Download PDF Epithelial cell culture methods and protocols methods in molecular biology 2749 mario
Epithelial Cell Culture Methods and Protocols Methods in Molecular Biology 2749 Mario Baratta
Visit to download the full and correct content document: https://textbookfull.com/product/epithelial-cell-culture-methods-and-protocols-methods -in-molecular-biology-2749-mario-baratta/
More products digital (pdf, epub, mobi) instant download maybe you interests ...
3D Cell Culture Methods and Protocols Methods in Molecular Biology 2764 2nd Edition Zuzana Sumbalova Koledova
University of Hertfordshire Hatfield, Hertfordshire, UK
For further volumes: http://www.springer.com/series/7651
For over 35 years, biological scientists have come to rely on the research protocols and methodologies in the critically acclaimed Methods in Molecular Biology series. The series was the first to introduce the step-by-step protocols approach that has become the standard in all biomedical protocol publishing. Each protocol is provided in readily-reproducible step-by step fashion, opening with an introductory overview, a list of the materials and reagents needed to complete the experiment, and followed by a detailed procedure that is supported with a helpful notes section offering tips and tricks of the trade as well as troubleshooting advice. These hallmark features were introduced by series editor Dr. John Walker and constitute the key ingredient in each and every volume of the Methods in Molecular Biology series. Tested and trusted, comprehensive and reliable, all protocols from the series are indexed in PubMed.
EpithelialCellCulture
Methods and Protocols
Second Edition
Edited by Mario Baratta
Department of Chemistry, Life Sciences and Environmental Sustainability, University of Parma, Parma, Italy
Editor Mario Baratta
Department of Chemistry, Life Sciences and Environmental Sustainability
University of Parma
Parma, Italy
ISSN 1064-3745ISSN 1940-6029 (electronic)
Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-0716-3608-4ISBN 978-1-0716-3609-1 (eBook) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3609-1
This work is subject to copyright. All rights are solely and exclusively licensed by the Publisher, whether the whole or part of the material is concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation, computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not imply, even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations and therefore free for general use.
The publisher, the authors, and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty, expressed or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been made. The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
This Humana imprint is published by the registered company Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature.
The registered company address is: 1 New York Plaza, New York, NY 10004, U.S.A.
Paper in this product is recyclable.
Preface
Epithelial cell culture has emerged as a cornerstone technique in the field of cell biology, providing invaluable insights into the fundamental mechanisms underlying various physiological processes. It is with great pleasure and excitement that we present the second edition of Epithelial Cell Culture: Methods and Protocols, which builds upon the success of the first edition and further delves into the dynamic world of epithelial cell research.
In this edition, we have taken a meticulous approach to ensure the integration of chapters from the previous edition (Chaps. 2, 3, 5, 9, 10) while also incorporating new issues that have surfaced since the first edition. The rapid advancements in cell culture methodologies and the ever-evolving understanding of epithelial cell biology have paved the way for novel techniques and applications. As such, this edition reflects the latest cuttingedge research, ensuring that our readers are equipped with the most up-to-date knowledge in the field.
An essential hallmark of this volume is the comprehensive representation of epithelial cell culture models from different mammalian species. As our understanding of cellular biology becomes more intricate, the need to explore diverse organisms becomes imperative. Hence, in this book, you will find detailed methodologies applicable to epithelial cells derived from primates, pigs, bovines, and laboratory animals. This expansion in scope allows researchers and students alike to grasp the nuances of comparative biology, fostering a deeper appreciation of species-specific variations in cellular behavior.
Epithelial Cell Culture: Methods and Protocols, Second Edition is not limited to conventional cell culture techniques; rather, it transcends boundaries by delving into the manipulation and differentiation of epithelial cells. As cellular engineering and regenerative medicine hold the promise of transformative medical therapies, understanding cellular behavior at this level of granularity becomes paramount. Therefore, the inclusion of these advanced methodologies is a reflection of our commitment to equipping researchers with the knowledge and tools needed to push the boundaries of scientific exploration.
Recognizing the growing significance of the gastroenteric system in human medicine and nutrition, we have dedicated special attention to epithelial cell models in this vital system. Epithelial cells lining the gastrointestinal tract play a crucial role in nutrient absorption, maintaining barrier integrity, and orchestrating interactions with the complex gut microbiome. As emerging research continues to reveal the intricate interplay between the gut epithelium and human health, we felt compelled to offer a dedicated section that addresses the unique challenges and opportunities presented by this essential system.
This second edition volume aspires to be more than just a reference guide; it aims to be a source of inspiration and knowledge that empowers researchers to push the boundaries of cellular science. We believe that the collective efforts of scientists and students in this field hold the key to unlocking groundbreaking medical discoveries, improving human health, and advancing our understanding of life itself.
We extend our heartfelt gratitude to all the contributors and researchers who have generously shared their expertise, making this second edition possible. Their collective dedication has enriched this volume and enabled it to become a cornerstone resource in the realm of epithelial cell culture.
Finally, we hope that the scientific community, educators, and students will find this edition to be a valuable companion in their journey to unravel the complexities of epithelial cell biology, cultivate curiosity, and inspire the next generation of groundbreaking research.
Parma, ItalyMario Baratta
Caitlynn M. L. Barrows, Danielle Wu, Simon Young, and Mary C. Farach-Carson
Weronika Gonciarz and Magdalena Chmiela
7 Method for Two-Dimensional Epithelial Monolayer Formation Derived from Mouse Three-Dimensional Small Intestinal Organoids
Yuta Takase
Paola Toschi, Irene Viola, Isabella Manenti, Silvia Miretti, Elisabetta Macchi, Eugenio Martignani, Paolo Accornero, and Mario Baratta
13 Amniotic Membrane and Amniotic Epithelial Cell Culture
Angelo Canciello, Adrian Cervero ` -Varona, Maura Turriani, Valentina Russo, and Barbara Barboni
14 Evaluation of the Epithelial Barrier Integrity in Primary Cultures of Pig Mammary Epithelial Cells 151
Chiara Bernardini, Debora La Mantia, and Monica Forni
Silvia Miretti, Isabella Manenti, Paola Toschi, Elisabetta Macchi, Eugenio Martignani, Paolo Accornero, and Mario Baratta
