Ministerio de Salud
GUÍA TÉCNICA TOXICOLOGÍA Y ANÁLISIS DE CANNABIS Y SUS DERIVADOS CAPÍTULO 2
D E PA RTA M E N T O S A L U D A M B I E N TA L
Instituto de Salud Pública
GUÍA TÉCNICA TOXICOLOGÍA Y ANÁLISIS DE CANNABIS Y SUS DERIVADOS
Dr. Alex Figueroa Muñoz
Director Instituto de Salud Pública de Chile
Roberto Bravo Méndez
Jefe Departamento Salud Ambiental
Iván Triviño Angulo
Jefe Subdepartamento Sustancias Ilícitas
Gastón Hernández H. Jefe Sección Decomiso
Editores:
Boris Duffau Garrido Katherine Alcamán Pantoja Sonia Rojas Rondón Paula Fuentes Azócar
® Instituto de Salud Pública de Chile – 2015.
ÍNDICE DE CONTENIDOS
CAPITULO 2
5
8. Técnicas para análisis de cannabis en incautaciones 8.1.3 Cromatografía en Capa Fina (TLC) 8.2.1 Cromatografía en capa fina de alta eficiencia HPTLC 8.2.2 Cromatografía Gaseosa A) Cromatografía Gaseosa con detector de Ionización de llama (GC/FID) B) Cromatografía Gaseosa con detector selectivo de masas (GC/MS) 8.2.4 Análisis de derivados de cannabis 8.3. Estimación de la edad de la planta mediante el perfil de canabinoides 8.4. Análisis de canabinoides sintéticos 8.4.1 Ensayos presuntivos. 8.4.2 Análisis cualitativo. 8.4.3 Análisis cuantitativo.
6 6 6 11 13 14 15 16 17 17 17 18
9. Técnicas para análisis de cannabinoides en muestras biológicas 9.1. Matriz Sangre 9.2. Matriz Orina 9.3. Matriz Pelo 9.4. Método Inmunológico. 9.5. Métodos Cromatográficos.
21 23 23 24 24 24
10. GLOSARIO DE TERMINOS
26
11. Referencias capítulos 1 y 2
27
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CAPITULO 2
8. TÉCNICAS PARA ANÁLISIS DE CANNABIS EN INCAUTACIONES Para iniciar el análisis de cualquier presunta droga que es incautada, existen esquemas analíticos a seguir. Estos esquemas generalmente se inician con una prueba de screening, que corresponde a un análisis rápido y presuntivo, posteriormente se realizan análisis cualitativos/cuantitativos y finalmente los confirmatorios. La comisión científica SWGDrug (Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs), realiza una categorización de técnicas analíticas y la forma en que se recomienda complementarlas para cumplir con los estándares forenses de análisis de drogas incautadas31. La comisión del Scientific working group for the analysis of seized drugs (SWGDRG) describe los tipos de métodos empleados en el análisis de drogas, y además señala las alternativas que se pueden emplear cuando no se dispone de todas las metodologías existentes. (Ver tabla 3) Cuando una técnica validada Categoría tipo A está incorporada en un análisis analítico entonces a lo menos otra técnica (de cualquier Categoría A, B o C) debe usarse. Esta combinación debe permitir identificar la presencia de la sustancia sin la aparición de falsos positivos. Cuando las técnicas de la Categoría A no están disponibles se deben aplicar a lo menos tres métodos diferentes de las otras dos categorías (Categoría B y C) y en caso de que usen técnicas acopladas como por ejemplo cromatografía gaseosa con detector de masas (GC/MS), Cromatografía líquida con detector ultravioleta y arreglo de diodos (HPLC-UVDAD) son consideradas como técnicas separadas para la identificación.
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Tabla 3:
Tipos de métodos de análisis según SWGDRUG CATEGORÍA A
CATEGORÍA B
CATEGORÍA C
Espectroscopia infrarroja
Electroforesis capilar
Test de color
Espectrometría de masas
Cromatografía gaseosa
Espectroscopia fluorescente
Espectrometría de resonancia nuclear magnética
Espectrometría de iones móviles
Inmunoensayo
Espectrometría raman
Cromatografía liquida
Punto de fusión
Test microcristales
Espectrometría uv-visible
Identificadores farmacéuticos Cromatografía en capa fina Examen macroscópica y microscópica (solo para cannabis)
8.1. Análisis Cualitativo 8.1.1 Identificación morfológica La planta cannabis puede ser identificada de acuerdo a sus características macro y micro morfológicas. Si hablamos de las características macro morfológicas, la planta cannabis destaca por sus hojas palmeadas con bordes dentados, mientras que microscópicamente, las características de mayor importancia son los pelos glandulares y cistolíticos que existen en su superficie. Los pelos glandulares son la estructura donde se produce la resina del cannabis, éstos se encuentran principalmente en las inflorescencias de la planta (género femenino), en las hojas y ocasionalmente en el tallo. En su interior es posible observar una sustancia viscosa correspondiente a la resina. Los pelos cistolíticos pueden encontrarse en toda la planta, son de aspecto más delgado y en su interior poseen cristales de que son visibles a microscopio26. Para el caso de muestras de cannabis se considera al examen macroscópico y microscópico como de categoría B cuando se aprecien rasgos botánicos característicos los que deben ser confirmados utilizando al menos una técnica de las demás categorías. En caso de que las características botánicas no sean suficientes para reconocer la cannabis se deben realizar ensayos que permitas determinar la presencia de los cannabinoides como el delta-9-THC. La figura 9 muestra la imagen tomada en el microscopio de planta de cannabis y de marihuana a un aumento de 10X
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Figura 9:
Imagen al microscopio de planta de cannabis y de marihuana a un aumento de 10X
Pelos glandulares planta Cannabis 10x
Pelos glandulares marihuana 10x
8.1.2 Pruebas colorimétricas a) Fast Blue B Sobre un tubo de ensayo poner un embudo con dos filtros de papel, colocar una porción de la muestra y agregar no más de 1,0 mL de metanol, una vez humedecida la muestra retirar el filtro superior y agregar al filtro inferior una punta de espátula del reactivo Fast Blue B (Concentración al 1% previamente mezclado con sulfato de sodio anhidro). La figura 10 muestra los resultados de una muestra de marihuana y de rimonabant en presencia de reactivo de fast blue Figura 10:
Análisis preliminar con fast blue
Fast Blue positivo para hojas frescas de cannabis. 8
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Falso positivo de Rimonabant, antagonista cannabinoide.
