Manual de procedimientos de laboratorio en el dx bioquímico tf by oscar panez

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS EN SALUD PUBLICA DIRECCION EJECUTIVA DE LABORATORIOS DE REFERENCIA DIVISION DE PATOLOGIA Y PATOLOGIA CLINICA

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO EN EL DIAGNOSTICO BIOQUIMICO

SEGÚN NORMA INTERNACIONAL ISO/FDIS 15189:2000

MINISTERIO DE SALUD LIMA-PERU

INDICE

INTRODUCCION................................................................................3 SECCION 1 Generalidades.....................................................................................4 SECCION 2 Bioseguridad.......................................................................................6 SECCION 3 Recolecci贸n de muestras de sangre...................................................11 SECCION 4 Acondicionamiento, Preservaci贸n y Transporte de Muestras............18 SECCION 5 Metodolog铆a e Instrumentaci贸n..........................................................21 SECCION 6 Procedimientos ..................................................................................33 SECCION 7 BIBLIOGRAFIA................................................................................. 107

ANEXOS.......................................................................................... .109

INTRODUCCION

La Bioquímica como espejo molecular de la vida. Con esta cita queremos atraer su atención hacia el concepto de esta enorme disciplina, centro importante del conocimiento actual y arma fundamental para desentrañar los misterios metabólicos celulares. El Laboratorio, como institución de apoyo diagnóstico e investigación, mantiene un enorme nexo con esta actividad, desarrollando en el quehacer diario numerosas pruebas relacionadas a componentes derivados de las diversas rutas metabólicas con significado clínico. De las buenas prácticas laboratoriales, surgiran reportes adecuados que ayudaran al personal médico y de salud en la toma de decisiones. El presente Manual de Procedimientos recopila información básica para los pasos técnicos en diversos ensayos de proceder común a la mayoría de laboratorios de la red. La intención es establecer uniformidad en ciertos criterios que permitan entender los principios metodológicos de las pruebas, las diferencias que pueden haber entre ellas y la instrumentación diversa para tales fines. Se ha respetado la arquitectura que los manuales deberían seguir en este caso, según las normas contenidas en el documento ISO/FDIS 15189. Sin embargo, hemos creído conveniente adelantar dichos procedimientos con explicaciones generales sobre Recoleción de Muestras, Metodología Instrumental y Bioseguridad, conocimientos básicos durante el trabajo preanalítico y analítico. La extensión de los mismos es breve y dirigida al área; en líneas generales cada uno de estos tópicos merece manuales independientes. Como es de conocimiento al personal que labora en un laboratorio de ensayos, no es posible generalizar un único procedimiento. Existiendo en la actualidad diversas alternativas de metodologías e instrumentación, sería muy difícil acercar la realidad particular de cada laboratorio de la red, la cual depende de recursos específicos, funciones, influencia poblacional y otras variables conocidas de nuestra desigual infraestructura. Desde esa perspectiva, hemos trabajado en algunos de los analitos con métodos estándar internacionales y que, intuimos , son utilizados por la mayoría de entidades. Para otro grupo de ensayos, solo hemos señalado lineamientos generales de los principales métodos, sin desarrollar ninguno en particular, evitando la pretensión de inclinar la balanza hacia alguno de ellos. Finalmente, creemos en la flexibilidad de esta primera entrega, la cual nos permitirá recoger el aporte de todos los involucrados en esta área y enriquecer con ello, futuras revisiones del presente trabajo.

Lima, Julio de 2003.

SECCION 1:

GENERALIDADES

1.1 FINALIDAD

El Manual de Procedimientos de Laboratorio en el diagnóstico Bioquímico, tiene por finalidad presentar las actividades analíticas relacionadas a las principales pruebas del área de Química Clínica, reuniendo criterios de aceptación internacional y enmarcadas de acuerdo a la guía ISO/FDIS 15189. Es propósito de la norma que los laboratorios de la red establezcan su propia documentación de acuerdo al modelo impartido en el presente escrito y en relación a su infraestructura y funciones. 1.2 ALCANCE Para aplicación y modelo en los centros dependientes del Instituto Nacional de Salud y en la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública . 1.3 DOCUMENTOS DE REFERENCIA 1.3.1 International Organization for Standardization. ISO / FDIS 15189. 2000. Quality Management in the Clinical Laboratory. 2001. 1.3.2 Ministerio de Salud. Manual de Procedimientos de Laboratorio . Laboratorios Locales I. Laboratorios Locales II. Lima, 1999. 1.3.3 Ministerio de Salud. Manual de Procedimientos de la Red de Laboratorios de Primer Nivel de Atención, Lima, 2000.

1.4 TERMINOS Y ABREVIATURAS 1.4.1 Absorbancia.Propiedad de una molécula o cojunto de ellas por retener parte de las longitudes de onda deun espectro de luz, no permitiendo su pasaje. 1.4.2 Acondicionamiento. Proceso por el cual se aseguran todas las propiedades de una muestra, permitiendo su correcto análisis, desde la recolección hasta su ingreso al área de análisis. 1.4.3 Acoplamiento.Variante en una reacción enzimática en la que se aprovecha la formación de un producto en una primera reacción , para convertirlo en sustrato de una segunda a la cual se unirá un componente que siga reaccionando con la primera. 1.4.4 Análisis. En la práctica laboratorial, la realización técnica de un proceso, básicamente la determinación de algún compuesto. 1.4.5 Analito. Elemento capaz de ser analizado o determinado. 1.4.6 Catalizador.Elemento químico capaz de modificar la velocidad de una reacción, básicamente acelerarla. Ejemplo : enzimas. 1.4.7 Coenzima. Molécula orgánica que unida a una enzima le permite mejorar su acción. 1.4.8 Componente. Molécula o conjunto de moléculas que logran una unidad y pueden estar independientemente en una sustancia o asociado a otros .

1.4.9 Corrida. Término utilizado en la práctica laboratorial, la cual denota el proceso poe el cual se determinan concentraciones de un analito enun mismo tiempo o en serie. 1.4.10 Cromógeno. Sustancia o componente químico capaz de virar hacia una tonalidad de color dentro de una reacción química. 1.4.11 Enzima. Proteína que cataliza una reacción química. 1.4.12 Extinción. Aumento en la velocidad de desapariciónde un sustrato o producto. 1.4.13 Filtro. Dispositivo que al paso de todo el espectro de la luz, permite separar sólo una banda de longitudes de onda de la misma. 1.4.14 Kit. Denominación de un set ó contenedor de diversos productos reactivos y materiales necesarios para un análisis. 1.4.15 Linealidad. Capacidad de un análisi de permitir crecimientos progresivos y lineales a medida que aumenta la concentración del analito. 1.4.16 Macromolécula. Se dice de las moléculas de alto peso molecular, compuestos por distintos grupos químicos, formando una unidad. Dichos grupos químicos pueden ser similares entre sí o distintos. 1.4.17 Método. Proceso o conjunto de procesos que permiten realizar una actividad, en este caso un análisis. Las técnicas son variaciones para poner en la práctica un método. 1.4.18 Monocromador. Dispositivo que permite seleccionar una determinada longitud de onda con menos amplitud de banda que un filtro convencional. 1.4.19 Preservación. Resguardo de las condiciones originales de los componentes químicos en una solución. 1.4.20 Prisma. Vidrio o cuarzo con caras laterales que al girar permite reflejar una longitud de onda (luz) específico.Se usa en espectrofotómetros. 1.4.21 Reproducibilidad. Capacidad de verificar una misma concentración bajo el mismo método de análisis, pero con anlista distinto y en un momento diferente de la determinación original. 1.4.22 Repetitibilidad : Capacidad de mantener la determinación de una concentración anlítica bajo las mismas condicones de analista, equipo y momento. 1.4.23 Standard. Solución o sustancia pura de concentración conocida. 1.4.24 Suero control. Solución de analitos que se utiliza en el control de precisión. La concentración obedece a una media y a un rango de valores calificados a ambos lados de esta media. 1.4.25 Transmitancia. Pasaje de luz o de longitudes de onda no retenidas al atravesar un cuerpo o compuesto molecular. 1.4.26 Trasvase. Acción de transportar una porción de un líquido o un sólido de un contenedor a otro distinto.

SECCION 2 : BIOSEGURIDAD

2.1 INFORMACION GENERAL Referirse al Manual de Normas de Bioseguridad (Serie de Normas Técnicas No. 18 ) del Instituto Nacional de Salud, para la consulta oportuna de las medidas establecidas . En esta sección, se daran indicaciones generales para el sector de Laboratorio de Bioquímica. 2.2 RESPONSABILIDADES La bioseguridad del laboratorio compromete a todo el personal; se deriva de esta afirmación que cada empleado debe comunicar a sus superiores cualquier acto o condición que atente contra ella, así como contribuir a su cumplimiento. Sin embargo, es aconsejable que el director del Laboratorio o un designado se encarguen de la supervisión de las normas. 2.3 PRINCIPALES MEDIDAS EN LABORATORIOS DE BIOQUIMICA 2.3.1 Protección Individual Facilitar equipo de protección necesario y mantenerlo en buenas condiciones de higiene y seguridad. Este equipo incluye : mascarillas, gafas de protección ocular y batas o mandiles apropiados, además de una buena provisión de guantes. La infrestructura tomará en cuenta la necesidad de regaderas o suministros de agua potable. 2.3.1

Almacenamiento de Líquidos Inflamables

Utilizar recipientes adecuados, perfectamente identificados y dispuestos en armarios o mobiliario de seguridad. Disponer señales en el área de almacenamiento (ver señalizaciones internacionales adelante) y extintores suficientes y en vigencia. 2.3.2

Saneamiento del medio

Mantener limpieza e higiene en mobiliarios, zonas de trabajo, pisos, corredores, indumentaria. Disponer de adecuados recipientes de basura y mantenerlos cerrados. Destinar espacio suficiente para la alimentación del personal, así como vestidores para comodidad de los mismos. 2.3.3

Prevención de Incendios y Riesgos Eléctricos

Mantener como requisitos mínimos : • Capacitación del personal en los tópicos pertinentes. • Señalizaciones adecuadas para las vías de escape en caso de incendios o siniestros. • Identificar los extintores portátiles y mantenerlos en buen uso. • Utilizar cables de tres conductores (con toma a tierra) en todas las instalaciones eléctricas.

•

Se aconseja el uso de tomas de corriente de un solo enchufe, evitando las conexiones múltiples.

2.4 LAS REGLAS DE BIOSEGURIDAD INVIOLABLES 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.4.4 2.4.5 2.4.6

Lavado de manos del personal después de haber manipulado material infeccioso. No permitir pipetear con la boca Prohibir al personal comer, beber o fumar en zonas de trabajo. Evitar el uso de cosméticos en áreas de trabajo. No guardar alimentos o bebidas en los refrigeradores de trabajo. Mantener el laboratorio limpio y aseado. Descontaminar superficies de trabajo una vez al día. 2.4.7 Usar batas, uniformes, mandiles en el ambiente de labores. No trasladar dicha indumentaria fuera del mismo. 2.4.8 Autorizar el paso a la zona de trabajo al personal del mismo y a todo aquel que sea informado de los requisitos para su permanencia en el lugar. Mantener las puertas cerradas. 2.4.9 No permitir niños en zonas de trabajo. 2.4.10 Prohibido absolutamente el ingreso de animales, con excepción de alguna finalidad dentro de las funciones del laboratorio. 2.4.11 Utilizar guantes en todos los trabajos que impliquen relación directa con material sanguíneo. 2.4.12 Esterilizar en autoclave el material de desecho permisible de dicha acción, antes de su eliminación. 2.5 DESINFECCION

Los desinfectantes recomendados para el trabajo general de laboratorio son: 2.5.1 Cloro: Hipoclorito sódico. El cloro es un desinfectante universal, activo contra todos los microorganismos. En general se utiliza en forma de hipoclorito sódico, con diversas concentraciones de cloro libre. Se trata de un agente oxidante, potente corrosivo para los metales. Las soluciones de hipoclorito se degradan poco a poco, por lo que es necesario prepararlas con frecuencia. Como desinfectante general para toda clase de trabajos de laboratorio, se utilizará una concentración de 1gr/L (1000 ppm) de cloro libre. En los casos de salpicaduras de sangre o en presencia de material orgánico en cantidad apreciable, para la desinfección se debe recurrir a una solución más concentrada de 10 g/L (10 000 ppm), de cloro libre. 2.5.2 Compuestos fenólicos. Muchos compuestos fenólicos que constituyen la base de ciertos número de desinfectantes corrientes. Los compuestos fenólicos pueden emplearse cuando no se dispone de hipocloritos, diluyéndolos de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. 2.5.3 Yodo y yodoformos. La acción de estos desinfectantes es parecida a las de los hipocloritos; las superficies limpias pueden tratarse eficazmente con soluciones que

contengan 0.075 g/L (75 ppm) de yodo libre. Los yodoformos pueden diluirse en alcohol etílicos para el lavado de manos o como esporicida. 2.5.4

Alcohol etílico y alcohol isopropilico. Estos desinfectantes son de menos eficacia que los ya mencionados.

2.6 ELIMINACION DE DESECHOS 2.6.1 Los desechos no contaminados se introducen en bolsas negras y pueden eliminarse con la basura corriente. 2.6.2 Los objetos agudos y cortantes, como las agujas hipodérmicas y jeringas, deben colocarse en recipientes rojos con paredes que no puedan traspasarse fácilmente. Cuando estos estén llenos, se colocan en bolsas anaranjadas para desechos contaminados y se incineran. 2.6.3 El material contaminado para tratamiento en autoclave y reutilización, se coloca en recipientes impermeables poco profundos, que contengan una cantidad de desinfectante suficiente para cubrir el contenido. Los recipientes se colocan luego en autoclave. No se efectúa ninguna limpieza previa; cualquier limpieza o reparación que sea necesaria se hace después del paso por el autoclave. 2.6.4 Los materiales contaminados para eliminación como todos los cultivos, sangre y sueros suelen esterilizarse en autoclaves. La eliminación de las muestras de suero es muy importante. Cada área debe tener recipientes de basura para descartar las muestras. Es importante tener presente que al descartar los desechos no producir aerosoles.

2.7 SEÑALIZACIONES PRINCIPALES)

INTERNACIONALES

(ETIQUETADOS

Los reactivos comerciales tienen en sus etiquetas símbolos de peligrosidad ,riesgos específicos y consejos de prudencia, para la interpretación de estos símbolos acudir al catálogo que debe proporcionar la casa comercial.

Símbolos de peligrosidad y su significado Pictograma

Indicación del peligro

Clasificación

Precaución

E Explosivo Según resultados experimentales Evitar choque, percusión, fricción según la prescripción de declaración formación de chispas, fuego y y control de la ley de productos acción del calor. químicos (R.F.A.).

O Comburente

Según los resultados de los ensayos Evitar cualquier contacto con considerando la inflamabilidad y sustancias combustibles. el peligro de explosión. ¡Peligro de inflamación! Los incendios pueden ser favorecidos y dificultado su extinción.

F+ Extremada-

Líquidos con punto de inflamación

Mantener

lejos

llamas

abiertas, mente inferior a 0ºC y punto de ebullición inflamable de máximo 35ºC; gases, mezclas de gases (aunque estén presentes en forma licuada), que con el aire a presión normal tienen punto de encendido.

chispas y fuentes de calor.

F Fácilmente

Determinados peróxidos orgánicos;

Mantener

inflamable

líquidos con punto de inflamación inferior a 21ºC, pero no extremadamente inflamables; sustancias sólidas que son fáciles de inflamar, de continuar quemando por si solas o arder sin llama por la acción de una fuente de encendido; liberación de sustancias fácilmente inflamables por la acción de la humedad u otras propiedades.

chispas y fuentes de calor.

Indicación del peligro

Clasificación

Precaución

T+ Muy tóxico T Tóxico

Tras resultados de ensayos de toxidad aguda oral, dermal, inhalativa, así como por indicios considerables de daños graves para la salud, posiblemente irreversibles, por absorción única, repetida o de larga duración.

Evitar cualquier contacto con el cuerpo humano, ya que no se pueden descartar graves daños para la salud, posiblemente de consecuencias mortales. Se hace referencia especial a la acción cancerígena o al riesgo de alteraciones genéticas o de acción teratógena de diversas sustancias.

Xn Nocivo

Según resultados de ensayos de toxicidad aguda oral, dermal, inhalativa

Evitar el contacto con el cuerpo humano, también la inhalación

así como por indicios considerables

vapores. Con posibles daños

lejos

llamas

abiertas,

Pictograma

de para de posibles daños para la salud, la salud en caso de empleo no posiblemente irreversibles, por adecuado. En algunas sustancias absorción única, repetida o de larga no es posible descartar totalmente duración.

una acción

cancerígena,alteración genética o teratógena. Se hace referencia a ello, igualmente al peligro de sensibilización.

C Corrosivo

Según intensidad de la destrucción de piel intacta sana durante tiempos de acción definidos.

Evitar el contacto con los ojos, la piel y la ropa mediante medidas protectoras especiales. No

inhalar los vapores.

Xi Irritante

Claros daños de los ojos o irritación de la piel, que se mantienen como mínimo 24 horas posteriores al tiem-

Evitar el contacto con los ojos y la piel. No inhalar los vapores. Si clasificado R43

po de acción, o una irritación clara de las vías respiratorias. Se hace referencia especial a una posible sensibilización por contacto con la piel.

posible.

sensibilización

SECCION 3: RECOLECCION DE MUESTRAS DE SANGRE

3.1 DISPOSICIONES GENERALES •

•

Ayuno : Para ciertos estudios que requieren muestras sanguíneas, se deben conservar condiciones de ayuno. Dicho tiempo puede variar entre 8 horas a 12 horas. Sin embargo, otros ensayos no requieren esa condición. En los procedimientos se cita dicha necesidad en el apartado correspondiente a la descripción de la muestra primaria. La sangre debe recolectarse en tubos de vidrio o plástico limpios. La esterilidad es una condición ideal aunque no absoluta en el trabajo bioquímico(esto se logra con tubos al vacío, aunque podrían no ser disponibles). La contaminación por bacterias podría acarrear la metabolización de ciertos analitos (ej. glucosa). En caso de recolectar la sangre con jeringa y aguja estériles, los tubos deben llenarse con celeridad, evitando movimientos bruscos que acarreen roturas de glóbulos rojos y posterior hemólisis. Luego de la recolección de la sangre, debe permitirse que se coagule antes de la centrifugación y separación del suero. Para la totalidad de los procedimientos descritos en este manual, bastará con la utilización de este componente sanguíneo. Sin embargo, para el manejo de muestras para ensayo de Hemoglobina glicosilada y en la eventualidad de usarse como alternativa el plasma, se recomienda someter los tubos a maniobras de inversión para lograr el mezclado correspondinte con el anticoagulante, evitando la formación de coágulos.

3.2 ANTICOAGULANTES PARA RECOLECCION DE MUESTRAS Los anticoagulantes son sustancias que previenen la formación de coágulos. Existen diferentes tipos de ellos en polvo o líquidos. Seleccionese el anticoagulante apropiado según el estudio a realizarse. Describiremos brevemente los disponibles a manera de información, no siendo necesarios en el trabajo bioquímico, con excepción de las muestras para ensayos de Hemoglobina glicosilada. 3.2.1 EDTA (Etilen Diamino Tetra Acetato): Usado para estudios celulares, es factible su su uso en el trabajo bioquímico de algunos componentes (ej. glucosa). 3.2.2 Citrato de Sodio : Usado en concentraciones al 3.8%, generalmente para estudios de coagulación. 3.2.3 Heparina : Se utiliza en presentaciones con concentraciones de litio y sodio. Para estudios bioquímicos es preferible el uso de heparina con litio. 3.2.4 Oxalatos : De menor uso en la actualidad, se restringe a los ensayos de glucosa. 3.2.5 Códigos de colores internacionales : Adoptados por muchas compañías que proveen los tubos con anticoagulantes para su uso cómodo, pues permiten una recolección prefijada de sangre, la cual se mezclará con la correspondiente cantidad de anticoagulante. Una vez realizada la toma de muestra, se recomiendan 10 a 15 inversiones del tubo para su homogenización. • Tapa Roja : Sin Anticoagulante • Tapa Violeta : Con EDTA. • Tapa Celeste : Con Citrato de Sodio. • Tapa Verde o Blanca : Con Heparina. • Tapa Gris : Con Oxalatos. 11

Material para Toma de Muestras : • • • • • • • • • •

Guantes Jeringa, aguja Tubo recolector Algodón 70° Alcohol Ligadura Lancetas Capilares Venditas Contenedor de desechos

3.3 GUIAS BASICAS DE ASEPSIA 3.3.1

3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5

3.3.6

Utilizar siempre guantes y mandil o bata para la obtención de muestras. Los guantes deben desecharse y ser cambiados por un nuevo par después de atender a cada paciente. Lavarse prolijamente las manos antes y después de la atención de un paciente. Todas las agujas, jeringas y de preferencia tubos de recolección deben ser estériles. Al utilizar una aguja, esta no debe haber tocado ningún elemento antes de la punción de la piel. Si esto llega a ocurrir, utilice una nueva aguja. Desinfectar adecuadamente el área de punción con alcohol 70°. Pueden utilizarse otras soluciones antisépticas como el yodo, pero en condiciones ideales use la primera. Jamás toque el sitio de punción luego de la desinfección.

3.4 REVISION DE PETITORIOS U ORDENES MEDICAS 3.4.1

3.4.2

Examine con cuidado el petitorio u orden, asegurándose haber entendido la solicitud. En caso contrario, pregunte a su superior o intente comunicarse con el médico tratante. No es aconsejable guiarse de las indicaciones del paciente. Si la orden le induce a pensar en incongruencias, incompatibilidades o amerita a su juicio un riesgo para el paciente, consulte el caso con su superior inmediato o con el médico tratante.

