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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE HEMATOLOGIA
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A media cuad CARLOS ARMANDO ESQUECHE ANGELES Biologo – Microbiologo C.B.P. 3913 2011
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TOMA DE MUESTRA ♦ Se elige la vena que favorece la toma de la muestra, preferiblemente de la región venosa antecubital, porque a este nivel la piel es fina y móvil y las venas son de grueso calibre y relativamente superficiales. Cuando este lugar no favorece para la punción, se observan otras venas como de la mano o de la cara anterior del antebrazo. ♦ El personal encargado de la toma de muestras se colocara los guantes de látex, previo lavado de las manos. ♦ Si las venas no son muy superficiales se coloca un torniquete 5cc arriba del sitio elegido para puncionar, se le pide al paciente que empuñe la mano y si es necesario se frota suavemente con la mano de quien va a puncionar el lugar de la vena elegida. Si la vena es superficial solo se le pide al paciente que empuñe la mano. ♦ Una vez elegida el área de punción se esteriliza con algodón empapado con alcohol antiséptico, se emplea jeringa desechable y se procede a la punción. ♦ La cinta elástica debe retirarse después de introducida la aguja en la vena, se aspira la sangre con la jeringa y una vez retirada, se presionará la zona puncionada con un algodón empapado en alcohol antiséptico. ♦ Cuando se va a tomar únicamente para exámenes de hematología, se toman 2cc de sangre, cuando además el paciente tiene orden para exámenes de química clínica y/o inmunología se toman 5cc. La muestra para CH se almacena en los tubos tapa lila que son previamente organizados y deben contener 2 gotas de EDTA.
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FROTIS SANGUINEO Y COLORACION Para el frotis sanguíneo se emplea el método de los dos portaobjetos: ♦ Identificar la lámina. ♦ Colocar una pequeña gota de sangre no más de 3 mm de diámetro de un portaobjetos a 2 cm de uno de los extremos. ♦ Colocar el canto de otro portaobjetos, por la parte anterior a la gota de sangre, sobre la superficie del primer portaobjetos, formando un ángulo de 45 grados y desplazarlo suavemente hacia atrás, hasta que alcance la gota de sangre. ♦ Esperar que por capilaridad toda la sangre se distribuya uniformemente, es aconsejable que la sangre no llegue a los lados del portaobjetos, sobre el que se realiza la extensión. ♦ Deslizar suavemente y a velocidad moderada un portaobjetos sobre el otro en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida, sobre la superficie del primer portaobjeto. El grosor del frotis sanguíneo puede variar de acuerdo al ángulo empleado durante la extensión, si es superior a 45° será gruesa y corta y si es inferior será larga y fina. Se deja secar a temperatura ambiente y en posición horizontal.
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Para la coloración, una vez seco el extendido no se deja pasar más de una hora: ♦ Se aplica 1 cm colorante de Wright por 1 minuto. ♦ Se aplica buffer Giordano (que debe mantenerse en la nevera, pero a temperatura ambiente en el momento de emplearlo) por 6 minutos. ♦ Se lava la lámina con agua de chorro, se seca por la parte posterior y se deja secar a temperatura ambiente en posición vertical.
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HEMOGLOBINA Servir en un tubo de ensayo 2,5 ml de Drabkin y tomar 10 ul de sangre con anticoagulante, limpiar muy bien la punta y llevar al fondo del tubo y aplicar, enjuagar la punta con el reactivo en la parte superior. Homogeneizar el tubo por inversión con movimientos suaves. Dejar en reposo de 5 a 10 minutos. Leer a 540 nm, llevando a cero con el blanco del reactivo y calibrando con el patrón de hemoglobina.
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HEMOGLOBINA: ESPECTROFOTOMETRICA ICSH
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FUNDAMENTO El ión ferroso de la HB se oxida a ión férrico por acción del ferricianuro potásico formándose hemiglobina (metahemoglobina). La hemiglobina reacciona con el cianuro para formar cianhemiglobina (cianmetahemoglobina) que se puede medir por espectrofotometría.
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REACTIVOS Reactivo concentrado y patrón de Hb, deben guardarse en refrigeración, bien cerrados, protegidos de la luz y evitar su contaminación durante su uso para que se conserve hasta la fecha indicada en la etiqueta. Presencia de turbidez, partículas en el reactivo y el blanco son indicaciones de deterioro, además de lecturas superiores de 0,010 a 540 nm del blanco. Reactivo de trabajo: Diluir el contenido del frasco de reactivo concentrado hasta 1000 ml con agua destilada, agitar. Para preparar otros volúmenes mezclar en proporción 1 ml de reactivo concentrado + 49 ml de agua destilada. Conservar en frasco oscuro siendo estable 6 meses a 15-30°C: No congelar.