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La presencia de cannabinoides se evidencia por la aparición de una coloración rojo/violeta que se intensifica con el tiempo o con la adición de hidróxido de sodio. Se expresa como positivo o negativo, la figura 11 muestra la formación del complejo coloreado de cannabinoides con fast blue Figura 11:
Reacción de cannabinoides con reactivo de Fast Blue B.
b) Duquenois-Levine Reactivos: Solución 1: Se disuelven 5 gotas de acetaldehído y 0.5 g de vainillina en 20 ml de etanol al 95% (almacenar refrigerada). Solución 2: HCl concentrado Solución 3: Cloroformo Coloque una pequeña cantidad de muestra en un tubo de ensayo y agitar con 2 ml de la solución 1 durante 1 minuto; agregue 2 ml de la solución 2 se agita y se deja reposar por 10 minutos, agregue 2 ml de la solución 3. Si la capa inferior (Cloroformo) se vuelve de color violeta indica la presencia de derivados de la cannabis 32. La figura 12 muestra un ensayo positivo para cannabis Figura 11:
Análisis de color de cannabis con Duquenois-Levine
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8.1.3 Cromatografía en Capa Fina (TLC) La cromatografía en capa fina es una técnica rápida, sencilla y de bajo costo que permite comparar el Rf de varias muestras con un estándar de forma simultánea. Preparación de muestra: Se toman aproximadamente 100 mg de droga seca y pulverizada, y se pasa a un tubo de ensayo. Se agrega 1,0 mL aproximadamente de metanol y se sonica 5 a 10 minutos. Si la cantidad de muestra es muy poca o la extracción con metanol no es eficiente, realizar extracción con acetonitrilo. Análisis de la muestra: Sembrar los extractos y estándar de Delta 9 Tetrahidrocannabinol a 1,0 cm del borde inferior con la ayuda de un Microcapilar con separación de 1,0 cm entre cada muestra y estándar, sobre una Cromatoplaca de Sílica Gel 60 F254. Desarrollar en cámara con fase móvil n-Hexano/Éter dietílico en proporción 80/20 hasta 1,0 cm del borde superior y revelar con solución acuosa de Fast Blue B 1% preparada en el momento. Resultados: Se compara el Rf de las muestras con el de estándar de delta-9-tetrahidrocannabinol y posteriormente la placa se revela con solución Fast Blue al 1% recién preparada. Se indica como positivo si coinciden los Rf y se produce la tinción al revelar 33. La figura 13 muestra un análisis de cannabis por TLC Figura 13:
Análisis de muestra real de cannabis
D-9-THC CBD CBN
8.2. Análisis Cuantitativo Para la cuantificación de cannabis las técnicas analíticas más utilizadas son: • Cromatografía en Capa Fina de Alta Eficiencia (HPTLC) • Cromatografía Gaseosa con detector de Ionización de llama (GC/FID) • Cromatografía Gaseosa con detector selectivo de masas (GC/MS) • Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)
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8.2.1 Cromatografía en capa fina de alta eficiencia HPTLC La cromatografía en capa fina de alta eficiencia se trata de una técnica rápida que permite el análisis de varias muestras de forma simultánea, además utiliza solventes de bajo costo y se trata de una técnica ideal para compuestos vegetales ya que las impurezas de la muestra quedan retenidas en la placa34. METODOLOGÍA Preparación de la muestra: La marihuana debe ser previamente homogenizada, siempre con el cuidado de no manipularla en exceso para así evitar romper los pelos glandulares que contienen la resina. Extracción: Se pesa aproximadamente 100 mg de material vegetal en un matraz de 10 mL. Se agrega acetonitrilo hasta completar volumen y llevar a sonicar durante 10 a 20 minutos. Debido a las características de polaridad de los cannabinoides, también se recomienda el uso de solventes apolares como Hexano. La figura 14 muestra el esquema de extracción de cannabis, mientras en la figura 15 aparecen los principales componentes de un equipo HPTLC Figura 14:
Esquema para la extracción de muestras de cannabis
Activación de la placa: Para eliminar todas aquellas impurezas presentes en la placa de sílica, ésta es sumergida en metanol grado HPLC mediante el dispositivo de inmersión con el que cuenta el equipo. La placa es sumergida 3 veces, y con ayuda del metanol, la sílica vuelve a su estructura química original. Posteriormente la placa se lleva a la estufa de secado a 80ºC durante 30 minutos para eliminar la humedad. Fase móvil: Se requiere de una fase móvil apolar que logre separar los tres principales cannabinoides presentes en la marihuana (D-9-THC, CBN, CBN). Se sugiere una fase móvil de Hexano/Dietiléter en proporciones 80:20. Preparación curva de calibración: Preparar una curva de al menos tres puntos a partir de un pool de estándar que contenga delta-9-thc, cannabidiol y cannabinol, se inyectan por duplicado y posteriormente se grafica las áreas v/s concentración. Luego expresar la ecuación de regresión lineal (y= ax + b) y el coeficiente de determinación R2. Las concentraciones para la curva de calibración pueden ir desde 0,5% (p/v) a 9,5% (p/v) así como se indica en la tabla 4, la tabla 5 indica las condiciones instrumentales del método.
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Tabla 4.
