La historia del canthin-6-ona : un potencial nuevo tratamiento de la enfermedad de Chagas aislado a partir de la planta paraguaya Z. chiloperone (tembetary hu) Alain FOURNET, PhD UMR217 - IRD Laboratorio de Farmacognosía Facultad de Farmacia-Paris 11 Châtenay-Malabry 92290 – Francia
Primer Congreso Paraguayo sobre Medio Ambiente y Desarrollo Sostenible Hotel Excelsior Asunción, Paraguay 28 Jul. 2010 – 30 Jul. 2010
Proporci贸n de nuevas drogas desarolladas durante el periodo 1975-2005 para las enfermedades desatendidas tropicales y la tuberculosis
Chirac P., Torreele E. Lancet. 2006 May 12; 1560-1561.
Métodos de selección
Criterios etnofarmacológicos y químiotaxonomicos (presencia de alcaloides) Actividad in vitro sobre tres cepas de Leishmania y tres clones de Trypanosoma cruzi
Zanthoxylum chiloperone var. angustifolium Engl. (Rutaceae)
tronco
frutas
Nombre vernacular: tembetary hu (tembĂŠ = labio, itĂ = piedra, y = arbol, hu = negro) Uso: antiparasitico, antimĂĄlarico, antiinflamatorio
Aislamiento y identificaci贸n de los principios activos
Esquema de extracción de la corteza del tronco de Zanthoxylum chiloperone (Rutaceae) Cortezas del tronco de Zanthoxylum chiloperone (1.9 kg) Amoladura y alcalinización Con NH4OH
Soxhlet CH2Cl2 y Soxhlet MeOH
Extracto CH2Cl2 44 g
Extracto MeOH 258.5 g
CC= columna cromatográfica CLHP = cromatografía líquida de alta performance
CC flash elución AcOEt/ CH2Cl2 (8:2)
f1 f2 3.81 g16.52 g
f3 2.32 g
f5 f6 f7 f8 f4 3.78 g 1.99 g 1.65 g 1.99 1.88 g g O (v/v) Et2O/Ac Cristalización en acetona 2
f3b f4a f4b F6a f3a 16.52 g 520 mg1.84 g 1.94soluble g 1.35 g canthin-6-ona 3.2 g
F6b insoluble 306 mg
f9 6.52 g
CLHP semi-preparativa con 197 mg 5-metoxi-canthin-6-ona 150 mg
MolĂŠculas responsables de la actividad antifĂşngica Candida albicans
Perfil CCM (a 254 nm)
5-metoxi-canthin-6-ona
canthin-6-ona
1 1
2
2
N-oxi-canthin-6-ona
3 3
34
4
Aspergillus fumigatus (cepa resistante)
C6 3
11 22
Saccharomyces cerevisiae
34
3
C6
1
2
Canthin-6-ona Candida albicans
11
22
3 34 C6
Cryptococcus neoformans
3
C6
1
2
Actividad antifĂşngica del canthin-6-ona y de 5-MeO-canthin-6-ona
Thouvenel C., Gantier J. C., Duret P., Fourneau C., Hocquemiller R., Ferreira M. E., Rojas de Arias A., Fournet A. (2003) Antifungal compounds from Zanthoxylum chiloperone var. angustifolium. Phytotherapy Research 17, 678-680
Estudio biol贸gico sobre Trypanosoma cruzi
Químoterapia existante de la enfermedad de Chagas Fase aguda
Benznidazole
Nifurtimox
Ningún tratamiento realmente eficaz para tratar la fase crónica
Drogas en estudio preclínico o en desarollo clínico
D0870 (Zeneca Pharmaceuticals)
BMS-207,147 (ravuconazole)
SCH56592 Posaconazole (Schering)
UR-9825 (Grupo Uriach)
TAK-187 (Takeda Co)
Compuestos antifúngicos de tipo triazoles
Características de la droga ideal para tratar la enfermedad de Chagas Nuevo tratamiento por adultos y niños eficaz en los estadios agudo y crónico Prioridad a la formulación pediatrica Eficaz contra todas las cepas de T. cruzi
Menos tóxico y más eficaz que las drogas en el mercado « Facil de uso » – Tratamiento de 30 dias maximo – De preferencia por via oral – De preferencia una vez por dia
Estable en medio tropical Costo abordable
Compuestos de origen natural activos in vivo sobre Trypanosoma cruzi
‌.no hay !!
