Unidad 2. Biología molecular de proteínas by Jazina Ruiz Hernández

Programa de la asignatura:

Biología molecular II

Biología molecular de proteínas

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Índice Presentación de la unidad ......................................................................................................... 2 Propósitos.................................................................................................................................. 2 Competencia específica ............................................................................................................ 3 2.1. Obtención de proteínas ...................................................................................................... 3 2.1.1. Extracción de proteínas................................................................................................... 4 2.1.2. Purificación de proteínas ................................................................................................. 9 2.2. Análisis de proteínas ........................................................................................................ 11 2.2.1. Electroforesis y su aplicación en el análisis de proteínas ............................................. 12 2.2.2. Cuantificación de proteínas ........................................................................................... 16 2.3. Caracterización de proteínas ........................................................................................... 18 2.3.1. Secuenciación de proteínas .......................................................................................... 19 2.3.2. Western blot .................................................................................................................. 22 2.3.3. Proteómica .................................................................................................................... 23 Actividades .............................................................................................................................. 28 Autorreflexines......................................................................................................................... 28 Cierre de la unidad .................................................................................................................. 28 Para saber más ....................................................................................................................... 29 Fuentes de consulta ................................................................................................................ 30

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Presentación de la unidad Como ya sabes, las proteínas son biomoléculas compuestas por una cadena de aminoácidos, el orden y el tipo de estos dependerá de la secuencia del genoma. Las proteínas tienen la capacidad de catalizar reacciones químicas, algunas son parte del metabolismo de los seres vivos, otras lo pueden hacer fuera de sistemas vivos por lo que tienen un interés industrial. Por su importancia en el metabolismo también despiertan el interés médico, ya que a través de la comprensión de su papel biológico pueden explicarse deficiencias, anomalías o patologías de los seres vivos. Por lo anterior, resulta especialmente importante estudiar las proteínas, no solo a nivel químico sino a nivel molecular. Al respecto, la biología molecular ha avanzado enormemente en su estudio, arrojando información valiosa tanto a nivel médico como industrial. Esta unidad te introducirá en el estudio de las proteínas desde la óptica de la Biología molecular, por lo que conocerás algunas de las técnicas básicas para su estudio y fortalecerás tu conocimiento y capacidades como biotecnólogo. ¡Bienvenido!

Propósitos

El estudio de esta unidad te permitirá:  Identificar algunas de las técnicas más utilizadas para el análisis de proteínas.  Analizar la aplicación de las proteínas en el campo de la biotecnología.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Competencia específica

Relacionar los procesos genéticos con la manipulación de proteínas, mediante el análisis de las técnicas de biología molecular para reconocer sus aplicaciones en el campo de la biotecnología como la producción de proteínas, enzimas, anticuerpos y análisis proteómicos.

2.1. Obtención de proteínas Al considerar que la función de todos los genes de un genoma es almacenar la información para sintetizar proteínas, es posible darse una idea de la importancia que éstas tienen en el metabolismo y en el mantenimiento de la vida misma. En ese sentido los genes solo sirven para hacer proteínas, moléculas tan versátiles que son las responsables de construir a un ser vivo y mantenerlo con vida; esto es porque están presentes en cada proceso metabólico y reacción química de los organismos, la fisiología entera depende de ellas, de ahí la importancia de estudiarlas a fondo. Las proteínas son el reflejo del metabolismo, si trabajan bien se conserva la homeostasis, pero cuando hay alguna falla la homeostasis se pierde y eventualmente puede perderse la vida. Al monitorear su actividad, concentración y tiempo de vida, es posible darse una idea de cómo funciona un organismo en condiciones normales y tener una referencia para estudiar a un organismo en condiciones “no normales” por ejemplo en estrés o enfermedad, incluso bajo la influencia de alguna sustancia tóxica o un fármaco, por mencionar algunos.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Figura 1. Diversidad de proteínas. Fuente: Las proteínas.org, s.f.

En este primer tema de la unidad revisarás algunos de los procesos de extracción y purificación de proteínas más utilizados en la investigación científica y en la industria.

2.1.1. Extracción de proteínas Para poder realizar cualquier estudio relacionado con proteínas es necesario obtenerlas en una fase soluble, las proteínas siempre están en asociación, ya sea con otras proteínas o con elementos como la membrana celular. La obtención de un extracto proteico de calidad permitirá el buen desempeño de estudios posteriores, como la purificación de alguna proteína de interés con alto rendimiento, a continuación conocerás un método práctico y eficiente para extraer proteínas de células eucariontes. La extracción de proteínas a partir de tejido animal es relativamente sencilla, ya que las células solo están delimitadas por la membrana, que es una estructura frágil, lo cual permite la aplicación de métodos de extracción más gentiles para las proteínas que se desean estudiar. Lo anterior, en comparación con la dura pared celular de las células vegetales o bacterianas. Los extractos crudos de tejido animal pueden entonces, ser sometidos a procesos de centrifugación. Si la proteína se encuentra embebida en un organelo en particular, como la mitocondria o el núcleo, la centrifugación diferencial o por gradiente de velocidad,

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

permite aislar el organelo de interés y posteriormente a la proteína (Alberts et al. 2008). En el siguiente esquema se muestra el proceso.

Figura 2. Esquema de una separación basada en la diferencia de velocidad de sedimentación. Fuente: Alberts et al; 2008.

Es necesario diluir la muestra en una solución de sacarosa en un gradiente de 5 a 20%, los organelos y demás componentes subcelulares se sedimentarán en función de su tamaño a diferentes velocidades. Con este método los componentes celulares pueden colectarse en tubos por separado. Un caso particular son las proteínas integrales de membrana, por lo general, estas proteínas son altamente hidrofóbicas y por consiguiente están unidas a la membrana fuertemente, cuando se pretende analizar proteínas de este tipo resulta conveniente seguir un protocolo que tome en consideración la hidrofobicidad de las proteínas. En este caso, pueden ser extraídas mediante la disrupción de la bicapa lipídica con detergentes o disolventes orgánicos como alcoholes, entre otros (Cutler, 2004); una práctica que ya te es familiar.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Figura 3. Ejemplo de proteínas integrales de membrana. Fuente: Pulgarin, A., 2010.

