Manual Tuberculosis by I.E.S.T.P. HIPOLITO UNANUE

Ministerio de Salud INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jr. Cápac Yupanqui 1400, Jesús María Telf. 471-3254, Fax: 471-7443 Lima, Perú, 1995

MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS EN BACTERIOLOGIA DE TUBERCULOSIS

COMITE RESPONSABLE: Blgo. Luis Asencios Solís Blgo. Neyda Quispe Torres Dr. Hemán Sanabria Rojas. Dr. Augusto Yi Chu. REVISION: Dra. Isabel N. de Kantor Asesora OPSIOMS COMITE EDITOR: Dr. Alfonso Zavaleta Martínez- Vargas Dr. Jaime Chang Neira Lic. Liliana Vigil Romero

CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA Dr. César Cabezas Sánchez. Director General INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Dr. Carlos Carrillo Parodi Jefe COLABORACION: PROGRAMA NACIONAL DE ENFERMEDADES TRANSMISIBLES: CONTROL DE TUBERCULOSIS Dr. Pedro Guillermo Suárez Aguilar Director

INDICE PRESENTACIÓN ........................................................................................................7 INTRODUCCIÓN .......................................................................................................8 RESOLUCIÓN JEFATURA .......................................................................................9 CAPITULO I LAS MUESTRAS 1.0 ASPECTOS GENERALES ................................................................................10 1.1 LA MUESTRA DE ESPUTO: Métodos de obtención ........................................10 1.1.1 Expectoración natural .....................................................................................10 1.1.2 Expectoración inducida .................................................................................12 1.2 MUESTRAS EXTRAPULMONARES ..............................................................13 1.3 CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA .............................14 CAPITULO II LA BACILOSCOPIA (Examen microscópio) 2.1 Ambiente y material de trabajo de laboratorio .......................................................16 2.2 Preparación de estendido ........................................................................................17 2.3 Coloración ( Técnica de Ziehl Neelsen) .................................................................19 2.4 Observación microscópica de la muestra coloreada............................................... 23 2.5 Método de lectura ...................................................................................................23 2.6 Informe de resultados .............................................................................................25 2.7 Eliminación de los materiales contaminados..........................................................25 2.8 Reutilización de las láminas usadas.......................................................................25 2.9 Registro diario de baciloscopías .............................................................................26 2.10 Informe baciloscópico mensual y trimestral........................................................... 26 2.11 Conservación y limpieza del microscópio.............................................................. 26

CAPITULO III EL CULTIVO 3.1 Aspectos generales e indicaciones del Método del cultivo para Mycobacterium tuberculosis...........................................................29 3.2 La muestra para el cultivo .......................................................................................29 3.3 Conservación de la muestra......................................................................................31 3.4 Descontaminación de la muestra ..............................................................................31 3.5 Descontaminación sin centrigugación y empleo del Medio de Ogawa Acidificado............................................................................31 3.6 Lectura ......................................................................................................................32 3.7 Informe de resultados del cultivo .............................................................................32

3.8 Envío de cultivos al Laboratorio de Referencia de tuberculosis (Anexo 7).........................................................................................32 3.9 Requerimientos para la preparación del medio a base de huevo.........................................................................................................33 3.10 Preparación del Medio Ogawa ...............................................................................34

CAPITULO IV REFERENCIAS BIBLIOGAFICAS ..........................................................................36 ANEXOS .......................................................................................................................37 Anexo 1: Solicitud para la investigación bacteriológica en TBC ............................................38 Anexo 2: Registro de muestras para investigación bacteriológica en TBC ..............................................................................................40 Anexo 3: Preparación de reactivos para baciloscopía ..............................................................42 Anexo 4: Cantidad de reactivos y cálculos de módulo individual para baciloscopía ......................................................................................................43 Anexo 5: Parámetros para programación del módulo individual ............................................44 Anexo 6: Preparación del material para Cultivo de Microbacterias ........................................ 46 Anexo 7: Informe mensual de baciloscopía y cultivo .............................................................. 48 Anexo 8: Directiva Nº 001-95: Prueba de sensibilidad de Micobacterium tuberculosis a los medicamentos antituberculosos ....................................................................... 49 PUBLICACIONES DEL INSTITUTO NACIONAL DE SALUD .............................................................................................51

PRESENTACION

En la actualidad la epidemia de Tuberculosis, que produce en el mundo la muerte de tres millones de personas por año exige revisar el arsenal disponible en la lucha contra la Tuberculosis (vacunación, métodos de diagnóstico y drogas antituberculosas) que ya se consideran desactualizadas, lo que produce estancamiento en los esfuerzos para detener la enfermedad. La reemergencia de la TBC, podría deberse a los siguientes factores: i) incremento de la población susceptible por la aparición de la infección por VIHISIDA); ii) emergencia de TBC multiresistente; iii) depresión de la estructura socioeconómica en muchas áreas urbanas (y/o rurales) que conllevan a la desocupación, desnutrición, drogadicción, vagancia y otros problemas; iv) la disminución del apoyo a las medidas de control y erradicación por la creencia que la TBC ha sido controlada o erradicada, situación que ocurre en muchas partes del mundo. Debemos aceptar también que se conoce poco acerca de la biología básica del Mycobacterium tuberculosis, de los mecanismos de resistencia a drogas y hasta de cómo actúa la isoniazida. Todos sabemos que los métodos de diagnóstico de laboratorio existentes son demasiado lentos, la confirmación por cultivo puede tomar tres a seis semanas y la determinación de resistencia antibiótica varios meses. Es necesario pues, insistir en discutir los beneficios y problemas del uso del esputo, desarrollar nuevos métodos de diagnóstico rápido, crear una nueva vacuna contra la TBC y nuevas drogas que sean efectivas y de acción completa. Este manual sistematiza procedimientos básicos en el tratamiento de las muestras de esputo para el diagnóstico de la TBC, teniendo como objetivo el consolidar los procedimientos a nivel nacional, con la perspectiva de su perfeccionamiento y así alcanzar la excelencia en su calidad y ejecución. De acuerdo al desarrollo de los laboratorios de referencia a nivel central (INS), podremos en el futuro mostrar la aplicación de técnicas rápidas y prometedoras como lo es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Dr. Carlos Carrillo Parodi Jefe Instituto Nacional de Salud

INTRODUCCION

El Laboratorio de Bacteriología es importante no solo por el rol que desempeña en el diagnóstico de las enfermedades transmisibles como la Tuberculosis, sino también en el control de la evolución del tratamiento de los pacientes, así como la evaluación epidemiológica y operacional. El Laboratorio tiene como función principal, la detección de fuentes de infección tuberculosa a través de la baciloscopía, una técnica básica, sencilla, eficaz y de bajo costo, que debe ser empleada preferentemente en los sintomáticos respiratorios. El cultivo está orientado al aislamiento e identificación del gérmen causal de la enfermedad, con miras a estudios de tipificación y evaluación de la sensibilidad antibiótica de inobjetable utilidad en salud pública, al permitir "efectuar el seguimiento de la sensibilidad bacteriana a los diferentes agentes antibióticos, y detectar la emergencia de cepas resistentes. La elección de la técnica básica más conveniente (baciloscopía y/o cultivo), y su estandarización permitirá la obtención de resultados comparables a lo largo de todo el país, además de facilitar la capacitación así como la ampliación de la cobertura. El propósito de este Manual es proporcionar al personal de Laboratorio, información sobre los procedimientos técnicos aplicables para el diagnóstico bacteriológico de la Tuberculosis. La aplicación de estas técnicas en buenas condiciones debe garantizar la validez de los resultados obtenidos por los diferentes laboratorios integrantes de la Red Nacional de Laboratorios de Salud.

