Biotechnology Frontier December 2013, Volume 2, Issue 4, PP.47-51
Study of Structure of Masson Pine Pollen Polysaccharide and Its Sulfated Derivatitive by Atomic Force Microscopy Yue Geng †, Yun Cai College of Life Science, Shandong Normal University, Key lab of Animal Resistance of Shandong Province, Jinan 250014, China †
Email: gengy@sdnu.edu.cn
Abstract Through AFM observations of Pinus massoniana pollen polysaccharide (PPM60-A) and its sulfated derivative (SPPM60-A), it was found that PPM60-A aggregated into well-proportioned, little round particles. SPPM60-A aggregated into bad-proportioned particles, the diameter was larger than PPM60-A, and had blame-like protuberance. It suggested that sulfated modification might change the space structure of polysaccharide. Keywords: Masson Pine Pollen; Polysaccharide; Sulfated Polysaccharides; Atomic Force Microscopy
马尾松花粉多糖及其酯化物的原子力显微镜比较 观察* 耿越，蔡云 山东师范大学生命科学学院，山东动物抗性重点实验室，山东 济南 250014 要：用原子力显微镜(AFM )对马尾松花粉多糖(PPM60-A)及其硫酸酯化物(SPPM60-A)的微观形貌进行观察, 发现
摘
PPM60-A 集聚成均匀的小圆球颗粒，SPPM60-A 圆球状颗粒直径增加，更加聚集，相连成片，具有火焰状突起。说明硫 酸酯化影响了多糖的空间结构. 关键词：马尾松花粉; 多糖; 硫酸酯化多糖; 原子力显微镜
引言 多糖结构的研究由来己久，但因其复杂性而远远落后于核酸和蛋白质的研究。近年来发现多糖的衍生物 尤其是硫酸酯化多糖具有独特的作用[1][2]，已成为当今多糖研究的又一个“兴奋点”。目前对国内对松花粉 多糖的研究报道还比较少，对其结构的分析尤其是硫酸酯化前后空间结构的变化研究更是不多。近年来本实 验室对马尾松花粉多糖的研究发现，硫酸酯化前后，其生物活性发生了很大的变化，差异显著，如对 HepG2 肝癌细胞增殖和细胞周期[3][4]，MIN6 细胞胰岛素分泌[5]，脾细胞[Ca2+]i 的影响[6]等。硫酸酯化对马尾松花粉 多糖活性的影响除了一级结构的变化，空间结构的改变同样值得关注。近年来 AFM 在多糖的结构研究中发 展很快，可以通过原子力显微镜直接观测糖分子的高级结构以及多糖形成的凝胶网络结构等[7]。 本文用原子力显微镜(AFM)观察马尾松花粉多糖(PPM60-A)及其硫酸酯化物(SPPM60-A)的微观形貌，探 究多糖硫酸酯化前后空间结构的改变，为多糖构效关系的研究提供一定的基础。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂 *
基金项目:山东省自然科学基金资助项目(No.Y2008D13) - 47 http://www.ivypub.org/bf/
马尾松(Pinus massoniana)花粉由烟台新时代天然营养品有限责任公司提供。Nanoscope(R)Ⅲ型原子力显 微镜。
1.2 马尾松花粉多糖的分离纯化 热水浸提，乙醇沉淀分级法提取 60%乙醇沉淀多糖组分(PPM60)，PPM60 经 Sephacryl S-400 凝胶柱层析 分离，三蒸水洗脱，苯酚-硫酸法[8]检测，收集各组分，经旋蒸浓缩，冷冻干燥后保存，各洗脱部分分别以 PPM60-A，B，C，D 命名。紫外检测无蛋白和核酸吸收，红外光谱具有典型的多糖特征。
1.3 马尾松花粉多糖的硫酸酯化 采用改良的Wolfrom法[9]，即氯磺酸-吡啶法对PPM60-A进行硫酸酯化，得到硫酸酯化多糖SPPM60-A。比 浊法测定含硫量，按公式 DS=(162×S)/(32－102×S)计算取代度。红外光谱证实硫酸酯化形成。
1.4 AFM 制样观察 将PPM60-A和SPPM60-A用三蒸水溶解，浓度为1μg/mL。用微量移液器取5 μL滴在新剥离的云母片上， 自然风干后置于原子力显微镜上测试。图像均在Tapping模式下获得，测试在室温和大气环境中进行，湿度为 50%-60%。探针为Si3N4，用200 μm长的微悬臂，力弹性常数为0.28 N/m[10]。
2 实验结果 2.1 SPPM60-A 取代度 测得 SPPM60-A 的取代度为 1.40。