Como se observa en la imagen, las proteínas integrales de membrana son de alto peso molecular, la porción de estas proteínas que están inmersas en la membrana es de carácter altamente hidrofobico, esta característica hace muy complicada su extracción. En realizar dicho proceso de extracción, la función del detergente es unirse a la membrana para disolverla formando un complejo detergente-lípido de membranaproteína, este complejo puede solubilizarse nuevamente para liberar a las proteínas que sean de interés. El objetivo principal de cualquier método de extracción es lograr el máximo grado de disrupción del tejido del que se van a extraer las proteínas utilizando la menor cantidad de fuerza posible. Para ello, existen muchos métodos que pueden cumplir esta característica, el que se te presenta a continuación resulta muy práctico y puede llevarse a cabo en cualquier laboratorio de investigación. (Cutler, 2004; trad. Díaz M. A., 2013).

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

1. Remover el exceso de grasa, tejido conectivo y vasos sanguíneos de la muestra de tejido, de forma manual, ayudándote con un bisturí o tijeras de disección, para posteriormente seccionarla en fragmentos de uno o dos gramos de peso.

2. Colocar el tejido limpio y seccionado en un vaso o contenedor frío y agregar buffer de extracción frío en proporción 2/2.5 volumen de buffer/peso de la muestra: 0.25 M sucrose, 1 mM EDTA, amortiguado en buffer Tris, MOPS, HEPES, and Tricina pH 7.0–7.6 (Si lo que se pretende es la purificación de proteínas nucleares no se emplea EDTA. Se sustituye por KCl y MgCl2).

3. La muestra se homogeniza a máxima velocidad por lapso de 1-3 minutos.

4. Tras la centrifugación, se remueven de la muestra los detritus celulares y cualquier partícula por centrifugación a 4°C a 3000 G por 30 min. Pasado el tiempo, puede decantarse el sobrenadante teniendo cuidado de no agitar la pastilla formada, así se evita que se resuspenda. Figura 4. Ejemplo de método de extracción.

Con estos cuatro pasos sencillos puede obtenerse un extracto proteico de buena calidad listo para el análisis de proteínas. Método de congelación y descongelación para extracción de proteínas Cuando las proteínas van a ser sometidas a un proceso de electroforesis bidimensional deben extraerse de un modo que se minimice al máximo su desnaturalización, y donde los reactivos empleados para ello no alteren de forma significativa o definitiva la estructura Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

química de las proteínas. Para esos casos, un método particularmente útil es el de congelación y descongelación. Este método de extracción es ideal, ya que es rápido y eficiente, los reactivos que se emplean son muy sencillos de preparar y no interfieren con las propiedades fisicoquímicas de las proteínas, algo necesario cuando se pretende realizar una electroforesis bidimensional. El proceso de extracción se realiza de la siguiente manera (Cutler, 2004; trad. Díaz M. Alfredo, 2013): 1.- Partiendo de una suspensión celular, la muestra se centrifuga a 1200 rpm a 4°C por 4 minutos, desechando el sobrenadante, en el fondo del tubo se formará un paquete celular o pellet que es necesario lavar re-suspendiéndolo en 50 ml de PBS 1X pH 6.8 a 4°C, para centrifugarlo nuevamente con el mismo esquema. Este procedimiento se realiza tres veces. Al terminar el segundo lavado se toma un alícuota de 10 µl de la suspensión celular para realizar un conteo con una cámara de Neubauer. 2.- Al concluir los tres lavados se retira la mayor cantidad posible de PBS y se resuspende el paquete celular, agregando 1ml de tris 100mM a 4°C por cada 15X106 células presentes paquete celular, este dato corresponde al conteo celular realizado en el segundo lavado. Posteriormente, es importante agregar inhibidores de proteasas. 3.- Como recordarás, las proteasas son enzimas que degradan otras proteínas, si no se inactivan con inhibidores degradarán toda la muestra, dejándola inservible. Existen muchos inhibidores de proteasas, las casas farmacéuticas cuentan con algunas marcas comerciales, pero el más utilizado es el sistema complete de roché, que ofrece una serie de inhibidores que inactivan a una gran variedad de proteasas, brindando protección a las muestras. En este caso, se adicionan 30µl de inhibidores de proteasas complete, más 1ml de E64 100 mM por cada15X106 células, y 15 µl de PMSF 100 mM. 4.- Tras agregar los inhibidores de proteasa es necesario congelar la muestra inmediatamente con hielo seco por un mínimo de cinco minutos (puede utilizarse hidrógeno líquido; sin embargo, para tal efecto se requiere contar con cierta infraestructura especial para el adecuado manejo del nitrógeno líquido), posteriormente resuspender con un vórtex a velocidad máxima el tiempo suficiente para descongelar totalmente la muestra; esto puede observarse a simple vista, ya que la muestra descongelada tiende a tornarse espumosa. 5.- Este procedimiento de congelación y descongelación se realiza tres veces. Al finalizar la última congelación, los tubos deben centrifugarse por 10 segundos a 1200 rpm para concentrar todo el contenido en el fondo del tubo. 6.- Para hacer más fácil el manejo del extracto, puede alicuotarse en tubos Eppendorf en volúmenes de 50-250 µl. una vez alicuotado el extracto, debe congelarse a -80°C para preservarlo y garantizar que las proteínas no se desnaturalizarán. Existe la posibilidad de almacenarlas a -20°C, sin embargo, a esta temperatura solo se conservan por unos cuantos meses.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

En relación a los procedimientos revisados, es importante que tomes en cuenta el origen de la muestra para poder elegir un método que te permita llevar a cabo una extracción de proteínas de calidad, con proteínas íntegras y abundantes. De esta forma podrás trabajar de manera eficiente y tus resultados serán confiables y sin ningún tipo de interferencia metodológica o errores estadísticos. Recuerda que el paso más importante es este, si extraes proteínas con cuidado toda tu investigación tendrá el rumbo que hayas predicho.

2.1.2. Purificación de proteínas Los extractos totales, además de las proteínas que sean de interés contienen deshechos celulares, como restos de membrana y ácidos nucleicos, entre otros. Al respecto, para estudiar las proteínas se requiere que los extractos estén limpios y libres de otras sustancias para evitar posibles interferencias en estudios posteriores. Para ello, los extractos deben limpiarse o lavarse, pues básicamente un extracto total de proteínas es bastante similar a un licuado.