CAPITULO I LAS MUESTRAS 1.0. ASPECTOS GENERALES La tuberculosis es una enfermedad infecciosa causada por un bacilo denominado Mycobacterium tuberculosis, que se transmite a través de las gotitas de saliva que los enfermos eliminan al exterior al hablar, toser o escupir. Esta enfermedad ataca preferentemente a los pulmones, pero puede afectar también a otros órganos del cuerpo humano. Generalmente se manifiesta por signos y síntomas generales que van aumentando progresivamente, los que incluyen pérdida de peso y de apetito, tos persistente y fiebre nocturna, entre otras. El diagnóstico se realiza por medio de la observación del bacilo teñido, en el examen directo (baciloscopía) o mediante cultivos de la muestra. 1.1. LA MUESTRA DE ESPUTO: METODOS DE OBTENCION 1.1.1. EXPECTORACION NATURAL 1.1.1.a. Calidad: Una buena muestra es aquella que proviene del árbol bronquial, y es obtenida después de un esfuerzo de tos. Sin embargo, una muestra con apariencia de saliva puede ser positiva. 1. 1. 1.b. Calidad: Para ser considerada suficiente, la muestra debe tener un volumen aproximado de 5 a 10 ml. Si el enfermo tiene escasa secreción, la muestra no debe ser inferior al esputo obtenido de tres expectoraciones sucesivas, salvo justificadas excepciones. 1.1.1.c. Número de muestras y momento de recolección: I Se recomienda analizar dos o tres muestras de cada sintomático respiratorio. La primera muestra debe obtenerse en el momento de la consulta y la segunda al día siguiente, al despertar por la mañana. Sin embargo, puede ser necesario una tercera muestra obtenida al momento de entregar al laboratorio la segunda muestra. Para el control del tratamiento examinar una muestra mensualmente

mientras dure la terapia antituberculosa. 1. 1.1.d. El Envase: El envase para ser adecuado, debe tener las siguientes características: Boca ancha (aproximadamente 5 cm. de diámetro) y 5 cm. de altura. Así, el paciente puede expectorar con facilidad dentro del envase y el laboratorista al momento de efectuar el examen directo puede extraer la partícula útil fácilmente. Tapa de rosca: Para disminuir el riesgo de que la muestra se derrame durante el transporte y también para evitar la producción de aerosoles al abrirla en el laboratorio. No debe rotularse la tapa. Cuerpo del envase con pared lisa para favorecer su rotulación y la correcta identificación del envase. Material desechable, pues favorece su incineración y evita la reutilización. De no contar con envase desechable con las características referidas anteriormente, puede utilizar frascos de vidrio de boca ancha con tapa rosca; pero antes de desecharlos someterlos a esterilización en autoclave o incinerarlos. Debe evitarse la reutilización de los frascos. 1.1.1.e. Obtención de la muestra: 1.1.1.e.1.En el momento de la consulta: a) Tomar un envase limpio para esputo y anotar el número de orden en el cuerpo del envase. b) Entregar el envase rotulado al paciente, pero conservar la tapa. c) Llevar al paciente al Ambiente de Recolección Inmediata de Esputo (ARIES). Este lugar debe tener buena ventilación y debe prohibirse la presencia de otras personas con el paciente en el momento de la toma de la muestra. d) Explicar al paciente el motivo por el cual tiene que depositar el esputo y a continuación demostrarle cómo hacerlo. Debe explicarse en forma senci\la e instruir al paciente para que produzca esputo respirando profundamente, reteniendo aire y lanzándolo violentamente. Repetir el procedimiento hasta obtener la cantidad adecuada. Evitar siempre que se derrame el esputo.

1.1.1.e.2.Muestra matinal: Las etapas son en esencia las mismas que las descritas para la obtención de las muestras en el momento de la consulta. Debe darse al paciente otro recipiente numerado, el que llevará a su domicilio, con instrucciones para que escupa en su interior al levantarse por la mañana y siempre antes del desayuno. El paciente debe colocar el envase con la tapa bien cerrada en una bolsa plástica y llevarlo al laboratorio inmediatamente. 1.1.2. EXPECTORACION INDUCIDA Cuando el paciente no logra expectorar y es necesario el examen del esputo, puede inducirse la obtención de muestra de la siguiente forma: 1.1.2.1 Obtención Postural: Acostar al paciente boca abajo sobre una camilla o cama, haciendo que su cabeza rebase el borde; colocar una almohada doblada debajo del tórax para lograr un plano inclinado que facilite el descenso de la secreción. El paciente coloca la base del tórax sobre la almohada, deja caer ambos brazos y la cabeza hacia el piso, de modo que la base del tórax quede más alta que la boca. Estando en la posición apropiada, se dice al paciente que inspire, retenga el aire y expire violentamente hasta conseguir la expectoración; el envase deberá estar sobre un recipiente o papel periódico en el piso. El ambiente donde se obtiene la muestra debe tener buena ventilación y debe prohibirse la presencia de otras personas con el paciente en el momento de la toma de la muestra. 1.1.2.2 Nebu/izaciones . Se nebuliza en la garganta con agua destilada. Se recoge la primera expectoración producida después de la nebulización y se entrega otro envase al paciente para que recoja los esputos de las 24 horas siguientes. 1.1.2.3 Lavado Bronquial Es un procedimiento invasivo y está reservado al médico especialista neumólogo; además de obtener muestras para baciloscopía es preciso cultivarlas. También debe instruirse al paciente para que recoja la expectoración de las 24 horas siguientes al procedimiento. 1.1.2.4 Hisopado Laríngeo: La toma de muestra debe estar reservada al especialista. Su proceso es obligatoriamente por cultivo, debido al escaso número de bacilos. Debe tomarse dos hisopados diarios en tres días consecutivos. La muestra debe procesarse de inmediato y en caso contrario, conservar en refrigeración no más de 24 horas. El procedimiento puede estimular la expectoración, por lo que es necesario tener siempre a mano, un envase

recolector. El personal que recoge la muestra debe adoptar las medidas de bioseguridad y las precauciones correspondientes. 1.2. MUESTRAS EXTRAPULMONARES Deben procesarse por cultivo, pues la escasa cantidad de bacilos así como la presencia de mycobacterias saprofitas, hacen que la baciloscopía no sea concluyente. 1.2.1

Orina La muestra más recomendada es la muestra de orina obtenida en la primera micción de la mañana, previa higiene externa con agua y jabón. Es preferible recolectar entre 300-500 mI. en un envase limpio y estéril de boca ancha, que facilite la recolección directa. La muestra debe ser procesada inmediatamente siempre por cultivo. Se sugiere cultivar por lo menos tres muestras seriadas. Debe recordarse que la prueba de baciloscopía efectuada al sedimento urinario no necesariamente es diagnóstico concluyente de tuberculosis, por cuanto existen mycobacterias saprofitas en orina, que pueden producir resultados falsos positivos en el examen de baciloscopía.

1.2.2

Jugo gástrico La recolección se hace por la mañana con el paciente en ayunas, utilizando una sonda nasogástrica por la que se aspira el jugo gástrico. Utilizar una jeringa de 20 a 50 mI. Vaciar la muestra en un envase limpio de 50 a 100 mI. de capacidad. Cultivar de inmediato o conservar en refrigeración no más de 6 horas. Mínimo debe tomarse 3 muestras. Su utilización es más frecuente en niños.

1.2.3

Líquidos de serosas (pleura-peritoneo) La muestra debe ser obtenida por el personal médico. El cultivo debe hacerse lo más rápido posible, así como el estudio baciloscópico. Debe procesarse todo el líquido extraído por aspirado en jeringas de 50 a 100 mI.

1.2.4

Líquido cefaloraquídeo La obtención de la muestra está reservada al personal médico. Obtenida la muestra en un volumen de aproximadamente 5 mI., ésta se dividirá en dos partes iguales, una de las cuales se centrifugará y cultivará inmediatamente, no precisando descontaminación previa. La segunda se conservará en refrigeración a 4°C. Si la primera parte de la muestra está contaminada, la otra parte se siembra luego de su descontaminación. Si el volumen de la muestra es pequeño, se siembra toda la muestra. En todos los casos se hará baciloscopía del sedimento luego de centrifugar la muestra.