16 Equine Induced Pluripotent Stem Cell Culture .
Julia Falk and F. Xavier Donadeu
Index
Contributors
PAOLO ACCORNERO • Department of Veterinary Sciences, University of Torino, Turin, Italy
YASUHIRO ADACHI • Department of Anatomy, School of Medicine, University of Occupational and Environmental Health, Fukuoka, Japan
STELLA AGRADI • Department of Veterinary Medicine and Animal Sciences, University of Milan, Milan, Italy
MARIO BARATTA • Department of Chemistry, Life Sciences and Environmental Sustainability, University of Parma, Parma, Italy
BARBARA BARBONI • Faculty of Bioscience and Technology for Food, Agriculture and Environment, University of Teramo, Teramo, Italy
CAITLYNN M. L. BARROWS • Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center at Houston, Houston, TX, USA; Katz Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The University of Texas Health Science Center at Houston, Houston, TX, USA
CHIARA BERNARDINI • Department of Veterinary Medical Sciences, University of Bologna, Bologna, Italy; Health Sciences and Technologies-Interdepartmental Center for Industrial Research (CIRI-SDV), Alma Mater Studiorum – University of Bologna, Bologna, Italy
ANGELO CANCIELLO • Faculty of Bioscience and Technology for Food, Agriculture and Environment, University of Teramo, Teramo, Italy
ADRIAN CERVERO ` -VARONA • Faculty of Bioscience and Technology for Food, Agriculture and Environment, University of Teramo, Teramo, Italy
MAGDALENA CHMIELA • Department of Immunology and Infectious Biology, Institute of Microbiology, Biotechnology and Immunology, Faculty of Biology and Environmental Protection, University of Lodz, Lodz, Poland
CINDRILLA CHUMDURI • Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany; Laboratory of Infections, Carcinogenesis and Regeneration, Medical Biotechnology Section, Department of Biological and Chemical Engineering, Aarhus University, Aarhus, Denmark; Chair of Microbiology, University of Wu¨rzburg, Wu¨rzburg, Germany
GIULIO CURONE • Department of Veterinary Medicine and Animal Sciences, University of Milan, Milan, Italy
MICHAEL K. DAME • Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, University of Michigan Medical School, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA
MATHEUS DE OLIVEIRA COSTA • Large Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Canada; Population Health Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, Utrecht, The Netherlands
F. XAVIER DONADEU • Division of Translational Bioscience, The Roslin Institute and Royal (Dick) School of Veterinary Studies, University of Edinburgh, Edinburgh, UK
JULIA FALK • Division of Translational Bioscience, The Roslin Institute and Royal (Dick) School of Veterinary Studies, University of Edinburgh, Edinburgh, UK
MARY C. FARACH-CARSON • Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center at Houston, Houston, TX, USA; Department of Bioengineering, Rice University, Houston, TX, USA; Department of Biosciences, Rice University, Houston, TX, USA
MASSIMO FAUSTINI • Department of Veterinary Medicine and Animal Sciences, University of Milan, Milan, Italy
PEYING FONG • Department of Anatomy and Physiology, Kansas State University College of Veterinary Medicine, Manhattan, KS, USA
MONICA FORNI • Health Sciences and Technologies-Interdepartmental Center for Industrial Research (CIRI-SDV), Alma Mater Studiorum – University of Bologna, Bologna, Italy; Department of Medical and Surgical Sciences, University of Bologna, Bologna, Italy
WERONIKA GONCIARZ • Department of Immunology and Infectious Biology, Institute of Microbiology, Biotechnology and Immunology, Faculty of Biology and Environmental Protection, University of Lodz, Lodz, Poland
RAJENDRA KUMAR GURUMURTHY • Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, Germany
NAVEEN KUMAR • Chair of Microbiology, University of Wu¨rzburg, Wu¨rzburg, Germany
DEBORA LA MANTIA • Department of Veterinary Medical Sciences, University of Bologna, Bologna, Italy
LINHAO LI • Department of Pharmaceutical Sciences, University of Maryland School of Pharmacy, Baltimore, MD, USA
SARA K. LINDE ´ N • Department of Medical Biochemistry and Cell biology, Institute of Biomedicine, Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden
ELISABETTA MACCHI • Department of Veterinary Sciences, University of Torino, Turin, Italy
ISABELLA MANENTI • Department of Veterinary Sciences, University of Torino, Turin, Italy
EUGENIO MARTIGNANI • Department of Veterinary Sciences, University of Torino, Turin, Italy
SILVIA MIRETTI • Department of Veterinary Sciences, University of Torino, Turin, Italy
MACARENA P. QUINTANA-HAYASHI • Department of Medical Biochemistry and Cell biology, Institute of Biomedicine, Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden
VALENTINA RUSSO • Faculty of Bioscience and Technology for Food, Agriculture and Environment, University of Teramo, Teramo, Italy
SINAN SHARBA • Department of Medical Biochemistry and Cell biology, Institute of Biomedicine, Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden
TOSHIO TAKAHASHI • Suntory Foundation for Life Sciences, Bioorganic Research Institute, Kyoto, Japan
YUTA TAKASE • Suntory Foundation for Life Sciences, Bioorganic Research Institute, Kyoto, Japan
MARIA L. TORRE • Dipartimento di Scienze del farmaco , Universita ` degli Studi del Piemonte Orientale, Vercelli, Italy
PAOLA TOSCHI • Department of Veterinary Sciences, University of Torino, Turin, Italy
SIMON D. TRAN • McGill Laboratory of Craniofacial Tissue Engineering and Stem Cells, Faculty of Dental Medicine and Oral Health Sciences, McGill University, Montreal, QC, Canada
MIGMAR TSAMCHOE • Department of Anatomy and Cell Biology, McGill University, Montreal, QC, Canada; Research Institute of the McGill University Health Center, McGill University, Montreal, QC, Canada
MAURA TURRIANI • Faculty of Bioscience and Technology for Food, Agriculture and Environment, University of Teramo, Teramo, Italy
AKSHAYA UPADHYAY • McGill Laboratory of Craniofacial Tissue Engineering and Stem Cells, Faculty of Dental Medicine and Oral Health Sciences, McGill University, Montreal, QC, Canada
DANIELE VIGO • Department of Veterinary Medicine and Animal Sciences, University of Milan, Milan, Italy
IRENE VIOLA • Department of Veterinary Sciences, University of Torino, Turin, Italy
HONGBING WANG • Department of Pharmaceutical Sciences, University of Maryland School of Pharmacy, Baltimore, MD, USA
DANIELLE WU • Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center at Houston, Houston, TX, USA; Department of Bioengineering, Rice University, Houston, TX, USA
SIMON YOUNG • Katz Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The University of Texas Health Science Center at Houston, Houston, TX, USA
Chapter 1
Culture of Mouse Thymic Epithelial Cells in Serum-Free Medium
Yasuhiro Adachi
Abstract
Primary cell culture systems are widely used as a valuable method for analyzing the biological functions of specific cells in vitro. Recently, various serum-free primary cell culture methods have been developed that do not involve the use of animal serums. Since the thymus is comprised of many cell types, such as thymocytes, thymic epithelial cells, macrophages, and fibroblasts, thymic epithelial cells must be isolated for their functional analysis in vitro. This chapter describes the detailed protocol for the selective primary culture of thymic epithelial cells using defined serum-free medium.
Key words Thymic epithelial cells, TECs, Collagenase, Primary cell culture, Serum-free medium
1 Introduction
The thymus is the primary lymphoid organ responsible for the differentiation and maturation of T lymphocytes that function in the periphery. Thymic epithelial cells (TECs) are divided into two subpopulations (cortical TEC and medullary TEC), both of which play a role in inducing the differentiation and maturation of bone marrow-derived T lymphocyte progenitor cells (thymocytes) [1]. In early TEC analysis using cell culture systems [2, 3], the use of animal serums as an essential component of the culture medium caused several problems, including the proliferation of fibroblasts, the promotion of TEC differentiation by calcium ions, the effects of unknown factors in serum, and reproducibility problems due to serum quality. Subsequently, various improvements have been made, and serum-free culture methods have been established [3–7]. In recent studies on TECs, accurate analysis [8] and isolation of TEC subpopulations have been performed, alongside the investigation of differentiation stage-specific marker molecules [9] using flow cytometry (FCM) and fluorescence-activated cell sor ting (FACS). However, the serum-free culture system is useful
for analyzing the effects of specific molecules such as cytokines, growth factors, and nutrients, since it has a defined medium composition and other serum components do not influence the experiment.