3.5 LOS TIEMPOS EN LA TOMA DE MUESTRAS 3.5.1 El primer tipo de tiempo se denomina “tiempo simple” y es parte de la mayoría de estudios, pues amerita una recolección con una sola punción. 3.5.2 El segundo tipo se describe como “tiempo múltiple” y pertenece a la recolección de varias muestras y, por lo tanto, otras tantas punciones, para un mismo examen. Entre nuestros procedimientos, destaca el correspondiente a la Prueba de Tolerancia Oral a la Glucosa. 3.5.3 Tómese en cuenta las siguientes indicaciones en ambos tipos de tiempos de toma de muestras :

• • • •

Las condiciones de preparación del paciente deben ser escrupulosamente respetadas. Preguntar por la ingesta de medicamentos; algunos de ellos interfieren en las pruebas. En toma de muestras de tiempo múltiple, dar las recomendaciones pertinentes al paciente mientras espera la siguiente punción (ej. : evitar ingerir alimentos o limitar la actividad física). Se sugiere que en tomas de tiempo múltiple, la persona que inicialmente dio las indicaciones al paciente y recolectó la primera muestra, sea la responsable de respetar los horarios indicados.

3.6 RECONOCIMIENTO DEL PACIENTE 3.6.1

Reconozca al paciente mediante un saludo agradable. Identifíquese ante él como la persona de experiencia que va a recolectar la muestra.

3.6.2

Asegúrese que el procedimiento que va a efectuar lo hará en el paciente indicado. Para ello no basta la identificación de número de historia y cama. De ser posible, hable con el paciente para averiguar sus nombres y apellidos.

3.6.3

Transmita confianza y seguridad, explicando calmadamente el procedimiento que realizará.

3.6.4

Si el paciente tiene dudas, trate de absolverlas: disminuirá su natural temor.

3.6.5

No extienda la conversación más allá de lo pertinente. Dialogos sobre temas ajenos a la preocupación del paciente, podrían perturbarlo.

3.6.6

Termine su procedimiento, indicando lo necesario frente a segundos muestreos, horarios de entrega de resultados y todo aquello que Ud. pueda y le sea permitido resolver.

3.7 SELECCIÓN DEL SITIO DE PUNCION 3.7.1 Acomode al paciente de forma segura y confortable. 3.7.2 No practique ninguna punción con el paciente en posición de pie. 3.7.3

3.7.4

3.7.5

Elija una extremidad en la que no exista ninguna venoclisis, herida o lesión reciente, comunicaciones arteriovenosas, heridas o procedimientos quirúrgicos y cualquier eventualidad que le haga dudar de la necesidad de punzar dicha zona. Elija una vena que tenga dos características : visible y palpable. Puede ubicarla en la fosa antecubital del antebrazo, por donde surcan las venas cefálica y braquial. Si la vena no es muy visible, intente realizar masajes desde la muñeca hasta el codo. Si no hay contraindicación, observe siempre ambas extremidades para elegir el mejor sitio de punción Ajuste una ligadura unos 2- 4 dedos por encima del sitio elegido. La presión debe ser media, lo suficiente para evitar presiones mayores que causarían hemólisis, colapso venoso o dolor.

3.7.6

Previa a la punción limpie la zona indicada con movimientos circulares y del centro hacia fuera.

3.7.7

Dirija la aguja en un ángulo de 15-30 ° con respecto a la superficie del brazo. Punze en forma directa a través de la piel y hasta el lumen de la vena.

3.7.8

Terminada la colección , retire suavemente la aguja del brazo del paciente, aplicando una gasa compresiva o torunda de algodón en el sitio de punción.

3.7.9

Acabado el procedimiento, indíquele al paciente que debe conservar la presión, ejerciendo hemostasia por unos 5 minutos. Coloque finalmente una banda adhesiva(vendita o “curita”) sobre la herida de la punción.

3.7.10 Si el sangrado no se detiene, aplique presión sobre la zona durante 10 minutos adicionales. Si el problema persiste, consulte con el superior inmediato o médico tratante. 3.7.11 Deposite y destruya todo el material desechable en los recipientes diseñados para tal propósito. Este acto de destruir el material frente al paciente, aumenta su confianza en las bondades y buenas prácticas de laboratorio. 3.7.12 Finalmente, y muy importante, termine su trabajo etiquetando e identificando los tubos recolectados antes de atender una nueva tarea. 3.8 PUNCION EN UN DEDO 3.8.1 Ciertos examenes y ciertas condiciones del paciente ameritan la extracción de sangre mediante la punción de la yema de un dedo. 3.8.1 Aprete el pulpejo del dedo seleccionado de manera que muestre congestión.Los dedos de elección deberían ser el 3º ó 4º de la mano no dominante. 3.8.2 Desinfecte la zona. 3.8.3 Tome una lanceta nueva y estéril desechable y realice una punción rápida y segura en la cara lateral. 3.8.4 Recolecte las gotas de sangre necesarias al interior de un capilar o colector específico para estos casos. Permita que las gotas de sangre fluyan libremente; no es aconsejable presionar el pulpejo del dedo en el intento de obtener la muestra. Dicha acción puede mezclar líquidos tisulares junto a la gota de sangre. 3.8.5 Terminada la recolección, proporcione al paciente una gasa para rodear el pulpejo por dos minutos hasta detener el sangrado. 3.8.6 Elimine todo el material desechable. 3.8.7 Etiquete apropiadamente los contenedores usados en la recolección. 3.9 RECOLECCION DE MUESTRAS EN NIÑOS 3.9.1 3.9.2 3.9.3

Siga adecuadamente las indicaciones propuestas anteriormente. Realize el procedimiento mediante la ayuda de compañeros de trabajo. Sujete firmemente el brazo del niño, incluso cuando éste no oponga resistencia. La natural reacción del niño es retirar bruscamente el brazo al sentir la punción, lo cual podría ocasionar heridas en el mismo y pérdida de la maniobra.

3.10 RECOLECCION DE MUESTRAS DE SANGRE EN BEBES 3.10.1 El sitio recomendado de punción, se encuentra graficado en el dibujo inmediato. Pertenece al talón del bebé o infante.

3.10.2 Precaliente el talón del bebé utilizando toallas calientes o alguna manta térmica que permita una temperatura de 42°C por 3 a 5 minutos. Esto permitirá la capilarización de la sangre y el flujo de la misma a la zona de punción. Mantenga la precaución de no lastimar al niño con este proceder. 3.10.3 Limpie la zona y mantenga firme el pie del infante para evitar sacudidas bruscas. 3.10.4 Use una lanceta estéril y punze en las porciones laterales del talón (no en el centro), en sentido contrario a los pliegues del talón, evitando que la gota de sangre resbale hacia abajo, usando estos pliegues como camino. 3.10.5 Limpie la primera gota de sangre y permita la salida de las posteriores con suaves masajes, evitando la dilución con líquidos tisulares. Llene el capilar o contenedores con la cantidad necesaria. 3.10.6 Al finalizar, eleve el talón, coloque algodón en la zona y presione ejerciendo la respectiva hemostasia. 3.10.7 Descarte el material desechable y etiquete apropiadamente los contenedores. 3.11 RECOLECCION EN LUGARES INUSUALES L a finalidad de este manual no permite extendernos en el tema, pero mencionaremos que en los casos de pacientes muy obesos, pacientes con venas fibrosas por quimioterapia, bebés y otras condiciones que imposibiliten la obtención de muestras en las venas superficiales de brazos, será necesario localizar otras zonas de punción. Entre las alternativas, podrían citarse el dorso de la mano (no recomendable en bebés) , dorso del pie y en casos muy difíciles, mediante punción de la vena yugular externa (recomendado sólo para personal con experiencia). 3.12 CONSIDERACIONES FINALES 3.12.2 Para Prevenir un hematoma : • • • • •

Punze sólo la pared superior de la vena. Remueva el torniquete o ligadura antes de remover la aguja Use venas superficiales mayores(cefálica, braquial). Asegúrese que la aguja penetra la pared superior de la vena (penetraciones parciales permiten la salida de sangre hacia el tejido blando). Aplique presión en el sitio de la punción.

3.12.3 Para prevenir hemólisis: • • • • •

Mezcle adecuadamente los tubos que contengan anticoagulante con la muestra obtenida. Evite recolección de sangre de una zona con hematoma. Evite la aspiración forzada de sangre si usa jeringa y aguja y dispender la muestra al contenedor a través de la aguja. Asegúrese que el sitio de punción está seco antes del procedimiento. Evite manipulaciones, repeticiones o venopunciones traumáticas.

3.12.4 Evite la Hemoconcentración : Un incremento de grandes moléculas y analitos en la sangre puede deberse a : 16

• • • •

Aplicación prolongada de la ligadura. Excesivo masaje o presión al probar el sitio de punción. Venas esclerosadas u obstruidas. Uso de terapias endovenosas de largo plazo.

3.12.5 Efectos de la aplicación prolongada del torniquete o ligadura : • • •

Hemoconcentración . Incrementos significativos en proteínas totales, transaminasas, lípidos totales, colesterol, hierro. Afecta al paquete celular sanguíneo.

3.12.6 Factores del paciente que afectan la calidad de la muestra recolectada. • • • •

•

Uso de fármacos. Considerar en cada procedimiento de ensayos, la posibilidad de ciertas drogas de interferir en el mismo. Ejercicio: La actividad muscular tiene efectos directos sobre la elevación de Creatina Kinasa, Aspartato aminotransferasa o Transaminasa glutámico oxalacética, Deshidrogenasa láctica y recuento de plaquetas. Stress: No tiene relación directa con los procedimientos de este manual, sin embargo, la elevación transitoria de cortisol y catecolaminas podría afectar indirectamente algunos analitos como la glucosa. Postura : Los cambios posturales ( de supina a sentado) pueden interferir en el ensayo de ciertos analitos. Ciertas moléculas grandes no son filtrables hacia los tejidos, de modo que obtendran una concentración mayor en la sangre. En esta categoría se encuentran enzimas, proteínas, lípidos, hierro y calcio. Otros factores : Edad, sexo, gestación.

SECCION 4 : ACONDICIONAMIENTO, PRESERVACION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

4.1 ACONDICIONAMIENTO DE MUESTRAS 4.1.1 Definición Son los procedimientos que aseguran la calidad de la muestra desde su recolección hasta el análisis real. 4.1.2 • •

•

• • • • •

•

Identificación de las muestras y Centrifugación Las muestras no podran salir de la zona de toma de muestra sin la correspondiente identificación. Los datos básicos de rotulación de los tubos de recolección dependeran del sistema generado por la institución, pero se aconseja anotar nombre y dos apellidos, código numérico si existiera, procedencia, análisis solicitados, señales de alerta en caso de antecedentes infecciosos del paciente o necesidad de análisis urgente. Llegada la o las muestras a la zona de trabajo, identificar las Esperar 20 a 30 mismas en una hoja de trabajo o planilla, validando si la minutos , muestra es conforme (si llegó en las condiciones adecuadas de evitando la volumen, preservante necesario, identificación, tiempo formación de prudente o cualquier otra condición necesaria para su fibrina latente posterior análisis). que puede Proceder a la espera de formación de coágulo, en el causar caso de separar suero, antes de su proceso de obturaciones. centrifugación. Centrifugar a 1000-1500 g por espacio de 10 minutos. Para las separaciones de plasma, es prudente no esperar más de una hora para su separación. Utilizar el mismo tiempo y FCR para la centrifugación. En ambos casos, los tubos recolectores deben ser centrifugados con su respectivo tapón. No olvide sus Luego del centrifugado, separe el suero o plasma logrado en normas de tubos secundarios, anotando la identificación y loa análisis bioseguridad : pertinentes al área de bioquímica. Si sospecha la posibilidad Use guantes, de repeticiones o adiciones de pruebas, separe un poco mascarillas y de la muestra en otro tubo y almacene refrigerado. gafas. Procure mantener un file u hoja de trabajo de las muestras separadas que traslada a las distintas zonas de trabajo, obteniendo del analista la conformidad de la muestra separada.

4.2

PRESERVACION DE LAS MUESTRAS

4.2.1 Definición Procedimientos destinados a eliminar o disminuir cualquier variación en los componentes biológicos y moleculares de una muestra recolectada y separada. 4.2.2

Procedimientos esenciales

4.2.2.1 Mantener como práctica ideal la centrifugación de una muestra, tan pronto como se formó el coágulo. 4.2.2.2 El tiempo máximo de espera de una muestra de sangre total para su separación es de una hora. Pasado este tiempo, sufren variaciones significativas la glucosa, el potasio, fósforo, creatinina y transaminasas. 4.2.2.3 Si se requiriera una conservación superior a 1 hora, se recomienda almacenar la muestra a temperatura ambiente,antes que a 4°C. Esto retardará discretamente la hemólisis. 4.2.2.4 En el caso de suero o plasma separado, las muestras que no puedan analizarse dentro de las primeras 4 horas deben ser almacenadas a temperatura de refrigeración ( 2-8 °C) hasta su proceso, con un límite de 48 horas. Si el tiempo de proceso se prolonga, es aconsejable almacenar las muestras a –20 °C.

Siempre almacene las muestras en tubos o recipientes taponados.

4.3

TRANSPORTE DE MUESTRAS

4.3.1 Definición Procedimientos de preservación de muestras durante traslados desde el laboratorio hacia otro centro de referencia. 4.3.2

Procedimientos esenciales

4.3.2.1 El tiempo ideal de traslado de un laboratorio hacia otro centro debiera oscilar entre 45 a 60 minutos. 4.3.2.2 Utilizar recipientes de material plástico (polietileno o polipropileno) como contenedores de las muestras transportadas. 4.3.2.3 Identificar correctamente las muestras trasladadas, enviando en formato externo cualquier dato adicional que no pudiera escribirse en el tubo o contenedor.

4.3.2.4 Depositar estas muestras en sobres o cajas que puedan permitir el uso de unidades o bolsas refrigerantes (los envases de polietileno son adecuados para este fin). 4.3.2.5 Asegurarse que los tubos se encuentren perfectamente sellados , evitando derrames o contaminaciones con las soluciones refrigerantes. 4.3.2.6 En caso de recurrir a envíos por correo o courier, asegurarse de las condiciones de entrega y emabalaje del material enviando, respetando la cadena de frío si es esencial. Actualmente existen compañías que mantienen experiencia en traslados de material biológico. 4.3.2.7 Verifique con el centro referencial las condiciones de envío de las muestras, así como su recepción exitosa.

Nunca envíe muestras de suero o plasma en tubos de vidrio. Por otro lado, procure utilizar tapas de tipo rosca para el sellado.

SECCION 5: METODOLOGIA E INSTRUMENTACIÓN

5.1 FOTOMETRIA 5.1.1 Definición El término equivale a “ medición de luz”, lo que se traduce en la práctica laboratorial como el proceso de determinar la intensidad de luz absorbida o emitida por una sustancia coloreada. Dicha sustancia coloreada puede ser el resultado del proceso para determinar un analito y, por lo tanto, la medición de ese color final tendrá una relación directa con la concentración de la sustancia. Para transformar la intensidad del color de una solución en unidades de concentración de una sustancia o analito, es necesario conocer la Ley de Lambert-Beer o simplemente Ley de Beer.

El color de una sustancia se produce porque al incidir la luz sobre ella, sus moléculas absorben ciertas longitudes de onda y dejan pasar las correspondientes al color que interpretaremos con nuestros ojos y cerebro.

5.1.2 Ley de Beer La Ley de Beer explica mediante una fórmula matemática que la concentración de una sustancia está en relación directa a la cantidad de luz absorbida o en relación inversa al logaritmo de la luz transmitida. L a relación establecida entre Absorbancia (A) y Transmitancia (T) se expresa de la siguiente manera :

A = log

100 = log 100 – log % T = 2 – log % T %T

En el terreno de la fotocolorimetría, sin embargo, usamos una fórmula práctica que nos permite relacionar la concentración frente a la absorbancia de una solución :

A del desconocido x C del patrón o Standard A del patrón o Standard

Donde C = Concentración del desconocido y A= Absorbancia (en nm).

Si quisiéramos producir una gráfica en papel milimetrado, enfrentando la absorbancia obtenida al medir distintas concentraciones de una misma sustancia, obtendríamos un trazado parecido al de la figura A. Por otro lado, si realizamos lo mismo con la transmitancia, el gráfico sería similar al de la figura B. A mayor concentración, mayor absorbancia

No hay relación directa y lineal entre concentración y transmitancia.

0 Concentración

Fig. A

Concentración Fig. B

Dichas figuras permiten explicar el por qué resulta práctico medir la absorbancia cuando intentamos realizar una curva de calibración en papel milimetrado. De esa forma podremos obtener una curva lineal, que permite visualizar en forma directa que, a mayor concentración, mayor cifra de absorbancia. Si quisiéramos lograr una curva lineal aunque inversa, utilizando la transmitancia, necesitaríamos utilizar papel semilogarítmico. 5.1.3 Fotómetros y Espectrofotómetros. Son los instrumentos esenciales para realizar labores de fotocolorimetría y , en general, para la realización de los procedimientos de bioquímica. Los fotómetros mantienen en su interior ( a manera de tambores) diversos filtros, los cuales dejan pasar ciertas longitudes de onda , las cuales incidiran sobre la solución a ser medida. El resto de las longitudes de onda son absorbidas por este filtro. Los espectrofotómetros, en cambio, permiten mediante prismas o rejillas de difracción seleccionar longitudes de onda más estrechas. En general, estos últimos permiten obtener bandas que, en promedio, no sobrepasan los 0.5 a 1.5 nm, a diferencia de los fitros que obtiene aislamientos de luz con bandas promedios de 5 a 10 nm. 5.1.3.1 Componentes de un Fotómetro o Espectrofotómetro •

Fuente de energía luminosa: Se requieren lámparas específicas para mediciones en el espectro de luz visible ( 360 a 950 nm aproximadamente) y en el ultravioleta ( no visible, de 220 a 360 nm aproximadamente). Para las

•

mediciones con luz visible se usan lámparas de wolframio o tungsteno y para las del rango ultravioleta, son apropiadas las de hidrógeno o deuterio. Selector de longitud de onda : Se usan filtros o monocromadores (prismas, rejillas de difracción). La selección de una determinada longitud de onda dependerá del color de la solución a ser medida.

Los análisis realizados en bioquímica clínica dependen de la medición de la cantidad de luz absorbida por la sustancia examinada.

Una solución de color Una solución de color amarillo, absorberá luz que amarillo, absorberá luz400 a está comprendida entre que está 480 nm, lacomprendida cual corresponde al entre 400 a 480 nm, la color azul.Es decir, cual corresponde al obtendremos una mayor color azul.Es decir, ABSORBANCIA en ese rango

Cuando escogemos una determinada longitud de de onda onda para para medir medir unauna sustancia, sabemos que la la misma misma absorberá absorberá tanta cantidad de esade luzesa como tanta cantidad cantidad de sustancia exista

Para una mejor comprensión, observe la siguiente tabla:

Color de la Solución

Amarillo Verdoso Amarillo Naranja Rojo Púrpura Violeta Azul Azul verdoso Verde azulado

Longitud de Onda Seleccionada (nm)

380-430 430-475 475-495 495-505 505-555 555-575 575-600 600-620 620-700

Color absorbido a dicha longitud de onda. Violeta Azul Verde Azulado Azul verdoso Verde Verde amarillo Amarillo Naranja Rojo

• • •

Cubetas : Son los recipientes donde se colocará la solución a ser medida. Los hay de diverso tamaño y material de construcción. Detectores de Energía Radiante o Luminosa : Se encargan de transformar la energía luminosa en energía eléctrica. Dispositivos de Lectura: Para transformar la energía eléctrica en un valor de absorbancia o transmitancia.

Regist

Fuente de Luz

5.1.4

Filtro ó Monocromador

Cubeta

Detector

Registro

Operación y Control de Instrumentos

5.1.4.1 Los siguientes pasos son instrucciones generales. Cada instrumento tendrá particularidades descritas en el manual del proveedor, así como recomendaciones en relación al mantenimiento. He aquí algunos consejos útiles: • • • •

• • • •

Revisar las condiciones de conexión del aparato a la red eléctrica. Tome mucha atención en el selector de voltaje. Conecte el instrumento a la energía cuando esté seguro del mismo. Encienda el fotómetro o espectrofotómetro . Algunos instrumentos requieren más tiempo que otros para estabilizar su sistema de medición, incluida la lámpara. Basado en los procedimientos de cada análisis, seleccione una longitud de onda determinada. Recuerde Lleve a cero la absorbancia. Convencionalmente se logra trasladar por esto utilizando agua destilada como solución de ajuste. En escrito las aparatos automatizados, la máquina realiza este instrucciones de procedimiento internamente. operación de su Cerciórese si su procedimiento requiere blanco de muestra o equipo a un reactivo. Coloque lo indicado en la cubeta y ajuste a cero la archivo del absorbancia. laboratorio, Mida la absorbancia de estándares y muestras. disponible a todos Finalizado el trabajo, apague el instrumento. Limpie cualquier derrame en el instrumento o en su área de trabajo.