1.2.5

Biopsias y material resecado Se utiliza un envase estéril. La muestra se divide en dos partes: una parte se envía de inmediato al laboratorio para el cultivo y la otra se conserva o envía para el estudio histopatológico en un frasco con formol al 10%.

1.3. CONSERVACION Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA: 1.3.1.

Conservación de la muestra: La probabilidad de encontrar M. tuberculosis, está en relación directa con la rapidez con que la muestra llega al laboratorio. La temperatura ambiente y el tiempo favorecen la multiplicación de los gérmenes habituales de la boca, dificultando la elección de la partícula útil de la muestra por desnaturalización de las proteínas con probable destrucción de los bacilos. Una vez obtenida la muestra, ésta debe procesarse cuanto antes. La muestra de esputo para baciloscopía mantiene positividad por un tiempo prolongado; mientras para el cultivo el material debe procesarse de inmediato, porque habrá mayor probabilidad de aislar los bacilos que pueden existir en la muestra. Si no es posible procesar la muestra el mismo día de su recepción, ésta debe guardarse en refrigeración a 4°C. En aquellos casos en que se requiere el cultivo, pero el envío se hace a temperatura ambiente, el lapso entre la toma de la muestra del esputo y su procesamiento no debe ser mayor de una semana. Si el laboratorio no puede procesar ni conservar la muestra para baciloscopía, se recomienda adicionarle de 5 a 10 gotas de fenol al 5% antes de realizar el extendido, a fin de evitar riesgos de infección al transportar y manipular láminas extendidas y fijadas. Luego envolver con papel cada lámina por separado, y enviar al laboratorio más cercano adjuntando la nómina correspondiente. No olvidar rotular las láminas apropiadamente.

1.3.2.

Transporte de las muestras: En el transporte de las muestras debe tenerse en cuenta los siguientes aspectos: Protegerla del calor excesivo. Protegerla de la luz solar. Acondicionar los envases sellando las tapas con esparadrapo para evitar que se produzcan derrames. Para el transporte es conveniente disponer de cajas de madera u otro material resistente con divisiones interiores. Indicar con una flecha la posición que deben mantener los envases y poner una etiqueta con-la dirección exacta del laboratorio.

1.3.3.

Recepción de la muestra: Comprobar que las muestras estén bien rotuladas y correspondan a las solicitudes de examen. Si existe un pequeño derrame del contenido, proceder a limpiar el envase con fenol al 5%. Si el derrame es masivo debe desecharse la muestra por incineración o previa esterilización en autoclave. Notificar al establecimiento de Salud que envía las muestras si hubo deficiencia en su identificación, calidad, volumen o en la forma del envío.

CAPITULO II LA BACILOSCOPIA (EXAMEN MICROSCOPICO) La baciloscopía es un examen básico para el diagnóstico de la tuberculosis, útil para el control de la evolución del tratamiento administrado al paciente, por lo que su conocimiento debe alcanzar a los servicios de salud del país de todos los ni veles. En el Anexo l se muestra la ficha utilizada para efectuar las solicitudes de investigación bacteriológica de Micobacterias en tuberculosis. 2.1. AMBIENTE Y MATERIAL DE TRABAJO DE LABORATORIO En los servicios de salud de mayor envergadura debe contarse en lo posible con un ambiente de tamaño suficiente para el laboratorio. Siempre deben aplicarse las normas de bioseguridad para el manejo de muestras potencialmente infectantes. 2.1.1.

Distribución adecuada del Laboratorio: Debe considerarse que el laboratorio debe tener una distribución adecuada para lo siguiente: -

Recepción de muestras. Preparación y fijación de los extendidos. Coloración de los extendidos. Para microscopía y registro de resultados.

Esta distribución debe evitar los movimientos cruzados y permitir que el ambiente esté despejado en la mitad del espacio. Otras necesidades importantes que deben satisfacerse son luz apropiada (natural o artificial), un grifo de agua corriente con salida de drenaje, buena ventilación y un lugar de almacenamiento para el equipo y materiales. 2.1.2.

Condiciones mínimas del Laboratorio: El ambiente para laboratorio deberá tener las siguientes condiciones mínimas: Una mesa de por lo menos 1,00 m. x 0,60 m. de material lavable, fácilmente desinfectable con soluciones germicidas, como fenol al 5%. Un lavadero pequeño con su 1lave de agua y desagüe; sobre los bordes del lavadero se colocarán 2 varillas de vidrio unidas por sus extremos, por un tubo de goma. Este lavadero debe estar cerca a la mesa y será dedicado a la coloración de extendidos. - Microscopio binocular, con objetivo de inmersión. - Caja para láminas portaobjetos. - Recipiente con los aplicadores o palitos de madera. Mechero. - Lápiz para marcar vidrio (graso). - Papel lente. - Soporte de varillas de vidrio.

Bandeja de acero inoxidable o fierro enlozado para recepción de muestras. Tres frascos tipo cuentagotas para los colorantes y decolorantes; de preferencia 2 juegos. Papel carbón (opcional). Papel de filtro. Un recipiente de latón con tapa para incineración del material contaminado. Aceite de inmersión. Tolueno o bencina. Reactivos: fucsina básica, azul de metileno, fenol en cristales, ácido clorhídrico, alcohol de 95° ó comercial yagua destilada. Libro de Registro.

2.2. PREPARACION DEL EXTENDIDO Antes de empezar el trabajo, el personal encargado debe lavarse las manos y ponerse un guardapolvo de protección lo más largo posible. Luego cerciorarse que no le falte ningún reactivo ni material. Todas las fases de preparación del extendido deben ser completamente sistematizadas, así como la conservación del orden de las muestras. Procesar las muestras por series, cada serie no debe ser mayor de doce (12) muestras. Al hacer el extendido cuidar que las láminas sean nuevas y hayan sido desengrasadas con alcohol; en lo posible no reutilizar las láminas positivas. Las etapas de la preparación del extendido son las siguientes: 2.2.1.

Organización del área de Trabajo: -

Colocar sobre la mesa de trabajo una hoja doble de papel periódico o una bandeja de fierro enlozado o acero inoxidable (dimensiones recomendadas: 60 x 40 x 10 cm) con papel periódico, humedecido con fenol al 5%.

Colocar los envases conteniendo las muestras de esputo previamente rotulados sobre la mesa de trabajo. De la misma forma colocar las láminas portaobjetos sobre el soporte de madera, en orden correlativo.

2.2.2. -

Identificación de muestras y láminas. Numerar los envases. Numerar las láminas portaobjetos empleando un lápiz graso, en forma correlativa. Deberá trazarse una línea en cada lámina portaobjeto empleando el lápiz graso, la que dividirá la superficie en una tercera parte destinada a la numeración y dos terceras partes para hacer el extendido. Esta línea debe trazarse en la cara inferior de la lámina a fin de evitar que se borre la numeración al momento de efectuar la coloración.

2.2.3. -

Realización del extendido. Destapar cuidadosamente el envase de la muestra que se va a procesar, manteniendo la boca del envase cerca del mechero encendido.

Dividir un aplicador de madera (baja lengua) en dos o tres partes y tomarlo entre el pulgar y el índice de la mano, para luego seleccionar y extraer la partícula útil, que es la porción muco-purulenta de color amarillo verdoso del esputo, enrollándola en el aplicador.

