Polycopie Ι :Instrumentation et méthodes de biologie et sécurité en laboratoire 01 Méthodes de Microscopies 02 Méthodes spectrales
03 Méthodes de fractionnements 04 Méthodes de marquages 05 Méthodes de biologie moléculaire
1
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes
1-Méthodes de microscopies : 1-1-Microscopie photonique : Elle fonctionne à la lumière blanche en utilisant le microscope optique comme instrument 1-2-Composition du microscope optique : a-Partie mécanique : 1-Vice macrométrique 2-Vice micrométrique 3-Platine 4-Condenseur b-Partie optique : 1-loupes objectives 2-lampe optique Dans la microscopie photonique le pouvoir séparateur du microscope est d’une valeur de 0,2 UM c’est la distance qui existe entre deux points.
2
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes
1-3-Microscopie électronique : On distingue deux types : 1-3-1-microscopie électronique à transmission 1-3-2-microscopie électronique à balayage 1-3-1-microscopie électronique à transmission Permet l’observation des ultrastructures de l’échantillon elle est applicable dans l’examen de coupe ultrafine de cellule son pouvoir séparateur est de l’ordre 4 A 4 A=0.0004ùm Un microscope électronique en transmission est composé des principaux éléments suivants :
d'un canon à électrons, qui fournit le faisceau électronique ; de lentilles magnétiques ; d'un système de détecteurs d'électrons.
1-3-2-Les techniques utilisées en microscopie électronique à transmission 1-Fixation chimique pour les spécimens biologiques visant à stabiliser la structure macromoléculaire mobile du spécimen par réticulationchimique des protéines avec des aldéhydes tels que le formaldéhyde et le glutaraldéhyde, et les lipides avec le tétroxyde d'osmium. 2-Cryofixation - gel rapide du spécimen, à la température de l'azote liquide voire de l'hélium liquide, afin que l'eau forme de la glace vitreuse (non cristalline). Cela préserve le spécimen dans un état instantané de sa solution. Tout un champ appelé cryo-microscopie électronique est dérivé de cette technique. Avec le développement de la cryo-microscopie électronique de sections vitreuses (CEMOVIS), il est maintenant possible d'observer des échantillons de pratiquement tous les spécimens biologiques dans un état proche de leur état naturel. 3-Déhydration - lyophilisation, ou remplacement de l'eau par des solvants organiques comme l'éthanol ou l'acétone, suivi de la phase critique de séchage ou d'infiltration de résines d'enrobage. 4-Intégration des spécimens biologiques : après la déshydratation des tissus pour l'observation dans le microscope électronique à transmission, le spécimen est intégré, c'est-à-dire sectionné. Pour ce faire, le tissu est passé au travers de «solvants de transition», tels que le propane et l'époxy puis infiltré avec une résine, telle que la résine époxy Araldite ; les tissus peuvent également être 3
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes
intégrés directement dans l'eau avec de la résine acrylique. Après la polymérisation (durcissement) de la résine, l'échantillon est sectionné en minces tranches et coloré ; il est alors prêt pour l'observation. 1-3-2-microscopie électronique à balayage :
Schéma MEB 1-3-2-1-Principe : Le microscope électronique à balayage (MEB ou SEM en anglais pour scanning electron microscopy) utilise un fin faisceau d'électrons, émis par un canon à électrons. Des lentilles électromagnétiques permettent de focaliser le faisceau d'électrons sur l'échantillon. L'interaction entre les électrons et l'échantillon provoque la formation d'électrons secondaires de plus faible énergie. Ils sont amplifiés puis détectés et convertis en un signal électrique. Ce processus est réalisé en chaque point de l'échantillon par un balayage du microscope. L'ensemble des signaux permet de reconstruire la typographie de l'échantillon et de fournir une image en relief. La préparation des échantillons est contraignante. Ils doivent être déshydratés puis subir un traitement pour devenir conducteur (fixation des tissus, nettoyage). L'échantillon est ensuite placé sur le porte-objet.