This chapter describes the basic culture protocol for growing thymic epithelial cells (TECs), including the dissection of thymus from newborn mice, pretreatment for culture, and culture methods using serum-free media.
2 Materials
2.1 Newborn Mice
2.2 Preparation of Culture Wells
2.3 Dissection of Thymus from Newborn Mice
Mice should be systematically mated according to institutional guidelines (see Note 1).
1. Sterile culture wells: 35 and 60 mm plastic dishes or fourchamber slides.
3. 0.1% (w/v) gelatin: Cell culture grade gelatin should be used. Add 0.5 g of gelatin powder in a bottle containing 500 mL of purified water. Autoclave to dissolve gelatin completely and sterilize (see Note 2). Add 5 mL of 0.1% gelatin solution to a 60 mm plastic dish and incubate at 4 °C overnight. The recommended gelatin solution volumes are 10 mL for 100 mm dishes, 2 mL for 35 mm dishes, and 0.5 mL for 24-well plates and 4-chamber slides. Wash the culture wells with the same volume of 1× PBS (-) just prior to use.
4. Basic medium: 1:1 mixture of Ca2+-free DMEM and Ham’s F-12 nutrient mix supplemented with 2 mM L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate, 100 U/mL penicillin, and 100 μg/ mL streptomycin.
5. Culture medium: Basic medium supplemented with 3 μg/mL recombinant human insulin (INS), 20 ng/mL recombinant human epidermal growth factor (EGF), 0.5 μg/mL hydrocortisone (HC), and 10 ng/mL cholera toxin (CT). For the preparation of 1000× stock solutions, mix together 3 mg/mL INS in basic medium, 20 μg/mL EGF in basic medium, 0.5 mg/mL HC in ethanol, and 10 μg/mL CT in purified water, and store at -20 °C. To make 1 mL of culture medium, add 1 μL each of 1000× growth supplement to 1 mL of basic medium just prior to use.
1. 70% (v/v) ethanol.
2. 60 mm plastic dishes.
3. Ice-cold, sterile Ca2+/Mg2+-free Hank’s balanced salt solution (HBSS).
4. Ice-cold, sterile 1× PBS (-).
2.4 Enzymatic Dissociation of Thymus Fragments
2.5 Culture in Serum-Free Medium
5. Two sets of sterile, regular, and microdissecting scissors and forceps: one for dissection and trimming the thymus and one for sterile use.
6. Stereomicroscope.
1. Sterile 14 mL polypropylene tubes.
2. Micropipettes with 200 μL and 1000 μL tip: The tips should be cut at 2 mm.
3. Basic media supplemented 1 mg/mL DNase I and 1 mg/mL collagenase with low protease activity.
The following operations should be performed under conditions as sterile as possible.
1. Prepare two sets of two 60 mm plastic dishes on ice with 5 mL of 1× PBS (-) and HBSS, respectively.
2. Sacrifice newborn mice (usually six to ten pups) by CO2 asphyxiation following institutional ethical regulations, and sterilize by immersion in 70% ethanol (see Note 3).
3. Remove the anterior thoracic wall with sterile scissors and forceps, and dissect the thymus under a stereomicroscope. Place the dissected thymus in a plastic dish containing ice-cold 1× PBS (-) to wash out the blood (Fig. 1).
4. Transfer the washed thymus to the next dish containing 1× PBS (-), and thoroughly remove connective tissue and capsule around the thymus with micro-forceps. Store the thymus in the next dish containing HBSS on ice.
5. Mince the trimmed thymus into 1–2 mm squares with sterile micro scissors in the dish containing HBSS.
Fig. 1 Dissection of the thymus obtained from newborn mice. Panel A: front view of thoracic organs. Anterior thoracic wall has been removed. T: thymus; H: heart; L: lung; d: diaphragm; and li: liver. Panel B: dissected thymus (“T” in panel A) before trimming in 1× PBS (-). Bar = 3mm
6. Collect the thymic fragments in a sterile 14 mL tube containing 5 mL of HBSS, and suspend by 15-gentle pipetting with a 1000 μL micro tip with the tip cut about 2 mm to release the bulk of thymocytes.
7. Stand the tube on ice for 5 min to allow the thymic fragments to settle.
3.2 Enzymatic Dissociation of Thymus Fragments
3.3 Culture in Serum-Free Medium
1. Transfer the supernatant containing thymocytes to another sterile tube.
2. Add5mLof37 °Cpre-warmedbasicmediumcontainingDNase I and collagenase to settled thymus fragments, and incubate for 30 min at 37 °C. Stir by ten-gentle pipetting every 5 min.
3. Transfer the supernatant to the tube of Step 1, and add 5 mL of new pre-warmed basic medium containing enzymes. Repeat three rounds of enzymatic dissociation (see Note 4).
4. Resuspend the resultant thymus fragments that are smaller in size in the 2 mL of culture medium.
1. Add growth supplements (EGF, INS, HC, and CT) to the basic medium stored on ice to prepare the required volume of culture medium.
2. Aspirate 0.1% gelatin in culture wells, wash wells with same volume of 1 × PBS (-) once, and add culture medium to each well.
3. Resuspend the enzymatically dissociated thymus fragments in culture medium, and add to the well in equal volumes. Place and arrange the thymus fragments evenly in a culture well with sterile micro-forceps (see Note 5).
4. Start culture in 5% CO2 incubator at 37 °C. The initial medium change should be performed after 3 days, and half the medium volume should be exchanged every 2 days after that (see Note 6).
5. In the second or third week of culture, cells may be transferred to new matrix-coated culture wells by trypsinization. Aspirate the culture medium off, and add 0.5 mL of trypsin-EDTA to a 60 mm dish. Incubate the culture at 37 °C for 10–20 min. At this time, check whether the cells have detached from the bottom of the culture wells; if not, incubate the culture for a few more minutes. To stop the enzymatic reaction, add 0.2 mL of 1 mg/mL trypsin inhibitor to the culture. Serum-containing medium should not be used as an inhibitor of trypsin here.
6. Collect the detached cells by pipetting, and centrifuge at 1000–1200 rpm for 5 min at 4 °C. Resuspend cells in fresh culture medium and seed onto new matrix-coated culture wells at a density of 105 cells/mL.
4 Notes
1. There is no significant difference in the proliferation of thymic epithelial cell from the thymus of mice up to 5 days old, but the authors use 3-day old mice for more efficient cell growth. In addition, pregnant mice can be purchased from animal suppliers.
2. Gelatin is used as a coating matrix for the adhesion of thymus fragments and cells to the dish in this protocol; type-I collagen can also be used [10]. Type-I collagen-coated culture wells can be purchased from a variety of suppliers.
3. Sacrificed mice should be wrapped in aluminum foil wiped with 70% ethanol and cooled in ice. Attention should be paid to the operator’s processing capacity and the number of mice to be processed.
4. The thymus fragments after the second enzymatic dissociation would be smaller because of the release of thymocytes. These should not be removed with supernatant containing thymocytes. Furthermore, the supernatant containing thymocytes which has been collected in a tube so far can be used for other analyses, such as flow cytometry.