Figura 5. Licuado de proteínas. Fuente: Portal de vegetarianos.com, 2013.

Existen muchos métodos para limpiar los extractos, incluso existen kits comerciales para limpieza de proteínas, que si bien son altamente eficientes resultan muy caros, en comparación con otros métodos llamados “caseros” que se basan en el uso de sustancias como disolventes orgánicos para limpiar las proteínas. Cuando estos métodos son bien empleados resultan igual de eficientes que los kits y su costo es mucho más económico; un ejemplo de ello es el método de limpieza que emplea acetona, metanol y cloroformo. Método de limpieza de proteínas con acetona, metanol y cloroformo Para iniciar la limpieza de proteínas, (Walker, 2002; trad. Díaz M. Alfredo, 2013), se debe:

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

•Agregar a cada alícuota: 200 µl de buffer de hidratación (Urea 7M, Tiourea 2M, Chaps 4%, DTT 40 mM, llevar el volumen a 25 ml con agua miliQ), los tubos se agitan en un agitador horizontal a temperatura ambiente por un lapso de 30-60 minutos a una velocidad de 30 rpm.

•Posteriormente, el extracto se centrifuga a 12000rpm / 5min / 4°C para separar la fracción proteica y se recupera el sobrenadante, en tubos falcon, después se agregan 8 volúmenes de acetona fría (4°C) (es decir, si tienes un mililitro de extracto, agregas ocho mililitros de acetona fría) y se enfrían por cinco minutos a -20°C y agitándose con un vortex por 15 segundos a máxima potencia. La centrifugación y el lavado con acetona fría se realiza 3 veces.

•Después de los tres ciclos de enfriamiento y centrifugación, los tubos se centrifugan a 4000rpm/5min/4°C y se cambia el acetona cuidando de no desechar la pastilla, y se aplica un vortex para deshacerla, este proceso de lavado se realiza 3 veces.

•La pastilla se resuspende en un volumen de 500-1000 µl de acetona fría y se desecha el sobrenadante, el botón obtenido se seca al aire por 3 minutos y se resuspende en 250µ de buffer de muestra con 15 µl de coctel inhibidor de proteasas complete.

•Al finalizar el lavado con acetona, los extractos se lavan con metanol y cloroformo, para lo cual se colocan 250 µl del extracto en un tubo Eppendorf, y se agregan 800µl de metanol y se agita para homogenizar; se le adiciona 300 µl de cloroformo agitando para incorporar la mezcla y se agrega 450 µl de H2O mili-Q. Se homogeniza agitando con un vortex por 10 segundos a máxima potencia. •Los tubos se centrifugan a 12000 rpm / 5min / 4°C, se elimina cuidadosamente con una pipeta la fase superior teniendo cuidado de no extraer o dañar el disco blanco formado entre las dos fases ya que este contiene las proteínas limpias.

Figura 6. Método de limpieza de proteínas con acetona, metanol y cloroformo.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Figura 7. Disco de proteínas. Fuente: Biology Reference, 2013.

En la imagen se observa el disco que se obtiene durante el proceso de limpieza, recuerda que es importante no dañarlo, pues como se ha dicho contiene la totalidad de las proteínas que se pretende estudiar. Una vez que… Se añade 450 µl de metanol, se agita en un vortex a máxima potencia por cinco segundos para homogenizar, se centrifuga a 12000rpm / 5 min / 4 °C, se decanta el sobrenadante y se seca el botón al aire por 2 minutos. Se disuelve la pastilla en 230 µl de buffer de hidratación y 20µl de coctel inhibidor de proteasa complete, finalmente se agita suavemente por 30-60 minutos a 4°C. Con esto quedan limpias las proteínas para poder realizar cualquier otro procedimiento. Pareciera un protocolo complicado, sin embargo, es todo lo contrario.

2.2. Análisis de proteínas Ahora que ya conoces lo referente a la extracción y purificación de las proteínas, ha llegado el momento de continuar con el siguiente paso en el proceso de análisis de proteínas. En relación a ello, ten presente que obtener un extracto proteico es sólo el inicio del análisis de proteínas, a fin de cuentas se trata de una mezcla de cientos de proteínas con propiedades fisicoquímicas diferentes y, hasta ahora, es lo único que sabes. Se desconoce cuántas proteínas diferentes están presentes en el extracto, no se saben sus pesos moleculares, ni siquiera se tiene la seguridad de que hayan conservado su integridad.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Las proteínas son moléculas termosensibles y pueden ser afectadas seriamente por tratamientos térmicos o por degradación enzimática. Si una proteína se desnaturaliza (pierde su estructura terciaria o configuración tridimensional) o se degrada por efecto químico o de las proteasas se torna inservible. Es primordial corroborar que las proteínas que se extraen estén íntegras para posteriormente poder separarlas o purificarlas (Brandemberg et al., 2011). Para llevar a cabo la separación y purificación de las proteínas, la electroforesis de proteínas resulta de gran utilidad como primer acercamiento en el análisis de proteínas ya que permite determinar la calidad de las proteínas, además de brindar información importante como la cantidad de éstas, su peso molecular, punto isoeléctrico, entre otros. De acuerdo con lo anterior, el objetivo de este segundo tema de la unidad es introducirte en el análisis preliminar de proteínas.

Figura 8. Determinación de proteínas en orina, una práctica común en el diagnóstico de patologías renales. Fuente: Esmas.com, 2013.

2.2.1. Electroforesis y su aplicación en el análisis de proteínas La electroforesis es un proceso que permite la separación de una mezcla de moléculas mediante la aplicación de un campo eléctrico, en presencia de este campo las moléculas en disolución se desplazarán en función de su carga hacia el polo contrario y de acuerdo a su peso lo harán más rápido o más lento. Así, las moléculas cargadas positivamente migrarán hacia al polo negativo y las negativas hacia el polo positivo, en este arreglo, las moléculas ligeras se orientarán más rápido que las más pesadas (Lodish et al, 2004).