4
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes
1-3-2-2-Fonctionnement de l’appareil : Un microscope électronique à balayage est essentiellement composé d’un canon à électrons et d’une colonne électronique, dont la fonction est de produire une sonde électronique fine sur l’échantillon, d’une platine porte-objet permettant de déplacer l’échantillon dans les trois directions et de détecteurs permettant de capter et d’analyser les rayonnements émis par l’échantillon. En outre l’appareil doit nécessairement être équipé d’un système de pompes à vide 2-Méthodes spectrales : 2-1-La spectrométrie d'adsorption est une méthode de spectroscopie électromagnétique utilisée pour déterminer la concentration et la structure d'une substance en mesurant l'intensité du rayonnement électromagnétique qu'elle absorbe à des longueurs d'onde différentes. La spectroscopie d'absorption peut être une spectroscopie atomique ou unespectroscopie moléculaire. La spectrophotométrie est une méthode analytique quantitative qui consiste à mesurer l'absorbance ou la densité optique d'une substance chimique donnée, généralement en solution. Plus l'échantillon est concentré, plus il absorbe la lumière dans les limites de proportionnalité énoncées par la loi de Beer-Lambert. La densité optique des échantillons est déterminée par un spectrophotomètre préalablement étalonné sur la longueur d'onde d'absorption de la substance à étudier. 2-2-les lois : ( voir le manuscrit du cours) 3-Méthodes de fractionnement : 3-1-Définition de chromatographie : La chromatographie, méthode d’analyse physico-chimique, sépare les Constituants d’un mélange (les solutés) par entraînement au moyen d’une phase mobile (liquide ou gaz) le long d’une phase stationnaire (solide ou liquide fixé), grâce à la répartition sélective des solutés entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile). Les différents types de techniques chromatographiques La classification des chromatographies peut se faire en fonction des mécanismes de séparation. Les facteurs qui interviennent dans le partage des molécules à séparer entre les phases fixe et mobile sont : la solubilité dans un solvant liquide, 5
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes
la taille (la forme), la polarité, la charge électrique, la présence de groupements d’atomes formant des sites particuliers. Les différents types de chromatographie résultent du fait que l’on a privilégié l’effet de l’un de ces facteurs, mais l’exclusivité d’un mécanisme n’est jamais totale au cours d’une séparation chromatographique. Chromatographies en phase liquide (CPL ou CL ou encore LC pour liquid chromatography en anglais) Dans ce cas, la phase mobile est un liquide. Selon la nature de la phase stationnaire, on distingue : 3-2-Les chromatographies de partage La chromatographie de partage : C’est une chromatographie liquide-liquide. La phase stationnaire est un liquide fixé sur un support inerte (ex. : de l’eau sur la cellulose d’un papier). Cette chromatographie est ainsi dénommée car elle est basée sur le partage du soluté dans les deux phases liquides. La chromatographie d’exclusion : On l’appelle également chromatographie d’exclusion diffusion, tamisage moléculaire, gel-filtration ou perméation de gel. La phase stationnaire est un solide poreux : les grosses particules sont exclues de la phase fixe, en revanche, les petites particules incluses diffusent dans les pores du gel. 3-3-Les chromatographies d’adsorption La chromatographie d’adsorption : C’est une chromatographie liquide-solide. La phase stationnaire est un adsorbant solide polaire. La chromatographie d’adsorption en phase inverse : C’est une chromatographie liquide solide dans laquelle la phase stationnaire est apolaire. 3-4-La chromatographie sur échangeurs d’ions : La phase stationnaire est un échangeur d’ions constitué par une résine porteuse de groupements ionisés négativement ou positivement, exerçant des interactions de type électrostatique avec les solutés ioniques du milieu. 3-5-La chromatographie d’affinité : La phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte, sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité biologie (bio affinité), pour un soluté de l’échantillon à analyser (affinité enzyme-substrat, ligandrécepteur, antigène-anticorps). Chromatographies en phase gazeuse (CPG ou CG, ou encore GC pour Gas chromatography en anglais) 6
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes
La phase mobile est un gaz appelé gaz vecteur ou encore gaz porteur. On distingue dans ce cas : La chromatographie gaz-liquide : C’est une chromatographie de partage. La phase stationnaire est un liquide fixé par imbibition d’un support inerte. La chromatographie gaz-solide : C’est une chromatographie d’adsorption. La phase stationnaire est un solide adsorbant.