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MUESTRAS Sangre capilar o venosa recogida con EDTA o heparina. La Hb en sangre es estable 6 días de 2-8°C.
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PROCEDIMIENTO
BLANCO --2.5 ml
PATRON 10 ul -2.5 ml
MUESTRA -10 ul 2.5 ml
PATRON MUESTRA REACTIVO TRABAJO Agitar y dejar por 3 minutos a temperatura ambiente. Leer las absorbancias a 540 nm frente al blanco. El color es estable por varias horas. Cálculos:
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Con patrón: A muestra ------------ X C patrón = C muestra A patrón Sin patrón: A muestra X 37,5 = C muestra VALORES NORMALES:
12-14 años 15-17 años 18-74 años
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HOMBRES 12,0-16,0 g/dl 11,7-16,6 g/dl 13,5-17,5 g/dl
MUJERES 11,5-15,0 g/dl 11,7/15,3 g/dl 12,0-16,0 g/dl
CARACETERISTICAS METROLOGICAS Límite de detección: 0,2 g/dl de Hb. Límite de linealidad: 20 g/dl. Para valores superiores diluir la muestra ½ con agua destilada y repetir. Interferencias: La bilirrubina no interfiere. La lipemia puede elevar falsamente los resultados debido a la turbidez. Otros medicamentos y sustancias pueden interferir.
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HEMATOCRITO Se llena el capilar de la muestra tomada con anticoagulante, hasta las 3/4 partes y sellar por este extremo con plastilina, colocarla en la microcentrifuga de 5 a 10 minutos entre 10.000 y 5.000 r.p.m. Cuando la centrifuga pare, leer el valor en la tabla de hemotocrito. Tomando el punto cero donde la plastilina se une con la muestra hasta la línea superior que marque con sangre en el capilar. Solamente se lee si no han quedado espacios, ni burbujas.
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RECUENTO DE LEUCOCITOS
♦ Aspirar mediante la pipeta de Thoma sangre total hasta el enrose de 0.5 y limpiar la punta de la pipeta. ♦ Aspirar líquido de turk hasta el enrose de 11. ♦ Con el dedo índice tapar la parte superior de la pipeta y con el dedo pulgar la parte inferior y mezclar suavemente. ♦ Desechar las tres primeras gotas. ♦ Llenar la cámara. ♦ Realizar la observación y conteo en 10X. ♦ Contar los leucocitos presentes en los 4 cuadrados grandes (los de las 4 esquinas), se cuentan las células contenidas en el interior del área de recuento y las que sean tangente o secantes a las líneas de demarcación superior y derecha. ♦ El total de leucocitos en los 4 cuadrados se multiplica por 50 y este será el valor del recuento de leucocitos.
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RECUENTO DIFERENCIAL En la lámina una vez coloreada se lee con objetivo de 100X las células vistas hasta llegar a 100 células contadas. La lectura se realiza en sentido vertical y de derecha a izquierda buscándose con anterioridad en 10X la zona ideal, en la parte media del frotis. Cada valor se dará en porcentaje de células vistas. Es importante diferenciar los tres tipos de células que podemos observar: ♦ Células nucleadas (leucocitos) con función defensiva.
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♦ Células anucleadas (hematíes) con función respiratoria. ♦ Seudofragmentos citoplasmáticos (plaquetas) con hemostática.
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Los leucocitos tienen la característica de tener núcleo y organélos citoplasmáticos lo que permite su diferenciación morfológica con los hematíes y las plaquetas. Estos pueden ser: Polinucleares: de núcleo lobulado de apariencia múltiple como los neutrofilos, eosinófilos y basofilos. Mononucleares: núcleo único y redondo como los linfocitos y monocitos.
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Neutrofilos: Es el más predominante, su citoplasma es ligeramente acidófilo (rosa pálido) y contiene abundantes granulaciones distribuidas en todo el citoplasma; el núcleo es de color violeta oscuro y de cromatina densa y esta divido en lóbulos unidos por puentes de cromatina, dando la apariencia de tener varios núcleos, cuando el puente es muy ancho adquiere forma de C siendo propio de los cayados o células inmaduras de esta línea granulocítica. Eosinofilos: Su citoplasma esta lleno de granulaciones de color naranja que se observan de gran tamaño, bien individualizados y redondos, casi nunca cubren el núcleo, el que se observa de un violeta más tenue que el neutrofilo y por lo general de dos masas. Basofilos: Es el menos abundante. su citoplasma se observa de gránulos irregulares que cubren completamente el núcleo y se observan de color muy oscuro entre azul y morado. Linfocitos: El citoplasma puede ser escaso o abundante y de color azul claro, se observan pequeñas y escasas ganulaciones de color rosado a rojo. Su núcleo es redondo y abarca gran parte de la células, se pueden observar espacios en el núcleo que están compuestos por cromatina laxa. Monocitos: De citoplasma abundante y color gris azulado. Aveces posee vacuolas. Posee granulaciones finas azurofilas por todo el citoplasma , el núcleo es central por lo general redondo aunque con una o más escotaduras ocupa gran parte del citoplasma, su cromatina es laxa, filamentosa e irregular.
