J RODRIGUES - Master Thesis Presentation

Instituto Superior Técnico

ISCHEMIA IN THE ACUTE HIPPOCAMPAL SLICE PREPARATION: CONSEQUENCES FOR MEMBRANE PROPERTIES

Joana Rodrigues nº 62757 2011/2012

Dissertação de Mestrado em Engenharia Biomédica

Acidente Vascular Cerebral (AVC) 

Caracterizado por uma rápida perda de função neurológica,

decorrente do oclusão ou ruptura de um vaso sanguíneo cerebral

 Privação de glucose e oxigénio (Isquémia) 

O cérebro representa apenas 2% da massa total do corpo



Consume aproximadamente 25% do fornecimento total de oxigénio

Neurotransmissores 

Glutamato 



Principal neurotransmissor excitatório no SNC Dois tipos de receptores  Receptores ionotrópicos: 



AMPAR, NMDAR e Kainato

Receptores metabotrópicos 

Lisman et al., 2007

mGluR



GABA 

Principal neurotransmissor inibitório no SNC



Dois tipos de receptores  Receptores ionotrópicos 



GABAA e GABAC

Receptores metabotrópicos 

GABAB

Eritropoietina (EPO) 





Função principal  Regulação da Eritropoiese

No feto, a produção da EPO ocorre no fígado, contudo após o nascimento a maioria da EPO passa a ser sintetizada pelos rins EPO e o seu receptor EPOR podem ser encontrados noutros tecido  tecidos do sistema nervoso

Possibilidade da EPO poder actuar como um factor de protecção

Objectivo 

Determinar o efeito da isquémia em células de fatias de hipocampo



Avaliar o papel da eritropoietina numa situação de isquémia 

Registo de patch-clamp (respostas passivas e activas) de neurónios piramidais da região CA1  Alterações ao nível da transmissão sináptica  Alterações no valor da capacitância da membrana

Métodos - Patch-Clamp 



Técnica laboratorial de electrofisiologia que permite o estudo de um ou vários canais iónicos presentes na membrana das células Configuração: Whole-cell 

Estudo do fluxo de corrente através dos canais iónicos 



Potencial de membrana constante (Vh=-70mV)

Estudo das propriedades passivas da membrana 

Capacitância

In http://www.leica-microsystems.com/

Métodos - Hipocampo 

Ratos Wistar machos com 3 ou 4 semanas



Fatias de hipocampo

Região CA1

Ramon y Cajal

Métodos – Tipo de Registos Libertação espontânea de GABA

Célula Piramidal Interneurónio

Glu Libertação espontânea de Glutamato

GABA

mIPSCs

mEPSCs

Amplitude Frequency (number of events/time)

Célula Póssináptica mIPSCs – miniature Inhibitory Postsynaptic Current mEPSCs - miniature Excitatory Postsynaptic Current

Glu GAD

GABA

Presynaptic cell

K+

Cl-

Cl- Cl

GABAA

astrocyte GABAB

Cl-

Cl-

Postsynaptic cell

Capacitância da Membrana 

Células apresentam membrana plasmática 

 

Dupla camada lipídica

Lípidos comportam-se como isolantes (dieléctricos) Membrana considerada como condensador Circuito Equivalente da Estrutura da Membrana



Capacitância   

In Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology.

Proporcional à área da célula Reflecte alterações ao nível das propriedades eléctricas da membrana Medida indirecta do volume das células

Cålculo da Capacitância Exemplo: Transiente Capacitivo

• Aplicação de um pulso hiperpolarizante • 20mV (500 ms) • Registo de 50 transientes capacitivos • MĂŠdia đ??­ đ??ˆ đ??­ = đ??ˆđ??Źđ??Ź + đ??ˆđ?&#x;Ž − đ??ˆđ??Źđ??Ź đ??žđ??ąđ??Š − đ?›•

Fit Exponencial ďƒ Y = Y0 + A−Bt ďƒ’

I0 − Iss = A Iss = Y0

ďƒ’

B=

ďƒ’

1 Ď„

Graph pad

CĂĄlculo da Capacitância đ??ˆ đ??­ = đ??ˆđ??Źđ??Ź + đ??ˆđ?&#x;Ž − đ??ˆđ??Źđ??Ź đ??žđ??ąđ??Š − Vp Ra = I0 Iss Gm = Vp − Ra ∗ Iss Cm = Ď„ ∗

đ??­ đ?›•

Ă rea Cđ?‘š Ă rea



C=



Forma elipsĂłide



Ď€ 4

minor axis + major axis

1 + Gm Ra Ampliação Objectiva: 40x Lentes: 4x

2

Capacitância da membrana Dados resultantes do fit no Graph Pad đ??ˆđ??¨ -432,2 pA