2.2.4. -

Colocar la partícula útil sobre el portaobjeto y extenderla, haciendo movimientos de vaivén, hasta lograr que el extendido sea homogéneo (ni muy fino ni muy grueso), que no llegue a los bordes de la lámina, para evitar que el operador se contamine al manipularla. Por ningún motivo debe calentarse la lámina mientras se haga el extendido, debido a que por el calor se forman círculos concéntricos y precipitados granulosos. Pasar por la llama del mechero los bordes de la lámina extendida, colocar sobre el soporte de madera y dejar secar a temperatura ambiente. Terminado el extendido, descartar los aplicadores en el receptáculo de incineración, cerrar el envase y proseguir en igual forma para las demás muestras.

Fijación del extendido. Fijar cada lámina, una vez seca, mediante dos o tres pasajes rápidos sobre la llama del mechero con el extendido hacia arriba.

2.3. COLORACION (TECNICA DE ZIEHL NEELSEN) La técnica más recomendada es la tinción de Ziehl Neelsen. Antes de su uso, todos los colorantes y soluciones a emplearse deben ser previamente filtrados. La forma de preparación de los reactivos, así como los módulos individuales se muestran en los anexos 3, 4 Y 5.

2.3.1.

Primer Paso: Coloración de bacilos

Colocar sobre el soporte de coloración (alambre o varilla de vidrio) la serie de láminas fijadas con el extendido hacia arriba, el número hacia el operador y la varilla próxima al operador ligeramente más alta que la otra.

Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con el colorante fucsina básica fenicada, filtrada en el momento de efectuar la tinción. No use colorante sin filtrar

Calentar suavemente con la llama del mechero de alcohol o un hisopo de algodón humedecido en alcohol hasta la emisión de vapores, repetir el proceso por tres veces, no debe hervir la preparación. Si el volumen del colorante disminuye por evaporación, debe agregarse más hasta cubrir totalmente el extendido y dejar enfriar. El tiempo mínimo de coloración con fucsina es de 5 minutos.

2.3.2.

Eliminar la fucsina tomando la lámina por el extremo numerado, entre el dedo pulgar y el índice o con una pinza, inclinándola hacia adelante y dejando caer agua corriente a baja presión sobre la parte que no tiene el extendido.

Segundo Paso: Decoloración -

Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con la solución de alcohol ácido durante dos minutos, hasta obtener una coloración rosa pálido. De ser necesario decolorar nuevamente, efectuando movimientos en vaivén de la lámina.

Una vez eliminado el alcohol ácido lavar nuevamente la lámina con agua a baja presión, cuidando de no desprender la película que formó el extendido.

2.3.3.

Tercer Paso: Coloración de fondo -

Cubrir la superficie del extendido con el colorante azul de metileno, previamente filtrado, durante 30 segundos a un minuto.

Eliminar el azul de metileno y lavar cada lámina con agua a baja presión, por ambos lados (el que tiene el extendido, como el otro lado).

Colocar las láminas coloreadas en orden numérico sobre el soporte de madera y dejar secar al medio ambiente. Verificar la numeración de la lámina antes de su observación al microscopio.

2.4. OBSERVACION MICROSCOPICA DE LA MUESTRA COLOREADA La observación microscópica, tiene dos objetivos importantes: a. Determinar si en el extendido hay Bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR). b. Establecer su número aproximado. 2.4. 1.

Condiciones para la observación de la muestra

Para la observación se debe emplear un microscopio que esté en buenas condiciones y cuente con el objetivo de inmersión 100x y un ocular de 10x. Antes de usar el objetivo de 100x, se debe colocar una gota de aceite de inmersión sobre el extendido.

Cada campo microscópico, se debe observar en superficie y en profundidad, para lo cual se utilizará permanentemente el tomillo micrométrico.

2.5. METODO DE LECTURA -

Los bacilos aparecerán como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, teñidos de rojo, generalmente con gránulos más coloreados en su interior, aislados, en parejas o en grupos sobre un fondo azul claro. (Foto 1).

Es aconsejable seguir una pauta uniforme de observación, avanzando de izquierda a derecha del extendido, y observando un mínimo de 100 campos

útiles, lo que un laboratorista capacitado hace en aproximadamente 5 minutos. Se considera campo microscópico útil aquel en el cual se observa elementos celulares de origen bronquial (leucocitos, fibras mucosas y células ciliadas). Los campos en que no aparezcan dichos elementos no deben contabilizarse en la lectura.

El observador irá tomando nota del número de bacilos observados y del número de campos microscópicos a observarse, que variará según la cantidad de bacilos que contenga la muestra.

Si en una lámina se encuentra sólo de 1 a 9 bacilos en 100 campos microscópicos observados, debe ampliarse la lectura a otros 100 campos más. Si persistiese el resultado, realizar otro extendido de la misma muestra e informar lo encontrado y solicitar nueva muestra.

Al término de la lectura retirar la lámina de la platina del microscopio, limpiar el aceite de inmersión de la lámina con tolueno y guardar la lámina. Limpiar el exceso de aceite del objetivo de inmersión del microscopio con papel lente humedecido con tolueno.

2.6.

INFORME DE RESULTADOS Se recomienda la siguiente escala semicuantitativa:

+ ++ +++

No se encuentran BAAR * en 100 campos microscópicos observados. Menos de un BAAR por campo en 100 campos observados (de 10-99 BAAR). Uno a 10 BAAR por campo, en 50 campos observados. Más de 10 BAAR por campo en 20 campos observados.

2.7. ELIMINACION DE LOS MATERIALES CONTAMINADOS -

Los materiales contaminados (envases de esputo, aplicadores, papeles del área de trabajo) se deben recoger y colocar en recipientes metálicos para su incineración o esterilización en autoclave. Limpiar bien toda la superficie de la mesa de trabajo con una solución desinfectante, dejándola secar con las ventanas abiertas

2.8. REUTILIZACION DE LAS LAMINAS USADAS Las láminas con resultados negativos se hierven durante media hora en solución de detergente, luego se lavan con agua corriente, y se enjuagan con agua destilada. Después se secan con una toalla limpia y se procede a seleccionar las láminas que no tienen rayaduras. Posteriormente se sumergen en alcohol y se secan con una toalla limpia.

* BAAR: Bacilos Acido Alcohol Resistentes

2.9. REGISTRO DIARIO DE BACILOSCOPIAS Los registros son medios prácticos para obtener información que ayudan en las actividades de vigilancia, supervisión y evaluación del Programa. Además ofrecen la información necesaria para preparar los informes mensuales y trimestrales sobre detección y control de casos. Una vez terminadas las lecturas, debe hacerse el registro diario de las baciloscopías para su informe al Programa Nacional de Control de Tuberculosis. Utilizar una numeración correlativa anual (se empezará anualmente el 2 de enero y terminará el 31 de diciembre del mismo año, desde el número 1 hasta el último correspondiente). El registro diario se lleva en un libro. El personal que realiza las baciloscopías estará obligado bajo responsabilidad a llevar el registro diario de las baciloscopías efectuadas y velará por la integridad y puesta al día de la información. Cuando la muestra no sea de esputo o cuando se quiera especificar el aspecto de la muestra, se hará en la columna correspondiente. La información mínima a registrarse se muestra en el Anexo 2. 2.10.INFORME BACILOSCOPICO MENSUAL Y TRIMESTRAL El consolidado mensual (Anexo 7) y trimestral debe llenarse en hoja AdHoc conforme lo establece el Manual de Normas y Procedimientos del Programa Nacional de Control de Tuberculosis. Así, por ejemplo, el ítem diagnóstico. total, comprende el total de baciloscopías realizadas para el diagnóstico. El número de baciloscopías positivas, comprende el número real de baciloscopías, considerando una baciloscopía positiva por paciente diagnosticado (Ejemplo: si al paciente se le realizó dos baciloscopías que fueron positivas, deberá considerarse sólo una en el informe). 2.11. CONSERVACION y LIMPIEZA DEL MICROSCOPIO 2.11.1. El microscopio es un equipo óptico de alta precisión y como tal debe ser tratado con mucho cuidado tanto en el aspecto mecánico como óptico. 2.11.2. La inspección del microscopio antes de su uso y la limpieza después de su uso son hábitos que contribuyen a la buena conservación de este equipo. 2.11.3. Las partes ópticas y las lentes deben limpiarse cuidadosamente con un trapo de lino fino o piel de gamuza que no desprenda pelusa. Nunca debe friccionarse el papel o gamuza sobre la lente. 2.11.4. Se debe preservar el equipo de la humedad y el polvo ambiental para evitar la formación de hongos y el atascamiento de sus partes por

