[PDF Download] Reverse genetics of rna viruses methods and protocols methods in molecular biology 27
Reverse Genetics of RNA Viruses
Methods and Protocols Methods in Molecular Biology 2733 2nd Edition
Daniel R. Perez
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Synthetic Biology Methods and Protocols Methods in Molecular Biology 2760 2nd Edition Braman Jeffrey Carl Edt
University of Hertfordshire Hatfield, Hertfordshire, UK
For further volumes: http://www.springer.com/series/7651
For over 35 years, biological scientists have come to rely on the research protocols and methodologies in the critically acclaimed Methods in Molecular Biology series. The series was the first to introduce the step-by-step protocols approach that has become the standard in all biomedical protocol publishing. Each protocol is provided in readily-reproducible step-bystep fashion, opening with an introductory overview, a list of the materials and reagents needed to complete the experiment, and followed by a detailed procedure that is supported with a helpful notes section offering tips and tricks of the trade as well as troubleshooting advice. These hallmark features were introduced by series editor Dr. John Walker and constitute the key ingredient in each and every volume of the Methods in Molecular Biology series. Tested and trusted, comprehensive and reliable, all protocols from the series are indexed in PubMed.
ReverseGeneticsofRNAViruses
Methods and Protocols
Second Edition
Edited by Daniel R. Pérez
College of Veterinary Medicine, University of Georgia, Athens, GA, USA
Editor Daniel R. Pe ´ rez
College of Veterinary Medicine
University of Georgia
Athens, GA, USA
ISSN 1064-3745ISSN 1940-6029 (electronic)
Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-0716-3532-2ISBN 978-1-0716-3533-9 (eBook) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3533-9
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Preface
Reverse Genetics of RNAViruses: Methods and Protocols, Second Edition follows the footsteps of the first edition with the incorporation of new chapters and modifications of some of the old chapters to highlight alternative methods and approaches for the manipulation of RNA viruses. This second edition complements and does not replace the first edition which continues to be relevant to this date. The term “reverse genetics” is an approach to unravel the function of a gene by establishing and analyzing the phenotypic effects of synthetically engineered gene sequences. For RNA viruses, reverse genetics implies the de novo reconstitution of the virus from a cDNA copy. Using molecular biology, cDNA copies of RNA viruses are cloned into a variety of vectors, most typically and in order of preference, plasmids, bacterial artificial chromosomes or bacmids, or recombinant viral vectors. Considered the holy grail to study RNA viruses, reverse genetics has truly revolutionized our understanding of pathogenesis, host range, and transmission of a myriad of RNA viruses. In recent years and despite the sounding alarms of those that warn against this type of research, reverse genetics has been instrumental in identifying and characterizing virulent markers in RNA viruses and in producing innocuous viral progenies and reporter systems that can be safely handled in the lab as surrogates for development of vaccines and antivirals. Reverse genetics and synthetic biology played a crucial role in the timely production of protective vaccines against influenza during the 2009 H1N1 pandemic. And prior research using reverse genetics systems of coronaviruses led to the realization and manipulation of key elements of the Spike glycoprotein of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) to produce in record time the highly effective mRNAs vaccines that helped curtail the effects of the COVID-19 pandemic.
Here we have compiled 15 chapters summarizing reverse genetics breakthroughs and detailed protocols. As with the first edition, the book does not cover every reverse genetics protocol for every RNA virus. And like the first edition, this book would not have been possible without the outstanding and most generous contributions of our authors who are leaders in their respective fields and that have shared their insights and step-by-step protocols to help you, our colleagues, with your own research endeavors. Reverse genetics will continue to play a fundamental role in studying RNA viruses, identifying markers of host range, disease, and transmission, and in helping us with the further the development of in silico computational biology tools and artificial intelligence algorithms that can better predict the emergence of pathogens that threaten food security and/or carry greater zoonotic and/or pandemic potential.
I hope you find this book helpful.
Athens, GA, USADaniel R. Pe´rez
Arantza Cobela-Garcı ´ a, Ignacio Mena, and Adolfo Garcı ´ a-Sastre
Joaquin Caceres, L. Claire Gay, Flavio Cargnin Faccin, and Daniel R. Pe´rez
5 Reverse Genetics of Bat Influenza A
Susanne Kessler, Adolfo Garcı ´ a-Sastre, Martin Schwemmle, and Kevin Ciminski
6 Rescue of Infectious Salmon Anemia Virus (ISAV) from Cloned cDNA
Daniela Toro-Ascuy, Matı ´ as Ca ´ rdenas, Yesseny Va ´ squez-Martı ´ nez, and Marcelo Cortez-San Martı ´ n
Breanna Tercero and Shinji Makino 8 Plasmid-Based Lassa Virus Reverse
Luis Martı ´ nez-Sobrido, Chengjin Ye, and Juan Carlos de la Torre 9 Bacterial Artificial Chromosome Reverse Genetics Approaches for SARS-CoV-2
Kevin Chiem, Aitor Nogales, Fernando Almaza ´ n, Chengjin Ye, and Luis Martı ´ nez-Sobrido 10 Construction of
Thinesshwary Yogarajah and Justin Jang Hann Chu 11 Reverse Genetics of Hepatitis C Virus Using an RNA Polymerase I-Mediated Transcription
Ryosuke Suzuki and Tetsuro Suzuki
12 Reverse Genetics of Zika Virus Using a Bacterial Artificial Chromosome
Aitor Nogales, Luis Martı ´ nez-Sobrido, and Fernando Almaza ´ n
13 A Stable Reverse Genetics System of Zika Virus Based on a Self-Splicing Group II Intron .
Zhong-Yu Liu, Xiao-Feng Li, and Cheng-Feng Qin
14 Reverse Genetics of Dengue Virus
Jose´ Valter Joaquim Silva Ju ´ nior, Andre´a Nazare´ Monteiro Rangel da Silva, Jefferson Jose´ da Silva Santos, and Laura Helena Vega Gonzales Gil
15 Recovery of Recombinant Rotaviruses by Reverse Genetics
Chantal A. Agbemabiese, Asha A. Philip, and John T. Patton
Index
Contributors
CHANTAL A. AGBEMABIESE • Noguchi Memorial Institute for Medical Research, University of Ghana, Accra, Ghana; Department of Biology, Indiana University, Bloomington, IN, USA
FERNANDO ALMAZA ´ N • Department of Molecular and Cell Biology, Centro Nacional de Biotecnologı ´ a (CNB), CSIC, Madrid, Spain
BIANCA S. BODMER • Institute of Molecular Virology and Cell Biology, Friedrich-LoefflerInstitut, Greifswald, Insel Riems, Germany
C. JOAQUIN CACERES • Department of Population Health, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, Athens, GA, USA
MATI ´ AS CA ´ RDENAS • Department of Population Health College of Veterinary Medicine, University of Georgia, Athens, GA, USA
KEVIN CHIEM • Texas Biomedical Research Institute, San Antonio, TX, USA
JUSTIN JANG HANN CHU • Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University Health System, Singapore, Singapore
KEVIN CIMINSKI • Institute of Virology, Medical Center – University of Freiburg, Freiburg, Germany; Faculty of Medicine, University of Freiburg, Freiburg, Germany
ARANTZA COBELA-GARCI ´ A • Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA; Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine, Hamburg, Germany; Faculty of Mathematics, Informatics and Natural Sciences, University Hamburg, Hamburg, Germany
MARCELO CORTEZ-SAN MARTI ´ N • Laboratory of Molecular Virology and Pathogens Control, Faculty of Chemistry and Biology, University of Santiago de Chile, Santiago, Chile
ANDRE ´ A NAZARE ´ MONTEIRO RANGEL DA SILVA • Virology Laboratory, Institute of Biological Sciences, Federal University of Para ´ , Bele´m, PA, Brazil
JEFFERSON JOSE ´ DA SILVA SANTOS • Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA
JUAN CARLOS DE LA TORRE • Department of Immunology and Microbial Science, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA
FLAVIO CARGNIN FACCIN • Department of Population Health, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, Athens, GA, USA
ADOLFO GARCI ´ A-SASTRE • Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA; Global Health and Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA; Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA; The Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA; Department of Pathology, Molecular and Cell-Based Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA
L. CLAIRE GAY • Department of Population Health, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, Athens, GA, USA
LAURA HELENA VEGA GONZALES GIL • Laboratory of Virology and Experimental Therapy, Aggeu Magalhaes Institute, Oswaldo Cruz Foundation, Recife, PE, Brazil
GRIFFIN HAAS • Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA
THOMAS HOENEN • Institute of Molecular Virology and Cell Biology, Friedrich-LoefflerInstitut, Greifswald, Insel Riems, Germany
SUSANNE KESSLER • Institute of Virology, Medical Center – University of Freiburg, Freiburg, Germany; Faculty of Medicine, University of Freiburg, Freiburg, Germany
BENHUR LEE • Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA
XIAO-FENG LI • Department of Virology, State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology, AMMS, Beijing, China
ZHONG-YU LIU • School of Medicine, Sun Yat-sen University, Shenzhen, China
SHINJI MAKINO • Departments of Microbiology and Immunology, Galveston, TX, USA; Institute of Human Infection and Immunity, Galveston, TX, USA; Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases, Galveston, TX, USA; UTMB Center for Tropical Diseases, Galveston, TX, USA; The Sealy Institute for Vaccine Sciences, Galveston, TX, USA
LUIS MARTI ´ NEZ-SOBRIDO • Texas Biomedical Research Institute, San Antonio, TX, USA
IGNACIO MENA • Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA; Global Health and Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA; Department of Immunology and Microbiology, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA
AITOR NOGALES • Centro de Investigacion en Sanidad Animal (CISA-INIA/CSIC), Madrid, Spain
JOHN T. PATTON • Department of Biology, Indiana University, Bloomington, IN, USA
DANIEL R. PE ´ REZ • Department of Population Health, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, Athens, GA, USA
ASHA A. PHILIP • Department of Biology, Indiana University, Bloomington, IN, USA; CSL Seqirus, Waltham, MA, USA
CHENG-FENG QIN • Department of Virology, State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology, AMMS, Beijing, China
MARTIN SCHWEMMLE • Institute of Virology, Medical Center – University of Freiburg, Freiburg, Germany; Faculty of Medicine, University of Freiburg, Freiburg, Germany
JOSE ´ VALTER JOAQUIM SILVA JU ´ NIOR • Virology Sector, Department of Preventive Veterinary Medicine, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS, Brazil; Virology Sector, Laboratory of Immunopathology Keizo Asami, Federal University of Pernambuco, Recife, PE, Brazil
RYOSUKE SUZUKI • Department of Virology II, National Institute of Infectious Diseases, Tokyo, Japan
TETSURO SUZUKI • Department of Microbiology and Immunology, Hamamatsu University School of Medicine, Hamamatsu, Japan
BREANNA TERCERO • Departments of Microbiology and Immunology, Galveston, TX, USA
DANIELA TORO-ASCUY • Laboratory of Virology, Department of Biology, Faculty of Sciences, Universidad de Chile, Santiago, Chile
YESSENY VA ´ SQUEZ-MARTI ´ NEZ • Escuela de Medicina, Faculty of Health Sciences, University of Santiago de Chile, Santiago, Chile
CHENGJIN YE • Texas Biomedical Research Institute, San Antonio, TX, USA
THINESSHWARY YOGARAJAH • Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University Health System, National University of Singapore, Singapore, Singapore
Reverse Genetics Systems for Filoviruses
Bianca S. Bodmer and Thomas Hoenen
Abstract
Filoviruses are causative agents of severe hemorrhagic fevers with high case fatality rates in humans. For studies of virus biology and the subsequent development of countermeasures, reverse genetic systems, and especially those facilitating the generation of recombinant filoviruses, are indispensable. Here, we describe the generation of recombinant filoviruses from cDNA.