Preparación curva de calibración
nivel
Volumen estándar (µL)
Vol. final (mL)
Concentración final (% p/v)
1
50
10
0,5
2
75
10
0,75
3
100
10
1
4
150
10
1,5
5
350
10
3,5
6
550
10
5,5
7
750
10
7,5
8
950
10
9,5
Preparación de controles: Siempre se recomienda preparar un control positivo de delta-9-thc de concentración conocida dentro del rango lineal del método para verificar el correcto funcionamiento de éste. Análisis de la muestra: a) Con el aplicador de muestras, sembrar los estándares para la curva de calibración por duplicado, los controles y las muestras en modo de banda con un ancho de 6 mm en una placa de sílica gel F254. El volumen de sembrado es de 3 µL para los estándares y 1 µL para muestras. b) En la cámara de desarrollo múltiple automático agregar la fase móvil (10 mL) que corresponde a nHexano/Éter dietílico 80:20 y dejar recorrer una distancia de 6 cm. c) Una vez terminado el proceso de secado de la placa, analizarla mediante el espectrofotodensitómetro y realizar la cuantificación utilizando el software de datos. Figura 15:
Principales componentes de un equipo HPTLC
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Tabla 5.
Resumen condiciones cromatográficas HPTLC PARAMETRO
CONDICIONES
Fase Estacionaria
Placa sílica gel F254 tamaño 20x10 cm
Fase Móvil
n-Hexano/ Éter dietílico (80:20)
Modo de Sembrado
Banda
Distancia Recorrida
6 cm 1 µL muestra
Volumen de Inyección
5 µL material referencia (pool de principales cannabinoides)
Ancho de Banda
6 mm
Longitud de onda Seleccionada
206 nm
8.2.2 Cromatografía Gaseosa a) Cromatografía Gaseosa con detector de Ionización de llama (GC/FID) La cromatografía gaseosa con detector de llama, consiste de una llama de hidrógeno-aire y una placa colectora. El efluente de la columna pasa a través de la llama, que ioniza las moléculas orgánicas. Los iones se recogen en un electrodo de polarización negativa y producen una señal eléctrica. El FID es extremadamente sensible y es el detector más ampliamente utilizado, su desventaja es que destruye la muestra35. Para el análisis cuantitativo de cannabinoides la preparación de la muestra y la extracción es la misma que en el punto 8.2.1, también es necesario el uso de una curva de calibración y de muestras control para corroborar el correcto funcionamiento del método. La corrida cromatográfica que se utiliza se detalla a continuación: Tabla 6:
Condiciones método GC/FID para análisis de THC, CBD y CBN
Rampa
°C/min
Siguiente Temperatura (°C)
Duración (min)
Tiempo de la corrida (min)
Inicial
275
---
9
---
2
11.0
Post Run
Las condiciones cromatográficas son las mismas para GC/FID y GC/MS, sólo cambia el volumen de inyección que en el caso de GC/FID es de 2 µL. La figura 16 muestra un cromatograma por GC/FID de los tres principales cannabinoides.
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Figura 16:
Cromatograma por GC/FID de los tres principales cannabinoides.
b) Cromatografía Gaseosa con detector selectivo de masas (GC/MS) La cromatografía gaseosa con detector de espectrómetro de Masas es uno de los detectores más potentes para cromatografía de gases. Los componentes dejan la columna en distintos momentos, pasando a través de la línea de transferencia hacia la fuente de iones del espectrómetro de masas, donde las moléculas se ionizan y pueden fragmentarse, generando lo que se conoce como huella química del compuesto. Según la clasificación de técnicas que indica la SWGDRUG, la cromatografía gaseosa con detector de masas corresponde a una técnica de categoría A, por lo que se considera confirmatoria. Para confirmación de cannabinoides se utiliza la misma corrida cromatográfica que en cuantificación por GC/FID. En la tabla 7 se indican las condiciones cromatográficas: Tabla 7:
método para GC/MS para análisis de cannabinoides
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PARAMETRO
CONDICIONES
Temperatura Inyector
275°C
Temperatura Auxiliar
300°C
Gas Carrier
Helio ultra puro grado 5,0
Retraso de Solvente
3,0 minutos
Modo Inyección
Split 1:25
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Volumen Inyección
2 µL
Tipo Inyección
Autosampler 5% MS
Columna
Largo: 30 metros Flujo: 1,3 mL/min Analizador: Cuadropolo
Detector MS
Fuente de iones: Impacto electrónico EI 70 Rango m/z : 40-500
8.2.4 Análisis de derivados de cannabis Cada vez aparecen con mayor frecuencia en el mercado los productos derivados de cannabis, donde se puede mencionar los aceites, cremas, alimentos como galletas o queques y bebidas. Debido a la matriz de la muestra y las bajas concentraciones de cannabinoides que generalmente poseen estos productos, algunos parámetros deben ser modificados al momento del análisis36cannabidiol (CBD. a) Preparación de la muestra: Se recomienda utilizar cantidades mayores de muestra, 1 g en caso de sólidos y de 10 a 30 ml en caso de líquidos. b) Extracción: Solventes orgánicos apolares, mezcla de Hexano/Isopropanol 90:10. Se sugiere aumentar el tiempo de sonicado a 30 minutos y utilizar centrifuga durante 5 minutos a 4,5 rpm. c) Condiciones instrumentales: Se mantienen para cada técnica. En caso de cromatografía gaseosa con detector selectivo de masas (GC/MS) si la muestra es derivatizada, se cambia a modalidad SIM, dónde los iones para THC-TMS son 303, 371 y 386, CBD-TMS 458, 390 y 337 y CBN-TMS 382, 367, 310. d) Derivatización: Se recomienda el uso de agente derivatizante BSTFA al 1% en TMCS. La figura 17 muestra un esquema del proceso de análisis de muestras de bebidas que contienen extracto de cannabis Figura 17:
Esquema de análisis de cannabinoides en alimentos
