Unidad 3. Introducción a la ingeniería genética by Jazina Ruiz Hernández

Programa de la asignatura:

Biología molecular II

Introducción a la ingeniería genética

Biología molecular II Introducción a la ingeniería genética

Índice Presentación de la unidad ......................................................................................................... 2 Propósitos.................................................................................................................................. 3 Competencia específica ............................................................................................................ 3 3.1. Clonación............................................................................................................................ 4 3.1.1. Enzimas de restricción .................................................................................................... 5 3.1.2. Clonación de genes (vectores de clonación) ................................................................ 15 3.1.3. Transformación y transfección. ..................................................................................... 20 Actividades .............................................................................................................................. 24 Autorreflexiones....................................................................................................................... 24 Cierre de la unidad .................................................................................................................. 24 Para saber más ....................................................................................................................... 25 Fuentes de consulta ................................................................................................................ 26

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Presentación de la unidad Bienvenido a la última unidad de esta asignatura, a lo largo de su estudio pudiste conocer algunas de las técnicas más prácticas y más utilizadas por los biólogos moleculares para estudiar el ADN y las proteínas. Los conocimientos que has adquirido hasta este momento te permitirán extraer, purificar, cuantificar y secuenciar ácidos nucleicos y proteínas. Sin embargo, la biología molecular va más allá en el estudio de estas biomoléculas. El conocimiento que adquiriste en las unidades anteriores constituye la base para el tema que vamos a abordar en la presente unidad; la ingeniería genética, misma que podemos definir como la aplicación de las técnicas moleculares en la manipulación o mejora de un organismo. En nuestra vida cotidiana cada vez hay más ejemplos de la presencia de organismos genéticamente modificados: Se habla de maíz, trigo, sorgo, jitomates, entre otras plantas que han sido modificadas al incluirse de manera artificial genes de otros organismos para mejorar su capacidad productiva o para brindarles resistencia contra plagas o depredadores naturales. En la investigación científica, el uso de bacterias, levaduras, roedores y muchos otros organismos modificados han constituido una herramienta poderosa para el avance de la ciencia; por ejemplo, el uso de ratones mutados en algunos genes ha permitido comprender la etiología de algunas patologías importantes como el cáncer o la diabetes, o en otros casos algunas enfermedades auto inmunes como la artritis. En la investigación básica el modificar bacterias, virus, levaduras o células de mamífero introduciéndoles un gen de otra especie o apagando un gen propio resulta una práctica cotidiana; incluso estos avances han llegado a permear en industrias como la farmacéutica y la alimenticia donde se emplean también organismos genéticamente modificados para producir a gran escala anticuerpos, hormonas, proteínas y enzimas, por mencionar algunos (Lodish, 2006). En esta unidad tendrás la oportunidad de integrar los conocimientos que recién has adquirido sobre la biología molecular y adentrarte en el estudio de los fundamentos de la ingeniería genética como es el empleo de las conocidas enzimas de restricción; tijeras moleculares que permiten buscar, cortar y extraer un gen de una célula para ingresarlo en otra en dos procesos de modificación de organismos conocidos como transformación y transfección, estos procesos constituyen la base de la ingeniería genética y te serán de gran utilidad en tu formación como biotecnólogo. ¡Bienvenido!

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Propósitos

Esta unidad te permitirá integrar los conocimientos y técnicas aprendidos sobre biología molecular aplicándolos a la ingeniería genética través del análisis de tres casos concretos que constituyen la base de esta disciplina: Restricción de genes para clonación, diseño y construcción de vectores de clonación y modificación genética de organismos.

Competencia específica

Analizar la ingeniería genética a través del estudio de las técnicas de biología molecular para identificar sus aplicaciones en el campo de la biotecnología como la modificación genética de organismos.