5.1.4.2 Control del Instrumento •

• •

5.1.5

Para exactitud de la absorbancia puede preparar una solución de dicromato potásico con 0.005 g del mismo y llevarla a 1 litro de solución con ácido sulfúrico 0.005 M. Esta solución debe dar una absorbancia de 0.535 a 350 nm de longitud de onda. En el mercado se encuentran además soluciones de absorbancia conocida para diferentes longitudes de onda. Para controlar la exactitud de la longitud de onda seleccionada es factible utilizar cristal de óxido de holmio y verificar que existan picos de absorbancia a 279; 287.6; 333.8; 360.8; 418.5; 536.4 y 637.5 nm. Finalmente puede chequearse la linealidad al comprobar la construcción de una curva o línea recta con una solución coloreada y diluida a distintas concentraciones. Las mediciones se realizaran a una longitud de onda que corresponda a la medición de dicho color. Métodos de Análisis

La medida de la concentración de sustancias por fotometría se realiza vía dos tipos de métodos : los de punto final y los cinéticos. No confundir con la longitud de onda utilizada para la medición, la cual puede ser de espectro visible o no visible (medición con longitud de onda ultravioleta). Igualmente es importante reconocer que para ambos métodos pueden existir variaciones enzimáticas y no enzimáticas, según se utilice o no estos elementos como reactivos. 5.1.5.1 Métodos de Punto Final •

•

En estos métodos se incuban según cada procedimiento, reactivos y muestra, además del mismo reactivo con el patrón o standard, esperando un tiempo determinado para lograr un equilibrio o finalización de la reacción. Al final se leen las absorbancias de la muestra, del patrón o standard, del blanco de reactivos ( si es exigencia del procedimiento) y debe conocerse la concentración del patrón. Se procede al cálculo mediante la ecuación presentada en el acápite 3.1.2 : Concentración de la muestra = Factor x (Absorb. Muestra-Abs. Blanco) El Factor es obtenido de la siguiente manera : Concentración del patrón o Standard Factor = (Abs. Del Patrón-Absorbancia Blanco)

Calibre diariamente colocando un Standard en cada corrida. De esta forma obtendrá un factor confiable para su prueba

Eliminar de estos cálculos la Absorbancia de Blanco de Reactivos si no es procedente. •

En algunas reaciones se recomienda el uso de blanco de muestra para reducir la interferencia que algún compuesto en la misma pudiera causar al proceso.

•

Sencillamente mida la absorbancia de este blanco de muestra y proceda a la sustracción con la absorbancia de la muestra. Finalmente, Ud. puede realizar el cálculo de la concentración de una sustancia o analito, construyendo una curva a partir de diluciones del patrón o Standard o con concentraciones ya conocidas del mismo componente. Coloque en una hoja milimetrada un gráfico de dos ejes. En el eje horizontal sitúe las concentraciones utilizadas y en el eje vertical las absorbancias obtenidas para cada una. Luego una las intersecciones logradas entre absorbancias y concentraciones y obtenga una línea recta. Para lograr conocer la concentración de una muestra desconocida, extrapole sus valores de absorbancia en la curva. Proceda a las respectivas intersecciones Eje vertical : Absorbancias

10 Trace una recta uniendo los puntos

Eje horizontal: Concentración

5.1.5.2 Métodos Cinéticos En estos métodos se determinan variaciones en la absorbancia de una reacción a través de mediciones por intervalos de tiempo, generalmente no mayor a los 5 minutos (varía de acuerdo al procedimiento específico y al tipo de instrumentación disponible). Por lo tanto, habrá una serie de absorbancias obtenidas durante el lapso de tiempo total. Para ello, se consigue calcular una delta A, mediante la sustracción entre la segunda determinación y la primera, la tercera y la segunda y así consecutivamente, terminando por promediar dichas diferencias y aceptando ese promedio como delta A. Luego, se procede a multiplicar dicha cifra por el factor proporcionado por el fabricante. Dicho factor es calculado a través de operaciones matemáticas complejas que incluyen la necesidad de conocer el coeficiente de extinción molar y el paso de luz o distancia óptica de la cubeta. Dada la complejidad de esta metodología, es preferible utilizarla con kits comerciales y con instrumentación adecuada que permita una adecuada

selección de la longitud de onda necesaria para la medición y un control preciso de la temperatura de reacción.

5.1.5.3 Medición de Concentración de Enzimas Especial atención merece el conocimiento metodológico en la medición de enzimas. Estas proteínas se encuentran en cantidades tan pequeñas, que la forma práctica de valorar su concentración es midiendo su actividad en las reacciones que catalizan. Para ello, se introducen sustancias que acoplados al sustrato o al producto permiten valorar en forma colorimétrica o mediante el rango ultravioleta dicha acción. •

El ejemplo clásico es la medición de la actividad de la deshidrogenasa láctica. Dicha enzima interviene en la siguiente reacción :

DHL Piruvato + NADH2

NAD + Lactato

•

Como se observa, en la reacción existen dos coenzimas : el NAD (compuesto en estado de oxidación) y el NADH2 (forma reducida de la coenzima). Se ha observado que la forma reducida de la coenzima (NADH2) absorbe luz a 340 nm (rango ultravioleta), razón por la cual si la reacción se midiera de izquierda a derecha y, por lo tanto , se midiera la producción de NAD, la medición de la absorbancia sería en forma decreciente a lo largo de un tiempo. Si, por el contrario, la medición de la reacción fuera a la inversa, se estaría midiendo el incremento en NADH2, por lo que la absorbancia sería medida en forma creciente a ciertos intervalos de tiempo. • Esta observación ha permitido adoptar el mismo sistema para la medición de enzimas, acoplando ya sea la medición de NADH2 o NAD, estableciendo una manera segura de determinar enzimas en el rango UV. 5.2 CENTRIFUGAS 5.2.1 Definición Instrumental destinado al proceso de centrifugación, técnica de separación por la cual las partículas de una solución son separadas lejos de un centro de rotación, gracias al movimiento originado por la fuerza centrífuga. Dicha separación dependerá de la masa y la forma de las partículas. 5.2.2 Tipos de Centrífugas Existen dos tipos fundamentales de centrífuga en el trabajo de un laboratorio de Bioquímica. Estos tipos dependen del cabezal o rotor que soporta los envases donde se colocan los tubos. Dichos cabezales pueden ser horizontales o angulares. En los primeros, los tubos se centrifugan en forma horizontal, en forma paralela al eje de rotación. En

27 Centrífuga Angular

los llamados angulares, la disposición de los tubos en ángulo con respecto al eje, permite una centrifugación que empuja las partículas hacia el fondo y hacia una pared lateral del tubo (ver fotografías).

5.2.3

Cálculos de velocidad

La aceleración en una centrífuga se expresa de manera estandarizada como múltiplo de la aceleración de la gravedad. Así, el número de veces de aceleración de la gravedad se indica como Fuerza Centrífuga Relativa (FCR) y se expresa en “g”. -5

FCR = 1.12 x 10

(rpm) x r

Donde r = radio de giro y rpm = revoluciones por minuto. De esto se desprende que una centrifugación a 10,000 g variará en rpm en una centrífuga con radio de giro de 5cm frente a una de 10 cm. 5.2.4 • • •

• •

Recomendaciones especiales Realizar mantenimientos preventivos en los carbones del instrumento y en las mediciones de rpm mediante un tacómetro. Calibrar si fuera posible al menos una vez al año ( esto se consigue por medio de alguna empresa que brinde dicho servicio metrológico). No es lo mismo calibrar que controlar las rpm en forma interna. Centrifugar con responsabilidad, manteniendo la tapa cerrada durante el proceso y esperando el tiempo necesario para el frenado completo . Eliminar la costumbre de abrir la cubierta del instrumento para apurar el proceso de frenado en forma manual. Realizar periódicamente una limpieza general y aplicar normas de bioseguridad en caso de rotura de tubos en su interior. Prevenga contaminaciones y accidentes balanceando eficazmente los tubos que introduce. Mantenga una ficha de mantenimiento en el archivo general de Mantenimiento de Equipos.

5.3 ANALIZADORES AUTOMATIZADOS Si bien no todos los centros pueden tener equipos de naturaleza automatizada o semiautomatizada, es pertinente para los fines del presente manual dar algunas definiciones en relación a este tipo de equipos. 5.3.1 Clasificación Los analizadores pueden clasificarse de la siguiente manera: 5.3.1.1 Según su grado de automatización :

• •

Automatización completa : Son equipos que partiendo de suero u otro líquido susceptible de análisis, son capaces de realizar todos los pasos técnicos hasta la entrega de resultados en forma de concentraciones. Automatización parcial o Semiautomatización : Son aquellos que requieren de algún manipuleo previo del suero o líquido a analizar, antes de suministrarlo a la máquina para que lo siga procesando.

Analizador Semiautomatizado

Analizador Automatizado

5.3.1.2 Según la secuencia de análisis • •

Seriada : Implica el análisis de las muestras en forma secuencial, una detrás de otra, no pudiendo existir dos muestras distintas que puedan estar en la misma etapa operativa. Paralela : El analizador trabaja varias muestras en forma simultánea, las cuales van pasando por los mismos pasos de una técnica .

5.3.1.3 Según la independencia o no de cubetas o recipientes de reacción • •

5.3.2

Discretos : Sea automatizado o no, cada muestra con sus correspondientes reactivos se encuentra en un recipiente separado. Aunque una muestra puede cambiar de recipiente, jamás comparte el mismo con otra muestra. De flujo continuo : Todas las muestras circulan a través de un mismo tubo, de tal manera que varias muestras distintas se encuentran simultáneamente, una detrás de otra , en el mismo recipiente. Mantenimiento de Analizadores automatizados :

Como cualquier instrumento, los analizadores automatizados requieren la puesta en marcha de un plan de mantenimiento. 5.3.2.1 Planifique anualmente el mantenimiento que le dará a fotómetros, centrífugas, estufas, pipetas, refrigeradores y termómetros. Incluya igualmente en fichas separadas, el correspondiente al analizador de uso. 5.3.2.2 Transfiera por escrito las principales indicaciones que el fabricante aconseja para el mantenimiento diario, semanal, mensual o anual, según corresponda. Puede encontrar útil la ficha de mantenimiento de equipos en la sección de anexos.

5.3.2.3 Delegue a una persona la responsabilidad del mantenimiento . Si el laboratori o cuenta con personal suficiente, puede dividirse este trabajo entre varias personas. 5.3.2.4 Mantenga el contacto y los datos precisos acerca del distribuidor local de su instrumento, con el objeto de coordinar mantenimientos preventivos y necesidades de reparación. 5.3.2.5 En relación a calibraciones, los equipos citados en este acápite no requieren estos procedimientos. Sustituya esta acción mediante verificaciones mensuales del rendimiento del equipo, basado en la performance buena o no del control de calidad interno. Es buena práctica pegar un sticker en alguna zona visible del aparato y realizar un check por cada mes en que se verifica el instrumento. Unido al mantenimiento arriba citado, Ud. habrá cumplido con el cuidado de este útil equipo.

5.4 PIPETAS 5.4.1 Definición Instrumentos empleados para trasvasar un volumen líquido de un recipiente físico hacia otro. Se emplea en los análisis de laboratorio tanto para reactivos como para muestras biológicas. 5.4.2

Clasificación

5.4.2.1 Pipetas de vidrio. Pueden ser volumétricas (aspiran y transportan volúmenes) y graduadas (permiten las aspiración y transporte de volúmenes medidos). En la rutina diaria de aspiración y trasvase de reactivos y muestras este tipo de pipetas deberían ser reemplazadas en lo posible por pipetas mecánicas,por su mayor tiempo de vida, precisión y seguridad biológica. 5.4.2.2 Pipetas Mecánicas: Las llamadas micropipetas mecánicas permiten trabajar en la rutina diaria con volúmenes de 0.5 a 1000 ul. Pueden ser de desplazamiento de aire (indirectas ) o de desplazamiento directo. Por ser las pipetas ideales para el trabajo bioquímico se citan más abajo recomendaciones sobre su uso. 5.4.2.3 Pipetas de Sanz : Recipientes con tapa ajustable y dispensador, útiles para la medición de muestras y para la distribución repetida de reactivos en el rango de 5-100 ul. . 5.4.3 • • • •

Recomendaciones de Uso Las pipetas mecánicas o micropipetas se cargan y descargan merced a la acción del dedo pulgar sobre un pistón. Las pipetas mecánicas de pistón presentan tres posiciones en este extremo:l a normal de reposo, la intermedia de aspiración y la de presión a fondo de dispensación. Estas pipetas se cargan apretando el émbolo hasta la posición intermedia y luego se afloja la presión para llenar la punta. Para descargarlas se aprieta el émbolo hasta el fondo. Al aspirar la muestra con la punta, es importante la técnica de secado de la misma. Mediante un papel absorbente o tela, realizar dos movimientos suaves hacia abajo a 90 ° uno con respecto del otro. Al realizar este secado, tener

•

presente iniciarlo por encima del nivel de líquido en el que la punta penetró y no tocar el líquido, ya que de esta forma se extraería parte del mismo. Finalmente, depositar la muestra o líquido en el contenedor o tubo que recibirá el primer volumen. Puede introducirse la punta hasta cierta profundidad y expeler la totalidad de lo aspirado con suavidad. Dado que las puntas utilizadas para estas micropipetas son no humedecibles, no existe el peligro de arrastre de solvente fuera del tubo o receptáculo que lo contiene. Incluso , pueden realizarse lavados finales con el solvente o reactivo final, desechando la punta al final de este acto.

5.4..4 Mantenimiento de Pipetas Mecánicas 5.4.4.1 No es posible dar recomendaciones específicas para la amplia variedad de modelos existentes en el mercado. Síganse los consejos descritos abajo. 5.4.4.2 Mantener como en cualquier equipo de laboratorio, una ficha o formato de mantenimiento individual por cada pipeta . 5.4.4.3 Mantener limpia cada pipeta en su aspecto externo. Si es posible y el fabricante lo recomienda, realizar periódicamente algún mantenimiento interno como aceitado de piezas. 5.4.4.4 En el caso de pipetas mecánicas que usan puntas descartables para las disposiciones de volumen, prevenir el abastecimiento de ellas; no es buena práctica de laboratorio reutilizar bajo ningún concepto las mismas. 5.4.4.5 Contactarse como mínimo una vez al año para la calibración de este material bajo una entidad especializada en el rubro de metrología. 5.4.4.6 Dentro de la programación de mantenimiento , disponer una periodicidad no mayor de 3 meses para la verificación de la calibración del instrumento. 5.4.4.6 Para la prueba respectiva de verificación de volumen, pueden seguirse el método de análisis gravimétrico o de pesada de volumen, propuesto por la Organización Mundial de la Salud en su Manual de Mantenimiento y Reparación del Equipo de Laboratorio . 5.5 Baño María 5.5.1 Definición Dispositivo para calentar agua. El calor se obtiene a partir de un módulo eléctrico. Se utiliza para trabajos a 25°, 30°, 37°, 42° ó 56 °, siendo de utilidad en bioquímica los tres primeros rangos. 5.5.2 • • •

Recomendaciones de Uso Controlar el nivel de agua, de modo que se mantenga por encima del nivel de la solución que se ha de incubar. Mantener la tapa del baño maría abierta cuando se proceda a la incubación de recipientes o tubos , evitando contaminaciones y la dilución del material por el agua condensada. Cambiar el agua con regularidad para evitar la proliferación de algas, bacterias u hongos.

5.5.3 Mantenimiento del Equipo 5.5.3.1 Desmontar los sistemas de circulación de agua para eliminar algas e impurezas. 5.5.3.2 Los termómetros de uso en el equipo deben verificarse al recibirlos de los proveedores y después cada 3 meses, frente a un patrón : hielo o agua hirviendo. 5.5.3.3 Mantener una ficha ó formato individual para mantenimiento, siguiendo las recomendaciones arriba citadas, así como las sugeridas por el fabricante.

SECCION 6: PROCEDIMIENTOS

6.1 GLUCOSA : METODO ENZIMATICO CON GLUCOSA OXIDASA

6.1.1

Presentación

La glucosa constituye el monosacárido de mayor uso como fuente de energía a nivel celular. La utilización de la misma se produce a través del metabolismo de carbohidratos de origen exógeno y endógeno por diversas rutas bioquímicas. Finalmente, la penetración de la glucosa a nivel celular requiere la presencia de insulina, óptima en cantidad y calidad. Precisamente, la disminución en el tenor de esta última y la resistencia a su acción constituyen algunos de los elementos causales de la aparición de diabetes mellitus. La hiperglicemia , como hallazgo común a diabetes mellitus puede derivar en acidosis metabólica y cetosis, debido a la incapacidad de utilizar la glucosa como fuente energética y trasladarse dicha necesidad a la utilización de grasas como alternativa. El hallazgo de niveles elevados de glucosa también se observan en diversos desordenes como enfermedades del páncreas, endocrinopatías (acromegalia, Síndrome de Cushing, Tirotoxicosis), uso de fármacos (esteroides, anticonceptivos orales) y asociada a la diabetes gestacional.

6.1.2

Principio del Procedimiento

Se describirá el método enzimático de la glucosa-oxidasa, el cual corresponde a la metodología recomendada y empleada como tal para la correspondencia con los rangos referenciales internacionales. Los laboratorios que no empleen esta metodología seguiran sus instructivos de acuerdo a las normas del fabricante del kit comercial o de la referencia bibliográfica utilizada para el desarrollo de la prueba. Se sugiere en todo caso, mantener dichas instrucciones al alcance del personal que labora en el área y para efectos de auditorías y/o supervisiones. 6.1.3

Descripción del método

Ante la presencia de glucosa en el suero o plasma analizado , ésta es oxidada por acción de la Glucosa Oxidasa, produciendo Acido Glucónico con liberación de Peróxido de hidrógeno. Luego, gracias a la acción de la Peroxidasa, este Peróxido libera agua y Oxígeno. La molécula de Oxígeno es capatada por la 4 Aminofenazona, el cual junto al fenol(en algunos casos podría ser el hidroxibenzoato u otro aceptor de oxígeno), forma un compuesto cromógeno de color rosado-grossella, el cual se mide fotométricamente (entre 490 a 530 nm). Dicha medición del cromógeno guarda una relación directa con la concentración previa de glucosa. Glucosa + O2 + H2O-----GOD--------- Acido Glucónico + H2O2 (Peróxido de Hidrógeno) 2H2O2 + 4-Aminofenazona + Fenol------POD-------- Cromógeno(quinona) + 4 H2O 33

6.1.4

Tipo de Muestra Primaria

Puede utilizarse suero o plasma. Condición importante: Ayuno de 8 horas. La toma de muestras para petitorios de Glucosa Post Prandial requieren de la ingesta de alimentos ricos en carbohidratos 2 horas antes de la toma de muestra (ej.: un desayuno convencional con bebida azucarada y 2 porciones de pan ). Previamente se requerirá una toma de muestra basal en ayunas.

6.1.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recolección 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mínimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recolección al vacío(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegúrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la sección de Toma de Muestras para las generalidades de la venopunción. 6.1.4.2 Obteniendo Plasma En caso de utilizar plasma, recurra a la utilización de 01 tubo de ensayo provisto con EDTA-K como anticoagulante. En los sistemas de recolección al vacío es fácil obtener la proporción adecuada de mezcla, obteniendo el volumen de muestra fijado por el fabricante. En caso de utilizar anticoagulante, cuya preparación se realiza en el laboratorio, siga las instrucciones siguientes : Mezcle 100 g de EDTA-K y 200 g de Fluoruro de sodio hasta homogenizar en un polvo. Se requerirá 5 mg de dicha preparación por cada 2 ml de sangre obtenida. Otros anticoagulantes como heparina, oxalato o fluoruro no interfieren en la reacción, por lo que también pueden emplearse. 6.1.4.3 Separación de la Muestra y Preservación Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de glóbulos rojos. Sin la utilización de aditivos, la glucosa en muestras de sangre completa se metaboliza a razón de 7 mg/dl/hora a temperatura ambiente y a 2 mg/dl/hora a 4°C. Sin embargo, separando a tiempo el suero o plasma, la glucosa es estable por 48 horas a temperaturas de refrigeración y aproximadamente 6 horas a temperatura ambiente. En caso contrario, al no existir condiciones para una separación oportuna de la muestra de sangre completa, utilice como aditivo el fluoruro de sodio: 2 mg del mismo por cada mililitro de sangre obtenida. Esto preserva la muestra en refrigeración por unas 48 horas.

6.1.5

Equipos y Materiales

6.1.5.1 Equipo de Medición Se requiere un fotómetro o espectrofotómetro con capacidad de lectura entre 490 a 530 nm. En el caso de espectrofotómetros se aconsejan lecturas a 505 nm. Los equipos automatizados suelen poseer este filtro, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informándose por el catálogo del mismo. 6.1.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material. 6.1.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recolección de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recolección del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Baño María : Para la respectiva incubación durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37°C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reacción, en el caso de preparación de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotómetro o espectrofotómetro. e) pHmetro en el caso de preparación de reactivos. f) Reloj o timer. 6.1.6

Reactivos

6.1.6.1 Reactivo Comercial Resulta una práctica muy generalizada la utilización de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribución en el mercado. La única indicación sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relación al uso y preservación de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. No son aceptables dentro de las normas actuales, el uso de los insertos o facsímiles comerciales, los cuales pueden ser almacenados como documentos externos de consulta. Es necesario, por lo tanto, transcribir los pasos de la técnica de una manera sencilla para el uso del personal del área de trabajo, manteniendo la misma en revisión y actualización periódica si fuera necesario. 6.1.6.2 Reactivo Preparado en el Laboratorio A continuación se describe el procedimiento para la preparación de reactivo “hecho en casa”, siguiendo la metodología enzimática(glucosa-oxidasa) :

a)Buffer Fosfato : Verificar al final un pH de 7.0 +/- 0.05 •

•

A un volumen de 800 ml de Agua destilada, añadir en el siguiente orden: Fosfato hidrogenado disódico dihidratado (Na2HPO4.2H2O)---- 12.95g Fosfato potásico dihidrogenado (KH2PO4)------ 4.95 g Azida sódica (NaN3)----- 0.5 g Disolver y completar hasta 1 litro de solución. Estable por 3-4 meses a 2-8°C.

b)Reactivo de Color •

A un volumen de 100 ml del buffer arriba descrito, añada lo siguiente en el orden indicado: 4-Aminofenazona----- 16 mg GOD (Glucosa Oxidasa: Sigma G 7016)----- 1800 Unidades POD (Peroxidasa: Sigma P 8250)------- 100 Unidades Fenol ------ 105 mg Tween 20 (Sigma P1359)------ 50 ml • Reconstituya el GOD y POD con el Buffer Fosfato. Dispense en viales separados la cantidad de unidades necesarias para cada preparación. Congele estos viales. • La solución así preparada es estable en frasco color caramelo por 2 semanas a 2-8 °C.

c)Acido Benzoico Disuelva 1 g de acido benzoico en agua y complete hasta 1 litro de solución. Almacene a temperatura ambiente hasta el consumo del mismo o deterioro. d)Solución Stock de Glucosa ( 1 g/ L) Disuelva 1 g de glucosa en ácido benzoico hasta lograr 100 ml de solución. Estable por 6 meses a temperatura ambiente . e)Solución Standard de Glucosa Para obtener un Standard con 100 mg/dl de glucosa, disuelva 10 ml de la solución stock en ácido benzoico hasta completar 100 ml de solución. Estable por 6 meses a temperatura ambiente.