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Se debe informar la presencia de neutrófilos con granulación tóxica, restos nucleares o normoblastos, cayados, linfocitos atípicos (cuando es superior a el 10% del total de linfocitos), reacción leucoeritoblástica que serán contados dentro de las 100 células del recuento diferencial. Ante la presencia de normoblastos realizar la corrección de leucocitos. RECUENTO DE PLAQUETAS
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Se busca entre el cuerpo y la cola del frotis sanguíneo una zona de distribución uniforme de hematíes (que no estén amontonados y no se observen grandes espacios en blanco entre ellos), se cuenta la presencia de 100 de estos por campo. Así, se contara en cada campo, siendo 10 en total, el número de plaquetas observadas, se suman, se divide por 10 y se multiplica por 21.000, siendo este el valor del número total de plaquetas por milímetro cúbico. ANALISIS DE FROTIS DE SANGRE PEIFERICA
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Seleccionamos la zona ideal de lectura en 10X, hacia la parte de la pluma y el cuerpo del frotis, donde las células se endosan unas con otras observándose bien delimitados sus contornos.
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Para valorar el recuento total de blancos, miramos 3 campos en forma vertical en 10X, homógenos en cuento a número de hematíes, contar la cantidad de células blancas en cada uno de ellos. Promediar y multiplicar este valor por la constante 250, dándonos el valor de leucocitos en mm3. (a+b+c) / 3 X 250 = leuc / mm3 Estos datos son confiables cuando la cantidad de blancos no sobrepasa los 20.000 mm3. Cifras mayores se pueden considerar fuentes de error y es necesario realizar el recuento total por líquido de turk confirmando el valor repitiendo la prueba.
Observar la morfología de los leucocitos en 100X e informar: • Cuantitativamente: la cantidad por mm3 como normales, leucocitosis, leucopenia.
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• Cualitativamente: el diferencial, si hay disminución o aumento en alguna de las líneas, morfología normal o las alteraciones observadas en las diferentes líneas. Anotar la presencia de neutrófilos con granulación tóxica, cuerpos de Dohle, degranulados, macropolicitos (hipersegmentados), hipolobulación (síndrome de Pelger – Huet) vacuolas; linfocitos atípicos, vacuolados; monocitos vacuolados; eosinófilos y basófilos hiperlobulados, con alteraciones en los gránulos; restos nucleares; núcleos picnóticos; presencia de células inmaduras.
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Para linfocitos atípicos se debe informar: si son mas del 10% (es decir, sumándolos al total de los linfocitos) se deben informar en el diferencial de los 100 leucocitos. Si es menor del 10% del total de linfocitos solo se anotan como: se observan linfocitos atípicos escasos.
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En caso de reacción leucoeritoblástica se incluyen por aparte dentro del recuento diferencial. Además la presencia de normoblastos deberán incluirse como se menciono.
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En caso de reacción leucoblástica o desviación a la izquierda también se deberá incluir en el recuento diferencial).
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Observar en 100X los eritrocitos para determinar y valorar: el tamaño o anisocitosis, el color, la variación de formas o poiquilocitosis y, la inmadurez globular o policromatofilia que es la presencia de hematies con tonalidad gris azulada y de mayor tamaño. • La anisocitosis se puede cuantificar así: Se determina al compararlos con los linfocitos pequeños, un glóbulo rojo normal debe tener el mismo tamaño de un linfocito. Se cuantifica en 10 campos: Normal Ligera Moderada Marcada 0–5 6 – 15 16 – 30 mayor 30 El tamaño se relaciona con el VCM 76 – 96 fl. Puede ser normocítico, microcítico o macrocítico, para estos dos últimos se informa ligera, moderada o marcada. De acuerdo al VCM: Macrocitosis:
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Ligera H 95 – 108, M101 – 108; moderada 109 – 120; marcada mayor de 120. Microcitosis: Ligera 76 – 80, moderada 66 – 75, marcada menor de 65. • El color dado normocrómico como: Normal 0- 5
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por la cantidad de hemoglobina presente puede ser o hipocromía. Esta última se determina en 10 campos Ligera 6 – 15
Moderada 16 – 30
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Marcada mayor 30
• Para la poiquilocitosis se debe informar la forma prevalente y cuantificar así: Normal Ligera Moderada Marcada 0 1–5 6 – 15 mayor de 15
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Pueden ser: esferocitos, ovalocitos, estomatocitos, codocitos, dacriocitos, esquitocitos, queratocitos, acantocitos, knizocitos, célula falciforme.