Filoviruses are classified in the order Mononegavirales and comprise four genera that are associated with infections in mammals (i.e. the genus Orthoebolavirus, Orthomarburgvirus, Cuevavirus, and Dianlovirus). At least two of these (the ebolaviruses and the marburgviruses) include viruses that are responsible for human infections where they cause severe hemorrhagic fevers with high case fatality rates (CFR). Consequently, all filoviruses are currently classified as biosafety level (BSL) 4 agents [1–3]. Of the six ebolaviruses that are known as of now, four are linked to human disease (i.e., Ebola virus (EBOV), Sudan virus, Bundibugyo virus, and Taı¨ Forest virus), while Reston virus is apathogenic in humans. Of these, the most virulent is EBOV, which was also responsible for the two most extensive outbreaks of filovirus disease ever reported: one in 2013–2016, with over 28,600 cases and 11,300 deaths (CFR 40%) and the other in 2018–2020, with nearly 3470 cases and 2280 deaths (CFR 66%) [3–5]. Importantly, increasing virus discover y efforts have led to the identification of several novel filoviruses of unknown pathogenic potential, e.g., Bombali virus (genus: Orthoebolavirus) in West Africa, Lloviu virus (genus: Cuevavirus) in Europe, and Me ˇ ngla ` virus (genus: Dianlovirus)i
China clearly showing that filoviruses have a much larger geographic distribution than previously believed. Further, this highlights the need for the development of broadly acting countermeasures to combat both the possible emergence of new filoviruses and future outbreaks of those that are already known [6–8]. Indeed, the unprecedented extent of the EBOV outbreaks in 2013–2016 and 2018–2020 has spurred research on antivirals and resulted in the approval of two EBOV-specific antibody-based treatments by the Federal Drug Administration (FDA) [9, 10]. Additionally, a vaccine based on an attenuated replication-competent vesicular stomatitis virus (VSV) that encodes the EBOV glycoprotein (GP) instead of the VSV glycoprotein has been approved by the FDA and European Medicines Agency (EMA) and was administered to over 300,000 people in ring vaccinations during the 2018–2020 outbreak [5, 11, 12]. Furthermore, the EMA approved a heterologous prime boost regimen based on two other vector vaccines (i.e., a GP-expressing adenovirus followed by a GP-expressing modified vaccinia Ankara) for use under exceptional circumstances in 2020 [13, 14]. Nevertheless, the dimensions of these recent ebolavirus disease outbreaks (in the case of the latter one, despite the use of ring vaccination) emphasizes the need for additional research efforts on filoviruses, and particularly those focused on identifying new therapeutic approaches. However, understanding the molecular biology of filoviruses is a prerequisite for both the development and testing of possible countermeasures. Importantly, reverse genetics can assist in these endeavors, and can be of particular use for work on novel filoviruses, since for many of these viruses, isolates are not available, and only their sequences are known.
The single-stranded, negative-sense RNA genome of filoviruses encodes for seven structural proteins. It is encapsidated by the nucleoprotein (NP), which together with the viral polymerase L, the viral protein 30 (VP30), a transcriptional activator for ebolaviruses, and VP35, a polymerase co-factor and interferon (IFN) antagonist, forms the ribonucleoprotein complex (RNP). These proteins also represent the minimal components required for replication and transcription of the viral RNA [15]. Further, the available data suggest that the nucleocapsid-associated protein VP24 condenses the RNP into a form that is no longer able to serve as a template for viral RNA synthesis, but is now able to be incorporated into nascent virions [16, 17]. For ebolaviruses and cuevaviruses, VP24 is also an IFN antagonist [18–20]. Budding and morphogenesis of the virus particles, which have a typical threadlike shape, is driven by the matrix protein VP40, which also acts as an IFN antagonist for marburgviruses [21, 22]. GP is embedded in the host cell-derived virus membrane and mediates attachment and fusion with target cells [23].
Reverse genetics can be used to model specific aspects of the filovirus life cycle, including replication and transcription, morphogenesis, budding, and entry outside of high-containment facilities (i.e., under BSL1 or BSL2 conditions, depending on local regulations) through the application of life cycle modeling systems (reviewed in [24]). Further, reverse genetic-based full-length clone systems allow the generation of recombinant viruses (including those that contain mutations in the virus genome) that are infectious and thus allow us to study the whole filovirus life cycle but must be used under BSL4 conditions. Here, we focus on the procedure for generating (or “rescuing”) full-length ebolaviruses (Fig. 1). In such a full-length system, the genetic information for the full-length ebolavirus genome is provided as a cDNA copy on a plasmid. Initial transcription from this plasmid results in the production of a cRNA antigenome. Traditionally, this transcription of the viral genome is facilitated by T7 RNA polymerase, which is co-expressed from another plasmid [25, 26]. The resulting cRNA is then recognized by RNP proteins, co-expressed from additional expression plasmids (usually PolII-driven, e.g., pCAGGS) and illegitimately encapsidated and replicated into vRNA. This vRNA can then be transcribed to produce all seven viral mRNAs, which in turn are translated to produce each of the viral proteins. These then support further viral RNA synthesis as well as all other steps in the viral life cycle, up to and including the budding of infectious ebolaviruses. By modifying the full-length genome plasmid, recombinant viruses can also be generated using this approach and used in subsequent experiments to study any and all aspects of the molecular biology of ebolaviruses. For example, such viruses have already been used to study the biology of inclusion bodies [27], virus-host interactions [28, 29], and pathogenicity determinants [30–33]. At the same time, the introduction of reporter genes (e.g., fluorescent proteins or luciferases) has extended the applications of such viruses to include high-throughput screening approaches (for instance, in antiviral testing or the identification of interacting host factors), as well as the analysis of cellular processes via imaging techniques [34, 35] and even in vivo applications [36]. In the following sections, a detailed protocol is described for the rescue of recombinant EBOV from cDNA; however, the rescue of other recombinant filoviruses is similar so that this protocol can also be adapted accordingly.
2 Materials
2.1 Rescue and Passaging of Viruses
1. Cells for initial rescue and passaging, e.g., VeroE6, HEK293T, or Huh7 cells (see Note 1).
Fig. 1 Schematic depiction of processes taking place during a filovirus rescue. Cells are transfected with plasmids encoding a cDNA copy of the full-length viral genome (rgZ) and each of the viral ribonucleoprotein complex (RNP) components, i.e., L, VP35, VP30, and NP. A plasmid encoding the T7 RNA polymerase is also transfected. Initial transcription of the viral genome-encoding plasmid by T7 RNA polymerase (A) results in a “naked” full-length antigenome (cRNA), which is subsequently illegitimately encapsidated (B) by the viral RNP proteins. At this point, it can then serve as a template for genome replication (C) to produce genomic RNA (vRNA), which is encapsidated to form RNPs. These vRNA-containing RNPs can undergo not only replication but also transcription of viral mRNAs encoding each of the viral proteins (D). This results in translation of the viral proteins (E), which further encapsidate newly replicated genomes and antigenomes (F) to mediate further viral RNA synthesis, but also mediate additional steps in the morphogenesis and budding of recombinant virus particles (G)
2.2 Sequence
Confirmation of Rescued Viruses
2. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with 10% (v/v) or 5% (v/v) fetal bovine serum (FBS, heat-inactivated for 30 min at 56 °C), 1% L-glutamine (Q, 2 mM), and 1% penicillin/streptomycin (PS, 100 U/mL).
3. OptiMEM.
4. 6-well plates and T150 tissue culture flasks.
5. Transit-LT1 transfection reagent.
6. Cell scrapers, 50 mL centrifuge tubes, and 1.5 mL cryovials.
1. QIAamp viral RNA Mini Kit.
2. 96–100% ethanol.