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

La mayoría de las proteínas pueden tener carga global positiva o negativa, como suma de las cargas de los elementos que las conforman, si se encuentran en disolución (como en un extracto total) y se aplica un campo eléctrico, estas migrarán en función de su carga, la velocidad de migración dependerá del tamaño o peso molecular que tengan. La variante de electroforesis más utilizada para separar proteínas es la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (dodecil sulfato de sodio o SDS-PAGE polyacrylamide-gel electrophoresis) un potente detergente con carga negativa. El gel de poliacrilamida sirve como matriz a través de la cual migran las proteínas en presencia de una carga eléctrica, los poros de su interior forman una maya uniforme que brinda una resistencia homogénea a la migración de las proteínas en todo el gel, esto permite que la medición de dicha migración de acuerdo a su peso molecular sea real y reproducible, características muy importantes en la investigación científica. Existen muchos protocolos o recetas para preparar un gel de poliacrilamida, dependerá de la información que quieras obtener de las proteínas, En cualquier libro de las fuentes de consulta utilizadas para desarrollar este curso encontrarás las recetas para preparar el gel; sin embargo, a continuación se te presenta el protocolo para preparar un gel al 10% de poliacrilamida, uno de los más usados.

Reactivo

Gel separador (10%) 4 ml

Gel concentrador (4%) 3.4 ml

Agua Acrilamida / bisacrilamida 3.3 ml 29:1 Tris 1.5 M pH 8.8 (separador)/ 6.8 2.5 ml (concentrador) SDS 10% 100 µl PSA 10% 100 µl TEMED 4 µl Tabla 1. Preparación de gel de poliacrilamida al 10%.

830 µl 630 µl 50 µl 50 µl 5 µl

Es recomendable que busques en la red y revises el video denominado SDS-PAGE Gel electrophoresis de Kasap, M. y Akpinar, G., s.f., en el cual se observa el procedimiento para elaborar este gel, de forma completa y detallada.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

La electroforesis de ADN y de proteínas tiene el mismo principio, se lleva a cabo en una cámara que contiene una solución amortiguadora cuyos iones disueltos permiten la conducción eléctrica que brindan los electrodos adosados a la cámara, que son alimentados por una fuente de poder que normalmente administra una corriente de 100V / 90mA por un tiempo de 90 minutos en una electroforesis estándar, estos parámetros pueden variar en función de lo que se pretenda realizar, del tamaño del gel, entre otros. (Watson, 2008; Solomon, 2008). En el siguiente esquema puedes ver el proceso de manera gráfica.

Figuro 9. Electroforesis. El gel se posiciona en una cámara para electroforesis en presencia de buffer para cerrar el circuito. Las muestras se cargan en el gel y se aplica una corriente eléctrica, las muestras migrarán a lo largo del gel en función de su carga y de su peso molecular o tamaño. Fuente: Silva, L. A., 2012.

La función de SDS dentro del sistema es unirse a las porciones hidrofóbicas de las proteínas haciendo que las cadenas polipeptídicas se plieguen; es decir, que se linearicen perdiendo su estructura terciaria, ya que las diferentes asociaciones entre los aminoácidos se pierden por acción del detergente, el beta-mercaptoetanol que funciona como agente reductor rompe los puentes disulfuro y la temperatura (Alberts et al. 2008). Observa la secuencia del proceso en la siguiente imagen.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Figura 11. Efecto de la temperatura, SDS y beta-mercaptoetanol sobre la estructura protéica y su interacción con proteínas globulares en la electroforesis SDS. Fuente: Biomodel, s.f.

El sistema electroforético queda funcional cuando cada proteína se une a cierta cantidad de moléculas del detergente (SDS), no olvides que este se encuentra cargado negativamente, al quedar la proteína cubierta en su totalidad por SDS la carga parcial natural de la proteína queda enmascarada por la carga negativa del detergente, de esta manera no importa que carga real tenga la proteína, al quedar recubiertas por una carga negativa del SDS todas migrarán hacia el lado positivo de la cámara sin importar su carga. La electroforesis SDS es muy utilizada, ya que es capaz de separar todos los tipos de proteínas, incluyendo las insolubles en agua (hidrofóbicas) (Alberts et al. 2008).

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Figura 12. Imagen real de un gel de proteínas teñido con azul de Coomassie, en el carril de la izquierda se aprecia el marcador de peso molecular con el valor de cada banda el kilodaltones (kD), en los carriles siguientes se corrieron extractos proteicos totales de Entamoeba histolytica.

2.2.2. Cuantificación de proteínas Siguiendo con el tema del análisis proteico, saber la cantidad de proteína presente en una muestra es muy importante porque conocer este parámetro permite la estandarización de los procedimientos y hacer comparaciones. Por ejemplo, si se está evaluando el efecto de un fármaco sobre la síntesis de una proteína en tres condiciones, se necesita estandarizar la cantidad de proteína para hacer los comparativos, de lo contrario los resultados serían muy subjetivos. Se sabe que toda la materia es capaz de interactuar con la luz, cuando un haz de luz choca con un cuerpo, este absorbe el haz de luz a una longitud de onda X y lo refleja a una longitud de onda Y. Este fenómeno es muy común, ya que en él se basa nuestra visión a color. La luz del sol abarca todo el espectro visible; por ejemplo, cuando un rayo de luz choca con las hojas de un árbol, estas absorben toda la longitud de onda menos la verde, que se refleja y es la que nuestros ojos captan. Esta capacidad de absorber y reflejar la radiación electromagnética que compone la luz es inherente a toda la materia incluyendo las proteínas, y puede ser empleada para, por ejemplo ¡hacer cuantificaciones! Existen muchos métodos para cuantificar proteínas, incluso hay kits comerciales para tales efectos. El método más utilizado por sencillo, rápido y económico es el método de Bradford, conocido así en honor a la científica que lo desarrolló Marion M. Bradford, un método espectrofotométrico-colorimétrico que depende de la cuantificación de la unión de un colorante, el azul de Coomassie a una serie de diluciones proteicas de concentración conocida denominadas estándares. Por lo general se utiliza la albúmina sérica bobina o BSA para preparar los estándares a partir de los cuales se construye una curva patrón con la que puede calcularse la concentración de una muestra de proteínas desconocida (Ausubel, 2002).

