Unidad 2. Síntesis de proteínas by Jazina Ruiz Hernández

Biología molecular I Síntesis de proteínas

Programa de la asignatura:

Biología molecular I

Síntesis de proteínas

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Índice Presentación de la unidad…………………………………………………………………………2 Propósitos…………………………………………………………………………………………...3 Competencia específica…………………………………………………………………………...3 2.1 Importancia de la síntesis de proteínas……………………………………………………..4 2.1.1 Procesos involucrados en la síntesis de proteínas…………………………………...…5 2.1.2 Importancia celular…………………………………………………………………………..6 2.2 Transcripción…………………………………………………………………………………...7 2.2.1 Tipos de ARN………………………………………………………………………………...8 2.2.2 Pasos de la transcripción………………………………………………………………….13 2.2.3 Procesos post-transcripcionales en eucariotas…………………………………………24 2.3 Traducción…………………………………………………………………………………….33 2.3.1 Pasos de la traducción…………………………………………………………………….34 2.3.2 Procesos post-traduccionales…………………………………………………………….45 2.4 Regulación genética……………………………………………………………………....…50 2.4.1 Regulación en procariotas: los operones…………………………………….....……....52 2.4.2 Regulación en eucariotas………………………………………………………….………55 Actividades………………………………………………………………………………………...59 Autorreflexiones…………………………………………………………………………………...59 Cierre de la unidad………………………………………………………………………………..59 Para saber más……………………………………………………………………………………60 Fuentes de consulta………………………………………………………………………………63

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Presentación de la unidad En la Unidad I aprendiste cómo ocurre el proceso de división celular, para lo cual es necesario replicar el ADN, y cómo influye en la evolución de los organismos. En esta unidad vas a tratar el tema de la síntesis de proteínas tanto en células procariotas como en células eucariotas así como su regulación. Finalmente, realizaras las actividades que tenemos programadas para ti, ¿te interesa? En esta segunda unidad vas a analizar un proceso clave para la vida celular: la síntesis de proteínas. Para ello, a partir del ADN se produce la transcripción para dar lugar al ARN, y a partir de esta molécula, ocurre la traducción que dará la proteína. Conocerás además, las diferencias que existen entre los procesos que ocurren en procariotas y eucariotas y cómo se regula la cantidad de proteínas presentes en la célula, porque recuerda: tener mucho es malo pero poco también, siempre tiene que existir la cantidad exacta de proteína para vivir en un ambiente determinado, ¿cómo se logra? Con una correcta regulación de la proteínas, como veras en esta unidad. Finalmente, los Ingenieros en Biotecnología utilizan las células para obtener un beneficio y las proteínas son muy importantes industrialmente, por ello, conocer la regulación te permitirá manipular las condiciones ambientales (temperatura, oxigenación, composición de medio de cultivo, entre otras.) para que la célula produzca mayor cantidad de proteína. Otra opción es la ingeniería genética, en la que se utilizan los conocimientos de la genética molecular para producir enzimas de interés industrial por lo que debes conocer los procesos involucrados para tal fin.

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Propósitos

El propósito de esta unidad es que comprendas cómo ocurre el proceso de síntesis de proteínas (transcripción y traducción), las diferencias de estos procesos entre procariotas y eucariotas y cómo se regula la cantidad de proteína presente en la célula en cada momento. Por ello, se propone que alcances los siguientes logros:    

Deduzcas la secuencia protéica a partir de un gen. Compares el proceso de síntesis protéica entre procariotas y eucariotas. Analices la importancia de la transcripción y traducción en la ingeniería genética. Utilices software libre para deducir la secuencia protéica de un gen.

Competencia específica

Utilizar el código genético para deducir la secuencia de una proteína a partir de su secuencia genética, a través de los procesos de transcripción y traducción.

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2.1 Importancia de la síntesis de proteínas Las proteínas son las moléculas que le dan vida a una célula, ¿lo recuerdas? Cuando fallecemos, nuestro cadáver queda, eso quiere decir que las células siguen ahí y en ellas estarán presentes los carbohidratos, los lípidos, los ácidos nucleicos y las proteínas. Lo que ocurre es que, una parte de estas últimas moléculas, las que realizan los procesos bioquímicos (es decir, las enzimas) dejan de actuar. De esta manera, no ocurre el metabolismo y por lo tanto la célula no puede hacer su función. Además, la presencia de determinadas enzimas hará que una célula se pueda desarrollar en determinados ambientes, por ejemplo, una célula que produzca amilasas podrá alimentarse del almidón presente en las plantas. En la materia de Bioquímica analizaste detalladamente el papel de las proteínas en la vida celular. Aprendiste que estaban formadas por aminoácidos y que la diferencia entre las diferentes proteínas es la secuencia de dichos monómeros. Para entender mejor este proceso revisa la siguiente analogía: ¿Cuántas letras forman el abecedario? ¿Cuántas palabras se pueden escribir con esas 27 letras? La diferencia entre una palabra y otra es el acomodo de sus letras y la extensión de las mismas. Algo parecido ocurre en las proteínas, y el conjunto de todas ellas definirá qué puede hacer una célula, igual que el conjunto de todas las palabras pueden escribir un libro. Tan importante son las enzimas (como se indicó anteriormente) como las proteínas estructurales, las encargadas del transporte celular, de la defensa del organismo, etcétera. Para obtener la secuencia correcta de estas proteínas es necesario realizar correctamente su síntesis, y como veras en esta unidad, ésta se lleva a cabo utilizando la información que contiene la secuencia de ADN a través de dos procesos: la transcripción y la traducción. Y, en este momento te preguntarás, ¿para qué es importante este proceso para un Ingeniero en Biotecnología? Y más específicamente, ¿para un Biólogo Molecular? Una clave de la Ingeniería Genética es la posibilidad que existe de poder obtener proteínas de organismos que anteriormente no podían hacerlo. Por ejemplo, existen los organismos transgénicos como el maíz capaz de resistir a herbicidas o tenemos el caso de la insulina humana, que actualmente es producida por una bacteria (Escherichia coli). En ambos casos, se introduce la secuencia del ADN que tiene la información para la síntesis de la proteína (es decir, el gen) y por ello, es importante conocer cómo ocurren los procesos para su síntesis y así realizar el transgénico de la manera correcta. Espero que con estos ejemplos, te haya quedado claro cuál es la importancia de las proteínas por lo que pasaremos a revisar cómo ocurre la síntesis de las mismas, es decir, cómo hace la célula para escribirlas y leerlas.

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2.1.1 Procesos involucrados en la síntesis de proteínas Para llevar a cabo la síntesis de las proteínas están involucrados dos procesos que se revisarán durante esta unidad. El primero es la transcripción, donde la información contenida en el ADN, en las secuencias denominadas genes (como verás más adelante) es leída por una enzima específica para la síntesis de ARN o RNA (por sus siglas en inglés). La segunda es la traducción, donde la información contenida en el ARN es “leída” y se sintetiza una cadena de aminoácidos para formar una proteína (Curtis y col., 2008). Cada uno de estos procesos se verán detalladamente más adelante. Con esto, se llega, al Dogma de Biología Molecular, como se observa en la figura, que fue establecido por Francis Crick en 1957, durante una conferencia en la Symp. Soc. Exp. Biol. XII y publicado en la revista Nature en 1970, este Dogma establece que en las células no es posible hacer los procesos de manera inversa, es decir, no se puede sintetizar ARN a partir de una proteína, igual que no se puede sinterizar ADN a partir de una molécula de ARN (Curtis y col., 2008).

Figura 1. Dogma Central de la Biología Molecular. Propuesta original de Crick. Fuente: Curtis y col, 2008.

Actualmente, se han realizado algunas modificaciones a este Dogma ya que existen virus (retrovirus) capaces de sintetizar ADN a partir de una molécula de ARN utilizando una enzima específica denominada transcriptasa reversa que como verás en la materia de Biología Molecular 2 tiene un amplia aplicación en la Ingeniería Genética, específicamente en el estudio de los genes que se expresan en una célula, en una condición determinada. Además otro tipo de virus, también es capaz de replicar moléculas de ARN, aunque estas acciones no contradicen el Dogma establecido por Crick ya que recuerda que los virus no se consideran células porque carecen de membrana plasmática.

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Figura 2. Dogma Central de la Biología Molecular. Propuesta actual Fuente: Curtis y Col., 2008.

Por otra parte, en referencia a las proteínas, en 1982, Stanley B. Prusiner, acuñó el término de prión a unas proteínas que tienen alterada su estructura secundaria capaces de producir enfermedades como “las vacas locas” (cuyo nombre científico es encefalopatía espongiforme bovina), que afecta al sistema nervioso central de manera crónica e irreversible. Esta ha sido otra modificación al Dogma Central de la Biología Molecular original, ya que una característica importante de estas moléculas es que son capaces de auto-duplicarse. Actualmente, se sigue manteniendo la unilateralidad del proceso de traducción ya que no es posible determinar la secuencia del ARN a partir de una proteína, como notarás posteriormente cuando se hable del Código Genético. El ARN tiene varios códigos diferentes para añadir un aminoácido, es decir, cada 3 ribonucleótidos (triplete o codón) se tiene la información para la adición de un aminoácido específico pero el mismo aminoácido puede ser añadido con tripletes diferentes. Por poner un ejemplo, los tripletes UUU y UUC tienen la información para la adición de una fenilalanina, de manera que si se sabe la secuencia de ARN se podrá saber la secuencia de la proteína que se está sintetizando, pero si tienes la secuencia de la proteína y contiene una fenilalanina, ¿cómo saber cuál de los dos tripletes se utilizó?

2.1.2 Importancia celular Cuando comenzó el tema se mencionó la importancia de la síntesis de proteínas y espero que te haya quedado claro, ya que, específicamente, las enzimas son las que dan vida a las células. Además, no todas las células pueden hacer lo mismo, ¿has oído hablar de que los humanos no pueden metabolizar algunos carbohidratos como la celulosa presente en la pared celular de todos los vegetales? Para ello, se tiene el apoyo de las bacterias Universidad Abierta y a Distancia de México 6

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simbiontes que habitan en el intestino que sí pueden hacer esta función. ¿Cuál es la diferencia? La respuesta es muy simple, los humanos, en nuestro genoma, no tenemos la información para la síntesis de la enzimas que degradan estos polímeros, es decir, las celulasas y las bacterias sí pueden hacerlo. Así se pueden mencionar muchos ejemplos, y es por ello, que una de las tareas como ingenieros en Biotecnología, es buscar organismos con la capacidad de realizar las funciones que nos interesan ya que no existe una célula “todóloga”. Por otra parte, aunque se tenga la información genética para la síntesis de una proteína determinada no siempre se está produciendo. Para que te quede claro, revisa los siguientes dos ejemplos, el primero relacionado con el ser humano y el segundo con un microorganismo. Te habrás dado cuenta de que no todas las células de tu cuerpo son iguales, una célula de ojo no es igual a una célula de corazón y no tienen la misma función pero la información genética de todas ellas es exactamente la misma, ¿qué ocurre? Que no todas las proteínas se producen al mismo tiempo y la célula de ojo sólo sintetizará aquellas proteínas para que la célula tenga la función de ojo, y lo mismo ocurrirá con la información genética que se exprese en las células de corazón. Así mismo, siguiendo con el segundo ejemplo, existen microorganismos (como las bacterias) capaces de sintetizar muchas enzimas, por poner, un ejemplo la celulasa. ¿Cuándo crees que el microorganismo la sintetice? Si el microorganismo tiene como fuente de carbono glucosa, que es un azúcar fácilmente metabolizable, ¿necesitará sintetizar la celulasa? La respuesta es obvia, no, en este caso no necesita la enzima. En cambio, si tiene como única fuente de carbono celulosa, entonces sí necesita la enzima celulasa para degradar el polímero en glucosa y utilizarlo para obtener energía para poder vivir. Con todo ello, es necesario hacerte ver que la regulación en la síntesis de las proteínas es muy importante; por esta razón conocerás cómo ocurre este proceso en las células, así como las diferencias entre procariotas y eucariotas.