3. Superscript IV Reverse Transcriptase kit (includes 5X SSIV buffer, 0.1 M DTT, RNase-free water, RNaseOUT recombinant RNase inhibitor, dNTPs (10 mM each), and RNase H).
4. iProof High-Fidelity DNA polymerase kit (includes 5× reaction buffers, MgCl2 solution, DMSO, dNTPs, and iProof DNA polymerase).
1. Seed p0 cells (see Note 1) in 2 mL DMEM10%FCS/PS/Q in 6-well plates for ~50% confluence on the next day. Incubate the cells at 37 °C and 5% CO2 in a humidified incubator.
2. After 24 h, combine the helper plasmids in a 1.5 mL reactiontube: 125 ng pCAGGS-NP, 125 ng pCAGGS-VP35, 75 ng pCAGGS-VP30, 1000 ng pCAGGS-L or pCAGGS-eGFP, 250 ng pCAGGS-T7 (amounts are per well to be transfected).
3. Add 100 μL Opti-MEM (per well to be transfected) to the helper plasmid mixture, vortex, and spin down the sample. It is advisable to transfect several wells in parallel since rescue efficacy is usually below 100%, and to use one well as negative control by replacing pCAGGS-L with an equal amount of pCAGGS-eGFP.
4. Transfer cells, diluted helper plasmids, and full-length clone plasmid into a BSL4 laboratory.
5. Add 250 ng full-length plasmid to the diluted helper plasmid mixture.
6. Briefly vortex the vial containing Transit-LT1 transfection reagent. Add 6 μL Transit-LT1 (per well to be transfected) (see Note 3) to the plasmid mixture, vortex, and spin down. Incubate for 15 min at room temperature to allow transfection complexes to form.
7. After 15 min, add 100 μL of transfection complexes in a dropwise fashion to the cells, trying to distribute them over the whole surface area of the well.
8. Rock the plates back and forth and from side to side. Do not swirl the plates, to avoid transfection complexes being pushed to the edge of the well. Return the cells to the incubator.
9. At 24 h post transfection, replace the medium with 4 mL DMEM5%FCS/PS/Q (see Notes 4 and 5). Return cells to the incubator.
1. Six days post transfection, seed p1 cells (see Note 6) in 4 mL DMEM10%FCS/PS/Q in 6-well plates for ~90% confluence on the next day. Incubate cells at 37 °C and 5% CO2 in a humidified incubator.
3.3 Harvest of Recombinant Viruses
2. On the next day (i.e., 7 days post transfection), take the p1 cells into the BSL4 laboratory. Add 1 mL of supernatant from the p0 cells to the medium of the p1 cells (see Note 7). Return the cells to the incubator.
3. From now on, check for cytopathic effect (CPE) in p1 cells daily (see Note 8). Alternatively, if reporter-expressing viruses (e.g., viruses expressing GFP or luciferase) are being rescued, reporter activity can be used as a read-out.
4. Once clear CPE is visible, passage 1 mL of p1 supernatant onto a T150 flask with 90% confluent cells (p2 cells) in 60 mL DMEM10%FCS/PS/Q (see Note 7). Check for CPE in p2 cells daily.
1. Once p2 cells show clearly discernibly CPE, scrape the cells into the medium using a cell scraper. Then transfer ~30 mL of the resulting cell suspension each into two 50 mL centrifuge tubes, and spin down for 10 min at 1000× g at 4 °C.
2. Pour the clarified supernatant into fresh centrifuge tubes each containing 3 mL FBS (heat-inactivated for 30 min at 56 °C; i.e., 10% total sample volume), mix by inversion, and aliquot. Store the aliquots in liquid nitrogen.
3.4 Sequence
Confirmation of Rescued Virus
1. To ensure that the rescued virus has the correct/expected sequence (see Note 9), inactivate 140 μL virus stock by adding it to 560 μL AVL buffer containing carrier RNA (from the QIAamp viral RNA Mini Kit). Vortex and incubate for 10 min.
2. Remove the inactivated virus from the biosafety cabinet and transfer it into a clean tube containing 560 μL96–100% ethanol (see Note 10). Mix by vortexing, incubate for a further 10 min, and then remove the sample from the BSL4 laboratory following appropriate approved protocols.
3. Extract viral RNA using the QIAamp viral RNA Mini Kit, following the manufacturer’s instructions.
4. In a PCR tube, combine 1 μL RNA, 1 μL RT primer #3185 (2 μM), 1 μL dNTPs, and 11 μL RNase-free water (see Note 11). Incubate for 5 min at 65 °C, and then place immediately on ice for at least 1 min.
5. In the meantime, combine 4 μL5× SSIV buffer, 1 μL 0.1 M DTT, 1 μL RNaseOUT, and 1 μL SuperScript IV, vortex briefly, and place on ice for at least 1 min.
6. Add 7 μL of this mixture to the RNA/primer/dNTP mix (see Note 11), incubate for 10 min at 50 °C, and then heatinactivate for 10 min at 80 °C and cool to 4 °C.
7. Add 1 μL RNase H (see Note 11), incubate for 20 min at 37 ° C, and then store cDNA at 4 °C.
Table 1
Primer combinations for PCRs and subsequent sequencing
Primersforsequencing
#3185 #3186
#3187 #3192
~0.7 kB
~2.1 kB
#3193 #3198 ~2.1 kB
#3199 #3204
kB
#3205 #3210 ~2.1 kB
#3211 #3216 ~2.1 kB
#3217 #3222
#3223 #3228
#3229 #3234
#3235 #3240
#3241 #3242
#3185 #3190
#3191 #3196
#3197 #3202
#3203 #3208
kB
kB
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kB
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#3209 #3214 ~2.1 kB
#3215 #3220
kB
#3221 #3226 ~2.1 kB
#3227 #3232
#3233 #3238
kB
~2.1 kB
#3185, #3186
#3187, #3188, #3189, #3190, #3191, #3192
#3193, #3194, #3195, #3196, #3197, #3198
#3199, #3200, #3201, #3202, #3203, #3204
#3205, #3206, #3207, #3208, #3209, #3210
#3211, #3212, #3213, #3214, #3215, #3216
#3217, #3218, #3219, #3220, #3221, #3222
#3223, #3224, #3225, #3226, #3227, #3228
#3229, #3230, #3231, #3232, #3233, #3234
#3235, #3236, #3237, #3238, #3239, #3240
#3241, #3242
#3185, #3186, #3187, #3188, #3189, #3190
#3191, #3192, #3193, #3194, #3195, #3196
#3197, #3198, #3199, #3200, #3201, #3202
#3203, #3204, #3205, #3206, #3207, #3208
#3209, #3210, #3211, #3212, #3213, #3214
#3215, #3216, #3217, #3218, #3219, #3220
#3221, #3222, #3223, #3224, #3225, #3226
#3227, #3228, #3229, #3230, #3231, #3232
#3233, #3234, #3235, #3236, #3237, #3238
Table1
(continued)
#3239 #3242
#3197 #3198
#3209 #3212
#3213 #3216
Primersforsequencing
#3239, #3240, #3241, #3242
#3197, #3198
#3209, #3210, #3211, #3212
#3213, #3214, #3215, #3216
8. Label 24 PCR tubes (e.g., three eight-tube strips) and place in a pre-chilled PCR cooling block.
9. Prepare the primers (Table 1) at a concentration of 5 μM each in eight-tube strips (see Note 12).
10. Program the PCR cycler (Table 2) and preheat to 98 °C.
11. Prepare the PCR master mix by combining 773.75 μL water, 250 μL5× GC buffer, 25 μL dNTPs (10 mM each), 37.5 μL DMSO, 12.5 μL MgCl2, and 6.25 μL iProof DNA polymerase, vortex, and place on ice (see Note 13).
12. Add 1105 μL PCR master mix to 20 μL cDNA, vortex, and pipet 45 μL into each PCR tube.
13. Add 5 μL primers using a multichannel pipette, mix well (see Note 11), and incubate the reactions in PCR cycler according to the temperature profile shown in Table 2.
14. After the run, PCR-purify the products using a commercial PCR purification kit following the manufacturer’s instructions, e.g., the Macherey-Nagel PCR NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit (see Notes 14 and 15).
15. Sanger-sequence the purified PCR products using the primers listed in Table 1.
4 Notes
1. Various cell lines and cell line mixtures have been used for the rescue of recombinant filoviruses, e.g., a HEK293T/Vero cell mix, Vero cells, or Huh-7 cells. These cell lines vary in their susceptibility to filovirus infection and their transfectability, both of which impacts rescue efficiency. For example, HEK293 and HEK293T cells are highly transfectable, but only poorly susceptible to filovirus infection (although this can be overcome by expressing the virus attachment factor Tim-1 in these cells) [17, 37]. In contrast, Vero cells are highly susceptible to filovirus infection, but somewhat harder to transfect although in our experience, this also varies between different Vero clones. Further, it has been shown that the choice of cell line can influence sequence fidelity in the recombinant viruses that are rescued, with rescue in Vero cells resulting in certain mutations (particularly A insertions in poly-A stretches) in the genome with a higher frequency than when using other cells [38]. These properties should be taken into consideration when choosing a cell line for rescue. The authors recommend Huh-7 cells for initial rescue, and either Huh-7 or VeroE6 cells for further passaging.
2. All primer sequences provided here are for the species Zaire ebolavirus and are based on the strain Mayinga sequence (GenBank accession number NC_002549) [39].
3. The amount of Transit-LT1 may need to be adjusted to obtain optimal transfection efficacy in the cell line used. As a starting point for most cell types, a ratio of 3 μL Transit-LT1 per 1 ug DNA can be used. For Vero cells, this ratio should be increased to 6:1.
4. At this point, the supernatant should be considered to contain infectious ebolaviruses, and standard practices should be used to avoid cross-contaminating wells (i.e., changing of pipettes/ pipette tips between different wells).