5. An appropriate number of thymic fragments to be placed in culture wells may be 2 or 3 fragments in 4-chamber slides, 10–15 fragments in a 35 mm dish, and 20–30 fragments in a 60 mm dish. Depending on the number of placed thymus fragments, if the culture is successful, TECs may start expanding by day 2 or 3 and be confluent in 1 or 2 weeks (Fig. 2).
Fig. 2 Proliferation of thymic epithelial cells on day 3 and 7 after the start of serum-free primary culture. Asterisks indicate enzymatically dissociated thymus fragments. Bar = 500 μm
6. Cultures should not be moved from incubator at least for the initial 48 h. The thymus fragments could detach if the medium shakes when it is removed from the incubator for observation. The reattachment of the thymus fragments is difficult, and detached fragments soon die. If the thymic fragments have not adhered and expanded at the bottom of the well 3 days after the start of the culture, the experiment failed.
References
1. Abramson J, Anderson G (2017) Thymic epithelial cells. Annu Rev Immunol 35:85–118. https://doi.org/10.1146/annurev-immunol051116-052320
2. Sun TT, Bonitz P, Burns WH (1984) Cell culture of mammalian thymic epithelial cells: growth, structural, and antigenic properties. Cell Immunol 83(1):1–13. https://doi.org/ 10.1016/0008-8749(84)90219-3
3. Farr AG, Eisenhardt DJ, Anderson SK (1986) Isolation of murine thymic epithelium and an improved method for its propagation in vitro. Anat Rec 216(1):85–94. https://doi.org/10. 1002/ar.1092160115
4. Nieburgs AC, Picciano PT, Korn JH, McCalister T, Allred C, Cohen S (1985) In vitro growth and maintenance of two morphologically distinct populations of thymic epithelial cells. Cell Immunol 90(2):439 – 450. https://doi.org/10.1016/0008-8749(85) 90208-4
5. Ropke C, Elbroend J (1992) Human thymic epithelial cells in serum-free culture: nature and effects on thymocyte cell lines. Dev Immunol 2(2):111 – 121. https://doi.org/10.1155/ 1992/95098
6. Ropke C (1997) Thymic epithelial cell culture. Microsc Res Tech 38(3):276–286
7. Sands SS, Meek WD, Hayashi J, Ketchum RJ (2005) Medium calcium concentration determines keratin intermediate filament density and distribution in immortalized cultured thymic epithelial cells (TECs). Microsc Microanal 11(4):283 – 292. https://doi.org/10.1017/ S1431927605050282
9. Wang HX, Pan W, Zheng L, Zhong XP, Tan L, Liang Z, He J, Feng P, Zhao Y, Qiu YR (2019) Thymic epithelial cells contribute to thymopoiesis and T cell development. Front Immunol 10:3099. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.03099
10. Ropke C, van Deurs B, Petersen OW (1990) Short-term cultivation of murine thymic epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro Cell Dev Biol 26(7):671–681. https://doi. org/10.1007/BF02624423
Chapter 2
Cultured Pig Thyroid Follicular Cells: Electrical Evaluation of Epithelial Integrity
Peying Fong
Abstract
Thyroid epithelial cells organize as enclosed follicles containing thyroid hormone precursor, iodinated thyroglobulin, with lumina bordered by the cellular apices. Transepithelial transport determines composition of compartmental milieu essential for both prohormone formation and its downstream conversion to thyroxine. Hence, not only do follicular lumina function as storage vessels but also as physiological reaction chambers into which reactive components, together with the proper salts and water, are secreted. Polarized, two-dimensional cultures of pig thyroid epithelia, prepared using established protocols, provide a convenient system for assessing transport processes subserving hormone production. This chapter details established methods for growing and evaluating integrity of primary pig thyroid cultures for downstream analysis of transport and other key physiological functions.
Key words Thyrocyte, Apical, Basolateral, Transport, Resistance, Voltage, Current
1 Introduction
Epithelia organize as polarized arrays of cells joined by tight junctional complexes defining distinct apical and basolateral domains. This structural organization confers the ability to move solutes and water directionally – by either secretion or absorption – between their blood-facing (or interstitial) compartments and luminal compartments. In the case of epithelia that can be isolated from tissues as two-dimensional sheets, such as the intestine, colon, and bladder, both apical and basolateral sides can be accessed, enabling simple, yet powerful, experimental interrogation of secretory and absorptive processes.
Studies of transport processes germane to thyroid function are limited by the three-dimensional, follicular organization of thyrocytes. In situ voltage-and ion-sensing microelectrode measurements can provide insights [1] but also are technically challenging and moreover limited by inaccessibility of the luminal compartment
to perfusion of experimental solutions. Thyrocytes grown on solid surfaces do develop polarity [2] but present the opposite problem of limiting accessibility to the basolateral aspect of the epithelium. Moreover, many epithelial cell types do not fully express transport proteins and polarize when grown on plastic but do when grown on permeable membrane supports [3]. Indeed, thyroid epithelial cells grown on permeable supports respond to thyroid-stimulating hormone (TSH) with iodide uptake and release [4, 5], permitting measurement of directional transport function [6, 7].
Early monolayer cultures of adult pig thyroids utilized fully dissociated cell suspensions [4, 6, 7]. Taking into account the greater proliferative capacity of neonatal and juvenile tissue and their potential for infiltration by fibroblasts introduced by complete cell dissociation procedures [8], we implemented isolated follicles for cultivating monolayer cultures of neonatal pig thyroids [9]. We based our procedures on the follicle isolation methods for culture of human thyroid [10], as well as adult pig [5]. This approach therefore favored development of high electrical resistance suitable for transport measurements [5]. Indeed, polarized thyrocyte epithelial monolayers derived from genetically engineered neonatal pigs proved indispensible for investigations seeking to understand the impact of these genetic manipulations on directional transport [11, 12].
Pig thyrocytes grown on permeable supports render thyroid epithelia suitable for measurements of transepithelial voltage, resistance, and short-circuit current. They also lend themselves well to tracer-based measurements of transport [5, 13], as well as studies of membrane polarization and subcellular trafficking using microscopic, cell biological and biochemical assays [6, 7, 11, 12]. In addition to reviewing our published protocol for culturing thyrocytes [9], the present chapter details a method for evaluating epithelial integrity necessary for terminal transport measurements. It serves as a functional tool for verifying development of monolayer polarity, regardless of the downstream application.
2 Materials
Review the following standard procedures for handling of reagents and materials.
• All surgically collected tissues are placed into sterile, ice-cold media and transported to the laboratory on ice.
• Solutions and growth media are stored at 4 °C and warmed to 37 °C before use.
• Serum and antibiotic stocks are aliquoted and stored at -20 °C to avoid multiple freeze-thaw cycles. Aliquots of stocks are thawed and mixed immediately before preparation of media.
2.1 Solutions for Thyroid Follicle
Isolation and Culture
• Store powdered enzymes at 4 °C in tightly lidded secondary containers filled with desiccant.
• Media for tissue culture, as well as for solutions for measuring monolayer electrical parameters, are sterilized by passing through disposable vacuum filtration units fitted with 0.22 μm pore size polyethersulfone membranes.
• For cell culture procedures, all plasticware and dissection instruments are sterile.
• Comply with all approved local safety procedures for disposal of biological waste, plasticware, and sharps.
Life Technologies supplies both liquid cell culture media and sera for our cell culture protocol. The compositions listed below correspond to their formulations.
