Morfología Bacteriana AUTORES DOCENTES MICROBIOLOGIA
CLAUDIA FAJARDO URIBE MARCELA GOMEZ GARZON ADRIANA JIMENEZ ROJAS PATRICIA TRUJILLO ROMAN
Práctica #2 MORFOLOGIA Y ESTRUCTURAS BACTERIANAS OBJETIVOS Al finalizar la práctica los estudiantes podrán: Explicar la base biológica de la reacción de tinción de Gram Conocer las diferentes coloraciones empleadas en el área de microbiología Identificar las morfologías y estructuras bacterianas
INTRODUCCION Las bacterias presentan una amplia variedad de tamaños y formas. La mayoría presentan un tamaño diez veces menor que el de las células eucariotas, es decir, entre 0,5 y 5 ìm. La forma de las bacterias es muy variada y a menudo, una misma especie adopta distintos tipos morfológicos, lo que se conoce como pleomorfismo. De todas formas, podemos distinguir tres tipos fundamentales de bacterias: 1) Coco (del griego kókkos, grano): de forma esférica. o Diplococo: cocos en grupos de dos. (Ej.: Neisseria, Moraxella) o Cadenas. (Ej.: Streptococcus) o Racimos. (Ej.: Staphylococcus) 2) Bacilo (del latín baculus, varilla): en forma de bastoncillo. (Ej.: Bacillus, Clostridium, Enterobacterias) 3) Formas helicoidales: o Vibrio: ligeramente curvados y en forma de coma o cacahuete. (Ej.: Vibrio, Campylobacter) o Espirilo: en forma helicoidal o en forma de sacacorcho. (Spirillum) o Espiroqueta: en forma de tirabuzón (helicoidal flexible). (Ej.: Treponema) Debido a su tamaño pequeño, que en ocasiones está en el límite con la capacidad de resolución del microscopio de luz (0.23 ì), se visualizan mejor con coloraciones, aunque en algunas muestras como materia fecal, orina, secreción vaginal es posible verlas “en fresco” (mezcla de la muestra con solución salina).
COLORACION DE GRAM En 1884, el patólogo danés Christian Gram, descubrió un método para colorear bacterias. Usando dos colorantes en secuencia, cada uno de color diferente, él encontró que las bacterias podían ser divididas en dos grupos. El primer grupo retenía el colorante inicial, cristal violeta (este grupo fue llamado Grampositivo). El segundo grupo perdía el color inicial al ser lavado con una solución decolorizante pero tomaba el color del segundo colorante, o de contraste, como safranina (este segundo grupo se llama Gramnegativo). Una solución de yodo es usada como mordiente (un químico que fija el colorante en o sobre una sustancia por combinación con un colorante para formar un compuesto insoluble). El principio de esta coloración es que las bacterias pueden ser coloreadas con cualquier colorante, pero solo las que poseen más peptidoglicano y menos lípidos en la pared (Gram positivas) retiene el colorante inicial a pesar de la decoloración. Las bacterias que poseen más lípidos (Gram negativas) serán decoloradas y se requerirá de un colorante de contraste para poderlas visualizar.
La tinción de Gram no permite colorear cápsula, esporas, Micobacterias, Chlamydias, Mycoplasma, Riccketsias ni virus aunque algunas veces pueden sugerir su presencia.
Los cuatro pasos de la coloración de Gram pueden resumirse así: 1. Colorante primario – cubra el Frotis con cristal violeta durante un minuto. Todas las bacterias tomarán el colorante y se ven de color púrpura. Enjuague con agua para desactivar el colorante en exceso. 2. Mordiente - Se agrega Lugol y se deja interactuar durante un minuto con el cristal violeta. Este complejo será difícil de quitar de ciertas bacterias durante el siguiente paso (decoloración). El exceso de yodo se enjuaga con agua. 3. Decoloración – Alcohol acetona es brevemente aplicado a los frotis (10-20 segundos) seguido de un enjuague con agua. 4. Colorante de contraste- safranina se agrega durante 20 segundos, esta tiñe todas las células decolorizadas. No cambiará el color de las células que mantienen el cristal violeta.