6.1.7

Procedimientos

6.1.7.1 Reactivo Comercial Mantenga las recomendaciones del proveedor. Recuerde la necesidad de transferir las mismas en un escrito propio de su manual de Procedimientos. Puede resultar útil el modelo adjunto en Anexos.

6.1.7.2 Reactivo Preparado en el Laboratorio •

Dilución de Standards, Muestras y Control

Pipetee lo siguiente en tubos identificados de 13 x 100 mm:

Muestra

Control

Agua destilada(ml) 1.9 Solución Standard De Glucosa( ml) 0.1 Muestra/Control --

1.8

1.7

1.6

1.5

1.9

0.2 --

0.3 --

0.4 --

0.5 --

0.1

Mezcle bien. •

Desarrollo de Color

Pipetee lo siguiente en otro set de tubos :

ml Reactivo De Color

Blanco

1.2

Agua Destilada 0.1

---

Standard Diluido ---

0.1

---

Muestra/ Control --Diluido

0.1

---

0.1

---

0.1

---

Muestra 1.2

Control 1.2

---

0.1

Mezcle todos los tubos. Incube a 37°C en baño maría por 15 minutos. Remueva del baño y deje atemperarse a temperatura ambiente. Lea en fotómetro o espectrofotómetro a 505 nm ó filtro verde los Standards, muestras y Control. Blanquee previamente a 0 con el Blanco preparado.

6.1.8

Cálculo de Resultados

El Standard S1 representa 100 mg/dl de concentración de glucosa. El Standard S2 representa 200 mg/dl de concentración de glucosa. El Standard S3 representa 300 mg/dl de concentración de glucosa. El Standard S4 representa 400 mg/dl de concentración de glucosa. El Standard S5 representa 500 mg/dl de concentración de glucosa. Represente en un papel milimetrado los valores de absorbancia de S1 a S5 en el eje vertical de un gráfico y las respectivas concentraciones en el eje horizontal. Asegúrese de obtener una curva lineal hasta los 500 mg/dl. Posteriormente calcule la concentración de muestras y controles ploteando la absorbancia obtenida en el gráfico diseñado.

Una vez que la linealidad está asegurada, no es necesario preparar gráficos de standards cada vez que se analizan muestras de pacientes. Utilice el Standard S2 (200 mg/dl de glucosa) en cada corrida y calcule la concentración de cada muestra utilizando la siguiente fórmula :

Concentración de la muestra =

Absorbancia de la muestra -------------------------------- x 200 mg/dl Absorbancia del Standard S2 38

6.1.9 Procedimientos de Control de Calidad. Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena práctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el número de ellas) , la participación de al menos un suero control. Dependerá de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio. 6.1.10 Interferencias Interfieren : hemoglobina ( > 0.5 g/dl), triglicéridos ( > 1,250 mg/dl) y bilirrubina (> 10 mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos de concentración. Niveles altos de acido ascórbico y ácido úrico pueden interferir disminuyendo los niveles de glucosa al interferir con el desarrollo de la reacción de color. 6.1.11 Intervalos de Referencia Biológica

Valores de Referencia Neonatos a Término : 30-90 mg/dl Valores de Referencia Adultos( Ayuno de 8 horas) : 70-110 mg/dl Valores de Referencia Glucosa Post Prandial (2 horas): Menor de 140 mg/dl 6.1.12 Valores de Alerta/Críticos Reportar inmediatamente, previo aviso al Médico o Responsable del Laboratorio , si los valores obtenidos son : Glucosa (Adulto) : Menor de 40 mg/dl ó Mayor de 500 mg/dl. Glucosa (Neonato): Menor de 40 mg/dl ó Mayor de 200 mg/dl 6.1.13 Interpretación de Laboratorio 6.1.13.1 Elevaciones de Glicemia : Se considera hiperglicemia todo valor que excede los valores referenciales para el laboratorio. Sin embargo, tienen especial interés aquellas cifras que sobrepasan el valor de 126 mg/dl y se repite en dos días distintos. Las condiciones productoras de hiperglicemia han sido referidas brevemente en el apartado 6.1. El médico tratante evaluará cada caso específico. 6.1.13.2 Criterios diagnósticos de Diabetes Mellitus: • Síntomas de diabetes má un glicemia casual en cualquier momento del día mayor o igual a 200 mg/dl • Glucosa en ayuno mayor o igual a 126 mg/dl • Glucosa plasmática a las 2 horas mayor o igual a 200 mg/dl durante una prueba de tolerancia. 6.1.13.2 Disminución de glicemia : Los valores por debajo del valor referencial inferior del laboratorio, pueden ser considerados hipoglicémicos. Diversas condiciones como hipoglucemia reactiva, hipoglucemia inducida por etanol o fármacos,

lesiones anatómicas que derivan en insulinomas, insuficiencia corticosuprarrenal, hipopituitarismo, neoplasias extrapancreáticas y enfermedad hepática masiva, pueden condicionar valores hipoglicémicos transitorios o continuos. 6.1.14 Especificaciones de desempeño 6.3.14.1 Linealidad : Varía según los fabricantes. Se sitúa aproximadamente en 500 mg/dl. 6.1.14.2Límite de detección : Igualmente, los diferentes productos citan cifras sobre 0.23 mg/dl. 6.1.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, esta metodología arroja coeficientes de variación entre 1.9% y 2.7 %, siendo menores las variaciones a mayor concentración de las muestras. 6.1.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variación se sitúan entre 0.9 y 1.2 % para la metodología. 6.1.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la sección de Bioseguridad Los procedimientos mencionados utilizan azida sódica y fenol, los cuales son tóxicos y cáusticos. No inhalar ni exponer piel y mucosas al contacto de estos elementos.

6.1.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.1.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser mayor a +/- 0.1°C. 6.1.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en incubación. 6.1.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.1.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.

6.2

PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA

6.2.1 Presentación Esta prueba se solicita en pacientes cuyo nivel de glucemia es dudoso frente aun diagnótico de diabetes mellitus, durante el embarazo o por razones epidemiológicas para detectar diabetes y disminución de la tolerancia a la glucosa. 6.2.2 Principio del Procedimiento. Se basa en proporcionar una sobrecarga de glucosa a un individuo, con la finalidad de determinar laboratorialmente la calidad de su respuesta fisiológica, la cual debería consistir en un aumento de los niveles de insulina que permitan mantener la glicemia bajo cifras aceptables. 6.2.3 Descripción del método Luego de tomar una glucosa basal, el paciente ingiere una cierta cantidad de glucosa, permitiendo luego de dos horas la recolección de una nueva muestra de sangre. Las muestras de sangre se colectan bajo normas convencionales y se procesan según el procedimiento explicado en el acápite 6.1, siguiendo la metodología de determinación enzimática de glucosa . 6.2.4 Tipo de Muestra Primaria 6.2.4.1 Se obtiene suero de la manera convencional, primero en una muestra basal y luego a las dos horas de ingerida la solución de glucosa. Se puede emplear igualmente plasma, siguiendo las recomendaciones del acápite 6.1. 6.2.4.2 Si las muestras no se van a procesar en forma inmediata, se aconseja recolectar en tubos con fluoruro de sodio como preservante. 6.2.5 Equipos y materiales 6.2.5.1 Equipo de Medición Se requiere de un fotómetro o espectrofotómetro que reúna las caracerísticas expuestas en 6.1.5.1. 6.2.5.2 Material de vidrio. Respetar las indicaciones en 6.1.5.2 6.2.5.3 Otros Implementos. Asegurar lo indicado en 6.1.5.3. 6.2.6 Reactivos 6.2.6.1 Se utilizan los reactivos citados en el acápite 6.1 . 6.2.6.2 Se requiere glucosa anhidra . 6.2.6.3 Agua potable temperada para la disolución de la glucosa. 6.2.6.4 Un vaso adecuado para contener al menos 375 ml de solución. 6.2.6.5 Opcionalmente, se puede requerir jugo de limón.

6.2.7 Procedimientos 6.2.7.1 Debe instruirse previamente al paciente con las siguientes medidas: • Tres días antes de la prueba, debe alimentarse con no menos de 150 g. De carbohidratos y llevar una actividad física normal. • Llegar al laboratorio a la hora solicitada, en la mañana. • El día del análisis concurrir en ayuna de 10 horas. Puede tomar agua durante ese tiempo. Está prohibido fumar . • Indicar al laboratorio si está tomando medicamentos o se encuentra con alguna probable infección. 6.2.7.2 Tomarle una muestra de sangre en ayunas. 6.2.7.3 Darle de beber 75 g. De glucosa disuelto en 250 a 300 ml de agua temperada. Deberá beberlo en un lapso de 5 minutos. 6.2.7.4 En el caso de niños proporcionar 1.75 g de glucosa por Kg. De peso. Y hasta un máximo de 75 g de glucosa. 6.2.7.5 Se puede proporcionar la solución con algunas gotas de limón para evitar las nauseas y el sabor de la solución. 6.2.7.6 Salvo indicaciones de su médico para otras tomas durante su espera, recolectar la segunda muestra a las dos horas de haber iniciado la ingestión de la glucosa. 6.2.7.7 Si ocurrió alguna eventualidad como nauseas y vómitos que impidan la realización de la prueba, citar al paciente en una semana, salvo indicación contraria de su médico. 6.2.8 Cálculo de resultados Las muestras son sometidas al análisis convencional de glucosa. Referirse al acápite 6.1.8 para explicaiones. 6.2.9 Procedimientos de Control de Calidad Se mantienen las mismas condiciones de la prueba de glucosa. Mantener la glucosa en un ambiente seco, para evitar hidrataciones y contaminaciones. 6.2.10 Interferencias Definidas en el acápite 6.1.10. 6.2.11 Intervalos de referencia biológica 6.2.11.1 Tolerancia normal a la glucosa : Cuando a las dos horas posteriores a la carga, presenta glucemia menor de 140 mg/dl. 6.2.12 Valores de Alerta /Críticos No aplica. 6.2.13 Interpretación de Laboratorio 6.2.13.1 Tolerancia normal: Valores a las dos horas menores a 140 mg/dl.

6.2.13.2Intolerancia a la glucosa : Valores a las 2 horas mayor o igual a 140 mg/dl y menor a 200 mg/dl. 6.2.13.3Diagnóstico de diabetes : Valores a las 2 horas mayores de 200 mg/dl. 6.2.14 Especificaciones de desempeño Sólo aplica la correspondiente al método analítico, citado en 6.1.14 6.2.15 Precauciones de Seguridad 6.2.15.1 Mantener informado al paciente sobre el procedimiento. 6.2.15.2Es aconsejable determinar la glucosa basal en forma rápida, con el objeto de verificar posible hiperglicemia en rangos de alerta 6.2.15.3 Aplican las recomendaciones en la sección de metodología de glucosa. 6.2.16 Potenciales fuentes de variabilidad Aplican las correspondientes a la metodología utilizada en la determinación de glucosa.

6.3

COLESTEROL TOTAL : METODO ENZIMATICO CON COLESTEROL OXIDASA

6.3.1

Presentación

El colesterol es un componente importante de la membrana celular y de obligada necesidad en la síntesis de hormonas esteroideas y sales biliares. Su síntesis se realiza a nivel hepático, siendo luego transportado en sangre constituyendo estos grandes complejos moleculares denominados lipoproteínas. El mayor porcentaje del colesterol se encuentra repartido en la forma LDL y HDL de estas lipoproteínas. Es conocida la importancia de este elemento dentro de las enfermedades cardiovasculares y numerosos estudios han probado la relación directa entre cardiopatía y elevación de este componente. Como parte de las actividades preventivas y de diagnóstico en este grupo de enfermedades, el laboratorio juega un rol importante, brindando información y permitiendo el estudio de valores referenciales en este componente y sus fracciones. 6.3.2

Principio del Procedimiento

Se describe el método enzimático de Colesterol oxidada, ampliamente utilizado hoy en día. Los laboratorios que no empleen esta metodología seguiran sus instructivos de acuerdo a las normas del fabricante del kit comercial o de la referencia bibliográfica utilizada para el desarrollo de la prueba. Se sugiere en todo caso, mantener dichas instrucciones al alcance del personal que labora en el área y para efectos de auditorías y/o supervisiones. 6.3.3

Descripción del Método

El colesterol se encuentra en sangre en forma de éster de colesterol y en forma libre. Para la reacción citada, los ésteres de colesterol son hidrolizados por la enzima colesterol esterasa. El colesterol libre obtenido de esta reacción es luego oxidado por la colesterol oxidasa , formando una cetona que libera peróxido de hidrógeno. Posteriormente, este peróxido de hidrógeno de desdobla en agua y oxígeno, siendo éste último capturado por la 4-aminofenazona ( en algunos kits comerciales la 4aminoantipirina) que en presencia de fenol forma una quinoneimina coloreada de rosado. Este componente puede ser medido a 500-505 nm o utilizando filtro verde de fotómetro ( 490-530 nm).

Colest. esterasa

Ester de Colesterol + H2O

Colesterol + Acido Graso Colest. Oxidasa

Colesterol + ½ O2 + H2O Hidrógeno)

Colestenona + H2O2 (Peróxido de Peroxidasa

2 H2O2 + 4-Aminofenazona + Fenol

Quinoneimina + 4H2O

6.3.4

Tipo de muestra Primaria

Se puede utilizar suero ó plasma . Condición importante : Ayuno de 12 horas. 6.3.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recolección 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mínimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recolección al vacío(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegúrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la sección de Toma de Muestras para las generalidades de la venopunción. 6.3.4.2 Obteniendo Plasma En caso de utilizar plasma, recurra a la utilización de 01 tubo de ensayo provisto con heparina como anticoagulante. En los sistemas de recolección al vacío es fácil obtener la proporción adecuada de mezcla, obteniendo el volumen de muestra fijado por el fabricante. Otros anticoagulantes podrían interferir en la reacción. Consulte al respecto el instructivo del proveedor. 6.3.4.3 Separación de la Muestra y Preservación Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de glóbulos rojos. La muestra es estable 7 días a 2-8°C y 3 meses a –20°C. 6.3.5

Equipos y Materiales.

6.3.5.1 Equipo de Medición Se requiere un fotómetro o espectrofotómetro con capacidad de lectura entre 490 a 530 nm. En el caso de espectrofotómetros se aconsejan lecturas a 505 nm. Los equipos automatizados suelen poseer este filtro, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informándose por el catálogo del mismo. 6.3.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo(13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material. 6.3.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recolección de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recolección del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Baño María : Para la respectiva incubación durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37°C.

Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reacción, probetas, en el caso de preparación de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotómetro o espectrofotómetro. e) Reloj o timer. 6.3.6

Reactivos Definido el kit que usará, recuerde trasladar por escrito el procedimiento específico.

6.3.6.2 Reactivo Comercial Recomendamos utilizar material comercial para la metodología empleada en la determinación de este componente. Estos elementos aseguran precisión y facilitan el trabajo de un laboratorio de cualquier nivel. Las características y procedimientos anotados posteriormente se ciñen a la metodología ya reseñada. 6.3.6.3 Reactivos Provistos en Kits Comerciales • • • • • •

•

6.3.7

Standard : El patrón ó Standard generalmente se provee en concentraciones de 200mg/dl en forma de solución. Enzimas : Se provee una suspensión conteniendo : Lipasa fungal ó Colesterol esterasa, Colesterol oxidasa , Peroxidasa . Reactivo 4-Aminofenazona. Reactivo Fenol . Los reactivos arriba indicados expiran en la fecha grabada en la etiqueta del fabricante. Conservar a 2-8°C. Reactivo de Trabajo : Ceñirse a las recomendaciones del fabricante en cuanto a proporciones de mezcla de cada uno de los elementos reactivos del kit. Generalmente, el reactivo de trabajo es estable por un mes a temperatura de refrigeración ( 2-8 °C). Indicios de inestabilidad : Procurar vigilar la presencia de turbidez ó partículas tanto en el Standard como en el reactivo de trabajo. Además, vigilar las recomendaciones del proveedor en cuanto a la absorbancia del blanco de reactivo, la cual tiene un límite .

Procedimientos

El siguiente es un procedimiento que indica proporciones estandarizadas por la mayoría de fabricantes : • Pipetee en tubos de ensayo de 13 x 100 mm los siguientes componentes : Muestra Reactivo(ml)

Blanco

React. De trabajo

2.0

Standard

0.02

Standard

Muestra

Mezclar bien e incubar a 37°C en baño maría por 5 minutos. Retirar del baño de agua y Muestra ó Control --0.02 preparar el espectrofotómetro ó fotómetro para la lectura respectiva. 46

• •

6.3.8

Leer la absorbancia del blanco, standard y muestra a 500-505 nm ó filtro verde (490-530 nm) en fotómetro con filtros. Blanquee a cero previamente con agua destilada. Las proporciones arriba indicadas pueden disminuirse ó aumentarse proporcionalmente de acuerdo a las necesidades de cada laboratorio y su infraestructura.

Cálculo de resultados

La linealidad para los gráficos de calibración ha sido bien documentada por diversos fabricantes de kits comerciales. Se ha obtenido un nível mínimo de linealidad de 500 mg/dl, razón por la cual basta utilizar un solo standard para la calibración de la prueba y para los cálculos respectivos de la concentración mediante la fórmula :

Absorbancia de la muestra Concentración (mg/dl) =

x 200 Absorbancia de Standard

6.3.9

Procedimientos de Control de Calidad.

Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena práctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el número de ellas) , la participación de al menos un suero control. Dependerá de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio. 6.3.10 Interferencias Interfieren : hemoglobina ( > 0.5 g/dl), triglicéridos ( > 1,000 mg/dl), bilirrubina (> 10 mg/dl) y ácido ascórbico (> 10 mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos.

6.3.11 Intervalos de Referencia Biológica Citando como fuente al National Colesterol Education Program de los Estados Unidos (2001) y, al último reporte del Adult Treatment Panel (2002), se refiere a la fecha los siguientes valores de referencia en adultos :

• • •

Deseable ó Aceptable : Menor de 200 mg/dl Moderadamente alto : 200-239 mg/dl Alto ó elevado : Mayor o igual a 240 mg/dl.

6.3.12 Valores de Alerta/Críticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.3.13 Interpretación de Laboratorio 6.3.13.1 Elevaciones de Colesterol : Además de las relaciones con la enfermedad cardiovascular(enfermedad arterial coronaria), el colesterol se encuentra en concentraciones elevadas en el hipotiroidismo, diabetes mellitus, síndrome nefrótico y en varias hiperlipidemias, especialmente aquellas que causan xantomatosis. 6.3.13.2 Disminución de glicemia : Puede detectarse niveles bajos de colesterol en la enfermedad hepatocelular , hipertiroidismo, anemia y desnutrición. 6.3.14 Especificaciones de desempeño 6.3.14.1 Linealidad : Varía según los fabricantes. Se sitúa entre 500 a 1000 mg/dl. 6.3.14.2Límite de detección : Igualmente, los diferentes productos citan cifras entre 0.3 mg/dl y 0.7 mg/dl. 6.3.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, esta metodología arroja coeficientes de variación entre 1.0% y 3.49 %, siendo menores las variaciones a mayor concentración de las muestras. 6.3.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variación se sitúan entre 0.9 y 1.1 % para la metodología. 6.3.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la sección de Bioseguridad Los procedimientos mencionados utilizan fenol, el cual es tóxico e irritante. No inhalar ni exponer piel y mucosas al contacto de este elemento. 6.3.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.3.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser mayor a +/- 0.1°C. 6.3.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en incubación. 6.3.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.3.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.