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3.1. Clonación La palabra clonación hoy en día nos es familiar ya que ha sido muy utilizada sobre todo en las historietas de los superhéroes modernos donde un científico duplica a un superhéroe o a sus poderes. Este término tiene sus orígenes en la lengua griega, concretamente en la palabra klon, que significa retoño; como el retoño de una planta que si bien es un organismo independiente, genéticamente es idéntico a la planta que le dio origen. Cuando un jardinero extrae un “piecito” de un árbol o una planta para resembrarlo en realidad está llevando a cabo una de las prácticas de clonación más antiguas del mundo. De hecho, existen especies que de manera natural recurren a la clonación como mecanismo de reproducción asexual; como las bacterias, algunos protozoarios como las amibas, una gran variedad de plantas, animales como las pulgas de agua (Daphnia magna), estrellas de mar y gusanos, entre otros. Científicamente, el término clonación implica generar copias idénticas de un organismo, célula ya desarrollado, incluso ya no sólo se aplica a organismos, si no a moléculas como el ácido desoxirrobonucléico (ADN); en concreto, los genes. Las herramientas moleculares que has estudiado hasta el momento permiten identificar y extraer un gen para clonarlo y obtener miles de copias de este mediante PCR, del inglés Polimerase Chain Reaction o reacción en cadena de la polimerasa, para después insertarlo en un organismo que de manera natural no presenta ese gen. Como puedes figurarte, la ingeniería genética constituye una de las más altas esferas de la investigación científica, con un impacto tal que sus beneficios han trascendido hasta la industria y el puente que ha unido a estos dos sectores es la biotecnología, que desde luego engloba a la ingeniería genética (Alberts, 2008). Para poder modificar genéticamente a un organismo primero es necesario tener a disposición el gen que se pretende introducir, por ejemplo: Supón que requieres modificar genéticamente a una amiba introduciéndole un gen de bacteria que codifica para una proteína que no tiene la amiba de manera natural. Primero necesitas extraer ese gen de la bacteria, para lo cual puedes extraer el ADN de ésta, diseñar primers específicos para ese gen y clonarlo por PCR como lo aprendiste en la unidad uno. Ahora que ya cuentas con el gen es necesario introducirlo a la amiba para lo cual necesitas un sistema de transporte que te permita ingresarlo y asegurar que el gen se multiplique o clone dentro de la amiba o incluso que se exprese. Los vectores de clonación o de expresión son los instrumentos ideales para tal efecto, son paquetes de información que puedes diseñar a medida en función de las características del gen que pretendes clonar y para construirlos requieres de cuatro elementos; el gen, el vector, enzimas de restricción que son las tijeras moleculares que cortarán y empalmaran todos

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los elementos y una enzima que una todos los elementos, la ligasa. (Amrita University, 2012 Finalmente, cuando hayas construido tu vector, necesitarás introducirlo en el sistema que hayas elegido para que la modificación genética tenga efecto. En esta unidad conocerás algunos de los protocolos más efectivos y sencillos que te permitirán modificar genéticamente a un organismo. ¿Verdad que es emocionante?

3.1.1. Enzimas de restricción Los inicios de la ingeniería genética se remontan al siglo pasado, a la década de 1970, con el estudio de los genomas de organismos como E.coli y Drosophila melanogaster; En esos momentos las herramientas disponibles permitían estudiar el genoma de estos organismos como una unidad; es decir, se estudiaba el comportamiento del genoma completo, más orientado hacia la genética y los mecanismos relacionados con la herencia, debido a que no se disponía de las herramientas que permitieran identificar y extraer una porción del genoma que tuviera un interés particular como los genes (recordemos que los genes son pequeñas unidades de ADN que almacenan información) distribuidos a lo largo de todo el genoma. Si tomamos en cuenta que el genoma de una célula es enorme y resulta casi imposible manipularlo de manera completa, ya que en la búsqueda del fragmento que nos interesa estudiar nos perderíamos en un universo de millones de nucleótidos; por ejemplo ¡el genoma de la bacteria E. coli tiene una longitud de 4.6 millones de bases! El genoma humano es mucho más grande (Curtis, 2004). La solución a este problema apareció con el descubrimiento de un grupo de enzimas bacterianas conocidas como nucleasas de restricción, estas enzimas tienen una actividad muy particular. Mediante el análisis básico de estas proteínas (como lo viste en la unidad dos) provenientes de diferentes bacterias se logró su capacidad para degradar cadenas de ADN ajeno al bacteriano proveniente tal vez de algún patógeno como los virus. Este mecanismo de defensa las enzimas lo llevan a cabo reconociendo secuencias de entre 4 y 8 pares de bases dentro del ADN extraño; La nucleasa se monta sobre el ADN extraño recorriéndolo y cuando identifica esta secuencia cataliza la hidrólisis del enlace fosfodiester que une a los nucleótidos de las cadenas de ADN rompiéndolas en dos, a esta secuencia se le conoce como sitio de corte, que es donde la nucleasa ejerce su acción (Lodish, 2006, Alberts, 2008). Visto de otro modo, las nucleasas de restricción funcionan como tijeras moleculares que cortan la cadena de ADN, pero no lo hacen de manera indiscriminada o desordenada, tienen la peculiaridad de cortar la doble cadena sólo en sitios específicos reconociendo una secuencia en particular, al romper la doble cadena es posible que se rompa la continuidad de un gen patógeno impidiendo su replicación y expresión, logrando así, una defensa efectiva ya que al cortarlos se impide la expresión del genoma intruso que eventualmente es degradado por las enzimas bacterianas y desechado. Universidad Abierta y a Distancia de México

