Programa de la asignatura:
IngenierĂa de biorreactores I
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Biotransformaciones
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Ingeniería de biorreactores I Biotransformaciones
Índice Presentación de la unidad…………………………………………………………………………2 Propósitos de la unidad……………………………………………………………………………3 Competencia específica…………………………………………………………………………...4 1.1. Concepto de biotransformación……………………………………………………………..4 1.1.1. Procesos biocatalizados……………………………………………………………………6 1.1.2. Fundamentos de la biocatálisis……………………………………………………………7 1.2. Teoría de la catálisis enzimática…………………………………………………………...10 1.2.1. Cinética enzimática………………………………………………………………………..11 1.2.2. Mecanismo de reacción enzimática……………………………………………………..15 1.3. Factores que afectan la cinética enzimática……………………………………………...17 1.3.1. Especificidad……………………………………………………………………………….19 1.3.2. Desnaturalización………………………………………………………………………….20 1.3.3. pH…………………………………………………………………………………………...21 1.3.4. Temperatura……………………………………………………………………………….22 1.3.5. Inhibición……………………………………………………………………………………22 1.3.6. Inmovilización de enzimas………………………………………………………………..25 Actividades………………………………………………………………………………………...27 Autorreflexiones…………………………………………………………………………………...28 Cierre de la unidad………………………………………………………………………………..28 Para saber más……………………………………………………………………………………29 Fuentes de consulta………………………………………………………………………………30
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Presentación de la unidad ¿Sabías que hoy en día las transformaciones biológicas de la materia tienen gran auge y que los bioprocesos son indispensables para la producción de antibióticos, probióticos, biopolímeros, biocombustibles? La respuesta a esta pregunta tiene fundamento en las biotransformaciones, que son aquellos procesos por los que una sustancia se convierte en otra a través de una reacción bioquímica o un conjunto de ellas. Estos procesos pueden llevarse a cabo en equipamientos específicos denominados biorreactores. Para ser capaz de diseñarlos, es necesario, como punto de partida, que comprendas cuáles son las sustancias y factores que pueden o no favorecer dichos bioprocesos; de ahí la importancia del estudio de esta primera unidad. Para comenzar, debes considerar que la velocidad de una reacción química se aumenta o disminuye agregando una sustancia llamada catalizador. En el caso particular de las reacciones químicas orgánicas, estos biocatalizadores reciben el nombre de enzimas, las cuales hacen posibles los procesos de degradación de algunas sustancias complejas; la transformación de una en otra o la producción de nuevos compuestos a partir de otros más pequeños (figura 1). Nuevos compuestos Sustrato Enzima
Figura 1. Representación del proceso de degradación de una sustancia (sustrato) por una enzima. Fuente: personas.ya.com, s.f.
¿Sabías que las enzimas son importantes en los procesos industriales? Por ejemplo, el detergente en polvo tiene unas enzimas llamadas lipasas que remueven selectivamente las manchas de manteca, aceite o lápiz labial de la ropa, o bien, proteasas que remueven las manchas de sangre y huevo.
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Otra enzima de amplia aplicación industrial es la lactasa, la cual se emplea para la producción de leche deslactosada, o las dextrinas que en presencia de una amiloglucosidasa y la β-amilasa se convierten en jarabes que se usan en industrias, tales como: producción de bebidas, confitería, fermentaciones, helados, alimentos infantiles y muchas más. Estas enzimas son amigables con el ambiente ya que permiten remplazar compuestos químicos poco biodegradables, minimizar el uso del agua y por supuesto, el consumo de energía. Las enzimas que se usan actualmente son producidas por bacterias y hongos, las cuales se reproducen en grandes equipos llamados biorreactores o fermentadores. Estos equipos proveen a los microorganismos, los requerimientos necesarios para su correcto crecimiento y reproducción, tales como: mezclado, suministro de oxígeno, nutrientes, control de pH, entre otros. Así, a través del desarrollo de la presente unidad, conocerás con más detalles qué es y para qué sirve una enzima, cuales son los factores que afectan su actividad y cómo puedes medir la velocidad de una reacción catalizada por este grupo de sustancias.
Propósitos de la unidad
El estudio de esta unidad te permitirá: Identificar que la mayor parte de las enzimas son específicas de acuerdo al tipo de reacción que catalizan.
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Diferenciar entre las seis clases principales de enzimas: oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Describir el mecanismo enzimático relacionado con el proceso de catálisis. Identificar aquellos factores que influyen en las propiedades catalíticas de las enzimas y por ende en su actividad tales como: especificidad, temperatura, pH, inhibición e inmovilización.
Competencia específica
Analizar el empleo de enzimas dentro de la biocatálisis y biotransformaciones mediante el estudio de la cinética enzimática para describir la influencia de los distintos factores físico-químicos.
1.1. Concepto de biotransformación ¿Alguna vez te has preguntado cuáles son los bioprocesos y los mecanismos responsables de que la fermentación de la piña se lleve a cabo? o bien ¿qué sustancias son las responsables de la conversión del alimento en la boca, en el estómago y en el intestino? Todos estos fenómenos, se llevan a cabo gracias al empleo de enzimas que actúan como biocatalizadores, a través del proceso llamado biotransformación. Las biotransformaciones son aquellos procesos que emplean biocatalizadores (enzimas) para la conversión de sustratos y obtener, a partir de ellos, un producto de amplia utilidad (figura 2).
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Glucosa
Sacarosa
Fructosa
Enzima
Figura 2. Ejemplificación de un proceso de biotransformación de sacarosa para producción de glucosa y fructosa. Fuente: genomasur.com, s.f.