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

La curva patrón de construye mezclando los reactivos en tubos Eppendorf de q.5 ml de la siguiente forma: Curva patrón para cuantificación de proteínas Tubo

Muestra

BSA

2.5µl

5µl

7.5µl

10µl

12.5µl

5µl

NaCl 0.15M

100 µl

95µl

90µl

85µl

80µl

75µl

95µl

Bradford

1 ml

Vol. final

1.1 ml

Tala 2. Curva patrón para cuantificación de proteínas. Fuente: Ausubel, 2002; trad. Díaz M. Alfredo, 2013.

En la tabla anterior, los tubos 1-6 corresponden a los estándares, cada uno tiene una concentración conocida de albúmina, desde los 2.5 hasta los 12.5 microlitros, con cada uno de estos, incluyendo el blanco (tubo 1) se calibra un espectrofotómetro para construir la curva patrón, el aparato guardará en su memoria cada una de las seis concentraciones de proteína que corresponden a seis puntos de la curva patrón. Una vez calibrada la curva, se procede a leer la muestra en el espectrofotómetro, el aparato registrará la absorbancia y la asociará a algún punto de la curva, al extrapolarla es posible calcular con una exactitud del 99.9% la concentración de la proteína en estudio.

Figura 13. Estándares. Fuente: Bio-Rad, s.f.

Figura 14. Espectrofotometro. Fuente: BioRad, s.f.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

En las imágenes se aprecia una serie de estándares para realizar una curva patrón con albúmina, cada cubeta está llena con una mezcla de proteína de concentración conocida y reactivo de Bradford, entre más oscura es la solución más concentración de proteína hay en la muestra, las cubetas se ingresan al espectrofotómetro para ser registradas y construir la curva patrón.

Es recomendable que busques en la red el video Protein Quantification (OD280). s.f. En él encontrarás más información sobre la elaboración de una curva patrón para cuantificar proteínas.

2.3. Caracterización de proteínas La caracterización de proteínas se puede mencionar que son el resultado final de la maquinaria genética de una célula, en el ADN se encuentran almacenados todos los genes de un individuo, cuando algún proceso fisiológico lo requiere se inicia la síntesis de alguna proteína en particular, para esto, la maquinaria genética ubica la posición del gen que la codifica dentro del genoma y lo transcribe en ARNm, éste viaja hacia los ribosomas donde son traducidos a proteínas, que como sabes son una secuencia de aminoácidos. La función de la proteína depende del plegamiento tridimensional que tenga la cadena peptídica y desde luego, de la secuencia de aminoácidos. Una alteración en esta secuencia y la proteína puede perder la totalidad de su función, a esto se conoce como mutación, las mutaciones pueden implicar un cambio parcial o total de la función biológica de la proteína y pueden abarcar la alteración de un solo aminoácido o de unos cuantos; lo cual puede tener su origen a nivel del ADN, o ser un error de transcripción del ARN. Cualquiera que sea el caso, la mutación cambiará de manera irreversible la secuencia de aminoácidos. Por otro lado, de manera natural una célula puede generar variantes de una proteína gracias a un proceso conocido como splicing alternativo, donde a partir de un solo ARNm pueden obtenerse isoformas o variantes de una proteína. El splicing no es una mutación, obedece más bien a una estrategia evolutiva para brindar más plasticidad y dinamismo al genoma.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Figura 15. Secuencia de aminoácidos de una proteína, cada aminoácido está representado por un círculo de colores. Fuente: Gómez, L. A., 2011.

Durante la realización de una investigación en particular, para identificar isoformas o formas mutadas de una proteína se debe conocer la secuencia de aminoácidos que la conforman para poder hacer comparaciones entre secuencias y así determinar el nivel de diferencia entre las proteínas que se están comparando. La forma más fácil de identificar estas diferencias es secuenciando las proteínas para conocer qué aminoácidos la componen y el orden de estos; ya que en conjunto los aminoácidos y su orden determinan la estructura tridimensional de la proteína, sus características fisicoquímicas y desde luego su función. En relación a esto último, en este tercer tema de la unidad abordarás las generalidades de los procesos de secuenciación de proteínas, western blot y proteómica.

2.3.1. Secuenciación de proteínas En el trabajo de laboratorio… secuenciar una proteína implica determinar los aminoácidos que la conforman y el orden en el que están enlazados de acuerdo con el código genético; el primer aminoácido de una proteína por lo general es la metionina, a ésta le siguen los aminoácidos que están determinados en la secuencia de ARNm.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Figura 16. El código genético. Fuente: Genes.com, 2011.

En la imagen se puede observar como el ARNm está ordenado por codones, cada codón corresponde a una tercia de nucleótidos que determinan a un aminoácido. El codón AUG del ARNm corresponde a la metionina, los codones UAA, UAG, UGA corresponden a los codones de paro de la síntesis de la proteína. Hoy en día los grandes laboratorios de investigación han desarrollado complejos aparatos que pueden secuenciar una proteína de manera relativamente sencilla, y todos tienen como fundamento una técnica conocida como degradación de Edman, desarrollada por el bioquímico sueco Pehr Edman. En esta técnica, el grupo N-terminal libre de la secuencia peptídica se marca adicionando una molécula de prenil isotiocianato, cuando este ácido interactúa con el extremo amino terminal induce la ruptura del enlace peptídico quedando libre en un sistema líquido que puede ser analizado mediante HPLC o cromatografía de líquidos de alta resolución. De este modo los aminoácidos de una proteína son identificados uno a uno a partir del extremo amino terminal libre. El procedimiento de esta técnica a grandes rasgos es como sigue: Las muestras son solubilizadas para posteriormente ser bombeadas a presión en un muestreador automático, que conduce la muestra a través de una columna que funciona como fase estacionaria, la muestra llega hasta un analizador donde es irradiada con un haz de luz a una longitud de onda determinada y se registra la transmitancia de la muestra; este dato corresponde a cada uno de los aminoácidos, los datos son procesados por una

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

computadora que entrega un cromatograma, que es un gráfico especial donde se observa cada uno de los componentes de una mezcla y su abundancia.

Figura 17. Diagrama de flujo de un análisis por HPLC. Fuente: Specialty Gases & Specialty Equipment, 2008.