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• La policromatofilia y los reticulositos (se valoran con coloración de azul de cresil brillante) son proporcionales en 10 campos, pero solo determinaremos la policromatofilia como: Normal Ligera Moderada Marcada 0–2 2–3 3–4 mayor 4
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• Además se debe informar la presencia de inclusiones como punteado basófilo, cuerpos de Howell Jolly, cuerpos de Heinz, anillos de Cabot, restos nucleares, parásitos y normoblastos si los hay. Para las plaquetas se debe informar si son normales en número y morfología. Si no se solicito antes un recuento de plaquetas que nos de un valoración de la cantidad se observa 100X, 10 campos en proporción cada uno de 100 hematíes y se debe encontrar de 7 a 21 plaquetas por campo para considerarlas normal, , en casos contrarios se informa trombocitosis o trombocitopenia y la morfología cuando se encuentran mas de 3 macroplaquetas lo que se debe informar o por el contrario microplaquetas.
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NORMOBLASTOS Ante la presencia de normoblastos se debe realizar la corrección de leucocitos. En este recuento interfiere los normoblastos y los restos nucleares. Se corrigen siempre que se encuentren mas del 10% al realizar el recuento diferencial. Deberán ser anotados a medida que se realice el recuento diferencial anotándolos apearte y se informa la cantidad de normoblastos en100 células blancas contadas.
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FORMA DE CORRECCION: 1. Hacer el recuento diferencial. 2. Saber cuántos normoblastos o cuantos restos nucleares se obtuvieron en este recuento. 3. Conocer el recuento total de blancos.
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Leucocitos corregidos: número de leucocitos contados X 100 / número de normoblastos + 100
Recuento total de leucocitos por mm3 por cualquier método, es decir, automatizado o manual por líquido de Turk. X 100 % que es le número de leucocitos contados para el diferencial / (100 % que es el número de leucocitos contados para el diferencial + el % de restos nucleares o normoblastos contados en el diferencial). Ejemplo:
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7.500 mm3 de leucocitos por líquido de turk 100 % de células contadas para el diferencial 20% de restos nucleares o normoblastos hallados en el diferencial 7.500 mm3 de leucocitos X 100% total de células contadas en el diferencial / 120% = 6.250 mm3 de leucocitos corregidos.
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LINEA MEGACARIOCITICA MEGACARIOBLASTO: De tamaño grande, núcleo con cromatina laxa, presencia de nucleolo, citoplasma intensamente azul, sin gránulos, presenta prolongaciones a modo de seudópodos útiles para su identificación morfológica.
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PROMEGACARIOCITO: De mayor tamaño que la anterior, núcleo multilobulado, citoplasma basófilo con abundantes granulaciones y desflecado. MEGACAROCITO: Es el de mayor tamaño. Gran citoplasma de color grisáceo y repleto totalmente de gránulos azurófilos, gran número de los cuales se agrupan y rodean lo que se denomina una membrana de demarcación. La fragmentación final del citoplasma dará origen a las plaquetas.
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PLAQUETAS: Se observan de pequeño tamaño, de color rosado y con gránulos en su interior.
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LINEA ERITROIDE
La maduración eritropoyética se caracteriza por: 1. El aumento progresivo de la acidofilia celular, más que la línea mieoloide. 2. Desaparición de todos los organelos citoplasmáticos. 3. Su núcleo es más central y pequeño que la línea granulocítica. PROERITOBLASTO: Gran tamaño, intensa basofilia citoplasmática, núcleo grande con cromatina laxa, alrededor del núcleo se observa como encaje, en el que pueden apreciarse dos o más núcleolos, aunque son muy difusos.
ERITOBLASTO BASOFILO: Es de menor tamaño que la anterior, la cromatina es más burda como grumos y los nucleolos poco distinguibles o completamente ausentes. El citoplasma conserva su intensa basofilia, núcleo más central. 12
ERITOBLASTO POLICROMATICO: Es de menor tamaño que la anterior, su citoplasma es de color gris azulado, cromatina gruesa e irregularmente condensada se nota como un tablero de ajedrez. ERITOBLASTO ORTOCROMATICO: Su tamaño es un poco menor a la anterior sin ser muy notoria la diferencia, núcleo picnótico, más pequeño y más condensado, citoplasma gris rosado.
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RETICULOCITO: Tiene un tamaño un poco mayor que el hematie, no tiene núcleo, citoplasma de tono azulado, con coloración supravital revela un retículo granulofilamentoso.