5. It is important at this point to completely remove all supernatant prior to adding fresh medium, in order to remove traces of the cDNA plasmid, which could otherwise cause problems in downstream procedures (e.g., sequencing). This can be achieved by first removing the supernatant with a serological pipette, and then removing any remaining liquid with a 100 or 1000 μL pipette.
6. Again, the choice of cells can be varied. Vero cells are most commonly used at this point; however, continuous passaging in these cells can lead to nucleotide insertions in regions encoding poly-A stretches, e.g., at the GP gene editing site [38, 40].
7. An alternative approach is to freeze 1 mL of p0 supernatant at -80 °C at the same time the p0 supernatant is passaged to p1 cells in 6-well format. Once p1 cells show clear CPE, the corresponding p0 supernatant can be used to inoculate the T150 flask for stock growth. This reduces the passage number for the virus stock, which in turn reduces the chance for the appearance of unwanted mutations while still allowing for easy screening of a larger number of wells for a successful virus rescue.
8. The onset of cytopathic effect is dependent on the properties of the rescued virus, as well as the rescue efficacy. As a rule of thumb, clear CPE (compared to the-L control) should start to be visible about a week after passaging. However, for some ebolavirus species, this can take up to 3 weeks and may be less pronounced than for EBOV.
9. Given the frequency with which rescued ebolaviruses show unwanted mutations, it is imperative that they are completely sequenced prior to use.
10. The addition of ethanol is important to ensure complete inactivation before removal from the BSL4 laboratory, as incubation with AVL for 10 min (as recommended by the manufacturer) is not always sufficient to completely inactivate samples [41, 42].
11. To ensure proper mixing, samples should be mixed by flicking the tubes repeatedly and then very briefly spinning them down at low speed (i.e., in a benchtop microfuge).
12. If sequencing is done more often, primers can be frozen in eight-tube strips. In this case, make sure the strips are spun down thoroughly before opening, and label both the strip caps and the tubes, to avoid cross-contamination. Note that strips from some manufacturers can be difficult to open, resulting in an increased risk of spilling the contents. To alleviate this issue, the strips can be incubated empty at 99 °C in a PCR cycler for 5 min before they are first used.
13. The amounts given are for 24 + 1 reactions, which is sufficient to sequence one virus completely. If more than one virus is sequenced, the amount can be scaled-up proportionally. However, since the iProof DNA polymerase has 3′ –5′ exonuclease activity and does not have to be activated by heating (i.e., hot-start), it becomes very important that all reactions are kept on ice or in a PCR cooling block, particularly when processing a large number of samples.
14. If desired, PCR products can also be visualized using standard gel electrophoresis prior to purification. In this case, loading 2 μL of PCR product should result in clearly visible bands after ethidium-bromide staining. The expected product sizes are indicated in Table 1
15. Other PCR purification kits can also be used; however, the Macherey-Nagel kit allows the use of diluted buffer NTI (1:4 in water) for the initial DNA binding step, which decreases the amount of small, unspecific products (primer-dimers) in the purified DNA.
Acknowledgments
This work was supported by the Friedrich-Loeffler-Institut through intramural funding and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; grant number 452208680). The authors further are grateful to Allison Groseth (Friedrich-Loeffler-Institut) for critical reading of this manuscript.
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Reverse Genetics Systems for the De Novo Rescue of Diverse Members of Paramyxoviridae
Griffin Haas and Benhur Lee
Abstract
Paramyxoviruses place significant burdens on both human and wildlife health; while some paramyxoviruses are established within human populations, others circulate within diverse animal reservoirs. Concerningly, bat-borne paramyxoviruses have spilled over into humans with increasing frequency in recent years, resulting in severe disease. The risk of future zoonotic outbreaks, as well as the persistence of paramyxoviruses that currently circulate within humans, highlights the need for efficient tools through which to interrogate paramyxovirus biology. Reverse genetics systems provide scientists with the ability to rescue paramyxoviruses de novo, offering versatile tools for implementation in both research and public health settings. Reverse genetics systems have greatly improved over the past 30 years, with several key innovations optimizing the success of paramyxovirus rescue. Here, we describe the significance of such advances and provide a generally applicable guide for the development and use of reverse genetics systems for the rescue of diverse members of Paramyxoviridae
Key words Paramyxovirus, Paramyxoviridae, Reverse genetics, Virus rescue
1 Introduction
Paramyxoviruses, members of the viral family Paramyxoviridae of the order Mononegavirales, are enveloped viruses with a negativesense, single-stranded RNA genome. Uniquely, paramyxoviruses have genome sizes that are always equally divisible by 6 and encode a minimum of six proteins (Fig. 1)[1, 2]. Paramyxoviridae is a broad family and includes many species that place a significant burden on human health. These include measles virus (MeV), mumps virus (MuV), and the human parainfluenza viruses (HPIV 1–4) [3]. Numerous wildlife reservoirs, including birds, reptiles, fish, rodents, and notably, bats harbor a myriad of paramyxovirus species [4, 5]. With the advent of metagenomic screens, new paramyxovir uses have been identified annually in increasingly diverse hosts. Concerningly, bat-borne paramyxoviruses of the genera Pararubulavirus and Henipavirus have demonstrated an aptitude
Fig. 1 General genome structure of paramyxoviruses. Paramyxoviruses encode a bipartite promoter sequence in both the 3′ leader (3′ Ldr) and 5′ trailer (5′ Tr) regions of the genome. Paramyxoviruses encode at least six genes, nucleocapsid (N), phosphoprotein (P), matrix protein (M), fusion protein (F), attachment protein (RBP), and the large vRdRp protein (L). Some species may encode additional proteins. The number of nucleotides in the genome is always equally divisible by 6
for traversing the species barrier and have caused severe disease when they have spilled over into human hosts; there is increasing concern that such zoonotic paramyxoviruses could establish themselves in the human population, resulting in outbreaks [6–11]. Systems to advance our understanding of paramyxoviruses are increasingly needed, and the use of such tools will undoubtedly bolster our ability to prepare for and respond to future (zoonotic) pandemics.
The ability to rescue paramyxovirus species de novo from cDNA provides numerous applications for both research and public health. Reverse genetics systems allow for the generation of pure viral stocks without a need for excessive passaging, preventing adaptation of virus to cell culture; this is desirable to produce vaccine or research strains in which passaging may introduce unexpected mutations. Plasmid-encoded viral cDNA can be easily manipulated, allowing for the integration of reporter genes, the generation of desired mutations, and the ability to knock out entire genes from viral genomes; such versatility greatly expands the toolkit of virologists and likewise the scope of questions that may be investigated. Excitingly, reverse genetics systems even allow for the de novo rescue and characterization of sequenced viral species that have been identified by metagenomics, but have yet to be isolated, such as a mumps-like virus from Epomophorus bats (BatMuV) and a morbillivirus from Myotis bats (Fig. 2)[12, 13].
Minireplicon systems laid the foundation for Paramyxoviridae reverse genetics. Between 1991 and 1993, minireplicon systems were constructed for Sendai virus (SeV), respiratory syncytial virus (RSV), and HPIV-3 [14–16]. These constructs were used as template for the in vitro transcription of synthetic, viral-like RNAs for each species; transfection of the respective viral-like RNA species into cells, complemented by superinfection with respective fulllength virus, resulted in “rescue” of the viral-like RNAs, characterized by replication of the viral-like RNA and concomitant reporter gene expression by the viral RNA-dependent RNA polymerase (vRdRp). Further, such viral-like RNAs were observed to be packaged into propagable, viral-like particles (VLPs). These works
Fig. 2 Phylogeny of fully sequenced members of Paramyxoviridae. The evolutionary history was inferred using the neighbor-joining method for amino acid sequences of the large (L) vRdRp protein from each species. The tree is drawn to scale, with branch lengths (next to the branches) in the same units as those of the evolutionary distances used to infer the phylogenetic tree. The evolutionary distances were computed using the Poisson correction method and are in the units of the number of amino acid substitutions per site. Evolutionary analyses were conducted in MEGA X. An asterisk (*) next to a species name denotes that reverse genetics systems have been successfully established for the respective species
provided fundamental insights into paramyxovirus biology, including as follows: (1) that the terminal ends of paramyxoviruses encode the necessary cis-acting promoter elements required for vRdRp recognition, and that such sequence elements are sufficient to drive replication and gene expression; (2) that the terminal ends of paramyxoviruses are sufficient for genome encapsidation by nucleoprotein and for the packaging of RNA into virions; and (3) that the expression of the viral replication complex nucleoprotein (N), phosphoprotein (P), and the large vRdRp protein (L) at proper ratios in trans is sufficient to facilitate the rescue of viral-like RNA species bearing the terminal ends of respective paramyxoviruses.
In 1995, endeavors to encode full-length paramyxovirus genomes into cDNA were successful, facilitating the first ever de novo rescue of replication-competent MeV, SeV, and RSV [17–19], although the latter is now classified as a member of the distinct Pneumoviridae family. However, early reverse genetics systems were inefficient, necessitating repeated rescue attempts in large quantities of transfected cells to successfully recover infectious virus. Paramyxovirus reverse genetics systems have since been optimized by taking the following factors into consideration:
1. Sufficiently high levels of the full-length antigenome must be transcribed from the template cDNA plasmid.
2. The resultant, full-length vRNA species that are transcribed from cDNA must have a genome size that is equally divisible by 6, without the introduction of artificial, exogenous sequence to the 3′ or 5′ extreme termini.