• Hank’s buffered saline solution (HBSS): 137 mM NaCl, 4.17 mM NaHCO3, 5.33 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.34 mM Na2HPO4, 0.41 mM MgSO4.7H2O, 0.49 mM MgCl2.6H2O, 1.26 mM CaCl2, 5.56 mM D-glucose. If necessary, filter-sterilize the solution. Store at 4 °C.
• Ca2+/Mg2+-free HBSS: 137 mM NaCl, 4.17 mM NaHCO3, 5.33 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.34 mM Na2HPO4, 5.56 mM D-glucose. Filter-sterilize if necessary and store at 4 °C.
• Tissue dissociation solution (TDM): On the day of undertaking thyroid follicle isolation, mix Ca2+/Mg2+-free HBSS with collagenase type A (3.9 Wu¨nsch U/50 mL) and dispase (50 mg/ 50 mL) (see Note 1). Sterilize by filtration, and place in 37 °C water bath. Fifty milliliters (50 mL) is sufficient for completing isolation from one thyroid (see Note 2).
• Collagenase type A (from Clostridium histolyticum).
• Dispase (neutral protease from Bacillus polymyxa).
• Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM): This base medium (Life Technologies #11965) contains 110.34 mM NaCl, 44.05 mM NaHCO3, 5.33 mM KCl, 0.81 mM MgSO4 (anhydrous), 1.80 mM CaCl2, 2.48 mM Fe(NO3)3 9H2O, 25 mM D-Glucose, and 0.04 mM phenol red. The formulation includes a mixture of vitamins and amino acids, including 4.0 mM L-glutamine (see Note 3). In a 5% CO2 atmosphere, pH is 7.4.
• Fetal bovine serum (FBS): The preferred product is Life Technologies #26140079 (see Note 4).
2.2 Plasticware and Dissection Tools
• Thyroid-stimulating hormone stock (TSH, 1 IU/mL, 1000×): Dissolve 10 IU in 10 mL HBSS with 0.1% bovine serum albumin to prepare TSH stock. Store frozen at -20 °C in conveniently scaled aliquots.
• Growth medium (GM): This comprises DMEM supplemented with FBS (10%), thyroid-stimulating hormone (final concentration, 1 IU/L), and penicillin-streptomycin (50 U/mL and 50 μg/mL). Mix components, filter to sterilize, and store at 4 °C.
• Antiseptic surgical scrub (such as Betadine): use if surgically excising thyroids from freshly euthanized animals [9].
Obtain the following items as pre-packaged, sterile units:
• Filtration units for sterilization of solutions (pore size, 0.22 μm): We typically use units suitable for filtering volumes ranging from 50 mL to 1 L.
• Sterile serological pipettes.
• Tissue culture dishes (100 mm diameter).
• Sterile conical centrifuge tubes (15 and 50 mL).
• Cell strainers with mesh pore size of ~100 μM. Units obtained from several sources yield comparable results.
• Tissue culture-treated T25 flasks.
• Permeable growth supports: Corning Costar Snapwell® inserts (12-mm-diameter membrane; 1.12 cm2 growth area) are the growth support of choice if the downstream use is continuous monitoring of epithelial transport via short-circuit current measurements (see Note 5). Snapwells are convenient for use in suitably modified Ussing chambers. The epithelial resistance procedure described uses a measuring chamber designed to accept Snapwell® inserts.
• Scalpel blades.
• In addition, have available the following sterilized items: Single-edged razor blades.
• Blunt and fine forceps.
• Dissection scissors.
• Scalpel handle.
• Weighing spatula.
• Borosilicate Pasteur pipettes.
2.3 Required Equipment for Cell Culture
For the cell culture procedure, the following equipment is used:
• Class II A2 biosafety cabinet fitted with a vacuum line.
• 5% CO2,37 °C humidified incubator.
2.4 Solutions and Required Equipment for Measuring Epithelial Integrity
• Cell counter.
• 37 °C water bath.
• Automatic pipettor.
• Dissection microscope and light source.
• Inverted light microscope.
• Cold blocks.
• Tabletop centrifuge: A low-speed centrifuge with a rotor accommodating 50 mL conical tubes is adequate.
This protocol uses electrical resistance as a proxy for epithelial integrity. Measurements of transepithelial resistance use either a Hepes-buffered Ringer solution (HBRS) or a phosphate-buffered Ringer solution (PBRS). These single time-point measurements are performed at room temperature (see Note 6).
• HBRS comprises 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1.06 mM MgCl2, 12.4 mM Hepes (free acid), 5.1 mM glucose, pH 7.4 using NaOH.
• PBRS contains 140 mM NaCl, 2.125 mM K2HPO4, 0.375 mM KH2PO4, 2 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 5 mM glucose. With this combination of di-and monobasic phosphate, pH should be close to 7.4. Adjust with NaOH if necessary.
• Epithelial voltmeter (EVOM; World Precision Instruments): See Fig. 2 for an image of the front panel.
• Electrode assembly of choice (EndOhm-24SNAP) and connectors. Figure 3c details the EndOhm-24SNAP chamber electrode arrangement.
• Small (2.5 mm blade) flathead screwdriver.
• Two blank Snapwell® inserts: Mark one to be used under non-sterile conditions and the other to be used under sterile conditions.
• Blunt curved forceps for transferring Snapwells to EndOhm24SNAP.
Adhere to aseptic technique whenever possible throughout the procedure. Undertake tissue mincing and follicle isolation, and culture in a Class II A2 Biological Safety Cabinet. Maintain cultures in a humidified 5% CO2 atmosphere, at 37 °C.
3.1 Transporting Freshly Excised Thyroid Glands
For the novice, conceptualize the protocol by considering the four general processes, described by Wills [14]. These are tissue isolation, mechanical and enzymatic dissociation of the tissue, selection for the proliferative units desired, and seeding.
If thyroids are obtained locally, ensure that all protocols and procedures for handling and euthanasia adhere to approved institutional protocols for animal care and use. Transfer excised thyroids to prechilled sterile HBSS, then seal containers tightly, and place on ice for transport to the laboratory. Thyroids tolerate overnight storage at 4 °C before successful follicle harvest. We find that thyroids shipped on ice by overnight express can produce similar results. All volumes stated in subsequent sections of this protocol are scaled for processing of one thyroid. For each thyroid harvested, aseptically dispense 30 mL HBSS into a labeled 50 mL conical tube and keep chilled on ice (see Note 7).
3.2 Coarse Tissue Mincing
3.3 Isolation of Follicle Fragments
• Transfer the tube to the biosafety cabinet, and rinse the thyroid three times with sterile TWS. Aspirate TWS completely between rinses.
• Place the thyroid into a fresh 100 mm culture plate.
• Mince the thyroid into ~2 mm × 2 mm pieces using a singleedged razor blade (see Note 8).
• Using a sterile weighing spatula, transfer the minced thyroid pieces into a 15 mL conical tube containing sterile TWS. Rinse by shaking, allowing the pieces to settle, and removing excess TWS.
• Repeat the washes, shaking well in between, for a total of five washes (see Note 9).
• Remove the HBSS from the last wash and rinse three times with Ca2+-Mg2+-free HBSS.
• After the last rinse, add 10 mL of warmed TDM. Incubate in a 37 °C water bath. Agitate intermittently (every 15 min) by briskly shaking for ~20 s. Allow digest to proceed 1 h.
