Studie: Aktivitäten exogener Enzyme in Backwaren

Aktivitäten exogener Enzyme in Backwaren

+Die Aktivitäten verschiedener exogener Enzyme wurden in Backwaren von der Teigbereitung über den Backprozess und die Lagerung hinweg systematisch analysiert. Die entwickelten Texturanalyseverfahren erlaubten eine Differenzierung der Vorgänge bei der Verfestigung der Weizenkrume in Prozesse, die vor oder nach dem Backen ablaufen. Die Anwesenheit der im Rahmen des Projektes untersuchten Enzympräparate zeigte während der Lagerung in der bereits ausgebildeten Krume entweder aufgrund einer vorangegangenen Inaktivierung oder mangelnder Funktionalität im Endprodukt keine nachweisbaren funktionellen Effekte.

Endogene Enzyme, die im Weizenmehl und in der Hefe natürlicherweise vorkommen, und exogene zugesetzte Enzyme sind bei der Herstellung von Backwaren für Veränderungen der Weizeninhaltsstoffe verantwortlich. Je nach Getreideart und -sorte, Umwelteinflüssen auf dem Feld und Reifezustand bei der Ernte unterscheiden sich die endogenen Enzymaktivitäten in Getreidemehlen. Um diese Unterschiede auszugleichen, die Teig- und Endprodukteigenschaften zu verbessern und eine reproduzierbare und hohe Qualität der Backwaren zu gewährleisten, werden bei der Herstellung von Backwaren exogene Enzyme eingesetzt. Hierbei kommen überwiegend Enzyme aus der Klasse der Oxidoreduktasen (EC 1) wie Glucose- oder Hexoseoxidasen und der Hydrolasen (EC 3) wie Amylasen, Xylanasen und Lipasen zum Einsatz [1].

Rechtliche Grundlagen zum Einsatz von Enzymen in Lebensmitteln

In der EU dürfen Enzyme nur zu Lebensmitteln zugesetzt werden, wenn diese dem aktuellen Stand der Umsetzung der Verordnung (EG) Nr. 1332/2008 entsprechen. Die Voraussetzungen für eine Zulassung sind die gesundheitliche Unbedenklichkeit für den Verbraucher, die technologische Notwendigkeit für den Einsatz und der Ausschluss einer Verbrauchertäuschung. Laut Verordnung (EG) Nr. 1332/2008 müssen Enzyme in der Zutatenliste mit dem Klassennamen und der spezifischen Bezeichnung aufgeführt werden, wenn sie Lebensmitteln aus technologischen Zwecken bei der Herstellung, Verarbeitung, Zubereitung, Behandlung, Verpackung, Beförderung oder Lagerung zugesetzt werden und im Endprodukt eine technologische Wirkung aufweisen. Sofern Enzyme während des Verarbeitungsprozesses inaktiviert werden und keine technologische Wirkung im Endprodukt haben, sind sie von der Deklarationspflicht befreit. Bei Backwaren wird üblicherweise angenommen, dass die zugesetzten Enzyme durch die Erhitzung während des Backens inaktiviert werden und deshalb mangels technologischer Wirkung im Endprodukt nicht deklariert werden müssen.

Eigenschaften und technologische Wirkung von Amylasen

α-Amylasen (EC 3.2.1.1) zählen zu den Endoamylasen, die α-(1,4)-glykosidische Bindungen innerhalb der Stärke spalten und niedermolekulare α-Dextrine freisetzen. Maltogene Amylasen (EC 3.2.1.133) und Maltooligosaccharid-freisetzende Amylasen (z. B. EC 3.2.1.60, EC 3.2.1.98) sind dagegen Exoamylasen, die Maltose und weitere Maltooligosaccharide, wie Maltotetraose oder Maltohexose, aus der Stärke freisetzen. Zudem relevant sind Pullulanase (EC 3.2.1.41) und Isoamylase (EC 3.2.1.68), die α-(1,6)-glykosidische Bindungen spalten und somit die Seitenketten des Amylopektins entfernen. Die

β-Amylase (EC 3.2.1.2) hydrolysiert dagegen α-(1,4)-glykosidische Bindungen vom nicht-reduzierenden Ende der Stärkepolymere her, sodass β-Maltose und β-Grenzdextrine als Hauptprodukte entstehen.