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Como se muestra en la figura: en el número 1 se observa una línea azul simulando una cadena de ADN, dentro de esta existe un gen marcado con color rojo, dentro del ADN extraño existen secuencias que las nucleasas son capaces de reconocer que se conocen como secuencias de corte (en amarillo) Puede darse el caso que estas secuencias de corte están contenidas dentro de algún gen del patógeno. Como puede verse en este ejemplo, dentro del gen (en rojo) existen tres secuencias de corte para nucleasas. En el paso 2 se observa como las nucleasas reconocen dichas secuencias de corte posicionándose sobre ellas para llevar a cabo el corte de la doble hélice. En el paso 3 se observa el material genético fraccionado por acción e las nucleasas, este ADN ya no representa ningún peligro para la bacteria, el gen que contenía ya no puede ser transcrito ni traducido a proteína por lo que queda inservible.

Figura 1. La imagen del mecanismo de reconocimiento y corte de ADN extraño mediado por nucleasas de restricción bacterianas.

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Esta capacidad de cortar sólo en sitios específicos es lo que las hace útiles como herramienta molecular ya que si se emplean para cortar un genoma en particular siempre y en todos los casos se obtendrán los mismos patrones de corte, la constancia y reproducibilidad en este patrón de corte es lo que las hace tan valiosas como tijeras moleculares empleadas en el proceso de corte y confección de la ingeniería genética (Alberts et al; 2004). Como lo ilustra la siguiente imagen: En la columna de arriba, en color azul se observa una franja que representa un fragmento de ADN que contiene un gen que se pretende extraer para insertarlo en otro organismo. Para poder extraerlo es necesario conocer la secuencia de la cadena de ADN (que se puede conocer mediante la secuenciación de Sanger, como se vio en la primera unidad). En este ejemplo, las secuencias que interesan son las que flanquean al gen a la izquierda y derecha, ya que con base en éstas pueden elegirse un par de nucleasas que corten específicamente en estos sitios dejando el ADN íntegro y liberándolo del resto del ADN. En el centro, las secuencias que flanquean el gen están señaladas en color amarillo, la secuencia de la izquierda tiene un sitio de corte que reconoce la nucleasa 1 mientras que la de la derecha contiene un sitio de corte para la nucleasa 2. Cuando estas enzimas se incuban con el ADN lo recorrerán hasta que cada una reconoce sólo su sitio de corte específico y catalizarán la ruptura del ADN.

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Figura 2. Restricción de un gen de interés con enzimas de restricción, los cortes que estas enzimas catalizan pueden ser de extremo romo (A) o pegajoso (B).

El corte puede darse de dos formas; puede ser recto o romo como en el caso de la nucleasa 1 o puede ser escalonado o pegajoso, como el de la nucleasa 2. Se le conoce de este modo ya que el corte deja un fragmento de cadena sencilla de unos cuantos nucleótidos, recordemos que las cadenas sencillas de ADN tienden a formar puentes de hidrógeno “pegándose” con cualquier secuencia complementaria, como se observa en la última figura. Los fragmentos obtenidos tras el corte con una nucleasa pueden ser extraídos y purificados para su análisis posterior o por el contrario mediante el corte con una nucleasa

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se puede abrir un espacio en una cadena de ADN donde se puede incluir un fragmento de ADN y es aquí donde comienza la ingeniería genética. En la siguiente figura se ejemplifica el proceso básico a través del cual las nucleasas cortan el ADN, cada corte genera dos extremos que para fines prácticos se les conoce como extremos romos (Fig. a) cuando el corte es parejo o bien pueden formar un corte en escalera generando extremos pegajosos o cohesivos (fig. b), ya que al quedar un pequeño fragmento de cuatro nucleótidos de cadena simple pueden unirse nuevamente a una secuencia complementaria formando puentes de hidrógeno.

Figura 3. Algunas nucleasas pueden efectuar cortes parejos en la cadena que están restringiendo, a estos se les denominan extremos romos (a). Algunas otras pueden producir extremos pegajosos o cohesivos (b), se denomina así debido a que al tener en cada extremo fragmentos de cadena simple, estos pueden hibridar con ellos mismos o con otras moléculas que tengan una secuencia complementaria.