• At the 1-h time point, shake again before allowing the pieces to settle. Collect the supernatant (see Note 10) and transfer to a sterile 15 mL tube, marking this as fraction 1 (F1). Note the volume collected, and then neutralize the enzymes by adding FBS (0.5%; for a 10 mL collection, add 50 μL). Set the tube containing the collected F1 on ice.
• Add 10 mL fresh TDM into the tube containing the residual loosely pelleted tissue fragments. Shake well and return the tube to the 37 °C water bath. Allow the digest to proceed above for an additional 30 min. Shake vigorously at 15 min and again at 30 min.
3.4 Counting and Seeding Follicle Fragments
• Collect the second fraction (F2), as described above (see Note 11). Repeat the procedure until no solid tissue remains.
• Pool all collected fractions and centrifuge at 200 g × 5 min. Discard the supernatant and suspend the pellet in 10 mL DMEM.
• Place the suspension on ice for 1 h to sediment the purified follicle fragments.
• Prepare Snapwell® plates by pipetting pre-warmed GM into the lower, and then upper, chambers. Add 1.8 mL to each lower chamber and 0.5 mL to each upper chamber. Keep warm and equilibrate pH by transferring to a humidified, 37 °C, 5% CO2 incubator.
• The follicles settle into a loose pellet in ~1 h. Carefully remove the supernatant.
• Add 10 mL fresh DMEM and resuspend the purified follicles.
• Place a 100 μm mesh cell strainer into a 50 mL conical tube. Slowly filter 5 mL of the suspension through this assembly. Rinse the strainer with 5 mL DMEM. The final volume will be ~10 mL.
• Place a second strainer into another 50 mL conical tube, then filter the remaining 5 mL follicle suspension and rinse with 5 mL DMEM. You will now have two 50 mL tubes, containing ~10 mL of 0.5× follicle suspension (~5 mL initial suspension +5 mL DMEM) in each (see Note 12). Ensure both tubes contain equal volumes; if not, balance before the next step.
• Spin the filtered suspension at 200 g × 5 min. Remove the supernatant, add fresh DMEM, and repeat the wash.
• Resuspend the final pellets in 1–4mLGM (see Note 13). Figure 1a is a light micrograph showing a preparation satisfactorily depleted of single cells and enriched in follicles.
• Count the follicles and estimate the total yield. Remove the medium from the upper chambers before seeding >1 × 104 follicles (or fragments)/Snapwell® (see Note 14). For example, if plating on Snapwell® inserts (1.12 cm2 growth area), plate ~1.25 × 104 fragments/well. Follicles also can be used directly for immunofluorescence staining and confocal imaging (Fig. 1c).
• Refresh GM 24 h after seeding. Remove media from lower chamber first before removing from upper chamber. When replenishing GM, reverse the order: upper chamber first, then lower chamber (see Note 15). Feed the cells every 2 days thereafter. Juvenile pig thyroid cultures studied between days 12 and 18 post-seeding consistently produce transepithelial resistances (Rte > 1000 Ohms cm2) suitable for measurement of shortcircuit current in Ussing chambers. Preparations from adult
Fig. 1 Light microscopic images shown in panels A and B document follicle release during isolation procedure. (a) shows open follicles released by enzymatic fractionation. Note partially open follicle at left, marked with the arrowhead; scale bar: 50 μm; original image acquired at 40× magnification. (b) provides a closer view of the open follicle shown within area of Panel A marked by square; image acquired at 100× magnification. Note the delineation of follicular edges by cuboidal epithelial cells. Visualization of tight junctions in panels C and D: (c) acutely isolated neonatal pig thyroid follicle, rabbit anti-ZO-1 primary antibody, donkey anti-rabbit AlexaFluor 594 secondary antibody. (d) Confluent pig thyroid epithelial monolayer, rabbit anti-ZO-1 antibody, donkey anti-rabbit Cy3-labeled secondary
3.5 A Simple Tool for Assessing Epithelial Integrity
pig thyroids can yield higher Rte. Polarized monolayers grown on Snapwell® Clear supports lend themselves well to visualization by confocal microscopy, and ZO-1 staining confirms preservation of ability to form tight junctions (Fig. 1d).
A choice of methods exists for assessing epithelial integrity. Each investigator should determine which best suits their anticipated downstream application. These options, described by [14], include assessment of dye permeation by absorbance measurement, as well as measurement of epithelial resistance. Our lab favors the latter, as our cultures are destined for transport studies using open-and short-circuit current measurements. The following is the procedure our lab uses to assess epithelial resistance using an epithelial voltmeter (EVOM; World Precision Instruments, Sarasota, FL), fitted with an EndOhm-24SNAP electrode chamber (also from World Precision Instruments) (see Note 16). This protocol customizes for our applications the instructions furnished by the supplier, incorporating specific details, adjustments, and notes. Technical data are available by consulting the supplier’s device manuals. So performed, the resultant resistance measurements are particularly useful for evaluations of primary pig thyroid cultures obtained from neonatal to adult pigs.
• Test the EVOM before use: Switch “Mode” to R (resistance) setting, power on, and then press “Test R.” The meter should read 1000 Ω or 1 kΩ, depending on the “Range” toggle setting (either 2000 Ω or 20 kΩ, respectively; see Note 17).
• Position the upper electrode of the EndOhm-24SNAP chamber: Place a blank Snapwell® (“dummy”) into the EndOhm24SNAP. Loosen the nut on the cap, and then adjust the upper electrode height by rotating the cap so that there is 1–2 mm clearance between the electrode and the membrane. Secure the nut. There should be no need to change the position once set, assuming exclusive and continued use of Snapwell® supports.
• Inspect the electrode surfaces. If they show shiny patches, they require re-chloriding. We use a disposable plastic Pasteur pipette to apply full-strength household bleach directly over the bottom electrode assembly (Fig. 3a; see Note 18). Invert the upper electrode assembly, carefully balance on the connector end, and apply a small volume on the electrode (Fig. 3b). Allow 15 min, and then rinse all surfaces thrice with distilled water.
• Sterilize the equipment by wiping surfaces well with 70% ethanol/30% double-distilled water (see Note 19).
• Transfer EVOM, EndOhm-24SNAP, and connectors to biosafety cabinet (i.e., if there is intention to perform repeated measurements over time to monitor development of resistance). This step is not strictly necessary if measurements are terminal.
• Rinse the EndOhm-24SNAP well with sterile measuring solution. Aspirate to remove.
• Test the electrodes: Fill the cup with ~3 mL of HBRS (or PBRS), and ensure there is fluid continuity between the top and bottom electrodes.
• On the EVOM, set “Range” to 2000 Ω, and turn on the power. The meter should read 0. If it does not, use a small flathead screwdriver to adjust the “Zero Ω” screw.
• Once the meter reads zero, press “Measure R” (see Note 20). This reflects the fluid resistance in the compartment.
• Power off the EVOM.
• Correct for blank membrane resistance: Aspirate to remove the solution. Insert a dummy Snapwell® into the chamber, and pipette 0.25 mL HBRS or PBRS into the top, then 2.5 mL to the bottom, chamber. Ensure there are no bubbles.
• The expected background resistance will be low, so “Range” remains at the 2000 Ω setting (see Note 21).