Die Wirkung von Amylasen während der Backwarenherstellung hängt von deren Temperaturstabilität, deren Spezifität und den entstehenden Produkten ab. Im Allgemeinen haben fungale Amylasen eine geringe Temperaturstabilität und deren Aktivität geht nach der Stärkeverkleisterung während des Backvorgangs verloren. Einige bakterielle Amylasen sind hingegen auch bei hohen Temperaturen stabil und können somit nach dem Backvorgang noch aktiv sein [2]. Aufgrund der geringen endogenen α-Amylase-Aktivität in Weizenmehlen ist die α-Amylase-katalysierte Erhöhung des Gehalts an fermentierbaren und reduzierenden Zuckern als Substrate für die Hefe- oder Sauerteigfermentation ein Ziel des Zusatzes. Der wesentliche Effekt von α-Amylase ist aber der Abbau der Stärkepolymere bei der Verkleisterung und dadurch die Beeinflussung des Gebäckvolumens, der Krumeneigenschaften hinsichtlich Weichheit und Porenausbildung. Als Nebeneffekt stehen mehr reduzierende Zucker für die Maillard-Reaktion und damit für aroma- und farbgebende Reaktionen zur Verfügung. Während der Lagerung führt der Zusatz von Amylasen zu einer Verzögerung des Altbackenwerdens (Anti-FirmingWirkung). Auf molekularer Ebene ist der Mechanismus bislang nicht eindeutig geklärt. Diskutiert wird, dass die Dextrine die Retrogradation des Amylopektins verlangsamen, oder dass die durch die α-Amylase-Aktivität modifizierte Stärke selbst andere Eigenschaften bei der Retrogradation aufweist.

Ziel des Forschungsvorhabens AiF 19543 N war es, die Aktivitäten verschiedener bei der Herstellung von Backwaren relevanter endogener und exogener Enzyme von der Teigbereitung über die Verarbeitung bis zum Endprodukt und über den Zeitraum der Lagerung systematisch zu analysieren.

Thermische Stabilität verschiedener Enzyme in der Matrix Teig

Im Fachgebiet Biotechnologie und Enzymwissenschaft an der Universität Hohenheim wurden verschiedene EnzymAssays zum Nachweis von Amylase-, Xylanase-, Glucoseoxidase- und Lipase-Aktivitäten durchgeführt und in Bezug auf ihre Sensitivität und Anwendbarkeit zum Nachweis möglicher Restaktivitäten in Backwaren miteinander verglichen. Die am besten geeigneten Enzym-Assays wurden dann, wo

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Abb. 1: Auswirkung verschiedener Zusätze zum Extraktionspuffer zur Bestimmung einer Restaktivität der maltogenen Amylase aus G. stearothermophilus aus hefegelockertem Weißbrot unter Verwendung verschiedener Zusätze zum Extraktionspuffer (1: ohne Zusatz, 2: mit 1 M Maltose, 3: mit 20 % (w/v) Maltodextrin, 4-8: mit 10 % (w/v) Maltodextrin und verschiedenen Extraktionszeiten; 1-4: 1 h Inkubationszeit; 5-8: 2, 3, 4 und 5 h Extraktionszeit)

© KIT nötig, im Hinblick auf ihre Sensitivität optimiert. Dabei konnte beispielsweise die Sensitivität des Betamyl-3-Assays, der zum Nachweis von exo-Amylase-Aktivitäten verwendet wird, durch Erhöhung der Assaylaufzeit und Anpassung der relevanten Parameter um mehr als das 60-Fache erhöht werden. Nachdem für alle relevanten Enzymklassen ausreichend sensitive Aktivitätsassays gefunden waren, konnte gezielt nach möglichen Restaktivitäten gesucht werden.

Es wurde unter anderem die Restaktivität der maltogenen Amylase aus Geobacillus (G.) stearothermophilus in hefegelockertem Weißbrot untersucht. Zunächst wurde unter Verwendung einer Enzymdosierung von 100 mg/kg (bezogen auf die Mehlmenge) eine neue Methode zur Probenvorbereitung für die Bestimmung der Amylase-Aktivität in Weißbrot entwickelt. Das Weißbrot wurde dafür gefriergetrocknet, gemahlen und mit Puffer extrahiert. Im Anschluss wurden verschiedene Zusätze zum Extraktionspuffer, wie Maltose und Maltodextrin, getestet. Die unter den verschiedenen Bedingungen erzielten spezifischen Aktivitäten sind in Abbildung 1 dargestellt. Durch Zusatz von 10 % (w/v)

Abb. 2: Zuckergehalt der Modell-Weizenbrote ohne Zusatz einer exogenen Amylase (A), mit Zusatz einer bakteriellen α-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens (B), mit Zusatz einer maltotetragenen Amylase aus Pelomonas saccharophila (C) bzw. mit Zusatz einer maltogenen α-Amylase aus Geobacillus stearothermophilus (D). Die Proben wurden 2 h, 22 h, 48 h und 96 h nach dem Backen entnommen. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 4) angegeben. Signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Zeitpunkten für jeden Zucker sind durch Sternchen (p < 0,05) gekennzeichnet. TM, bezogen auf die Trockenmasse.

