LABORATORIO ANALISIS COLIFORMES POR RECUENTO EN PLACA
A
ELABORADO POR: * ANDREA M ORENO *LAURA VARGAS *BEKSY HERNANDEZ
MARCO TEORICO
Existen diversos métodos para cuantificar el número de microorganismos presentes en muestras líquidas y sólidas. Dentro de las técnicas más comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, así como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintéticos sólidos o líquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) o la estimación por el método del Número Más Probable (NMP). El método del número más probable fue descrito por Mc Crady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este método fue empleado para estimar el número de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este método es aplicable para estimar el número de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias. Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44º C en vez de 37 ºC como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces están formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminación fecal. Éstos últimos se denominan termo tolerantes por su capacidad de soportar temperaturas más elevadas. Esta es la característica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotermos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgánica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminación fecal. Su presencia se interpreta como una indicación de que los organismos patógenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades. OBJETIVOS * Familiarizarse con los métodos de recuento, especialmente con coliformes. * Detectar bacterias coliformes totales y fecales. *Detectar si la muestra traída es apta para el consumo humano.
MATERIALES Y EQUIPOS
* Medio agar (EMB) * Agua peptona da *caldo brilla. * Erlemeyer * Tubos de ensayo * Morteros * Cajas Petri * Puntas para pipetear * Micro pipetas *Gradillas *Incubadora *campanas *muestra(cebolla cabezona) PROCEDIMIENTO a. *Alistar los materiales debidamente lavados *Preparamos diluciones hasta 10-3. *Preparar el agar para 100ml de agua. *Preparar el agua peptona da. *Preparar el caldo brilla. *Esterilizar. B. *Mesclar la muestra con el agua peptona da, y agitar. *Marcamos los tubos 3 tubos 10-3 y 3 tubos 10-2 y 3 10-1 *Le agregamos las campanas a los tubos. *Servir el caldo brilla en los 9 tubos 10ml.
*Adicionar un mi litro con el pipeteador, de la muestra en las 9 cajas petri. *Luego adicionar el agar encima de la muestra. *Marcar las cajas petri hasta 10-3 *Encubar 25°c por 24 horas.
ANALISIS
MICROORGANIS MO
Escherichia DETERMINA CION DE COLIFORME S
METODO
CARACTERISTICAS MICROBIOLOGIAS
DILUCION
* Medio agar (EMB) * Agua peptona da *caldo brilla.
Siembra a profundidad.
Klebsiella
Enterobacter
NUMERO DE COLONIAS
IMAJEN
CAJA PETRI 101 *crecimiento extendido en la caja Petri 10-1. De un verde metalizado que referencia a Echerichia coli
TUBOS DE ENSAYO *Presentan en los 3 tubos de ensayo de 10-1, turbulencia y aparici贸n en las campanas de co2
Citrobacter
CAJAS PETRI 10-2: *Presentan crecimiento extendido de un verde metalizado pero ya en menor concentraci贸n sin reconocimiento de colonias lo que hace referencia a Echerichia coli. TUBOS DE ENSAYO 10-2: *Presentan en los 3 tubos de ensayo turbulencia y aparici贸n en las campanas de co2.
CAJAS PETRI 10-3: *No presentan el verde metalizado ni presencia de colonias. TUBOS DE ENSAYO10-3 *Presentan turbulencia en el caldo y mas claro, con presencia de co2 en las campanas.
ANALISIS DE LOS RESULTADOS Coliformes fecales (E. coli) Observe los tubos que muestren turbidez y producci贸n de gas, generado por el desplazamiento del medio en la campana de Durham; reporte estos tubos como positivos, teniendo en cuenta confirmar con agar EMB. Los tobos
nos dieron como resultado 3 de 3 positivo por su turbidez y presencia de gas en las campanas. Confirmación de E.coli Obsérvese las colonias que crecieron en el medio de cultivo EMB y reporte los tubos confirmados como positivos, tener en cuenta las características macroscópicas de las colonias de E. coli, que se presento como verde metalizado que significa presencia de Coli. ALGUNOS TERMINOS IMPORTANTES scherichia coli Sustantivo femenino Bacteria gram-negativo de la familia de las enterobacteriacias que se encuentra en las heces y también en el colon de los humanos y de otros mamíferos. Ejerce una función beneficiosa para el hospedador, ya que sintetiza la vitamina K. También existen cepas patógenas que causan diarreas en los recién nacidos y que se hallan implicadas en múltiples infecciones urinarias. BACTERIAS GRAM POCITIVAS: Son aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la timcion de gram: de aquí el nombre de "Gram-positivas" o también "grampositivas". Esta característica Química está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como taxon se utiliza también el nombre de Posibacteria. BACTERIA GRAM NEGATIVA: Son aquellas bacterias que NO se tiñen de azul oscuro o violeta por la timcion de gram, y lo hacen de un color rosado tenue: de ahí el nombre de "Gram-negativas" o también "gram negativas". Esta característica está íntimamente ligada a la estructura didérmica dada por la envoltura celular, pues presenta doble membrana celular (una externa y la otra citoplasmática), lo que refleja un tipo natural de organización Bactrian.
Agar EMB Levine :es un medio de cultivo usado para el aislamiento y diferenciación de E.coli, tiene un aspecto purpúreo, aunque naranja tras su esterilización, es semisólido, y está destinado al cultivo en placa. Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enterobacterias, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y permite la diferenciación de bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa, dando lugar a colonias incoloras, las no fermentadoras, y colonias de color azulado-negro con cierto brillo metálico, las fermentadoras.
TURVIDEZ: la falta de transparencia de un líquido debido a la presencia de en suspension. Cuantos más sólidos en suspensión haya en el líquido (generalmente se hace referencia al agua), más sucia parecerá ésta y más alta será la turbidez. La turbidez es considerada una buena medida de la calidad del agua, cuanto más turbia, menor será su calidad. BIBLIOGRAFIA: es.wikipedia.org/wiki/Coliforme www.fao.org/home/es/ www.monografias.com Libro del laboratoro sobre analisis microbiologicos. ANEXOS