2.2 Transcripción Como ya se mencionó, la transcripción se puede definir como el “proceso enzimático mediante el que la información genética contenida en una hebra de ADN se utiliza para especificar una secuencia de bases complementaria en una cadena de ARN” (Lehninger, 2009). De esta manera es posible sacar “copias” de la información y producir varios ARN a partir de una única secuencia de ADN y por lo tanto sintetizar varias proteínas al mismo tiempo.

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Para ello, ocurre un proceso similar al que estudiaste durante la replicación, ya que tomando como molde la secuencia de ADN, específicamente, del gen (molécula de ADN que tiene información para síntesis de un ARN), la enzima ARN polimerasa sintetiza la molécula de ARN añadiendo los ribonucleótidos complementarios. El proceso de transcripción ocurre de manera diferencial en células eucariotas respecto a las células procariotas, ya que las primeras tienen un núcleo celular donde se tiene almacenado el material genético y las segundas tienen su cromosoma en el citoplasma. Por ello, en el primer caso, la transcripción ocurre en el núcleo, pero el ARN producido debe viajar al citoplasma donde ocurre la segunda fase de la síntesis de proteínas (la traducción) por lo que debe ser protegido en sus extremos para evitar una degradación temprana del material, esto ocurre con las denominadas modificaciones posttranscripcionales como comentaremos a lo largo de este tema. Por su parte, en los procariotas, la transcripción ocurre en el citoplasma e inmediatamente se produce la traducción de las secuencias de ARN y por lo tanto la síntesis de proteínas de manera que no es necesario proteger los extremos del ARN por lo que no existen modificaciones posteriores a la transcripción. La diferencia en estos procesos es fundamental como Ingenieros en Biotecnología, ya que si se desea obtener un organismos transgénico, será necesario saber si el gen proviene de una célula procariota u eucariota y si son necesarias las modificaciones posttranscripcionales para que la proteína se traduzca correctamente. Para hablar de este proceso se iniciará explicando los tipos de ARN que se pueden producir para después analizar los pasos que se llevan a cabo para que se produzca este proceso.

2.2.1 Tipos de ARN En Bioquímica analizaste esta biomolécula así que recuerda que el ARN es un ácido nucléico formado por ribonucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster. Cada ribonucleótido contiene un azúcar (ribosa), un fosfato y una base nitrogenada (adenina, uracilo, guanina y citosina). El ARN es de cadena simple a diferencia de la doble cadena de ADN y existen diferentes tipos de ARN presentes en las células, ¿recuerdas? Existen más de 10 moléculas con diferentes funciones (síntesis de proteínas, reguladoras y con actividad catalítica) y un resumen se puede observar en la siguiente tabla: Clasificación de los ARN Función celular Tipo de ARN Mensajero ARNm Síntesis de proteínas de transferencia ARNt Universidad Abierta y a Distancia de México 8

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Reguladores

Con actividad catalítica

Ribosómico ARNr De interferencia Micro ARN Interferente pequeño Asociados a Piwi Antisentido Largo no codificante Riboswitch Ribozima Espliceosoma (RNPsn) Pequeño nuclear ARNsn

Tabla 1. Clasificación de los ARN, Fuente: PQBio, s.f.

En este momento, vas a analizar los ARN involucrados en la síntesis de proteínas, es decir, el ARN mensajero, el ARN de transferencia y el ARN ribosomal: 1.- ARN mensajero (ARNm): es una molécula lineal cuya función será “llevar la información genética” y será la molécula que se usa como “molde” para la traducción. Es por ello, que como verás más adelante, esta molécula es leída en los ribosomas de manera que cada 3 bases (codón) se tiene información para la adición de un aminoácido utilizando el denominado código genético. Cuando se mencionen las diferencias entre procariotas y eucariotas verás que en estos últimos, el ARNm tiene que tener su extremos 5’ y 3’ protegidos para evitar su pronta degradación, por ello, en el extremos 5’ se encuentran una serie de modificaciones y proteínas que forman el denominado CAP (caperuza o casquete que se refiere a un nucleótido modificado de guanina, la 7metilguanosina, que se añade al extremo 5’ del ARNm para su protección) una extensión en el extremo 3’ con la adición de Adeninas formando la cola de poliA (cadena de adeninas que se añaden al extremo 3’ del ARNm para su protección, como se analizará detalladamente en el apartado 2.2.3 (Lehninger, 2009). En la siguiente imagen puedes observar la estructura del ARN mensajero de una célula eucariota.

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Figura 3. Estructura del ARNm presente en una célula eucariota. Fuente: INMEGEN, 2012.

2.- ARN de transferencia (ARNt): ésta molécula adopta una estructura tridimensional característica, gracias a los puentes de hidrógenos que se forman en las bases presentes en su secuencia. Su función es reconocer los codones del ARN a través de la complementación de bases entre la secuencia de éste con la secuencia de las tres bases que forman el anticodón presente en la molécula del ARNt. Esta complementación de bases se refiere a los puentes de hidrógeno que se forman entre A y U así como entre G y C. Por otro lado, ARNt tiene, en su extremo 3’ unido un aminoácido que será el que forme la cadena de aminoácidos durante el proceso de traducción. (Lehninger, 2009).

Figura 4. Estructura de un ARNt. Observa que en el extremo 3’ tiene unido el aminoácido y en la parte inferior hay tres bases que forman el denominado anticodón. Fuente: Síntesis proteica, 2010.

La adición del aminoácido es un paso importante y muy específico, ya que según sea el anticodón presente será el aminoácido que debe tener unido. Para ello, se utiliza una enzima denominada Aminoacil-ARNt-sintetasa. En la siguiente figura, podemos observar la acción de esta enzima tomando como ejemplo un ARNt que tiene como anticodón GCC al que se le debe unir el aminoácido valina. Primero ocurre la unión del aminoácido a la enzima utilizando la energía proporcionada por una molécula de ATP para posteriormente unirlo al ARNt de manera que la enzima vuelve a su estado original. En las células, debe existir por lo menos una Aminoacil-ARNtsintetasa específica para cada anticodón que une un aminoácido específico. Los ARNt que tiene unido el aminoácido específico que le corresponde se denominan aminoaciARNtAA donde “AA” corresponde al aminoácido que se une, en este ejemplo el resultado

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de la actividad enzimática sería Valinil-ARNtVal de ahí el nombre de la enzima (de Robertis y Hib, 2005).

Figura 5. Función de la Aminoacil-ARNt-sintetasa. Fuente: Galeón.com Hispavista, s.f.

3.- ARN ribosomal (ARNr): Esta molécula constituye alrededor del 80% del ARN total de una célula y es por ello, que en la zona del núcleo donde se transcribe se acumula una alta cantidad de proteínas y ARN que hace que se vea más oscuro cuando se visualiza a través de una microscopía y forma el nucléolo del que ya se habló anteriormente. Existen diferentes tipos de ARNr y la unión de los mismos junto con algunas proteínas formará los ribosomas celulares, lugar donde ocurre la síntesis de proteínas. En el caso de las células procariotas se pueden encontrar los ARNr 5S, 16S y 23S mientras que para los eucariotas, los ARNr presentes son 5S, 5,8S, 18S y 28S. 12En ambos casos, los ribosomas están formados por 2 subunidades; la subunidad grande (50S para procariotas y 60S para eucariotas, formados los ARNr 5S y 23S y 5S, 28S y 5,8S respectivamente) y la subunidad pequeña (30S y 40S formando por el ARNr 16S y 18S respectivamente). De esta manera, cuando se unen durante el proceso de traducción se forman los ribosomas 70S (procariotas) y 80S (eucariotas). Es importante aclarar que la unidad S o “svedberg” se refiere al coeficiente de sedimentación durante una ultracentrifugación que depende de una combinación de tamaño y forma, por eso, Universidad Abierta y a Distancia de México 11

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tomando como ejemplo la célula procariota, la unión de la subunidad de 50S con la 30S da como resultado el ribosoma de 70S (y no 80S como cabría esperar si las unidades se sumaran). Así mismo, debes recordar que en las mitocondrias y cloroplastos eucariotas, también existe el proceso de síntesis de proteínas ya que cada uno de estos organelos tiene su propio ADN, y los ribosomas presentes son similares a los procariotas, es decir, 70S (Lehninger, 2009).

Figura 6. ARNr presente en las células procariotas (así como mitocondriales y cloroplásticos) y eucariotas Fuente: Lodish y col, 2009.

Antes de pasar a ver cómo ocurre la síntesis de estas moléculas, es decir la transcripción, es necesario que reconozcas la relación entre los ARNr y la identificación molecular de un organismo y los estudios de relaciones filogenéticas. Para realizar esta técnica, se necesita una molécula de ADN que esté lo suficientemente conservada en la evolución para poder realizar su amplificación (utilizando la técnica de PCR que se analizará en la materia de Biología Molecular 2) pero a su vez, tenga secuencias lo suficientemente variables para que podamos distinguir entre la diferentes especies. Esto se consigue estudiando los genes que tienen la información para la síntesis de los ARNr, es decir, los genes ribosomales.

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En procariotas, el gen 16S (Rodicio, M. R. y Mendoza, M.C.) es el más utilizado para este fin ya que en su secuencia se encuentran regiones variables que son analizadas para la identificación de bacterias. En eucariotas se utilizan las secuencias ITS (por sus siglas en inglés Internal Transcribed Spacer, o Espaciadores Internos Transcritos) (Peteira y col., 2008), que son las secuencias presentes entre los genes 23 S y 5,8 S (ITS 1) y 5,8S y 28 S (ITS 2) Como se muestra en la siguiente figura.

Figura 7. Estructura de los genes ribosómicos en eucariotas donde podemos observar los Espaciadores Internos Transcritos (ITS) utilizados en la identificación de organismos eucariotas. Fuente: Michele A. Mansfield & Seogchan Kang. S.f.

Una vez analizados los diferentes ARN que se deben producir ahora vas revisar como ocurre el proceso de Transcripción que en el siguiente subtema.

2.2.2 Pasos de la transcripción El proceso de transcripción se puede definir como la síntesis de moléculas de ARN sobre la base de moldes de ADN (de Robertis y Hib, 2005). Este proceso ocurrirá mediante complementación de bases de una manera similar a la que ocurría en el proceso de replicación de manera que cuando la secuencia de ADN tenga una A se unirá una U, cuando tenga una T, se unirá una A, con una G se unirá una C y viceversa produciéndose enlaces fosfodiéster entre los ribonucleótidos y siempre en dirección 5’ 3’ como ya se analizó en la unidad anterior. Para ello, se necesita la acción catalítica de una enzima específica, que en este caso se conoce como ARN-polimerasa.

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Figura 8. Unión fosfodiéster entre los nucleótidos del ARN durante el proceso de transcripción del ADN por complementación de bases. Fuente: De Robertis y Hib, 2005.