Figura 18. Cromatógrafo convencional. Fuente: Estación Experimental del Zaídin, s.f.

El sistema de HPLC arroja un registro conocido como cromatograma, una serie de gráficos donde cada pico corresponde a un aminoácido, el orden en el que aparecen corresponde a la secuencia del péptido en particular que se está analizando.

Figura 19. Cromatograma obtenido mediante HPLC. Fuente: Malaver, L. F., 2009.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Para revisar un ejemplo de HPLC, es recomendable que investigues y veas el video High Performance Liquid Chromatography HPLC de la RCS.org. s.f. Traducido y subtitulado al español por Fernández, J. y Tassino, I.

2.3.2. Western blot Como sabes, las proteínas en general son las mejores estimulantes del sistema inmune, cuando un organismo es infectado por un patógeno, por ejemplo una bacteria o un virus, el sistema inmune lo captura y destruye, como resultado los linfocitos B producen anticuerpos específicos contra las proteínas del organismo invasor, estos anticuerpos reconocen únicamente a las proteínas para las cuales fueron diseñados acoplándose a ellas “marcándolas” para ser reconocidas por otras células fagocíticas del sistema inmune como macrófagos o linfocitos T, especialistas en destruir estos parásitos. A groso modo, así se desarrolla una respuesta inmune típica; al respecto la ciencia ha copiado el proceso natural para desarrollar una técnica especializada en el reconocimiento de proteínas conocida como Western blot. El Western blot parte de un gel de poliacrilamida donde se han separado electroforéticamente una mezcla de proteínas, estas proteínas son transferidas eléctricamente a una membrana de nitrocelulosa; la transferencia se lleva a cabo en un sistema acuoso (provisto por el buffer de electroforesis común) y una corriente eléctrica bajo el mismo principio que la electroforesis, las proteínas migrarán del gel hacia la membrana conservando la misma posición que tenían en el gel original.

Figura 20. Transferencia de proteínas a una membrana como parte del western blot. Fuente: Bensaccount, 2009.

Una vez en la membrana, las proteínas son expuestas a una solución que contiene anticuerpos específicos contra dichas proteínas, a estos se les conoce como anticuerpos

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

primarios. Tras la primera interacción la muestra es lavada para eliminar cualquier rastro de anticuerpo primario para ser expuesta a una segunda solución con anticuerpos secundarios, éstos están diseñados para reconocer específicamente a los anticuerpos primarios, el anticuerpo secundario está acoplado a una enzima, cuando se agrega el sustrato de dicha enzima se lleva a cabo una reacción colorimétrica que permite observar la interacción, que en la membrana aparecerá como una banda que señala la presencia de una proteína, la intensidad y el grosor de la banda están relacionadas con la concentración de la proteína que se está estudiando (Lodish, 2004, Cutler, 2004).

Figura 21. Detection in Wester Blots. (Detección en Western Blots). Fuente: Leinco Technologies, Inc., 2013.

Dada la alta especificidad de los anticuerpos no hay posibilidad de tener efectos cruzados, como se muestra en la imagen anterior; es decir, que reaccionen con otras proteínas de manera inespecífica, su capacidad de detección es tal que El Western Blots, es una técnica grandemente utilizada en la investigación científica (Lodish, 2004; Alberts, 2008).

2.3.3. Proteómica A las proteínas que son expresadas por un genoma en un tejido o en una célula se les conoce como proteoma, lo interesante de los proteomas es que son dinámicos y cambian cuando las condiciones ambientales lo hacen, por ejemplo, cuando se administra un fármaco o una sustancia tóxica o cuando se está atravesando por un proceso patológico o por estrés. Al estudio de los proteomas se le conoce como proteómica y ofrece una panorámica global de la síntesis de proteínas totales de un organismo bajo una condición en particular. La información que provee sobre los cambios de expresión de una o varias proteínas resulta valiosa para entender de forma sistémica los cambios metabólicos que experimenta un individuo. Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

La técnica es ampliamente utilizada para identificar nuevos blancos para fármacos, por ejemplo, si se tiene una sustancia que resulta dañina en alguna medida para un parásito, al ser tratado con esta, pueden extraerse sus proteínas y mediante el análisis proteómico identificar cuales proteínas fueron hipoexpresadas, hiperexpresadas, inducidas de novo o depletadas por completo. Tras secuenciar las proteínas afectadas se puede determinar si éstas pertenecen a la maquinaria genética, al metabolismo energético, al citoesqueleto, al mecanismo de reparación o de control del ciclo celular, por mencionar algunos y así elegir al mejor blanco para dirigir un tratamiento contra un patógeno (Alberts, 2008). Para poder llevar a cabo un análisis proteómico primero es necesario separar las proteínas de interés mediante electroforesis bidimensional o 2D. La electroforesis tradicional separa a las proteínas en una sola dimensión, el peso molecular; por el contrario la electroforesis 2D, las separa primero por punto isoeléctrico y posteriormente por peso molecular. El punto isoeléctrico es aquel pH al cual la carga neta de una proteína es igual a cero. Las proteínas son moléculas cargadas positiva o negativamente gracias a los elementos que las conforman, elementos y grupos como: N+, COO-, NH3+, H+ y OH-, S y P. Las cargas que aportan estos elementos y compuestos, determinan el pH de una proteína y puede ser ácido o básico. Cuando dichas proteínas interactúan con un gradiente de pH éstas tenderán a migrar hacia el punto que corresponda al pH que neutralice sus cargas. Para lograr este efecto, una vez más es necesario recurrir a la electroforesis, la generación de un campo eléctrico es crucial para separar a las proteínas de acuerdo a su pH, las proteínas ácidas tendrán carga positiva, mientras que las básicas tendrán negativa (Alberts, 2008, Cutler, 2004). Al hablar de electroforesis evidentemente están implícitos, como ya sabes, un sistema amortiguador en estado líquido, un campo eléctrico y desde luego un gel. Éste último tiene características muy especiales, a tal grado que lo mejor es adquirirlos de alguna casa comercial de productos para investigación, consta de una tira plástica delgada, que sirve de soporte para un gel de poliacrilamida el cual se copolimeriza con inmovilinas y anfolinas; las anfolinas componen el buffer en el que se diluirán las proteínas y definen el rango de pH en el que estas van a separarse por punto isoeléctrico, las más comunes son las que tienen un rango de pH de 3-13, 4-7 y 5-8. Las inmovilinas mantienen a las anfolinas inmóviles en el gel para que no se muevan del rango de pH que tienen, a estas tiras se les conoce como tiras IPG o tiras de Gradiente de pH inmovilizado y las hay en tamaño de 7 y 13 cm. El gel que compone a estas tiras se encuentra deshidratado, es necesario hidratarlo por 18 h. con una solución de 200 – 400µg de proteínas totales (de ahí la importancia de la cuantificación de la muestra de acuerdo al método de Bradford) diluidas en el buffer con anfolinas; por ejemplo si se requiere separar estas proteínas en un rango de pH de 4 a 7, las anfolinas y la tira IPG deberán corresponder a este rango, al sistema se adicionan 3 o 4 microlitros de azul de bromofenol como indicador de corrida.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Figura 22. Tiras IPG de 16 cm teñidas de color azul. Fuente: BIOpHORETICS., s.f.