Schéma d’un montage à chromatographie 3-6-Rapport frontal : On appelle rapport frontal, RF (ou facteur de rétention, coefficient de migration), le rapport Distance parcourue par le soluté / Distance parcourue par le solvant. 4-Méthodes de Marquages : 4-1-Définition : les cellules des organismes vivants manifestent en dehors des états de multiplication et de développement ,il presque impossible d’observer les mouvements et les échanges à l’interieur de la cellule sauf avec le marquage par un élément radioactif qui produit des rayon détectable par la radiographie et donc les élément biologiques deviennent reconaissables et suivi. 4-2-L’utilisation de l’isotope: L'utilisation des isotopes en biologie apparaît comme un cas particulier, à l'échelle moléculaire, des méthodes de marquage ou de traçage antérieurement connues et appliquées, comme, par exemple, le baguage des oiseaux qui permet de déterminer leurs aires de dispersion et, dans le cas des oiseaux migrateurs, leurs routes de migration. De façon générale, il s'agit de reconnaître et de suivre, 7
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes
au sein d'ensembles généralement complexes, le devenir de constituants particuliers de ces ensembles. Le marquage (aussi appelé traçage) isotopique est appliqué à l'étude de multiples problèmes biochimiques et physiologiques : localisation des métabolites et des enzymes, mécanismes et vitesses des réactions métaboliques dans l'organisme et dans la cellule, suivi des phénomènes de captation, transport et accumulation, explorations fonctionnelles physio-pathologiques, détermination des vitesses de renouvellement des constituants et des structures biologiques. En application biomédicale, le marquage isotopique est utilisé notamment en pharmacocinétique et, étant donné sa sensibilité, en dosage radioimmunologique. 4-3-Application et exemple : Exemple 1 :L'iode 123 est un isotope de l'iode utilisé pour étudier le métabolisme thyroïdien. Ses radiations riches en photons gamma et sa demivie de 13 heures en font un agent bien adapté à l'imagerie Exemple 2 : Le gallium 67 est un isotope du gallium qui mime le métabolisme du fer. Utile pour imager la fonction de la moelle osseuse Exemple 3 : utilisations des radioisotopes en sédimentologie dynamique, permettent d'utiliser de nombreux radioisotopes, tels que: 21 Na - Fe - 12p et de disposer de quantités variables de matériaux radioactifs 4-4-Le marquage des acides nucléiques : In vitro, il est possible de marquer l'ADN dans sa masse. C’est-à-dire que l'on peut insérer des atomes radioactifs soit dans sa longueur (marquage interne), soit aux extrémités. On peut également utiliser des marqueurs fluorescents comme le bromure d'éthidium ou l'iodure de propidium, qui sont des agents intercalants des acides nucléiques, souvent employés pour révéler les électrophorèses 5-Méthodes de biologie moléculaire : 5-1-L’électrophorèse : L’électrophorèse sur gel d’agarose ou de polyacrylamide est une des techniques les plus communément utilisées pour l’étude de l’ADN aussi bien à des fins 8
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes
analytiques que préparatives. Elle permet l’identification, la séparation ainsi que la purification de fragments d’ADN en fonction de leur taille, préalable indispensable dans de multiples applications (notamment pour identifier des fragments d’ADN découpés par des enzymes ou pour identifier un gène... etc.). Les acides nucléiques étant des macromolécules polyanioniques uniformément chargées, elles peuvent migrer dans un champ électrique. La vitesse de migration d’une molécule d’acide nucléique dépend de plusieurs paramètres en particulier le nombre de paires de bases ou de bases et la concentration du gel en agarose. La quantité d’agarose utilisée dépend aussi de la taille de la plaque de gel. % en agarose 0,3 0,6 0,7 0,9 1,2 1,5 2
Taille des fragments en kb 5-60 1-20 0,8-10 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2
Les échantillons d’ADN à analyser, ainsi qu’un marqueur de poids moléculaire, sont mélangés à un colorant de charge, le bleu de bromophénol, ce qui permet de suivre leur migration au cours de l’électrophorèse. Une fois la migration arrêtée, le système est débranché et le gel est retiré du tampon TBE (Tris Borate EDTA) et déposé sur une table à UV où s’effectue sa visualisation. La quantité d’ADN présente sur le gel peut être estimée grâce à l’intensité de fluorescence émise par le BET (bromure d’éthidium) intercalant additionné à l’ADN à une concentration finale de 3%.