Maltodextrin konnte die Extraktionseffizienz um mehr als das 7-Fache gesteigert werden. Eine Erhöhung der Maltodextrin-Konzentration auf 20 % (w/v) brachte keine weitere Erhöhung der Extraktionseffizienz. Im letzten Schritt wurde die Extraktionszeit untersucht. Dabei konnte die Extraktionseffizienz durch Erhöhung der Extraktionszeit von 1 h auf 3 h noch einmal um 16 % gesteigert werden. Hiermit stand eine geeignete Probenaufarbeitungsmethode für die Bestimmung der Restaktivität der maltogenen Amylase in hefegelockertem Weißbrot zur Verfügung. Es wurden Weißbrote mit drei verschiedenen Dosierungen (10, 50 und 100 mg/kg, bezogen auf die Mehlmenge) der maltogenen Amylase und als Referenz ein Weißbrot ohne Enzymzusatz gebacken. Die Weißbrote wurden im Anschluss auf eine Restaktivität hin untersucht. Dabei wurde im Mittel eine Restaktivität von 17,8 % der zugesetzten maltogenen Amylaseaktivität ermittelt. Die Standardabweichung auf alle durchgeführten Messungen lag dabei bei 1,2 % [3].

Neben der maltogenen Amylase aus G. stearothermophilus wurden noch andere Amylasen, Lipasen und Glucoseoxidasen aus der Backwarenindustrie auf ihre Stabilität in Teig unter Backbedingungen hin untersucht. Dabei wurde zunächst für jedes Enzym eine Methode zur Extraktion aus Teig entwickelt. Diese Untersuchungen erfolgten in einem speziell entwickelten Erhitzungsverfahren im Labormaßstab, bei dem der Temperaturverlauf im Inneren eines Weißbrotes während des Backvorgans imitiert werden konnte. Hierfür wurde jeweils Teig (5 g) in einem Glas in einem Ölbad bei 110 °C für 24 min erhitzt und im Anschluss abgekühlt. Dieses Verfahren wurde nur zum Abschätzen der Stabilität der einzelnen Enzyme verwendet. Dabei wurde für die maltotetragene Amylase aus Pelomonas saccharophila (früher Pseudomonas saccharophila) eine Restaktivität von 12,0 % ermittelt. Für die α-Amylasen aus Bacillus subtilis und Aspergillus niger wurden nur sehr geringe Reaktivitäten (0,7 % und 1,4 %) festgestellt. Es wurden fünf verschiedene Lipasen, unter anderem aus Thermomyces lanuginosus, Fusarium culmorum und Fusarium heterosporum, getestet. Dabei wies lediglich die Lipase aus Thermomyces lanuginosus eine geringe Restaktivität von 2,5 % auf. Daneben wurden vier Glucose- bzw. Hexoseoxidasen aus Chondrus crispus, Aspergillus niger und Trichoderma reesei untersucht, wobei nur sehr geringe Reaktivitäten von unter einem Prozent nachgewiesen werden konnten.

Einfluss verschiedener Amylasen auf die Zuckergehalte in der Brotkrume

Die Auswirkungen des Zusatzes verschiedener Amylasen auf die Freisetzung von Mono-, Di- und Oligosacchariden wurden anhand des Zuckerspektrums in der Brotkrume von Modelltoastbroten 2 h nach dem Backen und nach Lagerung für bis zu 96 h untersucht. Ohne Zusatz von Amylasen zeigten sich keine Veränderungen der Gehalte an Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Maltotriose

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und Maltotetraose über die Lagerdauer von bis zu 48 h (Abbildung 2 A). Bei Zugabe einer bakteriellen α-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens zeigte sich im Vergleich zum Kontrollbrot ohne Zusatz ein deutlich verändertes Spektrum an Mono-, Di- und Oligosacchariden (Abbildung 2 B) [4]. Zusätzlich zu den 2 h nach dem Backen bereits vorhandenen Zuckern wurden nach 22 h Lagerzeit Maltotetraose und nach 48 h Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose und Maltooctaose in der Krume nachgewiesen. Im Vergleich zu den Broten ohne Zusatz führte dieses Präparat zu einem 3,9-fach erhöhten Maltosegehalt. Der Maltotriosegehalt stieg signifikant von 17,4 mg/g 2 h nach dem Backen auf 46,6 mg/g nach 96 h Lagerzeit an. Maltotetraose nahm ebenfalls signifikant von 6,9 mg/g nach 22 h auf 43,0 mg/g nach 96 h Lagerzeit zu. Darüber hinaus stieg der Gehalt der erstmals nach 48 h Lagerung identifizierten und quantifizierten Zucker signifikant bis 96 h nach der Lagerung an: Maltopentaose stieg von 21,4 mg/g auf 34,6 mg/g, Maltohexaose von 31,4 mg/g auf 48,0 mg/g und Maltoheptaose von 31,1 mg/g auf 52,0 mg/g. Mittels Enzymaktivitätsassay wurde in der Krume eine kaum messbare Amylase-Aktivität von 0,07 nkat/g nachgewiesen.

Die Verwendung einer maltotetragenen Amylase aus Pelomonas saccharophila bewirkte im Vergleich zur Kontrolle ebenfalls eine klar erkennbare Veränderung der Gehalte an Mono-, Di- und Oligosacchariden (Abbildung 2 C) [5]. Dieses Präparat wies in der Krume ebenfalls nur eine sehr geringe Aktivität von 0,6 nkat/g auf. Nach 48 h Lagerzeit wurden dennoch Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose und Maltooctaose zusätzlich zu den bereits nach 2 h nachweisbaren Zuckern detektiert. Charakteristisch für die Wirkung dieses Präparats war der signifikante Anstieg des Gehalts an Maltotetraose von 2,1 mg/g (nach 2 h) auf 29,5 mg/g (nach 96 h), sodass Maltotetraose ab diesem Zeitpunkt das Hauptprodukt war.

Im Fall der mit maltogener α-Amylase aus G. stearothermophilus hergestellten Brote wurden 2 h nach dem Backen die Zucker Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Maltotriose und Maltotetraose identifiziert (Abbildung 2 D) [5]. Während der Lagerung wurden hier kaum Veränderungen der Zuckergehalte nachgewiesen. Lediglich der Gehalt an Maltotetraose stieg über den beobachteten Zeitraum hinweg von 0,6 mg/g (nach 2 h) auf 22,9 mg/g (nach 96 h) signifikant an. Dies könnte mit der gemessenen Restaktivität von 5,7 nkat/g zusammenhängen, die in etwa 14 % der ursprünglich hinzugegebenen Aktivität entsprach. Allerdings ist hier aufgrund der insgesamt verhältnismäßig geringeren Veränderungen des Zuckerspektrums von keiner technologischen Wirkung der Amylasen auszugehen.

Entwicklung von Texturanalyseverfahren zur Ermittlung einer enzymatisch induzierten Brotkrumen-Verfestigung nach dem Backen

Im vorgestellten Forschungsvorhaben wurden primär die Auswirkungen von verschiedenen exogenen Amylasen auf die enzymatisch induzierte Brotkrumen-Verfestigung nach dem Backen untersucht. Um die Ursachen der Anti-FirmingWirkung von exogenen Amylasen in Backwaren aufzuklären, wurden verschiedene neue Texturanalyseverfahren entwickelt. Die Standardkrumentexturanalyse mittels Texture Analyser umfasst die Kompression zweier Brotscheiben à 12,5 mm um 40 % in zwei Zyklen. Dabei werden u. a. Informationen über die Krumenhärte und die Elastizität der Krume gewonnen. Analysiert wird hierbei die Antwort der durch den Gär-, Back- und Lagervorgang resultierenden Struktur der Krume auf die vorgegebene Verformung. Somit fließen sämtliche Einflussgrößen, welche Krumenstruktur und -material (z. B. Gasvolumenanteil der Krume, Porenbild, Krumenmatrixfestigkeit) beeinflussen, in das Texturergebnis ein. Theoretisch könnte somit im Falle des Einsatzes von Amylasen eine veränderte Krumenhärte beispielsweise auf einem veränderten Porenbild durch die vermehrte Bereitstellung von fermentierbaren Zuckern beruhen. Des Weiteren kommen theoretisch auch ein modifizierter Krumenausbildungsprozess aufgrund des amylolytischen Abbaus von Stärkepolymeren durch Amylasen während des Gär- und Backprozesses oder auch amylolytische Aktivität nach dem Backvorgang als Ursachen infrage. Um diese materialseitigen Abhängigkeiten und Komplexitäten schrittweise zu kontrollieren und zu verringern, wurde im Rahmen des Forschungsprojektes die gängige Krumentexturanalyse weiterentwickelt [6].

Abb. 3: Krumenfestigkeit der reengineerten Krumenpellets (-x-) ohne Zusätze, (-■-) mit Zusatz einer einer maltogenen Amylase aus Geobacillus stearothermophilus, (-■-) mit Zusatz der ermittelten Restaktivität einer maltogenen Amylase (29 %) nach der Erhitzung auf 90 °C in der Krume, (-●-) mit Zusatz einer bakteriellen α-Amylase und (-●-) mit Zusatz der ermittelten Restaktivität einer bakteriellen α-Amylase aus Bacillus subtilis (5 %) nach der Erhitzung auf 90 °C in der Krume. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) angegeben. Signifikante Unterschiede zwischen Krumenpellets und dem Referenzkrumenpellets ohne Zusätze am jeweiligen Lagertag sind durch Sternchen (p < 0,05) gekennzeichnet.

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In einem ersten Schritt wurde die Abhängigkeit des Porenbildes von der Hefe durch die Produktion chemisch gelockerter Brote überwunden. Zur Standardisierung der Deformation des Materials wurde die Einwaage des Krumenmaterials standardisiert und eine biaxiale Kompression bis zur Porenfreiheit des Materials durchgeführt. Um inhaltsstoffliche Einflüsse auf das Krumenverfestigungsverhalten analysieren zu können, muss jedoch der Eintrag hypothetisch krumenverändernder Materialen nach dem Backprozess ermöglicht werden. Herausfordernd hierbei ist die homogene Verteilung der Zusätze in die bereits ausgebildete Krumenstruktur. Am Lehrstuhl für Brau- und Getränketechnologie wurde hierzu ein Verfahren für die Texturanalyse von reengineerten porenfreien Krumenpellets entwickelt. Hierbei wird eine chemisch gelockerte Krume zunächst gefriergetrocknet, in einem thermisch schonenden Verfahren zerkleinert und anschließend definiert rehydratisiert und pelletiert. Die entstandenen homogenen, porenfreien und reproduzierbaren Pellets können Lagerversuchen in definierter Umgebung unterzogen und texturell analysiert werden. Der entscheidende Vorteil dieser Methodik liegt in der Rehydratisierung des Krumenmaterials. Sie erlaubt zudem, Inhaltsstoffe in die Krume einzuarbeiten, welche ihre Wirkung folglich ausschließlich während der Lagerung entfalten können. Durch die Nutzung von standardisiert hergestelltem Krumenmaterial wird jeglicher Einfluss auf die Krume während des TeigKrumen-Übergangs ausgeschlossen.

Die entwickelte Methodik wurde verwendet, um die Auswirkungen eventuell vorhandener (Rest-)Aktivität einer maltogenen Amylase aus G. stearothermophilus und einer α-Amylase aus Bacillus subtilis in einer Standardweizenkrume auf das Firmingverhalten zu analysieren. Die Lagerversuche (Abbildung 3) der Pellets ergaben hierbei, dass das Alterungsverhalten der Krumenpellets, welche nach dem Backen mit einer maltogenen Amylase aus G. stearothermophilus supplementiert wurden, sich nicht vom Firmingverhalten (Firming = Verfestigung der Krume über die Lagerzeit) einer Standardkrume unterschieden. Somit scheint die hypothetische Anwesenheit dieser aktiven maltogenen Amylase während der Lagerung keine funktionalitätsverändernden Einflüsse auf das Krumenmaterial zu haben. Im Gegensatz dazu wurde im Fall von 100%iger Aktivität einer α-Amylase aus Bacillus subtilis im gebackenen Produkt tendenziell ein reduziertes Firmingverhalten beobachtet. Die Nachstellung der tatsächlich ermittelten Restaktivität (5 % der Anfangsaktivität) resultierte hingegen in keinem Anti-Firming-Effekt. Somit konnte für die beiden getesteten Enyzmpräparate in herstellerempfohlener Dosage ein funktioneller Einfluss auf das Endprodukt durch (i) mangelnde Funktionalität im Endprodukt (Beispiel maltogene

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