Técnicas de cultivo

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GENÉTICA

FORESTAL

Técnicas de cultivo in vitro

América González Pasten

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Contenido Introducción .................................................................................................................................. 3 Justificación ................................................................................................................................... 4 Objetivo......................................................................................................................................... 5 Desarrollo...................................................................................................................................... 6 Conclusiones................................................................................................................................ 10 Bibliografía................................................................................................................................... 11

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Introducción El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristemo, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerará una o muchas plantas. Durante las últimas décadas, la técnica del cultivo “in vitro” ha ganado especial interés para el establecimiento de diversas plantas para la producción de compuestos o la obtención de cultivos más sanos y con características genéticas específicas. El cultivo in vitro de vegetales se basa en el aislamiento de órganos, tejidos o células vegetales y en el ajuste de las condiciones necesarias para la obtención de respuestas fisiológicas o morfogénicas a partir de estos explantes (Höxtermann, 1997).

La potencialidad de una célula diferenciada para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta. De este modo y desde la óptica de la conservación de especies vegetales la aparición de la variación espontánea no controlada y al azar durante el proceso del cultivo in vitro se convierte en un fenómeno inesperado y no deseado en la mayoría de los casos.

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Justificación La propagación por cultivo in vitro se basa en la multiplicación masiva de plantas dentro de vasos de cristal que contienen medio de cultivo estéril. Dicho medio de cultivo posee los componentes necesarios para que la planta se desarrolle (sales minerales, vitaminas, azucares y reguladores de crecimiento) La presencia de reguladores y el mantenimiento bajo condiciones adecuadas de luz y temperatura, favorece ciclos de crecimiento muchos más rápidos y sucesivos que los que se dan en condiciones naturales, pudiéndose obtener miles, o cientos de miles de plantas a partir de unas pocas yemas en un solo año.

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Objetivo El cultivo de tejidos vegetales es utilizado como herramienta fundamental en un número importante de áreas y técnicas de la investigación y la producción vegetal, todas ellas relacionadas con lo que actualmente se conoce como biotecnología vegetal.

A continuación se enumeran algunas de las más importantes: •

Estudios básicos de anatomía, desarrollo y nutrición vegetal.

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Variación somaclonal y gametoclonal a través de selección celular.

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Producción de plantas haploides a través de cultivo de anteras o cultivo de polen.

Rescate de óvulos fecundados y embriones de cruzamientos interespecíficos e intergenéricos

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Ingeniería Genética: incluye todas las técnicas que utilizan organismos vivos o sus componentes para producir o modificar sus productos. La variedad de aplicaciones incluye las áreas de energía, manejo medio ambiental y productos farmacéuticos y agrícolas.

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Micropropagación vegetal. Propagación clonal o propagación in vitro o propagación vegetativa.

Embriogénesis somática.

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Cultivo de meristemos para la eliminación de virus y enfermedades presentes en las plantas.

Producción de fitoquímicos o producción de sustancias de metabolismo secundario.

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Mejorar la calidad de productos forestales.

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Desarrollo

1.Homogeneidad del material obtenido La micropropagación por cultivo in vitro es una multiplicación asexual basada en la multiplicación axilar, a partir de yemas preexistentes, y continuada que favorece ciclos de crecimiento muchos más rápidos que los que se dan en condiciones naturales, pudiéndose obtener miles, o cientos de miles de plantas a partir de unas pocas yemas en un solo año. El hecho de haber partido de una única planta inicial hace que todas las plantas obtenidas mediante este método sean totalmente homogéneas geneticamente(clones).

2.Óptimo sistema radicular Uno de los factores más importantes a tener en cuenta como criterio de calidad de una planta es la superficie radicular y la relación raíz/parte aérea. Generalmente en una planta micropropagada el sistema radicular está formado por 3 ó más raíces en estrella, mientras que el caso de plantas de semilla con sistema radicular muy pivotante (poco ramificado) es solo una raíz la dominante.

Si bien es cierto que la pivotancia radicular, es una adaptación muy beneficiosa en los sistemas forestales y en determinados cultivos de secano, no lo es tanto cuando tenemos en cuenta los sistemas de cultivo actuales en fruticultura, en los que es necesaria una correcta distribución de las raíces en la franja de suelo útil para un mejor aprovechamiento del agua y los nutrientes.

3.Rapidez de multiplicación El proceso de multiplicación mediante cultivo in vitro permite obtener en apenas un año miles de plantas totalmente clonales, sanas y homogéneas a partir de unas pocas decenas de yemas, acortándose drásticamente los largos periodos que hay que esperar para obtener material de reproducción en cantidad suficiente como para abastecer las posibles demandas del mercado. El uso de este método puede ser realmente importante en el caso de que se obtengan nuevas variedades, tanto procedentes de cruces como de los obtenidos a partir nuevas técnicas biotecnológicas.

De todo lo mencionado hasta ahora se puede concluir que la micropropagación, es una herramienta a tener en consideración, sobre todo en casos puntuales de clones seleccionados y nuevos porta injertos, bien recalcitrantes al estaquillado, bien sea poco productor de semilla.