- Equação do Fit -Transiente Capacitivo

MATLAB

đ??ˆđ??Źđ??Ź -120,4 pA

đ?›•

Exponential Curve

6,136 ms

-432.2e-12+120.4e12)*exp(I(:,1)/(0.006136))120.4e-12))

Programa em MATLAB

Ischemia Conditions Normal Conditions

Exp

Ra (Ω)

Gm (S)

Cm (F)

Major axis (µm)

Minor axis (µm)

Area (µm2)

Area (cm2)

C (F/cm2)

1

3.57E+07

6.49E-09

1.46E-10

1.30E+01

5.55E+00

268.80

2.68E-04

5.44E-07

2

2.24E+07

8.62E-09

1.70E-10

1.02E+01

7.40E+00

242.59

2.43E-04

7.01E-07

3

2.52E+07

7.23E-09

1.52E-10

1.48E+01

4.63E+00

296.35

2.96E-04

5.12E-07

4

1.80E+07

1.05E-08

2.18E-10

1.57E+01

6.48E+00

387.07

3.87E-04

5.64E-07

5

2.94E+07

1.38E-08

1.26E-10

1.39E+01

5.18E+00

285.17

2.85E-04

4.44E-07

6

3.52E+07

6.45E-09

1.03E-10

1.24E+01

9.25E+00

367.96

3.68E-04

2.79E-07

7

3.33E+07

4.12E-09

1.38E-10

1.11E+01

5.55E+00

217.73

2.18E-04

6.33E-07

8

2.54E+07

6.57E-09

1.25E-10

1.57E+01

8.33E+00

454.27

4.54E-04

2.76E-07

1

4.03E+07

6.67E-09

1.17E-10

1.30E+01

6.48E+00

296.35

2.96E-04

3.94E-07

2

3.44E+07

1.07E-08

1.06E-10

1.67E+01

5.55E+00

387.07

3.87E-04

2.75E-07

3

3.34E+07

6.07E-09

1.54E-10

1.48E+01

7.40E+00

387.08

3.87E-04

3.98E-07

4

3.35E+07

6.73E-09

1.61E-10

1.30E+01

7.40E+00

325.25

3.25E-04

4.95E-07

5

3.22E+07

1.03E-08

1.09E-10

1.11E+01

7.40E+00

268.80

2.69E-04

4.06E-07

6

3.68E+07

6.87E-09

1.12E-10

1.85E+01

8.33E+00

565.18

5.65E-04

1.99E-07

7

4.63E+07

8.34E-09

8.14E-11

1.48E+01

3.70E+00

268.80

2.69E-04

3.03E-07

8

4.27E+07

7.34E-09

1.10E-10

1.57E+01

3.70E+00

296.35

2.96E-04

3.72E-07

Capacitância da Membrana n=8 *p=0.0461

16 células

8 células não sofreram isquémia 8 células sofreram isquémia

Capacitância da Membrana – Representação Indirecta do volume da Célula (Chi and Xu, 2000)

Isquémia influencia o volume da célula Significância estatística determinada por Unpaired T-test

Ischemia Conditions Normal Conditions

Exp

Ra (Ω)

Gm (S)

Cm (F)

Major axis (µm)

Minor axis (µm)

Area (µm2)

Area (cm2)

C (F/cm2)