9
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes
PISTE 1: Marqueurs de taille (en paires de bases). PISTE 2: Echantillon d’ADN dont la taille est à déterminer
Photo de l’electrophorese 5-2-La centrifugation : La centrifugation est une technique de séparation rapide des particules solides (les plus lourdes) des substances en solution (moins lourdes). Une suspension de macromolécules peut éventuellement laisser sédimenter celles-ci sous l'effet du champ de pesanteur. Cependant, l'agitation thermique met en oeuvre des énergies bien supérieures à l'énergie potentielle de gravitation, pour une macromolécule se déplaçant sur quelques centimètres. 10
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes
Pour rendre possible la séparation, il faut travailler avec de très grandes accélérations. Ceci est possible avec des centrifugeuses ou ultracentrifugeuses. Ces appareils, sont composés des éléments suivants: 1- un moteur capable de tourner à plusieurs dizaines de milliers de tours par minute ; 2- un rotor, capable de supporter des rotations aussi rapides 5-3-La PCR et ses applications : Cette méthode de Biologie Moléculaire a été mise au point en 1985 par Kary Mullis, qui obtint pour ces travaux le prix Nobel de Chimie en 1993. Aujourd’hui, ce procédé révolutionnaire couplé à l’utilisation d’une ADN polymérase thermorésistante permet d’obtenir, sans clonage, une amplification considérable d’un fragment donné d’ADN. La réaction PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier. Pour se faire, une série de réactions permettant la réplication d’une matrice d’ADN double brin est répétée en boucle. Ainsi, au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant, l’amplification est donc exponentielle. Chacune des trois étapes, constituant un cycle de PCR, sont effectuées à des températures différentes permettant de contrôler l’activité enzymatique. Pour effectuer ces transitions de températures, les microtubes contenant le mélange réactionnel sont placés dans un appareil programmable : un thermocycleur. Cet appareil permet d’exposer les tubes à des températures choisies et pour des durées déterminées par l’expérimentateur. La réaction PCR est extrêmement rapide et ne dure que quelques heures (2 à 3 heures pour une PCR de 30 cycles). Pour avoir la réplication d’un ADN double brin, il faut agir en trois étapes : 1 - Il faut dénaturer l’ADN pour obtenir des matrices simple brin ; 2 -Borner et amorcer la réplication de la séquence à amplifier à l’aide d’oligonucléotides amorces spécifiques ; 3 - Réaliser la réaction de polymérisation du brin complémentaire. A la fin de chaque cycle, les produits sont sous forme d'ADN double brin. Applications : 1- Clonage du produit PCR (introduction dans un vecteur) 2- Séquençage direct du produit PCR.
11
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes
5-3-L’hybridation moléculaire : Fusion de l’ADN et notion de Tm: Lorsqu’un ADN bicaténaire est chauffé à une température supérieure à la température dite de fusion Tm, les deux brins de la molécule se séparent par suite de la rupture des liaisons hydrogène qui les maintiennent appariés. Le passage de la forme bicaténaire à la forme simple brin est brutal pour une très faible variation de température autour de la Tm, du fait du caractère coopératif de la réaction. Le passage de la forme bicaténaire à la forme mono-brin s’objective très facilement par simple mesure de la variation de densité optique à 260nm, le coefficient d’extinction de l’ADN monocaténaire étant sensiblement plus élevé que celui de l’ADN bicaténaire (effet hyperchrome). Plus Plus un fragment d’ADN est long, plus le nombre de liaisons hydrogène entre les brins est important, et plus l’énergie requise pour la séparation des brins est grande. Il en résulte que la température de fusion sera d’autant plus grande que l’ADN sera plus long. D’autre part, compte tenu de la différence du nombre de liaisons hydrogène (3 entre G et C, 2 entre A et T), il est évident que la composition en bases sera un facteur important dans la stabilité d’un ADN bicaténaire. Applications : 1-comparaison des tailles de génomes sans séquences répétitives (virus, bactéries, mitochondries..). le Cot1/2 sera directement fonction de la taille du génome. 2-analyse globale des pourcentages d’homologie de séquence entre deux espèces proches : A réaction complète, le % d’hybrides peut être assimilé grossièrement au % de séquences homologues. 3-analyse des séquences répétitives : qui auront tendance à provoquer une déformation du début de la courbe représentant la cinétique d’hybridation du fait que les séquences répétitives possèdent une cinétique de réassociation plus rapide. 5-4-Séquençage de l’ADN : La détermination de la séquence en acides aminés d’une protéine est un travail difficile et long, voire parfois impossible à réaliser dans son intégralité. Toute la difficulté résulte du fait qu’elle ne peut être effectuée qu’à partir de très grandes quantités d’une protéine ultra-pure. Cet écueil majeur n’existe pas avec les acides nucléiques puisque le clonage permet d’obtenir la séquence à analyser en 12
