Instituto Superior Técnico
ISCHEMIA IN THE ACUTE HIPPOCAMPAL SLICE PREPARATION: CONSEQUENCES FOR MEMBRANE PROPERTIES
Joana Rodrigues nº 62757 2011/2012
Dissertação de Mestrado em Engenharia Biomédica
Acidente Vascular Cerebral (AVC)
Caracterizado por uma rápida perda de função neurológica,
decorrente do oclusão ou ruptura de um vaso sanguíneo cerebral
Privação de glucose e oxigénio (Isquémia)
O cérebro representa apenas 2% da massa total do corpo
Consume aproximadamente 25% do fornecimento total de oxigénio
Neurotransmissores
Glutamato
Principal neurotransmissor excitatório no SNC Dois tipos de receptores Receptores ionotrópicos:
AMPAR, NMDAR e Kainato
Receptores metabotrópicos
Lisman et al., 2007
mGluR
GABA
Principal neurotransmissor inibitório no SNC
Dois tipos de receptores Receptores ionotrópicos
GABAA e GABAC
Receptores metabotrópicos
GABAB
Eritropoietina (EPO)
Função principal Regulação da Eritropoiese
No feto, a produção da EPO ocorre no fígado, contudo após o nascimento a maioria da EPO passa a ser sintetizada pelos rins EPO e o seu receptor EPOR podem ser encontrados noutros tecido tecidos do sistema nervoso
Possibilidade da EPO poder actuar como um factor de protecção
Objectivo
Determinar o efeito da isquémia em células de fatias de hipocampo
Avaliar o papel da eritropoietina numa situação de isquémia
Registo de patch-clamp (respostas passivas e activas) de neurónios piramidais da região CA1 Alterações ao nível da transmissão sináptica Alterações no valor da capacitância da membrana
Métodos - Patch-Clamp
Técnica laboratorial de electrofisiologia que permite o estudo de um ou vários canais iónicos presentes na membrana das células Configuração: Whole-cell
Estudo do fluxo de corrente através dos canais iónicos
Potencial de membrana constante (Vh=-70mV)
Estudo das propriedades passivas da membrana
Capacitância
In http://www.leica-microsystems.com/
Métodos - Hipocampo
Ratos Wistar machos com 3 ou 4 semanas
Fatias de hipocampo
Região CA1
Ramon y Cajal
Métodos – Tipo de Registos Libertação espontânea de GABA
Célula Piramidal Interneurónio
Glu Libertação espontânea de Glutamato
GABA
mIPSCs
mEPSCs
Amplitude Frequency (number of events/time)
Célula Póssináptica mIPSCs – miniature Inhibitory Postsynaptic Current mEPSCs - miniature Excitatory Postsynaptic Current
Glu GAD
GABA
Presynaptic cell
K+
Cl-
Cl- Cl
GABAA
astrocyte GABAB
Cl-
Cl-
Postsynaptic cell
Capacitância da Membrana
Células apresentam membrana plasmática
Dupla camada lipídica
Lípidos comportam-se como isolantes (dieléctricos) Membrana considerada como condensador Circuito Equivalente da Estrutura da Membrana
Capacitância
In Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology.
Proporcional à área da célula Reflecte alterações ao nível das propriedades eléctricas da membrana Medida indirecta do volume das células
Cålculo da Capacitância Exemplo: Transiente Capacitivo
• Aplicação de um pulso hiperpolarizante • 20mV (500 ms) • Registo de 50 transientes capacitivos • MĂŠdia đ?? đ??ˆ đ?? = đ??ˆđ??Źđ??Ź + đ??ˆđ?&#x;Ž − đ??ˆđ??Źđ??Ź đ??žđ??ąđ??Š − đ?›•
Fit Exponencial ďƒ Y = Y0 + A−Bt ďƒ’
I0 − Iss = A Iss = Y0
ďƒ’
B=
ďƒ’
1 Ď„
Graph pad
CĂĄlculo da Capacitância đ??ˆ đ?? = đ??ˆđ??Źđ??Ź + đ??ˆđ?&#x;Ž − đ??ˆđ??Źđ??Ź đ??žđ??ąđ??Š − Vp Ra = I0 Iss Gm = Vp − Ra ∗ Iss Cm = Ď„ ∗
đ?? đ?›•
Ă rea Cđ?‘š Ă rea