Figura 23. Las tiras deben ser hidratadas con una solución de proteínas, anfolinas y azul de bromofenol por 18 h, para ser isoelectroenfocadas. Fuente: Pharmatec Systems, s.f.

Tras ser hidratadas, las tiras pueden isoelectroenfocarse en una cámara para tal efecto, las tiras se posicionan en los carriles de la cámara, se sujetan con los electrodos de la cámara y se llenan con aceite mineral grado biología molecular que fungirá como medio líquido conductor de la corriente. Las casas comerciales que distribuyen las tiras proporcionan con éstas un instructivo que contiene los voltajes y tiempos a programar en la cámara de isoelectroenfoque, al terminar el ciclo programado las proteínas embebidas en el gel habrán quedado separadas de acuerdo a su punto isoeléctrico. Esta separación es muy importante y útil, ya que es posible que dos proteínas puedan tener el mismo peso molecular, lo que haría difícil separarlas por electroforesis convencional; sin embargo, es prácticamente imposible que dos proteínas tengan exactamente el mismo punto isoeléctrico, y en caso de coincidir, la segunda dimensión de la técnica resolverá el problema (Cutler, 2004).

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Figura 24. La imagen muestra una tira hidratada y teñida con azul de bromofenol posicionada en uno de los carriles de la cámara de isoelectroenfoque, puede observarse que el carril está saturado de aceite mineral, en cada extremo de la tira se observan dos bloques negros que corresponden a los electrodos que proporcionarán la corriente eléctrica.

Figura 25. Cámara de isoelectroenfoque, proporciona un flujo eléctrico que permite separar proteínas de acuerdo a su punto isoeléctrico, cuenta con una pantalla y controles que permiten programar los voltajes y tiempos de enfoque de acuerdo al fabricante de la tira.

Al término del isoelectroenfoque (donde se separaron las proteínas por punto isoeléctrico), deberán separarse ahora por peso molecular mediante una electroforesis convencional; para hacerlo, se construye un gel de poliacrilamida y se monta en la cámara el gel con la tira enfocada en la parte superior, se agrega el buffer de corrida, se colocan los electrodos y se administra la corriente eléctrica que hará el trabajo, separando a las proteínas por peso molecular, que corresponde a la segunda dimensión de la técnica.

Figura 26. Gel de poliacrilamida convencional.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

En la imagen anterior se muestra la posición en la que debe colocarse la tira IPG para que las proteínas isoelectroenfocadas puedan separarse por peso molecular.

Figura 27. Efecto de las dos dimensiones en las proteínas. Fuente: Propteome plus, 2011.

Al término de la electroforesis, las proteínas de la tira han sido transferidas al gel y separadas por peso molecular, para poder visualizarlas es necesario teñirlas (existen muchos colorantes para tal efecto como sypro ruby, azul de coomassie coloidal, plata, la elección dependerá de la técnica que adopte cada laboratorio). Lo que se obtiene es el proteoma del organismo al cual pertenecen las proteínas en un rango de pH. En el gel las proteínas se observan como pequeñas manchas circularas llamadas spots, cada una corresponde a un péptido (Ausubel, 2004; Cutler, 2004).

Figura 28. Muestra de 3 geles en 2D.

La imagen muestra tres geles 2D, cada punto azul representa un péptido que ha sido separado por punto isoeléctrico y peso molecular, en este caso se trata de tres

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

condiciones; la proteómica permite monitorear los cambios en los patrones de expresión de proteínas en condiciones diferentes.

Actividades La elaboración de las actividades estará guiada por tu docente en línea, mismo que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como los envíos que tendrán que realizar. Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BBM2_U2_A1_XXYZ, donde BB2 corresponde a las siglas de la asignatura, U1 es la unidad temática, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Autorreflexiones Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación. Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BBM2_U2_ATR _XXYZ, donde BBM2 corresponde a las siglas de la asignatura, U2 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Cierre de la unidad Ahora que has terminado esta segunda unidad, has podido dimensionar la importancia que tienen las proteínas en sectores como el industrial y el de las ciencias de la salud, habrás caído en cuenta sobre la necesidad creciente de su estudio no solo a nivel químico sino a nivel molecular; ya que es a través de la biología molecular que se logra la manipulación completa e industrialización de estas poderosas moléculas. Esta unidad complementa la información de la Unidad 1. Biología molecular de ácidos nucleicos, que te introdujo en la manipulación de ácidos nucléicos. Ahora has abordado las generalidades sobre la biología molecular de proteínas, partiendo desde su extracción, purificación, cuantificación, secuenciación y hasta su análisis electroforético.

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

Con los conocimientos adquiridos hasta el momento, estás preparado para enfrentar las necesidades básicas de la investigación en la biología molecular de ADN y proteínas, además te permitirán abordar de manera amigable Unidad 3 Introducción a la ingeniería genética, donde integrarás lo aprendido. Por lo que te exhortamos a continuar con empeño tu aprendizaje a través de esta asignatura que sin duda, te será de mucha utilidad en tu vida profesional como biotecnólogo.