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Asimismo podemos mencionar algunos ejemplos concretos, en los que se puede ver totalmente justificado, la utilización del cultivo in vitro como sistema de multiplicación. Como ejemplos de lo anterior se pueden mencionar: 1) Casos en los que se pretenda obtener un número elevado de plantas de un portainjertos que no estaquille con facilidad o que no produzca suficiente semilla 2) Cuando la planta madre o material de partida presente patologías ( Virosis, bacteriosis...) y sea necesario su saneamiento. La propagación puede ser realizada a posteriori por métodos más económicos (caso del boniato que se estaquilla a partir de planta saneada in vitro y procedente de micropropagación).

3) En el caso de que se quieran implantar portainjertos y/o variedades de nueva aparición en un corto periodo de tiempo (1 año frente a los 3 ó 4 que hacen falta para planta de semilla y/o estaquillado).

De esta manera y en casos como los mencionados anteriormente es donde el cultivo in vitro se revela como un sistema de multiplicación totalmente viable y contrastada, por el que se puede obtener un tipo de planta de perfecta calidad. Las técnicas de micropropagación por cultivo in vitro representan la mejor alternativa actual para la clonación rápida que existe en el mercado; tanto para portainjertos seleccionados como para cultivares concretos. El cultivo in vitro ofrece asimismo la posibilidad de sanear y eliminar los virus de que esté afectada una planta, bien mediante el cultivo del meristemo, bien mediante el sistema utilizado con gran éxito en cítricos por parte del IVIA de tratamiento previo con termoterapia y posterior microinjerto (Navarro y otros 1975).

Asimismo otro aspecto a tener en cuenta es la posibilidad de micorrizar la planta producida.

Es muy importante en vivero producir planta de alta calidad. Para ello hay que tener en cuenta adicionalmente que en condiciones naturales más del 70% de las plantas que existen sobre la tierra están micorrizadas, y en la mayoría de los casos, éstas presentan un mayor desarrollo que las que no lo están (Barea y Azcón, 1983;). Está comprobado que los hongos micorricicos ayudan a las plantas a soportar mejor las condiciones estrés (sequía, salinidad, acumulación de metales pesados) y producen fitohormonas y metabolitos que les ayudan a defenderse de agresiones exteriores (Barea, 1990).

El proceso de aclimatación y producción en contenedor que exige el cultivo in vitro favorece las condiciones de la simbiosis planta-hongo y permite garantizar en vivero la micorrización controlada y específica de los hongos micorrícicos previamente aislados y seleccionados para nuestras condiciones edaficas y climáticas; por lo que además de la calidad de la planta producida por cultivo in vitro se puede añadir la facilidad para conseguir una micorrización controlada.

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Fases para realizar la propagación clonal por cultivo in vitro (figura1) A.

Elección de la planta y/o tejido donante de explantos. En esta fase se incluyen los tratamientos, preparación y selección de las plantas madre a partir de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad (especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad (libre de patógenos, deficiencias o estrés).

B.

Establecimiento: consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial para inducir: tallo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirán ventajosamente con el explanto

C.

Multiplicación: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.

D.

Enraizamiento: es el proceso de inducción de la formación de raíces con el fin de convertir a los brotes o embriones somáticos en plántulas completas. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas. Esta operación se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una soluciónconcentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosíntesis para obtener la energía necesaria para desarrollarse y formar las raíces.

E.

Rusticación: es el paso de aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algún sustrato inerte.

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El enraizamiento ex vitro permite que la fase de enraizamiento y la fase de aclimatación se logren simultáneamente y que raramente se forme callo en la base de los explantos, asegurando así una conexión vascular continua entre el vástago y la raíz.

Figura 1

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Conclusiones

Como respuesta tecnológica se ha evaluado diferentes alternativas para aumentar la disponibilidad de plantas a muy corto plazo, lo que es imposible de obtener en nuestro medio con métodos convencionales (propagación por estacas), pero sí es posible mediante el cultivo “in vitro”. Respondiendo a la creciente demanda de plantas por parte de viveristas y productores, se impulsó la transferencia de tecnología a través de una modalidad de franquicia, basada en el sistema AR-VITRO®, cuyo objetivo es contribuir a difundir una herramienta aplicable en forma eficiente a la propagación de variedades de arándano, en apoyo al desarrollo de la tecnología de micropropagación in vitro a escala comercial.

La tecnología de cultivo in vitro permite mejorar el acceso a una gran cantidad de plantas a partir de cantidades mínimas de material vegetal, y su desarrollo productivo representa una oportunidad de crecimiento y diversificación a nivel del sector forestal de nuestro país.

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Bibliografía - Barea, J. M. 1990. Micorrizas vesículo arbusculares. Manuales Universitarios del secretariado de publicaciones de la Universidad de Sevilla. Microbiología, pp. 271-278.

- Respuesta de dos clones de Pyrus calleryana a distintos medios de cultivo, setiembre 1992.

Castillo A; Capdevielle, F. La Biotecnología Aplicada a la Pord - Margara. Bases de la multiplicación vegetativa (1986)