6.4

TRIGLICERIDOS: METODO ENZIMATICO CON GLICEROL FOSFATO OXIDASA

6.4.1 Presentación Los triglicéridos son ésteres formados gracias a la unión de glicerol y ácidos grasos provenientes de dos fuentes: exógena (dieta) y endógena, por síntesis interna a partir de carbohidratos y principalmente en el hígado. Son transportados al igual que otros lípidos en complejos moleculares denominados lipoproteínas hacia el tejido adiposo, músculo y otros, teniendo como función principal el aportar energía a nivel celular. Sus elevaciones se han reportado en diversas hiperlipidemias primarias, de origen genético, así como secundariamente a patologías de fondo como la diabetes mellitus. Hoy en día se considera la hipertrigliceridemia como un factor de riesgo de enfermedad coronaria arterial en forma independiente. 6.4.2 Principio del Procedimiento

Se describe el método enzimático con el uso de Glicerol Fosfato oxidasa como enzima que cataliza la formación de peróxido de hidrógeno y Peroxidasa como responsable de la separación de Oxígeno del peróxido. Esta metodología es ampliamente utilizada hoy en día y aplicable a cualquier analizador.El mercado provee de kits comerciales para su uso . Los laboratorios que no empleen esta metodología seguiran sus instructivos de acuerdo a las normas del fabricante del kit comercial o de la referencia bibliográfica utilizada para el desarrollo de la prueba. Se sugiere en todo caso, mantener dichas instrucciones al alcance del personal que labora en el área y para efectos de auditorías y/o supervisiones. 6.4.3 Descripción del Método Los triglicéridos presentes en la muestra, sufren una escisión inicial, dando lugar a la separación del glicerol y los ácidos grasos. Luego, el glicerol es unido a adenosina trifosfato (ATP) que, en presencia de glicerolquinasa, cede un fósforo al glicerol, convirtiéndolo en glicerol 3-P. Este, unido al oxígeno y bajo la acción de la Glicerol Fosfato oxidasa forma una cetona y peróxido de hidrógeno. Finalmente, el Peróxido de hidrógeno, ante la presencia de la Peroxidasa, cede oxígeno, el cual es capturado por la 4-aminofenazona en presencia de clorofenol, terminando en un compuesto coloreado o quinonimina roja. Este último componente es medido fotométricamente , estando en relación direca a las concentraciones previas de triglicérido. El rango de medición se establece en 500-505 nm o bien con filtro verde (490-530 nm) en fotómetros que lo utilicen. Lipasa

Triglicéridos + H2O

Glicerol + Acidos grasos

Gliceroquinasa

Glicerol + ATP

Glicerol 3-P + ADP Glicerol Fosfato Oxidasa

Glicerol 3-P + O2

Dihidroxiacetona-P + H2O2

2 H2O2 + 4-Aminofenazona + Clorofenol

Quinonimina

6.4.4 Tipo de Muestra Primaria

Puede utilizarse suero o plasma. Condición importante: Ayuno de 12 horas.

6.4.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recolección 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mínimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recolección al vacío(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegúrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la sección de Toma de Muestras para las generalidades de la venopunción. 6.4.4.2 Obteniendo Plasma En caso de utilizar plasma, recurra a la utilización de 01 tubo de ensayo provisto con EDTA-K como anticoagulante. En los sistemas de recolección al vacío es fácil obtener la proporción adecuada de mezcla, obteniendo el volumen de muestra fijado por el fabricante. Otros anticoagulantes como heparina, oxalato o fluoruro no interfieren en la reacción, por lo que también pueden emplearse. 6.4.4.3 Separación de la Muestra y Preservación Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de glóbulos rojos. Los triglicéridos son estables en estas muestras durante 3 a 5 días a temperatura de refrigeración (2-8 °C). No congelar.

6.4.5

Equipos y Materiales

6.4.5.1 Equipo de Medición Se requiere un fotómetro o espectrofotómetro con capacidad de lectura entre 490 a 530 nm. En el caso de espectrofotómetros se aconsejan lecturas a 505 nm. Los equipos automatizados suelen poseer este filtro, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informándose por el catálogo del mismo. 6.4.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.

6.4.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recolección de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recolección del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Baño María : Para la respectiva incubación durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37°C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reacción, en el caso de preparación de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotómetro o espectrofotómetro. e) Reloj o timer.

6.4.6

Reactivos

6.4.6.1 Reactivo Comercial Resulta una práctica muy generalizada la utilización de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribución en el mercado. La única indicación sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relación al uso y preservación de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente acápite, se describirá el procedimiento estándar utilizado por la mayoría de proveedores.

6.4.6.2 Reactivos Provistos en Kits Comerciales • • • • •

•

Standard : El patrón ó Standard generalmente se provee en concentraciones de 200mg/dl en forma de solución de glicerol. Enzimas : Se provee una suspensión conteniendo : lipoproteín lipasa,glicerolquinasa, glicerolfosfato oxidasa, Peroxidasa, adenosina trifosfato y 4-amiofenazona . Buffer con solución de Goods y Clorofenol Los reactivos arriba indicados expiran en la fecha grabada en la etiqueta del fabricante. Conservar a 2-8 °C. Reactivo de Trabajo : Ceñirse a las recomendaciones del fabricante en cuanto a proporciones de mezcla de cada uno de los elementos reactivos del kit. Generalmente, el reactivo de trabajo es estable por un mes a temperatura de refrigeración ( 2-8 °C). Indicios de inestabilidad : Procurar vigilar la presencia de turbidez ó partículas tanto en el Standard como en el reactivo de trabajo. Además, vigilar las recomendaciones del proveedor en cuanto a la absorbancia del blanco de reactivo, la cual tiene un límite .

6.4.7

Procedimientos

El siguiente es un procedimiento que indica proporciones estandarizadas por la mayoría de fabricantes : •

Pipetee en tubos de ensayo de 13 x 100 mm los siguientes componentes : Muestra Reactivo(ml) Blanco Standard Muestra React. De trabajo

1.0

Standard

0.01

Muestra ó Control

0.01

• • •

6.4.8

Mezclar bien e incubar a 37°C en baño maría por 5 minutos. Retirar del baño de agua y preparar el espectrofotómetro ó fotómetro para la lectura respectiva. Leer la absorbancia del blanco, standard y muestra a 500-505 nm ó filtro verde (490-530 nm) en fotómetro con filtros. Blanquee a cero previamente con agua destilada. Las proporciones arriba indicadas pueden aumentarse proporcionalmente de acuerdo a las necesidades de cada laboratorio y su infraestructura.

Cálculo de resultados

La linealidad para los gráficos de calibración ha sido bien documentada por diversos fabricantes de kits comerciales. Se ha obtenido un nível mínimo de linealidad de 600 mg/dl, razón por la cual basta utilizar un solo standard para la calibración de la prueba y para los cálculos respectivos de la concentración mediante la fórmula :

Absorbancia de la muestra Concentración (mg/dl) =

x 200 Absorbancia de Standard

6.4.9

Procedimientos de Control de Calidad.

Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo.

Se aconseja mantener la buena práctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el número de ellas) , la participación de al menos un suero control. Dependerá de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.4.10 Interferencias Interfieren : hemoglobina ( > 1.0 g/dl), bilirrubina (> 2.5 mg/dl) mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos.

6.4.11 Intervalos de Referencia Biológica Citando como fuente al National Colesterol Education Program de los Estados Unidos (2001) y, al último reporte del Adult Treatment Panel (2002), se refiere a la fecha los siguientes valores de referencia en adultos : • • • •

Deseable ó Aceptable : Menor de 150 mg/dl Moderadamente alto : 150-199 mg/dl Alto ó elevado : 200-499 mg/dl. Muy alto ó muy elevado : Mayor o igual a 500 mg/dl.

6.4.12 Valores de Alerta/Críticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.4.13 Interpretación de Laboratorio 6.4.13.1 Elevaciones de Tiglicéridos : Además de comportarse como factor independiente en la enfermedad arterial coronaria, la hipertrigliceridemia se observa en enfermedades hepatobiliares, diabetes mellitus, nefrosis, hipotiroidismo, alcoholismo, hiperlipoproteinemias familiares tipo IV y V. 6.4.13.2 Disminución de Triglicéridos : Puede detectarse niveles bajos de colesterol en condiciones extremas de desnutrición.

6.4.14 Especificaciones de desempeño 6.4.14.1 Linealidad : Varía según los fabricantes. Se sitúa entre 600 a 1000 mg/dl. 6.4.14.2 Límite de detección : Igualmente, los diferentes productos citan cifras entre 0.8 mg/dl y 1.6 mg/dl. 6.4.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, esta metodología arroja coeficientes de variación entre 1.7% y 2.6 %. 6.4.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variación se sitúan entre 0.7 y 1.7 % para la metodología.

6.4.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la sección de Bioseguridad Los procedimientos mencionados utilizan fenol, el cual es tóxico e irritante. No inhalar ni exponer piel y mucosas al contacto de este elemento.

6.4.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.4.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser mayor a +/- 0.1°C. 6.4.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en incubación. 6.4.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.4.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.

6.5

HDL-COLESTEROL : METODOS : A) PRECIPITACIÓN B) DIRECTO

6.5.1

Presentación

Las lipoproteínas constituyen macromoléculas de forma esférica con una capa externa de proteínas, fosfolípidos y colesterol libre en diversa proporción. La parte central de la esfera contiene básicamente colesterol esterificado y triglicéridos, cuya concentración difiere según el tipo de lipoproteína. La función principal de estas moléculas es transportar adecuadamente los lípidos dentro de un medio acuoso como es el torrente sanguíneo. Las HDL cumplen importante función vía el mecanismo reverso, retornando colesterol periférico desde los tejidos hacia el hígado. Esto permite afirmar que su actividad es cardioprotectiva, razón por la cual son sus disminuciones las que tienen un efecto contrario en la enfermedad cardiovascular. 6.5.2

Principio del Procedimiento

Se presentan dos procedimientos. Uno de ellos, el referido al uso de reactivo precipitante es el más conocido y difundido, si bien con tendencia a ser suplantado por la medición directa, de mayor facilidad en el trabajo y mayor precisión . La metodología con reactivo precipitante implica el uso de un agregado de acido fosfotúngstico con iones magnesio, logrando la precipitación selectiva de las fracciones LDL y VLDL, quedando en el sobrenadante (luego de una centrifugación) la fracción HDL, a la cual se le mide el colesterol. Por otro lado, la determinación directa de HDL se basa en el uso de detergentes y polímeros que logran fraccionar y solubilizar las HDL, permitiendo posteriormente su determinación vía la cuantificación de colesterol. 6.5.3

Descripción del Método

6.5.3.1 Determinación de HDL con Reactivo Precipitante Las lipoproteínas HDL se separan precipitando las VLDL y LDL gracias al agregado de Acido Fosfotúngstico y iones magnesio en forma de cloruro de magnesio. Luego de un determinado tiempo de reposo entre reactivo y muestra, se procede a un centrifugado de esta reacción capturando una porción del sobrenadante. Esta muestra se procesa con el reactivo de determinación de colesterol, generalmente suplido con el kit comercial. De no ser así, puede emplearse el reactivo utilizado normalmente para el análisis de colesterol, siempre y cuando se respeten las diluciones propuestas por el fabricante. 6.5.3.2 Determinación de HDL sin precipitación ó directo Para esta determinación se usan polímeros o polianiones que logran mantener como complejos estables a las VLDL, LDL y Quilomicrones, no logrando su solubilización en la reacción. Al contrario, la acción de un detergente específico permite a las HDL su fragmentación y solubilización, con lo que su aporte de colesterol será cuantificado posteriormente sin la necesidad del paso de centrifugación.

Polianión Lipoproteínas de bajo peso molecular Detergente HDL-colesterol HDL-colesterol soluble en solución

Estabilización de complejos Fragmentación de HDL Determinación deColesterol (Colesterol Oxidasa)

6.5.4 Tipo de Muestra Primaria

Puede utilizarse suero o plasma. Condición importante: Ayuno de 12 horas.

6.5.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recolección 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mínimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recolección al vacío(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegúrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la sección de Toma de Muestras para las generalidades de la venopunción. 6.5.4.2 Obteniendo Plasma En caso de utilizar plasma, recurra a la utilización de 01 tubo de ensayo provisto con EDTA-K como anticoagulante o heparina. Algunos fabricantes prefieren el uso de heparina si se trabaja con plasma. En todo caso, consulte dichas recomendaciones en el inserto del kit. En los sistemas de recolección al vacío es fácil obtener la proporción adecuada de mezcla, obteniendo el volumen de muestra fijado por el fabricante. Otros anticoagulantes como oxalato o fluoruro no interfieren en la reacción, por lo que también pueden emplearse. 6.5.4.3 Separación de la Muestra y Preservación Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de glóbulos rojos. Las partículas de HDL son estables en estas muestras durante 7 días a temperatura de refrigeración (2-8 °C). Sin embargo, algunos autores prefieren procesos mucho más rápidos, con un máximo de almacenamiento de 3 días.

6.5.5 Equipos y Materiales 6.5.5.1 Equipo de Medición Se requiere un fotómetro o espectrofotómetro con capacidad de lectura entre 490 a 530 nm y en algunos kits se requiere lecturas de 600/700 nm. Los equipos automatizados suelen poseer estos filtros, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informándose por el catálogo del mismo. 6.5.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.

6.5.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recolección de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recolección del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Baño María : Para la respectiva incubación durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37°C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reacción, en el caso de preparación de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotómetro o espectrofotómetro. e) Reloj o timer. f) Centrífuga de tubos.

6.5.6

Reactivos

6.5.6.1 Reactivo Comercial Resulta una práctica muy generalizada la utilización de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribución en el mercado. La única indicación sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relación al uso y preservación de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente acápite, se describirá el procedimiento estándar utilizado por la mayoría de proveedores.

6.5.6.2Reactivos Provistos en Kits Comerciales 6.5.6.2.1 Reactivos del Método de Precipitación a. Standard : El patrón ó Standard generalmente se provee en concentraciones variables de colesterol etiquetadas en el frasco. Otros kits podrían no contenerlo. Verificar información en su instructivo. b. Reactivo Precipitante: Se provee una suspensión conteniendo : Fosfotungstato (Acido Fosfotúngstico) y Cloruro de Magnesio. c. Set de enzimas para la determinación de Coleserol : Colesterol esterasa, colesterol oxidasa, peroxidasa, 4-aminofenazona, fosfatos, diclorofenolsulfonato. d. Los reactivos arriba indicados expiran en la fecha grabada en la etiqueta del fabricante.Conservar de 2-8 °C, a excepción del reactivo precipitante, capaz de ser almacenado a temperatura ambiente según muchos fabricantes. Verificar esta última información en su instructivo comercial. e. Indicios de inestabilidad : Procurar vigilar la presencia de turbidez ó partículas tanto en el Standard como en los reactivos 6.5.6.2.2 Reactivos del Método sin Precipitación ó Directo a) Calibrador : Suero humano liofilizado conteniendo diversas concentraciones de lipoproteínas, especialmente HDL/LDL. Estas concentraciones varían, verificar la etiqueta del frasco o el instructivo comercial. b) Detergentes/Polímero/Enzimas: Las concentraciones y presentacione cambian según el tipo de reactivo, pero lo usual es separar por un lado el polímero o polianión con alguna de las enzimas implicadas en los primeros pasos de la reacción de determinación de colesterol y en segundo término el detergente con la cantidad mayor de enzimas implicadas en la metodología enzimática con colesterol oxidasa. c) Conservar a 2-8°C. El calibrador es estable 1 semana a estas temperaturas, pero puede alicuotarse y almacenarse a -20°C por un mes. El resto de los reactivos una vez abiertos son estables por unas semanas. Verificar esta información. d) Indicios de Inestabilidad : Procurar vigilar la presencia de turbidez ó partículas tanto en el Standard como en los reactivos 6.5.7

Procedimientos

6.5.7.1 Metodología con Reactivo Precipitante El siguiente es un procedimiento que indica proporciones estandarizadas por la mayoría de fabricantes :

a. Pipetear en un tubo 13 x 100 mm : Muestra

0.2 ml

Reactivo Precipitante

0.5 ml

b. Mezclar bien y dejar en reposo por 10 minutos a temperatura ambiente . c. Centrifugar 10 minutos a 4,000 rpm. Esta información debe ser confrontada con el reactivo comercial . Existen diversas alternativas de variar el tiempo y rpm. d. Extraer el sobrenadante. e.Proceder al segundo tiempo de reacciones (Determinación del Colesterol HDL):

Blanco

Agua destilada

0.05 ml

Standard colesterol

Sobrenadante

Reactivo de enzimas

1.0 ml

Standard

-0.05 ml -1.0 ml

Muestra

--0.05 ml 1.0 ml

Las cantidades arriba citadas varían en cada kit. El anterior ejemplo sólo presente ser demostrativo de una variante. Consulte su instructivo y no olvide trasladarlo por escrito a su documento de procedimientos.

f. Mezclar bien e incubar a 37°C en baño maría por 10 minutos. Retirar del baño de agua y preparar el espectrofotómetro ó fotómetro para la lectura respectiva. g. Leer la absorbancia del blanco, standard y muestra a 500-505 nm ó filtro verde (490-530 nm) en fotómetro con filtros. Blanquee a cero previamente con agua destilada.

6.5.7.2 Procedimiento con Metodología sin precipitación o Directa Para este caso, los procedimientos y concentraciones varían. En general se intenta incubar en un primer paso la muestra y el calibrador, con el objeto de fragmentar la HDL-colesterol y poder luego, en un segundo paso, gracias a las enzimas provistas por la metodología colesterol oxidasa, determinar la concentración de colesterol de las HDL. Las lecturas varían : en algunos se utiliza 505 nm, en otras variantes 600/700 nm. Verifique el instructivo.

6.5.8

Cálculo de resultados

6.5.8.1 Metodología con Reactivo Precipitante Al variar las cantidades de reactivos con muestras, los cálculos varían según el kit comercial empleado. Respetar la sugerencia del fabricante. A continuación, la fórmula empleada de manera genérica :

Concentración de Muestra = Absorbancia de Muestra x Concent. Standard x F Absorbancia Standard

Donde F= Factor de dilución de muestra

6.5.8.2 Metodología sin reactivo de precipitación y directa. Al ser una técnica que llega a 2 pasos, existen dos lecturas de absorbancia, la primera de ellas luego de la primera incubación (A1) y la segunda al final de la reacción completa (A2). Se realiza el mismo procedimiento con el calibrador. El cálculo general será el siguiente :

Concentración de muestra= A2-A1 (Muestra) x Concent. Calibrador A2-A1 (Calibrador)

6.5.9

Procedimientos de Control de Calidad.

6.5.10 Interferencias Interfieren : hemoglobina ( > 0.5 g/dl), bilirrubina (> 10 mg/dl) mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos. Es discutible la interferencia de los triglicéridos en cuanto a cifras, pero es aconsejable considerar esta acción a cifras superiores a 1000 mg/dl.

6.5.11 Intervalos de Referencia Biológica Citando como fuente al National Colesterol Education Program de los Estados Unidos (2001) y, al último reporte del Adult Treatment Panel (2002), se refiere a la fecha los siguientes valores de referencia en adultos : Deseable : 40-60 mg/dl Protectivo : Mayor de 60 mg/dl

6.5.12 Valores de Alerta/Críticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.5.13 Interpretación de Laboratorio La disminución de cifras de HDL-colesterol se considera en correlación positiva en la incidencia de la enfermedad coronaria arterial y, en general, en la incidencia de ateroesclerosis. Existen también otros estados patológicos en los cuales se puede evidenciar disminución de estas cifras : enfermedad hepática, malnutrición, diabetes mellitus, anemia crónica, ansiedad, tabaquismo. 6.5.14 Especificaciones de desempeño 6.5.14.1 Linealidad : Varía según los fabricantes. Se sitúa entre 150 a 500 mg/dl para ambas metodologías. 6.5.14.2 Límite de detección : Igualmente, los diferentes productos citan cifras entre 3.0 mg/dl para la metodología precipitante y 6.0 mg/dl en el método directo. 6.5.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, estas metodologías arrojan coeficientes de variación entre 3.1 % y 4.2 %.

6.5.14.3 Repetitibilidad : Los coeficientes de variación se sitúan entre 2.0 % y 3.3 % para las metodologías.

6.5.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la sección de Bioseguridad

6.5.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.4.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser mayor a +/- 0.1°C. 6.4.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en incubación. 6.4.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.4.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.

6.6

LDL-COLESTEROL :METODOS: A) PRECIPITACIÓN B)DIRECTO

6.6.1 Presentación Con una carga de 50 % de colesterol transportado, básicamente de naturaleza endógena, la lipoproteína LDL se convierte en factor clave en la patogenia de la enfermedad cardiaca coronaria. Su función es precisamente transportar este colesterol al interior de las células, convirtiéndose por lo tanto en un elemento comprometido en la formación de la placa ateromatosa. Numerosos estudios le han asignado el papel negativo en este proceso y sus cifras debieran vigilarse ante alguna evidencia clínica, incluso con cifras normales de colesterol total. Por otro lado, el aumento de esta lipoproteína puede sobrepasar largamente el efecto de las HDL, las cuales sólo tienen un papel protector hasta cierto límite. 6.6.2 Principio del Procedimiento Se describen dos metodologías. La primera en relación al uso de reactivo precipitante, el cual provoca una sedimentación de esta macromolécula, dejando en el sobrenadante las HDL y VLDL, las cuales, por diferencia con el colesterol total indicaran el tenor de LDL-colesterol. El segundo procedimiento implica el uso de detergentes y polímeros parala solubilización específica de las LDL y su posterior cuantificación, vía su colesterol. 6.6.3 Descripción del Método 6.6.3.1 Método con Reactivo Precipitante Mediante el agregado de polímeros de alto peso molecular, las LDL son precipitadas para dejar tras una centrifugación un sobrenadante con el colesterol de las HDL y VLDL. Este colesterol se determina y luego se resta del colesterol total, quedando calculado el LDL-colesterol. 6.6.3.2 Método sin reactivo precipitante o Directo En ese método, se emplea un primer paso para solubilizar el colesterol de HDL, VLDL y Quilomicrones, logrando consumir este compuesto vía enzimas, sin desarrollo de color. Esto se logra vía un primer agente tensioactivo. Aplicando otra concentración de agente tensioactivo, se logra en un segundo paso solubilizar la LDL restante y, esta vez, someter su colesterol a una cuantificación directa.

Polímero-Detergente-Enzimas

HDL + VLDL +Quilomicrones

Liberación de colesterol y Consumo por Enzimas.

Agente tensioactivo

LDL-colesterol

Colesterol para Ser medido.

6.6.4 Tipo de Muestra Primaria

Se debe usar suero. Sólo en algunos kits se condiciona el uso de plasma bajo recolección con EDTA ó heparina y con metodología directa. Condición importante: Ayuno de 12 horas.

6.6.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recolección 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mínimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recolección al vacío(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegúrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la sección de Toma de Muestras para las generalidades de la venopunción.