Las ARN-polimerasas están formadas por varias subunidades (2α, 1 β, 1 β’ y 1 ) y su función será reconocer el ADN y unir los ribonucleótidos complementarios mediante enlaces fosfodiéster en dirección 5’3’ (las subunidades B actúan como una “garra” que se une al ADN para utilizarlo como molde en la transcripción).

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Figura 9. ARN-Polimerasa bacteriana A. Subunidades que forman la enzima, a la derecha se observan las subunidades beta en rosa y amarillo y el Mg2+ que forma parte del centro activo. B. Proceso de transcripción. Fuente: Basado en Berg y Col., 2007.

En las células procariotas, solo existe una ARN-polimerasas, en cambio, de acuerdo con de Robertis y Hib, (2005), las ARN-polimerasas de las células eucariotas se clasifican en: - ARN-polimerasa I que sintetiza los ARNr 28S, 5,8S y 18S. - ARN-polimerasa II que sintetiza ARNm y ciertos ARNs pequeños nucleares. - ARN-polimerasa III que sintetiza ARNr 5S; los ARNt y algunos ARNs pequeños nucleares y citosólicos. - ARN-polimerasa mitocondrial que sintetiza los ARN de los genes presentes en el cromosoma de este organel. - ARN-polimerasa cloroplástico, ya que (como en el caso anterior) este organelo cuenta con su propio ADN circular. Ahora que conoces las enzimas implicadas en este proceso, el siguiente paso es ver como ocurre este proceso. Para ello, es importante definir que un gen es la secuencia de ADN que tiene la información para la síntesis de una molécula de ARN. Durante mucho

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tiempo se definió como la secuencia de ADN que tiene la información para la síntesis de una proteína, pero este concepto queda corto ya que excluye a los ARNr y ARNt. Por lo tanto, la ARN polimerasa necesita reconocer el sitio de inicio y finalización del gen para sintetizar la cadena de ARN correspondiente (Berg y col., 2007). El promotor es la secuencia de ADN que es reconocida por la ARN-polimerasa para comenzar la transcripción (que inicia en la base +1). Según el tipo de organismo, esta secuencia tiene ligeras diferencias. En la siguiente figura puedes ver las secuencias consenso de los promotores más comunes en procariotas y eucariotas. En los procariotas se encuentra una secuencia denominada Pribnow en posición -10 (es decir, 10 bases adyacentes por el lado 5’ al inicio de la transcripción) y la región -35. Por su lado, en las células eucariotas, se encuentra la caja TATA (por su secuencia rica en A y T) en posición -25 y la secuencia CAAT en posición -75. Esta información es muy importante a la hora de analizar secuencias para estudiar algún gen o algún promotor interesante para su aplicación en Ingeniería Genética ya que para definir dónde empieza el gen, se analiza la existencia de las cajas anteriormente mencionadas en las posiciones mencionadas.

Figura 10. Secuencias consenso de los promotores de células procariotas (a) y células eucariotas (b). El primer nucleótido que se transcribe recibe el número +1 y el adyacente por el lado 5’ se señala como -1. Observa que en la secuencia CAAT aparece un nucleótido como N, eso quiere decir que puede ser cualquier de los existentes, es decir, A, T, G o C Fuente: Berg y col., 2007.

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El concepto de secuencias consenso se refiere a la secuencia presente en la mayoría de los organismos y para ejemplificarlo observa la siguiente figura. Aunque hay ligeras diferencias en las secuencias, se eligen aquellas que aparecen en la mayoría de los casos.

Figura 11. Concepto de secuencias consenso. Observa cómo se eligen las bases que se repiten en la mayoría de los casos Fuente: Lehninger, 2009.

Volviendo al tema ahora vas a analizar cómo ocurre la transcripción de los 3 ARN más importantes en los procesos de síntesis de proteínas. Los diferentes ARNr se transcriben de diferentes genes: los ARNr 18S, 5,8S y 28S se procesan a partir del gen 45S (presente en el nucléolo) sintetizado gracias a la ARNpolimerasa I. Por su parte, el ARNr 5S (situado fuera del nucléolo) se transcribe por la acción de la ARN polimerasa III. La ARN-polimerasa I se activa gracias a la existencia de factores de transcripción como las proteínas UBF y SL1. Esto lo puedes ver en la figura Transcripción del ARNr 45, B. de manera que se transcribe un gen 45S que posteriormente será procesado para producir los ARNr 18S, 5,8S y 28S. En el genoma se encuentran varias copias de este gen en tándem (es decir una detrás de otra) como puedes observar en la figura mencionada.

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Figura 12. Transcripción del ARNr 45 S. A. Los factores de transcripción UBF y SL1 se unen al promotor del gen para activar la ARN-polimerasa I. B. En primer lugar se transcribe un ARN 45S que posteriormente será procesado para producir los ARNr 18S, 5,8S y 28S Fuente: de Robertis y Hib, 2005.

Por otro lado, es necesario transcribir el gen 5S (que se encuentra fuera del nucléolo) por lo que este proceso ocurre gracias a la ARN-polimerasa III que se activa por la acción de factores de transcripción protéicos como TFIIA, TFIIB y TFIIC.

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Figura 13. Transcripción del gen 5S por la acción de la ARN-polimerasa III activada gracias a los factores de transcripción TFIIA, TFIIB y TFIIC. Fuente: de Robertis y Hib, 2005.

Esta enzima, también es la responsable de transcribir los ARN de transferencia con la diferencia que se activa con factores de transcripción diferentes, en este caso son las proteínas TFIIIB y TFIIIC, como se muestra en la imagen. En los tres casos (ARNr 45S, ARN 5S y ARNt), la terminación de los genes ocurre por la existencia de varias timinas en el extremo 3’ del gen que reconocen las ARN-polimerasas y cesan la trascripción.

Figura 14. Transcripción de los ARNt por la acción de la ARN polimerasa III que se activa gracias a la acción de los factores de transcripción TFIIIB y TFIIIC. Fuente: de Robertis y Hib, 2005.

La acción de la ARN-polimerasa II, que sintetiza los ARN mensajeros, es un poco más compleja porque estos genes deben estar regulados para que, como se mencionó anteriormente, se produzca la cantidad de proteína necesaria en cada momento, ni más ni menos. Para ello, se apoyan de complejos proteicos denominados factores de transcripción que puede ser de dos naturalezas (de Robertis y Hib, 2005): - Factores de transcripción específicos que interactúan en el regulador del gen y pueden ser activadores o represores como analizarás en la regulación. - Factores de transcripción basales, que son requeridos para reconocer el promotor ya que se unen a la secuencia TATA o Pribnow. Los más conocidos son los factores TBP (proteína de unión a TATA por sus siglas en inglés) y TFII (factores de transcripción tipo II) para eucariotas y el factor sigma en procariotas. De esta manera, se reconoce el promotor y comienza la transcripción en la posición +1. La terminación de la transcripción puede darse por diferentes mecanismos que involucran secuencia de ADN denominadas terminadores de la transcripción. En el caso de Escherichia coli se puede dar por dos mecanismos, por la existencia de una región rica en pares GC seguida de una serie de 6 o más adeninas, como se muestra en la imagen Terminadores de la transcripción, en el inciso A), o terminación dependiente de

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la actuación del factor proteico Rho, en este último caso esta proteína reconoce una secuencia específica del ARN denominada secuencia Rut, mostrado en el inciso B).

B) Figura 15. Terminadores de la transcripción. A. Región rica de GC, B. terminación mediada por la proteína Rho. Fuente: UMC, s. f.

En la Figura: Etapas de la transcripción. Se presenta un resumen gráfico, del proceso de transcripción comenzando por el reconocimiento del promotor (poniendo como ejemplo una bacteria ya que se presenta el factor sigma), la síntesis como tal del ARN y la terminación.

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Figura 16. Etapas de la transcripción. Fuente: Martinki, 2009.

Es importante, notar que sólo se transcribe una molécula de ADN, aquella que tiene dirección 3’5’ para que la síntesis del ARN sea en dirección 5’3’, observa este proceso en la siguiente figura.

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Figura 17. La transcripción toma como molde una única hebra de ADN y se realiza en dirección 5’3’. Fuente: Curtis y col., 2008.

Así mismo, la transcripción ocurre simultáneamente, es decir, cuándo una ARNpolimerasa II reconoce el promotor (con la participación de los factores de transcripción que hemos analizado) y empieza la transcripción, inmediatamente otra ARN-polimerasa hará la misma función y se sintetizarán numerosos ARNm a la vez.

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Figura 18. Micrografía electrónica que muestra un gen transcribiéndose. Fuentes: de Robertis y Hib, 2005.

La transcripción de la células procariotas prácticamente termina con la presente explicación, en cambio, en células eucariotas ocurren procesos post-transcripcionales que es importante analizar como verás en el siguiente tema. Pero antes, en el siguiente esquema se presentan las principales diferencias entre la transcripción de las células procariotas y las eucariotas.

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Figura 19. Diferencias entre transcripción de células procariotas y eucariotas. Fuente: Storage.canalblog, s. f.

2.2.3 Procesos post-transcripcionales en eucariotas Las células eucariotas, como ya sabes, tienen varias diferencias con las células procariotas y entre ellas está la existencia del núcleo con su membrana que protege el material genético que está en su interior. En él, ocurre la transcripción y el ARNm producido debe transportarse al citoplasma para su traducción. Por otro lado, recuerda que las células necesitan tener la cantidad de proteína necesaria para poder vivir, ni más ni menos. Es por ello, que en todas las células (procariotas y eucariotas) existen ribonucleasas (abreviadas como ARNasas) que se encargan de degradar el ARNm producido para que se traduzca sólo la cantidad necesaria de proteína y así poder regular su producción. Como se mencionó en el ejemplo inicial, las bacterias que producen celulasas, necesitan la enzima sólo cuándo en el medio de cultivo exista celulosa como fuente de carbono. Si, añadimos glucosa entonces la enzima no será Universidad Abierta y a Distancia de México 24

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necesaria y se dejará de producir. De esta manera, si el ARNm no fuera degradado, una vez producido no dejaría de traducirse y no se podría detener la síntesis de proteína. Esta es la importancia de las ARNasas en la regulación celular. Esta enzimas son exonucleasas, es decir, liberan ribonucleótidos desde los extremos, ya sea 3’ o 5’. (Lehninger, 2009)

Figura 20. Las ARNasas rompen los enlaces fosfodiéster de los ribonucleótidos terminales de las moléculas de ARN. Fuente: Worthington, Biochemical Corporation, s. f.

En las células procariotas, tanto la transcripción como la traducción ocurren en el citoplasma, y “da tiempo” para que la traducción tenga lugar antes de que el ARNm sea degradado. De hecho, ambos procesos son simultáneos, antes de que termine la transcripción comienza la traducción.

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Figura 21. En células procariotas la transcripción y la traducción ocurren manera simultánea. Fuente: UCM, s. f.