3. The viral replication complex proteins (N, P, and L) must be expressed relative to one another at an optimal ratio.
Achieving sufficient transcription of the cDNA-encoded vRNA has been fulfilled by cloning the viral sequence to be under the control of a DNA-dependent RNA polymerase. The DNA-dependent RNA polymerase from the T7 bacteriophage has been widely applied in reverse genetics systems. T7 polymerase possesses remarkably efficient processivity, making it ideal for the transcription of long vRNAs that often exceed 15 kilobases in length. Further, because the T7 polymerase specifically recognizes a phage promoter element and not a mammalian promoter, all T7 polymerase expressed within a mammalian system is dedicated to the reverse genetics system [20]. Despite the advantages of T7 polymerase, there are challenges that must be overcome for its implementation; namely, the T7 polymerase must be sufficiently expressed in mammalian cells during rescue. There have been several strategies to achieve high expression of T7 within target cells, such as by encoding T7 polymerase in recombinant helper virus (e.g., vaccinia virus), or via the generation of cell lines (including HEK-293T and BHK cells) that stably express T7 polymerase [17, 21, 22]. We have demonstrated that in trans expression of codon-optimized T7 polymerase significantly enhances T7 expression in mammalian cells and concomitantly improves paramyxovirus rescue [23, 24]. Recently, reverse genetics systems have been developed that utilize mammalian RNA polymerase II promoter elements either alone or in combination with a T7 promoter element [25–27]. Because RNA Pol II is constitutively expressed in mammalian cells, its use alleviates the requirement to achieve high expression of a polymerase species in target cells; however, this comes at the cost of specificity, as there is competition between the reverse genetics system and cellular DNA for RNA Pol II.
Fig. 3 A Hh-Rbz allows for efficient transcription without compromising the rule of six. (a) Minimal and optimal T7 promoter sequences. Templated G’s are underlined. (b) A Hh-Rbz allows for implementation of the optimal T7 promoter sequence, as it can be designed to cleave immediately upstream of the viral 3′ terminus (shown in blue)
Transcribing paramyxovirus vRNA from cDNA may consequently introduce additional, exogenous sequences to the terminal ends of a vRNA. Indeed, the optimal promoter element for T7 polymerase includes three templated “G” nucleotides, and removal of one or more of these “G’s” significantly decreases activity by T7 polymerase (Fig. 3a) [28]. The addition of exogenous sequence to the termini of paramyxovirus vRNAs is problematic, as the extreme 3′ and 5′ ends contain bipartite promoter elements that are precisely positioned relative to one another and are essential for recognition by the vRdRp. During paramyxovirus replication, both the negative-sense genomic vRNA and positive-sense antigenomic vRNA are completely encapsidated in N. Each monomer of N binds precisely to six consecutive nucleotides (a hexamer) of the vRNA [2, 29, 30]. Full encapsidation of the vRNA by N drives a helical, three-dimensional spatial arrangement of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP); the fully encapsidated, helical vRNP positions two conserved, distal promoter elements in the 3 ends of both the respective viral genome (encoded in the 3′ leader) and viral antigenome (encoded in the 5′ trailer) such that two promoter elements are arranged on the same face of the vRNP complex [29, 31–33]. Proper three-dimensional arrangement of the bipartite promoter is essential for recognition by the viral RdRp; having evolved under this constraint, paramyxoviruses accommodate the bipartite promoter structure by maintaining genome sizes that are equally divisible by 6 (such that all nucleotides are encapsidated by
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ihrer Gesamtheit bei mir den Eindruck freundschaftlicher Vertrautheit, mit Wohlwollen gepaart, hervorriefen. Als sich die Frauen der kleinen Gruppe zugesellten, hafteten meine Augen auf den silbernen Ketten und Schnallen, die sie trugen, und die ich, wie ich mich dunkel erinnerte, schon früher gesehen hatte. Beim Abschied trat ein ältlicher Mann vor und erbot sich, uns eine Stunde weit zu begleiten, da der Weg nach Hārim schwer zu finden sei, wie er sagte. Noch waren wir keine hundert Schritte zusammen gegangen, als mir die Bedeutung meines unbewußten Wiedererkennens klar wurde.
»Mascha'llah!« sagte ich, »ihr seid Drusen.«
Ängstlich blickte sich der Mann nach Nadjīb und Michaïl um, die uns auf dem Fuße folgten, dann nickte er mit dem Kopfe und schritt ohne zu sprechen vorwärts.
»Du brauchst dich nicht zu fürchten,« tröstete ich, »der Soldat und mein Diener sind verschwiegene Männer.«
Da nahm er sich ein Herz und sprach:
»Etliche von uns wohnen hier in den Bergen, aber wir fürchten die Mohammedaner und verheimlichen vor ihnen, daß wir Drusen sind, damit sie uns nicht verjagen. Es sind nicht über 200 drusische Häuser, alles in allem.«
»Ich hatte mich schon auf euch gefreut,« entgegnete ich, »denn ich kenne die Scheichs im Haurān; sie haben mir viel Freundlichkeit erwiesen. Deshalb will ich alle Drusen begrüßen, wo ich sie auch finde.«
»Allah,« sagte er, »kennst du den Turschan?«
»Bei Gott!« erwiderte ich.
»Schibly und seinen Bruder Jahya?«
»Jahya kenne ich, aber Schibly ist tot.«
»Tot!« rief er aus, »Allgütiger — Schibly tot?«
Und so entlockte er mir alle Neuigkeiten aus dem Gebirge und lauschte mit atemloser Aufmerksamkeit den mancherlei
Geschichten, für die ich, so weit von Salchad entfernt, kein williges Ohr zu finden erwartet. Plötzlich stockte sein Fragen, er verließ den Weg und trat auf einen Weingarten zu, in dem ein junger Mann die Stöcke verschnitt.
»Oh mein Sohn!« rief er, »Schibly el Atrasch ist tot! Borge mir deine Schuhe, daß ich mit der Dame nach Hārim gehen kann, die meinen sind zerrissen!«
Der junge Mann näherte sich und zog währenddes seine roten Lederpantoffeln von den Füßen.
»Wir sind Gottes!« sagte er. »Ich habe Schibly zuletzt vor einem Jahr gesehen.« Und die Kunde mußte ihm in ihren Einzelheiten wiederholt werden.
Während wir über die steinigen Berggipfel dahinzogen, und unsre Füße das Seidelbastgestrüpp streiften, das in üppiger Fülle die Hänge überwucherte, plauderten wir, als wären wir alte, lange getrennt gewesene Freunde. Als wir den Rand des Djebel el 'Ala erreichten, sahen wir Hārim unter uns liegen, und ich bestand darauf, daß mein Begleiter sich die Mühe weiteren Mitgehens erspare. Mit großem Widerstreben nur gab er nach und goß fünf Minuten lang all seine Segenswünsche über mich aus, ehe er Abschied nahm. Schließlich kehrte er nochmals um, um sich zu versichern, ob wir ihn auch bezüglich des Weges richtig verstanden hätten.
Hārim.
»Und wenn Sie das nächste Mal in den Djebel el 'Ala kommen,« sagte er, »müssen Sie Ihr Lager in Kalb Lōzeh aufschlagen und wenigstens einen Monat bleiben. Dann geben wir Ihnen alles, was Sie brauchen, und zeigen Ihnen alle Ruinen. Und nun gefalle es Gott, daß Sie in Frieden und Sicherheit ziehen und nächstes Jahr in Frieden und Gesundheit wiederkehren.«
So trennten wir uns, und in meinem Herzen fühlte ich wieder jene warme Zuneigung zu diesem Volk, die immer wieder aufs neue entfacht wird. Sie mögen grausam im Kriege sein — hier spricht überwältigendes Zeugnis gegen sie — manche erklären sie für treulos, andre haben sie habgierig gefunden; aber wenn ich einem Drusen begegne, so begrüße ich ihn als Freund und werde das so lange tun, bis ich den Beweis habe, daß mein Vertrauen übel angebracht ist.
Die Burg Hārim steht auf einem Bergkegel an der Mündung einer der wenigen Schluchten, die Zugang zum Djebel el 'Ala gewähren. Jenseits liegt die große Orontesebene, die in alten Zeiten die
Kornkammer der Stadt Antiochien war Da die letzten Regengüsse den sumpfigen See, von den Syrern El Barah genannt, in seiner ganzen Ausdehnung angefüllt hatten, stand der nördliche Teil der Ebene fast ganz unter Wasser. Wir wandten uns von Hārim südwärts und ritten am Fuße des Djebel el 'Ala entlang nach Salkīn. Dieser Ritt wird mir der außerordentlichen Schönheit der Landschaft wegen unvergeßlich bleiben. Nirgends weiter in Syrien habe ich solch üppige Fruchtbarkeit gefunden. Oliven- und Mandelhaine teilten sich mit Hafer und Gerste in die Fettigkeit des Bodens, undurchdringliches Gestrüpp von Ginster, Seidelbast und Brombeeren säumte den Weg, und jede sonnige Stelle war mit der blauen Iris stylosa übersät. Salkīn selbst lag in einem bewaldeten Tal inmitten eines wahren Olivenhaines, der sich mehrere Meilen weit, fast bis an den Orontes hin, erstreckte. Ehe wir die Stadt erreichten, stiegen wir auf einem freien Platz zwischen Olivengärten ab. Es war 5 Uhr, aber Fāris war noch nicht da; wir machten es uns deshalb unter den Bäumen gemütlich und warteten auf ihn. Unsre Ankunft verursachte einige Aufregung unter den Leuten, die, im Grase sitzend, den ruhigen Abend genossen; es dauerte nicht lange, so kam einer, augenscheinlich eine vornehme Persönlichkeit, in Begleitung eines Dieners auf mich zu und forderte mich auf, in seine Wohnung zu kommen und auszuruhen. Obgleich erst von mittleren Jahren, war er ein stattlicher Mann und hatte angenehme Züge. Ich nahm seine Einladung an, da ich neugierig war zu sehen, was Salkīn zu bieten hatte. Besonders in fremden Ländern muß man jede Gelegenheit ergreifen, seine Kenntnisse zu erweitern.