C=

Forma elipsĂłide

Ď€ 4
minor axis + major axis
1 + Gm Ra Ampliação Objectiva: 40x Lentes: 4x
2
Capacitância da membrana Dados resultantes do fit no Graph Pad đ??ˆđ??¨ -432,2 pA
- Equação do Fit -Transiente Capacitivo
MATLAB
đ??ˆđ??Źđ??Ź -120,4 pA
đ?›•
Exponential Curve
6,136 ms
-432.2e-12+120.4e12)*exp(I(:,1)/(0.006136))120.4e-12))
Programa em MATLAB
Ischemia Conditions Normal Conditions
Exp
Ra (Ω)
Gm (S)
Cm (F)
Major axis (µm)
Minor axis (µm)
Area (µm2)
Area (cm2)
C (F/cm2)
1
3.57E+07
6.49E-09
1.46E-10
1.30E+01
5.55E+00
268.80
2.68E-04
5.44E-07
2
2.24E+07
8.62E-09
1.70E-10
1.02E+01
7.40E+00
242.59
2.43E-04
7.01E-07
3
2.52E+07
7.23E-09
1.52E-10
1.48E+01
4.63E+00
296.35
2.96E-04
5.12E-07
4
1.80E+07
1.05E-08
2.18E-10
1.57E+01
6.48E+00
387.07
3.87E-04
5.64E-07
5
2.94E+07
1.38E-08
1.26E-10
1.39E+01
5.18E+00
285.17
2.85E-04
4.44E-07
6
3.52E+07
6.45E-09
1.03E-10
1.24E+01
9.25E+00
367.96
3.68E-04
2.79E-07
7
3.33E+07
4.12E-09
1.38E-10
1.11E+01
5.55E+00
217.73
2.18E-04
6.33E-07
8
2.54E+07
6.57E-09
1.25E-10
1.57E+01
8.33E+00
454.27
4.54E-04
2.76E-07
1
4.03E+07
6.67E-09
1.17E-10
1.30E+01
6.48E+00
296.35
2.96E-04
3.94E-07
2
3.44E+07
1.07E-08
1.06E-10
1.67E+01
5.55E+00
387.07
3.87E-04
2.75E-07
3
3.34E+07
6.07E-09
1.54E-10
1.48E+01
7.40E+00
387.08
3.87E-04
3.98E-07
4
3.35E+07
6.73E-09
1.61E-10
1.30E+01
7.40E+00
325.25
3.25E-04
4.95E-07
5
3.22E+07
1.03E-08
1.09E-10
1.11E+01
7.40E+00
268.80
2.69E-04
4.06E-07
6
3.68E+07
6.87E-09
1.12E-10
1.85E+01
8.33E+00
565.18
5.65E-04
1.99E-07
7
4.63E+07
8.34E-09
8.14E-11
1.48E+01
3.70E+00
268.80
2.69E-04
3.03E-07
8
4.27E+07
7.34E-09
1.10E-10
1.57E+01
3.70E+00
296.35
2.96E-04
3.72E-07
Capacitância da Membrana n=8 *p=0.0461
16 células
8 células não sofreram isquémia 8 células sofreram isquémia
Capacitância da Membrana – Representação Indirecta do volume da Célula (Chi and Xu, 2000)
Isquémia influencia o volume da célula Significância estatística determinada por Unpaired T-test
Ischemia Conditions Normal Conditions
Exp
Ra (Ω)
Gm (S)
Cm (F)
Major axis (µm)
Minor axis (µm)
Area (µm2)
Area (cm2)
C (F/cm2)
1
3.57E+07
6.49E-09
1.46E-10
1.30E+01
5.55E+00
268.80
2.68E-04
5.44E-07
2
2.24E+07
8.62E-09
1.70E-10
1.02E+01
7.40E+00
242.59
2.43E-04
7.01E-07
3
2.52E+07
7.23E-09
1.52E-10
1.48E+01
4.63E+00
296.35
2.96E-04
5.12E-07
4
1.80E+07
1.05E-08
2.18E-10
1.57E+01
6.48E+00
387.07
3.87E-04
5.64E-07
5
2.94E+07
1.38E-08
1.26E-10
1.39E+01
5.18E+00
285.17
2.85E-04
4.44E-07
6
3.52E+07
6.45E-09
1.03E-10
1.24E+01
9.25E+00
367.96
3.68E-04
2.79E-07
7
3.33E+07
4.12E-09
1.38E-10
1.11E+01
5.55E+00
217.73
2.18E-04
6.33E-07
8
2.54E+07
6.57E-09
1.25E-10
1.57E+01
8.33E+00
454.27
4.54E-04
2.76E-07
1
4.03E+07
6.67E-09
1.17E-10
1.30E+01
6.48E+00
296.35
2.96E-04
3.94E-07
2
3.44E+07
1.07E-08
1.06E-10
1.67E+01
5.55E+00
387.07
3.87E-04
2.75E-07
3
3.34E+07
6.07E-09
1.54E-10
1.48E+01
7.40E+00
387.08
3.87E-04
3.98E-07
4
3.35E+07
6.73E-09
1.61E-10
1.30E+01
7.40E+00
325.25
3.25E-04
4.95E-07
5
3.22E+07
1.03E-08
1.09E-10
1.11E+01
7.40E+00
268.80
2.69E-04
4.06E-07
6
3.68E+07
6.87E-09
1.12E-10
1.85E+01
8.33E+00
565.18
5.65E-04
1.99E-07
7
4.63E+07
8.34E-09
8.14E-11
1.48E+01
3.70E+00
268.80
2.69E-04
3.03E-07
8
4.27E+07
7.34E-09
1.10E-10
1.57E+01
3.70E+00
296.35
2.96E-04
3.72E-07
Capacitância da Membrana n=8 *p=0.0461