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La marihuana contiene más de 400 componentes químicos, que se transforman en más de 2.000 al fumarla. Los cannabinoides que se encuentran en mayor proporción en la planta son el ∆9-THC, principal causante de los efectos psicoactivos de esta droga, el Canabidiol (CBD) que es un constituyente no psicoactivo pero abundante en distintos tipos de fibra y finalmente el canabinol (CBN) que es el que se encuentra en menor cantidad cuando se trata de plantas frescas. Cabe destacar que debido a las características particulares de estos canabinoides, esto es: alta retención de en los tejidos con mayor contenido graso, y la presencia de metabolitos activos, es que se hace difícil y errático relacionar los niveles de concentración en la planta para así establecer el grado de intoxicación del individuo, ya que los canabinoides se transforman en uno o en otro dependiendo de la edad de planta, de las condiciones de almacenamiento de la marihuana obtenida y de la forma de administración, por lo que la determinación de la concentración de THC en la misma no permite establecer valores de corte para los efectos y los daños que provocará la cannabis en el individuo, lo anterior atiende al reciente aumento en las solicitud de análisis cuantitativos de incautaciones de cannabis, lo que a juicio de los editores de esta guía y basada en la evidencia científica no tiene mayor implicancia judicial más allá de intentar ligar un decomiso de marihuana con otro siempre que las condiciones de almacenamientos sean idénticas, por otra parte al igual que otras drogas como la cocaína, la marihuana es adulterada y se le añaden componentes que aumentan el potencial tóxico de la droga37. La marihuana es la droga de abuso que reporta mayor ingreso de pacientes adolescentes a tratamiento por adicción y en la mitad de los pacientes que están en tratamiento por otras drogas2. El aumento sostenido del consumo de esta droga en Chile se debe al mayor acceso y a la disminución de la percepción del riesgo asociado a su consumo. En consecuencia no existe una dosis, pureza o concentración segura para el consumo de cannabis que no revista daño para el consumidor38. 8.3. Estimación de la edad de la planta mediante el perfil de canabinoides De las determinaciones cualitativas y cuantitativas realizadas por la Sección análisis de drogas del Instituto de Salud Pública de Chile34, se desprende que el canabinol no está presente en aquellas muestras de marihuana que han sido secadas recientemente y en condiciones de mayor cuidado (sombra y temperatura ambiente, sin alta humedad). En todos aquellos casos en que se detecta la presencia de CBN, podemos deducir que la muestra ha comenzado a degradarse debido a su mala conservación, y como lo señala Naciones Unidas, no debe utilizarse para efectos comparativos entre decomisos.39 Del mismo modo nuestros estudios revelen que muestras de marihuana con una antigüedad superior a un año pierden casi completamente su contenido de THC, el cual se transforma paulatinamente en CBN, proceso que puede revertirse al combustionar la muestra de cannabis40cannabinol (CBN. Se puede estimar la antigüedad de una muestra de marihuana en base a su contenido de THC y CBN, en el supuesto de que su almacenamiento haya sido a temperatura ambiente y protegido de la luz. Debido a lo anterior la UNODC recomienda que el análisis para efectos comparativos no se lleva a cabo por lo general más de tres meses después de la incautación de la muestra3. El THC parece degradarse más rápidamente durante el primer año que en los años siguientes, así estudios señalan que la velocidad de descomposición del THC en el cannabis a temperatura ambiente se estima en un 17% por año. En un estudio de Naciones Unidas, se expone que las muestras que contienen una proporción entre CBN y THC inferior a 0,013 tienen menos de seis meses, y aquellas con una proporción entre 0,04 y 0,08 tienen entre uno y dos años, no obstante al utilizar este método para estimar la antigüedad de las muestras de cannabis y marihuana, deberán tenerse presentes las variaciones de las condiciones experimentales y de conservación de la muestra41.
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8.4. Análisis de canabinoides sintéticos El análisis de los cannabinoides sintéticos es muy dependiente de la homogeneidad de la muestra a analizar, así como también del método de extracción utilizado. Por esta razón la muestra completa debe ser homogenizada y luego extraída con algún solvente medianamente polar o no polar como metanol, etanol, acetonitrilo o acetona y finalmente filtrada o centrifugada. Además se debe considerar que los cannabinoides sintéticos usualmente se encuentran en bajas concentraciones por lo que el método a utilizar debe ser sensible42. 8.4.1 Ensayos presuntivos. Las pruebas colorimétricas no son recomendadas debido a las posibles interferencias de la matriz y a la baja concentración de los analitos en las mezclas de hierbas24. En este aspecto pruebas como la reacción de fast blue no son concluyentes y pueden llevar a errores de interpretación 8.4.2 Análisis cualitativo. Cromatografía en capa fina (TLC). Al igual que para los cannabinoides naturales, la TLC es una muy buena herramienta, económica y rápida. El inconveniente en este caso es la falta de disponibilidad de patrones. De elegir esta técnica se deben utilizar los mismos materiales y solventes mencionados para cannabinoides naturales24. Espectroscopia infrarroja (FTIR). Esta técnica es bastante sencilla para el caso de muestras puras en polvo. En el caso d muestras de material vegetal impregnado es necesaria una extracción previa del analito del material vegetal, para luego evaporar el extracto directamente en la celda de diamante24. Cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (GC/MS). GC/MS es la técnica más usada para la identificación forense de drogas. Como se mencionó anteriormente se debe extraer la muestra en un solvente adecuado y posteriormente filtrar para eliminar cualquier impureza. Como estándar interno (EI) se puede utilizar N,N-dibenzil-2-clorobenzamida en metanol a una concentración de 20 µg/mL. Las condiciones recomendadas por Naciones Unidas para el análisis de cannabinoides sintéticos por esta técnica son las siguientes24 (Tabla N°18) Tabla 18:
Condiciones instrumentales para análisis de SCs por GC/MS PARÁMETRO
CONDICIÓN
Horno
T° inicial 240°C x 1 min, 6°C/min hasta 330°C x 4 min
Columna
5% fenil metil polisiloxano 30m x 0.25 mm, 0.25 µm
Inyector
Modo splitless T° 250°C
Carrier gas
Helio, 1mL/min a flujo constante
Volumen de inyección
1µL
Detector Solvent delay
Modo EI, 70eV T° de línea de transferencia 280°C T° de la fuente de iones 225°C Modo scan, rango 30-600 amu a 2.17 scan/seg min Departamento Salud Ambiental Instituto de Salud Pública de Chile.