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LINEA GRANULOPOYETICA Es característico que el núcleo disminuya de tamaño en relación al citoplasma.
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MIELOBLASTO: Citoplasma azulado y granulaciones primarias o azurófilas muy escasas o inexistentes. Cromatina muy laxa con dos o tres nucleolos definidos y oscuros, el núcleo ocupa la mayor parte de la célula quedando solo una pequeña cantidad del citoplasma.
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PROMIELOCITO: De mayor tamaño que la anterior, con abundante granulación azurófila (se observan rojos, toscos y grandes) citoplasmática. Los gránulos son visibles en el núcleo como en el citoplasma. Núcleo redondo y relativamente grande, aún se pueden distinguir los nucleolos. El citoplasma es azul con una zona relativamente clara alrededor del núcleo. MIELOCITO: De menor tamaño que la anterior, la cual se caracteriza por la gran abundancia de granulaciones específicas citoplasmáticas. Según su naturaleza se clasifican en neutrófilo, eosinófilo y basófilo. El núcleo contiene una cromatina más condensada que la del promielocito, es excéntrico y no posee nucleolos. Es de forma redonda u ovalada.
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METAMIELOCITO: De menor tamaño que la anterior con núcleo excéntrico, presenta una ligera invaginación dando aspecto de frijol, citoplasma rosado. EN BANDA O CAYADO: La invaginación es más pronunciada arqueando la totalidad del núcleo, que se va a lobular generalmente a neutrófilo, eosinófilo o basófilo según los gránulos que se observan cerca del núcleo.
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LINEA MONOCITICA
MONOBLASTO: Son similares a los mieloblastos y difícil de diferenciar entre sí. El citoplasma es basófilo y tienen un halo pálido alrededor del núcleo. El núcleo tiene una cromatina fina, suave y homogénea que se ve interrumpida por los núcleolos, que pueden ser de 2 a 4 redondos y de color azul claro.
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PROMONOCITO: Tiene un núcleo regular e irregular, citoplasma azul grisáceo más abundante que en el monoblasto. Escasos gránulos azurófilos, el citoplasma presenta ligeras prolongaciones simulando pseudópodos.
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MONOCITO: Núcleo irregular en forma de frijol. Un pliegue en el núcleo es bastante característico. La cromatina es fina e irregularmente distribuida. El citoplasma es de color azul – grisáceo. Casi siempre contiene gránulos azurófilos. HISTIOCITOS
Son los monocitos que de sangre periférica pasan a los diferentes tejidos, con actividad macrofágica. Sus características dependen del tejido al cual ha migrado: NOMBRE TEJIDO Histiocitos Conjuntivo Células de Kupfer Hígado Macrófagos alveolares Pulmón Macr. de cordones y senos esplénicos Bazo 14
Células sinusoidales Macrófagos medulares Macrófagos de las serosas Osteoclastos Células de la microglia
Ganglio linfático Médula ósea Pleura y peritoneo Hueso Sistema nervioso
Los histiocitos son células grandes con abundante citoplasma que contiene vacuolas digestivas y/o partículas fagocitadas bien visibles, de núcleo excéntrico. El citoplasma es azul claro o gris azulado, con o sin gránulos. Algunos pueden presentar seudópodos obtusos, sin gránulos. Otros bordes citoplasmáticos dilacerados, característicos de células tisulares fijas que han sido arrancadas de su sitio normal.
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LINEA LINFOIDE LINFOBLASTO: Tiene la cromatina homógena y delicada pero es un poco más burda que la de los mieloblastos y monoblastos. Tiene uno o dos nucleolos, escaso citoplasma azul, sin gránulos y un halo claro perinuclear.
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PROLINFOCITO: Más basófilos que los linfocitos, más grandes, de núcleo ligeramente excéntrico, con un nucleolo, cromatina menos densa que el linfocito, el citoplasma a veces parece rugoso y granular. LINEA PLASMOCITICA
PLASMOBLASTO: Célula de tamaño intermedio. Por lo general es redonda pero no necesariamente, de núcleo grande con cromatina fina y presencia de nucleolo bien definido, citoplasma de color azul oscuro y algunas veces se puede observar una zona clara perinuclear. PROPLASMOCITO: forma ovalada, núcleo excéntrico grande que contiene el nucleolo, mayor cantidad de citoplasma que presenta color azul intenso y la zona clara perinuclear se observa mejor. PLASMOCITO: el núcleo es muy excéntrico con una cromatina muy condensada da el aspecto de radios de rueda, el citoplasma ha tomado 15
forma ovalada. El citoplasma no es granuloso pero sí de gran tamaño contrario al linfocito, se tiñe de azul oscuro y presenta una brillante translucidez o zona clara. HEMOCLASIFICACION Si el paciente llega únicamente con orden de hemoclasificación, se toma la muestra del pulpejo de su dedo índice. Se limpia la zona con algodón impregnado con alcohol antiséptico, se deja secar a temperatura ambiente toma una lanceta y se punciona por la zona del lado del pulpejo del dedo, se descarta la primera gota y se toma tres gotas en una lámina portaobjetos, separadas entre sí, se colocara una torunda de algodón en la zona puncionada y se le dirá al paciente que la sostenga por un minuto.