16 células
Capacitância da Membrana – Representação Indirecta do volume da Célula (Chi and Xu, 2000)
8 células não sofreram isquémia 8 células sofreram isquémia
Trabalho Futuro: Análise do valor da Capacitância após administração da EPO
EPO reduz o swelling das células (Bernaudin et al., 1999; Gonzalez et al.,
Isquémia influencia o volume da célula
2008)
Significância estatística determinada por Unpaired T-test
Influência da Isquémia nas mEPSCs
Estudo de efeito de isquémia em células do hipocampo Resultados contraditórios (Furukawa et al., 1990; Chang et al., 1989) Efeito Pré-Sináptico
n=7 *p=0.0163
Diferença na frequência das mEPSCs nas células que sofreram um insulto de isquémia de 30 minutos
antes da administração da EPO Significância estatística determinada por Unpaired T-test
Efeito da EPO nas mEPSCs após isquémia
TTX – Bloqueia os canais de sódio dependentes da voltagem
Gabazina – Antagonista dos receptores de GABA
Efeito da EPO nas mEPSCs após isquémia
EPO diminui a frequência das mEPSCs em neurónios da região CA1, após insulto de isquémia de 30 min. n=7 *p=0.0214
Efeito Pré-Sináptico Efeito Inibitório Experiência Representativa
n=7 p=0.5600
Efeito Neuroprotector ?
Significância estatística determinada por Unpaired T-test
Efeito da EPO nas mIPSCs
TTX – Bloqueia os canais de sódio dependentes da voltagem Ácido Quinurénico – Antagonista de receptores AMPA, NMDA e Kainato
Efeito da EPO nas mIPSCs
EPO aumenta a frequência das mIPSCs em neurónios da região CA1 n=6 *p=0.0461
Experiência Representativa
Efeito Pré-sináptico
Trabalho Futuro n=6 p=0.9962
Efeito da EPO na transmissão GABAérgica após 30 min de isquémia
Interneurónios são menos afectados por isquémia que neurónios piramidais (Furukawa et al., 1990) Significância estatística determinada por Unpaired T-test
Conclusões Aumento da Capacitância
Isquémia
Redução na frequência mEPSCs
EPO
Alteração das propriedades eléctricas Vulnerabilidade das células CA1
Isquémia
mEPSC
Diminuição da frequência
Sem Isquémia
mIPSC
Aumento da frequência
Novas perspectivas para o papel da EPO na terapêutica do AVC
Instituto Superior Técnico
ISCHEMIA IN THE ACUTE HIPPOCAMPAL SLICE PREPARATION: CONSEQUENCES FOR MEMBRANE PROPERTIES
Joana Rodrigues nº 62757 2011/2012
Dissertação de Mestrado em Engenharia Biomédica
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Nernst equation
Patch-clamp Configurations Four different methods of patch clamp: (A) cell-attached recording, (B) whole cell configuration,
(C) outside-out configuration, and (D) inside-out configuration.
Cell-attached configuration
Whole-cell configuration
Fig. Registration of the flow of current through a single ion channel at the neuromuscular endplate of frog muscle fiber with patch clamp method. (From Sakmann and Neher, 1984.)

Sodium Channels

Potassium Channels
UNDERSTANDING OF THE IONIC CHANNELS
UNDERSTANDING OF THE IONIC CHANNELS 3 possible states : 1. Resting 2. Opened/Activated 3. Inactivated
• • • •
Q-PCR Imunocitoquimica Imunoprecipitação Western Blot
15 min
TTX (0.5 ÂľM) + Kinuretic Acid (1mM)
40 min
+ EPO (2.4 IU/ml)
15 min
EPO Washout
Ischemia Induction 7mM sucrose (3mM glucose) 95%N2/5%CO2.
30 min
15 min
TTX (0.5 µM) + Gabazine (2 µM)
40 min
+ EPO (2.4 IU/ml)
15 min
EPO washout