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La identificación de los cannabinoides sintéticos debe ser hecha idealmente por comparación del espectro de masas con el de un estándar obtenido con el mismo equipo y con las mismas condiciones. Como la adquisición de estándares es difícil, sobre todo para países como el nuestro, se pueden utilizar espectros de referencia de librerías comerciales o de bases de datos reconocidas como la DEA o SWGDRUG, pero para esto se debe ser muy cuidadoso y realizar una comparación exhaustiva de los espectros. A modo de referencia Naciones Unidas24 entrega el siguiente listado con los tiempos de retención para una serie de cannabinoides sintéticos utilizando las condiciones antes descritas, junto con los iones principales del espectro de masas (Tabla 19). Tabla 19:
Tiempos de retención de GC e iones principales de GC/MS para SC COMPUESTO
TR GC (MIN)
IONES PRINCIPALES GC/MS (M/Z)
UR-144
6.05
214, 144, 296, 311M+
CP-47,497
6.80
215, 233, 318M+, 300
Estándar interno
8.10
139, 141, 244, 335M+
JWH-251
9.20
214, 144, 116, 319M+
JWH-250
10.15
214, 144, 116, 335M+
AM-694
11.82
232, 435M+, 220, 360
APINACA
11.90
215, 145, 294, 365M+
JWH-018
12.60
341M+, 284, 324, 214
AM-2201
13.70
359M+, 232, 284, 342
MAM-2201
14.80
373M+, 298, 356, 232
JWH-081
15.30
371M+, 314, 354, 214
AM-2232
16.20
225, 352M+, 127, 284
8.4.3 Análisis cuantitativo. a) Cromatografía gaseosa con detector de ionización de llamas (GC/FID). Esta técnica puede ser utilizada tanto para análisis cualitativo como para cuantificar los cannabinoides presentes en una muestra. Como estándar interno (EI) se puede utilizar metil oleato en metanol (0.8 mg/mL). Preparación de las muestras: Una vez homogenizada la muestra pesar aproximadamente 50 µg y agregar 5 mL de metanol, luego sonicar y centrifugar a 2,500 rpm por 5 min y rescatar el sobrenadante. Mezclar cada muestra con la solución de estándar interno (1:1) Preparación de estándares: Preparar una curva de calibración de al menos 3 puntos (5 puntos recomendado) en un rango apropiado, por ejemplo 0.02-2.00 mg/mL en metanol. Mezclar cada estándar con la solución de estándar interno (1:1).
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GU�A TÉCNICA TOXICOLOG�A Y ANà LISIS DE CANNABIS Y SUS DERIVADOS (CAP�TULO 2)
Las condiciones recomendadas por Naciones Unidas para el anĂĄlisis de cannabinoides sintĂŠticos por esta tĂŠcnica son las siguientes24: Tabla 20:
condiciones instrumentales para anĂĄlisis cuantitativo de SCs PARĂ METRO
CONDICIĂ“N
Detector
FID, 280°C
Columna
5% fenil metil polisiloxano o equivalente, 30 m, 0.25 mm, 0.25 Âľm
Carrier gas
Helio, 1.2 mL/min
Gas del detector
Hidrogeno, 35 mL/min, aire 350 mL/min
Temperatura del inyector
250°C
Temperatura del Horno
T° inicial 70°C, 40°C/min hasta 180°C, 10°C/min hasta 300°C
Volumen de inyecciĂłn
1 ÂľL
Split
30:1
Como referencia se mencionan tiempos de retenciĂłn en estas condiciones para algunos SCs 24: Tabla 21:
Tiempo de retenciĂłn de principales SCs COMPUESTO
TIEMPO DE RETENCIĂ“N (MIN)
EstĂĄndar interno
9.3
JWH-073
183
JWH-018
19.4
JWH-122
22.8
CĂĄlculos: Construir una curva de calibraciĂłn utilizando las ĂĄreas obtenidas para cada estĂĄndar (ĂĄrea del estĂĄndar/ĂĄrea del estĂĄndar interno). El resultado puede ser expresado como porcentaje de la droga en la muestra original. Para calcular el porcentaje de SC en la muestra utilizar la siguiente formula: % cannabinoide sintĂŠtico = 100 x đ?‘‰ đ?‘Ľ (đ?‘…đ?‘ −đ?‘?)đ?‘Žđ?‘Šđ?‘
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Dónde: V: Volumen de solvente de extracción utilizado (mL) Rs: Razón de respuesta observada para la muestra (área SC/área EI) a: Pendiente de la curva de calibración b: Intercepto de la curva de calibración Ws: Peso de la muestra (mg) Cabe destacar que para muestras con concentraciones muy bajas de SCs es recomendable utilizar una técnica con mayor sensibilidad como LC-MS o LC-MS/MS. b) Cromatografía Líquida de Ultra alto rendimiento (UHPLC): Esta técnica funciona a mayores presiones que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), además las columnas utilizadas permiten una separación más eficiente y más rápida. Los estándares y muestras pueden ser trabajados en metanol como solvente y deben ser del orden de los µg/mL. Para calcular el porcentaje de droga presente en la muestra se puede utilizar la misma fórmula mencionada antes24. c) Cromatografía Líquida de Alto rendimiento (HPLC): Otra técnica de mayor acceso en países como el nuestro es el HPLC-UV/DAD, siendo un enfoque ideal ya que no se necesita estándar interno y los límites de cuantificación para la mayoría de los cannabinoides sintéticos debieran ser bajos debido a que poseen cromóforos altamente conjugados43. Preparación de la muestra: La extracción puede ser hecha con acetonitrilo, se debe sonicar por 30 min y filtrar con filtros de membrana de nylon de 0.45 µm. La concentración de trabajo debe ser del orden de µg/mL. Preparación de estándares: Preparar una curva de calibración de al menos 3 puntos (5 puntos recomendado) en un rango apropiado, por ejemplo 0.1-1.3 mg/mL en acetonitrilo. Condiciones cromatográficas: La tabla 22 muestra los parámetros y condiciones cromatográficas para HPLC en la detección cuantitativa de SCs
Tabla 22:
Parámetros para análisis cuantitativo de SCs por HPLC PARÁMETRO Columna Fase móvil Volumen de inyección Flujo Longitud de onda