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes
quantités illimitées, et ce avec une pureté théoriquement absolue. Cette technique utilise les connaissances qui ont été acquises depuis une trentaine d'années sur les mécanismes de la réplication de l'ADN. C’est aujourd'hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie. En effet, avec les systèmes mis au point, la puissance des vecteurs maintenant utilisés et les moyens informatiques dont peuvent disposer les laboratoires même les plus petits, la détermination de la séquence d’un acide nucléique ne pose plus guère de problèmes et est extrêmement rapide. A tel point que la détermination de la totalité de la séquence du génome humain (3000000000 de paires de bases environ) a cessé d’être un objectif chimérique. De manière schématique, deux grands principes sont utilisés : a-Méthode chimique 1- Avant toute détermination l’ADN doit être purifié sous forme simple brin, 32 puis marqué à l’une de ses extrémités par le P . 2- Il est alors séparé en quatre aliquotes qui subiront chacune un traitement chimique particulier. 3- Les produits utilisés altèrent de façon absolument spécifique un type de base. En pratique les réactifs utilisés clivent spécifiquement les 5 catégories suivantes : G, A, C, G et A, T et C. Par exemple, la coupure après la guanine consiste en un retrait de la base suivi par une destruction, par de la piperidine, du désoxyribose. Cette coupure ne s’effectue qu’avec un très faible rendement, ce qui fait que moins de 2% des bases sont touchées. Il en résulte que statistiquement, chaque copie de la séquence ne sera coupée qu’une seule fois et en un endroit différent. Après séparation électrophorétique (PAGE) la lecture de l’autoradiographie révèle la séquence du brin d’ADN. b-Méthode enzymatique par les di-désoxynucléotides (Sanger) : Les ADN polymérases sont capables de synthétiser un brin complémentaire d'ADN, à partir d'un brin matrice. Pour le séquençage des nucléotides légèrement différents sont utilisés: les didésoxyribonucléotides (ddNTP) au lieu des désoxyribonucléotides triphosphate (dNTP). Les ddNTP diffèrent des dNTP par l'absence d'un groupement OH en position 3’. Ainsi lorsqu'une ADN polymérase utilise un ddNTP, elle n'est plus capable de rajouter le moindre nucléotide à sa suite : la synthèse du brin d'ADN s'arrête. Ainsi, il faut préparer 4 mélanges: 1- le fragment qui doit être séquencé 13
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes
2- un petit morceau d'ADN dont la séquence est complémentaire à l'extrémité 3' du fragment à séquencer = amorce 3- les 4 dNTP's (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) 3- l'ADN polymérase 4- dans chaque tube, de petites quantités d'un ddNTP fluorescent ou radioactif son incorporation aléatoire stoppant la synthèse On obtient à la fin des réactions un ensemble de brins d'ADN de tailles variées, selon l'endroit où un ddNTP se sera inséré et que la réaction aura ainsi été stoppée. L'utilisation d'un ddNTP permet d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN de différentes tailles, correspondant aux emplacements d'un nucléotide donné NB : synthèse du brin complémentaire, donc si arrêt par un ddGTP, c'est qu'il y a une Cytosine sur la séquence 1- Électrophorèse sur gel d'acrylamide. 2- Détection des fragments d'ADN, soit en regardant la fluorescence, soit en exposant un film photographique au gel selon le marquage du ddNTP 3- lecture de la séquence nucléotidique. Il existe actuellement des séquenceurs automatiques capables de réaliser les réactions de séquence, puis de les lire. Une fois la réaction de séquence terminée 6-Extraction de l’ADN : L'extractation de l'ADN est une technique permettant d'isoler l'ADN de cellules ou de tissus. L'ADN ainsi extrait peut ensuite être utilisé pour des recherches de biologie moléculaire, telles que le séquençage, la PCR ou le clonage. Il existe différents protocoles pour extraire l'ADN, qui suivent approximativement le même schéma de principe : 1-Lyse des cellules 2-Elimination des protéines 3-Elimination des autres acides nucléiques (ARN, etc.) 4-Concentration de l'ADN par précipitation à l'alcool Différentes variantes sont employées, suivant que l'on cherche à extraire de l'ADN génomique (issu du ou des chromosomes des cellules analysées) ou de l'ADN plasmidique (provenant de plasmides portés le plus souvent par des cellules bactériennes comme Escherichia coli). Il existe aujourd'hui des kits
14
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes
commerciaux permettant de réaliser rapidement ces extractions à l'aide de réactifs prêts à l'emploi.
15
Mr :Ziri Mohammed Abderrahmane /responsable du module :Instrumentation et Méthodes