En cambio, como ya se ha comentado, en las células eucariotas es necesario transportar esta molécula al citoplasma y por ello, es necesario “proteger al ARN” antes de su degradación y esto ocurre con los procesos post-transcripcionales. El ARN que se transcribe se denomina transcrito primario y una vez que es procesado pasa a ser un ARNm maduro. Los tres procesos que ocurren son: adición del CAP, splicing y poliadenilación. A continuación se describen detalladamente: a) Adición del CAP. En primer lugar, se añade el CAP (capuchón) en el momento en el que el transcrito primario empieza a transcribirse. El primer extremo que aparece es el 3’ y su ribonucleótido contiene 3 fosfatos ya que recuerda que los ribonucleótidos que se unen a la cadena son trifosfato. En este momento, una enzima específica denominada Guaniltransferasa incorpora un GTP al extremo 5’ del transcrito primario con tres características (de Robertis y Hib, 2005): 1. El nucleótido se agrega al extremo 5’. 2. Entre los nucleótidos se establece una unión trifosfato (uno de los fosfatos lo aporta el GTP y otros 2 fosfatos corresponden al ribonucleótido del transcrito. 3. La unión trifosfato liga el carbono 5’ de la pentosa del GTP con el carbono 5’ del ribonucleótido del transcrito primario y no es una unión 5’ 3’ como las que hemos

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analizado. De esta manera queda el nucleótido del CAP invertido convirtiéndose en otro extremo 3’. A continuación, una Metiltransferasa toma dos grupos metilos de una molécula denominada S-adenosilmetionina y los transfiere: uno a la guanina del CAP y otro al que ha pasado a ser el 2º ribonucleótido del transcrito primario. De esta manera, el CAP evita la degradación del extremo 5’ protegiéndolo de la acción de las ARNasas que analizamos anteriormente. La estructura final se puede observar en la siguiente figura.

Figura 22. Formación del CAP. Obsérvese que la unión es por un enlace trifosfato entre los carbonos 5’ de manera que el extremo se convierte en 3’. Así mismo, tanto la guanina terminal como la base del que se transforma en el 2º ribonucleótido se metilan por acción de la metiltransferasa. Fuente: de Robertis y Hib, 2005.

b) Splicing El segundo procesamiento del ARNm que ocurre es la eliminación de los intrones. Los genes eucariotas están formados por exones e intrones, los primeros contienen la información genética para la síntesis de la proteínas pero para que esto ocurra, primero hay que eliminar las secuencias intrónicas tal y como puedes ver en la siguiente figura. Este proceso se denomina splicing, este concepto no tiene una traducción en español aunque se puede encontrar como corte y empalme o ajuste.

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Figura 23. Los genes eucariotas cuentan con exones e intrones, los cuales son eliminados de manera que los exones se unen para formar el ARNm maduro. Fuente: Modificado Mazenett, R. y Zarante, I., 2012.

El splicing se lleva a cabo, principalmente, por dos métodos: con la ayuda de un espliceosoma y mediante autoprocesamiento. El complejo denominado espliceosoma está formado por RNPsn (por sus siglas en inglés snRNP small nuclear ribonucleoprotein particles), es decir, partícula ribonocleoprotéicas nucleares pequeñas. Este proceso tiene que ser muy específico y para ello se reconoce una secuencia característica. En el extremo 5’: AGGT y en el extremo 3’ (C, U) AGG. Otra secuencia importante es el llamado punto de ramificación cuya secuencia es menos conservada pero siempre contiene una A, como se observa en la figura Splicing con el apoyo de un espliceosoma, en el inciso a). En primer lugar, el 2’OH de este ribonucleótido ataca el extremo 5’ del intrón y lo hidroliza, (inciso b)), simultáneamente se forma una especie de lazo (llamado “lariat”) al formarse un enlace 2’Universidad Abierta y a Distancia de México 28

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5’ dentro del intrón (Inciso c)). Finalmente, el grupo 3’-OH libre ataca el enlace A-G en el extremo 3’ del intrón, de manera que se empalman los exones y se elimina el intrón aún en forma de lazo (Inciso c)).

A del punto de ramificación

Figura 24. Splicing con el apoyo de un espliceosoma. Fuente: Modificado de UAM, s.f.

El autoprocesamiento ocurre cuando los intrones se eliminan sin necesidad de ayuda de proteínas u otros ARNs, y existen dos tipos. En los intrones del grupo I, el proceso autocatílico requiere de una guanosina y carece de secuencias consenso en los puntos de empalme; en cambio, los del grupo II (figura, Autoprocesamiento de un intrón del grupo II.), el proceso requiere de una adenina y durante el empalme se forman estructuras características en forma de lazo.

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Figura 25. Autoprocesamiento de un intrón del grupo II. Fuente: Procesos Genéticos de síntesis de proteínas: la transcripción, s. f.

Los intrones tienen una función importante en la regulación. Además, este proceso permite que un mismo gen pueda producir proteínas totalmente diferentes mediante el splicing alternativo, es decir, según el tipo celular se eliminan intrones diferentes. Un ejemplo típico es lo que sucede en la tiroides y el hipotálamo donde el mismo transcrito primario se procesa diferente dando lugar a la hormona de calcitonina en la tiroides y el péptido CGRP en el hipotálamo con secuencia y función diferente, como se observa en la siguiente figura.

Figura 26. Ejemplo de splicing alternativo. El transcrito primario (ARNhn) se procesa de manera diferencial en la tiroides (procesamiento 1) y en el hipotálamo (procesamiento 2) produciendo proteínas diferentes. Fuente: Porto, A. s.f.

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c) Poliadenilación Finalmente, es necesario proteger el extremo 3’ y esto ocurre con la adición de aproximadamente 250 adeninas, formando el denominado poliA. Antes de que la ARNpolimerasa II alcance la secuencia de terminación del gen, unos factores protéicos denominados CPSF, CSTP, CFI y CFII reconocen la secuencia llamada señal de poliadenilación (AAUAAA) y cortan el transcrito primario aproximadamente 20 nucleótidos después de esta secuencia. Curiosamente, el gen se transcribe hasta que la ARN-polimerasa II reconoce las señales de terminación y el tramo adicional es degradado por las ARNasas al carecer de un CAP en el extremo 5’ que lo proteja. Al transcrito primario liberado se le añaden las adeninas mediante la acción de la poli-A-polimerasa para lo cual es necesaria la presencia del CPSF y otro factor, el PABII. Esta cola de poliA además de proteger el extremo 5’ también colabora con la salida del ARNm al citoplasma a través de los poros nucleares presentes en la membrana nuclear, este proceso ocurre por interacción entre proteínas del poro con las proteínas que se unen al ARNm producido. Las nucleoporinas (o proteínas del poro) son proteínas que conforman el poro nuclear cuya función es el transporte selectivo y direccional de las moléculas entre el núcleo y el citoplasma. Una vez que el ARNm atraviesa el poro nuclear, las proteínas nucleares que estaban unidas a él se separan para regresar al núcleo y se unen proteínas citoplasmáticas. (Lodish y col., 2005).

Figura 27. Salida del ARNm al citoplasma. A. Esquema del proceso, B. Microscopía electrónica que muestra la salida del ARN unido a proteínas. Fuente: Basado en Lodish y col., 2005.

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Un resumen de los procesos post-transcripcionales se presenta en la siguiente figura. Primero la adición de CAP, a continuación el splicing para finalizar con la adición de la cola de poliA todo ello a la vez que el ARN se está transcribiendo.

Adición del CAP

Splicing

Poliadenilación

Figura 28. Procesos post-transcripcionales. Fuente: Basado en Plano, A. y Leone, M. J., s. f.

Todo el análisis que se ha realizado, además de tener importancia para que entiendas cómo ocurre el proceso de transcripción, te permite tener conocimientos básicos para poder desempeñarte en la Ingeniería Genética. Particularmente, se quieren resaltar dos características importantes. La primera es que si, en algún momento, quieres expresar una proteína en cualquier tipo de célula, no puedes olvidar que la ARN-polimerasa II necesita un promotor para poder comenzar la transcripción por lo que en tu construcción genética deberás introducir una secuencia de este tipo. Por otro lado, has observado cómo el transcrito primario se diferencia del ARNm maduro en que el primero contiene intrones que se deben procesar y no todas las células lo hacen de la misma manera. Es por ello, que en Ingeniería Genética se utiliza el ADN complementario (ADNc), es decir, se extrae el ARN total de la célula, se purifica el ARNm (gracias a la secuencia poliA que contiene) y se realizar una retrotranscripción utilizando una transcriptasa reversa vírica.

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De esta manera, el ADNc contiene únicamente los exones que tienen la información para la síntesis de proteínas. Todos los detalles de estas técnicas se analizarán en Biología Molecular 2, ¿te parece interesante?

2.3 Traducción En la materia de Bioquímica se vio que las proteínas están formadas por 20 aminoácidos (aa) pero ¿qué diferencia una proteína de otra? ¿Cómo pueden tener características diferentes? La respuesta está en su tamaño y el orden de los aa; la información está en el gen que una vez transcrito pasa a ARNm. Como viste anteriormente, necesitamos “escribir nuestra propia palabra” para lo cual es necesario sintetizar la proteína con el orden correcto de aminoácidos. Para ello, se lee la molécula de ARNm que fue transcrita mediante el proceso de traducción, que se puede definir como “proceso en el que la información genética presente en una molécula de ARNm especifica la secuencia de aminoácido durante la síntesis de proteínas” (Lehninger, 2009). Este proceso ocurre en tres pasos importantes: iniciación (donde el ARNm y el ARNt se unirán junto con los ribosomas para comenzar el proceso), elongación (donde los codones del ARNm serán “leídos” por el ARNt y se irán uniendo los aminoácidos de manera correcta para formar la proteína) y terminación (donde el ribosoma se desprenderá del ARNm y la proteína será liberada para su posterior plegamiento). Por lo que además del ARNm, interviene el ARNt que será “quien lee el mensaje” del ARNm y el ARNr que forman los ribosomas dónde ocurrirá este proceso. Posteriormente, la proteína será plegada y modificada para que tenga la conformación correcta para ser funcional como veras en el apartado 2.3.2. La traducción es similar en procariotas y eucariotas con la diferencia en la composición de los ribosomas (como vimos anteriormente) y en algunas proteínas involucradas en el proceso. En cambio, una vez producida la proteína sí vemos diferencias entre ambos tipos celulares debido a la complejidad de las células eucariotas. ¿A qué me refiero? Cuando se produce una proteína en las células procariotas, su función tendrá lugar en el citoplasma, membrana o pared celular por lo que su transporte no es muy complicado. En cambio, en las células eucariotas, existen varios organelos y la función de los mismos es muy diferentes por lo que el transporte debe realizarse de manera correcta, ¿qué ocurriría si una enzima hidrolítica de los lisosomas queda en el citoplasma? Podría destruir la célula completa. Por ello, existen señales en las proteínas que las direccionan al organelo donde debe realizar su función y sólo cuando está libre de cualquier señal, la proteína queda en el citoplasma. Las señales más importantes para los Ingenieros en Biotecnología son aquellas que secretarán a la proteína al exterior, porque así será más fácil su recuperación y la producción de la proteína a nivel comercial será más barata. Universidad Abierta y a Distancia de México 33

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Esta señal viene dada por el péptido señal que hará que la proteína entre la Retículo Endoplásmico Rugoso, de ahí será transportado a través de vesículas al Aparato de Golgi para terminar en el exterior celular por exocitosis que puede definirse como la “fusión de una vesícula intracelular con la membrana plasmática con liberación de los contenidos de la vesícula al espacio extracelular” (Lehninger, 2009). Así mismo, una vez que la proteína es sintetizada es necesario que se pliegue correctamente para ser funcional. Por ello, existen las modificaciones post-traduccionales donde la proteína se glicosila, fosforila, adición de grupos prostéticos (ión metálico o compuesto orgánico, diferentes a un aminoácido, que está unido covalentemente a una proteína siendo esencial para su actividad).