acumulación de polvo y pelusas. El microscopio debe guardarse en su estuche de protección (con una bolsa conteniendo no menos de 0,5 kg. de Silicagel seco de color azul) lejos de la humedad y polvo. En caso que el Silicagel se tome de color rosado cambiar por otro o calentar hasta que se tome azul para su reutilización. 2.11.5. El personal de laboratorio nunca debe desarmar el microscopio para realizar limpieza o reparación. Este trabajo debe ser realizado por personal especializado con la finalidad de garantizar que el equipo mantenga su eficiencia y precisión. 2.11.6. La superficie exterior de los oculares debe limpiarse diariamente. Recordar que tanto los párpados como las pestañas tienen grasa, y al apoyarlos sobre los oculares, las lentes pueden ensuciarse. Para la limpieza debe emplearse papel lente o un trozo de gamuza seca. 2.11.7. El objetivo de inmersión debe limpiarse después de su uso con papel especial para limpieza de lentes (Lens Cleaning llssue 105,10 x 15 cm) humedecido con tolueno o bencina para eliminar el aceite de inmersión. Por ningún motivo la lente de inmersión quedará sin limpiarse, caso contrario el aceite se secaría y ocasionaría la inutilización del objetivo. 2.11.8. Utilizar alcohol etílico 95° para la limpieza de lentes de los oculares, filtro y todos los elementos y lentes de condensador. 2.11.9. Para la limpieza diaria del microscopio se requiere disponer del siguiente material: -

Trapo de lino fino. Papel lente o bien papel absorbente tipo pañuelo descartable. También una piel de gamuza o trapo del tipo que no desprenda pelusa. Tolueno o bencina para limpiar los objetivos. Pequeña pera de goma. Pincel fino. Una bolsa conteniendo no menos de 0,5 kg. de Silicage1.

2.11.10. Las partes del microscopio binocular se indican en la figura siguiente.

CAPITULO III EL CULTIVO 3.1. ASPECTOS GENERALES E INDICACIONES DEL METODO DE CULTIVO PARA MYCOBACTERlUM TUBERCUWSlS. El cultivo es en la actualidad el método bacteriológico más sensible y específico disponible para realizar el aislamiento y tipificación de mycobacterias en especial M. tuberculosis de una determinada muestra. El cultivo se utilizará selectivamente con el siguiente orden de prioridades (Anexo 8): a) En el diagnóstico difer~ncial de tuberculosis pulmonar de sintomáticos respiratorios con dos baciloscopías negativas y cuadro cIínicoradiológico sugestivo de tuberculosis. b) Diagnóstico de la tuberculosis infantil con baciloscopía negativa. c) Diagnóstico de tuberculosis extrapulmonar. d) Para estudio de sensibilidad a medicamentos antituberculosos en muestras de pacientes con sospecha de fracaso del esquema único de tratamiento por persistencia o reaparición de baciloscopia positiva de esputo al término del quinto mes de tratamiento. e) En pacientes HIV positivos/Sida. f) En pacientes multitratados con persistencia de baciloscopia positiva. g) En muestras pancitacilares de BK (1 a 9 BAAR en más de 100 campos microscópicos observados). h) Para estudios epidemiológicos de resistencia primaria y secundaria de M. tuberculosis. La programación de materiales para cultivos de micobacterias se muestra en el Anexo 6. 3.2. LA MUESTRA PARA EL CULTIVO El procedimiento a seguir depende de la asepsia existente en la muestra, la que depende de la forma de obtención, pudiendo clasificarse en dos grupos: a) Muestras obtenidas asépticamente. b) Muestras obtenidas no asépticamente (contaminadas).

3.2.1.

Procedimiento para muestras obtenidas asepticamente: Las muestras obtenidas asépticamente, que recolectadas en un recipiente estéril pueden cultivarse prescindiendo del proceso de descontaminación incluyen a:

3.2.1.1 Muestras obtenidas por punción: Líquido cefaloraquideo, pleural, peritoneal y articulares. Si se cuenta con volúmenes suficientes deben ser centrifugadas y el sedimento se sembrará en varios tubos de cultivo, si la cantidad de la muestra es pequeña se sembrará toda la muestra. 3.2.1.2

Materiales de biopsia pleural, hepática y ganglionar: En estos casos el operador (que debe trabajar protegido con una mascarilla) fraccionará el material biológico con instrumento quirúrgico estéril en un mortero de porcelana previamente esterilizado. De ser necesario, agregar agua destilada estéril, hasta obtener una suspensión que puede ser inoculada directamente en el medio de cultivo, siempre que cumpla las condiciones de esterilidad, de lo contrario se descontaminará antes de sembrar.

3.2.2. Procedimiento a seguir para muestras contaminadas: Las muestras contaminadas tales como: esputo, orina, contenido gástrico, entre otras, deben ser descontaminadas antes del cultivo. En caso de muestras de orina, la primera micción de la mañana es la recomendada. Se sugiere cultivar por lo menos tres muestras seriadas. Tanto para la muestra de orina como para el contenido gástrico, se deberán centrifugar el volumen total a 3,000 ó 3,500 RPM. durante 20 a 30 minutos. Eliminar el sobrenadante. Descontaminar y sembrar el sedimento.

3.3. CONSERVACION DE LA MUESTRA Las muestras después de su obtención deben procesarse de inmediato. En el caso de muestras de esputo, si el laboratorio no puede procesarlas el mismo día de su recepción, pueden conservarse en refrigeración a 4°C por no más de una semana. 3.4. DESCONTAMINACION DE LA MUESTRA La descontaminación de las muestras se realiza con hidróxido de sodio (NaOH) al 4%, solución acuosa estéril. La descontaminación tiene por objeto: Eliminar la flora asociada a M. tuberculosis, cuyos gérmenes se multiplican más rápido que el bacilo. Asimismo sirve para homogenizar la muestra especialmente el esputo a fin de liberar al bacilo del mucus, material celular y tejidos. 3.5. DESCONTAMINACION SIN CENTRIFUGACION Y EMPLEO DEL MEDIO DE OGAWA ACIDIFICADO 3.5.1. PROCEDIMIENTOS 3.5.1.a. Colocar las muestras numeradas en orden creciente sobre la mesa de trabajo, poner en una gradilla igual cantidad de tubos estériles numerados con la misma secuencia de las muestras. 3.5.1.b. Trasvasar en cada tubo 1 mI. de muestra de esputo o de suspensión obtenida por macerado y en caso de muestras centrifugadas emplear todo el sedimento (flamear los bordes de los tubos al abrir y cerrar

las tapas).Agregar4 mI. de solución estéril de hidróxido de sodio ( NaOH) al 4 %. 3.5.l.c. Dejar a 37°C por 20 minutos en estufa (o baño maría). 3.5.1.d. Retirar los tubos de la estufa o baño maría, homogenizar la muestra con una pipeta e inocular 0.1 mI. (por tubo) en 2 tubos de medio de Ogawa, y bañar toda la superficie del medio. 3.5.1.e. Colocar los tubos en una bandeja de madera de fondo inclinado, e incubar en estufa a 37°C. 3.5.1.f. Después de 48 horas revisar los tubos y ajustar las tapas, además de verificar si algún tubo está contaminado, alcalinizado (color .blanco amarillento) o acidificado (color azul oscuro) por mala neutralización de la muestra. El desarrollo de colonias antes de 48 horas es indicativo de contaminación, algunas veces el medio se licua por acción de gérmenes proteolíticos. 3.5. l .g. Revisiones posteriores se realizarán durante la incubación, a los 7, 30 Y 60 días. 3.6. LECTURA El desarrollo de M. tuberculosis generalmente aparece luego de 2 a 3 semanas. Las colonias típicas son de color crema, secas, rugosas de aspecto de coliflor.y de borde irregular. (Fotos 2, 3 Y 4). Si no se observan colonias en el tiempo antes mencionado se deja los cultivos hasta las 8 semanas, antes de proceder a informar el resultado como negativo. 3.7. INFORME DE RESULTADOS DEL CULTIVO Se recomienda la siguiente escala semicuantitativa. Nº... + ++ +++ c

No se observan colonias. Número total de colonias, si hay menos de 20. De 20 a 100 colonias. Colonias separadas más de 100. Colonias confluentes (se observa desarrollo en toda la superficie del medio). Cultivo contaminado. Se debe realizar frotis y coloración Ziehl-Neelsen de las colonias que no tienen morfología típica. De observarse B.A.A.R.*, se enviará el cultivo para su tipificación al I.N.S.