• Power on the EVOM and push the “Measure R” button. This is the background resistance of the blank membrane filter. In HBRS, it should be ~20 Ω. Record the measured value.
• Switch off the EVOM before removing the blank insert. It is a good idea to have the electrodes in contact with fresh HBRS or PBRS.
• The system now is ready to measure resistance of the epithelial cultures.
• Prepare the culture inserts for measurement: Remove growth medium from both chambers. After washing both chambers twice with the measuring solution of choice (HBRS or PBRS) at room temperature, refresh the top chamber with 0.25 mL measuring solution.
• With the EVOM switched off, replace the media in the EndOhm bottom chamber with 2.5 mL HBRS or PBRS.
• Using a pair of blunt, curved forceps, transfer the culture insert (already containing 0.25 mL apical solution) directly to the EndOhm-24SNAP, ensuring there are no bubbles trapped underneath the insert as you do so. Place the upper electrode cap assembly over the Snapwell®, and check the top electrode makes contact with the apical solution.
• Ensure that mode is set on R and the correct range is selected (see Note 21).
• Turn on the EVOM, and push the “Measure R” button.
• Record the displayed value.
• Switch the unit off. Remove the Snapwell® and replace in its original plate well. Aspirate the measuring solution from the EndOhm lower chamber, and then replace with fresh solution. Repeat the procedure for all samples.
• After the final measurement, perform another background resistance measurement on the blank Snapwell®
• If further growth is intended for measured cultures, aspirate off measuring medium, and replace with GM before returning to incubator.
• Switch off the meter, detach the connectors, aspirate recording solution from EndOhm-24SNAP chamber, and then rinse electrode surfaces and chamber interior three times with doubledistilled water. Dry by blotting gently with a KimWipe, and then allow to air dry before storage.
• Average the background resistance measurements taken before and after epithelial monolayer measurements. Make sure to subtract the average background resistance from values recorded for epithelial monolayers. From the corrected resistance values, calculate the unit area resistance (see Note 22).
4 Notes
1. Note the lot number and activity of Collagenase A from the information supplied by the provider. Use this information to calculate the appropriate mass prior to preparing TDM.
2. Do not save TDM for later use. Discard any that remains at the end of the procedure.
Vitamins contained in this product are (in μM) 28.6 choline chloride, 8 D-calcium pantothenate, 9 folic acid, 32.8 niacinamide, 19.4 pyridoxine hydrochloride, 1.1 riboflavin, 11.9 thiamine hydrochloride, 40 i-inositol.
A powdered form of this medium is also available (Life Technologies #12100).
4. FBS growth factor composition varies by lot. Fortunately, pig thyroid cultures do not appear to be sensitive to this, and we find that multiple lots of Life Technologies #26140079 yield comparable results. FBS from other suppliers likely will yield similar results.
Another random document with no related content on Scribd:
A fenyves erdők megmozdultak.
– Na mondtam És az alispánságban megbukik! A nótárius úr jó mathematikus itt, megmondhatja, hogy lehetséges-e már ez? Úgy-e, hogy nem? Tiszta, világos ármány volt.
– Hja, a választás mindig ármánykodással jár, – jegyezte meg keserüen a jegyző. Ismertem egy valakit, a ki számvevő akart lenni valamikor. Az egész közgyűlésen valami tízen voltak jelen. Mikor az adminisztrátor a másik kandidátus nevére föltette a kérdést, a tízből négyen fölkeltek és ő kimondta a többséget. Igen, mert az a valaki, a kit én ismertem, hazafi volt, a másik meg pecsovics. Így van ez már a világon.
– Háromszáz esztendeje, – fejezte be tiszt. Molnár Ábrahám úr a kifakadásokat, melyek alatt a házigazda nagy karosszékéből gyakran pillantgatott a kandalló fölött ketyegő órára. A kisebbik mutató már kilencz felé járt. Noha Illés Dániel úrnak szünet nélkül mozgó, nagy feje időről-időre eltakarta is, világosan lehetett látni, hogy már a kilencz felé jár. Benedek úr keveset ügyelve a panaszokra, melyektől súlyos volt körülötte a terem levegője, egyszer csak mindenkit elhallgattatva mordult meg:
– Hol a pokolba késhetik ennyi ideig az a fiú?
Az avatott tapintat és reménykedő ügyesség ott is ért és siet a válaszszal, a hol tulajdonképen nem hozzá intéztetik a kérdés. A tiszttartó tiszteletteljes nyugalommal emelkedett föl ültéből, az ispán pedig ugri alázatossággal termett Benedek úr mellett és mindaketten siettek megnyugtatni, hogy az út bizony nem egy helyt igen rossz, a lovak két napi útban kifáradtak, a korcsmárosok rendetlenek az etető stácziókon és Halásziban egész nyomorúság kivárni, míg össze tudják kotyvasztani az ebédet. A közbeszurt megjegyzés az egész társalgásnak is alkalomszerűbb fordulatot adott, melybe, – talán mondani sem szükséges – Bárándy Gáspár úr ügyessége zökkentette be.
– Sohase tessék aggódni nagyságodnak. Majd megjönnek. Olyan lovakkal, meg olyan kocsissal nem eshetik baj. Tiszta világos,
hogy megjönnek. Csak az én utam lenne olyan biztos, mint Béla barátunké! Gondolom, mindegyikünk megköszönné. De meg is köszönhetné. Hisz olyan híre jár neki itt a környéken, hogy gyalog már majd beszélni sem lehet vele. Azt sem tudjuk hamarjában, minek tegyük meg. De csak szóljon, mi akar lenni? Aztán itt vagyunk mi a többire.
A társaságban többen voltak akként meggyőződve, hogy nekik most ezt a pipa dohányt, a mit füstölnek, meg azt a pohár bort, a mi rájok várakozik, minden kitelhető módon meg kell érdemelniök. És a politikus fölhívására dörgő fogadkozásban törtek ki. Csak a medve mozgatta búsan az ős-erdőket; az ármánynyal is kell ám számolnotok! Bárándy Gáspár úr nem azért tartatott éles látású politikusnak, hogy egy pillantással le ne olvassa a gondolatokat, a melyek a rengeteg szemöldök alatt forrtak, és meg ne feleljen rájok iziben;
– Itt még az ármány sem diadalmaskodhatik fölöttünk. Mert teljes tiszta lehetetlenség, hogy a lángész ki ne vívja jogát akárki ellen. Béla úr pedig lángész. Minő pálya áll ez ifjú ember előtt! Mi most azt sem tudjuk világosan, hogy igazság szerint hol kell kezdenie; hát még ha azt kérdeznék tőlünk, hogy hol fogja végezni? Nyitva áll előtte az út a legmagasabb polczig. Mert ilyen időkben, a milyenek ránk várakoznak, a lángész rettenetes tőke, a mely százas kamatokat hozhat.
– Már az igaz, – erősíté a megtermett tiszttartó és lelkesedésében nagyot rántott fekete nyakkendője csombókján. Fölséges dolog is a tudomány!
– Tiszta világos igazság, hogy nagyra született, – folytatta áradozásait Bárándy úr. Soha nem ajánlottam föl senkinek nagyobb készséggel edzett vállaimat az emelkedésre, mint Béla barátunknak fogom. Mert hiába, – ármány ide, ármány oda, – mégis csak a vármegye marad az igaz magyar politikus iskolája.