Como comentamos con anterioridad, la secuencia de corte que reconocen las enzimas de restricción es un palíndromo; una secuencia que sin importar el sentido en el que se lea (3´-5´o 5´-3´) es la misma. En el siguiente cuadro se concentran algunas de las enzimas de restricción utilizadas con mayor frecuencia: su nombre comercial, organismo del que provienen, secuencia palindrómica de corte y tipo de extremo que generan, la figura dos brinda un claro ejemplo de como algunas de estas nucleasas ejercen su efecto sobre el ADN.

Enzyme

Source Microorganism

Recognition Site

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Ends Produced

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Bam-HI

Bacillus amyliliquefaciens

Sticky

Eco-RI

Escherichia coli

Sticky

HindIII

Haemophilus influenzae

Sticky

Kpnl

Klebsiella pneumonia

Sticky

Pstl

Providencia stuartii

Sticky

Sacl

Streptomyces achromogenes

Sticky

SalI

Streptomyces albue

Sticky

Smal

Serratia marcescens

Blunt

Sphl

Streptomyces phaeochromogenes

Sticky

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Xbal

Xanhomonas badrii

Sticky

Tabla 1. Principales enzimas de restricción, organismo del que provienen, secuencia de corte y tipo de extremo que generan tras la restricción. Fuente: (Lodish, 2006).

El conocer la secuencia del ADN que se pretende extraer es de suma importancia ya que permite elegir las nucleasas cuya secuencia de corte coincida con las secuencias que flanquean al gen, si se elige una enzima cuya secuencia de corte caiga dentro del gen lo cortará en dos, dejándolo inservible. Esta técnica de ingeniería genética es crucial para la modificación de organismos y es utilizada a nivel mundial incluyendo, desde luego, a México.

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Figuera 4. Mecanismo de corte de las nucleasas más utilizadas en ingeniería genética. Fuente: Alberts, 2004.

Al día de hoy nos es posible conocer tanto la actividad metabólica de estas enzimas así como la secuencias sobre las que actúan, esto no hubiera sido posible sin la Universidad Abierta y a Distancia de México

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implementación de las técnicas moleculares que estudiaste en las dos primeras unidades de esta asignatura. Al principio de esta unidad hicimos una analogía entre la ingeniería genética y el oficio de corte y confección, en verdad estas dos actividades tienen mucha similitud, ya que un sastre corta diferentes fragmentos de telas y los une para formar una prenda completamente diferente a la materia prima que ocupó para confeccionarla, de igual manera lo hace la ingeniería genética; sólo que en lugar de tela, se emplea ADN de diferentes orígenes que se cortan mediante enzimas de restricción, con la finalidad de confeccionar una nueva molécula de ADN, puede ser por ejemplo, la inclusión de un gen de resistencia a plagas a una planta que no lo tenía o unidades genéticas conocidas como vectores de clonación o vectores de expresión que estudiarás más adelante. En este proceso de corte y confección molecular es necesario contar con una herramienta que haga de hilo o costura para unir nuevamente las piezas de ADN para crear la nueva molécula, ésta herramienta también es una enzima y se conoce como ligasa. Como su nombre lo indica esta enzima puede unir dos fragmentos de ADN entre sí, restableciendo el enlace fosfodiester utilizando ATP en el proceso, no importa si son extremos romos o pegajosos, con la ligasa y ATP se unirán nuevamente como lo ilustra la siguiente figura.

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Figura 5. Mecanismo de ligación de dos fragmentos de ADN utilizando la enzima ligasa. Fuente: Alberts, 2004.

Para resumir se puede mencionar que la ingeniería genética permite cortar segmentos de interés de ADN como los genes y con ellos confeccionar nuevas moléculas con diferentes Universidad Abierta y a Distancia de México

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fines, entre ellas la clonación a gran escala de esa secuencia, estos procesos se llevan a cabo utilizando enzimas de restricción, nucleasas de origen bacteriano que son capaces de romper moléculas de ADN dejando extremos pegajosos o romos que posteriormente pueden ser reensamblados por la enzima ligasa que mediante la hidrólisis de ATP reestablece el enlace fosfodiester entre dos fragmentos de ADN. Ahora, antes de continuar con el siguiente tema, vas a llevar a cabo la siguiente actividad.

Para comprender como se llevan a cabo los procesos de restricción y ligación te recomendamos que analices el video: Enzima de restricción. (2010) que se encuentra en la red.