2.2 AFM 观察 图 1 至图 3 是 PPM60-A 在云母片上的 AFM 图像，扫描范围为 5 µm×5 µm。图 1 是 PPM60-A 的原子力 显微镜平面图像，可见 PPM60-A 呈圆球状。图 2 是 PPM60-A 的原子力显微镜立体图像，侧面观察 PPM60-A 颗粒呈现微小突起。图 3 是 PPM60-A 原子力显微镜切面图，由高度图可以看出 PPM60-A 集聚成较均匀的圆 球状颗粒。用 version 5.30r3.sr3 软件分析计算，PPM60-A 颗粒直径约为 20-40 nm，高度约为 1-3 nm，粗糙度 为 0.294nm，密度为 57.45/nm2。在此视野下难以清晰地观察到颗粒之间的胶束连接。 SPPM60-A 的原子力显微镜图像如图 4-6 所示，扫描范围为 5 µm×5 µm。图 4 是 SPPM60-A 的原子力显 微镜平面图像，可见 SPPM60-A 呈更为聚集的圆球状。图 5 是 SPPM60-A 的原子力显微镜立体图像，侧面观 察 PPM60-A 颗粒呈明显的火焰状突起。颗粒之间的连接清晰明显，局部区域形成网状结构。图 6 是 SPPM60-A 原子力显微镜切面图，由高度图可以看出 PPM60-A 集聚成大小不均的圆球状颗粒。用 version 5.30r3.sr3 软件 分析计算，SPPM60-A 颗粒直径约为 20-70 nm，高度约为 5-8 nm，粗糙度为 0.606nm，密度为 97.39/nm2。
图 1 PPM60-A 原子力显微镜平面图像
图 2 PPM60-A 原子力显微镜立体图像
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图 3 PPM60-A 原子力显微镜切面分析，右侧曲线为左图中划线处的高度图
图 4 SPPM60-A 原子力显微镜平面图像
图 5 SPPM60-A 原子力显微镜立体图像
图 6 SPPM60-A 原子力显微镜切面分析，右侧曲线为左图中划线处的高度图
PPM60-A 经硫酸酯化后，空间形貌发生较大改变，如表 1 所示。经硫酸酯化后的马尾松花粉多糖体积有 所增大，空间构象得以伸展。表 1 的数据显示马尾松花粉多糖硫酸酯化后分子的聚集度明显增加，聚集体之 间分子胶束的缠绕更为明显。 表 1 PPM60-A 和 SPPM60-A AFM 的分析结果 形态
直径(nm)
高度(nm)
粗糙度(nm)
密度(/nm2)
PPM60-A
均匀圆球颗粒
20-40
1-3
0.294
57.45
SPPM60-A
密集的不均匀颗粒
20-70
5-8
0.606
97.39
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3 讨论 多糖经化学修饰后，分子结构发生变化，其空间结构也发生变化，其生物活性也会随之变化。因此， 应用原子力显微镜来观察多糖分子修饰前后的空间结构的变化，可为活性多糖的构效关系的探讨提供理论 依据。 多糖是由糖单元以 α-、β-糖苷键连接而成的直链或带有分支的线型大分子，其分子链可以卷曲成团或球， 也可以伸展成线状，并可缔合形成单股或多股螺旋或棒状，高级结构的形成取决于糖分子的一级结构（链的 长度和键接、分支程度、单糖组成等）。 PPM-A 和 SPPM-A 均显示出分子聚集体的存在，出现区域性聚集分布，这种结果是多糖分子链在云母片 表面干燥过程中发生移动而导致。酯化后这种聚集化更为明显，显示颗粒变大，聚集体之间的分子胶束缠绕 更加明显，这与多糖分子中引入硫酸基团有关。可见多糖的硫酸酯化不仅改变了多糖分子的一级结构，而且 对其空间构象也有明显的改变。有研究报道[8]白芨多糖经过硫酸酯化修饰后，硫酸酯基不仅改变了多糖的一 级结构，还使多糖带有大量的负电荷，从而使糖链的空间构象变得舒展，暴露出较多的羟基，造成极性增大， 增加了多糖的溶解度。推测在水溶液中，马尾松花粉多糖单个分子链倾向于转折卷曲，形成较为稳定的球状 结构或线团结构，由此也可推断马尾松花粉多糖的分子链柔性较大或分枝较多[11][12]。多糖硫酸酯化后多糖链 上引入硫酸基，多糖碳原子上的自由羟基被硫酸酯基取代，由于硫酸酯基之间的排斥作用导致糖环构象扭曲 或者转变，使多糖卷曲构象呈伸展状态。酯化前后活性的变化除了与一级结构变化有关外，与多糖空间结构 的改变之间存在何种联系，还需要深入的研究。 多糖的立体构型是决定多糖生物活性的决定因素之一，许多科学家认为多糖的高级结构对功能的影响比 一级结构重要。由于多糖结构的复杂性，目前对于多糖高级结构的研究还较少。AFM 已经为多糖结构的深入 研究提供了极大的方便，将 AFM 与其它现代表征手段联用是研究多糖高级结构的发展方向，具有广泛的应 用前景。
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【作者简介】 1
耿越（1965-），男，汉，博士，教授，
主要研究方向为天然产物与细胞生物
2
蔡云（1983-），女，汉，硕士，2010 年毕业于山东师范大
学生物系获理学硕士学位。Email: yunnan2007@sina.com
学。1985 年，1988 年毕业于山东师范大 学生物系分获理学学士学位和硕士学 位，1999 年同济大学获理学博士学位。 细胞生物学。Email: gengy@sdnu.edu.cn
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