1

3.57E+07

6.49E-09

1.46E-10

1.30E+01

5.55E+00

268.80

2.68E-04

5.44E-07

2

2.24E+07

8.62E-09

1.70E-10

1.02E+01

7.40E+00

242.59

2.43E-04

7.01E-07

3

2.52E+07

7.23E-09

1.52E-10

1.48E+01

4.63E+00

296.35

2.96E-04

5.12E-07

4

1.80E+07

1.05E-08

2.18E-10

1.57E+01

6.48E+00

387.07

3.87E-04

5.64E-07

5

2.94E+07

1.38E-08

1.26E-10

1.39E+01

5.18E+00

285.17

2.85E-04

4.44E-07

6

3.52E+07

6.45E-09

1.03E-10

1.24E+01

9.25E+00

367.96

3.68E-04

2.79E-07

7

3.33E+07

4.12E-09

1.38E-10

1.11E+01

5.55E+00

217.73

2.18E-04

6.33E-07

8

2.54E+07

6.57E-09

1.25E-10

1.57E+01

8.33E+00

454.27

4.54E-04

2.76E-07

1

4.03E+07

6.67E-09

1.17E-10

1.30E+01

6.48E+00

296.35

2.96E-04

3.94E-07

2

3.44E+07

1.07E-08

1.06E-10

1.67E+01

5.55E+00

387.07

3.87E-04

2.75E-07

3

3.34E+07

6.07E-09

1.54E-10

1.48E+01

7.40E+00

387.08

3.87E-04

3.98E-07

4

3.35E+07

6.73E-09

1.61E-10

1.30E+01

7.40E+00

325.25

3.25E-04

4.95E-07

5

3.22E+07

1.03E-08

1.09E-10

1.11E+01

7.40E+00

268.80

2.69E-04

4.06E-07

6

3.68E+07

6.87E-09

1.12E-10

1.85E+01

8.33E+00

565.18

5.65E-04

1.99E-07

7

4.63E+07

8.34E-09

8.14E-11

1.48E+01

3.70E+00

268.80

2.69E-04

3.03E-07

8

4.27E+07

7.34E-09

1.10E-10

1.57E+01

3.70E+00

296.35

2.96E-04

3.72E-07

Capacitância da Membrana n=8 *p=0.0461

16 células

Capacitância da Membrana – Representação Indirecta do volume da Célula (Chi and Xu, 2000)

8 células não sofreram isquémia 8 células sofreram isquémia

Trabalho Futuro: Análise do valor da Capacitância após administração da EPO

EPO reduz o swelling das células (Bernaudin et al., 1999; Gonzalez et al.,

Isquémia influencia o volume da célula

2008)

Significância estatística determinada por Unpaired T-test

Influência da Isquémia nas mEPSCs 

Estudo de efeito de isquémia em células do hipocampo  Resultados contraditórios (Furukawa et al., 1990; Chang et al., 1989) Efeito Pré-Sináptico

n=7 *p=0.0163

Diferença na frequência das mEPSCs nas células que sofreram um insulto de isquémia de 30 minutos

antes da administração da EPO Significância estatística determinada por Unpaired T-test

Efeito da EPO nas mEPSCs após isquémia

TTX – Bloqueia os canais de sódio dependentes da voltagem

Gabazina – Antagonista dos receptores de GABA

Efeito da EPO nas mEPSCs após isquémia 

EPO diminui a frequência das mEPSCs em neurónios da região CA1, após insulto de isquémia de 30 min. n=7 *p=0.0214

Efeito Pré-Sináptico Efeito Inibitório Experiência Representativa

n=7 p=0.5600

Efeito Neuroprotector ?

Significância estatística determinada por Unpaired T-test

Efeito da EPO nas mIPSCs

TTX – Bloqueia os canais de sódio dependentes da voltagem Ácido Quinurénico – Antagonista de receptores AMPA, NMDA e Kainato

Efeito da EPO nas mIPSCs 

EPO aumenta a frequência das mIPSCs em neurónios da região CA1 n=6 *p=0.0461

Experiência Representativa

Efeito Pré-sináptico

Trabalho Futuro n=6 p=0.9962

Efeito da EPO na transmissão GABAérgica após 30 min de isquémia

Interneurónios são menos afectados por isquémia que neurónios piramidais (Furukawa et al., 1990) Significância estatística determinada por Unpaired T-test

Conclusões Aumento da Capacitância

Isquémia

Redução na frequência mEPSCs

EPO

Alteração das propriedades eléctricas Vulnerabilidade das células CA1

Isquémia

mEPSC

Diminuição da frequência

Sem Isquémia

mIPSC

Aumento da frequência

Novas perspectivas para o papel da EPO na terapêutica do AVC

Instituto Superior Técnico

ISCHEMIA IN THE ACUTE HIPPOCAMPAL SLICE PREPARATION: CONSEQUENCES FOR MEMBRANE PROPERTIES

Joana Rodrigues nº 62757 2011/2012

Dissertação de Mestrado em Engenharia Biomédica

Extra slide stuff ..

Nernst equation

Patch-clamp Configurations Four different methods of patch clamp: (A) cell-attached recording, (B) whole cell configuration,

(C) outside-out configuration, and (D) inside-out configuration.

Cell-attached configuration

Whole-cell configuration

Fig. Registration of the flow of current through a single ion channel at the neuromuscular endplate of frog muscle fiber with patch clamp method. (From Sakmann and Neher, 1984.)



Sodium Channels



Potassium Channels

UNDERSTANDING OF THE IONIC CHANNELS

UNDERSTANDING OF THE IONIC CHANNELS 3 possible states : 1. Resting 2. Opened/Activated 3. Inactivated

• • • •

Q-PCR Imunocitoquimica Imunoprecipitação Western Blot

15 min

TTX (0.5 ÂľM) + Kinuretic Acid (1mM)

40 min

+ EPO (2.4 IU/ml)

15 min

EPO Washout

Ischemia Induction 7mM sucrose (3mM glucose) 95%N2/5%CO2.

30 min

15 min

TTX (0.5 µM) + Gabazine (2 µM)

40 min

+ EPO (2.4 IU/ml)

15 min

EPO washout