Ich merkte bald, daß ich in die Hände des reichsten Bewohners der Stadt gefallen war. Mohammed 'Ali Agha ist der Sohn Rustum Aghas, eines Zirkassiers von Geburt, der Diener in der großen zirkassischen Familie Kakhya Zādeh von Hamadān war — so lautet ihr arabischer Name, während die Perser sie Kat Khuda Zādeh nennen. Die Familie wanderte vor 200 Jahren nach Aleppo aus; durch die bei den Zirkassiern üblichen Unternehmungen wurde sie außerordentlich reich und ist nun eine der mächtigsten Familien in Aleppo. Ihre Diener teilten ihren Erfolg, und Rustum Agha legte als sorglicher Mann so viel Geld zurück, daß er sich in Salkīn, im Orontestale, nahe bei seines Herrn großem Grundbesitz, ein Stück
Land kaufen konnte. Dazu begünstigte ihn das Glück so sehr, daß sein Sohn die Hand einer Tochter aus dem Hause der Kakhya erhielt. Ich erfuhr diese Einzelheiten nicht alle sofort und wunderte mich bei meinem Besuch in Mohammed 'Alis Harem über die Ehrerbietung, die er seiner Frau entgegenbrachte. Ich konnte mir nicht denken, warum die kleine Dame mit den scharfen Zügen und den hellen Augen, die ihm doch keinen Sohn geschenkt hatte, von ihrem Mann mit solcher Hochachtung angeredet wurde, denn ich wußte noch nicht, daß sie die Schwester Reschīd Agha Kakhya Zādehs war Mohammeds einziges Kind, ein Mädchen von sechs Jahren, schien, obwohl sie einem so unnützen Geschlecht angehörte, doch des Vaters Augapfel zu sein. Während ich die vortrefflichen Oliven und die Kirschenmarmelade aß, die seine Mägde mir vorgesetzt hatten, sprach er weitläufig über des Kindes Erziehung und seine weitere Zukunft. Die Hausfrau ließ sich herab, den Kaffee mit ihren eignen Händen zu bereiten und den abgenutzten Filzhut zu bewundern, der, mit einem purpur- und silberfarbenen Tuch ausgeputzt, neben mir auf dem Diwan lag.
Salkīn.
»Oh, der schöne europäische Hut,« sprach sie, »warum legen Sie eine Verhüllung darüber, wo er doch so hübsch ist?«
Damit streifte sie das seidene Tuch und die Kamelshaarschnur ab, drückte ihn in seiner ganzen kahlen Schäbigkeit auf die schwarzen Locken ihrer Tochter und erklärte ihn für den schönsten Kopfputz der Welt.
Um 6 Uhr bekam ich die Nachricht von der Ankunft meiner Packtiere, aber ehe ich zu meinen Zelten zurückkehren durfte, mußte ich erst noch Rustum Agha besuchen. Er lag in wattierte Seidendecken gebettet in einem oberen Zimmer, das auf den rauschenden Strom und die beiden großen Zypressen hinausblickte, die so viel dazu beitragen, der Stadt ein malerisches Ansehen zu verleihen. Riesigen schwarzen Schildwachen gleich, stehen diese Bäume vor dem Tor des Hauses, das das erste und größte der krummen Straße ist. Rustum Agha war sehr alt und leidend. Wie das Antlitz eines Toten hob sich sein Gesicht von der blaßgelben Seide ab. Mein Besuch erfreute ihn augenscheinlich, aber sobald er die Lippen zu einem Wort der Begrüßung öffnete, wurde er von einem so unerträglichen Husten befallen, als ob er sich die Seele heraushusten solle. Sobald er sich einigermaßen erholt hatte, verlangte er die letzten Berichte über Rußland und Japan zu hören, und ich wunderte mich, daß er, mit dem Tode so nahe vor Augen, nicht lieber zu wissen begehrte, ob wir wohl den säumigen Schnitter mit seiner Sense durch die Zypressen auf das Tor zuschreiten sähen.
Als ich mich dann in meinem Zelt zum Abendessen niederließ, traten zwei Diener Mohammed 'Alis mit einem großen Krug Oliven ein, die in den Gärten von Salkīn gewachsen und in ihrem eignen Öl eingelegt waren. Die Diener fragten auch an, ob ihr Herr kommen und eine Stunde mit mir verbringen dürfte. Ich ließ um die Ehre bitten. Später erschien er mit einigen Begleitern, die ihm seine Wasserpfeife trugen, und ließ sich zum behaglichen Geplauder nieder, das durch das gemütliche, besänftigende Lied der Wasserpfeife nur um so angeregter wurde. Er erzählte mir, daß Salkīn, eine der vielen seleucischen Städte, von Seleucus I selbst als eine Art Sommerresidenz für die Bewohnerschaft von Antiochien gegründet worden wäre. Auf der Stelle, wo mein Lager stand und auf dem Kirchhofe daneben, hatte, wie er sagte, jene alte Stadt
gestanden, »und sobald wir ein Grab graben, stoßen wir auf behauene, nicht selten mit Inschrift versehene Steine.« Es erscheint nicht unglaubhaft, daß diese fruchtbaren Ausläufer des Gebirges von den Antiochiern als eine günstige Lage für ihre Landhäuser erwählt worden sind, aber ich habe keinen weiteren Beweis für diese Annahme. Mohammed 'Ali erzählte auch, daß sein Schwager Reschīd Agha bei ihm weile, und sprach die Hoffnung aus, daß ich ihn vor meiner Abreise besuchen würde.
Reisende.
Reschīd Agha Kakhya Zādeh ist der größte Magnat des Distriktes, aber auch der größte Schurke. Ich fand ihn am andern Morgen unter den Zypressen am schäumenden Strome sitzen, und man könnte sich kein boshafteres Gesicht in einer lieblicheren Umrahmung und von einer strahlenderen Sonne beschienen vorstellen. Er war ein großer Mann mit hochfahrendem Wesen; hinter seiner niederen Stirne lauerte eine ganze Welt böser Gedanken, seine Augen schielten fürchterlich, über seine dicken Lippen sprudelten die eitlen Ruhmredereien und die scharfen Befehle nur so, die der Gipfelpunkt seiner Unterhaltung waren. Er trug ein hellseidenes Gewand und rauchte eine Wasserpfeife, deren Mundstück mit Edelsteinen besetzt war. Den neben ihm liegenden Strauß Frühlingsblumen hob er hin und wieder an das Gesicht und roch während des Redens daran; schließlich bot er mir die schönsten Blüten daraus. Es ist einer der Vorteile, die der unabhängige Reisende genießt, daß er selbst die Gesellschaft von Schurken nicht zu meiden braucht: als ich deshalb erfuhr, daß mein
Freund Mohammed 'Ali seinen Schwager Reschīd Agha nach dessen Heim in Alāni begleiten wollte, und daß dieser Ort an meinem Wege lag, stimmte ich dem Vorschlag, die Reise in ihrer Begleitung zu machen, bei. Die Reittiere wurden gebracht, wir stiegen unter den Zypressen auf und trabten unter Olivenhainen dem Orontestale zu. Reschīd Agha ritt eine prächtige arabische Stute; ihr schwarzes Fell glänzte dank sorgfältigster Pflege, sie war leicht aufgeschirrt, ihr Zaum bestand aus silberner Kette, den Sattel schmückten silberne Zieraten, jede ihrer Bewegungen war eine Augenweide. Verschiedentlich forderte ihr Herr den an seiner Seite dahintrabenden Mohammed 'Ali zur Bewunderung des schönen Tieres heraus, und wenn derselbe die erwarteten Lobsprüche gespendet hatte, wurden seine Worte von einem alten fetten Mann, der uns auf einem dürren Pony begleitete, aufgegriffen und verstärkt wiederholt. Der Alte war Kakhya Zādehs ordinierter Spaßmacher und Schmeichler, und überdies, wenn sein Gesicht nicht trog, auch Gefährte seiner Laster und Hehler seiner Verbrechen — in solch seltsamer Gesellschaft befand ich mich an jenem Aprilmorgen. Hadji Nadjīb trottete ganz zufrieden hinter uns drein, Michaïl aber, mit seinem stark ausgeprägten Sinn für alles Geziemende, konnte seine Mißbilligung kaum verbergen und antwortete nur einsilbig, sobald ihn der Spaßmacher oder Reschīd Agha selbst anredeten, wenn er sich auch gegen Mohammed 'Ali, der ihm (und mit Recht) aus anderem Stoffe gemacht schien, ganz zugängig zeigte. Ungefähr eine Stunde lang ritten wir über weichen, sprießenden Boden dahin, während uns Reschīd auf die Schönheiten seines Besitztums aufmerksam machte.
»Alle diese Olivengärten gehören mir,« sprach er, »und bei Gott und seinem Propheten, es gibt im ganzen Lande keine solche Oliven. Jedes Jahr komme ich von Aleppo, um der Olivenernte mit meinen eignen Augen zuzusehen, damit die Schurken, die für mich arbeiten, mich nicht betrügen. Gottes Fluch über sie! Deshalb habe ich mir auch ein Haus in Alāni gebaut. Der Mensch muß es sich behaglich machen und anständig wohnen. Aber Sie werden es ja sehen, denn Sie müssen bei mir speisen; mein Tisch ist für alle Gäste gedeckt. Und um das Haus habe ich Maulbeerplantagen angelegt, tausend Schößlinge sind in den letzten fünf Jahren
gepflanzt worden. Ich will Seidenzucht einführen, in großem Stile, so Gott will. Oh Jusef! zeige ihr die Schachteln mit Eiern, die aus dem Lande Frankreich gekommen sind.«
Der Spaßmacher zog aus seiner Brusttasche einen kleinen Pappkasten mit dem Stempel einer französischen Firma; aber noch ehe ich dem Fleiße des Agha meine Achtung zollen konnte, wurde seine Aufmerksamkeit plötzlich durch zwei Bauern abgelenkt, die die Olivenbäume nicht zu seiner Zufriedenheit verputzten. Er sprengte hinüber, und eine Flut von Flüchen und Verwünschungen ergoß sich über die unglücklichen Männer. Danach kehrte er zurück und sang sein eignes Lob weiter.