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La lámina portaobjetos en su posición horizontal se divide en 3 partes, en cada una en la parte superior se marca como A, B y D. Cada gota se coloca debajo de cada letra y se aplican los reactivos del juego de hemoclasificadores, en la zona A, se aplica una gota de Anti A, en la zona B una gota de Anti B y en la zona d una gota de Anti D. Para los dos primeros espacios se determina el grupo sanguíneo y para el último el Rho. Si solo se observa aglutinación en la zona A, el paciente es grupo A; si solo se observa aglutinación el la zona B, el paciente es grupo B; si la aglutinación es para las dos zonas, el paciente es grupo AB y si no se observa aglutinación para ninguna de las dos zonas, el paciente es grupo sanguíneo O. En la zona D la presencia de aglutinación nos indica rho positivo y la no aglutinación un rho negativo.
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Si la orden además indica otro examen que implique la toma de tubo con EDTA, la muestra será tomada del mismo tubo y no se puncionara al paciente en su dedo índice. DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO PRINCIPIO BOLOGICO DE LA PRUEBA Se basa en la hemaglutinación directa. La incubación de los hematíes muestra con el reactivo Anti A, Anti B, Anti D produce una reacción específica de antígeno - anticuerpo, si el correspondiente antígeno esta
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presente en los hematíes muestra. La reacción es demostrada por la aglutinación visible. La no aglutinación indica ausencia del antígeno para cada uno de los reactivos siempre que se hayan cumplido correctamente la indicaciones del procedimiento. DESCRIPCION DEL PRODUCTO Los reactivos son preparados de pool de suero humano obtenidos de donantes inmunizados. Deben almacenarse de 2-8°C, no congelar. Si se observa turbidez no emplearlo, puede presentar contaminación bacteriana o deterioro del producto, tampoco usarlo después de la fecha de vencimiento. El material biológico con los que se preparó el reactivo fue sometido a pruebas de HBsAg y Anti VIH dando negativo, sin embargo, se deben manipular como si fueran material sospechosos de infección.
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MUESTRA No se requiere preparación especial del paciente para obtener la muestra. Se puede tomar muestra venosa (usando anticoagulante) o por punción capilar en este caso si la prueba se realiza de una vez sin retrasos para evitar que la muestra se seque. Lavado de glóbulos rojos de pueden almacenar en solución preservante de 2-8°c por no más de 35 días.
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GOTA GRUESA
Puede hacerse con sangre con anticoagulante o de gotas obtenidas por punción, que se obtienen de la parte lateral de la yema del dedo medio de la mano y en niños pequeños del dedo gordo del pie. Se debe limpiar la piel con alcohol, se deja secar, se punciona con lanceta desechable y se limpia la primera gota con algodón seco. Se presiona para obtener una gota pequeña. Se coloca dos gotas en una lámina portaobjetos sin tocar la piel, la cual se ha divido imaginariamente en 3 partes, una para marcarla en el extremo derecho y los otros dos espacios para colocar cada gota. Se extiende la sangre de cada gota utilizando el ángulo y los primeros 5 mm del borde longitudinal de otro portaobjetos se extiende la gota amanera de “N” para
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formar un rectángulo de 1,5 a 0.5 cm; se hacen 2 laminas que se dejan secar a temperatura ambiente en posición horizontal, se deben colorear antes de 2 horas de tomadas empleando la coloración de Field. Limpiar con alcohol la lámina que se utilizó para las gotas gruesas con el fin de evitar la contaminación de las siguientes muestras. Es importante tener en cuenta que el exceso en el tiempo de secado, el alcohol o el calor pueden fijar la hemoglobina, haciendo inadecuada la muestra para el diagnóstico de malaria.
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Primero se hace una precoloración: Se sumerge durante 1 segundo la lámina en azul de metileno fosfatado, se deja escurrir sobre una toalla de papel en posición vertical. Enjuagar con solución amortiguadora rápidamente La coloración se realiza colocando la lámina boca abajo en una superficie cóncava, allí se adiciona el colorante de Field evitando la formación de burbujas que se ha preparado previamente adicionando 3 ml de solución amortiguadora, una gota de solución A y una gota de solución B; se deja actuar por 9 minutos, luego se escurren sobre el papel absorbente y se deja secar.