3.8. ENVIO DEL CULTIVO AL LABORATORIO DE REFERENCIA DE TUBERCULOSIS (ANEXO 8)

3.8. l. Objetivos del envío de cultivos al laboratorio referencial: Las cepas se enviaran al Laboratorio de Referencia para: * B.A.R.R.: Bacilos Acido Alcohol Resistente. a) Realización de estudios de sensibilidad antituberculosos. b) Tipificación de la Micobacterias. 3.8.2.

medicamentos

De las condiciones del transporte de cultivos de BK: Para el transporte de cultivos se debe tener en cuenta los siguientes aspectos: Proteger del calor excesivo Proteger de la luz solar. Para el transporte de cultivos es conveniente sellar con esparadrapo las tapas de los tubos, acondicionarlos en cajas de cartón resistente o de madera, para evitar roturas y/o derrames. Indicar la posición en que deben mantenerse los cultivos. Poner una etiqueta con la dirección correcta del Laboratorio de Referencia de Tuberculosis-Instituto Nacional de Salud (Capac Yupanqui 1400, Jesús María, Lima).

3.9. REQUERIMIENTOS PARA LA PREPARACION DE MEDIO A BASE DE HUEVO 3.9.l.a.

Equipos, materiales y reactivos

3.9.1.a.1. Requerimientos para la preparación de la solución de sales. -

Balanza analítica. Espátula. Papel glacine. Erlenmeyer (500 mI), para preparar la solución. Probeta (100 mi), para medir agua destilada, para la solución de sales. Baño maría, para disolver la solución de sales. Fosfato monopotásico (KH2PO4). Glutamato de sodio. Agua destilada.

3.9.l.a.2. Requerimientos para la preparación de huevo homogenizado. -

Huevos frescos Algodón, para la limpieza de los huevos Baguetas o palillos, para homogenizar los huevos Gasa, para filtrar el huevo homogenizado (4 capas de gasa estéril) Probeta (250 mi), para medir el huevo homogenizado Beaker (500 mI), para homogenizar los huevos

Embudo, para filtrar el huevo homogenizado Beaker (100 mI), para verificar la calidad de los huevos Pipetas (10 mi), para adicionar glicerol y verde de malaquita al 2% Glicerol Verde de malaquita al 2%

3.9.1.a.3. -

Requerimientos para la distribución de medio. Tubos de 20 x 125 mm. con tapa de rosca Dispensador de medio Gradilla

3.9.1.a.4. Requerimientos para la coagulación y conservación del medio -

Coagulador Bolsas de plástico para guardar los medios Refrigeradora

3.10. PREPARACION DEL MEDIO OGAWA 3.10.1.

INGREDIENTES: -

3.10.2

Fosfato monopotásico (KH2PO 4) Glutamato de sodio Agua destilada Glicerol Verde de malaquita 2% Huevo homogenizado

3g 1g 100ml. 6ml. 6ml. 200ml.

PROCEDIMIENTOS

3.10.2.1. Preparación de Solución de Sales: Disolver en 100 ml. de agua destilada, el KH2P04 y el glutamato de sodio y colocar en baño maría a 100°C por 30 minutos o en autoclave a 121°C por 15 minutos. 3.10.2.2. Preparación de Huevo Homogenizado: Lavar los huevos con detergente y enjuagar con agua de caño, dejar secar en una canastilla de alambre. Limpiar los huevos con algodón embebido en alcohol al 70% y dejar secar. Romper los huevos uno por uno y vertir en un vaso pequeño, para comprobar si están en buenas condiciones, de 10 contrario descartar y cambiar de vaso.

Vaciar los huevos en un beaker y homogenizar con una bagueta o palillos estériles, filtrar utilizando cuatro capas de gasa estéril. Adicionar 6 ml de Glicerol y 6 ml de verde de malaquita al 2% a la solución de sales enfriada a temperatura de ambiente y mezclar bien. Agregar el huevo homogenizado lentamente por la pared del Erlenmeyer evitando la formación de burbujas. Mezclar suavemente y dejar reposar por 30 minutos. 3.10.2.3. Distribución del Medio: Distribuir el medio en tubos de 20 x 125 mm, en una proporción de 6 mI por tubo, evitando la formación de burbujas. 3.10.2.4. Coagulación del Medio: Colocar los tubos inclinados en el coagulador y dejar a 90°C por una hora (el coagulador debe haberse encendido previamente hasta lograr una temperatura de 90°C). 3.10.2.5. Conservación del Medio: Después de la coagulación, sacar los tubos y dejar enfriar. Luego guardar en bolsas de plástico y cerrarlas herméticamente, anotando la fecha de preparación. Los medios pueden guardarse en el refrigerador hasta por un mes.

CAPITULO IV REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. CASAL, M. (1990). Microbiología Clínica de las enfermedades por Micobacterias: Facultad de Medicina, Universidad de Córdoba, España: 19-42. 2.

CEPANZO (1984). Manual de Normas y Procedimientos Técnicos para la Bacteriología de la Tuberculosis OPS/OMS. Nota Técnica N° 26. Buenos Aires, 26 pp.

3. CEPANZO. (1985). Bacteriología de la Tuberculosis. El Cultivo del Mycobacterium tuberculosis. Comité Asesor OPS/OMS. Nota Técnica N°27. Buenos Aires, 24 pp. 4. DE KANTOR, 1; BOLOGNA, H.; FERREIRAM. (1989).Algunos equipos básicos del Laboratorio de Bacteriología: Descripción, construcción y mantenimiento. Cepanzo, OPS/OMS, Buenos Aires. Publicación Especial N°9:1-7 5. DOMÍNGUEZ, L. (1983). Diagnóstico de la Tuberculosis por el examen microscópico del esputo. Bol. Instituto Nacional de Salud 1 (1): 4-7. 6. JAPAN INTERNATIONAL COOPERATION AGENCY. (1985). Minimum essentials of Laboratory Procedure for Tuberculosis Control. Tokyo, 96 pp. 7. DE KANTOR, 1. (1988). Bacteriología de la Tuberculosis OPS/OMS. Serie de Monografías Científicas y Técnicas N° 11. Buenos Aires, 63 pp. 8. MINISTERIO DE SALUD DEL PERU. Programa Nacional de Control de la Tuberculosis. (1991). Doctrina, Normas y Procedimientos para el Control de la Tuberculosis en el Perú. Lima: 17-25. 9. ORGANIZACION PANAMERICANA DE LA SALUD. (1979). Control de Tuberculosis en América Latina: Manual de Normas y Procedimientos para Programas Integrados. Publicación Científica N° 376, : 20-21. 10. ORGANIZACION PANAMERICANA DE LA SALUD. (1987). Bacteriología de la Tuberculosis. La Organización de los Laboratorios, Medidas de Bioseguridad. Comité Asesor OPS/OMS. Nota Técnica N° 29, 39 pp.