6.6.4.2 Separación de la Muestra y Preservación Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de glóbulos rojos. Las partículas de LDL son estables en estas muestras durante 24 horas a temperatura de refrigeración (2-8 °C) cuando se practica la metodología con reactivo precipitante y entre 4-5 días en refrigeración para el método directo.

6.6.5 Equipos y Materiales 6.6.5.1 Equipo de Medición Se requiere un fotómetro o espectrofotómetro con capacidad de lectura entre 490 a 530 nm y 600 a 700 nm. Los equipos automatizados suelen poseer estos filtros, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informándose por el catálogo del mismo. 6.6.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.

6.6.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recolección de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recolección del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Baño María : Para la respectiva incubación durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37°C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reacción, en el caso de preparación de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotómetro o espectrofotómetro. e) Reloj o timer. f) Centrífuga de tubos.

6.6.6

Reactivos

6.6.6.1 Reactivo Comercial Resulta una práctica muy generalizada la utilización de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribución en el mercado. La única indicación sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relación al uso y preservación de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente acápite, se describirá el procedimiento estándar utilizado por la mayoría de proveedores.

6.6.6.2Reactivos Provistos en Kits Comerciales 6.6.6.2.1 Reactivos del Método de Precipitación a. Reactivo Precipitante : Solución de polivinil sulfato disuelto en polietilenglicol. Conservar a 2-8°C hasta fecha de expiración. b. Indicios de inestabilidad : Procurar vigilar la presencia de turbidez ó partículas tanto en el Standard como en los reactivos, al igual que cambios de color. c. Adicionalmene, se requiere un kit para determinación de colesterol por método enzimático de colesterol oxidasa.

6.6.6.2.2 Reactivos del Método sin Precipitación ó Directo a) Calibrador : Suero humano liofilizado conteniendo diversas concentraciones de lipoproteínas, especialmente HDL/LDL. Estas concentraciones varían, verificar la etiqueta del frasco o el instructivo comercial. b) Detergentes/Polímero/Enzimas: Las concentraciones y presentaciones cambian según el tipo de reactivo dando como resultado 2 reactivos separados. c) Conservar a 2-8°C. El calibrador es estable 1 semana a estas temperaturas, pero puede alicuotarse y almacenarse a -20°C por un mes. El resto de los reactivos una vez abiertos son estables por 4 semanas. Verificar esta información. d) Indicios de Inestabilidad : Procurar vigilar la presencia de turbidez ó partículas tanto en el Standard como en los reactivos 6.6.7

Procedimientos

6.6.7.1 Metodología con Reactivo Precipitante El siguiente es un procedimiento que indica proporciones estandarizadas por la mayoría de fabricantes :

a. Pipetear en un tubo 13 x 100 mm : Muestra

0.4 ml

Reactivo Precipitante

0.2 ml

b. Mezclar bien y dejar en reposo por 15 minutos a temperatura ambiente . c. Centrifugar 15 minutos a 4,000 rpm. Esta información debe ser confrontada con el reactivo comercial . Existen diversas alternativas de variar el tiempo y rpm. d. Extraer el sobrenadante. e.Proceder al segundo tiempo de reacciones (Determinación del Colesterol en el sobrenadante):

Blanco

Agua destilada

0.02 ml

Standard colesterol

Sobrenadante

Reactivo de enzimas

1.0 ml

Standard

-0.02 ml -1.0 ml

Muestra

--0.02 ml 1.0 ml 66

f. Mezclar bien e incubar a 37°C en baño maría por 10 minutos. Retirar del baño de agua y preparar el espectrofotómetro ó fotómetro para la lectura respectiva. g. Leer la absorbancia del blanco, standard y muestra a 500505 nm ó filtro verde (490-530 nm) en fotómetro con filtros. Blanquee a cero previamente con agua destilada.

6.6.7.2 Procedimiento con Metodología sin precipitación o Directa Para este caso, los procedimientos y concentraciones varían. En general se intenta incubar en un primer paso la muestra y el calibrador, con el objeto de solubilizar el colesterol de todas las lipoproteínas, excepto la LDL-colesterol, consumiendo las primeras sin que reaccionen y poder luego, en un segundo paso, gracias a las enzimas provistas por la metodología colesterol oxidasa , determinar la concentración de colesterol de las LDL.De esta forma, hay una lectura de absorbancia por cada uno de los pasos, tanto para las muestras como para el calibrador.

6.6.8

Cálculo de resultados

6.6.8.1 Metodología con Reactivo Precipitante Al variar las cantidades de reactivos con muestras, los cálculos varían según el kit comercial empleado. Respetar la sugerencia del fabricante. A continuación, la fórmula empleada de manera genérica :

Concentración de Muestra = Absorbancia de Muestra x Concent. Standard x F Absorbancia Standard

Donde F= Factor de dilución de muestra

Con esto se obtiene la concentración del colesterol del sobrenadante. Para calcular el colesterol de LDL, debe lograrse una diferencia entre el colesterol total del paciente y la concentración obtenida con el cálculo anterior :

Concentración de LDL-colesterol= Colesterol total – Colesterol del sobrenadante

6.6.8.2 Metodología sin reactivo de precipitación y directa. Al ser una técnica que llega a 2 pasos, existen dos lecturas de absorbancia, la primera de ellas luego de la primera incubación (A1) y la segunda al final de la reacción completa (A2). Se realiza el mismo procedimiento con el calibrador. El cálculo general será el siguiente :

Concentración de muestra= A2-A1 (Muestra) x Concent. Calibrador A2-A1 (Calibrador)

6.6.9

Procedimientos de Control de Calidad.

6.6.10 Interferencias Interfieren : hemoglobina ( > 0.5 g/dl), bilirrubina (> 10 mg/dl) mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos. Es discutible la interferencia de los triglicéridos en cuanto a cifras, pero es aconsejable considerar esta acción a cifras superiores a 1000 mg/dl.

6.6.11 Intervalos de Referencia Biológica Citando como fuente al National Colesterol Education Program de los Estados Unidos (2001) y, al último reporte del Adult Treatment Panel (2002), se refiere a la fecha los siguientes valores de referencia en adultos : Deseable : Menor a 130 mg/dl. Riesgo Moderado a Elevado : 130-189 mg/dl. Riesgo muy elevado : Mayores o iguales a 190 mg/dl .

6.6.12 Valores de Alerta/Críticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.6.13 Interpretación de Laboratorio El aumento de las cifras de LDL-colesterol se observan en ateroesclerosis y sus consecuencias, especialmente infarto de miocardio y accidentes cerebrovasculares. Igualmente se detecta aumento en nefrosis, diabetes mellitus, obesidad y tabaquismo.

6.6.14 Especificaciones de desempeño 6.6.14.1 Linealidad : Varía según los fabricantes. Se sitúa entre 450 a 1000 mg/dl (más alta con el método precipitane)para ambas metodologías. 6.6.14.2 Límite de detección : Igualmente, los diferentes productos citan cifras entre 0.45 mg/dl para la metodología precipitante y 3.5 mg/dl en el método directo. 6.6.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, estas metodologías arrojan coeficientes de variación entre 1.5 a 4.8 %. 6.6.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variación se sitúan entre 1.4 % y 2.7 % para las metodologías.

6.6.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la sección de Bioseguridad

6.6.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.6.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser mayor a +/- 0.1°C. 6.6.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en incubación.

6.6.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.6.16.4Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes. 6.6.16.5 Observar un sobrenadante claro. La aparición de turbidez puede implicar la necesidad de adicionar otra cantidad de precipitane. Verificar los instructivos comerciales para las correcciones respectivas. 6.6.16.6 En la metodología con precipitane, procurar no dejar el precipitado en contacto con el sobrenadante, debido a que puede haber redisolución del colesterol de las otras lipoproteínas, disminuyendo en el cálculo final el tenor de LDL-colesterol.

6.7

UREA : METODO ENZIMATICO CON UREASA

6.7.1 Presentación La úrea es producida en el hígado, como paso final de la desaminación de aminoácidos y excretada posteriormente a través de la orina. Es una porción importante del nitrógeno no proteico y vía final delmetabolismo de este gran grupo metabólico. Su relación con la función renal es clara, si bien se debe estudiar igualmente los factores extrarrenales de su elevación en sangre. 6.7.2 Principio del Procedimiento Se describirá un método enzimático espectrofotométrico al alcance de la mayoría de laboratorios por medio de kits comerciales. El uso de la ureasa como enzima principal h apermitido establecer no sólo esta técnica colorimétrica, sino también modificaciones que permiten reacciones para lectura en ultravioleta, lo cual no será materia del presente manual . Para la técnica colorimétrica se establece la acción de la ureasa sobre la úrea, descomponiéndola y permitiendo posteriores reacciones con el objeto de formar un compuesto coloreado medible. 6.7.3 Descripción del método La ureasa actúa sobre la úrea, permitiendo la formación de dióxido de carbono y amoníaco, reaccionando este último con salicilato e hipoclorito, reacción en medio alcalino que origina indofenol de color verde, medible fotométricamente a 570 nm.

Ureasa

Urea + H2O

2 NH4+ + CO2 Nitroprusiato

NH4+ + Salicilato +Hipoclorito de sodio

Indofenol

6.7.4 Tipo de Muestra Primaria 6.7.4.1 Puede usarse suero, plasma u orina. Utilizar la orina diluida 1/50 con agua destilada y multiplicar el resultado por esta dilución. Para el uso de plasma, obtenerla a partir de heparina como anticoagulante. Ceñirse a otras instrucciones impartidas en la sección de venopunción en Toma de Muestras. 6.7.4.2 La úrea en suero es estable por 7 días a 2-8°C. En muestras de orina es estable por 3 días en refrigeración , salvo excesivo crecimiento bacteriano. Para aumentar a 6 meses la conservación deben usarse temperaturas de – 20°C o más bajas.

6.7.5 Equipos y Materiales 6.7.5.1 Equipo de Medición Se requiere un fotómetro o espectrofotómetro con capacidad de lectura entre 600 +/- 20 nm (filtro naranja) o bien espectrofotometría para lecturas a 570-600nm. Los equipos automatizados suelen poseer estos filtros, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informándose por el catálogo del mismo. 6.7.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad de 1 a 10 ml para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.

6.7.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recolección de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recolección del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Baño María : Para la respectiva incubación durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37°C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reacción, en el caso de preparación de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotómetro o espectrofotómetro. e) Reloj o timer.

6.7.6

Reactivos

6.7.6.1 Reactivo Comercial Resulta una práctica muy generalizada la utilización de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribución en el mercado. La única indicación sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relación al uso y preservación de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente acápite, se describirá el procedimiento estándar utilizado por la mayoría de proveedores.

6.7.6.2Reactivos Provistos en Kits Comerciales a) b) c) d) e)

Reactivo 1 : Salicilato d e sodio, nitroprusiato sódico, tampón. Reactivo 2 : Solución de Hipoclorito de sodio en hidróxido de sodio. Reactivo 3 : Ureasa. Standard: La concentración de úrea varía según el fabricante. Conservar a 2-8 °C. El tiempo de estabilidad dependerá del tipo de reactivo. El reactivo 1 y 2 son estables hasta la fecha de caducidad. El reactivo de trabajo con ureasa es la mezcla del reactivo 1 con el reactivo 3 bajo medidas que depende de especificaciones propias de cada kit; suele ser estable por un mes luego de su preparación y en refrigeración. f) Verificar indicios de deterioro mediante observación de turbidez, partículas o absorbancia de blanco superior a la indicada por el fabricnte.

6.7.7

Procedimientos

a) Pipetear en tubos de ensayo 13 x 100 mm :

Blanco

Muestra

Standard

0.01 ml

Muestra

0.01 ml

1.0 ml

Reactivo de TrabaJo ( 1 + 3) 1.0 ml

b) c) d) e)

Standard

Mezclar e incubar por 5 minutos a 37 °C. Agregar a cada uno de los tubos anteriores 1.o ml de Reactivo 2. Mezclar e incubar por 5 minutos a 37 °C. Leer absorbancia de muestras y Standard a 600 nm.

6.7.8

Cálculo de resultados

Concentración de muestra= Absorbancia de muestra x Concent.Standard Absorbancia Standard

6.7.9

Procedimientos de Control de Calidad.

6.7.10 Interferencias Interfieren : hemoglobina ( > 0.2 g/dl), bilirrubina (> 20 mg/dl) mg/dl), triglicéridos ( > 1000 mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos.

6.7.11 Intervalos de Referencia Biológica Cada laboratorio deberá establecer sus propios rangos referenciales, en razón a recomendaciones del proveedor o bajo estudio de población. Como cifras de orientación, se dan las siguentes : Urea (Suero y Plasma) : 10-45 mg/dl Urea (Orina) : 20 – 40 g/24 horas.

6.7.12 Valores de Alerta/Críticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.7.13 Interpretación de Laboratorio Se encuentran concentraciones elevadas en diversas disfunciones renales, además de uremias extrarrenales como dieta hiperproteica, aumento de catabolismo proteico, post hemorragia gastrointestinal, deshidratación, shock, insuficiencia cardiaca, uso de corticoides, litiasis renal, hipertrofia prostática. No considerar la elevación de la úrea

como único indicador de enfermedad renal, debido a su amplia variación por causas extrarrenales. 6.7.14 Especificaciones de desempeño 6.7.14.1 Linealidad : Varía según los fabricantes. Se sitúa entre 250 a 300 mg/dl . 6.7.14.2 Límite de detección : Igualmente, los diferentes productos citan cifras alrededor de 1.3 mg/dl. 6.7.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, estas metodologías arrojan coeficientes de variación entre 1.32 % a 2.4 %. 6.7.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variación se sitúan entre 0.8 y 1.6 %.

6.7.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la sección de Bioseguridad El Reactivo 2 de hipoclorito sódico es irritante. En caso de contacto con ojos, lávese abundantemente con agua y acuda al médico. Deben usarse guantes y protección para ojos y cara. 6.7.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.7.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser mayor a +/- 0.1°C. 6.7.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en incubación. 6.7.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.7.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes. 6.7.16.5 Conservar estrictamente la reacción de trabajo con ureasa a 2-8 °C. Debido a sus propiedades enzimáticas es muy sensibles a cambios de temperatura. Periodos prolongados a temperatura ambiente reducen su estabilidad. 6.7.16.6 En relación a los rangos referenciales,tomar en cuenta el sexo como fuente de variabilidad (mayor cantidad en hombres) y la edad ( cifras menores en neonatos y mayores en ancianos).

6.8

CREATININA : METODO DE JAFFE/PICRATO ALCALINO

6.8.1

Presentación

La creatinina es un producto de degradación formado en el músculo partir de la creatin fosfato.El compuesto es muy estable en concentraciones a nivel de sangre y excreción urinaria en individuos normales, de ahí que resulte un gran marcador de disfunción renal. Su eliminación es casi exclusivamente por orina, siendo útil su cuantificación en sangre y orina para los cálculos del clearance o depuración de creatinina. 6.8.2

Principio del Procedimiento

La creatinina presente en suero y plasma reacciona con el picrato en medio alcalino (reacción de Jaffé), produciendo un cromógeno rojo. Se describirá un método cinético con lectura espectrofotométrica en visible. No se requiere como en la tradicional variante, el paso previo de desproteinización. Para realizar este procedimiento es necesario obtener el kit comercial, compatible con la metodología descrita. 6.8.3

Descripción del Método

En la reacción de Jaffé, la producción del cromógeno rojo se puede medir a intervalos de tiempo controlados, siendo esta velocidad de reacción, una medida de la concentración de creatinina en la muestra. Se ha observado que la mayoría de cromógenos distintos a la creatinina, reaccionan dentro de los primeros 30 segundos de la reacción, siendo la creatinina la única que incrementa el color de la reacción luego de ese tiempo. Esta es la razón por la que se mantiene la medida de la absorbancia entre los 30 segundos y los 5 minutos iniciales. 6.8.4 Tipo de Muestra Primaria

Puede utilizarse suero u orina de 2 y 24 horas de recolección.

6.8.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recolección 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mínimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recolección al vacío(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegúrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la sección de Toma de Muestras para las generalidades de la venopunción. 6.8.4.2 Recolección de Orina Recolectar orina de 2 ó 24 horas en un recipiente limpio, manteniendo el mismo en refrigeración mientras dure su colección. Posteriormente medir el volumen y utiizar una muestra con dilución 1/50. La recolección de orina de 2 horas requiere de la multiplicación del volumen por 12, simulando una recolección de 24 horas.

6.8.4.3 Separación de la Muestra y Preservación Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero del paquete de glóbulos rojos. La creatinina en suero es estable 24 horas en refrigeración de 2-8°C. La orina mantiene creatinina estable por 4 días.

6.8.5 Equipos y Materiales 6.8.5.1 Equipo de Medición Se requiere un fotómetro o espectrofotómetro con capacidad de lectura entre 490 a 530 nm. En el caso de espectrofotómetros se aconsejan lecturas a 505 nm. Los equipos automatizados suelen poseer este filtro, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informándose por el catálogo del mismo. 6.8.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material. 6.8.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recolección de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recolección del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Baño María : Para la respectiva incubación durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 25°C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reacción, en el caso de preparación de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotómetro o espectrofotómetro. e) Reloj o timer.

6.8.6

Reactivos

6.8.6.1 Reactivo Comercial Resulta una práctica muy generalizada la utilización de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribución en el mercado. La única indicación sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relación al uso y preservación de los

mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente acápite, se describirá el procedimiento estándar utilizado por la mayoría de proveedores.

6.8.6.2 Reactivos Provistos en Kits Comerciales • • • • •

•

6.8.7

Standard : El patrón ó Standard generalmente se provee en concentraciones de 2.0 mg/dl de solución de creatinina. Acido pícrico. Reactivo Alcalino de Hidróxido de sodio. Los reactivos arriba indicados expiran en la fecha grabada en la etiqueta del fabricante, mantenidos a temperatura ambiente. Reactivo de Trabajo : Ceñirse a las recomendaciones del fabricante en cuanto a proporciones de mezcla de cada uno de los elementos reactivos del kit. Generalmente, el reactivo de trabajo se prepara en partes iguales entre el Acido pícrico y el reactivo alcalino, siendo estable por una semana a temperatura ambiente. Indicios de inestabilidad : Procurar vigilar la presencia de turbidez ó partículas tanto en el Standard como en el reactivo de trabajo. Además, vigilar las recomendaciones del proveedor en cuanto a la absorbancia del blanco de reactivo, la cual tiene un límite .

Procedimientos

El siguiente es un procedimiento que indica proporciones estandarizadas por la mayoría de fabricantes : •

Pipetee en tubos de ensayo de 13 x 100 mm los siguientes componentes :

Standard

•

Muestra

Reactivo Trabajo

1 ml

Standard

0.2 ml

Muestra

0.2 ml

Mezclar bien e incubar a 25°C en baño maría,disparando el cronómetro al mismo tiempo.Medir la absorbancia a los 30 segundos (S1 y M1), continuando la incubación y luego a los 5 minutos de iniciado el conteo(S2 y M2). El espectrofotómetro debe haber sido blanqueado previamente a cero con agua destilada.

•

6.8.8

Leer las absorbancias citadas del Standard y muestra a 500-505 nm ó filtro verde (490-530 nm) en fotómetro con filtros.

Cálculo de resultados

Calcular la creatinina en suero de la siguiente manera :

Concentración = (M2 – M1) x F Donde F = Concentración de Standard (2.0 mg/dl) S2-S1

Para cálculos en orina, multiplicar por el factor de dilución y luego calcular de acuerdo al volumen en 24 horas. 6.8.9

Procedimientos de Control de Calidad.

6.8.10 Interferencias Interfieren : hemoglobina ( > 0.7 g/dl), bilirrubina (> 20 mg/dl), triglicéridos (> 1000mg/dl), glucosa (> 500 mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos.

6.8.11 Intervalos de Referencia Biológica Cada laboratorio establecerá sus rangos referenciales de acuerdo a las sugerencias de su proveedor o al estudio de su población. Se citan los siguientes valores como referencia en la metodología descrita : Suero : 0.8-1.4 mg/dl Orina : 900-1500 mg/dl

6.8.12 Valores de Alerta/Críticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.8.13 Interpretación de Laboratorio Se observan valores incrementados como reflejo de una disminución en el rango de filtración glomerular. Las causas pueden ser : • Pre-renales : Insuficiencia cardíaca, shock, diarrea, diabetes mellitus, uso de diuréticos. • Renales : Glomerulopatías. • Post-renales : Hipertrofia prostática, litiasis. 6.8.14 Especificaciones de desempeño 6.8.14.1 Linealidad : Varía según los fabricantes. Se sitúa en promedio en 6 mg/dl. 6.8.14.2 Límite de detección : Igualmente, los diferentes productos citan cifras distintas. En promedio 0.03 mg/dl. 6.8.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, esta metodología arroja coeficientes de variación entre 0.6 % y 3.9 %. 6.8.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variación se sitúan entre 1.3 y 2.9 % para la metodología. 6.8.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la sección de Bioseguridad El ácido pícrico es tóxico y el hidróxido de sodio cáustico. Evitar contacto con piel y mucosas. 6.8.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.8.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser mayor a +/- 0.1°C. 6.8.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en incubación. 6.8.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.8.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes. 6.8.16.5 Mantener la temperatura controlada. Una diferencia entre la temperatura de incubación del Standard y Muestras puede disminuir la precisión de la prueba. 6.8.16.6 Respetar los tiempos de lectura . Deben haber mediciones exactas a los 30 segundos y 5 minutos de iniciada la reacción. Esto puede afectar la exactitud de la prueba. 6.8.16.7 Aunque no ha sido recomendado, el uso de plasma proporciona resultados disminuidos.