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La observación se realiza en 100X, examinando la gota a partir de uno de sus bordes, y mover la lámina en breves trazados horizontales y verticales (zig – zag) en la que se identifica la presencia del parásito, su especie en caso de observarse y el recuento del plasmodium. También se puede hacer extendido coloreando la lámina con 2 ml Wright por 1 minuto y luego 0.5 de buffer Giordano por 6 minutos, se lava con agua de chorro, se escurre y se deja secar a temperatura ambiente en posición vertical. Para hacer el diagnóstico por la lectura de extendido se debe realizar hematocrito al paciente.
LECTURA: Con base en el número de leucocitos. En gota gruesa se cuentan los trofozoitos, esquizontes y gametocitos para P. vivax; y/o trofozoitos y/o gametocitos, aunque ocasionalmente esquizontes para P. falciparum, presentes en los campos microscópicos determinados con
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10X y 40X donde se encuentre mayor número de leucocitos. Un buen campo microscópico es aquel en donde se encuentran de 10 a 20 leucocitos, mirando los campos hasta que estos sumen 100 leucocitos. Conociendo el número de leucocitos por mm3 se puede calcular la cantidad de parásitos en este volumen de sangre. De no visualizar el parásito, se deben observar 200 campos para calificar la muestra como negativa. Ejemplo: paciente con malaria con un recuento de 8.000 leuc/ul de sangre. Se establece la proporción de parásitos en 100 leucocitos encontrados: # de parásitos X 8.000 luec/ul de sangre / 100 leucocitos = # de parásitos/ul de sangre.
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Con base en el número de sangre de la gota gruesa. Se calcula que en una preparación bien hecha, 100 campos microscópicos en 100X, equivalen a 0.2 mm3 de sangre. Puede determinarse la parasitemia contando en los 100 campos, los trofozoitos y esquizontes presentes.
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Con base en el número de eritrocitos. En un extendido de sangre periférica se busca el porcentaje de eritrocitos parasitados por trofozoitos y esquizontes presentes en 10.000 eritrocitos, lo que equivale a 100 campos microscópicos, asumiendo que cada campo tiene igual cantidad de eritrocitos. Se busca campos en donde la distribución de los eritrocitos sea homogénea y no se encuentren superpuestos, hacia el segundo tercio del extendido. Ejemplo: serían necesarios 33 campos microscópicos, si hay 300 eritrocitos por campo.
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INFORME DE RESULTADOS: Con base en el número de leucocitos: Para los casos de P. vivax no se debe hacer recuento ni diferenciación entre las formas sexuadas y asexuadas. En los casos de P. falciparum se debe informar por separado las formas sexuadas y asexuadas. En las infecciones mixtas se debe registrar primero el parásito prevalente y luego la especie subordinada. Ejemplos: • Hemoparásitos: Negativo. 19
• Hemoparásitos: Positivo para P. vivax. • Hemoparásitos: Positivo para P. falciparum (50.000 trofozoitos/ul). • Hemoparásitos: Positivo para P. falciparum (100 trofozoitos/ul y 5 gametocitos/ul). • Hemoparásitos: Positivo para P. falciparum (200 gametocitos/ul). • Hemoparásitos: Positivo para infección mixta: P. vivax (5.000 parásitos/ul) y P. falciparum ( 2.000 trofozoitos/ul). • Hemoparásitos: Positivo aunque no se puede precisar la especie. Se sugiere nuevo examen.
E
P
Con base en el número de sangre de la gota gruesa. El recuento semi cuantitativo consiste en informar la especie de Plasmodium que ocasiona la infección y el número aproximado de parásitos encontrados. Así: 1 – 10 en 100 campos microscópicos + 11 – 100 en 100 campos microscópicos ++ 1 – 10 por campo microscópico +++ mayor de 10 por campo microscópico ++++
SE R V
LA
Jr. 5 E
A media cuad
En las infecciones por P. falciparum, por la facilidad en el reconocimiento de los gametocitos de los trofozoitos, es posible informar separadamente las forma sexuales de las asexuadas. Ejemplo: Hemoparásitos: Positivo para P. falciparum: trofozoitos ++ y gametocitos + Hemoparásitos Positivo para P. vivax ++. Con base en un extendido de sangre periférica. Para determinar el número de parásitos en 10.000 eritrocitos serian necesarios 33 campos si hay 300 eritrocitos por campo microscópico. Para un hematocrito de 40% estimamos que el paciente tienen 4.000.000 eritrocitos/ul de sangre. Ejemplo: # parásitos X # de eritrocitos/ul de sangre / 10.000 eritrocitos = parásitos/ul de sangre
20
3 eritrocitos/ul = hematocrito x 100.000 reemplazando y simplificando: #
SE R V
COMPARACION DE LAS ESPECIES DE PLASMODIUM EN EXTENDIDO
LA
# de parásitos en 10.000 eritrocitos parásitos/ul de sangre.
X
hematocrito
X
10
=
Se indica la presencia y la cantidad de formas presentes.