ANEXOS

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD ANEXO 1 INSTRUCTIVO SOLICITUD PARA INVESTIGACION BACTERIOLOGICA EN TUBERCULOSIS 1.

Escribir el nombre de la Región y/o sub región y el establecimiento de Salud.

Filiación del paciente: Anotar apellidos y nombres, edad, sexo, historia clínica o fichafamiliar.

Marcar con aspa (x) el tipo de muestra. Si es otra diferente a Esputo, mencionar en la línea punteada.

Antecedentes de tratamiento: Al momento de la identificación del sintomático respiratorio interrogar al paciente si en una anterior oportunidad ha recibido medicamentos antituberculosos y durante cuanto tiempo (anotar Observaciones). l. Nunca Tratado: Marca con aspa (x) si no recibió tratamiento en una anterior oportunidad (virgen al tratamiento). 2. Antes Tratado: Marca con aspa (x) en la categoría RECAIDA si el sintomático respiratorio identificado recibió un tratamiento completo exitoso (curado) y existe la sospecha de recaída, al solicitar la baciloscopía o en la categoría ABANDONO si el paciente no concurrió a recibir tratamiento previo por más de 30 días consecutivos.

Para diagnósüco.- Se consideran dos categorías de diagnóstico: - Sintomático respiratorio (SR), persona que tiene tos y expectoración por más de 15días. - Rx. Anormal, persona que presenta radiografía de pulmones con imagen sospechosa de TBC y con muestras de esputo iniciales negativas, debiendo ser cultivada para investigar Mycobacterias. Ambas categorías son excluyentes. 1ra. M (Primera Muestra) 2da. M (Segunda Muestra)

Para control de.- Marcar con aspa (x) el mes de tratamiento actual. En caso de retratamiento, anotar en la línea punteada el mes correspondiente.

N° de caso.- Es el mismo número de orden que encontrará en el Libro de Registro y Seguimiento de Pacientes, para aquellos que están en tratamiento.

Escribir el nombre de la persona y fecha en que solicita la baciloscopía.

RESULTADOS: - Se marcará en los casilleros correspondientes el resultado: si es Positivo marcar el número de cruces (+) (++) (+++) con tinta roja y Negativa (-) con tinta azul o negra, anotando el N° de Registro que es el mismo N° de Orden del Libro de Registro de Muestras para Investigación Bacteriológica enTuberculosis y la fecha correspondiente, tanto para el caso de baciloscopía como para Cultivo. - Escribir el nombre del laboratorio y la fecha en que se procesa la muestra. OBSERVACIONES.- Anotar comentarios y sugerencias, como por ejemplo: Tiempo de tratamiento anterior recibido: Indicación de cultivo para casos especiales y otros.

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD ANEXO 3 PREPARACION DE LOS REACTIVOS PARA BACILOSCOPIA 1. Para preparar un litro de fucsina fenicada se necesitan 3 g. de fucsina básica y 100 ml. de alcohol de 95°. Se disuelve por agitación y se agregan 55 ml. de fenol acuoso. Se agita y se agrega agua destilada hasta completar un litro. Se deja reposar 24 horas y se filtra (el fenol acuosos se prepara agregando a 100 g. de fenol cristalizado, 10 ml. de agua destilada. Se calienta en baño maría hasta la completa disolución y se enfría. El fenol acuoso se mantiene líquido). 2. Para preparar un litro de azul de metileno se emplea 1 g. de azul de metileno y 100 ml. de alcohol de 95°. Se disuelve por agitación y se agrega agua destilada hasta completar un litro. Se deja reposar 24 horas y se filtra antes de usar. 3. Para preparar un litro de solución decolorante se requiere 30 ml. de ácido clorhídrico para análisis y 970 ml. de alcohol de 95°. Con la pipeta se deja escurrir el ácido clorhídrico por las paredes del matraz, que contiene el alcohol, y se agita suavemente. 4. Cada vez que las soluciones colorantes sean trasvasadas a los pequeños frascos cuentagotas que se emplean para la tinción, deben filtrarse; esto es especialmente necesario para la fucsina fenicada, porque con el tiempo se forman pequeños cristales que son causas de error al hacer la lectura de las láminas. Los frascos cuentagotas y sus tapas deben ser lavados con todo cuidado cada vez que se renueve su contenido. 5. Conservación: Los reactivos deben conservarse en frascos de color ámbar. Se recomienda preparar los colorantes en cantidades para un consumo no mayor de un mes.

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD INSTRUCTIVO ANEXO 5 PARAMETROS PARA LA PROGRAMACION DEL MODULO INDIVIDUAL La Programación por Módulo Individual para el PeT, debe realizarse todos los años en el mes de Julio, en la primera quincena e inmediatamente después remitir al nivel correspondiente para su consolidación. I. ATENDIDOS: Enfermos con Tuberculosis (E), programar según la prevalencia local por 100 habitantes y con el too% de la población. II. ATENCIONES: Baciloscopías de Diagnóstico, 15 por enfermo y 3 de control. III. INSTRUMENTOS: Horas Baciloscopista. Rendimiento 5 baciloscopías por hora. IV. NECESIDADES DE LABORATORIO PARA BACILOSCOPIAS: 1. Envases para esputo, se requiere 18 por enfermo o 1.5 por S.R. 2. Aplicadores de madera, en promedio 5 por enfermo. 3. Láminas portaobjeto: 10 láminas por enfermo, considerando que el 40% se rompen, rayan o son positivos. 4. Aceite de inmersión, se requiere 0.36 cc. por enfermo o por cada 10 S.R. 5. Fucsina básica, se requiere 0.10 gr. por enfermo o por 10 S.R. 6. Fenol cristalizado: 1.98 gr. por enfermo o por cada 10 S.R. 7. Alcohol 95°, 78.84 cc. por enfermo o por cada 10 S.R. 8. Acido Clorhídrico, 2.16 cc. por enfermo o por cada 10 S.R 9. Azul de Metileno 0.05 gr. por enfermo o por cada 10 S.R.

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD ANEXO 6 PROGRAMACION DE MATERIAL PARA CULTIVOS DE MICOBACTERIAS El fortalecimiento de la Red de Laboratorios a nivel nacional con equipos para el procesamiento de cultivos de Mycobacterium tuberculosis, ha permitido ampliar la cobertura <1" atención en los Laboratorios de nivel Intermedio; motivo por el cual se ha creado un instrumento que permitirá a cada laboratorio realizar la programación de material para cultivos de mycobacterias correspondiente al próximo año, el cual debe ser remitido a la Dirección del Programa de Control de Tuberculosis a más tardar el 15 de enero de cada año, para tal fin se emite la presente directiva. MATERIAL PARA 01 CULTIVO CON EL METODO OGAWA REACTIVOS: Hidróxido de sodio (NaOH) al 4% : Glutamato Monosódico Fosfato Monopotásico (KHlO.) Glicerina Verde Malaquita Agua destilada Huevos de gallina Fenolal5% :

: 0.16g para 4ml.de NaOH al 4% : 0.02 g : 0.06 g : 0.12 ml : 0.0024g : 2 ml : 4 ml (01 huevo para 10 cultivo 05 ml (01 litros de fenol Cristalizados da 20 litros de fenol 5%)

INSTRUMENTAL: Tubo de vidrio con tapa rosca (25 x 150 mm.) Tubo de vidrio con tapa rosca (20 x 125 mm.) Pipeta Pasteur x 6mm. de diámetro por 20 cm. de largo Bandejas de aluminio 40 x 30 cm. Bombilla de jebe para pipetas

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD ANEXO 8 DIRECTIVA N° 001-95 PRUEBA DE SENSIBILIDAD DE Mycobacterium tuberculosis A LOS MEDICAMENTOS ANTITUBERCULOSOS I. INDICACIONES PARA EJECUCION DE LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD Estos estudios se indican en los siguientes casos*:

II.