Compuestos aislado y probados en la enfermedad de Chagas experimental
Canthin-6-ona
N-oxi-canthin-6-ona
N N
O
5-metoxi-canthin-6-ona
benzo[4,5]-canthin-6-ona
QuĂmoterapia de la enfermedad de Chagas
Efecto del benznidazole, canthin-6-ona y 5-MeO-canthin -6-ona en ratones Balb/c infectados con Trypanosoma cruzi en fase aguda Patente IRD/Universidad Nacional de Asuncion: PCT/FR03/03459 du 24/11/2003. J. Ethnopharmacol. 2007, 109, 258-263
Serología ensayos in vivo fase crónica (cepa CL, T. cruzi)
J. Ethnopharmacol., 2007, 109, 258
Serología: ELISA anti-T. cruzi. 1/ 75 dias post-infección; 15 dias post-tratamiento 2/ 105 dias post-infección; 45 dias post-tratamiento. Valor de P vs no tratados Patente IRD/Universidad Nacional de Asuncion: PCT/FR03/03459 du 24/11/2003
Nueva Estrategia de Desarollo - Investigación Para preservar el recurso natural: dos opciones
Extracción
•Uso de recursos renovables (hojas, frutos, semillas…) • Preparación de extractos estandarizados • Confirmación de la eficacia • Busqueda de socios industriales
Síntesis
•Preparación por via síntetica de una biblioteca de canthinonas • Optimización • Estudios de farmacología • Cambio de escala
ESTUDIOS A PARTIR DE LOS EXTRACTOS
La bioautografĂa Cryptococcus neoformans
Candida albicans Fase mobile : CH2Cl2/MeOH (8/2)
Extracto CH2Cl2
Extracto MeOH
Ketoconazole
Extracto CH2Cl2
Extracto MeOH Ketoconazole
Anรกlisis por HPLC
Cromatogramas de los productos de referencias (HPLC-UV)
Concentraciones en compuestos activos de los varios extractos preparados a partir de los diferentes organos de Z. chiloperone Canthin-6-one (mg/g extracto)
5-MeO-canthin6-one
N-oxido-canthin6-one
Corteza de tronco (diclorometano)
64,7
29,4
63,2
Corteza de tronco (metanol)
85,6
19,1
8,2
Hojas (diclorometano)
5.2
10.8
ND
Hojas (metanol)
2.5
5.0
ND
Frutos
ND
3.5
ND
Corteza de raiz
8.2
2.5
ND
Resina
0.6
5.0
1.9
ND= no detectado
Actividad tripanocida in vitro de los extractos de Z. chiloperone (formas tripomastigote e amastigote) Tripomastigotes (% lisis)*
Amastigotes Intracelulares (ÂľM)
Corteza de tronco (diclorometano)
51
-
Corteza de tronco (metanol)
56
-
Hojas (diclorometano)
73
-
Hojas (metanol)
78
-
Frutos
45
-
Corteza de raiz
48
-
Canthin-6-ona
79
15,1
90
5-metoxi-canthin-6-ona
75
15,1
66,4
100
-
-
87
192
97,5
Violeta de genciana Benznidazole *% de lisis a 250 Âľg/ml
% anti-amastigotes actividad
ACTIVIDAD IN VIVO DEL EXTRACTO ETANOLICO DE HOJAS SOBRE RATONES INFECTADOS CON T. CRUZI
Cepa CL
Cepa Y
Elaboración de una pomada antifúngica a base de un extracto total de la corteza de Z. chiloperone var. angustifolium
pomada
« pie de atleta » tratado con la pomada
Uña con infección fúngica
… y tratado con la pomada durante tres meses
ESTUDIOS A PARTIR DE LAS MOLECULAS DE SINTESIS
Síntesis química
Síntesis de la canthin-6-ona y sus análogos (ciclización de Bischler-Napieralski) R1 R3 R2
O
O
NH2
N H
R1
O
R3 R2
NH
O
N H
CH2Cl2, 18h, AT Amberlit H-15 ¨ MeOH, 18 h, 60¡C
O
HO R1 R3
R1
NH
R2
POCl3
N O R2
R3
N H
MeO
N H
refluxing benzene, 2h
MeO DBU, CH2Cl2, 18h, AT
N N
55 % O
O
O
Unos compuestos análogos obtenidos
10-metoxi-canthin-6-ona
9-fluoro-canthin-6-ona
1,4-di-fluorobenzo[4-5]canthin-6-ona
2-metil-canthin-6-ona
pirazino[4-5]-canthin-6-ona
Síntesis de más de 40 canthinonas
benzo[4-5]-canthin-6-ona
ciclohexil[4-5]-canthin-6-ona
Soriano-Agaton F., J. Nat. Prod. 2005, 68, 1581
Optimización de la síntesis
Majoramiento de los rendimientos (80-85 %) Preparación de 2-3 g de un golpe Nuevo metodo « one spot » Reducción drástica de los residuos y de los catalizadores con metales pesados
Enfoque del mecanismo de acci贸n Busqueda de blancos potenciales
Canthin-6-ona antif煤ngica se acumula en las gotas lipidicas y afecta el metabolismo de los acidos grasos de Saccharomyces cerevisiae
Localizaci贸n de canthin-6one en el colorante rojo de Nilo en Saccharomyces cerevisiae por microscopia confocal
Hipotesis: una estimulaci贸n de la cadena alkila de la enzima desaturasa. Los agentes antif煤ngico clasicos no afectan el nivel de desaturasa. Lagoutte et al., Biomed. Pharmacother. 2008, 62, 99
.