Sein Haus war groß und neu und durchweg mit Plüsch und goldgerahmten Spiegeln ausgestattet. Der Agha war nicht eher befriedigt, bis ich alles gesehen und jeden Winkel bewundert hatte. Der Spaßmacher lenkte mein Lob und meine Beglückwünschungen in die rechte Bahn; von ihm erfuhr ich auch, daß der Agha besondere Würdigung der eisernen Öfen erwartete, die in allen Räumen standen — ohne Zweifel erhöhten sie die Behaglichkeit sehr, weniger aber den Eindruck des Malerischen. Nach der Besichtigung ließen wir uns auf einen Diwan nieder, um das Erscheinen des Frühstücks zu erwarten. Der Hausherr benutzte die Zeit, um mir mit übertriebenem Unwillen von seinen Kämpfen gegen die verderbte tyrannische Regierung zu erzählen, unter der er lebte. Freilich vergaß er zu erwähnen, daß er jede Unbill, die ihm von seinen Vorgesetzten zuteil ward, mit Zinsen an seine Untergebenen weitergab.
»Bei Gott!« sprudelte er hervor, »wie ich in meinen Olivenplantagen arbeite, wie ich Maulbeerbäume anpflanze und Seidenwürmer von fernher kommen lasse, um einen neuen Erwerbszweig einzuführen! Aber ist der Vāli dankbar? Beim Propheten, nein! Er schickt seine Leute, und die sagen: »Halt' ein, wir müssen erst sehen, wieviel höher wir dich besteuern können!« Und als ich unten am Fluß eine Mühle zum Mahlen meines Kornes erbauen wollte, sprachen sie wieder: »Halt' ein, das ist nicht erlaubt!« Dann ließen sie mich mitten in der Ernte holen. Hastig ritt ich nach Aleppo und mußte dort Tag um Tag, Woche um Woche
warten, denn sie verboten mir, die Stadt zu verlassen Aber bei Gott!« schrie der Agha und schlug mit der Faust auf den kleinen eingelegten Tisch, »ich habe sie überlistet. Ich ging zum Kadi und sprach: ‚Wer hat den Befehl gegeben?’ ‚Der Vāli,’ antwortete er.
Danach fragte ich den Vāli: ‚Wer hat den Befehl gegeben?’ ‚Ich weiß nicht,’ gab er zur Antwort, ‚vielleicht der Kādi.’ Nun verlangte ich es von beiden schriftlich, aber das wagten sie nicht zu tun und ließen mich gehen.«
Mitten in dieser Unterhaltung wurden drei Besucher angekündigt. Bescheiden ließen sie sich auf dem gegenüberstehenden Diwan nieder und ergingen sich in Begrüßungen und Lobsprüchen. Der Agha empfing sie wie der Kaiser seine Untertanen, und einer ergriff die Gelegenheit, um mir bedeutungsvoll und jedem verständlich zuzuflüstern:
»Sie wissen nun, was für ein Mann der Agha ist! Kommt er Ihnen nicht vor, wie ein König in seinem Lande?« worauf der Agha sich voll noch königlicherer Gnade zeigte.
Endlich ließen wir uns vor einem Tisch nieder, der mit allen Arten syrischer Delikatessen beladen war, und wenig fremde Küchen können sich mit der guten syrischen Kochkunst messen. Der Agha sprach und aß mit gleichem Eifer, indem er seinen Gästen eine Schüssel nach der anderen aufnötigte. Als das Fest in vollem Gange war, trat ein Diener mit der Meldung ein, daß ein gewisser Bauer den Herrn zu sprechen wünschte.
»Er soll kommen!« sprach der Agha gleichmütig. Darauf erschien die zerlumpte Gestalt eines Landmannes in der Tür und starrte mit halb trotzigem, halb erschrecktem Blick auf die Gesellschaft und die Fülle auserlesener Gerichte.
»Friede sei mit dir, oh Agha!« begann er.
Kaum aber hatte dieser den Bittsteller erblickt, als er in leidenschaftlichster Wut aufsprang. Sein Gesicht wurde purpurrot, die Augen traten aus ihren Höhlen hervor, und mit der geballten Faust auf den Tisch schlagend, schrie er:
Antiochien.
»Hinaus mit dir! Gottes Fluch über dich und deine Kinder! Möge er deines Vaters Haus zerstören! Hinaus mit dir, sage ich, und schaffe das Geld, oder ich werde dich mit deiner Frau und deiner ganzen Familie ins Gefängnis werfen und zu Tode hungern lassen.«
»Oh Agha,« sprach der Mann und setzte der Wut des anderen eine gewisse Würde entgegen, »nur ein wenig Zeit! Gewähre mir ein wenig Zeit!«
»Nicht einen Tag! nicht eine Stunde!« tobte der Agha. »Fort! Fort! und noch heute bringst du mir das Geld!«
Ohne ein weiteres Wort verschwand der Bauer durch die Tür, der Agha aber ließ sich wieder zu seiner unterbrochenen Unterhaltung und seinem unterbrochenen Mahle nieder. Die anderen Gäste aßen weiter, als wäre nichts geschehen, ich aber schämte mich einigermaßen meines Platzes an Reschīds Rechter und war nicht böse, als ich ihm Lebewohl sagen konnte.
Der Agha schickte uns an den Orontes hinab und ließ uns in seinem eignen Fährboot über den Strom setzen. Als wir das andere Ufer erreichten, zog Michaïl ostentativ eine Brotkruste aus der Tasche und begann sie zu essen.
»Hast du nicht in Alāni gespeist?« fragte ich.
Antiochien.
»Ich esse nicht mit solchen Leuten, wie er ist,« erwiderte Michaïl steif.
Nadjīb, den kein solches Bedenken davon abgehalten hatte, sich an dem ungewohnten Luxus eines reichen Mahles zu erfreuen, nickte darauf mit dem Kopfe und sprach:
»Der Agha ist ein böser Mann. Gott lohne ihm nach seinen Taten! Er preßt den letzten Heller aus den Armen, nimmt ihnen ihr Land, vertreibt sie von Haus und Hof und gibt sie dem Hungertode preis.«
»Und er tut noch Schlimmeres!« bemerkte Michaïl düster.
»Ja, bei Gott!« bestätigte Nadjīb. »Jeder, der eine schöne Frau oder eine schöne Tochter hat, muß ihn fürchten, denn er ruht nicht, bis sie in seinen Händen ist. Bei Gott und Mohammed, seinem Propheten, er hat manchen Mann getötet, nur um seine Frau in seinen eignen Harem bringen zu können, und niemand wird mehr gehaßt, als er.«
»Vermag das Gesetz nichts wider ihn?« fragte ich.
»Wer sollte etwas wider ihn vermögen?« erwiderte Nadjīb, »er ist reich — möge Gott sein Haus zerstören!«
»Oh Michaïl,« sagte ich, während wir mühsam über die schlammigen Felder zogen, »ich habe euer Land viel bereist und habe viel Menschen gesehen und kennen gelernt, aber selten nur bin ich einem Armen begegnet, den ich mir nicht zum Freunde gewünscht, und ebenso selten einem Reichen, dessen Gesellschaft ich nicht lieber gemieden hätte. Wie kommt das? Verändert der Reichtum selbst das Herz in Syrien? Denn sieh, in meiner Heimat sind zwar längst nicht alle Mächtigen tugendhaft, es sind aber auch nicht lauter Schurken. Würdet denn auch ihr, du und die Drusen von Kalb Lōzeh, und Mūsa, der Kurde, wie Reschīd Agha werden, wenn euch plötzlich Reichtümer zufielen?«
»Oh, meine Dame,« erwiderte Michaïl, »die Herzen sind die gleichen, aber Sie haben in Ihrem Lande eine starke und gerechte Regierung, der jeder Engländer, auch der reiche, gehorchen muß; bei uns dagegen gibt es keine Gerechtigkeit: der Große verschlingt den Kleinen, der Kleine den noch Kleineren, und die Regierung verschlingt sie alle. Wir leiden alle in unsrer Weise und schreien zu Gott um Hilfe, da wir uns nicht selbst helfen können. Aber wenigstens habe ich Reschīd Aghas Brot nicht gegessen,« schloß Michaïl ziemlich anzüglich. Worauf Nadjīb und ich den Kopf hängen ließen.
Es folgten nun fünf Stunden mühseligsten Vorwärtskommens. Es war dies vielleicht für Nadjīb und mich die gerechte Strafe, weil wir an der Tafel des Gottlosen gesessen hatten, aber wie fast immer, so betraf auch dieses Strafgericht den Gerechten mit den Sündern, denn Michaïl hatte dasselbe zu leiden wie wir. Hatten uns am Tage
vorher die Felsen und Steine zu schaffen gemacht, so stöhnten wir heute unter dem Gegenteil, dem Schlamm. Nur daß diese Plage tausendmal schlimmer war. Fünf Stunden lang wateten wir über Erdberge hin, auf denen kein einziger Stein zu sehen war. Abhänge, bedeckt mit dickem, zähem Schlamm, wechselten mit tiefen Morästen, in die unsre Pferde bis zum Gurt einsanken. Als wir endlich dieses Sumpfland hinter uns hatten und das Orontestal erreichten, waren Menschen und Tiere völlig erschöpft. Das Hügelland, welches wir eben verlassen, erhob sich nun zu felsigen Bergrücken und Gipfeln, zu unsrer Rechten aber lag das breite, zum Teil von Wasserfluten überschwemmte Tal, und jenseits desselben zog sich eine prächtige Bergkette dahin. Bald erblickten wir auch die byzantinischen Türme und Mauern auf den Bergrücken zur Linken, und zwischen blühenden Lorbeerhecken stolperten unsre Tiere über das lückenhafte Pflaster der alten Römerstraße dahin, die nach Antiochien führte.
