). Short protocols in molecular biology. 5ª edición. USA: Wiley. ISBN: 100471250929

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