Para saber más

Para profundizar tus conocimientos sobre la biología molecular de proteínas es recomendable que revises los siguientes recursos de libre acceso; con ellos podrás identificar las posibles aplicaciones de lo que has aprendido en esta unidad. 

Astroz, Y. & Segura, C. (2012) Métodos proteómicos aplicados al estudio de la malaria: Plasmodium falciparum. Acta biológica colombiana. l.17 (3). El artículo habla sobre la aplicación de la proteómica en el área médico biológica como herramienta de diagnóstico de enfermedades parasitarias. Disponible en: http://www.sci.unal.edu.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120548X2012000300002&lng=es&nrm=iso



Facio, M. L. et al. (2010) Seguimiento del perfil proteico urinario en el trasplante renal. Acta bioquímica. Clínica. Latinoamericana. [Online]. vol.44, (4), pp. 653-660. Disponible en: http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S032529572010000400006&lng=es&nrm=iso Este artículo habla sobre un estudio, para realizar la evaluación renal post trasplante mediante el monitoreo de proteínas utilizando la electroforesis.



López L., Binaghi M., Greco C., Mambrín M., Cellerino K. y Valencia M. (2010) Salazones y chacinados embutidos secos: detección por electroforesis de especies cárnicas y de proteínas extrínsecas agregadas. [PDF]. Diaeta28.131. El Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

artículo habla sobre la detección electroforética de proteínas con fines comerciales en la industria alimenticia. Disponible en: http://www.scielo.org.ar/pdf/diaeta/v28n131/v28n131a02

Fuentes de consulta

Básicas: 



 



Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K y Walter P. (2008). Biología molecular de la célula. Traducción al español. 5ª ed. Barcelona: Omega. ISBN 9788428215077 Ausubel F., Brent R., Kingston R., Moore D., Seidman J., Smith J. and Struhl K. (Eds.). (2002). Short protocols in molecular biology. 3rd ed. Wiley: USA. ISBN100471250929 Brandemberg O., Dhlamini Z., Ghosh K. and Sonnino A. 2011. Introduction to molecular biology and genetic engineering. Food and Agriculture Organization of the United Nations: Rome. ISBN 92-5-105585-8 Cutler P. (Ed.). (2004). Protein purification protocols. 2nd ed. Springer: USA. ISBN 1-59259-655X Lodish H., Berk A., Matsudaira P., Kaiser C., Krieger M., Scott M., Zipursky and Darnell J. (2004). Molecular and Cell Biology. 5th ed. WHFreeman: USA. ISBN 10: 0-7167-3136-3 Walker J. (Ed.). (2002). The protein protocols handbook. 2nd ed. New Jersey: USA. ISBN 0-89603-940-4

Complementarias: 

Bensaccount (2009) Western blot transfer. [Imagen]. Recuperada de: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Western_blot_transfer.png

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas



 



   



  

 

Biology, Reference. (2013). Disco de proteínas en: Separation and Purification of Biomolecules. [Imagen]. Recuperado de: http://www.biologyreference.com/ReSe/Separation-and-Purification-of-Biomolecules.html BIOpHORETICS. (s.f.) SERVA IPG BlueStrips 3-10, 12 Pack. [Imagen]. Recuperada de: http://biophoretics.com/ipg-strips/376-serva-ipg-bluestrips-ph-310-12-pack.html Biomodel (s.f.). Electroforesis de proteínas y de ácidos nucleicos. [imagen]. Recuperado de: http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm BIO-RAD (s.f.). Got protein? Kit. [Fotografía]. Recuperado de: http://www.biorad.com/prd/es/ES/LSR/PDP/4dad28a9-0b07-49f2-b399-9e5b55643b04/GotProtein?-Kit Cuantificación de aminoácidos en plasma empleando Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia. Acta bioquím. clín. latinoam. [Online]. vol.43, (4), pp. 647-660. Recuperado de: http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S032529572009000400011 Esmas.com (17/07/2013). Relación riñones proteína. [Fotografía]. Recuperado de: http://www.esmas.com/salud/786376.html# Estación Experimental del Zaídin. (s.f.) Comatógrafo convencional. [Fotografía]. Recuperado de: http://www.eez.csic.es/?q=en/node/1187 Genes.com. (2011). Código genético. [Imagen]. Recuperado de http://www.genes.com.uy/acidos-nucleicos/codigogenetico.html Gómez D., L. A. (01/04/ 2011). Proteínas concepto. ¿Qué concepto tenemos hacia las proteínas? [Imagen]. Recuperado de: http://proteinasbiologia.blogspot.mx/2011_04_01_archive.html HiQ (2008). Specialty Gases & Specialty Equipment. [Imagen]. Recuperada de: http://hiq.lindegas.com/international/web/lg/spg/like35lgspg.nsf/docbyalias/image_hplc Las proteínas. (s.f.). Clasificación delas proteínas. [Imagen] Recuperado de: http://proteinas.org.es/que-son-las-proteinas Leinco Technologies, Inc. (2013) Illustration of detection in Western Blot. [Imagen] Recuperada de: http://www.leinco.com/general_wb Malaver, O., L. F. et al. (2009). Cromatograma obtenido mediante HPLC. [Imagen]. En: Recuperado de: http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S032529572009000400011 Pharmatec Systems. (s.f). Tiras IPG. [Imagen] Recuperada de: http://www.ptsys.co.kr/kor/product_info/Ettan_IPGphor_IEI_System_01.html Pulgarin, A. (24/10/2010) Membrana plasmática. [Imagen en blog]. Recuperado de: http://alejandrobcdc.blogspot.mx/2010/10/entrada-8-evaluacion-de-la-literaturay.html

Universidad Abierta y a Distancia de México

Biología molecular II Biología molecular de proteínas

 



Portal de vegetarianos. (2013) Licuado de frutas. [Imagen]. Recuperado de: http://www.vegetarianos.com.mx/2010/07/28/licuado-de-frutas/ Propteome plus. (2011). Efecto de las dos dimensiones en las proteínas. [Esquema]. Recuperada de: http://proteomeplus.files.wordpress.com/2011/07/esquema-2de2.png Silva, L. A. (2012). Electroforesis en gel1.png [Imagen]. Recuperado de: http://creationwiki.org/es/Archivo:Electroforesis_en_gel1.png

Universidad Abierta y a Distancia de México