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CONDICIÓN Fenilhexil, 5 µm, 4.6mm ID, 250 mm Cannabinoides neutros= Acetonitrilo: agua (70:30; 80:20; 60:40) Cannabinoides con amina= acetonitrilo: buffer 35mM TEA acetato pH 3.7 (70:30) Cannabinoides con morfolina= acetonitrilo: buffer 35mM morfolina acetato pH 3.7 (70:30) 10 µL 1.0 mL/min Ciclohexilfenoles y dibenzofuranos 278 nm Naftoilindoles y benzoilindoles 315 nm Fenilacetilindoles, tetrametilciclopropilindoles y AKB48 304 nm
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CĂĄlculos: Del mismo modo que las tĂŠcnicas anteriores se procede a construir una curva de calibraciĂłn utilizando las ĂĄreas obtenidas para cada estĂĄndar. El resultado puede ser expresado como porcentaje de la droga en la muestra original. Para calcular el porcentaje de SC en la muestra utilizar la siguiente formula:
DĂłnde:
% cannabinoide sintĂŠtico = 100 x đ?‘‰ đ?‘Ľ (đ?‘…đ?‘ −đ?‘?)đ?‘Žđ?‘Šđ?‘
V: Volumen de solvente de extracciĂłn utilizado (mL) Rs: Ă rea observada para la muestra a: Pendiente de la curva de calibraciĂłn b: Intercepto de la curva de calibraciĂłn Ws: Peso de la muestra (mg)
9.TÉCNICAS PARA ANĂ LISIS DE CANNABINOIDES EN MUESTRAS BIOLĂ“GICAS De acuerdo a lo que se ha planteado en la literatura, asĂ como tambiĂŠn en esta guĂa, la vĂa de administraciĂłn mĂĄs comĂşn de cannabis es a travĂŠs de la vĂa inhalatoria, es decir, fumada; y ocasionalmente se ingiere vĂa oral ya sea en alimentos o aceites. De acuerdo a su toxicocinĂŠtica, el compuesto THC es ampliamente metabolizado y menos del 1% del THC no sufre cambios durante su metabolismo y es excretado en orina. Cuando la cannabis es ingerida por la vĂa inhalatoria, el metabolismo inicial ocurre en los pulmones, y posteriormente en el hĂgado. Pero para determinar estos cannabinoides en muestras biolĂłgicas, es necesario conocer la ruta de metabolizaciĂłn. La figura 18 muestra los metabolitos del THC en el organismo Figura 18:
Ruta metabĂłlica de THC en el organismo
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Una vez que se ha ingerido de forma inhalatoria cannabis, cerca del 50% es excretado en forma de metabolito, mientras que el otro 50% es distribuido a los diferentes tejidos, principalmente a los tejidos con más grasas. Los metabolitos son excretados mayoritariamente por la vía urinaria (25%) y por las heces (65%). El metabolito que se encuentra en mayor abundancia es el ácido 11-nor-∆-9-tetrahidrocannabinol-9carboxilico (9-carboxy-THC), por ende, la identificación de 9-carboxy-THC en orina es considerada el mejor indicador de consumo de cannabis. La concentración de THC en plasma disminuye rápidamente una vez que se ha iniciado el metabolismo y su consecuente almacenamiento en el tejido graso. En resumen, el mayor componente psicoactivo de cannabis es ∆-9-tetrahidrocanabinol (∆-9-THC) es posible detectarlo en sangre, la presencia de este compuesto orienta a un reciente consumo de cannabis. La detección del metabolito hidroxilado (11-OH-THC) puede ser interpretado como el consumo próximo en el tiempo, mientras que el metabolito carboxilado (THC-COOH) es posible identificarlo tanto en orina como en sangre días después del consumo de cannabis. Una vez obtenida las muestras para analizar, es importante tener presente las condiciones de almacenamiento en las cuáles se conservar las muestras previas a su análisis, puesto que las altas temperaturas pueden contribuir a la degradación de los metabolitos, específicamente el 9-carboxi-THC (THC-COOH) puede disminuir su concentración a temperatura ambiente luego de 1 semana. También resulta importante considerar el contenedor en el cual se almacena la muestra debido a que los analitos pueden ser absorbidos por éste44. Matrices biológicas. De acuerdo a las diferentes matrices biológicas que se pueden utilizar para analizar drogas de abuso, el uso del pelo como matriz es considerado la herramienta más eficiente para investigar este tipo de analitos, particularmente cuando se requiere conocer en un periodo largo de tiempo el abuso por parte del consumidor. Otras matrices alternativas como el fluido oral han ganado especial atención en el ámbito forense, ya que puede entregar información en circunstancias específicas. En la tabla 23 se observan las diferentes ventanas de detección de acuerdo a la matriz utilizada, en donde los perfiles metabólicos difieren mucho entre las muestras tradicionales de sangre y orina45. Tabla 23:
Períodos de detección de cannabinoides en distintas matrices biológicas
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MUESTRA DE MATRIZ BIOLÓGICA
VENTANA DE DETECCIÓN
Sangre (suero)
Varias horas hasta 1 a 2 días
Orina
Varias horas hasta 3 días
Fluido oral (saliva)
Varias horas hasta 1 a 2 días (o más para drogas básicas)
Sudor
Semanas
Pelo
Meses/años