E
P
P. vivax Agrandados, pálidos. Punteado fino (punteado de Schuffner, puntos pequeños de rosa a rojos que aumentan con intensidad con el crecimiento del parásito, numerosas). Inicialmente invade los reticulocitos, Marginales raras
P. falciparum No agrandados. Color normal, Punteado grueso (hendiduras de Maurer, puntos rojos generalmente escasos.). Invade todos los eritrocitos. *
Grande Anillos grandes (1/2 a 1/3 del diámetro de los eritrocitos) a veces con citoplasma ameboide o amorfo, vacuolados. Generalmente un gránulo de cromatina, ocasionalmente granulaciones de Shuffner. Pigmento en los trofozoitos Partículas finas de color en desarrollo pardo ligero carmelito, amarillento, diseminados, en el citoplasma del parásito, en los esquizontes se condensan en una masa única. Trofozoitos viejos Muy pleomorfos, rico en
Pequeño Anillos muy pequeños (1/5 del diámetro de los hematies). Muchas veces dos gránulos o dos puntos de cromatina; infecciones múltiples; anillos delicados y regulares; pueden adherirse a los eritrocitos.
G.R parasitados
Forma especiales del parásito Tamaño del parásito Fase de anillo de los trofozoitos (T. Jóvenes)
Jr. 5 E
En “i”, “”, candelabro.
A media cuad
21
Grumos burdos de color negro o carmelito oscuro, escasos, dispersos en el citoplasma del parásito. En los esquiozontes se condensa en una masa única. Compactos y redondeados,
Esquizontes maduros (segmentados)
E
Gametocitos
Distribución en sangre periférica Parasitemia habitual
citoplasma muy ameboide, vacuolado, aumenta el tamaño del eritrocito. Ocupa generalmente todo el glóbulo rojo. De 12 a 24 merozoitos. Posee una masa de pigmento malárico, granulaciones Shuffner. Redondos u ovales, grandes, ocupa por lo general todo el eritrocito, cromatina abundante laxa puede se claramente distinguible (macrogametocito femenino) o difusa (microgametocitomasculino) Todas las formas.
P
presencia de granulaciones de Maurer * De 2 a 4 merozoitos. Muy raros en sangre periférica pero puede llegar a tener de 8 y 40merozoitos.. * Semilunares o salchicha. Masa de cromatina central rodeada por pigmento malárico en forma de bastones.
SE R V
LA
Jr. 5 E
Solamente anillos y semilunas (gametocitos). * Hasta 30.000 /ul de sangre. Hasta más de 200.000 / ul. Comúnmente 50.000 / ul
A media cuad
* Ordinariamente solo se observan etapas de anillo o gametocitos en sangre periférica con P. falciparum; las etapas consecutivas a la fase de anillo hacen adherentes a los eritrocitos y tienden a ser retenidos en los lechos capilares profundos en infecciones masivas. CARACTERISTICAS DEL PLASMODIUM EN GOTA GRUESA PARASITO Trofozoitos jóvenes
P. VIVAX Formas de anillo pequeño, aveces abierto mostrando un citoplasma regular o ameboide.
Trofozoito maduro
Grande con variedad de formas ameboides. Vacuola presente. Pigmento malárico, color carmelito. Granulaciones de Shuffner
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P. FALCIPARUM Anillos muy pequeños, finos y delicados, regulares. A veces abierto formando figura de i, “”, candelabro. Compacto con aspecto sólido, vacuola pequeña, usualmente contiene pigmento. Raro de encontrar.
Esquizonte
E
Gametocitos
Grandes, redondos. Gránulos de pigmento marrón o negro esparcidos por el citoplasma. De 12 a 14 merozoitos distribuidos irregularmente. Granulaciones de Shuffner a manera de halo rosado. Redondos ovalados con una única cromatina grande, pigmento malárico distribuido en el citoplasma, granulaciones de Shuffner como halo rosado.
P
Pequeños, redondos y compactos. Con 2 o más merozoitos, una sola masa de pigmento malárico. En infecciones severas acompañado de un gran número de trofozoitos. Forma creciente de media luna o salchicha, también pueden demostrase redondeados. Cromatina central rodeada de pigmento malárico de color negro a manera de bastones. Se puede diferenciar el femenino del masculino.
SE R V
LA
Jr. 5 E
A media cuad
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