Actividad in vivo del canthin-6-ona C6 20 VO (canthin-6-one 20 mg/kg/j par voie orale)
C6 20 IP
100%
100%
80%
80%
60%
60%
40%
40%
Jours
Jours 20%
20%
0%
0% J0
J1
J2
J3
J4
J5
J6
J7
J8
J9
J10
J11
J12
J13
J0
J14
J1
J2
J3
J4
J5
J6
J7
J11
J12
J13
J14
C6 10 IP 100%
80%
% de survie
60% 40%
No tratado
20%
fluconazole
0%
Canthin-6-ona
J0
J1
J2
J3
J4
J5
J6
J7
J8
J9
J10
Jours
J8
J9
J10
J11
J12
J13
J14
Actividad in vivo de la 9-fluoro-canthin-6-ona C6-9F 20 VO 100% 80% % de survie
60% 40%
20% 0% J0
J1
J2
J3
J4
J5
J6
J7
J8
J9
J10
J11 J12 J13 J14 Jours
C6-9F 20 IP 100% 80%
% de survie
60%
40%
no tratado 9-fluro-canthin-6-one kĂŠtoconazole
20% 0% J0
J1
J2
J3
J4
J5
J6
J7
J8
J9
J10 J11 J12 J13 J14 Jours
Relación estructura-actividad
la metilación reduce la actividad
la metoxilación reduce la actividad 10
2
9
N
un atómo de fluor favorece la actividad
N 4 O
la quaternización reduce la actividad
5
auscencia de sustitución
Colaboraci贸n entre IRD y DNDi (Drugs for Neglected Diseases initiative)
Consorsio « canthin » IRD, CNRS, Paris 11 (Francia), Universidad Nacional de Asuncion (Paraguay): redes y proveedores de hits Centre for Drug Candidate Optimisation (CDCO), Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Australia, ADMET (administración, distribución, metabólismo, excreción y toxicología), bioensayos in vitro contra Trypanosoma cruzi Alpha Chimica (Francia): síntesis de canthin6-ona y derivados
OTROS ESTUDIOS CON CANTHIN-6-ONA
Estudio farmacéutico de la forma galénica Preparación de sales de canthinonas y ensayos de cristalización Perfíl fisicoquímico y formulación Estudio de la estabilidad física y química bajo estrés y estudio de polimorfismo Formulación relevante por la administración por via oral
Parametros farmacologicos de la canthin-6-ona
Propriedades fisicoquímicas – in silico predictions consistent with “drug-like” properties – Moderate to good aqueous solubility, pH dependent – Moderately protein bound (91.1%)
Intermediate to high in vitro metabolism (microsomes) – EH 0.80 (mouse); 0.63 (human)
High permeability in PAMPA (52% recovery)
In vivo mouse exposure – Rapidly absorbed following IP dosing; Cmax ~5 min – Good exposure following PO dosing; Cmax ~15min, exposure out to >7.5h – Data suggests reasonable oral BA
Structure-based toxicity alerts – No alerts – Toxicity: LD50 reported at around 400 mg/kg.
Perspectivas A corto plazo: • Micropropagación de plantines (comunidades campesinas en Itaipu) • Desarollo local de productos fitofarmacos con extractos para tratamiento de las infecciones fúngicas •Estudios complementarias de la actividad antichagasica, de toxicología del extracto Con las canthin-6-onas y derivados de síntesis: • Nuevos analogos, optimización de la síntesis, nuevas propriedades biológicas (malaria…), toxicología, cambio de escala (scale-up), farmacología, formulación…..
ANUNCIO Busquamos inversionistas o facilidores en Paraguay para desarollar productos antifĂşngicos a base de Z. chiloperone (hojas) Uso como fitofarmacos para medicinas humana y veterinaria
Muchas gracias a todas las personas que participaron a los estudios sobre Z. chiloperone y las canthin-6-onas Instituto de Investigaciones en las Ciencias de la Salud, Departamento de Medicina Tropical, Universidad de Asunción, Asunción, Paraguay - Dra Antonieta Rojas de Arias -Lic. Maria Elena Ferreira, - Lic. Ninfa Vera de Bilbao -Dra Alicia Schinini - Dr Hector Nakayama, - Lic. Susana de Ortiz, - Lic. Luis Sanabria, - Lic. Elva Serna
Laboratoire de Pharmacognosie, UMR 217(CNRS-Paris 11, IRD), Faculté de Pharmacie, Université ParisSud, Châtenay-Malabry France -Pr Reynald Hocquemiller Dr Bruno Figadère, Pr Erwan Poupon -- Dra Delphine Lagoutte Dra Flor Agaton Dr Gerardo Cebrian -Dr Alain Fournet CEDIC, Asuncion, Paraguay: Dra Antonieta Roja de Arias Dra Celeste Vega
Dra Miriam Rolon
Alpha Chimica, Faculté de Pharmacie, Châtenay-Malabry, France: Dr. Bernardin AKAGAH Dr Anh Tuan LORMIER
Muchas gracias por su atenci贸n !!