Cultivo positivo obtenido de muestras de pacientes al término del quinto mes de tratamiento con el Esquema Unico.

Cultivo positivo obtenido de muestras de pacientes en retratarniento.

Cultivo positivo obtenido de muestras de pacientes multitratados.

Cultivo positivo obtenido de muestras de pacientes HIV Positivos/Sida.

Para estudios epidemiológicos de resistencia inicial y adquirida del Mycobacterium tuberculosis. a los medicamentos antituberculosos.

Para otros estudios de investigación operacional.

REQUERIMIENTOS PARA ENVIO LABORATORIO NACIONAL DE TUBERCULOSIS (I.N.S. - LIMA)

DE CULTIVOS REFERENCIA

AL DE

Los cultivos deben cumplir con los siguientes requisitos: 1)

Estas acompañados de sus respectivas fichas debidamente llenadas (Anexo 1)

Tener anotado en el tubo un número de identificación y la fecha de la siembra.

No tener menos de 30 ni más de 60 días contados a partir de la fecha de siembra.

El número de colonias por tubo no deberá ser menor de 10 colonias claramente diferenciadas.

_________________________________________ *· Las indicaciones han sido tomadas y adaptadas de las Directivas 001-94-INS y 014-94

PCT.

El medio no deberá estar alcalinizado (color amarillo), acidificado (color azulino) ni contaminado con hongos.

El tubo de cultivo no deberá contener líquido ni el medio licuado.

Los tubos de cultivo deberán estar sellados con cinta adhesiva para asegurar el cierre hermético.

Los tubos de cultivo deben enviarse en cajas de material resistente debidamente acondicionados para evitar la rotura de los tubos. Se indicará con flecha la posición en que debe mantenerse la caja.

Anotar la dirección del Laboratorio Referencia\. Laboratorio Nacional de Referencia de Thberculosis INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Capac Yupanqui 1400, Jesús María, Lima, Perú

10) SE RECOMIENDA la utilización de tubos con tapa de rosca, que permiten el cierre hermético.

PUBLICACIONES DEL INSTITUTO NACIONAL DE SALUD SERIE DE INFORMES TECNICOS CARRILLO, C; AGU/LAR D.,J.; ZAVALETA, A.; ESPINOZA A, A.; GALVAN, H; HIGUCHI O., E. Y HUAPAYA C,B. (Eds). (1991). Reunión Técnica de la Red Metropolitana de Laboratorios de Cólera (13-14 de mayo de 1991). Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud. Red Nacional Integrada y Regionalizada de Laboratorios de Salud. Serie de Informes Técnicos N° 2. Lima, Ediciones Técnicas y Científicas. 80 págs. . SERIE DE NORMAS TECNICAS CARRILLO, C; BRAVO, N; AGU/LAR O.,J.; GU/LLEN, A.; YI CHU, A. (1991). Manual de Laboratorio de Cólera. Procedimientos para el diagnóstico de Laboratorio del Cólera. Galván, H.; Zavaleta, A; Espinoza A, A; Higuchi O., E. Y Huapaya C., B. (Eds). Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud. Red Nacional Integrada y Regionalizada de Laboratorios de Salud. Serie de Normas Técnicas N° 2. Lima, Art. Lautrec S.R.Uda. 32 págs. CARRILLO, C; CHIAPPE, M; VARGAS DE MAYO, C; GALVAN, H; NAVARRO, A. (1991). Manual de Laboratorio de Cólera para muestras ambientales. Carrillo, c.; Aguilar O., J.; Galván, H.; Espinoza A, A.; Huapaya, B. (Eds). Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud. Red de Nacional Integrada y Regiona-lizada de Laboratorios de Salud. Serie de Normas Técnicas N° 3. Lima, Art. Lautrec, 34 págs. ZAVALETA, A.; VERGARA, R.; VADILLO, B.; BARRIENTOS, A.; VENTO, C (1991). Control de Calidad de Especialidades Far-macéuticas y Productos Galénicos. Manual de Procedimientos Administrativos. Carrillo, C.; Aguilar O., J.; EspinozaA, A; Galván, H.; Higuchi O., E. y Zavaleta, A (Eds). Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, Centro de Control de Calidad. Red de Laboratorios de Control de Calidad de Medicamentos. Serie de Normas Técnicas N° 4. Lima, Empresa Gráfica Cosmos. 44 págs. CARRILLO, C; BURSTEIN, M; AGUILAR, J.; BRAVO, N; MURGUIA, M (1991). Normas de Calificación de Laboratorios para Emisión de Certificados Oficiales de Cólera. Carrillo, C.; Aguilar O., J.; Burstein P., M.; Espinoza A, A; Galván, H.; Higuchi O., E. Y Zavaleta, A (Eds). Minis terio de Salud, Instituto Nacional de Salud. Red de Laboratorios de Cólera. Serie de Normas Técnicas N° 5. Lima, Art. Lautrec, 14 págs. BURSTEIN P. M; ARRISUEÑO, G. c.; LOZANO A., R. Y MONGE S., E. (1994). Normas de Procedimientos en Gastroenterología. Carrillo, C.; Zavaleta, A.; Espinoza A, A; Aguilar O., J.; Burstein P., M.; Galván, H.; Higuchi O., E. Y Monge, E. (Eds). Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud. Serie de Normas Técnicas N° 6. Lima, Art. Lautrec, 48 págs.

QUlSPE T.N. Y DIAZ DE SILVA, S. (1995). Manual de normas de control de calidad de las baciloscopías. Zavaleta, A; Vigil, L.; Cabezas, C. (Eds). Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud. Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública. Red Nacional de Laboratorios de Salud. Laboratorio de Referencia Nacional de Mycobacterias. Serie de Normas Técnicas N° 7. Lima, Art. Lautrec, 20 págs. QUlSPE T.N.; ASENCIOS SL y VASQUEZ C. L. (1995). Manual de normas de bioseguridad para los laboratorios de diagnóstico de tuberculosis: Regionales, Intermedios y Locales. Zavaleta, A; Vigil, L.; Cabezas, C. (Eds). Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud. Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública. Red Nacional de Laboratorios de Salud. Laboratorio de Referencia Nacional de Mycobacterias. Serie de Normas Técnicas W 8. Lima, Art. Lautrec, 20 págs. ZAVALETA, A.; NALVARTE, R. y AREVALO, Z. (1995). Procedimientos Normalizados de Operación. PNO 01-95: Reglamento de Dirimencias. PNO 02-95: Guías generales para control de calidad de productos pesquisados. Zavaleta, A; Vigil, L.; Chang, J. (Eds). Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud. Centro Nacional de Control de Calidad. Red de Laboratorios de Control de Calidad de Medicamentos del Sector Salud. Serie de Nor-mas Técnicas N° 9. Lima, Art. Lautrec, 48 págs. OTRAS PUBLICACIONES ZA V ALETA, A. (Ed.) (1992). El Laboratorio Afiliado: Un modelo de docencia e investigación científica cooperativa en el Perú. Convenio de cooperación para investigación científica y docencia entre el INS-MINSA y la Universidad Peruana Cayetano Here-dia. Centro de Impresiones de la Universidad Peruana Caye-tano Heredia, Lima. 36 págs. INFORMACION y DOCUMENTACION BIOMEDICA. (1993). Vol. N° l. números 1 y 2. Instituto Nacional de Salud, OFIEL, Lima, Perú.

ANOTACIONES ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... ......................................................................................................... .........................................................................................................

Esta publicación se terminó de imprimir en mayo de 1995 en los Talleres Gráficos de Art. Lautrec S:R:Ltda.. Av. Paseo de la República 731 – Lima 13 Tel/fax: 423-7616