Finalmente, es importante destacar que las enzimas de restricción constituyen herramientas moleculares vitales para el desarrollo de la ingeniería genética, el conocimiento de estas enzimas y su funcionamiento influye en el éxito de procesos tan complicados como la clonación por lo que se convierten en puntos clave de la ingeniería genética. En el siguiente tema revisarás qué son los vectores de clonación, mismos que son necesarios para llevar a cabo la clonación, pues estos son los vehículos para lograr la replicación, es decir los que llevan la información de un organismo a otro.

3.1.2. Clonación de genes (vectores de clonación) Para la ingeniería genética, un vector es un medio que transporta y transfiere información genética de un organismo a otro, es decir, un paquete que acarrea genes de un lado a otro. En la naturaleza, los virus han sido los vectores naturales más estudiados ya que tienen la función de transmitir su material genético a las células que infectan, para la ingeniería genética los plásmidos constituyen los vectores más utilizados para ingresar ADN a una célula para modificarla genéticamente. Revisando los conceptos básicos de biología molecular, recuerda que un plásmido es una molécula de ADN circular que dentro contiene uno o más genes y un origen de replicación o de expresión A través de los plásmidos pueden ingresarse genes especiales dentro de bacterias o células eucariontes para modificarlas genéticamente, cuando se modifican células bacterianas por medio de plásmidos (al introducirles un gen que no tenían de manera natural) el proceso se conoce como transformación mientras que para el caso de célula eucariontes se denomina transfección y aunque como veremos más adelante el proceso es el mismo, los vectores o plásmidos empleados son muy diferentes. Universidad Abierta y a Distancia de México

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Figura 6. Estructura básica de un plásmido, incluye un origen de replicación, sitios de corte para varias enzimas de restricción y un gen de resistencia a antibióticos que sirve como mecanismo de selección de células transformadas.

Como se observa en la figura, la estructura del ADN que ingresan es muy similar a la de un plásmido bacteriano; tiene un sitio donde inicia la replicación llamado Ori, una región que contiene los sitios de corte para varias enzimas de restricción, esto permite elegir las enzimas de restricción que mejor se adapten al gen que se desea incluir y un gen de resistencia a antibióticos como la tetraciclina o ampicilina. Este último sirve como indicador de que la bacteria ha recibido el plásmido y que éste funciona correctamente, ya que cada vez que la bacteria se replique replicará y expresará también el plásmido y los genes que este contenga (Fig. 7), de tal modo que si se cultivan las bacterias transformadas en un medio con tetraciclina o ampicilina, el gen de resistencia (que por lo general es una enzima que degrada al antibiótico como la betalactamasa) les permitirá sobrevivir solo a las bacterias que lo estén expresando y con mucha seguridad expresarán también el gen de interés que se les ha introducido.

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Figura 7. Proceso de selección de colonias transformadas utilizando el gen de resistencia a antibióticos incluido en el plásmido. Fuente: Argenbio, s.f.

A continuación se te presentan algunos de los plásmidos que por su estructura y eficiencia se han convertido en los más utilizados por la comunidad científica para la transformación y transfección de células. El plásmido pBR322 es uno de los vectores de clonación para la transformación de E. coli más utilizados, tiene la capacidad de aceptar un inserto de ADN (un gen) de hasta 4361pares de bases, la zona rep alberga al replicón, que es el encargado de replicar el plásmido, contiene también al gen rop que promueve la conversión de la enzima RNA1 que es inestable a RNA2, mucho más estable y sirve para disminuir el número de copias.

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El gen bla es el de resistencia y codifica para la enzima b-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina mientras que el gen tet confiere resistencia para tetraciclina, esto permite elegir el mejor sistema de enzimas de restricción.

Figura 8. Imagen del mapa de restricción del plásmido pBR322 thermo cientific. Las flechas grises indican la posición de los genes que contiene, en naranja se ilustran las enzimas de restricción que acepta este plásmido mientras que los números de color negro indican el número de nucleótido donde tienen efecto. Fuente: Termhoscientific, s.f.