Un ejemplo de biotransformación tiene lugar cuando la leche se almacena en bolsas hechas con estómagos de terneras recién sacrificadas (figura 3), así, las enzimas ahí presentes, dan lugar a la formación de una sustancia semisólida y fácil de almacenar que conoces con el nombre de queso.
Figura 3. Producción de queso. Fuente: emverde, s.f.
¿Te imaginas todo lo que puedes llegar a crear a partir de las biotransformaciones? Hoy día se acepta incluso, que estos procesos sustituirán en gran parte a la síntesis orgánica, con lo que, se evitarán problemas de contaminación ambiental, ya que los biocatalizadores son biodegradables, las condiciones suaves de trabajo implican poco consumo energético y por tanto, poco costo y emisión de contaminantes. A través del desarrollo del presente tema comprenderás la importancia de la biocatálisis en los procesos industriales, así como las ventajas y desventajas de su uso, lo que te permitirá analizar el empleo de enzimas dentro de los bioprocesos.
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1.1.1. Procesos biocatalizados Tal como se mencionó en la introducción del tema, el proceso de biotransformación también recibe el nombre de biocatálisis. La palabra biocatálisis proviene de dos términos: bio=vida y catálisis=acelerar. Dentro de cada ser vivo, se realizan un sin número de reacciones químicas, las cuales se efectúan de manera simultánea y a temperaturas moderadas. Las transformaciones se llevan a cabo gracias a un conjunto de moléculas orgánicas denominadas enzimas, que actúan como catalizadores biológicos acelerando las reacciones dentro de los organismos. Por lo tanto, el objetivo de la biocatálisis es el uso de las enzimas y de dichas reacciones con fines tecnológicos. Para desarrollar procesos biocatalíticos a gran escala, se suelen seguir las etapas a continuación citadas:
Etapas de un proceso biocatalítico
Etapa 1
•Elección del organismo a cultivar: este debe contener una cantidad importante de metabolitos que faciliten la generación del producto de interés, además de ser fácil de conseguir y cultivar, así como, ser económicamente viable.
Etapa 2
•Ensayos a nivel laboratorio: permite estudiar el comportamiento de los microorganismos, es decir, conocer: su velocidad de crecimiento, condiciones óptimas de nutrientes, pH, temperatura, oxígeno disuelto, velocidad de agitación, entre otros.
Etapa 3
•Escalado a nivel planta piloto: permite determinar los parámetros de diseño, materiales de construcción, operaciones unitarias, impurezas, corrosión, procedimientos operativos y problemas de trabajo y ambientales.
Etapa 4
•Escalado a nivel planta industrial: se genera el producto de interés a gran escala y a niveles rentables.
La naturaleza proteica de los biocatalizadores permite que las moléculas se degraden fácilmente, recuerda que en contraposición hay catalizadores químicos que, al estar constituidos por metales pesados, son difíciles de destruir. Sin duda, las ventajas de los
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biocatalizadores no sólo se limitan al aspecto ambiental, sino también al desarrollo de diversas áreas industriales, tales como: la farmacéutica, la alimentaría y la de cosméticos, entre otras. Para seguir documentándote y comprendiendo el subtema, es recomendable que realices la lectura del documento “Biotransformación”, de la Escuela Politécnica del Ejército de Ecuador (2012). El este texto encontrarás el concepto de biotransformación y biocatálisis, los bioprocesos industriales en los que está involucrado y finalmente, sus ventajas y desventajas.
1.1.2. Fundamentos de la biocatálisis De acuerdo a lo estudiado en el subtema anterior, las enzimas o biocatalizadores, son las moléculas encargadas de acelerar las biotransformaciones. Para comprender lo previamente citado, a continuación se explicará el mecanismo por el que ocurre una reacción química ordinaria. En una reacción química una o más sustancias, dan lugar a la formación de productos, por una serie de reacomodos en los enlaces químicos de los reactivos de partida. Para que esto ocurra, se requiere de una cierta cantidad de energía, a la que se denomina energía de activación. La forma más común de proporcionar dicha energía, es a través del incremento de la temperatura, sin embargo, existen transformaciones que deben verificarse a temperatura ambiente. Para favorecer estos procesos, se emplean catalizadores, cuya función es disminuir la energía activación, requiriéndose de menos calor para que se lleve a cabo la reacción (Figura 4).
Figura 4. Reacción química catalizada. Fuente: The oil crash, 2013.
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Pues bien, las enzimas son complejos proteínicos, encargados de disminuir la energía necesaria para que se realicen reacciones químicas al interior de los organismos biológicos (figura 5).
Figura 5. Biocatálisis de una reacción. Fuente: Luengo, L., s.f.
Estos biocatalizadores, actúan sobre una sustancia denominada sustrato. Al unirse a él, a través del sitio activo (parte funcional de la enzima), se forma un complejo (complejo enzima-sustrato) que posteriormente da lugar al producto de interés, tal como se muestra en la siguiente figura 6:
Figura 6. Formación de complejo enzima-sustrato. Fuente: Luengo, L., s.f.
De acuerdo a ITESCAM (s.f.), la actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como proteína (tal como la observada en la figura anterior), mientras que otras necesitan, además, uno o más componentes no proteicos, llamados cofactores. El cofactor puede ser un ion metálico o bien una molécula orgánica, llamada coenzima, aunque algunos enzimas necesitan de ambos. El cofactor puede estar fuertemente unido Universidad Abierta y a Distancia de México
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a la proteína (suele ser el ión metálico, aunque puede igualmente ser un coenzima) y recibe entonces el nombre de grupo prostético, o débilmente unido, por lo que en realidad actúa como un sustrato específico de la enzima (co-sustrato; suele ser una molécula orgánica, coenzima). El complejo enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la proteína restante, que por sí misma es inactiva catalíticamente, se designa con el nombre de apoenzima (Figura 7).