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Tratamiento de muestras biológicas para el análisis de cannabinoides Para identificar los analitos por las técnicas analíticas, es necesario realizar varios pasos que van a permitir que el análisis de los cannabinoides resulte de manera satisfactoria. Estos pasos comprenden un proceso de hidrolisis, que es necesario realizar para dejar el metabolito libre es decir sin la forma conjugada como glucorónido. Posteriormente se realiza un paso de extracción, en el cual a través de diferentes maneras ya sea liquido-liquido o bien en fase solida SPE o SPME en que se desea eliminar las impurezas que acompañan al analito de interés. Finalmente, en caso que sea necesario, se pueden concentrar las muestras para que pueda ser detectable con la técnica analítica a emplear45. 9.1. Matriz Sangre En esta matriz es posible identificar los analitos THC y THC-COOH. • Preparación de la muestra: Una vez que se ha almacenado la muestra en las condiciones de temperaturas idóneas, se recomienda ambientar la muestra durante unos minutos para continuar el análisis. Luego se toman una alícuota de 2,0 mL de muestra junto a 4,0 mL de acetonitrilo para proceder a eliminar las proteínas de la muestra en un Vortex. Posteriormente la muestra se coloca en una centrifuga a 4000g, por 10 minutos a 4°C. Luego se añaden 0,6 mL de hidróxido de amonio al 1% al sobrenadante resultante, para luego proceder a la extracción ya sea líquido -líquido o extracción en fase sólida. • Extracción en fase solida: Utilizando un cartucho para intercambio aniónico débil o bien mixto SAX o MCX, para extracción en fase sólida, se ambienta el cartucho con 1 mL de metanol seguido de 1 mL de hidróxido de amonio al 1%, luego se añade 1 mL de muestra, posteriormente se lava con 0,5 mL de acetonitrilo al 50%. Finalmente eluir con 1,5 mL con hexano/ etilacetato/ ácido acético (49:49:2 v/v/v). Posteriormente se coloca la muestra eluida en un concentrador de nitrógeno a 40°C en el que finalmente se reconstituye la muestra con 0.5 a 1,5 mL de metanol al 70% en agua46. 9.2. Matriz Orina En esta matriz es posible identificar los analitos THC-COOH y 11-OH-THC. • Preparación de la muestra: Para analizar los cannabinoides en orina es necesario realizar una hidrolisis alcalina que es más eficiente y reproducible que una hidrolisis acida o enzimática. Para esto se toma una alícuota de 10 mL de orina, luego añadir 2 mL de hidróxido de potasio a 10N e incubar por 20 minutos a 50°C. Posteriormente se recomienda extraer las impurezas básicas y neutras con 20 mL de ciclohexano-etilacetato en proporción 7:1 v/v. • Extracción en fase solida: Se recomienda utilizar un cartucho con adsorbente en fase reversa, en el que para acondicionar la columna se añaden 3 mL de una solución en partes iguales de metanol/ agua 50:50 posteriormente se añade la muestra hidrolizada y luego se lava con 10 mL de HCl 0.1N y 25 mL de ácido fosfórico 50mM en acetonitrilo al 10%. Finalmente se eluye el analito con 1 mL de acetona. Posteriormente se coloca la muestra eluida en un concentrador de nitrógeno a 40°C en el que finalmente se reconstituye la muestra con 0.5 a 1 mL de metanol46.
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9.3. Matriz Pelo En esta matriz es posible identificar los analitos THC-COOH en muy bajas concentraciones. De acuerdo a las recomendaciones de Naciones Unidas para el análisis de drogas de abuso en matrices biológicas, se acepta de manera general cortar segmentos de pelo entre 10-30 mm de longitud, ya que permite obtener un perfil de la historia del individuo. Por otro lado, se recomienda lavar el pelo antes de comenzar el análisis, ya que esto permite reducir las posibles interferencias analíticas, contaminación y mejora la extracción, eliminando los residuos de la superficie del pelo, ya que se debe eliminar una contaminación producto de algún tipo de droga que se encuentren presente en el ambiente o que hayan sido depositadas en el pelo de forma pasiva45. • Preparación de la muestra: Se realiza un paso de descontaminación en que se puede utilizar solventes orgánicos: tomando 100 mg de muestra, luego se lava con 5 mL de diclorometano por 2 minutos, posteriormente se deja secar en un papel adsorbente y se vuelve a repetir el lavado. • Extracción de la muestra: El primer paso es la homogenización de la muestra, lo que se consigue cortando el pelo en segmentos de 1 a 3 mm. Para ello se recomienza obtener por lo menos 20-30 mg de pelo del individuo ya lavado. Es posible realizar la extracción con metanol, soluciones acidas o buffer en el que para este paso se 0,01-0,50 M HCl o bien 1M de buffer fosfato a pH 6,4-7,6 y dejar la solución a 56°C por toda la noche. Luego se realiza un proceso de digestión utilizando 1M de NaOH que se añade al pelo, dejando la solución por 1 hora a 80°C y 60°C por toda la noche. Finalmente la extracción en fase sólida se realiza utilizando un cartucho de adsorbente apolar C8. 9.4. Método Inmunológico. De manera general, es útil que los laboratorios cuenten con un método de screening o tamizaje que permita orientar la presunta sustancia a determinar. Las pruebas de inmunoensayo se encuentran disponibles con varios nombres comerciales que permiten determinar de manera cualitativa los cannabinoides en orina. Estos dispositivos detectan la presencia de 9-carboxy-THC. Sin embargo se recomienda confirmar estos resultados preliminares con un método analítico cuyo principio químico sea diferente al primero47. 9.5. Métodos Cromatográficos. • Cromatografía gaseosa
Luego de obtener el extracto de la muestra, ésta se debe derivatizar para que en el caso de que se utilice una cromatografía gaseosa, para ello se puede utilizar46: -
50 µL de N,O-bis-trimetilsilyl-trifluoracetamida (BSTFA) y trimetilclorosilano (TMCS) y calentar por 60°C por 10 minutos. - 70 µL de una solución al 20% de hidróxido de tetrametilamonio (TMAH)- dimetilsulfóxido, más 5 µL de yoduro de metilo, luego añadir 200uL de ácido clorhídrico 0.1N y extraer la solución con 2 mL con isooctano.