El plásmido pcDNA 3.1 (+) es un vector de 5400 pares de bases y fue diseñado la transfección de células de mamífero, en su estructura cuenta con el promotor de transcripción temprana SV40 del citomegalovirus humano Pcmv que se adapta a una gran variedad de células de mamífero (entre las que se encuentran las humanas) además cuenta con múltiples sitios de clonación directa y reversa (Sitios PCMV y BGH)lo que facilita la adaptación de los insertos y su posterior clonación, los genes de resistencia que emplea son los de neomicina y ampicilina que permiten seleccionar las clonas que recibieron el plásmido de manera estable. Universidad Abierta y a Distancia de México

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Figura 9. Mapa de restricción del plásmido pcDNA de la marca invitrogen para células de mamífero, cuenta con múltiples ori y sitios que permiten la transcripción directa y en sentido reversa , dos genes de resistencia y multiples sitios de restricción para 14 nucleasas. Fuente: Invitrogen, s.f.

Como puedes observar, ambos plásmidos tienen básicamente la misma estructura, las diferencias radican en si están diseñados para transformación (E. coli) o transfección (células de mamíferos) si diseño les confieren ciertas ventajas como la posibilidad de elegir la dirección en el que se replica el plásmido y las enzimas de restricción que pueden emplearse en función del gen que se pretende incluir. Existen varias casas comerciales que ofrecen ambos plásmidos con características similares, los que aquí se presentan sólo tienen una finalidad ilustrativa.

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Para comprender el proceso de construcción de vectores de clonación se te recomienda que busques en la red los siguientes videos: Clonación de un gen en un plasmido vector de Emabiolog, (2013). Y Transformation of Host Cells. (Video en inglés) de la Amrita University (2012).

Para concluir este tema es importante mencionar que sin los vectores de clonación sería imposible realizar el proceso completo pues estos componentes forman parte importante del proceso de clonación. Es importante por lo tanto que conozcas bien el papel que juegan en los proceso de transformación y transfección que verás a continuación.

3.1.3. Transformación y transfección. En este momento tu conocimiento sobre la ingeniería genética ya es amplio; has analizado algunas de las herramientas moleculares más utilizadas en la ingeniería genética como son las enzimas de restricción, su funcionamiento y aplicaciones; también has identificado y estudiado algunos de los vectores de clonación más utilizados en la ingeniería genética para transformar o transfectar células, incluso has sido capaz de diseñar un vector de clonación para resolver un caso concreto, esta información puede permitirte llevar a cabo clonaciones de los genes que pudieran resultar de interés en tu práctica como biotecnólogo. Ahora ya estás preparado para desarrollar organismos genéticamente modificados, sin embargo, para conseguirlo es necesario lograr que el plásmido atraviese la membrana de la célula que se pretende transformar o transfectar, este es un proceso complicado ya que hay que lograrlo sin romper la membrana, porque esto implicaría la muerte de la célula. Como en todos los procesos que hemos estudiado, existen varios protocolos que permiten la transformación o transfección de las células, algunos incluso son muy sofisticados ya que requieren el uso de kits comerciales para poder llevarlo a cabo, lo que los hace muy caros, además de innecesarios ya que existen protocolos muy sencillos que pueden llevarse a cabo en cualquier laboratorio, que requieren pocos materiales y que si se ejecutan de la manera correcta pueden tener una eficiencia extremadamente alta, igual que la que ofrecen los kits comerciales que cuestan varios miles de pesos. A continuación abordaras dos de los protocolos más utilizado la transformación y transfección de células.

Transformación utilizando cloruro de calcio (CaCl2) Lo primero es crecer un cultivo de E. coli, para tener suficiente cantidad de células competentes. Una célula competente es aquella que se encuentra lista para ser modificada, posteriormente las células se centrifugan por 7 minutos a 1600 rpm para Universidad Abierta y a Distancia de México

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concentrarlas y eliminar el medio de cultivo en el que crecieron, posteriormente se resuspenden en 10 ml de una solución de CaCl2 10 mM enfriada previamente en hielo, esta solución permite que en la membrana se facilite la formación de poros por los cuales se introducirán los plásmidos. Las células se centrifugan nuevamente por cinco minutos a 1100 RPM a 4°C y se deshecha el sobrenadante para resuspender el pellet nuevamente en 2 ml de CaCl2 frio. Se toma un alícuota de 100 µl de células competentes y 10 ng del plásmido pRB322 que contiene el gen que se pretende introducir a la bacteria. Inmediatamente se sumerge el tubo que contiene las células en agua a 42°C por dos minutos, éste es el paso más importante, recordemos que las células están a una temperatura de 4°C en hielo, el sumergirlas en agua a 42°C les provoca el esperado shock térmico que induce la formación de grandes poros en la membrana por los cuales se introducirán los plásmidos. Los poros no duran mucho tiempo abiertos, el estrés generado por el procedimiento no es demasiado agresivo para las bacterias por lo que se recuperan rápidamente. Terminado el procedimiento se agrega 1 ml de medio de cultivo LB especial para crecer E. coli y se agita a 250 RPM por 1hr a 27°C para permitir que las células crezcan. Pasado el tiempo el cultivo líquido se resiembra en cajas Petri con medio LB sólido conteniendo ampicilina y se permite que las bacterias crezcan por 24 horas, ya que el cultivo contiene ampicilina sólo permitirá el crecimiento de aquellas bacterias que han sido transformadas y por ende contienen dentro de si el plásmido con el gen de resistencia al antibiótico y desde luego el gen que interesa clonar (Abusel, 2002).

Para formarte una idea de cómo se lleva a cabo este proceso se te recomienda revisar el siguiente video, mismo que podrás encontrar en la red: How to Transform DNA into Competent Cells. (Video en inglés) de LabTricks.com (2010).

Ahora en el siguiente protocolo revisarás como se lleva a cabo la transfección de células eucariontes.

Transfección de células eucariontes utilizando fosfato de calcio Asumiendo que ya se tiene el cultivo de células eucariontes listas para transfectarse,

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Para preparar el plásmido a transfectar primero es necesario precipitarlo con ayuda de una microcentrífuga para después resuspender el pellet en 450 µl de PO42Ca3 Colocar 500 µl de buffer HeBS 2X en un tubo falcon de 15 ml y agregar la solución de ADN/ PO42Ca3, permitir la precipitación por gravedad por 20 minutos a temperatura ambiente Utiliza una pipeta Pasteur para redistribuir el precipitado en una placa de 10 cm agitando suavemente Incubar por 4 a 16 horas bajo condiciones de crecimiento estándar (37°C, Co2 5%) y posteriormente incubarlas en el medio de selección. (Ausubel, 2002) Para el caso de las bacterias, un mecanismo de selección no es complicado pues con el descubrimiento de los genes de resistencia a antibióticos el problema queda resuelto, basta con incluir en el plásmido cualquiera de estos genes, transformar a las bacterias con éste e incubarlas en presencia del antibiótico y ¡listo! sobrevivirán las que hayan incluido al plásmido, con las células eucariontes se tiene el problema de que ¡los antibióticos no les afectan! ¿Entonces, que empleamos como mecanismo de selección? La respuesta brillará ante nosotros en color verde. En el mar existe una medusa, la Aequorea victoria o gelatina cristal es una medusa bioluminiscente, puede producir de manera natural un hermoso color verde fluorescente mediante una reacción química: Un pigmento conocido como luciferina es el sustrato de las enzimas llamadas Luciferasa y GFP del inglés Green Fluorescent Protein o proteína verde fluorescente. Ante una señal de estrés la medusa incrementa la concentración de calcio intracelular, entonces la luciferasa cataliza la descarboxilación de la luciferina transformándola en oxiluciferina que tiene la capacidad de emitir luz de color azul, la cual, es transferida a la GFP en forma de energía de fluorescencia. La GFP emite entonces un color verde fluorescente característico de la medusa. Mediante la manipulación de ADN se logró el aislamiento del gen que codifica para la proteína verde fluorescente y aquí tenemos a nuestro sustituto del gen de resistencia a antibióticos. Los plásmidos utilizados para transfectar células eucariontes utilizan genes conocidos como reporteros, las proteínas que codifican estos genes catalizan una reacción colorimétrica que permite seleccionar a las clonas transfectadas visualmente, es decir, cuando se agrega el sustrato de estas enzimas se produce un color, sólo las células transfectadas correctamente presentarán este color y serán seleccionadas. El gen de la GFP es un gen reportero, al incluirse en los plásmidos y transfectarse en células eucariontes, las que lo contengan fluorescerán de color verde lo que permitirá su selección. En la actualidad existen varias proteínas que emiten luz en distintos colores, su funcionamiento es similar al de la GFP, sin embargo, esta proteína de medusa fue la primera adoptada por la ingeniería genética como herramienta de selección y sigue siendo una de las más usadas.

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Figura 10. Estos ratones verdes fueron transfectados con la GFP en las primeras fases de su desarrollo embrionario, todas sus células heredaron el gen GFP y son capaces de expresarlo, es por esta razón que estos pequeñines tienen este peculiar color cortesía de la medusa y de la ingeniería genética. Fuente: Ultimas noticias ciencia. 2011.

Para comprender mejor el concepto de transfección se te recomienda que analices los siguientes videos que podrás consultar en la red: Introduction to transfection., de Promega Video. (2013) y GFP- Green fluorescent protein, de doctr31 (2009).

Como puedes ver los procesos de transfección son relativamente simples, requieren pocos elementos para llevarse a cabo y mucha concentración y paciencia, ahora conoces dos métodos sencillos y eficaces que te permitirán modificar genéticamente una gran variedad de células, en tu práctica profesional como futuro ingeniero en biotecnología.

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Actividades La elaboración de las actividades estará guiada por tu docente en línea, mismo que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como los envíos que tendrán que realizar. Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BBM2_U3_A1_XXYZ, donde BB2 corresponde a las siglas de la asignatura, U1 es la unidad temática, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Autorreflexiones Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación. Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BBM2_U3_ATR _XXYZ, donde BBM2 corresponde a las siglas de la asignatura, U3 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Cierre de la unidad Acabas de concluir la tercera y última unidad de esta asignatura, en este punto cuentas con habilidades y conocimientos básicos que te permitirán extraer, purificar, caracterizar, secuenciar, clonar y sintetizar ADN y proteínas. El dominar las técnicas de manipulación y análisis de ADN y proteínas son la base para tener éxito en la ingeniería genética, sin estos conocimientos la modificación genética de organismos resultaría en extremo difíciles, sin embargo el factor determinante para tener éxito en esta ciencia es el cuidado con el que lleves a cabo estos protocolos, debes procurar trabajar con tiempo, respetar rigurosamente tiempos, concentraciones y parámetros para garantizar el éxito de tu trabajo, el éxito de la ingeniería genética es para aquellos que tienen la paciencia para perseguirlo.

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Biología molecular II Introducción a la ingeniería genética

Te exhortamos a que continúes tu preparación con mucho empeño para que puedas convertirte en un biotecnólogo de éxito.

Para saber más

Para ahondar más en tus conocimientos sobre la ingeniería genética se te recomiendan las siguientes lecturas de libre acceso para que identifiques las posibles aplicaciones de lo que has aprendido en esta unidad 

Díaz Granados, C., Chaparro Giraldo, A. (2012). Métodos y usos agrícolas de la ingeniería genética aplicada al cultivo del arroz. Revista Colombiana de biotecnología [on line], vol.14 (2) Bogotá. Disponible en: www.revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/.../39789

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Chaves-Bedoya G., Ortiz-Rojas L. (2011). Ingeniería genética vegetal para resistencia viral y vectores virales en genética reversa. Orinoquia, [On line]. vol.15 (2). Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S012137092011000200003&script=sci_arttext

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Biología molecular II Introducción a la ingeniería genética

Fuentes de consulta

Básica: 

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Lodish, H. Berk A., Matsudaira P., Kaiser C., Krieger M., Scott M., Zipursky and Darnell, J. (2006). Biología Celular y Molecular. 5ª ed. México: Panamericana. ISBN: 10:950-06-1374-3 Alberts, B. Johnson, A., Lewis J., Raff M., Roberts K y Walter P. (2008). Biología Molecular de la Célula. 5ª ed. España: Omega. ISBN 9788428215077 Solomon, E., et.al. (2008). Biología. 8ª ed. México: McGraw-Hill. ISBN: 978-84282-1507-7 Curtis, S., Barnes, M. (2007). Biología. 7ª ed. México: Panamericana. ISBN 9789500603348

Complementaria: 

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Alberts B., Bray L., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K. and Walter P. 2004. Essential cell biologi. 2nd Edition. Garland Science. New York. ISBN: 08153-3480-X. Ausubel F., Brent R., Kingston R., Moore D., Seidman J., Smith J. and Struhl K. 2002. Short protocols in molecular biology. 5th edition. USA: Wiley Argenbio, s.f. Bacterias, plásmidos y proteínas recombinantes. [Imagen]. Recuperado de: http://www.argenbio.org/adc/uploads/imagenes_doc/ingenieria_genetica/plasmidor ecombinante.jpg Termhoscientific, s.f. Mapa de restricción del plásmido pcDNA. [Imagen]. Recuperado de: http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/home?storeId=11152&langId=-1

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Ultimas noticias ciencia. 2011. ¿Qué es la proteína verde? [Imagen]. Recuperado de: http://www.noticiascientificas.info/2011/01/que-es-la-proteina-verdefluorescente.html User manual for pc DNA tm 3.1 (+) / (-) catalog nos. V790-20 and V795-20. Version K. 10 November 2010. Invitrogen

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