6.9

PROTEINAS TOTALES : METODO COLORIMETRICO DE BIURET

6.9.1 Presentación Las proteínas son un gran grupo de macromoléculas formadas por aminoácidos, cuya función es primordial en la vida, siendo parte de estructuras celulares, medios de transporte, mecanismos de defensa, catalizadores y en combinación con otras moléculas. Su presencia se advierte al estudio de enzimas, anticuerpos, hormonas, factores de coagulación, hemoglobina y transportadores como en el caso de lipoproteínas, haptoglobina, transferrina y una serie de elementos que requieren de su presencia al no ser solubles en sangre. Entre los componentes de mayor presencia, la albúmina producida en el hígado reviste una importancia especial por las diversas funciones asignadas, así como por las patología asociada a su descenso. 6.9.2 Principio del Procedimiento Los enlaces peptídicos, formados por los aminoácidos presentes en las proteína se unen al ión cúprico y, en medio alcalino, dan lugar a la formación de un compuesto coloreado de tonalidad violeta. La medición de este complejo a 540 nm es proporcional a la concentración de proteínas totales. 6.9.3 Descripción del Método

Cuando se calienta la úrea a una temperatura de unos 180°C, se descompone transformándose en un producto llamado biuret, el cual en presenciade Cu++, en solución alcalina, forma un complejo de color violeta o azul violeta. La reacción tiene lugar como sigue :

UREA

BIURET

Complejo Cu

Esta reacción coloreada la dan sustancias que contengan 2 moléculas CH2 NH2 unidos entre sí o a través de un átomo de Carbono o Nitrógeno y también estructuras peptídicas que contengan como mínimo 2 enlaces peptídicos, característica de cualquier proteína. Se han propuesto muchas variantes de la reacción de Biuret con el objeto de estudiar las concentraciones óptimas de cada uno de los componentes y establecer una estabilidad a temperatura ambiente por tiempo prolongado, previniendo la autorreducción y formación de óxido cuproso.

6.9.4 Tipo de Muestra Primaria Se utiliza suero. 6.9.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recolección 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mínimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recolección al vacío(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegúrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la sección de Toma de Muestras para las generalidades de la venopunción. 6.9.4.2 Separación de la Muestra y Preservación Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero del paquete de glóbulos rojos. La muestra puede conservarse hasta 3 días en refrigeración de 2-8°C o en congelador a –20 °C por una semana.

6.9.5 Equipos y Materiales 6.9.5.1 Equipo de Medición Se requiere un fotómetro o espectrofotómetro con capacidad de lectura entre 520 -560 nm. En el caso de espectrofotómetros se aconsejan lecturas a 540 nm. Los equipos automatizados suelen poseer este filtro, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informándose por el catálogo del mismo. 6.9.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material. 6.9.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recolección de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recolección del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Matraces, vasos de reacción, en el caso de preparación de reactivos. c) Cubetas y accesorios propios de cada fotómetro o espectrofotómetro. d) Reloj o timer.

6.9.6

Reactivos

6.9.6.1 Reactivo Comercial Resulta una práctica muy generalizada la utilización de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribución en el mercado. La única indicación sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relación al uso y preservación de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. 6.9.6.2 Reactivo preparado en Laboratorio Puede acceder a la preparación de una de las variantes de la reacción de Biuret mediante la preparación del siguiente reactivo : a) Solución de Hidróxido de sodio al 10 %. b) Reactivo de Gornall : • Sulfato de cobre con 5 moléculas de agua.......... 1.5 g • Tartrato de sodio y potasio con 4 H2O ............ 6 g • Disolver en 500 ml de agua destilada. Agregar a lo preparado 300 ml del hidróxido de sodio al 10 % y completar con agua destilada a 1000 ml. • Etiquetar y almacenar el reactivo a temperatura ambiente por tiempo indefinido. Descartar si presenta turbidez o precipitación. c) Solución fisiológica de cloruro de sodio 0.85 %. d) Standard comercial de proteínas totales. 6.9.7

Procedimientos

6.9.7.1 Reactivo comercial Mantenga las recomendaciones del proveedor. Recuerde la necesidad de transferir las mismas en un escrito propio de su manual de Procedimientos. Puede resultar útil el modelo adjunto en Anexos. 6.9.7.2 Reactivo preparado en el Laboratorio En 3 tubos de ensayo colocar : Blanco

Muestra

Standard

0.1 ml

Suero

0.1 ml

Suero Fisiol..

2 ml

1.9 ml

Reactivo

8 ml

Mezclar y dejar 20 minutos a temperatura ambiente. Leer a 540 nm o en filtro 520-560 nm, blanqueando a cero con el blanco de reactivo.

6.9.8

Cálculo de resultados

Calcular la concentración de proteínas en suero de la siguiente manera :

Concentración = Absorbancia de Muestra x Concent. Standard Absorbancia de Standard

6.9.9

Procedimientos de Control de Calidad.

6.9.10 Interferencias Interfieren : bilirrubina (> 10 mg/dl), provocando falso aumento. No se ha observado mayor interferencia con hemólisis ligera a moderada ni turbidez por presencia de triglicéridos.

6.9.11 Intervalos de Referencia Biológica Cada laboratorio establecerá sus rangos referenciales de acuerdo a las sugerencias de su proveedor o al estudio de su población. Se citan los siguientes valores como referencia en la metodología descrita : Suero : 6.0 – 8.0 g/dl

6.9.12 Valores de Alerta/Críticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.9.13 Interpretación de Laboratorio • •

Disminución de proteínas : Se observa en el caso de desnutrición, pérdidas renales, infecciones crónicas, enfermedad hepática. Elevación de proteínas : Hemoconcentraciones (ej. deshidratación), mieloma múltiple, infecciones .

6.9.14 Especificaciones de desempeño 6.9.14.1 Linealidad : Hasta 12 g/dl 6.9.14.2 Límite de detección : Según la bibliografía consultada existen detecciones de 0.02 g/dl. 6.9.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, esta metodología arroja coeficientes de variación entre 0.39 % y 0.56 %. 6.9.14.4 Repetitibilidad : No se hallan datos bibliográficos.

6.9.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la sección de Bioseguridad El hidróxido de sodio es cáustico. Tener cuidado especial en su preparación por la energía que libera la reacción con agua. Evitar contacto con piel y mucosas. 6.9.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.9.16.1 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.9.16.2 Mantener la temperatura controlada. 6.9.16.3 Considerar variaciones en los tenores de proteínas de acuerdo a los estados de hidratación del individuo. 6.9.16.4 El efecto postural permite una variación de casi el 20 % entre la posición erecta a la acostada, siendo mayor para la primera. 6.9.16.5 En relación a edad, el neonato mantiene cifras algo superiores que el infante y éste a su vez tasas menores frente al adulto en 1-1.5 g/dl.

6.10 ALBUMINA : COLORIMETRIA CON VERDE DE BROMOCRESOL

6.10.1 Presentación La albúmina constituye la proteína más abundante en el plasma, aproximadamente 60 % de las proteínas totales. Mantiene como función principal el mantener la presión oncótica del plasma, evitando la salida del componente líquido por fuera del mismo (caudante de edemas). Además es proteína transportadora y fuente de aminoácidos no provenientes de la dieta. Su alteración, básicamente en forma de descenso tiene significado clínico en numerosas patologías. 6.10.2 Principio del Procedimiento La albúmina se une cuantitativamente con el verde de bromocresol en medio ácido, resultando en la formación de un color verde el cual puede ser medido a 630 nm o en filtro rojo. 6.10.3 Descripción del Método Las técnicas para la determinación de albúmina por conjugación con colorantes aprovechan el llamado “error de proteína ” de los indicadores. La adición de proteínas a una solución de ciertos colorantes da lugar a la formación de un complejo coloranteproteína, que muestra propiedades ópticas distintas de las que posee el colorante libre. Al diluir el suero con verde de bromocresol, se lee la disminución de la absorbancia con respecto a la concentración de albúmina, no siendo interferida bajo el filtro de lectura por la hemoglobina, bilirrubina ni lipemia.

6.10.4 Tipo de Muestra Primaria Se utiliza suero. 6.10.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recolección 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mínimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recolección al vacío(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegúrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la sección de Toma de Muestras para las generalidades de la venopunción. 6.10.4.2 Separación de la Muestra y Preservación Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero del paquete de glóbulos rojos. La muestra puede conservarse hasta 3 días en refrigeración de 2-8°C o en congelador a –20 °C por una semana.

6.10.5 Equipos y Materiales 6.10.5.1 Equipo de Medición Se requiere un fotómetro o espectrofotómetro con capacidad de lectura entre 630 +/- 20 nm. En el caso de espectrofotómetros se aconsejan lecturas a 630 nm. Los equipos automatizados suelen poseer este filtro, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informándose por el catálogo del mismo. 6.10.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material. 6.10.5.3 Otros implementos a)Pipetas para recolección de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recolección del volumen necesario de suero . Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b)Matraces, vasos de reacción, en el caso de preparación de reactivos. c)Cubetas y accesorios propios de cada fotómetro o espectrofotómetro. d) Reloj o timer. 6.10.6 Reactivos 6.10.6.1Reactivo Comercial Resulta una práctica muy generalizada la utilización de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribución en el mercado. La única indicación sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relación al uso y preservación de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. 6.10.6.2 Reactivos provistos en kit comercial a) Reactivo de verde de bromocresol en tampón citrato, detergente. b) Standard o patrón de albúmina.La concentración viene etiquetada en el frasco. c) La conservación del reactivo es a 15-30°C y del standard a 2-8°C hasta la fecha de vencimiento. 6.10.7 Procedimientos En 3 tubos de ensayo colocar :

Blanco

Standard

Suero

Reactivo

1 ml

Standard Muestra

0.015 ml

1 ml

Mezclar y dejar 1 minuto a temperatura ambiente. Leer a 630 nm o en filtro rojo 630 +/20 nm, blanqueando a cero con el blanco de reactivo.

6.10.8 Cálculo de resultados

Calcular la concentración de albúmina en suero de la siguiente manera :

Concentración = Absorbancia de Muestra x Concent. Standard Absorbancia de Standard

6.10.9 Procedimientos de Control de Calidad. Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena práctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el número de ellas) , la participación de al menos un suero control. Dependerá de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.10.10 Interferencias Interfieren : triglicéridos ( > 1250 mg/dl), hemoglobina (> 0.125 g/dl). La bilirrubina no interfiere. 6.10.11 Intervalos de Referencia Biológica Cada laboratorio establecerá sus rangos referenciales de acuerdo a las sugerencias de su proveedor o al estudio de su población. Se citan los siguientes valores como referencia en la metodología descrita : Suero : 3.5 – 5.0 g/dl (Adultos) 3.8-5.4 g/dl (Niños)

6.10.12 Valores de Alerta/Críticos No se reporta en la literatura valores de alerta.

6.10.13 Interpretación de Laboratorio •

•

Disminución de albúmina : Se observa en el caso de desnutrición, pérdidas renales, enfermedad hepática, malabsorción, catabolismo aumentado por inflamación o daño tisular, inflamaciones del tuvo digestivo(coitis ulcerativa), quemaduras extensas, analbuminemia congénita. Elevación de albúmina : Hemoconcentraciones (ej. deshidratación). No existen casos clínicamente traducibles de hiperalbuminemia. Ante la eventualidad de resultados elevados, descartar la primera posibilidad y error técnico.

6.10.14 Especificaciones de desempeño 6.10.14.1 Linealidad : Hasta 7 g/dl 6.9.104.2 Límite de detección : detecciones de 0.02 g/dl. 6.10.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, esta metodología arroja coeficientes de variación entre 0.9 % y 1.7 %. 6.10.14.4 Repetitibilidad : Coeficientes de variación entre 0.8 a 1.0%.

6.10.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la sección de Bioseguridad

6.10.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.10.16.1 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.10.16.2 Mantener la temperatura controlada. 6.10.16.3 Considerar variaciones en los tenores de proteínas de acuerdo a los estados de hidratación del individuo. 6.10.16.4 La reacción de la albúmina con el verde de bromocresol es inmediata. No demore las lecturas; otras proteínas podrían reacionar lentamente.

6.11

BILIRRUBINA TOTAL Y DIRECTA: COLORIMETRIA CON REACTIVO SULFANILICO-DIAZOADO.

6.11.1 Presentación La bilirrubina es formada a partir del fragmento hem de la hemoglobina, liberada por el recambio natural de eritrocitos o por la destrucción de los mismos. El hígado, el bazo y la médula ósea son sitios donde se forma la bilirrubina. La s formadas en los dos últimos deben ser transportadas al hígado para su ulterior conjugación. La enfermedad hepática afecta este sistema y permite la acumulación de la bilirrubina en sangre. Los fenómenos obstructivos a nivel de toda la vía biliar intra y extrahepática también son causantes de elevación de niveles de este componente. 6.11.2 Principio del Procedimiento Se basa en la diazorreación de Ehrlich, que consiste en la copulación , en medio ácido, de la bilirrubina con el ácido sulfanílico diazotado ( mezcla de de acido sulfanílico y nitrito de sodio). La bilirrubina directa (una aproximación a la bilirrubina conjugada, no exactamente igual) reacciona precisamente en forma “directa” con el diazorreactivo; la bilirrubina no conjugada requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite de manera “indirecta” su reacción. De esta manera, se comprende que para que podamos medir la bilirrubina total (la suma de ambas), debe agregarse a la reacción el benzoato de cafeína que, en esta metodología, actúa como el desarrollador acuoso. 6.11.3 Descripción del método La reacción de los componentes de la biirrubina en la llamada “diazorreacción” se explica de la siguiente manera : Reactivo diazo (Acido Sulfanílico + Nitrito de Sodio)

Reacción directa con el suero

Medición de Bilirrubina Directa

Se añade Benzoato de cafeína

Se solubiliza la bilirrubina Indirecta.

Medición de Bilirrubina Indirecta + Bilirrubina Directa BILIRRUBINA TOTAL

6.11.4 Tipo de Muestra Primaria Se utiliza suero o plasma. 6.11.4.1 Obteniendo Suero Para obtener suero utilice como envase de recolección 01 tubo de ensayo limpio sin aditivos, con la suficiente capacidad para contener un mínimo de 2 ml de sangre . Por otro lado, en caso de utilizar tubos de ensayo bajo el sistema de recolección al vacío(conocidos en el mercado como tubos de tapa roja), asegúrese de obtener la cantidad fijada por el fabricante del envase. Recurra a la sección de Toma de Muestras para las generalidades de la venopunción. 6.11.4.2 Obteniendo plasma Se prefiere el uso de heparina como anticoagulante. En el comercio se obtiene tubos preparados para fines de recolección; adicionalmente, estos elementos permiten una adecuada proporción entre muestra y anticoagulante. 6.11.4.3 Separación de la Muestra y Preservación Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero del paquete de glóbulos rojos. La muestra puede conservarse hasta 48 horas en refrigeración de 2-8°C pero es ideal trabajarla lo más pronto posible. La luz directa puede destruir en una hora hasta el 50 % del tenor de bilirrubina en la muestra; prevenga esta acción protegiendo con papel negro el tubo. 6.11.5 Equipos y Materiales 6.11.5.1 Equipo de Medición Se requiere un fotómetro o espectrofotómetro con capacidad de lectura entre 520-550 nm. En el caso de espectrofotómetros se aconsejan lecturas a 530 nm. Los equipos automatizados suelen poseer este filtro, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informándose por el catálogo del mismo. 6.11.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros y plasma y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material. 6.11.5.3 Otros implementos a)Pipetas para recolección de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recolección del volumen necesario de suero . Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b)Matraces, vasos de reacción, en el caso de preparación de reactivos. c)Cubetas y accesorios propios de cada fotómetro o espectrofotómetro. d)Reloj o timer.

6.11.6 Reactivos

6.11.6.1 Reactivo Comercial Resulta una práctica muy generalizada la utilización de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribución en el mercado. La única indicación sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relación al uso y preservación de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el caso específico de la determinación de biirrubina, resulta práctico el uso comercial para evitar la manipulación de ácido clorhídrico, producto controlado en nuestro medio y necesario como componente del reactivo sulfanílico. 6.11.6.2 Reactivos provistos en kit comercial a) b) c) d) e)

Reactivo desarrollador : Solución acuosa de benzoato de cafeína tamponada. Standard de bilirrubina. Verificar la concentración en la etiqueta. Nitrito de sodio en solución. Reactivo sulfanílico: Solución de ácido sulfanílico y ácido clorhídrico. Preparación del Diazorreactivo : Mezclar 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo sulfanílico. f) Los reactivos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de caducidad. El Diazorreactivo es estable por 3 meses en frasco color caramelo y a refrigeración de 2-8°C.

6.11.7 Procedimientos

En 3 tubos de ensayo colocar :

Blanco

Directa

Total

0.2 ml

Muestra

0.2 ml

Agua destil.

2.5 ml

Desarrollador --

2.5 ml

React. Sulfan. 0.2 ml

Diazorreact.

0.2 ml

Utilizar el standard como muestra para hallar luego el factor. Mezclar y dejar 5 minutos a temperatura ambiente. Leer a 530 nm o en filtro verde de 520-550 nm, blanqueando a cero con agua destilada. La lectura de la bilirrubina directa debe realizarse a los 5 minutos exactos. La correspondiente a la total puede realizarse entre 4 y 15 minutos de iniciada la reacción. En caso de ictericia moderada se puede usar un volumen menor de muestra como 0.05

ml y luego multiplicar el resultado por 3.79. Para el caso de ictericias severas puede utilizarse 0.02 ml, multiplicando el resultado por 9.38.

6.11.8 Cálculo de resultados

Calcular la concentración de bilirrubinas de la siguiente manera :

Factor = Concentración del Standard Absorbancia Standard Bilirrubina total =( Absorbancia total – Absorbancia blanco ) x Factor Bilirrubina directa = (Absorbancia directa –Absorbancia blanco) x Factor

6.11.9 Procedimientos de Control de Calidad. Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena práctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el número de ellas) , la participación de al menos un suero control. Dependerá de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.11.10 Interferencias Interfieren : La hemólisis moderada o intensa interfiere inhibiendo la reacción directa y dando valores de bilirrubina total falsamente aumentados. 6.11.11 Intervalos de Referencia Biológica Cada laboratorio establecerá sus rangos referenciales de acuerdo a las sugerencias de su proveedor o al estudio de su población. Se citan los siguientes valores como referencia en la metodología descrita : Adultos : Bilirrubina total : Hasta 1.0 mg/dl Bilirrubina directa: Hasta 0.2 mg/dl Neonatos a término : 2.5 –12.0 mg/dl

6.11.12 Valores de Alerta/Críticos Neonatos: Biulirrubina indirecta mayor a 15 mg/dl.

6.11.13 Interpretación de Laboratorio 6.111.13.1 Hiperbilirrubinemia indirecta : Ictericia fisiológica, hemólisis por anemia hemolítica ohematoma extenso, eritropoyesis defectuosa, síndrome de Gilbert, síndrome de Crigler-Najjar. 6.11.13.2 Hiperbilirrubinemia directa : Hepatitis, cirrosis, colestasis extrahepática e intrahepática.

6.11.14 Especificaciones de desempeño 6.11.14.1 Linealidad : Hasta 15 mg/dl 6.11.14.2 Límite de detección : detecciones de 0.03 mg/dl de bilirrubina total. 6.11.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, esta metodología arroja coeficientes de variación entre 1.1 % y 4.7 % para bilirrubina total. 6.11.14.4 Repetitibilidad : Coeficientes de variación entre 1.0 y 3.0 % para bilirrubina total.

6.11.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la sección de Bioseguridad Prestar especial cuidado al ácido sulfanílico, evitando contacto con ojos, piel y mucosas. 6.11.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.11.16.1 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.11.16.2 La lectura de las reacciones en el caso de bilirrubina directa es de capital importancia. Lecturas antes de los 5 minutos dan valores por debajo de lo esperado, ocurriendo lo contrario con tiempos de lectura posteriores. 6.11.16.3 Se reitera la importancia de la protección de las muestras de la luz, sea artificial o natural.Utilizar papel negro para proteger las muestras que no seran analizadas de inmediato. La prolongación del análisis en una hora, puede permitir la pérdida de hasta el 50 % de la concentración de la muestra. 6.11.16.4 Los niveles de bilirrubina en los neonatos a término alcanzan las cifras de adulto hacia el primer mes de vida. Considerar que en el caso de pretérminos se retarda esta nivelación, debido a una inmadurez hepática.