2.3.1 Pasos de la traducción Auqne ya se ha hablado de ello, es importante recordar que en el proceso de traducción van a intervenir tres tipos de ARN: 1. El ARNm que lleva la información (en sus codones) para que se unan los aa correctos. 2. El ARNt que mediante la secuencia de su anticodón reconoce el codón del ARNm e incorpora el aa que lleva unido en el extremo 3'. 3. El ARNr que formará los ribosomas donde ocurre el proceso de traducción. Antes de mencionar los pasos de la traducción se tiene que hablar sobre el código genético (que anteriormente ya se ha nombrado). Básicamente es una especie de diccionario que establece una equivalencia entre los ribonucleótidos y los aminoácidos. Los codones (también llamados tripletes) del ARNm son reconocidos por los anticodones del ARNt que tiene unidos un aa determinado. Por ejemplo, y observando la Tabla: El código genético, podemos ver que si el codón del ARNm es un AUG, entonces será reconocido por un ARNt (con anticodón UAC) que tendrá unido una metionina; si el codón es CUG entonces el anticodón será GAC y se unirá leucina y así sucesivamente.

El código genético Primera posición (extremo 5’) U

Segunda posición

Tercera posición (extremo 3’) G

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Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ile Ile Met Val Val Val Val

Ser Ser Ser Ser

Tyr Tyr Stop Stop

Pro Pro Pro Pro

His His Gln Gln

Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala

Asn Asn Lysd lys Asp Asp Glu glu

Cys Cys Stop Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly

C A G U C A G U C A G U C A G

Tabla 2. El código genético. Esta tabla identifica el aminoácido codificado por cada triplete. Por ejemplo, el codón 5’ AUG 3’ del mRNA específica metionina, mientras que CAU específica histidina. UAA, UAG y UGA son señales de terminación 8stop9. AUG es parte de la señal de iniciación, además de codificar las metioninas interiores. Fuente: UNCOMA, s.f.

Este código genético contiene 61 codones que tienen información para un aa y 3 codones que actúan como señales para la terminación de la traducción que se conocen como codones de paro o stop. En la figura, tienes un ejemplo de la unión de codón del ARNm y el anticodón del ARNt de 2 de los 6 codones que codifican para la leucina.

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Figura 29. Unión del ARNm con el ARNt de 2 de los 6 codones que codifican para el aminoácido leucina. Fuente: de Robertis y Hib, 2005.

El código genético posee una serie de características importantes (Mc Cormack, 2007): 1. Es universal, es decir, lo utilizan todos los seres vivos conocidos excepto algunos casos excepcionales en pocos tripletes de bacterias. Aunque es importante señalar que no todos los codones están presentes en todas las células. 2. No es ambiguo ya que cada triplete tiene información para 1 aa. 3. Todos los codones tienen sentido, o bien codifican para un aa o bien indican la terminación de la traducción. 4. Está degenerado, pues hay varios codones que tiene la información para un mismo aa. Es una de las razones principales de que el Dogma de la Biología Molecular sea unidireccional, ¿lo recuerdas? De la secuencia de ARN se puede deducir la secuencia de la proteína pero no viceversa. Por ejemplo, si tienes como secuencia UUU, el aminoácido sería leucina, pero si el aminoácido es leucina, ¿cuál de los 6 codones aparece en el secuencia de ARN? Eso no lo podríamos saber. 5. Carecen de solapamiento, es decir los codones no comparten bases nitrogenadas. 6. Es unidireccional ya que los codones se leen en dirección 5’ 3.’ Universidad Abierta y a Distancia de México 36

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Como verás un poco más adelante, en todos los seres vivos se comparte el mismo codón de inicio (AUG) que tiene la información para adicionar una metionina (en las células eucariotas) y N-formamilmetionina (en caso de procariotas). Además todos los genes tienen lo que se denomina marco de lectura abierto ORF (por sus siglas en inglés “Open Reading Frame”), el cual, básicamente, es la secuencia de ADN comprendida entre un codón de inicio (AUG) y un codón de terminación. Estos ORF están flanqueados por regiones que no se traducen y que se denominan UTR (del inglés untranslated región o untranslated tráiler y generalmente posee un 5’-UTR y un 3’-UTR, como se observa en la siguiente imagen. comienzo de la transcripción

5’ca p

5’UTR

señal de poliA

ORF

codón de inicio

3’UTR

3’ poli A

codón de stop

Proteína

Figura 30. Regiones UTR y ORF de un gen. Solo el ORF tiene la información para su traducción en una proteína. Fuente: Basado en UMBIO, s.f.

En este momento ya estás preparado para deducir la secuencia proteica de un gen según lo que has aprendido sobre transcripción y el código genético. En la Figura Deducción de una secuencia genética, A tenemos la secuencia hipotética de un ADN donde se indica el inicio de la transcripción (+1) y las direcciones de las hebras. En la misma figura B, se presenta la deducción de la secuencia de ARN teniendo en cuenta que siempre ocurre en dirección 5’ 3’, que se añade la base complementaria y que en el ARN no existe T si no U. Finalmente, en la C, aparece la secuencia de proteína correspondiente teniendo en cuenta que la traducción comienza en un AUG y termina en un codón de stop. Para facilitar este análisis, se presenta la cadena de ADN que se transcribe y los codones del ORF en negrita. Es muy importante que entiendas este proceso y si tienes dudas, por favor, ponte en contacto con tu docente en línea ya que como verás al finalizar este desarrollo, una de las actividades contempladas en esta Unidad es la deducción manual de una secuencia proteica a partir de la secuencia genética. Así mismo, encontrarás las instrucciones para Universidad Abierta y a Distancia de México 37

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realizar la deducción de la secuencia utilizando software libre presente en páginas de internet como el ExPaSy (Bioinformatics Resource Portal), con ello podrás realizar la actividad integradora.

Figura 31. Deducción de una secuencia genética. A. ADN (en negrita se presenta la secuencia que se transcribe), B. ARN (en negrita se presenta el ORF), C. Proteína

Pero, ¿Qué ocurre si el promotor está del lado derecho? Entonces, la secuencia que se transcribe será la de abajo porque es la que produciría un ARNm en dirección 5’3’. Analiza la siguiente figura donde se describe un ejemplo con este caso, observa que, de todos modos, la secuencia de ARN se indica en dirección 5’ 3’.

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Figura 32. Deducción de una secuencia genética. En este caso, el promotor está en dirección contraria por lo que se transcribe la otra cadena de ADN (en comparación con la Figura anterior).

Antes de conocer cómo ocurre este proceso de traducción, paso por paso, vas a realizar la siguiente actividad. Ahora para continuar vas a revisar cómo ocurre el proceso de traducción, pero primero tienes que conocer un poco mejor a los ribosomas. Como ya se mencionó están compuestos de ARNr y un conjunto de proteínas cuya unión producen las subunidades 40S y 60S si ponemos como ejemplo una célula eucariota. La unión de ambos, durante la fase de iniciación de la traducción formará el ribosoma 80S. La subunidad pequeña (40S) tiene forma irregular. En la cara que se relaciona con la subunidad grande (60S) existe un canal donde por el que se desliza el ARNm y junto a él se observan tres áreas excavadas continuas: el sitio A (por “aminoacil”), sitio P (por “peptidil”) y el sitio E (por “exit” o salida). Así mismo, la subunidad grande tiene un forma muy irregular y en la cara que se relaciona con el canal y los sitios A, P y E de la subunidad pequeña nace un túnel por donde la proteína sale del ribosoma según se va traduciendo como se observa en siguiente figura. (de Robertis y Hib, 2005).

B Figura 33. Los ribosomas cuentan el sitio E (“exit), P (“peptidil”) y A (“aminoacil”). Fuente: Basado en Biólogo calentano, 2013.

El proceso de traducción básicamente ocurre en tres pasos: iniciación, elongación y terminación. 1. Etapa de Iniciación

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Esta etapa está regulada por proteínas citoplasmáticas denominadas factores de iniciación (IF) que provocan dos hechos separados: por un lado, el CAP del ARNm es reconocido por el factor IF-4 y por otro lado el metionil-ARNtMet se coloca en el sitio P de la subunidad pequeña del ribosoma con la ayuda del IF-2 (que obtiene la energía de una molécula de GTP). Una vez que ocurren ambos acontecimientos, el factor IF-3 con ayuda del IF-4 coloca el ARNm sobre la cara de la subunidad pequeña que posee los sitios E, P y A. De inmediato, la subunidad grande se desliza por el ARNm hasta que detecta el codón de inicio (AUG) que se coloca en el sitio P, de manera que el segundo codón del ARNm queda en el sitio A. Entre tanto, el metionil-ARNtMet ubicado en el sitio P se une al codón AUG y concluye la etapa de iniciación acoplando la subunidad pequeña con la subunidad grande (de Robertis y Hib, 2005). En la siguiente figura se observa el proceso de forma gráfica.

Figura 34. Etapa de iniciación de la traducción. Observa como el Metionil-ARNtMet se une en el sitio P de ribosoma dejando el 2º codón en el sitio A. Fuente: Lehninger, 2009.

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2. Etapa de elongación Esta etapa está regulada por factores de elongación (EF) y comienza con el ingreso de un aminoacil-ARNtAA cuyo anticodón sea complementario al segundo condón del ARNm que se está traduciendo. Esta entrada ocurrirá por el sitio A (de ahí su nombre de “aminoacil) mediada por el factor EF-1 que suministra la energía por la hidrólisis de un GTP. La proximidad de los dos aminoacil-ARNtAA produce la unión de ambos mediante un enlace peptídico y el ribosoma se recorrerá tres nucleótidos en dirección al extremo 3’ del ARNm; esta reacción se lleva a cabo gracias a la acción del EF-2 que consume una nueva molécula de GTP. Así, el codón AUG quedará en el sito E y el sitio P quedará ocupado por el 2º codón que tendrá su aminoácido unido a la metionina inicial. Como hemos indicado anteriormente, el sitio E recibe su nombre de “exit” o salida ya que es el lugar por el que el primer ARNt sale del ribosoma. Así termina el primer ciclo de elongación y da paso al ciclo siguiente ya que el sitio A está libre y puede acceder un nuevo aminoacil-ARNtAA, como se observa en la figura.

Figura 35. Fase de elongación de la traducción A. Primer paso de la elongación; B. Segundo paso de la elongación. Fuente: Lehninger, 2009.

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Este proceso es muy costoso energéticamente hablado ya que por cada aa incorporado se gasta una molécula de ATP (cuando el aa se une al ARNt) y dos moléculas de GTP (como acabas de ver). Se calcula que la velocidad de este procesos es de aproximadamente 50 aa por segundo (de Robertis y Hib, 2005). Como se ha mencionado, cuando se produce el enlace peptídico el ribosoma se desliza tres bases hacia la dirección 3’ del ARNm por lo que cada vez se aleja más del extremo 5’. Cuando se han incorporado unos 30 aa, el codón de iniciación es abordado por un nuevo ribosoma y comienza la traducción de manera simultánea (A) y se forma el polisoma que puede ser visualizado utilizando un microscopio electrónico (B).

Figura 36. Traducción A. Un único ARNm es traducido simultáneamente por varios ribosomas B. Micrografía de un polisoma. Fuentes: Martinki, 2009 y Wolfe, s.f.