Cofactor
Sitio activo
Coenzima
Apoenzima Holoenzima Figura 7. Holoenzima-apoenzima. Fuente: Pearson Education, 2006.
Las enzimas se clasifican, de acuerdo al tipo de reacción que catalizan, en:
Oxidorreductasas: catalizan reacciones de transferencia de electrones. Transferasas: catalizan reacciones de transferencia de grupos químicos específicos. Hidrolasas: catalizan reacciones de ruptura o de unión de grupos químicos, asociadas con la ruptura o la síntesis de una molécula de agua. Liasas: catalizan la ruptura o la formación de uniones químicas, con la formación o eliminación de enlaces dobles. También llamadas Sintasas. Isomerasas: desplazan grupos químicos dentro de una molécula, sin cambiar la fórmula general del substrato. Ligasas: catalizan reacciones de unión de moléculas, asociadas con la hidrólisis de nucleósidos trifosfato (principalmente ATP). También llamadas Sintetasas.
Para concluir este tema, es importante enfatizar que los procesos de biotransformación o biocatálisis son importantes ya que reducen riesgos de contaminación, esta es una de
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las razones por las que se han convertido en una herramienta valiosa para la sociedad, especialmente dentro del campo industrial. La naturaleza proteica de los biocatalizadores permite que las moléculas se degraden fácilmente, recuerda que en contraposición hay catalizadores químicos que, al estar constituidos por metales pesados, son difíciles de destruir. Sin duda, las ventajas de los biocatalizadores no sólo se limitan al aspecto ambiental, sino también al desarrollo de diversas áreas industriales, tales como: la farmacéutica, la alimentaría, la de cosméticos, entre otras. Es importante, para el control de un bioproceso, conocer aspectos fundamentales de los biocatalizadores empleados, tales como los mecanismo de reacción y cinética enzimática, mismos que serán abordados en el siguiente tema.
1.2. Teoría de la catálisis enzimática ¿Sabías que las enzimas son biocatalizadores que pueden llegar a acelerar unas 106 veces más la velocidad de una reacción? Así, por ejemplo, un proceso de fermentación que sin ayuda de enzimas podría tardar hasta 180 días en efectuarse, bajo condiciones normales de temperatura, puede reducirse de 15 a 20 días, interesante ¿no crees? Tal como estudiaste en el tema anterior, en todos los sistemas vivos se realizan reacciones químicas que por sí mismas ocurren a velocidades muy bajas. Las enzimas son herramientas moleculares que permiten que dichas reacciones ocurran a niveles útiles para las células (figura 8).
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Figura 8. La catálisis permite que las reacciones costosas transcurran por caminos mucho más sencillos. Fuente: WILEY-VCH, 2008.
Entonces… ¿Cómo se determina la velocidad con que se efectúa una reacción en presencia de un biocatalizador? Pues bien, esta incógnita será respondida a través del desarrollo del presente tema, que tiene como propósito que analices cómo la presencia de enzimas dentro de una reacción química influencia la velocidad de la misma. Asimismo, identificarás las herramientas que te permitirán calcular la afinidad que tiene un biocatalizador por un sustrato y la velocidad máxima que puede llegar a adquirir.
1.2.1. Cinética enzimática La actividad enzimática se mide cuantificando la velocidad de reacción, que generalmente se expresa como cambios de concentración por unidad de tiempo, es decir, la cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. El comportamiento característico de la mayoría de las enzimas se describe a través de la ecuación de Michaelis-Menten que muestra la relación entre la velocidad inicial y la concentración de sustrato. Tal como se estudió en el tema anterior, las reacciones químicas que se efectúan en presencia de biocatalizadores, ocurren en dos etapas (figura 9):
Etapa 1. La enzima se une, a través del sitio activo, al sustrato, formando el complejo enzima-sustrato. Etapa 2. El complejo enzima-sustrato da lugar a la generación del producto, liberando la enzima para volver a iniciar la etapa 1.
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Etapa 2 Etapa 1
Figura 9. Etapas de una reacciĂłn biocatalizada. Fuente: BiologĂacelular-iq.blogspot.mx, 2010.