Wir mußten uns in den Weg mit einem Nebenfluß des Orontes teilen, der lustig über das Pflaster plätscherte. Nicht ohne eine gewisse Erregung konnte ich auf die Stadt Antiochien blicken, die so viele Jahrhunderte lang Wiege der Kunst und Mittelpunkt einer der glänzendsten Kulturepochen gewesen ist, die die Welt je gekannt. Das moderne Antiochien gleicht dem Harlekin, dessen Kleider viel zu weit für seine mageren Glieder sind: umschließen doch die Festungsmauern, die über Fels und Hügel dahinklettern, ein weites Weichbild, von dem die Stadt allmählich hinweggeschmolzen ist. Aber noch heute bietet sie mit den hohen, zerrissenen, mauergekrönten Bergen im Hintergrund und den sich in dem breiten, fruchtbaren Orontestale ausbreitenden Gruppen roter Ziegeldächer eins der lieblichsten Bilder.
Am Ufer des Orontes.
Erdbeben und Überflutungen des Stromes haben die Paläste der Griechen- und Römerstadt gestürzt und mit Schlamm bedeckt, und doch! als ich bei Sonnenuntergang auf der abfallenden Rasenfläche des nosairischen Kirchhofs stand, am Fuße des Berges Silpius, wo mein Lager aufgeschlagen war, und die wachsende Mondsichel die Trümmer beleuchtete, da erkannte ich, daß Schönheit das unveräußerliche Erbe Antiochiens sei.
Vierzehntes Kapitel.
Auch meine weitere Bekanntschaft mit Antiochien änderte an dem Eindruck des ersten Abends nichts. Je mehr ich die engen, gepflasterten Straßen durchwanderte, desto bewundernswerter erschienen sie mir. Bis auf die Hauptstraße, den Bazar, waren sie fast menschenleer; meine auf den Kieselsteinen widerhallenden Tritte unterbrachen die Stille von Jahren. Die flachen, mit roten Ziegeln gedeckten Giebel verliehen der ganzen Stadt einen reizvollen, eigenartigen Ton; Haus für Haus war mit vorspringenden, verschließbaren Balkonen versehen. Von der Vergangenheit ist freilich kaum eine Spur mehr vorhanden. In der Serāya befinden sich zwei schöne Sarkophage, die mit Girlanden und Köpfen sowie mit den bekannten Stiere zerfleischenden Löwen geziert sind, letzteres, wie ich glaube, ein speziell asiatisches Motiv. Ein dritter, weniger großartiger, steht am Saume der Daphnestraße. Ferner sah ich im Hofe eines türkischen Hauses das Fragment eines klassischen Simses und auf der Hauptstraße ein Stückchen Mauerwerk, das sicherlich aus der vormohammedanischen Zeit herrührte — die Bauart, abwechselnde Streifen in Ziegeln und Steinen, — gleicht derjenigen der Akropolis. Im übrigen lebt das Antiochien des Seleucus Nicator nur in der Phantasie. Die Insel, worauf es erbaut war, ist mit der Veränderung des Flußbettes verschwunden; der Überlieferung nach hat es oberhalb der modernen Stadt gelegen. Prächtige Villen müssen die Ufer des Orontes gesäumt haben. Man erzählte mir, daß die Grundmauern davon zum Vorschein kamen, wenn genügend tief in den Morast gegraben wurde, und daß kleine Wertgegenstände, Münzen und Bronzen, oft gefunden wurden. Es wurden mir auch gar viele zum Verkauf angeboten, aber ich erachtete sie für ungeschickte Nachahmungen und wurde auch in dieser Meinung von einem türkischen Pascha, Rifa't Agha, bestärkt, der sich zu seinem Vergnügen eine Antiquitätensammlung angelegt hat. Von seiner schönen Serie seleucidischer Münzen sind die
ältesten beinahe so gut wie die besten sizilianischen, und die späteren fast so schlecht wie die schlechtesten byzantinischen. Auch einige Bronzelampen sind vorhanden. Eine derselben, ein lockiger Eroskopf, ist ein schönes Exemplar römischer Kunst. Der Agha verehrte mir einen kleinen Kopf, welchen ich für eine Nachahmung von dem Haupte des Antiochus mit der hohen Krone halte. Obgleich er ziemlich grob gearbeitet ist, verrät er doch durch eine gewisse Vornehmheit die Abstammung von einem großen Original.
Der
Getreidemarkt, Antiochien.
Noch vor 40 Jahren waren die Mauern und Türme der Akropolis fast unversehrt; jetzt sind sie fast gänzlich zerstört. Die Bewohner Antiochiens behaupten, die Stadt werde jedes halbe Jahrhundert bis in ihre Grundfesten erschüttert, und sie selbst erwarten jeden Augenblick eine neue Bodenbewegung, nachdem die letzte im Jahre 1862 stattgefunden hat. Die Verwüstung der Festung aber hat kein Erdbeben, hat der Wohlstand herbeigeführt. Die Stadt ist wunderbar günstig in ihrem reichen Tale gelegen und mit dem Hafen Alexandretta durch eine ziemlich gute Landstraße verbunden, so daß sie mit Leichtigkeit zu einem bedeutenden Handelszentrum werden könnte. Während der letzten 50 Jahre ist sie — sogar unter türkischer Herrschaft — beträchtlich gewachsen, freilich auf Kosten der Akropolis. Der Orientale läßt sich durch keinerlei Schwierigkeiten abschrecken, wofern sie ihm nur die Mühe des Steinebrechens ersparen, und trotz der Mühe, die das Befördern der behauenen Steine der Festung macht, ehe sie bis an den Fuß des ungemein steilen Hügels, worauf sie steht, gelangen, hat man zum Bau all der neueren Häuser das Material von dort genommen. Das Werk der Zerstörung hält an. Die Steine der Mauern verschwinden schnell, und der Rest von Schutt und Mörtel wird in kurzer Zeit dem Einfluß der Witterung erliegen. Eines Morgens umging ich die Festung; es kostete mich drei Stunden. Westlich vom Gipfel der Berges Silpius wurde die Berglehne von einem Felsenspalt durchschnitten, der voller Felsengräber war, und direkt über meinem Lager von einem Aquädukt überspannt wurde. Auf der linken Seite der Schlucht fiel die Felsenwand jäh ins Tal ab. An größeren Überresten erkannte man deutlich, daß die Mauern abwechselnd aus Reihen von Steinen und Ziegeln bestanden hatten, ja hier und da war auch in den Steinreihen noch durch größere und kleinere Blöcke Abwechselung geschaffen worden. Die Befestigungen umfaßten eine weite Fläche; leicht ansteigende, mit Gestrüpp und verfallenem Gemäuer bedeckte Hänge führten zu der Spitze des Hügels. In der Westmauer war eine schmale, massive Steintür, die von einem Sims aus gefügten Blöcken mit einem erhabenen Bogen darüber gekrönt war. Die südliche Mauer wurde durch Türme unterbrochen, die Hauptzitadelle aber befand sich an der südöstlichen Ecke. Von hier aus fielen die Mauern wieder steil nach der Stadt zu ab und setzten sich noch eine
Strecke östlich derselben fort. Ich glaube, sie können bis an den Orontes hin verfolgt werden. Ich ging ihnen nicht nach, sondern kletterte auf einem steinigen Pfad von der Zitadelle in die tiefe Schlucht, die das östliche Ende des Hügels durchschneidet. Den Eingang zu derselben bewacht eine mächtige Ziegel- und Steinmauer, und sie führt den Namen »Das eiserne Tor«. Jenseits desselben klettern die Festungswerke an der gegenüberliegenden Seite der Schlucht empor und ziehen sich an der Spitze des Hügels weiter. Wie weit sie sich erstrecken, weiß ich nicht, denn der Boden war so uneben und mit Gestrüpp überwachsen, daß ich den Mut verlor und umkehrte. Eine reiche Fülle von Blumen, Ringelblumen, Asphodill, Zyklamen und Iris, wucherten zwischen den Felsen. Auf der Berglehne, die jenseits vom Eisernen Tor auf den Orontes niederblickt, befindet sich eine Höhle, welche die Tradition St. Petershöhle nennt. Die Griechengemeinde hat an ihrem Eingang eine kleine Kapelle errichtet. Ein wenig weiter am Hügel hin ist eine noch merkwürdigere Reliquie Altantiochiens, nämlich das Haupt einer Sphinx, reliefartig aus einem etwa 20 Fuß hohen Felsen ausgehauen. Sie trägt auf ihrer Stirn eine Drapierung, die, zu beiden Seiten ihres Gesichtes niederfallend, dort endet, wo der Hals in die unbekleidete Brust übergeht. Ihr ausdrucksloses Gesicht ist leicht talaufwärts gerichtet, als ob sie jemandes harre, der aus dem Osten kommen müsse. Könnte sie nur reden! Sie würde uns von großen Königen und prunkvollen Aufzügen, von Kämpfen und Belagerungen erzählen, denn all das hat sie von ihrem Felsen an der Berglehne aus gesehen. Sie erinnert sich auch, wie die ihr bekannten Griechen von Babylonien heraufzogen, aber da selbst die Römer sie nicht lehren konnten, daß das wahre Leben westwärts liegt, durfte auch ich nicht hoffen, sie aufzuklären, und ließ sie daher weiter des Neuen aus dem Osten harren.