3. Fase de terminación. Esta última etapa está regulada por factores de terminación (RF por sus siglas en inglés releasing factor) y tiene lugar cuando el codón de terminación (UAA, UGA o UAG) llega al sitio A del ribosoma. Debido a que no hay ningún aminoacil-ARNtAA en el sitio A, entra el RF-1 que es capaz de reconocer cualquiera de los tres codones de stop. Ante la ausencia de un nuevo aminoacil-ARNtAA, la proteína del peptidil-ARNt ubicado en el sitio P se desliga del nuevo ARNt y se independiza del ARNm y del ribosoma proceso que involucra al factor eRF-3 que consume una nueva molécula de GTP. Inmediatamente, se separan las subunidades grande y pequeña del ribosoma. Al finalizar la traducción tendremos una proteína cuyo primer aminoácido es la metionina que usualmente es removida de manera que el 2º aminoácido pasa a estar en la primera posición teniendo su extremo amino libre; de esta manera, el último aa tendrá el extremo carboxilo libre ya que Universidad Abierta y a Distancia de México 42

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el enlace peptídico ocurre entre el grupo carboxilo aportado por el último aa de la cadena en crecimiento y el grupo amino cedido por el aa del aminoacil-ARNtAA (de Robertis y Hib, 2005).

Figura 37. Fase de terminación de la traducción. Fuente: Lehninger, 2009.

La vida media del ARNm depende del tipo celular. Recordemos que el ARNm de las células procariotas no tiene modificaciones post-transcripcionales que protejan los extremos de la acción de las ARNasas por lo que su vida media es de, aproximadamente, 2 minutos. En cambio, el ARNm de las células eucariotas cuentan con una cola de poliA en el extremo 5’ de manera que las ARNasas comienzan a eliminar adeninas de este extremo pero tardan en llegar a la secuencia del ORF por lo que la vida media del ARNm

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varía entre 4 y 24 horas. El extremo 3’ está protegido gracias a la modificación química que produce el CAP (Lewin, 2008). Para finalizar este tema, se presenta un resumen del proceso de síntesis de proteínas. Observa como los genes de ADN (a la derecha) son transcritos (tanto los ARNr como los ARNt y ARNm). Por su parte, el ARNt será modificada por la Aminoacil-ARNt-sintetasa añadiendo el aa correspondiente a su anticodón y produciendo los aminoacil-ARNtAA (parte superior). Se irán acoplando los ribosomas (parte inferior) que recorrerán el ARNm hacia su extremos 5’ dejando libre el inicio para la entrada de un nuevo ribosoma formando así el polisoma. Cuando, el sitio A llegue a un codón de terminación, la proteína traducida será liberada y las subunidades de los ribosomas se desprenderán para comenzar una nueva traducción.

Figura 38. Resumen del proceso de síntesis de proteínas. Fuente: Curtis y col., 2008.

Como puedes apreciar, la secuencia de ADN determina la secuencia de proteínas y si existe alguna modificación (o mutación) se puede afectar su estructura y por lo tanto su actividad como se analizará en la 3ª unidad de esta materia. Por otro lado, cuando quieras hacer la expresión de una proteína, debes asegurarte que el gen contiene el ORF completo para que pueda producir la proteína correcta.

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En el siguiente tema vas a analizar qué pasa con las proteínas producidas ya que recuerda (como viste en Bioquímica) que las proteínas necesitan tener una conformación espacial correcta para poder estar activas y por lo tanto necesitan plegarse. Además, existen proteínas (que siempre están glucosiladas) que se secretan al exterior de las células ¿Cómo ocurren estos procesos?, A de responder esta pregunta con el siguiente tema, realiza la siguiente activad.

2.3.2 Procesos post-traduccionales La traducción tiene como resultado la síntesis de una proteína lineal pero para que ésta sea activa necesita tener una conformación tridimensional determinada. Así mismo, en muchas proteínas es necesario realizar algunas modificaciones que se denominan posttraduccionales como (Lehninger, 2009): 



   

Modificaciones amino-terminales y carboxilo-terminales ya que como hemos comentado la metionina inicial (eucariotas) y N-formamilmetionina (procariotas), y hasta el 50% de las proteínas eucariotas el amino-terminal es acetilado. Modificación de aminoácidos concretos como los residuos de serina, treonina o tirosina pueden ser fosforilados o se pueden añadir grupos carboxilos a aa como aspártico y glutámico. Unión de cadenas laterales de glúcidos o glucosilación en residuos de serina o treonina (O-glucosilación) o en residuos como asparragina (N-glucosilación). Adición de grupos isoprenilos a residuos de cisteína en la proteína. Esta acción sirve para anclar la proteína en la matriz nuclear. Adición de grupos prostéticos que son requeridos para la actividad enzimática como el grupo hemo del citocromo c. Modificación proteolítica ya que en algunos casos como, por ejemplo, la insulina, se sintetiza en forma de precursores que necesita ser recortado proteolíticamente para dar su forma activa.

En este listado, faltan dos modificaciones, que analizarás más a detalle: el plegamiento y la secreción ya que tienen una gran importancia para los Ingenieros en Biotecnología. El plegamiento definirá la conformación de la proteína que será necesaria para ser activa y la secreción viene determinada por una secuencia que dirige a la proteína al interior del Retículo Endoplásmico Rugoso. De esta manera, cuando se realiza Ingeniería Genética para obtener proteínas heterólogas (producción de la biomolécula en un organismos diferente al original) es necesario tener en cuenta ambos conceptos para hacer una correcta planeación. Ahora, analiza una por una:

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Plegamiento de proteínas Recuerda que las proteínas activas necesitan una conformación espacial determinada y que la secuencia de los aa será la clave para que tengan el plegamiento correcto por ello se distinguen diferentes niveles de organización donde se incluyen las siguientes estructuras: a. Primaria que se refiere a la secuencia lineal de aminoácidos tal y como se traducen b. Secundaria donde se forman las α-hélices y las β-plegadas c. Terciaria donde se forman los dominios protéicos d. Cuaternaria cuando se asocian varios monómeros

Figura 39. Nivel de organización de las proteínas. Fuente: Temas de bioquímica, 2008.

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El plegamiento comienza durante la traducción y las proteínas adoptan espontáneamente la conformación mínima de energía en base a la secuencia de aminoácidos de manera que los residuos hidrofóbicos se entierran en el núcleo interior. Las fuerzas que estabilizan las conformación de la proteína incluye interacciones no covalentes (puentes de hidrógeno, interacciones electrostáticas, fuerzas de Van de Waals e interacciones hidrofóbicas) e interacciones covalentes por la formación de puentes disulfuro formados entre residuos de cisteínas. En ocasiones, la proteína no puede plegarse per se y necesita de la ayuda de un complejo proteico denominado proteosoma formado por proteínas HSP presente en células eucariotas, arqueas y muy pocas enzimas, como se observa en la siguiente figura.

Figura 40. Acción de las chaperonas en el plegamiento de las proteínas. Fuente: Sabbatino, V., Lassalle, A., Gladys Gálvez, G. y Márquez, S., s.f.

Esta necesidad de plegar correctamente las proteínas es importante para tu formación como Ingeniero en Biotecnología porque no todas las células son capaces de hacerlo correctamente. Por ejemplo, si la proteína necesita del proteosoma para su plegamiento y realizas una expresión de un gen eucariota en una bacteria que no posee este complejo no podrás obtener una proteína activa ya que no podrá plegarse correctamente. En este caso, será necesario realizar un plegamiento fuera de la célula lo que puede aumentar los costos de producción. Universidad Abierta y a Distancia de México 47

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Secreción de proteínas En las células eucariotas, las proteínas pueden ser secretadas al exterior de la célula gracias a la entrada de la proteína al Retículo Endoplásmico Rugoso (RER) donde se empaqueta en una vesícula que es transportada al Aparato de Golgi para salir al exterior por exocitosis. Este proceso lo puedes observar de forma gráfica en el siguiente esquema.

Figura 41. Proceso de secreción de proteínas. Fuente: Curso de fisiología, s.f.

Pero, ¿Cómo ocurre la entrada de la proteína al RER? Todos los ARNm comienzan a traducirse en el citoplasma ya que la entrada al RER viene determinado por una secuencia de aminoácidos denominado secuencia señal o péptido señal. Cuando esta secuencia aparece en la proteína que se está traduciendo es reconocida por una proteína llamada SRP (por sus siglas en inglés: partícula de reconocimiento de la señal). A continuación este complejo es reconocido por una proteína situada en la cara externa de la membrana del RER denominada Receptor del SRP y cuando se unen abre un complejo proteico membranal que permite que el ribosoma se acople y la proteína se sintetiza de

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manera que se introduce en el lumen del RER. Una vez dentro, el péptido señal se elimina y la proteína ser plegada, glucosilada y transportada al exterior. Observa elproces en la siguiente imagen. (Lehninger, 2009).

Figura 42. Entrada de las proteínas al RER. 1. La traducción comienza en citoplasma o citosol, 2. Se traduce la secuencia señal o el péptido señal. 3. Esta secuencia de aa es reconocida por la proteína SRP. 4. El complejo se une al receptor del SRP que abre un complejo proteico y la proteína SRP se separa. 5. El SRP puede unirse con otro péptido señal recientemente traducido. 6. El ribosoma se acopla al complejo proteico abierto y la traducción de la proteína hace que ésta entre en el lumen del RER. 7. Finalmente el péptido señal es eliminado. Fuente: Lehninger, 2009.

De una manera similar se producen las proteínas transmembranales y lisosómicas pero el tema se ha centrado en las proteínas extracelulares por su importancia para los Ingenieros en Biotecnología, ¿por qué este interés? Si se quiere producir una proteína a nivel industrial, una opción es realizar su expresión (como ya se ha comentado) y para su venta, en la mayoría de los casos, será necesaria su purificación. Si esta proteína es extracelular tenemos varias ventajas: será más fácil de purificar ya que el número de proteínas extracelulares siempre es mucho menos que las proteínas intracelulares; será más fácil de obtener ya que no requerimos de ruptura celular y podemos realizar una fermentación en continuo de manera que obtengamos el extracto extracelular y las células intactas pueden seguir produciendo la proteína con un medio de cultivo fresco. Así que si estás interesado, por favor, no olvides el péptido señal para que pueda ser transportada al exterior. Universidad Abierta y a Distancia de México 49

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Así mismo, industrialmente, los hongos son los organismos más utilizados en la producción de enzimas y esta cualidad se debe a su nutrición extracelular ya que producen enzimas digestivas que secretan al exterior donde metabolizarán los polímeros (proteínas, polisacáridos, etc.) y absorberán los monómeros (aminoácidos, monosacáridos, etc.). Como se acaba de mencionar esta característica es ventajosa industrialmente hablando y por ello las amilasas, proteasas, peptidasas, etc., se producen en este tipo de organismos.

Para ampliar la información sobre este tema se recomienda leer el artículo Producción y aplicación de enzimas industriales, de Carrera, J. E. (2003), que puedes consultar en el Material de apoyo.

A continuación, se recomienda que realices la tercera actividad para que identifiques la aplicación de los procesos que has aprendido hasta este momento en la Ingeniería Genética.