En la etapa 1 puede distinguirse que se forma el complejo enzima-sustrato, sin embargo, cierta parte de dicho complejo, se disocia para restablecer la enzima libre y el sustrato; en cambio, en la etapa 2, el complejo enzima-sustrato se disocia para generar la enzima libre y el producto; de tal forma, que las velocidades con sus respectivas constantes cinĂŠticas, para cada uno de los procesos individuales, se pueden expresar como: đ?‘Ł1 = đ?‘˜1 [đ??¸][đ?‘†]
đ??¸đ?‘Ąđ?‘Žđ?‘?đ?‘Ž 1: đ?‘“đ?‘œđ?‘&#x;đ?‘šđ?‘Žđ?‘?đ?‘–Ăłđ?‘› đ?‘‘đ?‘’đ?‘™ đ?‘?đ?‘œđ?‘šđ?‘?đ?‘™đ?‘’đ?‘—đ?‘œ đ?‘’đ?‘›đ?‘§đ?‘–đ?‘šđ?‘Ž − đ?‘ đ?‘˘đ?‘ đ?‘Ąđ?‘&#x;đ?‘Žđ?‘Ąđ?‘œ
đ?’—đ?&#x;? = đ?’Œđ?&#x;? [đ?‘Źđ?‘ş]
đ??¸đ?‘Ąđ?‘Žđ?‘?đ?‘Ž 1: đ?‘‘đ?‘–đ?‘ đ?‘œđ?‘?đ?‘–đ?‘Žđ?‘?đ?‘–Ăłđ?‘› đ?‘‘đ?‘’đ?‘™ đ?‘?đ?‘œđ?‘šđ?‘?đ?‘™đ?‘’đ?‘—đ?‘œ đ?‘’đ?‘›đ?‘§đ?‘–đ?‘šđ?‘Ž − đ?‘ đ?‘˘đ?‘ đ?‘Ąđ?‘&#x;đ?‘Žđ?‘Ąđ?‘œ
đ?’—đ?&#x;‘ = đ?’Œđ?&#x;‘ [đ?‘Źđ?‘ş]
đ??¸đ?‘Ąđ?‘Žđ?‘?đ?‘Ž 2: đ?‘‘đ?‘–đ?‘ đ?‘œđ?‘?đ?‘–đ?‘Žđ?‘?đ?‘–Ăłđ?‘› đ?‘‘đ?‘’đ?‘™ đ?‘?đ?‘œđ?‘šđ?‘?đ?‘™đ?‘’đ?‘—đ?‘œ đ?‘’đ?‘›đ?‘§đ?‘–đ?‘šđ?‘Ž − đ?‘ đ?‘˘đ?‘ đ?‘Ąđ?‘&#x;đ?‘Žđ?‘Ąđ?‘œ
Donde: k1, k2, k3=constantes microscĂłpicas de velocidad [E]=concentraciĂłn de enzima libre [S]=concentraciĂłn de sustrato [ES]=concentraciĂłn del complejo enzima-sustrato Dado que la concentraciĂłn de enzima permanece constante a lo largo de la reacciĂłn, la concentraciĂłn total de enzima se puede expresar como:
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[đ??¸đ?‘‡ ] = [đ??¸] + [đ??¸đ?‘†] Donde: [ET]=concentraciĂłn total de enzima Despejando [E] de la expresiĂłn anterior, se tiene que: [đ??¸] = [đ??¸đ?‘‡ ] − [đ??¸đ?‘†] Sustituyendo la ecuaciĂłn anterior en la expresiĂłn de đ?‘Ł1 = đ?‘˜1 [đ??¸][đ?‘†], se tiene: đ?‘Ł1 = đ?‘˜1 ([đ??¸đ?‘‡ ] − [đ??¸đ?‘†])[đ?‘†] đ?’—đ?&#x;? = đ?’Œđ?&#x;? [đ?‘Źđ?‘ť ][đ?‘ş] − đ?’Œđ?&#x;? [đ?‘Źđ?‘ş][đ?‘ş] Este modelo cinĂŠtico adopta la hipĂłtesis del estado estacionario, segĂşn la cual la concentraciĂłn del complejo enzima-sustrato es pequeĂąa y constante a lo largo de la reacciĂłn. Por tanto, la velocidad de formaciĂłn del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociaciĂłn (v2 + v3): đ?‘Ł1 = đ?‘Ł2 + đ?‘Ł3 Entonces, sustituyendo en esta expresiĂłn, las ecuaciones respectivas de velocidad, se tiene: đ?‘˜1 [đ??¸đ?‘‡ ][đ?‘†] − đ?‘˜1 [đ??¸đ?‘†][đ?‘†] = đ?‘˜2 [đ??¸đ?‘†] + đ?‘˜3 [đ??¸đ?‘†] Multiplicando por 1/k1: 1 (đ?‘˜1 [đ??¸đ?‘‡ ][đ?‘†] − đ?‘˜1 [đ??¸đ?‘†][đ?‘†] = đ?‘˜2 [đ??¸đ?‘†] + đ?‘˜3 [đ??¸đ?‘†]) ( ) đ?‘˜1 [đ??¸đ?‘‡ ][đ?‘†] − [đ??¸đ?‘†][đ?‘†] =
đ?‘˜2 đ?‘˜3 [đ??¸đ?‘†] + [đ??¸đ?‘†] đ?‘˜1 đ?‘˜1
Despejando la [ES]: [đ??¸đ?‘†][đ?‘†] +
đ?‘˜2 đ?‘˜3 [đ??¸đ?‘†] + [đ??¸đ?‘†] = [đ??¸đ?‘‡ ][đ?‘†] đ?‘˜1 đ?‘˜1
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[𝐸𝑆] ([𝑆] +
𝑘2 𝑘3 + ) = [𝐸𝑇 ][𝑆] 𝑘1 𝑘1
[𝐸𝑆] ([𝑆] +
𝑘2 + 𝑘3 ) = [𝐸𝑇 ][𝑆] 𝑘1
[𝐸𝑆] =
Sustituyendo
𝑘2 +𝑘3 𝑘1
[𝐸𝑇 ][𝑆] [𝑆] +
𝑘2 +𝑘3 𝑘1
= 𝑘𝑚 , se tiene:
[𝐸𝑆] =
[𝐸𝑇 ][𝑆] 𝑘𝑚 + [𝑆]
Donde: km=constante de Michaelis-Menten Sustituyendo la expresión anterior, en la ecuación de velocidad de formación del producto, se tiene: 𝑣 = 𝑣3 = 𝑘3 [𝐸𝑆] 𝑣=
𝑘3 [𝐸𝑇 ][𝑆] 𝑘𝑚 + [𝑆]
Si la velocidad máxima de la reacción (Vmax) se alcanza cuando toda la enzima se encuentra unida al sustrato, es decir, 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘3 [𝐸𝑇 ], sustituyendo en la ecuación anterior, se obtiene que: 𝒗=
𝑽𝒎𝒂𝒙 [𝑺] 𝒌𝒎 + [𝑺]
Esta expresión es conocida como la ecuación de Michaelis-Menten. A partir del modelo previamente citado, se realiza el cálculo de las constantes cinéticas Vmax y km. De acuerdo a Ehu (s.f.), la constante de Michaelis-Menten (km) es un parámetro cinético importante por múltiples razones:
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La km es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si km=[S], la ecuación de MichaelisMenten se reduce a: v=Vmax/2.