6.12

TRANSAMINASAS : METODO CINÉTICO UV OPTIMIZADO (IFCC)

6.12.1 Presentación Bioquímicamente, las aminotransferasas catalizan la formación de ácido glutámico a partir de 2-oxoglutarato mediante la transferencia de grupos amino. Para ello, la Alanin amino transferasa (ALT) ó Transaminasa Glutámico Pirúvica (TGP) parte de un sustrato con alanina, mientras que la Aspartato amino transferasa (AST) ó Transaminasa Glutámico Oxalacética lo hace con aspartato. Su importancia clínica radica en que cambios en la permeabilidad de las porciones donde se localizan, provocan aumentos de su concentración en sangre. Así, la AST/TGO se encuentra en citoplasma y mitocondrias, mientras que la ALT/TGP es citoplasmática. La concentración de cada una de ellas en las diversas patologías asociadas, implicará la profundidad de las lesiones a nivel celular. 6.12.2 Principio del Procedimiento Existen diversas metodologías para la deteminación de transaminasas, sin embargo, la laboriosidad de algunas, unida a su poca precisión, lograron trabajos para la estandarización metodológica. En este manual se describirá el método optimizado adoptado por la Federación Internacional de Química Clínica (IFCC), la cual propone la utilización de la banda ultravioleta para captar la actividad de la enzima vía la extinción de NADH(icotin-adenina –dinucleótido reducido) y su transformación en NAD. 6.12.3 Descripción del método Para ambos casos de transaminasas, se mide vía un acoplamiento, la velocidad de desaparición de NADH, medido a 340 nm. 6.12.3.1 Reacción de determinación de actividad de ALT/TGP :

ALT/TGP ALANINA + 2-OXOGLUTARATO

PIRUVATO + GLUTAMATO

SE ACOPLA AL PIRUVATO : Desshidrogenasa Láctica PIRUVATO + NADH + H+ LACTATO + NAD+

Se mide a 340 nm su desaparición

6.12.3.2 Reacción de determinación de actividad AST/TGO:

AST/TGO

ASPARTATO + 2- OXOGLUTARATO

Oxalacetato + Glutamato

SE ACOPLA AL OXALACETATO: Malato Deshidrogenasa

OXALACETATO + NADH + H+

MALATO + NAD+

Se mide a 340 nm su desaparición

6.12.4 Tipo de Muestra Primaria

6.12.4.1 Puede usarse suero y plasma . Para el uso de plasma, obtenerla a partir de heparina como anticoagulante. Ceñirse a otras instrucciones impartidas en la sección de venopunción en Recolección de muestras. 6.12.4.2 Las transaminasas son estables en suero por 3 días a 2-8°C. No congelar. 6.12.5 Equipos y Materiales 6.12.5.1 Equipo de Medición Se requiere un fotómetro o espectrofotómetro con capacidad de lectura en rango no visible o ultravioleta (340 nm). Los equipos automatizados suelen poseer estos filtros, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informándose por el catálogo del mismo. 6.12.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material. 6.7.6.2 Otros implementos 96

a) Pipetas para recolección de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recolección del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Baño María : Para la respectiva incubación durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37°C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reacción, en el caso de preparación de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotómetro o espectrofotómetro. e) Reloj o timer.

6.12.6 Reactivos 6.12.6.1 Reactivo Comercial Resulta una práctica muy generalizada la utilización de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribución en el mercado. La única indicación sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relación al uso y preservación de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente acápite, se describirá el procedimiento estándar utilizado por la mayoría de proveedores. 6.12.6.2 Reactivos Provistos en Kits Comerciales a) Buffer : Solución de TRIS conteniendo l-alanina (para ALT/TGP) ó l-aspartato (para AST/TGO). b) Sustrato : viales conteniendo : • Para ALT/TGP : 2-oxoglutarato, NADH, LDH. • Para AST/TGO : 2-oxoglutarato, NADH, MDH y LDH. d) Preparar el sustrato reconstiruyendo con el buffer. Ceñirse a las instrucciones del fabricante. e) Conservar a 2-8 °C. El sustrato reconstituido dura 1 mes aproximadamente. f) Verificar indicios de deterioro mediante lecturas de absorbancia del sustrato reconstituido con el espectrofotómetro o fotómetro llevado a cero con agua destilada (a 340 nm). El fabricante dará las pautas de absorbancias que impliquen deterioro. 6.12.7 Procedimientos

a) Colocar en una cubeta o tubo mantenido a 37°C las siguientes cantidades: (Válido para ambas transaminasas)

Sustrato reconstituido.......... 2ml Muestra .......................... 0.2 ml

b) Mezclar de inmediato y disparar en simultáneo el reloj ó timer. Luego de 1 minuto, registrar la absorbancia inicial. Posteriormente, registrar la absorbancia a los 1, 2, 3 minutos de la primera lectura. c) Determinar la diferencia promedio, restando cada lectura de la anterior y luego promediando dichas diferencias ( A/min).

6.12.8 Cálculo de resultados 6.12.8.1Cálculo para ALT/TGP : ALT/TGP =

A/min x factor

A/min x Factor.

El factor es provisto por el fabricante y calculado de acuerdo a la temperatura de trabajo. Para el procedimiento descrito, dicho factor = 1740 (deberá colocarse un signo negativo en los fotómetros automatizados, debido a que es una reacción por extinción de NADH). 6.12.9 Procedimientos de Control de Calidad. Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena práctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el número de ellas) , la participación de al menos un suero control. Dependerá de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.12.10 Interferencias Interfieren : Muestras con cetoácidos, bilirrubina (>6.0 mg/dl), triglicéridos (>550 mg/dl), hemoglobina (> 0.14 g/dl) dan valores falsamente aumentados. Deficiencias de vitaminas, piridoxal fosfato y hemodializados dan valores falsamente bajos.

6.12.11 Intervalos de Referencia Biológica Cada laboratorio deberá establecer sus propios rangos referenciales, en razón a recomendaciones del proveedor o bajo estudio de población. Como cifras de orientación, se dan las siguentes :

ALT/TGP: Hombres ( hasta 41 U/l) Mujeres ( hasta 31 U/l) AST/TGO: Hombres (hasta 38 U/l) Mujeres ( hasta 32 U/l)

6.12.12 Valores de Alerta/Críticos No se reporta en la literatura valores de alerta. 6.12.13Interpretación de Laboratorio 6.12.13.1 Elevación de ALT/TGP : Hepatitis de diversa índole, otras alteraciones hepáticas-biliares. 6.12.13.2 Elevación de AST/TGO: Alteraciones hepatobiliares (hepatitis, hepatitis con necrosis), infarto de miocardio, alteraciones musculares.

6.12.14 Especificaciones de desempeño 6.12.14.1 Linealidad : Para el método descrito hasta 500 U/l. 6.12.14.2 Límite de detección : Aproximadamente 1.6 U/l de actividad. 6.12.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, estas metodologías arrojan coeficientes de variación entre 2.7 a 5.9 %. 6.12.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variación se sitúan entre 1.4 y 2.8 %.

6.12.15 Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la sección de Bioseguridad 6.12.16 Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.12.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser mayor a +/- 0.1°C. 6.12.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en incubación. 6.12.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.12.16.4Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes. 6.12.16.5Controlar exactamente los tiempos de lectura de absorbancias para el cálculo de A/min.

6.13

FOSFATASA ALCALINA : CINÉTICA OPTIMIZADADIETANOLAMINA

6.13.1 Presentación La fosfatasa alcalina cataliza bioquímicamentela hidrólisis de monoésteres de fosfato orgánicos en medio alcalino. Se encuentra distribuida en hígado, hueso, placenta, intestino, riñón. Su importancia diagnóstica está dirigida al área hepato-biliar y ósea, por tener mayor concentración en dichos tejidos. 6.13.2 Principio del Procedimiento Tan igual como en otras determinaciones enzimáticas, existen diversos procedimientos para la determinación de su actividad. Sin embargo, optamos por el método cinético optimizado a 405 nm, utilizado un tampón de dietanolamina. 6.13.3 Descripción del método La fosfatasa alcalina cataliza en medio alcalino la transferencia del grupo fosfato del 4nitrofenilfosfato a la dietanolamina, liberando 4-nitofenol. A partir de la velocidad de formación del 4-nitrofenol se relaciona la actividad de la enzima.

4-Nitrofenil fosfato + Dietanolamina

Dietanolamina-fosfato + 4-Nitrofenol

6.13.4 Tipo de Muestra Primaria

6.13.4.1 Puede usarse suero y plasma . Para el uso de plasma, obtenerla a partir de heparina como anticoagulante. Ceñirse a otras instrucciones impartidas en la sección de venopunción en Recolección de muestras. 6.13.4.2 La fosfatasa alcalina es estable en suero por 7 días a 2-8°C. 6.13.5 Equipos y Materiales 6.13.5.1 Equipo de Medición Se requiere un fotómetro o espectrofotómetro con capacidad de lectura a 405 nm. Los equipos automatizados suelen poseer estos filtros, por lo que es aconsejable asegurarse de su presencia en el tambor de filtros mediante el proveedor del equipo o informándose por el catálogo del mismo. 6.13.5.2 Material de Vidrio Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo. Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo. Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.

100

6.13.5.3 Otros implementos a) Pipetas para recolección de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recolección del volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas desechables. b) Baño María : Para la respectiva incubación durante el ensayo de los tubos de ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37°C. Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este equipamiento. c) Matraces, vasos de reacción, en el caso de preparación de reactivos. d) Cubetas y accesorios propios de cada fotómetro o espectrofotómetro. e) Reloj o timer.

6.13.6 Reactivos 6.13.6.1 Reactivo Comercial Resulta una práctica muy generalizada la utilización de reactivos provistos dentro de un kit comercial de amplia distribución en el mercado. La única indicación sugerida es mantener las recomendaciones del proveedor, en relación al uso y preservación de los mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente acápite, se describirá el procedimiento estándar utilizado por la mayoría de proveedores. 6.13.6.2 Reactivos Provistos en Kits Comerciales a) Buffer : Dietanolamina, cloruro de magnesio. b) Sustrato : 4- nitrofenilfosfato. d) Preparar el sustrato reconstituyendo con el buffer. Ceñirse a las instrucciones del fabricante. e) Conservar a 2-8 °C. El sustrato reconstituido varía en su vigencia. f) Verificar indicios de deterioro mediante lecturas de absorbancia del sustrato reconstituido con el espectrofotómetro o fotómetro llevado a cero con agua destilada (a 405 nm). El fabricante dará las pautas de absorbancias que impliquen deterioro. 6.13.7 Procedimientos

a) Colocar en una cubeta o tubo mantenido a 37°C las siguientes cantidades:

Sustrato reconstituido.......... 1 ml Muestra .......................... 0.02 ml Estas cantidades son a modo de ejemplo. Varían según el kit comercial.

101

Fosfatasa alcalina (actividad) =

A/min x Factor.

El factor es provisto por el fabricante y calculado de acuerdo a la temperatura de trabajo.

6.13.9 Procedimientos de Control de Calidad. Siga los procedimientos incluidos en el Programa de Control de Calidad Interno y Externo. Se aconseja mantener la buena práctica de incluir dentro de cada corrida de muestras (sin importar el número de ellas) , la participación de al menos un suero control. Dependerá de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad comerciales o preparados en el laboratorio.

6.13.10 Interferencias Interfieren : bilirrubina (>20 mg/dl), triglicéridos (>1000 mg/dl), hemoglobina (> 0.5 g/dl) dan valores falsamente aumentados.

6.13.11 Intervalos de Referencia Biológica Cada laboratorio deberá establecer sus propios rangos referenciales, en razón a recomendaciones del proveedor o bajo estudio de población.

6.13.12 Valores de Alerta/Críticos No se reporta en la literatura valores de alerta. 6.13.13 Interpretación de Laboratorio Se encuentran elevaciones en colestasis biliar, hepatopatías(hepatitis, hepatotoxicidad por medicamentos), carcinoma primario o metastásico óseo y hepático, fenómenos osteoblásticos, osteomalacia por deficiencia de vitamina D, enfermedad de Paget, hiperparatiroidismo. Fisiológicamente durante el desarrollo óseo de la niñez y en el embarazo.

102

6.13.14 Especificaciones de desempeño 6.13.14.1 Linealidad : Para el método descrito hasta 690 U/l. 6.13.14.2 Límite de detección : Aproximadamente 1.6 U/l de actividad. 6.13.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, estas metodologías arrojan coeficientes de variación entre 2.2 a 4.5 %. 6.13.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variación se sitúan entre 0.7 y 1.1 %.

6.13.15Precauciones de Seguridad Cumplir las normas generales expuestas en la sección de Bioseguridad 6.13.16Potenciales Fuentes de Variabilidad 6.13.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser mayor a +/- 0.1°C. 6.13.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en incubación. 6.13.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son causa de variaciones en las reacciones. 6.13.16.4Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes. 6.13.16.5Controlar exactamente los tiempos de lectura de absorbancias para el cálculo de A/min.

103

6.14

HEMOGLOBINA GLICOSILADA: CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IONICO

6.14.1 Presentación La hemoglobina en el interior de cada glóbulo rojo es capaz de reaccionar químicamente con la glucosa, proceso no enzimático que forma una base de Schiff, la cual se transforma posteriormente en una ketoamina irreversible o producto de Amadori. Gracias a esta reacción existen diversas hemoglobinas glicosiladas, las cuales han sido reunidas en un global llamado Hb A1 . De este colectivo, la de mayor concentración es la Hb A1 c . La concentración de Hemoglobina A 1 c es directamente proporcional a la concentración media de glucosa en sangre durante un periodo de 6-8 semanas. La determinación de la glicohemoglobina es el mejor indicador disponible actualmente para el control del paciente diabético. 6.14.2 Principio del procedimiento Est prueba muestra variabilidad entre las diversas metodologías e incluso entre fabricantes . Para garantizar que la información obtenida es confiable, resulta indispensable que los laboratorios utilicen métodos cromatográficos certificados por el National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP). En la actualidad es recomendable en laboratorios de referencia, la utilización de cromatografía de intercambio iónico a baja presión. 6.14.3 Descripción del Método Los sistemas que disponen de cromatografía de intercambio iónico a baja presión, utilizan en conjunción gradientes de elución para separar subtipos y variantes de la hemoglobina rescatada de sangre hemolizada. Las distintas fracciones de hemoglobina son separadas y monitorizadas por un promedio de valores de absorción a 415 nm.Se obtiene un cromatograma, el cual es grabado y almacenado por una computadora, la cual realizará la evaluación y reporte impreso. 6.14.4 Tipo de Muestra Primaria Se recolecta sangre total en tubos con anticoagulante EDTA. Utilize de preferencia el sistema al vacío. Las muestras de sangre completa son estables por siete días a 2-8°C. Procure homogenizar adecuadamente mediante inversión de la muestra o en un agitador mecánico. 6.14.5 Equipos y Materiales 6.14.5.1 Equipo de Medición La metodología propuesta requiere el uso de analizadores específicos para la determinación de este componente, los cuales incluyen un software adecuado. Existen

104

en el mercado alternativas de acuerdo al volumen de pruebas de los distintos laboratorios. Se entiende que este es un procedimiento que debería centralizarse en Laboratorios de referencia, dado el costo y complejidad de su performance. 6.14.5.2 Material requerido • Dispositivos para pruebas • Reactivos diversos para la preparación del hemolizado. • Software • Dispensadores, viales muestra. • Pipetas para volúmenes de muestra y reactivo según los protocolos de cada fabricante. • Impresora y papel de impresión. 6.14.6 Reactivos Los fabricantes proveen reactivos con buffer y reactivos de hemólisis, específico para cada marca. Además, debe obtenerse controles. 6.14.7 Procedimientos Los procedimientos varían según el proveedor, pero existen pasos generales en todos ellos : 6.14.7.1 Iniciar la corrida con un control de Calidad. Utilizar los niveles exigidos. 6.14.7.2 Calibración : Este paso no suele ser necesario, gracias al apoyo de un software que guarda la información de curvas de calibración leyendolas de cada lote de reactivos. 6.14.7.3 Preparación de los hemolizados a partir de las muestras de pacientes. 6.14.7.4 Inicio de corrida. 6.14.7.5 Aspiración de muestra y análisis. 6.14.7.6 Reporte e impresión de resultados. 6.14.8 Cálculo de Resultados 6.14.8.1 Los porcentajes de Hemoglobina glicosilada son calculados por el sistema. 6.14.8.2 Se puede hacer un estimado de Glucosa media basal(MBG) a partir de la cifra de concentración de HbA1c . MBG= 33.3( % HbA1c) – 6 6.14.9 Procedimientos de conrol de calidad. Utilizar en cada corrida los controles internos necesarios para asegurar una óptima performance. Existen programas de Control de Calidad Externo para este análisis. 6.14.10 Interferencias No se han observado interferencias con triglicéridos. La bilirrubina interfiere a partir de valores superiores a 20 mg/dl, dando elevaciones falsas. Otras causas de falsas elevaciones : presencia de bases de Schiff, hemoglobina F, hemoglobina C. 6.14.11 Intervalos de Referencia Biológica Se precisan niveles no diabéticos entre 4.0- 6.3 % 105

6.14.12Valores de Alerta/Críticos No se reportan. 6.14.13Interpretación de Laboratorio HbA1c

> 8% 7-8 % <7% 6-7 % < 6%

Control de Glucosa

Tomar acciones Control bueno Objetivo Cerca de glicemia normal NO diabético

6.14.14Especificaciones de desempeño 6.14.14.1 Linealidad : Lineal hasta 17 % . 6.14.14.2 Límite de detección : No se obtienen datos. 6.14.14.3 Reproducibilidad: Para la información obtenida: Coeficientes de variación de 1.51 % (interserie). 6.14.14.4 Repetitibilidad: Para la información revisada: C.V 3.63% (intraserie). 6.14.15 Precauciones de Seguridad 6.14.15.1 No combinar lotes de ningún reactivo. 6.14.15.2 Las soluciones reactivas contienen azida sódica. No exponer a ojos, piel ni mucosas. 6.14.15.3 Disponer los líquidos de desecho de acuerdo a los procedimientos estándares de seguridad. 6.14.15.4 No permitir que los reactivos con azida sódica entren en contacto con metales pesados o ácidos, pues se pueden formar compuestos explosivos o liberarse gases tóxicos. 6.14.16 Potenciales fuentes de Variabilidad 6.14.16.1 No utilizar anticoagulantes distintos a EDTA en la recolección de muestras. 6.14.16.2 Asegurar la incubación oportuna de las muestras antes del ensayo. 6.14.16.3 Asegurar que todos los reactivos pertenezcan a mismo lote. 6.14.16.4 La posibilidad de diabetes subclínica y/o intolerancia a la glucosa no puede ser eliminada dentro de muestras no diabéticas. Analizar con cuidado la información.

106

SECCION 7 : BIBLIOGRAFIA

7.1 American Diabetes Association : Standards of Medical Care for Patients with Diabetes Mellitus. Diabetes Care, 1996: S8-S9. 7.2 BIO RAD. Programa DiaSTAT. Hemoglobina A1c . 1998. 7.3 Bernabei D. Seguridad. Manual para el Laboratorio. Merck, 1994 ; p. 11-12. 7.4 Castañeda M, León M, Zambrano F. Manual de Programa de Garantía de Calidad en Química Clínica.Red de Laboratorios /Garantía de Calidad. Bogotá, 1998. 7.5 College of American Pathologists. Clinical Laboratory Improvement Manual . Surveys Program. 2002. 7.6 College of American Pathologists.So You’re Going to Collect a Blood Specimen: An Introduction to Phlebotomy. 9ed, 2002. 7.7 González de Buitrago J. Tecnología y Métodos del Laboratorio Clínico, Salvat, México, 1992. 7.8 Henry Bernard. Diagnóstico y Tratamiento Clínicos por el Laboratorio. 9ª ed. , Salvat, Barcelona, 1993. 7.9 Henry R.J., Cannon Dc, Winkelman JW. Química Clínica. Bases y Técnicas, 2ª ed., Editorial Jims, Barcelona , 1980. 7.10 Instituto de Salud Pública de Chile. Manual de Control de Calidad en el Laboratorio Clínico. 1998. 7.11 Instituto Nacional de Salud. Manual de Bioseguridad para los Laboratorios. Serie de Normas Técnicas N0. 18.Lima, 2002. 7.12 Ióvine, Selva. El Laboraorio en la Clínica. Metodología analítica, Fisiología e Interpretación, 3ª ed., Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, 1985. 7.13 Ministerio de Salud. Manual de Procedimientos de Laboratorio para la obtención y envío de Muestras (I). Serie de Normas Técnicas No. 15, Lima, 1995. 7.14 NCCLS. Clinical Laboratory Safety. Approved Guideline. Document GP 17-A. 1996. 7.15 Niño H, Barrera L. Garantía de Calidad en el Laboratorio Clínico, Ed. Panamericana, Bogotá, 1993. 7.16 Organización Mundial de la Salud. Serie de Informes Técnicos. Prevención de la Diabetes Mellitus. 1994.

107

7.17 Terrés-Speziale. Confiabilidad y Aplicabilidad de los Nuevos Criterios internacionales para el diagnóstico de Diabetes Mellitus. Revista Mexicana de Patología Clínica, Vol. 49, N0. 4, Octubre-Diciembre 2002. 7.18 University of Michigan Hospitals. Laboratory Critical Values.2001. 7.19 World Health Organization. Definition, Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus and its Complications. Report of a WHO Consultation. Geneva, 1999. 7.20 World Health Organization. Regional Office for South East Asia. Guidelines on Standard Operating Procedures for Clinical Chemistry. 2001.

108

ANEXO A

MODELO DE HOJA DE PROCEDIMIENTOS

LABORATORIO CLINICO

HOJA DE PROCEDIMIENTOS

1.NOMBRE DE LA PRUEBA

2. METODOLOGIA

3. MARCA DEL FABRICANTE

4. INSTRUMENTO UTILIZADO LECTURA A :

5. PROCEDIMIENTO : a. Muestra: b. Preparaci贸n de Reactivos:

c. Procedimiento t茅cnico:

6. CALCULO DE RESULTADOS

109

7. RANGO DE REFERENCIA

8. PERFORMANCE

Linealidad : L铆mite de detecci贸n; Reproducibilidad : Repetitibilidad: Otros :

9. SUSTANCIAS INTERFERENTES

10. CONTROL DE CALIDAD

Suero Control Utilizado: Nivel 1 Nivel 2 Frecuencia de uso :

Control de Calidad Externo Si

NOMBRE

CARGO

FIRMA

FECHA

Elaborado Revisado Aprobado

110

ANEXO B

TABLA DE CONVERSION DE UNIDADES TRADICIONALES A UNIDADES SI

Unidad Convencional

Unidad SI

Factor Conversi贸n

ALBUMINA

g/dl

g/L

ALT/TGP

U/L

ukat/L

0.017

AST/TGO

U/L

ukat/L

0.0167

BILIRRUBINA

mg/dl

umol/L

17.1

COLESTEROL

mg/dl

mmol/L

0.026

CREATININA

mg/dl

umol/L

88.4

GLUCOSA

mg/dl

mmol/L

0.0555

PROTEINAS TOTALES

g/dl

g/L

TRIGLICERIDOS

mg/dl

mmol/L

0.0113

UREA

mg/dl

mmol/L

0.763

111