2.4 Regulación genética Finalmente has llegado al último tema de la unidad: la regulación genética, la cual se refiere a los eventos para “controlar” la expresión de la información genética y de ese modo la cantidad de proteínas presentes en la célula en un momento dado (Martinki, 2009). Ya que se analizó anteriormente, que no tener suficiente proteína con una función determinada puede conllevar a la muerte de la célula, pero producir en exceso es un gasto muy alto de energía (1 molécula de ATP para unir el aminoácido al ARNt y dos moléculas de GTP durante la traducción). En este tema vas a estudiar cómo ocurre esta regulación en células procariotas y eucariotas centrándote en la regulación de la transcripción. Pero antes, debes tener claro que esta regulación genética no es la única forma de regular la cantidad de proteínas presente en la célula. En primer lugar se puede regular la transcripción del gen, de manera que si no existe no podremos tener la proteína. A continuación podemos regular los procesos posttranscripciones que se llevan a cabo así como la traducción. Finalmente podemos regular la proteína una vez sintetizada de manera que se active o se desactiva rápidamente. En este sentido, la fosforilación y defosforilación suelen ser los mecanismos más utilizados (Lehninger, 2009).

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Figura 43. Niveles de regulación de la cantidad de proteína activa. Fuente: Lehninger, 2009.

En referencia a su regulación podemos encontrar genes constitutivos, inducibles y reprimibles. Los primeros se caracterizan porque siempre se producen en la misma cantidad sin importar las condiciones ambientales o el medio de cultivo. Algunos ejemplos serían genes ribosomales o la producción de actina o miosina ya que siempre se necesitan en la célula. Los genes inducibles son aquellos que se empiezan a transcribir cuando se le añade un compuesto (denominado inductor) a diferencia de los genes reprimibles que se producen cuando se elimina un compuesto denominado represor, como se observa en el siguiente esquema. (Lehninger, 2009).

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Figura 44. Regulación de la transcripción. A. Inducción, la expresión comienza cuando se añade un inductor (en este caso lactosa). B. Represión, la expresión comienza cuando se elimina el represor (en este caso el triptófano). Fuente: Curtis y col., 2008.

La regulación de la expresión genética ocurre de manera diferente en células procariotas y en células eucariotas ya que, como verás a continuación, los genes se acomodan de manera diferente. En procariotas, un mismo promotor regula la expresión de varios genes cosa que no ocurre en las células eucariotas. Por ello, realizarás el análisis por separado.

2.4.1 Regulación en procariotas: los operones En los procariotas es común la existencia de operones, un grupo de genes que se encuentran muy próximos y son regulados por un operador y un promotor (de Robertis y Hib, 2005). Una imagen de su estructura se puede apreciar en la siguiente figura.

Figura 45. Estructura de operón bacteriano. Conjunto de genes que están regulados por el mismo operador y un mismo promotor. Fuente: Lehninger, 2009.

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Para explicar cómo ocurre la regulación de estos operones analizarás un operón inducible (el operón lac) y un operón reprimible (operón trp). Se iniciará con el operón lac, que está constituido por un promotor, un operador y 3 genes denominados lacZ, lacY y lacA. El gen lacZ codifica para la enzima β-galactosidasa que cataliza la reacción de hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa. El gen y que codifica para la proteína galactósido permeasa cuya función es facilitar el transporte de la galactosa al interior de la bacterias y el gen a que codifica para una transferasa cuya función no está relacionada con el metabolismo de la lactosa aunque se regulan del mismo modo. Cuando la célula está creciendo en un medio sin lactosa, no es necesaria la síntesis de estas proteínas por lo que su expresión es mínima (expresión basal) y el regulador está ocupado por un represor que impide que la ARN-polimerasa pueda transcribir los genes. En cambio, cuando la lactosa está presente en el medio de cultivo, ésta se introduce al interior celular (gracias a la expresión basal de la galactósido permeasa) y la β-galactosidasa (también por la expresión basal) metaboliza la lactosa en alolactosa que se une al represor desactivándolo. De esta manera, la ARN-polimerasa está libre para transcribir lo genes necesarios para la degradación de este azúcar y conseguir los azúcares (glucosa y galactosa) y obtener energía de su catabolismo,como se observa a continuación. (de Robertis y Hib, 2005).

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Figura 46. Regulación del operón lac. A. Estructura del operón. B. Cuando no existe alolactosa el represor está activo y no se produce la transcripción de los genes. C. Cuando existe alolactosa en el medio se une al represor de manera que se desactiva y la transcripción tiene lugar. Fuente: Proyecto Biosfera, s.f.

Ahora el siguiente es el operón reprimible trp. En este caso el operador regula la expresión de genes involucrados en la síntesis de este aminoácido y la situación cambia respecto al ejemplo anterior. Si la célula está creciendo en presencia de triptófano, no necesita producir el aminoácido. En cambio, cuando éste está ausente es necesaria su síntesis para poder producir las proteínas. De esta manera, cuando la célula crece en presencia de triptófano, éste actúa como co-represor uniéndose al represor activándolo de manera que se impide la transcripción. Cuando el aminoácido está ausente, no existe coUniversidad Abierta y a Distancia de México 54

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represor de manera que el represor se desactiva y la transcripción tiene lugar (de Robertis y Hib, 2005).

Ausencia del triptófano

Represor inactivo

Síntesis de 5 proteínas

Presencia del triptófano

No hay transcripción Represor

Trp (co-represor)

Figura 47. Regulación del operón reprimible Trp. Fuente: Basado en Figueroa, P., s.f.

Para finalizar conocerás el mismo proceso de la regulación pero ahora en las células eucariotas.

2.4.2 Regulación en eucariotas En las células eucariotas los genes cuentan con su propio promotor. Los genes constitutivos únicamente se activan con los factores de transcripción basales (como lo viste anteriormente) en cambio en los genes reprimibles o inducibles, lo factores de transcripción específicos tendrán un papel fundamental, (como se aprecia en la figura). Su unión propiciará que se la ARN-polimerasa II reconozca (inducción) o no (represión) al promotor (de Robertis y Hib, 2005).

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Figura 48. Acción de un factor de transcripción específico. Cuando se transcribe el regulador, éste se une al promotor permitiendo el reconocimiento de la ARN-polimerasa II que comienza la transcripción. Fuente: de Robertis y Hib, 2005.

Aunque existen numerosos factores de transcripción, éstos comparten dominios con estructuras secundarias y terciarias que nos permiten su clasificación en un número limitado de familias (de Robertis y Hib, 2005): a. Hélice-vuelta-hélice. Esta estructura consta de dos cadenas de aminoácidos con forma de hélice separadas por una “vuelta” o cadena más corta. Una de las hélices se unen al regulador del gen y la otra mantiene la hélice en la posición adecuada. Comúnmente esta proteína está acompañada por otra simétrica formando dímeros.

Figura 49. Dominio con forma de hélice-vuelta-hélice (en rojo) unida una molécula de ADN (en morado). Fuente: Robertis y Hib, 2005.

b. Cremallera de leucina. Consta de dos cadenas polipéptidicas en paralelo que forman una hélice. Cada cadena posee dos sectores, uno que se une al ADN y otro que lo hace con su homólogo para formar el dímero. Los sectores unidos

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entre sí presenta, cada 7 aa (que corresponden a dos vueltas de la hélice) una leucina que da al interior.

Figura 50. Dominio con forma de cremallera de leucina (en rojo) unida una molécula de ADN (en morado). Fuente: Robertis y Hib, 2005.

c. Dedos de zinc. Cada dominio está compuesto por una secuencia corta de aminoácidos y un átomo de zinc el cual se liga tetraédricamente a cuatro cisteínas o dos cisteínas y dos histidinas. Estas son las estructuras entre los factores de transcripción.

Figura 51. Dominio con forma de dedos de zinc (en rojo) unida una molécula de ADN (en morado). Fuente: Robertis y Hib, 2005.

d. Hélice-bucle-hélice. Esta estructura (Figura 50) tiene una configuración parecida a la cremallera de leucina, con dos cadenas polipéptidicas con dos sectores funcionales cada una: el específico rico en aminoácidos básicos (que se une al ADN) y el responsable de la polimerización. Se diferencia de la cremallera de leucina porque sus partes dimerizadas no se encastran.

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Figura 52. Dominio con forma de hélice-bucle-hélice (en rojo) unida una molécula de ADN (en morado). Fuente: Robertis y Hib, 2005.

Anteriormente se analizó la condensación del ADN y viste que cuando está altamente condensado (heterocromatina) parece que la transcripción no tiene lugar, a diferencia de la eucromatina donde el ADN se encuentra menos enrollado y la transcripción tiene lugar. Si recurdas, las histonas son proteínas claves en el empaquetamiento del ADN y parece que la acetilación de las mismas (específicamente H3 y H4) disminuye el enrollamiento de la cromatina lo que favorece la unión de los factores de transcripción. Por otro lado, hay otro mecanismo de regulación genética denominado metilación de la citosina (metilcitosina o mC) la cual ocurre en secuencias CG, de manera que en una cadena de ADN está presente mC-G y en la cadena complementaria aparecerá G-mC. Cuando esta modificación está presente en un promotor, la transcripción se inhibe pero cuando está presente en el gen, parece que no afecta a la síntesis de ARNm (de Robertis y Hib, 2005). Como ves, hay múltiples formas de regular la expresión genética ya que es necesario tener la cantidad exacta: si tienes poco puedes morir por falta de la proteína que sintetice; por ejemplo, si es clave en el catabolismo no podrás tener la energía que necesitas para realizar tus funciones; o si está implicada en la estructura de algún organelo éste no realizará su función correctamente. Así mismo, tener una cantidad excesiva de la proteína en cuestión también es contraproducente, ¿recuerdas cuánta energía se gasta en la síntesis de las proteínas? Es por ello, que la regulación es la clave del bienestar celular. Si se conoce bien este proceso es posible manipular el medio o las condiciones de cultivo para que nuestro organismo de estudio produzca la proteína de interés. Por poner un ejemplo, anteriormente se ha mencionado del interés industrial de enzimas como las amilasas, cuya función es degradar el almidón liberando monómeros de glucosa. Este gen está reprimido por glucosa (cuando está presente no se transcribe, en cambio cuando está ausente la transcripción tiene lugar). De esta manera, si queremos producir amilasas en altas concentraciones es necesario eliminar la glucosa del medio de cultivo o nunca podremos producirla y eso sólo lo sabremos si conocemos cómo se regula el gen. Universidad Abierta y a Distancia de México 58

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Con esto llegamos al final del desarrollo de esta unidad, ahora se te invita a realizar las actividades que se prepararon para ti, ¿te animas?

Actividades La elaboración de las actividades estará guiada por tu docente en línea, mismo que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como los envíos que tendrán que realizar.

Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BBM1_U2_A1_XXYZ, donde BBM1 corresponde a las siglas de la asignatura, U2 es la unidad de conocimiento, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Autorreflexiones Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación. Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BBM1_U2_ATR _XXYZ, donde BBM1 corresponde a las siglas de la asignatura, U2 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno

Cierre de la unidad Durante el desarrollo de esta unidad tuviste oportunidad de conocer que la síntesis de proteínas es un proceso clave para la vida celular y éste ocurre a través de varios

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procesos: la transcripción (seguida de las modificaciones post-transcripcionales en las células eucariotas), la traducción y las modificaciones post-traduccionales. Así mismo, advertiste que la regulación es igual o más importante que el mismo proceso de síntesis de proteínas ya que recuerda que tener poco nos puede llevar a la muerte pero sintetizar de más es realizar un gasto de energía muy alto que podría ser utilizado en otros procesos como la reproducción. Todo ello, lo has ido analizando a través de los diferentes ejemplos y actividades que te permitieron aplicar los conocimientos adquiridos. Así mismo, este conocimiento te permite como Ingeniero en Biotecnología manipular las condiciones ambientales o la composición del medio de cultivo para que el organismo de interés produzca una mayor concentración de la proteína de interés. Así como elegir correctamente los elementos genéticos que se deben utilizar para poder expresar un gen ya sea en el mismo organismo (expresión homóloga) o en otro microorganismo (expresión heteróloga) utilizando técnicas de Ingeniería Genética.