El valor de km da idea de la afinidad de la enzima por el sustrato: a menor km, mayor afinidad de la enzima por el sustrato, y a mayor km, menor afinidad. Este hecho tiene fácil explicación si tenemos en cuenta que km se define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reacción 1 lo forma. Así, si km es grande, el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si km es pequeña, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato).
Para seguir documentándote y comprendiendo el subtema, es recomendable que realices la lectura del documento “Enzimas: qué son y para qué sirven”, de Franco Vera (2007), en el que se presenta información que te permitirá comprender el funcionamiento de una enzima y el control de su actividad.
1.2.2. Mecanismo de reacción enzimática La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten, deducida en el subtema anterior, es una hipérbola, tal como puedes observar en la siguiente figura 10:
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Figura 10. Representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Mentes. Fuente: Wikimedia commons, 2010.
El valor de Vmax se puede determinar a partir del valor máximo obtenido de la curva; mientras que la km corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax. Otra forma de determinar las constantes cinéticas, es a través de la representación de Lineweaver-Burk, en la que se gráfica el inverso de la velocidad inicial contra el inverso de la concentración de sustrato. A partir de este gráfico, que corresponde con una línea recta, se toman las siguientes consideraciones:
La pendiente corresponde a km/Vmax La abscisa en el origen (1/vo=0) corresponde a -1/km La ordenada en el origen (1/[S]=0 corresponde a 1/Vmax
Figura 11. Gráfico de Lineaweaver-Burk. Fuente: payala.mayo.uson.mx, s.f.
En conclusión, existen métodos gráficos que facilitan el cálculo preciso de km y Vmax. Los cuales se hacen a partir de la manipulación matemática de los datos empleados para la representación de Michaelis-Menten y de Lineweaver-Burk (figura 12).
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Para seguir documentándote y comprendiendo el subtema, es recomendable que realices la lectura del artículo Análisis informático de cinética enzimática por medio de macros de Ms Excel de Maldonado et al. (2004), en el que se presenta que mediante el empleo de una hoja de cálculo, es posible evaluar la velocidad de la reacción en un tiempo dado y a diferentes concentraciones tanto del sustrato como de un inhibidor. También podrás entender cómo se efectúan los gráficos de Michaelis-Menten y de Lineweaver-Burk y el cálculo de Vmax y km. Posteriormente, te invitamos a revisar los documentos Enzimas de la Universidad del País Vasco (2012) y Enzimas II de la Universidad de Huelva (2012), en los que se exponen: la nomenclatura, clasificación y modo de acción de las enzimas; así como, una introducción a la cinética enzimática en la que deberás prestar especial atención a la ecuación de Michaelis-Menten y a la representación de Lineweaver-Burk.
1.3. Factores que afectan la cinética enzimática Como ya has estudiado en los temas anteriores, las biotransformaciones se pueden acelerar a través de enzimas denominadas biocatalizadores y que, a través de un estudio de cinética enzimática, es posible monitorear la velocidad con que se efectúan las reacciones bioquímicas. Ahora, es conveniente plantearse una serie de preguntas relacionadas con lo previamente descrito. ¿Has notado que cuando dejas un alimento a temperatura ambiente, por un determinado lapso de tiempo, este tiende a descomponerse a mayor velocidad que uno que se encuentra en el congelador; o que si agregas unas gotas de limón sobre la pulpa, de una manzana partida por la mitad, disminuye su oxidación; o que cuando hierves la leche tiende a descomponerse más lentamente; o bien, que la fruta se conserva por más tiempo cuando la preparas en mermelada? (figura 12).
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Figura 12. Descomposición de alimentos. Fuente: noticiasinteresantes.info, s.f.
Todos los fenómenos descritos indican que existen factores que son capaces de modificar la velocidad de una reacción enzimática. Un claro ejemplo donde se observa la influencia de la temperatura sobre un biocatalizador en la vida cotidiana, es en la cocina de tu casa. Por ejemplo, un pastel al ser horneado acelera las reacciones que transforman la mezcla líquida en un producto esponjoso o cuando los alimentos se guardan en lugares fríos, debido a la baja temperatura, se retardan las reacciones que los descomponen. Ahora bien, existen sustancias que son capaces de modificar la velocidad de reacción enzimática pero haciéndola más lenta, es decir, la retrasan. A estas sustancias se les llama inhibidores. El uso de inhibidores es muy importante en la industria farmacéutica y en la industria alimenticia ya que al hacer más lentas las reacciones evitamos la formación, durante un tiempo determinado, de sustancias o productos indeseables que hacen que tanto los medicamentos como los alimentos se descompongan rápidamente. En la industria alimenticia a estos inhibidores se les llama conservadores. Estos pertenecen a un grupo de sustancias llamadas aditivos que suelen agregarse a los alimentos procesados para mejorarlos. Como ves, existen múltiples factores que aceleran o retardan la velocidad de reacción, por lo que, a través del desarrollo del tema “Factores que afectan la cinética enzimática” podrás analizar el empleo de enzimas en las biotransformaciones y describir la influencia de dichos factores fisicoquímicos.