OTRAS COLORACIONES COLORACION DE TINTA CHINA PARA CAPSULA La cápsula es una estructura de naturaleza polisacárida, que rodea a la pared celular que se encuentra presente en algunas bacterias. La cápsula no se colorea con la tinción de Gram. Para visualizarlas se requiere de coloraciones especiales como el mucicarmin que se emplea en ocasiones para teñir la cápsula del hongo Criptococcus neoformans. También se puede recurrir a la tinción negativo que si bien no colorea la cápsula, si la puede poner en evidencia porque establece un contraste que delimita la superficie externa de la estructura. El colorante que más se emplea es la tinta china negra que se homogeniza con una suspensión de bacterias.
PROCEDIMIENTO - Colocar una gota de S.S. sobre una lámina y agregar una cantidad muy pequeña de una colonia con asa. - Mezclar bien y agregar una gota de tinta china. Permitir que seque la preparación al aire. - Cubrir la preparación con solución de safranina durante 1 min. Lavar con agua.
COLORACION DE SCHAEFFER – FOULTON PARA ESPORAS La espora bacteriana es una estructura de resistencia que forman algunas bacterias en un medio físico adverso, por ejemplo cuando escasean los nutrientes, presencia de luz ultravioleta o metales pesados. Para formar la espora se requieren cambios en la pared celular que resultan en una estructura llamada corteza que aisla la bacteria del medio ambiente y mantiene protegido el DNA. Debido al alto contenido de calcio de la corteza, los colorantes corrientes empleados en frío no colorean la espora aunque en la coloración de Gram se puede deducir su presencia por los espacios vacios que se observan dentro de la bacteria. Cuando las condiciones ambientales son favorables, las esporas germinan y la célula vegetativa emergente puede reanudar su replicación. Las bacterias más comunes espora-formadores son bacilos Gram psotivos pertenecientes al género Bacillus (bacteria aerobia) y el género Clostridium (bacteria anaerobia).
Los métodos de tinción de esporas como el de Shaeffer Foulton utilizan calor para ayudar al colorante verde de malaquita a penetrar la superficie de la espora. La safranina se utiliza a continuación como un colorante de contraste. Así, las esporas se verán verdes y las células vegetativas rojas.
PROCEDIMIENTO -
Cubrir el extendido con verde de malaquita al 5%. Calentar hasta desprendimiento Lavar con agua. Cubrir con Safranina durante 30 segundos. Lavar con agua. Dejar secar al aire y observar al microscopio.
de vapores.
ACTIVIDADES 1) Observe e identifique las preparaciones microscópicas de bacterias. Dibújelas teniendo en cuenta morfología, agrupación y comportamiento frente al colorante de Gram.
COCOS GRAMPOSITIVOS EN GRUPOS
COCOS GRAMPOSITIVOS EN CADENAS
COCOS GRAMPOSITIVOS EN PARES
BACILOS GRAMPOSITIVOS
BACILOS GRAMPOSITIVOS RAMIFICADOS
BACILOS GRAMNEGATIVOS
COCOS GRAMNEGATIVOS EN PARES
FLOTA MIXTA: COCOS GRAMPOSITIVOS EN PARES BACILOS GRAMNEGATIVOS BACILOS GRAMPOSITIVOS ESPORULADOS
2) Observe e identifique las preparaciones microsc贸picas de bacterias. Dib煤jelas teniendo en cuenta la coloraci贸n empleada para cada estructura.
ESPORAS: COLORACION SCHAEFFER-FOULTON
BACILOS GRAMPOSITIVOS ENCAPSULADOS
CAPSULA : COLORACION TINTA CHINA
BACTERIAS MIXTAS EN FRESCO (MATERIA FECAL CON SOLUCION SALINA)
BACTERIAS MIXTAS (MATERIA FECAL COLOREADA CON GRAM)