Para saber más

Para comprender mejor los temas que se han expuesto en esta unidad se te recomienda revisar las siguientes fuentes: Curtis, E., Barnes, S.N., Schnek, A. (2008) Biología (7ª ed.). Argentina: Médica Panamericana. Revisa los capítulos 13, 14 y 17. Es un libro básico de biología pero para un primer acercamiento acerca de los procesos de síntesis de proteínas, puede ser de gran ayuda. De Robertis, E., Hib, J. (2005) Fundamentos de Biología Celular y Molecular (4ª ed.). Argentina: El Ateneo. Este libro se me hace muy interesante ya que la información viene Universidad Abierta y a Distancia de México 60

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bastante resumida pero muy clara y completa además de que las figuras apoyan el texto para un mejor entendimiento. Particularmente, revisa los capítulos 14, 15 y 16. http://es.scribd.com/doc/23794366/Tips-de-arn En esta página encontrarás información sobre la estructura y los tipos de ARN presentes en las células. http://www.inmegen.gob.mx/es/divulgacion/glosario-de-terminos Encontrarás definiciones sobre varios términos utilizados en esta unidad como ARN, ARN, mensajero, expresión genética, transcripcion, traducción, etc. Con videos sencillos que nos ayudan a entender cada concepto. http://sintesis-jmr.blogspot.mx/2010/11/arn-mensajero-arn-de-transferencia-html se definen, muy brevemente, cada uno de los tres ARNs más importantes involucrados en la síntesis de proteínas. http://www.maph49.galeon.com/sinte/addaa.html se muestra el esquema y una breve explicación de la función de la enzima Aminoacil-ARNt-sintetasa en la unión del aminoácido al ARNt. http://www.aulanets.net/WQ/transcripcion/lectura.html En esta página se hace un análisis breve de la transcripción en las células procariotas. http://acasti.webs.ull.es/docencia/Tercer%20parcial/lista%20de%20temas/tema27/tema27. pdf Esta página está bastante completa y habla de la transcripción en células procariotas. http://docencia.izt.uam.mx/japg/RedVirtualJAP/CursoDRosado/5_BiologiaMolecular/3Transcripcion3enEucariotes.pdf Cambiando a la transcripción de las células eucariotas, no puedes dejar de visitar esta página ya que el proceso está muy completo. http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Transcripcion/Transcripcion.htm Esta página analiza la transcripción con sus diferentes pasos y te explica los diferentes mecanismos para finalizar el proceso. http://storage.canalblog.com/29/38/269315/85665721.pdf En esta página, únicamente aparece un esquema con las diferencias entre la transcripción de las células procariotas y eucariotas pero que es importante analizar. http://www.fbmc.fcen.uba.ar/materias/g1/genetica/teoricas/Regulacion-2do-2010parte2.pdf Aquí encontraras una presentación muy completa que explica los procesos post-transcripcionales (adición de CAP, splicing y adición de poliA). http://docencia.izt.uam.mx/japg/RedVirtualJAP/CursoDRosado/5_BiologiaMolecular/4ProcesamientoRNAm.pdf También encontrarás una presentación sobre el procesamiento del ARNm muy interesante e incluso está mejor explicada que la anterior. http://genetica2012.wikispaces.com/intron Explica qué son los intrones y cómo se eliminan por el proceso de splicing. Aunque está muy resumido considero que es bastante claro. http://www.bionova.org.es/biocast/tema19.htm Esta página de Alejandro Porto Andión es muy completa y habla desde un poco de historia, algunos experimentos claves en la Biología Molecular, hasta la replicación, expresión genética y su regulación. Por favor, no dejes de revisar este documento tan interesantes, completo y bien explicado.

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http://faciasweb.uncoma.edu.ar/academica/materias/morfo/ARCHIVOPDF6/PARTE8/DUP LICACIoN3_codigo_genetico.pdf Aquí encontrarás una explicación del código genético y sus características más importantes. http://biologocalentano.blogspot.mx/2012/05/722-estructura-ribosomal.html Si quieres conocer un poco mejor la estructura de los ribosomas tanto procariotas como eucariotas, no dudes en visitar esta página donde la información es bastante completa. http://mipaginapersonal.movistar.es/web3/mantmedina/flujo.htm Aunque la información está muy resumida, aquí puedes encontrar definiciones sencillas de trasncripción y traducción pero lo que es interesante son los videos que incluye ya que te ayudarán a reforzar tus conocimientos. http://temasdebioquimica.wordpress.com/2008/10/01/estructura-primaria-de-las-proteinas/ Si no recuerdas bien la estructura de los aminoácidos y cómo ocurren los enlaces peptídicos, visita esta página, incluso tiene un video de cómo ocurre el enlace entre el amino-terminal de una aminoácido y el carboxilo-terminal del aminoácido con el que se va unir. http://genomasur.com/lecturas/Guia11.htm Este es otra página que no puedes dejar de visitar. Habla sobre la “Naturaleza molecular del gen y del genoma” y describe desde la estructura del ADN hasta la síntesis de proteínas, sin omitir la regulación de la expresión génica y cómo ocurren los procesos post-traduccionales incluyendo el plegamiento de las proteínas. http://212.128.130.23/eduCommons/ciencias-biosanitarias/bioquimica-biosintesis-demacromoleculas/contenidos/11.%20Plegamiento%20de%20Proteinas.pdf También una página interesante donde encontrarás una presentación donde se analiza el plegamiento de las proteínas. http://www.iqb.es/cbasicas/fisio/cap04/cap4_1.htm ¿Necesitas recordar cómo están constituidas las células eucariotas y cuál es la función de cada organelo? Visita esta página. Recuerda que la secreción de proteínas involucra el Retículo endoplasmático Rugoso y el Aparato de Golgi por lo que tendrás que refrescar la información que se analizó de ambos en la materia de Biología Celular. http://recursostic.educacion.es/ciencias/biosfera/web/estudiante/2bachillerato/genetica/con tenido13.htm Si no te ha quedado claro cómo funcionan los operones bacterianos y cómo se regulan, visita esta página, te ayudará. http://pathmicro.med.sc.edu/spanish/chapter9.htm Esta página, al igual que la anterior, explica cómo funcionan los operones bacterianos. Lehninger, A. (2009). Bioquímica. México: Omega. Aunque es un libro enfocado a Bioquímica más que a Biología Molecular, se explican los procesos que hemos analizado en esta unidad. Particularmente en los capítulos 25, 26 y 27. Lewin, B. (2008) Genes IX, México: McGraw-Hill/Interamericana. Este es uno de los libros más completos que existen sobre Biología Molecular, continuamente salen nuevas versiones que incluyen los nuevos descubrimientos.

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Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P., Baltimore, D., Darnell, J. (2005) Biología Celular y Molecular (5ª ed.). Argentina: Médica Panamericana. Si algún día tiene oportunidad, este libro es muy bueno. La explicación es clara y además viene acompañado de un CD con animaciones que te ayudan a entender cómo funciona una célula. Martinki, J. (2009) Brock Biología de los Microorganismos. (12a ed.) EEUU: AddisonWesley. Con este libro, ocurre algo parecido a Curtis y colaboradores (2008); aunque es de Microbiología, los conceptos básicos pueden ser de utilidad. Revisa los capítulos 7, 8 y 10. Peteira, B., Rodríguez, M.G., Rosales, C. Salazar, E. (2008). Uso de técnicas moleculares en la identificación de nematodos entomopatógenos y sus bacterias simbiontes. INIA HOY 3: 1-16. Aunque la revisión está centrada en la identificación de nematodos, las técnicas que se analizan en este texto se utilizan para la identificación de cualquier organismo eucariota. Rodicio, M. R. y Mendoza, M. C. (s. f.) Identificación bacteriana mediante secuenciación del ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones en microbiología clínicas. En: Puesta al día en métodos microbiológicos para el diagnóstico clínico. Capítulo 11, pp. 8187. Recuperado de: http://www.icb.uncu.edu.ar/upload/rodiciocap11.pdf . Este artículo es muy interesante y te habla de la utilización de los genes ribosomales para la identificación de las bacterias.

Fuentes de consulta

Básicas: 1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (2010) Biología Molecular de la Célula, (5ª ed.) EEUU: Garland Publishing. ISBN: 9788428215077. Universidad Abierta y a Distancia de México 63

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2. Curtis, E., Barnes, S.N., Schnek, A. y Massarini. (2008) Biología. (7ª ed.) Argentina: Médica Panamericana. ISBN: 9789500603348. 3. Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Stryer, L. (2007) Bioquímica. España: Reverté. ISBN: 9788429176001. 4. de Robertis, E., Hib, J. (2005) Fundamentos de Biología Celular y Molecular de Robertis. (4ª ed.). Argentina: El Ateneo. ISBN 9789500203845 5. Lehninger, A. L. (2009). Bioquímica. México: Omega. ISBN: 9788428214865 6. Lewin, B. (2008) Genes IX. México: McGraw-Hill/Interamericana. ISBN: 9780763740634. 7. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P., Baltimore, D., Darnell, J. (2005) Biología Celular y Molecular. (5ª Ed.), Argentina: Médica Panamericana. ISBN 9789500613743. 8. Martinki, J. (2009) Brock Biología de los Microorganismos. (12a Ed.). EEUU: Addison-Wesley. ISBN: 9788478290970. Complementarias: 1. ARN-Polimerasa bacteriana. [Imagen]. Modificada de: http://www.aulanet.net/WQ/transcripcion/lectura.html 2. Biólogo calentano. (2012, Mayo 13). [Imagen sin título de descripción del trabajo]. Recuperado de: http://biologocalentano.blogspot.mx/2012/05/722estructura-ribosomal.html 3. Curso de fisiología. (s.f.). Proceso de secreción de proteínas. [Imagen].Recuperado de http://www.iqb.es/cbasicas/fisio/cap04/cap4_1.htm 4. Figueroa, P. (s.f.). Regulación del operón reprimible Trp. [Imagen]. Recuperado de: http://pathmicro.med.sc.edu/spanish/chapter9.htm 5. Galeón.com, hispavista (s.f.). Función de la Aminoacil-ARNt-sintetasa. [Imagen]. Recuperado de: http://www.maph49.galeon.com/sinte/addaa.html 6. INMEGEN. (2012). Estructura del ARNm presente en una célula eucariota. [Imagen]. Recuperado de: http://www.inmegen.gob.mx/es/divulgacion/glosariode-terminos 7. Mansfield, M. y Seogchan, K. (s.f). Estructura de los genes ribosómicos en eucariotas. [Imagen]. Recuperado de: http://www.phytophthoradb.org/protocols.php 8. Mazenett, R. y Zarante, I. (s.f.). [Imagen sin título de descripción del trabajo]. Recuperado de: http://genetica2012.wikispaces.com/intron 9. Plano, A. y Leone, M. J., (s. f.). Procesos post-transcripcionales. [Imagen]. Recuperado de: (http://aportes.educ.ar/biologia/nucleo-teorico/estado-delarte/como-se-encienden-y-apagan-los-genes-el-dogma-central-de-la-biologiapaso-a-paso/transcripcion.php?page=2

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