• Cromatografía gaseosa con detector de masas (GC-MS)
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La tabla 24 muestra las principales condiciones del método para análisis de cannabinoides en matrices biológicas mediante GC/MS
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Tabla 24:
Condiciones instrumentales para análisis de cannabinoides por GC/MS PARÁMETRO Volumen de inyección Tempertura inyector Flujo columna
Horno
Rango de trabajo Iones principals (m/z)
CONDICIONES 1 µL Splitless 250°C 1,3 mL/min Helio 160°C por 1 minutos 25°C/min a 260°C por 2 minutos 5°C/ min a 300°C por 1 minuto 2,5-25,0 ng/mL para ∆9-THC y 11-OH-THC 5,0-150 ng/mL para THC-COOH THC-COOH-diTMS 488(M+), 473, 371 THC-COOH-diTBDMS 572 (M+)557, 515, 413
• Cromatografía Líquida Cromatografía líquida de alta eficiencia con detector ultravioleta (HPLC-UV-DAD) En la tabla 25 se muestran las principales condiciones instrumentales para el análisis de cannabinoides en matrices biológicas mediante HPLC, en un rango de trabajo de 50 a 150 ng/mL44 Tabla 25:
Condiciones por HPLC para análisis de cannabinoides en matrices biológicas PARÁMETRO Columna Fase móvil Flujo Detector Volumen de inyección Rango de trabajo
CONDICIONES C-8, 5um, 25 cm x 4,6 mm Acetonitrilo-50mM ácido fosfórico (65:35 v/v) 1,5 mL/min UV a 211 nm (rango entre 200-350 nm si se utiliza detector con arreglo de diodos) 10-15 µL 2,5-25,0 ng/mL para ∆9-THC y 11-OH-THC 5,0-150 ng/mL para THC-COOH
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10. GLOSARIO DE TERMINOS Adicción: Afición y sometimiento al uso regular de una sustancia en busca de alivio, bienestar, estimulación o vigor, frecuentemente con desarrollo de necesidad de consumo. Agonista: Sustancia que se une a los receptores biológicos, que normalmente responden a las sustancias fisiológicas, y origina la respuesta que le es propia. CBD: Cannabidiol CBN: Cannabinol Cannabis: Por cannabis se entiende a las unidades floridas o con fruto de la planta (a excepción de las semillas y las hojas no unidas a las sumidades) de las cuales NO se ha extraído la resina Cromatografía: Un conjunto de técnicas basadas en el principio de adsorción selectiva cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla y en algunos casos identificar estos si es que no se conoce su composición. Droga: Sustancia empleada para producir un efecto en la estructura o funciones de un organismo humano o animal. Es también una sustancia empleada para el diagnóstico, cura, tratamiento o prevención de las enfermedades del hombre o de otro animal Estupefaciente: droga que administrada en dosis terapéuticas, disminuye la percepción de los impulsos sensoriales, en especial del dolor, por el cerebro; en grandes dosis causa estupor, coma o convulsiones. Límite de detección (LOD): Es la concentración más baja de una sustancia en una muestra que se puede detectar, pero no necesariamente cuantificar bajo las condiciones establecidas del análisis. Pelos con cistolitos: Estructuras de la planta de cannabis, que contienen un depósito de carbonato de calcio y generalmente corresponden a una sola estructura celular. Al realizar el examen microscópico se le agrega cuidadosamente gotas de HCl concentrado se aprecia la efervescencia por la producción de CO2 Prueba de campo: Es un procedimiento analítico, generalmente cromático (muestra un color característico cuando está positivo), e identifica a una o más drogas simultáneamente, presentes en la muestra sin especificar a cuál de todas SCs: Sigla en inglés para la denominación de cannabinoides sintéticos Sicotrópico: Dícese de cualquier droga o agente que presenta un afinidad peculiar por la psiquis o tiene efectos peculiares sobre la misma THC: Tetrahidrocanabinol, ∆-9-tetrahidrocannabinol, D-9-THC o delta-9-THC químicamente se conoce como dronabinol. Gran parte del contenido de THC de una planta se encuentra en forma de ácido o una variante menos potente y la aplicación de calor es indispensable para hacerlo totalmente disponible. Toxicocinética. Expresión en términos matemáticos de los procesos que experimenta una sustancia tóxica en su tránsito por el cuerpo (captación, absorción, distribución, biotransformación y eliminación). Considera la velocidad de los procesos y las variaciones de las concentraciones de las sustancias originales y de sus metabolitos en los compartimientos Toxicodinamia. Proceso de interacción de una sustancia tóxica con los lugares diana, y las consecuencias bioquímicas y fisiopatológicas que conducen a los efectos tóxicos. Trazas: Cantidad o concentración de analito que puede ser detectada pero no cuantificada con un cierto nivel de confianza, es decir, corresponde aquella concentración que está por sobre el límite de detección pero bajo el límite de cuantificación.
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Esta guía se terminó de editar en el Instituto de Salud Pública de Chile en 2015 durante la administración del Dr. Alex Figueroa Muñoz
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