– Béla itthon marad, – dörgött bele a kombinácziókba Benedek úr Nem megy sehová. Ilyen ideig-óráig tartó, felfordult világban okos ember semmibe sem kezd.
– Bizony, ha meggondoljuk, – magyarázta Istók, – hogy a kamarilla még mindig milyen hatalmas odafönn, hogy Napoleon császár hogyan rászedte az olaszokat is, hogy mi minő hajlandók vagyunk elhamarkodni mindent: biz ezt ha jól eszünkbe vesszük, nem sok bizodalmunk lehet hozzá, hogy ez a mostani gyöngyélet itéletnapig tart.
– Kérem, Pallér úr, – vágott közbe a politikus, kinek edzett vállaira Benedek úr határozata szerint egyelőre nem lesz semmi szükség, – kérem, Pallér úr, szíveskedjék meggondolni azt is, hogy már csak Nápoly van hátra, azután teljes bizonyossággal mi következünk. Hanem hát így is jól van. Annál dicsőbb. Béla barátunk legalább egészen a mienk marad, és mézes heteit…
– Hónapjait és esztendeit, – toldotta meg a hosszan vérző lelkipásztor.
– Tehát mézes hónapjait és esztendeit nem fogják a gondok legterhesebbjei megzavarni. Tiszta világos, hogy nagyságos uram együtt határozott Ágnes kisasszonnyal. Alig várom, hogy koczinthassak az egészségükre.
Ágnes, kinek egészségére Bárándy úr minél előbb koczintani szeretett volna, és már köszörülte a torkát, odabenn a kék szobában még mindig az albumot nézegette az asszony-vendégekkel. E kis, piros bársonyba kötött könyvecske, melynek szélén és tábláján rég meghalaványodott már az aranyozás, a Kálozdy-család nő-tagjainak egész történetét kitárta mindenki előtt. Titkok, melyek régesrég napfényre kerültek, meg el is vonultak a feledés homályába; érzések, melyek mind megvítták csatáikat, élvezték győzelmüket, vagy elszenvedték bukásukat s porló szívek koporsójában csöndesen eltemetkeztek; kaczérságok, melyeknek égető szomja rég kialudt, vagy büntetése annak rendje szerint elkövetkezett; igéretek, melyek híven beváltattak, s a róluk szóló kötelezvényt elfeledték összetépni; remények, melyek e papiroknál gyorsabban mentek füstbe; itt-ott sokra biztató tehetségek, egy-egy költő, képíró vagy bölcs pólyáiban, melyekből sohasem sikerült kibontakoznia; álmok, melyekből rég felébredtek, vagy mindörökre beléjök merűltek
azok, kik egykor álmodták; világi hiúságok, szerelmeskedések, számítgatások és elragadtatások; mindezek benne voltak ama kis vörös bársony kötésű könyvben. Mennyire megsárgúlt papirosok és meghalaványodott írás! Az illatot azonban, mely a szép parmai
Izabella római királyi szalonjaiban s Windischgrätz grófné és Lichtenstein herczegné termeiben divatos volt, mintha mostanig megtartották volna. Mennyi finom élcz, minő éles vagdalkozás, mennyi elménczség és nagyszavu bók e franczia sorokban, melyeket mind elhomályosított ama durva, katonás és egyenes vallomás, mely fölött az akkor még ifjú és daliás Péter úr hosszú órákon keresztül törte fejét. És az együgyü sorok a kis grófnénál megtették hatásukat. A hozzá intézett lapok ritkulnak. Csak egy franczia abbé, ki tanítója és gyóntatója volt, intéz még hozzá érzékeny sorokat, mielőtt neki indulna a magyarországi ismeretlen világnak. Az, ki a következő lapokon merengett szép szemeivel, már emlékben is alig él. Péter úrnak egy korán sírba szállott leánygyermeke volt. Pedig azon a kis képen, mely most akadt Ágnes kezébe, milyen életteljes kék szemek mosolyognak, minő gazdag fürtök csavarodnak föl görög kontyba, milyen finom két orcza pirúl! Ügyesen forgathatta az ecsetet, a ki festette és aláírta, hogy; «Aurora tükre.» Már az sokkal nehezebb kéz volt, a melyik azt a sírkő-forma oltárt rajzolta, melyen az emlékezet örök tüze lobog. Vajjon nem aludt-e ki ez az örök láng, a mint a szép Auróra behúnyta szemeit?! Maga is írt egy lapot; ki tudja, kinek szánta és ki tudja, miért nem adta át? Talán igen őszinte és igen meleg volt, s édes anyja, a grófné, nem találta elég illemesnek. Elég az hozzá, hogy a lap egy kegyetlen tollal keresztülhúzva itt maradt a családi gyűjteményben; és az a bizonyos sohasem tudta meg, milyen szívvel gondolnak rá a kálozdi kastélyban, ha csak kedvese valamelyik enyhe éjjelen föl nem kelt sírjából és el nem mondta neki, a mi szívét nyomta. Ádám úr fösvény felesége, Mátéfi kisasszony is volt fiatal valaha, és neki is irtak emléklapokat. Íme a régi, szellemes ötletek: az egyiken girbe-gurba írás magyarázza, hogy milyen az élet; valamelyik udvarlója a hitet, reményt és szeretetet óhajtotta nyújtani neki ismert jelképeikben; volt olyan is, ki egy csinos versszakkal adta bizonyságát, hogy ismeri Himfy Szerelmei-t. A mint Biró Eufrozina kisasszony hamiskás szeme a névre esett, a mely az
olvadozó sorok és lágy rímek alatt állt, megdöbbenve kapta föl a fejét és egy önkénytelen, gyönge szemrehányás tört ki kebléből:
– Ah, a hűtelen!
Mind oda tekintettek. A kiáradt szív bizonynyal szerette volna, ha el nem árúlja titkát; de már későn volt. Uram fia, a hűtelen nem más vala, mint a medve, ki a másik szobában néma borongással rázogatja ős-erdeit. Kerekesné néni, (kinek vérében volt, hogy mindenkinek minden kinálkozó alkalommal mondjon valami boszantót,) a mint megértette, hogy kiről van szó, egyet igazítva szemüvegén, éles és gúnyos sóhajtással jegyezte meg:
– Haj, haj, írt az annak idejében nekem is eleget! Nagy kujon volt.
A kétszeresen csalódott Eufrozina kisasszony bús megadással forgatta tovább az albumot. Móricz bátyánknak egy kortársa elég elmés volt egy legyet és egy nefelejtset rajzolni le, a kettő közé írván ezt a szót, hogy: «boldog;» jöttek még egypáran azok közül, kik ma már mind nagyapák vagy vén medvék, és senki sem hinné róluk, hogy valaha még Kisfaludy Sándort is forgatták. Ím itt egy lap, teleírva mind a két oldalán szép, öreg betükkel; a tudós hírben állt Mátéfi uram czitált a leánya fejére mindenféle deák klasszikust. Mondják, hogy értette is, a kihez intézve voltak. Azután egy nagy összehajtogatott papiros következik, melyen valami Kálozdy Mihály úr, neve aláírásával, tökéletlen és összevissza düledező betükben bizonyította, hogy: a ház magas, a város szép, a tehén legel és a paripa fut. Ez volt az utolsó írása a szegénykének, Benedek úr legifjabb kis öccsének. