Biología Molecular
Biología Molecular
Portafolios
Laura Santirso Rodríguez 2LACB3
2016-2017(2ª evaluación)
Biología Molecular
ÍNDICE CRONOGRAMA ................................................................................................................... 2 CALIBRACIÓN MICROPIPETAS .......................................................................................... 3 MANUAL DE BUENAS PRÁCTICAS EN EL MANEJO DE PIPETAS ............................................. 3 RESULTADOS Y VERIFICACIÓN DE LAS PIPETAS AUTOMÁTICAS ........................................... 7 EXTRACCIÓN DE ADN DE SANGRE .................................................................................. 9 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 9 FUNDAMENTOS .................................................................................................................. 9 MATERIAL .......................................................................................................................... 9 PREPARACIÓN REACTIVOS ............................................................................................... 10 PROTOCOLO .................................................................................................................... 12 RESULTADOS ................................................................................................................... 13 PREGUNTAS ..................................................................................................................... 14 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA ..................................................................... 15 FUNDAMENTOS ................................................................................................................ 15 MATERIAL ........................................................................................................................ 15 PREPARACIÓN DE REACTIVOS .......................................................................................... 15 PROTOCOLO .................................................................................................................... 16 RESULTADOS ................................................................................................................... 17 PREGUNTAS……………………………………………………………………………………….17 PCR .................................................................................................................................... 18 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 18 INVENTARIO DEL MATERIAL .............................................................................................. 18 PROTOCOLO .................................................................................................................... 19 RESULTADOS ................................................................................................................... 19 PREGUNTAS ..................................................................................................................... 20
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CRONOGRAMA
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CALIBRACIÓN MICROPIPETAS MANUAL DE BUENAS PRÁCTICAS EN EL MANEJO DE PIPETAS Objetivo de la práctica El objetivo de la práctica consiste en pipetear, calibrar, aprender y proceder al mantenimiento de una pipeta, y verificar la calibración de las pipetas. Manejo de la pipeta automática: TÉCNICA DE PIPETEO PARA LÍQUIDOS CLAROS: 1. Se presiona el botón superior suavemente hasta el primer tope. 2. Se sumerge la punta, en la solución que se necesita pipetear estando seguros que la punta esté bien colocada y que no haya ningún tipo de residuos entre la punta y el cuerpo de la pipeta. 3. Mantenga la pipeta verticalmente mientras toma la solución. 4. Para descartar la solución de la punta presione el botón hasta el segundo tope. 5. Descarte las puntas utilizando el eyector que traen las pipetas. Fi.1: Micropipeta
TÉCNICA DE PIPETEO PARA LÍQUIDOS CON ALTA VISCOSIDAD:
1. Presione el botón superior hasta el segundo tope. 2. Sumerja la punta en la solución (2-3 mm) y suelte el botón despacio. La punta tiene que estar bien llena. 3. Descarte el líquido de la punta presionando suavemente el botón superior hasta el primer tope.
Fi.2: Técnica de pipeteo
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Protocolo para la calibración y verificación de pipetas automáticas ELEMENTOS Y EQUIPOS REQUERIDOS: ● ● ● ● ● ● ●
Micropipeta Vaso de precipitado Erlenmeyer Termómetro Balanza analítica Agua Puntas pipeta
PROCEDIMIENTO: El procedimiento se basa en medir el volumen de una muestra de agua, a partir de la masa de agua que dispensa una pipeta de capacidad conocida. (Dividiendo la masa de agua dispensada por la densidad del agua). En la práctica se realiza un grupo de mediciones, a las que se aplican correcciones que compensen cualquier variación que las aparten de las condiciones estándar de temperatura y presión atmosférica y cualquier evaporación que resulte importante durante el tiempo que duren los ensayos. Este tipo de ensayo permite las siguientes actividades 1. Instalar una punta nueva en la pipeta. 2. Succionar con la pipeta agua del recipiente de almacenamiento y desecharla en el recipiente de desperdicio al menos 5 veces, para estabilizar la humedad del volumen de aire en el interior de la pipeta. 3. Añadir agua al recipiente que se utilizará para pesar, hasta que se obtenga una altura del líquido de al menos 3 mm. 4. Registrar la temperatura del agua y la presión ambiental 5. Registrar el peso que presenta la balanza o efectuar la tara para que la lectura de la misma quede en cero (0). 6. Llenar la pipeta con agua del recipiente de almacenamiento y dispensarla en el recipiente de pesado. Expulsar la totalidad del agua. El trabajo se realiza de la misma forma que se utiliza la pipeta de forma cotidiana. 7. Registrar el nuevo peso detectado por la balanza. 8. Repetir los pasos 6 y 7 por nueve (9) veces adicionales, registrando al final de cada ciclo el peso que registra la balanza. 9. Registrar la temperatura del líquido en el recipiente de pesado, al final del décimo ciclo y medir el tiempo transcurrido desde el inicio de las mediciones.
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Mantenimiento de pipetas automáticas LA INSPECCIÓN DEBE CUBRIR LOS SIGUIENTES ASPECTOS: 1. Verificar la integridad y ajuste de los mecanismos. Los mismos deben poder moverse de forma suave. El pistón debe desplazarse suavemente. 2. Confirmar que el portapuntas no presenta distorsiones o marcas de desgaste, dado que es esencial para la exactitud de las medidas. VERIFICAR EL AJUSTE DE LAS PUNTAS. ●
Colocar una punta y llenarla con agua destilada. La pipeta no debe presentar ningún tipo de fuga.
LIMPIEZA Y DESCONTAMINACIÓN DIARIA: 1. Verificar cada día que la pipeta se encuentra limpia en superficies interiores y exteriores: ●
Si se detecta suciedad hay que limpiarla utilizando un solvente adecuado o una solución jabonosa. Revisar las recomendaciones de cada fabricante y seleccionar aquellos solventes que no produzcan efectos dañinos a la integridad de los componentes.
●
Esterilizar la micropipeta siguiendo las indicaciones de los fabricantes, algunas se pueden esterilizar en el autoclave utilizando un ciclo de 121ºC y un tiempo de 20 minutos. Algunas requieren ser desensambladas para que el vapor pueda estar en contacto con los componentes internos, consiste en liberar o desenroscar el cuerpo central de la micropipeta siguiendo las indicaciones del fabricante se deben utilizar un conjunto de herramientas que normalmente son proporcionadas por el fabricante, solo debe ensamblarse de nuevo cuando el proceso de esterilización haya acabado y se verifique que los componentes se encuentren secos.
●
Lavar los componentes con agua destilada, secar y ensamblar.
●
Si la pipeta ha sido utilizada con sustancias peligrosas para la salud el usuario deberá asegurar que está completamente descontaminada antes de que la misma sea utilizada en otros procedimientos o sea retirada del laboratorio.
●
Es conveniente que se indique la marca, modelo, número de serie sustancias con las que se ha trabajado y sustancias o procedimientos con las que ha sido tratada o limpiada.
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LIMPIEZA SEMESTRAL: El mantenimiento deberá hacerse semestralmente. Debe ser sometida a los siguientes procedimientos para garantizar su correcto funcionamiento. 1. Desensamblar la pipeta siguiendo el procedimiento que indica el fabricante en el manual (dependiendo del modelo, tipo y marca el proceso puede variar). Normalmente, se desensambla el cuerpo principal de la pipeta del sistema eyector de puntas, desenroscando el cuerpo de la pipeta del cilindro. 2. Limpiar los anillos en O, el émbolo y las paredes interiores del cilindro antes de lubricar. 3. Si los componentes interiores fueron contaminados accidentalmente, todas las superficies deberán ser limpiadas con un detergente y luego con agua destilada. Si los anillos o sellos en O requieren ser cambiados, deberán ser sustituidos por repuestos con las mismas características que los originales. Este tipo de recambios varían dependiendo de la marca, el tipo y modelo.
4. Pipetas de volumen variable monocanal: 1 medida al 10%, 50%, y 100% al volumen nominal máximo, más 10 medidas al 10%, 50%, y 100% al volumen nominal máximo.
Fi.3: partes de una micropipeta
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RESULTADOS Y VERIFICACIÓN DE LAS PIPETAS AUTOMÁTICAS
Resultados
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Verificar calibración Fórmulas para analizar los resultados de las medidas
Conversión de masa a volumen
Fi.4: Formulas para la calibración
V= ( w + e ) x Z V= volumen (mL) w=peso (weight) (mg) e= perdida por evaporación (mg) z= factor de conversión para mg/mL
Exactitud: Error Sistemático La exactitud es la diferencia entre el volumen dispensado y el seleccionado en una pipeta A=
- VS
A= Exactitud (accuracy) =Volumen medio Vs=volumen seleccionado En un certificado de calibración la exactitud se expresa como un valor relativo ACC%= 100% x A/Vs
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EXTRACCIÓN DE ADN DE SANGRE INTRODUCCIÓN Para esta práctica elegiremos una muestra de sangre, ya que se emplea por defecto en los laboratorios de análisis genéticos. Es una muestra de la que podemos obtener una gran cantidad de ADN ya que tiene un gran número de células de partida. Durante este proceso debemos tomar una serie de medidas para no contaminar las muestras con ácidos nucleicos extraños o con inhibidores. Para ello conviene limpiar las áreas de trabajo con lejía al 5%, utilizar guantes y trabajar con materiales y soluciones libres de ADNasas.
FUNDAMENTOS El fundamento de esta práctica es obtener una muestra de ADN a partir de células humanas. En este caso no hemos utilizado ninguna muestra biológica, ya que hemos preparado el blanco con el cual sabremos si estaba contaminado.
MATERIAL El material que hemos utilizado es el siguiente: ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●
Muestra de sangre. Tampón de lisis (Tris-HCI 10mM, MgCI2 5mM, Sacarosa 0,3 M, Triton-X100 1%). NaCI 0,9%. SDS 20%. Proteinasa K 20 mg/ml. NaCI saturado (6M). Etanol absoluto. Etanol 70%. 2 microtubos. 1 tubo de fondo cónico 15 ml. 1 varilla para capturar la madeja de ADN. 2 pipetas pasteur de 3 ml.
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PREPARACIÓN REACTIVOS a) Tampón de lisis REACTIVOS
CONCENTRACIÓN FINAL
CANTIDAD
Tris-HCL
10mM
0,605g
MgCl2.H2O
5mM
0,51g
Sacarosa
0,32mM
54,77g
Triton-X100
1%
5ml
Agua (para biología molecular)
Hasta 500ml
Preparación de 500ml: 1. Pesar cada uno de los reactivos según las cantidades especificadas en la tabla anterior. 2. Añadir agua (para uso en biología molecular, suministrada en el kit) hasta 400ml. 3. Disolver en agitador magnético. Si es necesario, facilitar la disolución mediante la aplicación de calor suave durante la agitación. 4. Ajustar a pH=7.5 (con HCL) 5. Añadir agua hasta 500ml. Almacenamiento: - Almacenar a 4ºC, durante no más de 15 días. Precauciones: - Esta solución no puede ser autoclavada una vez preparada. b) NaCl 0,9% REACTIVOS
CONCENTRACIÓN FINAL
CANTIDAD
NaCl
0,9%
0,9g
Agua (para biología molecular)
Hasta 100ml
Preparación de 100ml: 1. Pesar NaCl según la cantidad especificada en la tabla anterior. 2. Añadir agua (para uso en biología molecular, suministrada en el kit) hasta 100ml. 3. Disolver en agitador magnético. 4. Si no se va a usar en el momento, conviene autoclavar la solución. Almacenamiento: - Almacenar a temperatura ambiente.
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c) NaCl Saturado REACTIVOS
CONCENTRACIÓN FINAL
CANTIDAD
NaCl
6M
3,5g
Agua (para biología molecular
Hasta 10ml
Preparación de 10ml: 1. Pesar NaCl según la cantidad especificada en la tabla anterior. 2. Añadir agua (para uso en biología molecular, suministrada en el kit) hasta 10ml. 3. Disolver en agitador magnético. 4. Si no se va a usar en el momento, conviene autoclavar la solución. Almacenamiento: - Almacenar a temperatura ambiente. d) SDS REACTIVOS
CONCENTRACIÓN FINAL
CANTIDAD
SDS
20%
2g
Agua (para biología molecular)
Hasta 10ml
Preparación de 10 ml: 1. Pesar SDS según la cantidad especificada en la tabla anterior. 2. Añadir agua (para uso en biología molecular, suministrada en el kit) hasta 8ml. 3. Disolver en agitador magnético con aplicación de calor suave. 4. Una vez disuelto, enrasar a 10ml. Almacenamiento: - Almacenar a temperatura ambiente. e) ETANOL 70% REACTIVOS
CONCENTRACIÓN FINAL
CANTIDAD
Etanol absoluto
70%
10,5ml
Agua (para biología molecular)
4,5ml
Preparación de 15ml: 1. Medir el etanol según la cantidad especificada en la tabla anterior. 2. Añadir agua (para uso en biología molecular, suministrada en el kit) hasta 15ml. 3. Mezclar.
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Almacenamiento: - Almacenar a temperatura ambiente. PROTOCOLO Sangre periférica 1. 2. 3. 4. 5.
Partir de sangre periférica en EDTA Añadir 10 ml de Tampón de lisis. Mezclar por inversión. Dejar en la nevera (4ºC) durante 30 minutos. Centrifugar 18 minutos a 3.000 rpm. Eliminar el sobrenadante con pipeta pasteur o mediante decantación. 6. Añadir el precipitado NaCl 0,9% hasta 4 ml. Disolver completamente el precipitado. 7. Centrifugar 18 minutos a 3.000 rpm. 8. Eliminar el sobrenadante con pipeta pasteur o mediante decantación. Fi.5: sobrenadante con precipitado 9. Añadir al precipitado 500 µl de Tampón de lisis, 25 µl de SDS 20% y 2,5 µl de Proteinasa K. Agitar con vórtex. 10. Incubar a temperatura ambiente toda la noche. 11. Añadir 160 µl de NaCl saturado. 12. Añadir dos volúmenes de etanol absoluto frío. Mezclar por inversión muy lentamente observando la formación del ovillo de ADN precipitado. 13. Capturar la madeja de ADN con una varilla. 14. Lavar la madeja en un microtubo con 1 ml de etanol 70%. 15. Dejar secar el ADN en la varilla durante 30 minutos, apoyando la varilla sobre una gradilla. Pasar la varilla a un microtubo vacío. 16. Resuspender en 300 µl de agua destilada estéril, Con este procedimiento se obtiene una concentración de ADN promedio de 100 - 200 ng/µl.
Blanco
Fi.6: Sobrenadante con precipitado más visual
1.Partir de agua destilada. 2.Añadir 10 ml de Tampón de lisis. Mezclar por inversión. 3.Dejar en la nevera (4ºC) durante 30 minutos. 4.Centrifugar 18 minutos a 3.000 rpm. a. Como no ha habido precipitado, no seguimos con el proceso de extracción del ADN.
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RESULTADOS En el blanco no salió precipitado porque al no tener muestra no tenía ningún ADN que precipitase.
Fi.7: Muestra blanco
En el caso del preparado con la muestra, en el grupo 3 consiguieron sacar el ADN. Como nosotros hicimos el blanco, no nos apareció ningún precipitado, con lo que no conseguimos ningún resultado de obtención de ADN.
Fi.8: ADN
Causas por las que no aparece el ADN:
● ●
Contaminación por DNAasas Poco ADN
○ ○ ○ ○
División de la muestra. Lisis parcial. No conecta sedimentación. más números de lavados, pérdida de precipitado.
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PREGUNTAS 1. Enumera y ordena en función de la cantidad de células presentes, los distintos tipos de muestras humanas a partir de la cuales se puede hacer una extracción de ADN. 1. Muestra sanguínea. 2. Tejido muscular. 3. Células de la mucosa oral (saliva). 4. Pelo arrancado de la raíz. 2. ¿Qué cantidad de ADN comparten una célula epitelial, un hepatocito y una neurona? Poseen la misma cantidad de ADN. 3. ¿A partir de qué células sanguíneas se puede aislar ADN? A partir de todas las células con núcleo. 4. ¿En qué parte de la célula está el ADN? En el núcleo. 5. En función de la muestra biológica de partida empleada, aproximadamente ¿a partir de cuantos núcleos celulares hemos extraído ADN en esta práctica? 10 millones de células. 6. ¿Por qué precipita el ADN en el paso 12? Porque el ADN es polar y el etanol Apolar, entonces el ADN será muy poco soluble en el etanol, y menos aún en etanol frío, porque a menor temperatura menor solubilidad, por lo que precipitara más rápido. 7. ¿Se pondría lavar el ADN en el paso 14 con Etanol 40%? No, porque se podría disolver. 8. ¿Cuál es la finalidad de lavar el ADN con etanol 70%? Lavar la muestra de ADN para purificarla. 9. ¿Por qué es importante que el Etanol se evapore bien en el paso 15? Porque el ADN tiene que quedar totalmente puro sin ningún rastro de ninguna otra sustancia para que después no interfiera más adelante en otras reacciones.
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ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA FUNDAMENTOS Los ácidos nucleicos tienen carga negativa, por lo que cuando se someten a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo. La electroforesis se lleva a cabo en el interior de un gel, este facilita el desplazamiento de los fragmentos de menor tamaño por la trama del gel que los más largos. Después aparecen varias bandas que corresponden a los fragmentos de distinto tamaño. MATERIAL ● ● ● ● ● ● ●
Muestras de ADN para cargar en el gel Agarosa Tampón TBE. Se debe diluir hasta tener TBE 1x, del que se necesitan 50ml para preparar el gel y 250ml para sumergirlo en la cubeta. Midori Green (agente intercalante) Marcador de peso molecular Tampón de carga (5 µl para cada muestra) Microtubos de 0,6 ml
PREPARACIÓN DE REACTIVOS TAMPÓN DE ELECTROFORESIS
REACTIVOS
CONCENTRACIÓN FINAL
CANTIDAD
TBE 10x
1x
30ml
Agua (para biología molecular o destilada)
Hasta 300ml
Preparación de 300ml: ● Medir la cantidad correspondiente de TBE 1x, en función de la cantidad de tampón de electroforesis necesaria para preparar el gel y llenar la cubeta de electroforesis que se vaya a emplear. ● Añadir agua hasta 300ml. ● Mezclar. Almacenamiento: - Almacenar a temperatura ambiente.
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PROTOCOLO PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA REACTIVOS
GEL 1% *
GEL 2 % *
Agarosa
0,5 g
1g
TBE 1x
50 ml
50ml
●
Para esta práctica usamos en gel 2 %.
1. Preparar la bandeja con el peine. 2. Pesar la agarosa directamente en el vaso de precipitados. Añadir el TBE 1x. 3. Hervir en horno microondas hasta la disolución total de la agarosa, agitando el vaso con la mano de vez en cuando. 4. Mantener en agitación hasta alcanzar los 65ºC aproximadamente (temperatura orientativa). 5. Añadir 5 µl de Midori Green a la agarosa líquida. Mover para distribuir uniformemente. 6. Servir en la bandeja con el peine colocado. 7. Dejar polimerizar a temperatura ambiente, hasta que la agarosa deje de estar transparente. 8. Quitar el peine levantándolo verticalmente del gel y evitando moverlo hacia los lados para no romper los pocillos. REALIZACIÓN DE LA ELECTROFORESIS a) Para preparar el Tampón de Electroforesis (TBE 1x): REACTIVOS
CANTIDAD
TBE 10x
25ml
Agua (para biología molecular o destilada)
Hasta 250ml
b) Para preparar las muestras: POR CADA PEINE Marcador de peso molecular
4µl
Tampón de carga
5µl
Agua destilada
11µl
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1. Preparar el tampón de electroforesis. 2. Mezclar la muestra de DNA (gDNA, producto de digestión tras RFLP…) con el tampón de carga y agua para aumentar el volumen de la muestra a cargar. 3. Introducir gel y tampón de electroforesis en la cubeta e insertar las muestras de ADN en los pocillos, anotando el orden de colocación en el gel, con precaución de no dañar el pocillo. 4. Conectar la cubeta a la fuente y poner voltaje constante (100-120 V) hasta que el frente de la electroforesis haya recorrido las tres cuartas partes del gel. 5. Desconectar la fuente. VISUALIZACIÓN DE LOS RESULTADOS 1. Una vez detenida la electroforesis, sacar el gel de la cubeta con cuidado para que no se rompa y, sin bandeja, colocarlo sobre un transiluminador UV. 2. Analizar el resultado obtenido mediante la visualización del gen, con precaución de proteger cara y ojos con la luz UV, con una pantalla de metacrilato. RESULTADOS La electroforesis salió mal como podemos ver en la foto, ya que lo dejamos más tiempo del debido y corrió demasiado por lo que no podemos observar nada. PREGUNTAS
Fi.9: Gel agarosa con resultados
1. Explicar brevemente en qué se basa la electroforesis de ácidos nucleicos. Analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. 2. ¿Qué función tiene el tampón de carga? Dar color e intensidad a la electroforesis. 3. ¿Por qué aparecen bandas con distinta intensidad? Dependiendo del tipo de proteína que sea aparecerán bandas de más intensidad o menos. 4. ¿Por qué no se hace la electroforesis en agua en vez de en tampón TBE? Porque si no hay iones y sales sueltos la corriente eléctrica no corre. 5. Interpretar los resultados obtenidos al analizar el ADN Genómico y/o el producto de PCR y la restricción enzimática mediante electroforesis en agarosa. La electroforesis salió mal como podemos ver en la foto, ya que lo dejamos más tiempo del debido y corrió demasiado por lo que no podemos observar nada. 6. ¿Por qué la electroforesis en agarosa es sumergida? Porque para poder separar los fragmentos de ADN necesita ser sumergido en un líquido que tenga iones para que se pueda producir adecuadamente la corriente y pase del lado negativo al positivo y se formen adecuadamente las bandas.
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PCR INTRODUCCIÓN La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN: el ADN bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a enrollar. Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de: - Desnaturalización - Anillamiento - Extensión de la cadena Los oligonucleótidos (cebadores o primers) consisten normalmente en secuencias relativamente cortas, que son diferentes entre sí y complementarias de los sitios de reconocimiento que flanquean el segmento de ADN diana que debe amplificarse. Las fases de desnaturalización del ADN molde, anillamiento del cebador y extensión del cebador constituyen un “ciclo” del método de amplificación de PCR.
Fi.10: Localización cromosómica del gen MTHFR
INVENTARIO DEL MATERIAL
Muestras de ADN Enzima Taq polimerasa Tampón de actividad 5x Cebadores o primers: Fodward y reverse Microtubo de 0,2ml Gradilla Guantes
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PROTOCOLO ●
Mezclar en un tubo eppendorf de 0,2ml los siguientes reactivos, para un volumen total de 25μL. Mezclar siempre por pipeteo, no emplear el vortex. x1 Tubo
ADN
5 μL
Taq polimerasa
0,4 μL
Tampón 5x (con dNTPs y MgCl2)
5 μL
Primers 20 μM
0,5 μL de cada uno
Agua destilada estéril
13,6 μL
Volumen total:
25 μL
●
Efectuar la PCR en el termociclador con el siguiente programa: Temperatura
Tiempo
Desnaturalización inicial
95ºC
5 min
Desnaturalización
95ºC
15 s
Anillamiento
57ºC
15 s
Elongación
72ºC
10 s
Elongación final
72ºC
5 min
x 40 ciclos
14ºC ●
Comprobar el resultado de la reacción mediante una electroforesis en agarosa y explicar los patrones de bandas obtenidos.
RESULTADOS La PCR nos salió mal por dejarlo más tiempo de lo debido, entonces no apareció nada.
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PREGUNTAS 1. ¿Qué particularidad tiene la ADN polimerasa para que pueda emplearse en este procedimiento? Que es la enzima que interviene en la replicación del ADN y que es necesaria la utilización de la polimerasa Taq, debido a que es necesario aplicar altas temperaturas para desnaturalizar la molécula de ADN. 2. ¿Cuál es el factor limitante del proceso? Cantidad de cebadores disponibles y actividad de la Taq ADN polimerasa. 3. ¿Qué sucede en cada etapa de un ciclo de temperaturas: desnaturalización, anillamiento, elongación? Desnaturalización: Convertimos el ADN bicatenario en ADN monocatenario. Anillamiento: Unión de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores. Elongación: Extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos. 4. ¿Cómo podemos asegurar que estamos amplificando el gen que necesitamos analizar? Porque nosotros sabemos cuál es el fragmento que hemos utilizado o cogido y a la hora de hacer la electroforesis hay un marcador que te va a indicar el número de pares de bases que tienen ese gen y ese número de pares de bases tiene que corresponder con la parte del gen que hemos extraído. 5. Enumera los motivos por los que no se produciría amplicación por PCR. ¿Qué ocurre si hay una mutación en la secuencia complementaria de unión de los cebadores? Al haber una mutación en la secuencia complementaria ésta no comenzará el proceso de anillamiento y, por lo tanto, tampoco dará lugar al proceso de elongación. Por esta razón si hay una mutación en la secuencia complementaria de unión de los cebadores no se podrá realizar la PCR. 1- No dará paso al proceso de anillamiento. 2- Si no hay anillamiento no hay elongación. 3- No se producirá la PCR por ese motivo.
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