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1.3.1. Especificidad Tal como se mencionó en la introducción del tema, la velocidad de una biotransformación, catalizada por enzimas, se ve modificada por diversos factores fisicoquímicos, entre los que se encuentra la especificidad. Los biocatalizadores son específicos para un determinado tipo de sustrato, o bien de reacción. Cuando la enzima sólo puede actuar sobre un tipo de sustrato, se dice que muestra especificidad absoluta. Si puede actuar sobre sustratos con estructuras muy similares, se dice que muestra especificidad relativa. De acuerdo a Rebolledo, L. y Rebolledo, I. (s.f.), la especificidad está determinada por el sitio activo de la enzima, es decir, el sector de la molécula que contiene los grupos funcionales particulares que le permiten unirse específicamente con el sustrato. Generalmente el sitio activo se encuentra en una grieta, en una leve depresión en la superficie de la molécula proteica. La geometría del sitio activo está estrechamente relacionada con la conformación tridimensional de la molécula del sustrato. Las enzimas aceleran las reacciones alterando la conformación de sus sustratos para que logren llegar al estado de transición. El modelo más simple para entender esta interacción enzima–sustrato es el modelo de llave-cerradura, en el cual el sustrato encaja perfectamente en el sitio activo de la enzima. En muchos casos, las conformaciones tanto de la enzima como del sustrato son modificadas cuando logran unirse: es el llamado modelo de encaje inducido. Esta alteración de las conformaciones hace que logren llegar más rápido al estado de transición. En la siguiente figura 13 se puede observar que el sitio activo ocupa un área relativamente pequeña de la superficie de la molécula de enzima. Esto significa que una pequeña porción de la molécula de enzima participa realmente en la catálisis. Las otras regiones de la superficie de la enzima pueden permitir la unión con otras moléculas involucradas en la regulación de la actividad enzimática.
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Modelo de llave-cerradura
Modelo de encaje inducido
Figura 13. Modelos de especificidad enzimática. Fuente: Luengo, L., s.f.
1.3.2. Desnaturalización Otros de los factores que afectan la actividad enzimática es la temperatura. Los aumentos de temperatura aceleran las reacciones enzimáticas, por cada 10°C de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Sin embargo, cuando la temperatura es muy elevada, dichos biocatalizadores se desnaturalizan, es decir, sufren un cambio en su estructura, por lo que se observa pérdida de actividad catalítica hasta la anulación. Otros factores que intervienen en esta modificación son: el pH, los cambios de concentración, la velocidad de agitación o la presencia de agentes desnaturalizantes (figura 14).
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Figura 14. Desnaturalización. Fuente: Reyes, E. J., 2013.
Se puede concluir que existe pérdida o disminución de la capacidad catalítica de las enzimas, ya que al modificarse su estructura, la conformación del sitio activo también se ve alterada.
1.3.3. pH Los aminoácidos que forman a las enzimas están ionizados, es decir, se encuentran cargados positiva o negativamente, dependiendo el pH del medio. Los biocatalizadores al contener ambas cargas a lo largo de su cadena, experimentan fuerzas de atracción y repulsión que permiten el mantenimiento de la estructura tridimensional de la proteína. Cualquier modificación del pH, por encima o debajo del óptimo, afecta drásticamente la actividad enzimática. De acuerdo a Merino, P. J. y a Noriega, B. M. J. (s.f.), dependiendo del pH del medio en el que se encuentren las enzimas pueden no tener carga, o por el contrario estar cargados, bien positiva o negativamente. Estas cargas sirven para estabilizar la conformación natural de la proteína y cuando el pH las cambia, también se modifica la estructura, llevando en último extremo a la desnaturalización de la proteína, y en el caso de las enzimas a la pérdida de actividad.
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Dependiendo del medio dónde deba ejercer su acción catalítica, cada enzima tendrá su conformación más adecuada, y por lo tanto su máxima actividad, alrededor de un valor concreto de pH, que recibe el nombre de pH óptimo. El cambio, bien sea hacia valores más altos o más bajos provocará una disminución de la actividad (figura 15). Figura 15. Gráfica de pH óptimo para dos enzimas. Fuente: Luengo, L., s.f.
1.3.4. Temperatura La velocidad de una reacción enzimática varía al aumentar la temperatura. Esto es, la velocidad de una reacción enzimática se incrementa al aumentar la temperatura dentro de un determinado rango, alcanzando un valor máximo a la denominada temperatura óptima. A valores superiores la actividad disminuye debido a que el enzima, como cualquier otra proteína, sufre procesos de desnaturalización y, por lo tanto, de inactivación (Tena, A. M. y Jorrín, N. J. V, s.f.) (figura 16).
Figura 16. Gráfica de temperatura óptima. Fuente: Luengo, L., s.f.
1.3.5. Inhibición La actividad enzimática disminuye por acción de sustancias que se unen fuertemente al sitio activo y bloquea la entrada del sustrato. Dichas sustancias reciben el nombre de inhibidores, (figura 17) los cuales pueden ser: Universidad Abierta y a Distancia de México
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Figura 17. Efecto del inhibidor en la actividad enzimática. Fuente: Luengo, L., s.f.
a) Irreversibles: se enlazan permanentemente a la enzima con lo que la inhibición es completa. Los inhibidores reversibles se unen covalentemente a la enzima con lo cual resultan muy difíciles de eliminar. b) Reversibles: se enlazan a la enzima pero no permanentemente con lo que la inhibición es transitoria. Los inhibidores reversibles se pueden eliminar normalmente mediante diálisis o cambios en el pH o en la disolución tampón. Hay tres formas principales de inhibición reversible: competitiva, no competitiva y acompetitiva. De acuerdo a UPCT (2008), un inhibidor competitivo (figura 18) normalmente es similar a la enzima en tamaño y forma por lo que compite por la enzima con el sustrato al unirse a la enzima por el mismo centro activo. La velocidad de reacción se reduce porque baja la proporción de moléculas unidas al sustrato. Cuanto más inhibidor (I) hay presente, más complejo enzima-inhibidor se forma y menos producto se forma.
Figura 18. Inhibición competitiva. Fuente: Donoso, J., 2006.
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El nivel de inhibición real que causa un inhibidor competitivo depende de las concentraciones relativas de inhibidor [I] y de sustrato [S]. Ambas sustancias compiten por la enzima, a bajas concentraciones de I, la inhibición puede vencerse aùadiendo una gran cantidad de S con lo que aumenta la cantidad de complejo enzima-sustrato sobre el complejo enzima-inhibidor. Ya que es necesario aùadir mås sustrato para vencer la inhibición, km serå mayor. Matemåticamente la ecuación para una cinÊtica Michaelis– Menten con inhibición competitiva es: �=
đ?‘‰đ?‘šđ?‘Žđ?‘Ľ [đ?‘†] [đ?‘†] + đ?‘˜đ?‘š (1 + [đ??ź]/đ?‘˜đ?‘– ) En la inhibiciĂłn no competitiva (figura 19), tanto el sustrato como el inhibidor se enlazan a la enzima pero en sitios activos diferentes.
Figura 19. InhibiciĂłn no competitiva. Fuente: Donoso, J., 2006.
El enlace de I ejerce un efecto sobre el centro activo probablemente afectando a la estructura de la enzima que ya no funciona tan eficientemente. En consecuencia Vmax se altera pero no se altera km (UPCT, 2008).
La expresiĂłn matemĂĄtica para el mecanismo Michaelis-Menten para este tipo de inhibiciĂłn es: đ?‘Ł=
đ?‘‰đ?‘šđ?‘Žđ?‘Ľ [đ?‘†] ([đ?‘†] + đ?‘˜đ?‘š )(1 + [đ??ź]/đ?‘˜đ?‘– )
En la inhibiciĂłn acompetitiva (figura 20) el inhibidor se enlaza al centro activo pero solo despuĂŠs de que el sustrato lo haya hecho y, por tanto, el inhibidor y el sustrato no compiten.
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De esta manera, aunque todo el sustrato esté saturando la enzima y toda la enzima esté como complejo enzima-sustrato, el inhibidor puede enlazarse produciendo un complejo inactivo enzima-sustrato-inhibidor. Como el inhibidor solo se une al complejo enzima-sustrato estimula la formación del complejo enzima-sustrato y, por tanto, incrementa la unión del sustrato a la enzima, disminuyendo km. Sin embargo, el complejo enzima-sustrato-inhibidor no conduce a productos y Vmax disminuye (UPCT, 2008).
Figura 20. Inhibición acompetitiva. Fuente: Donoso, J., 2006.
1.3.6. Inmovilización de enzimas La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente (Arroyo, 1998). Tras una inmovilización, la actividad de los biocatalizadores puede disminuir e incluso perderse por:
Impedimento del paso de sustrato al centro activo por bloqueo durante la unión al soporte. Los grupos reactivos del soporte reaccionan con algún grupo del centro activo de la enzima esencial para la actividad catalítica. Durante la unión al soporte se puede originar cambio en la estructura tridimensional de la enzima. Las condiciones del proceso pueden causar desnaturalización.
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Figura 21. Simulación del efecto de la inmovilización en la actividad enzimática. Fuente: Tripod, s.f.
De acuerdo a la figura 21, la enzima puede desnaturalizarse por reactivos o productos involucrados en el procedimiento de inmovilización (formación de la matriz de atrapamiento, reacción para el enlace covalente o reacciones de entrecruzamiento; esquema 1). Las condiciones de inmovilización pueden conducir a la desnaturalización o a la desactivación (Esquema 2). La desactivación enzimática puede causarse por un grupo reactivo en el sitio activo que participa en la reacción de enlace (Esquema 3).
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Las fuerzas de enlace pueden mantener la molécula enzimática en una configuración inactiva (cambios conformacionales; Esquema 4). La orientación de la molécula de enzima unida al soporte puede impedir el acceso del sustrato al sitio activo, o la liberación del producto (efectos estéricos; Esquema 5). Para seguir documentándote y comprendiendo el subtema, te recomendamos realizar la lectura del documento Enzimas: fundamentos que es un fragmento del libro Bioquímica. Texto y Atlas de Koolman (2004), en el que encontrarás información relacionada con la catálisis enzimática y su dependencia con la temperatura, presión, pH, fuerza iónica y la concentración de sustratos, como factores e inhibidores más importantes. Puedes continuar con el estudio de la liga: http://www.lourdesluengo.es/animaciones/unidad8/inhibicion_enzi matica.swf, en la que observarás como se efectúan las inhibiciones competitivas y no competitivas. También, puedes revisar el texto Enzimas II en el apartado de Inhibición enzimática. En el cual podrás encontrar los diversos tipos de inhibición e inhibidores, así como su identificación a través del modelo de Lineweaver-Burk. Finalmente, te recomendamos realizar la lectura y análisis del artículo Inmovilización de Enzimas. Fundamentos, Métodos y Aplicaciones de Arroyo (1998). En esta información encontrarás que la inmovilización de enzimas permite una mejora significativa de su estabilidad, lo que hace posible su empleo en la industria para la elaboración de productos químicos, farmacéuticos, alimenticios; y otras muchas aplicaciones. En esta revisión se analizan los diferentes métodos de inmovilización de enzimas, y el efecto sobre las propiedades catalíticas y la estabilidad de los biocatalizadores obtenidos.
Actividades La elaboración de las actividades estará guiada por tu docente en línea, mismo que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como los envíos que tendrán que realizar. Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BIB1_U1_A1_XXYZ, donde BIB1 corresponde a las siglas de la asignatura, U1 es la etapa de conocimiento, Universidad Abierta y a Distancia de México
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A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.
Autorreflexiones Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación.
Cierre de la unidad A lo largo de la unidad abordaste aspectos relacionados con las biotransformaciones y el modo en que son catalizadas para incrementar o disminuir la velocidad de la reacción. De esta forma, has logrado:
Identificar el tipo de reacción catalizada de acuerdo a clasificación enzimática. Describir el mecanismo enzimático relacionado con el proceso de catálisis. Analizar los factores de influyen en la actividad enzimática a través de modelos matemáticos.
Esto te prepara para aplicar los conocimientos adquiridos en el diseño de biorreactores, a fin de identificar el modo en qué las biotransformaciones son catalizadas y cuáles son los parámetros fisicoquímicos que deberás cuidar para el correcto escalamiento de dichos dispositivos.
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Para saber más
Puedes consultar el video realizado por González et al. (2010), de Investigadores del 4to. Grado de PEDECIBA Química. El propósito de este documental es profundizar en el concepto de biocatálisis, sus aplicaciones, usos y fuentes de diversas enzimas con fines tecnológicos (http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=VgqJ88vBc2E). Posteriormente, es recomendable que consultes el video desarrollado por el Instituto de Biotecnología de la UNAM, campus Morelos (2009), en el que se presenta como la biocatálisis es importante para reducir, en el ambiente, los impactos negativos ocasionados por sustancias provenientes de diversos procesos industriales (http://www.youtube.com/watch?v=kXyCaS6HQ7g&feature=player_detailpage). Enseguida puedes consultar el problemario propuesto por el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Alcalá (2010), en que se podrás visualizar y analizar paso a paso la resolución de problemas relacionados con la ecuación de Michaelis-Menten, y el cálculo de las constantes cinéticas km y Vmax (http://www2.uah.es/sancho/farmacia/problemas%20cinetica%20enzimatica%201011%20con%20respuestas.pdf). La consulta de la liga: http://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/aotw3.html en el apartado “The model/kinetics_model.xls” de Jonathan Monroe (2004), te permitirá descargar los cálculos en formato Excel de cinética enzimática, que te ayudará a manipular el gráfico representativo de la ecuación de Michaelis-Menten; podrás observar cómo se modifican los parámetros de km y Vmax, si manipulas los valores de la concentración inicial.
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Fuentes de consulta
Básicas: Ehu. (s.f.). Motivos que hacen de km un parámetro cinético importante. Recuperado de: http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#km ITESCAM. (s.f.). Tema 7. Enzimas. Pág. 76-77. Recuperado de: https://www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r60942.PDF Merino, P. J., Noriega, B. M. J. (s.f.). Enzimas. Fisiología General. Universidad de Cantabria. Recuperado de: http://ocw.unican.es/ciencias-de-la-salud/fisiologiageneral/materiales-de-clase-1/tema-1.-introduccion-al-estudio-de-lafisiologia/Tema%202B-Bloque%20I-Enzimas.pdf Rebolledo, L., Rebolledo, I. (s.f.). Enzimas. Recuperado de: http://bibmed.ucla.edu.ve/DB/bmucla/edocs/materialdidactico/celular/enzimas.pdf Tena, A. M., Jorrín, N. J. V. (s.f.). Estudio cinético de la actividad invertasa de levadura de panadería. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Campus Universitario de Rabanales. Recuperado de: http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/32%20INVERTASA%20CIN%C3%89TICA.pdf UPCT. (2008). Anexo II. Modelo de Michaelis-Menten. Pág. 56-58. Recuperado de: http://repositorio.bib.upct.es/dspace/bitstream/10317/282/5/ANEXO%20II.%20MODELO% 20DE%20MICHAELIS-%20MENTEN.pdf
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Complementarias: Arroyo, M. (1998). Inmovilización de enzimas. Fundamentos, métodos y aplicaciones. Ars Pharmaceutica. 39 (2), 23-98. Bertoluzzo M. G., et al (2008). Estudio cinético de la actividad proteolítica de la enzima Ficina. Anales AFA. 20:243-245. Escuela Politécnica del Ejército de Ecuador. (2012). Biotransformación. Procesos Bio. Pág.1-6. Recuperado de http://procesosbio.wikispaces.com/BioTransformaci%C3%B3n Franco, V. L. (2007). Enzimas: qué son y para qué sirven. Rev. R. Acad. Cienc. Exact. Fís. Nat. VIII Programa de Promoción de la Cultura Científica y Tecnológica. Koolman y Rohm. (2004). Enzimas: fundamentos. Bioquímica. En: Texto y Atlas. 3era. Edición. Editorial: Panamericana. Pág. 88-97. Maldonado, C. E., Giraldo, J. F., Quijano, A. (2004). Análisis informático de cinética enzimática por medio de macros de Ms Excel. Revista de la Facultad de Ciencias Básicas. 2 (2), 15-20. Tejero F. (2008). Las enzimas en los nuevos procesos de panificación. La técnica. Molinería y Panadería. 1:16-23. Universidad de Huelva. (2012). Enzimas II. Pág. 1-12. Recuperado de http://www.uhu.es/08007/documentos%20de%20texto/apuntes/2005/pdf/tema_08_enzima s_2.pdf Universidad del País Vasco. (2012). Enzimas. Pág. 1-11. Recuperado de http://www.ehu.es/biomoleculas/1b/pdf/11_enzimas.pdf Voet, D., Voet, J. G., Pratt, C. (2009). Capítulo 12. Cinética, inhibición y regulación de las enzimas. En: Fundamentos de Bioquímica. Editorial: Medica Panamericana. Buenos Aires. Pág. 357-377. Biologíacelular-iq.blogspot.mx. (2010). Etapas de una reacción biocatalizada. [Imagen]. Recuperado de: http://biologiacelular-iq.blogspot.mx/2010/10/estrategias-de-busquedasobre-recursos.html
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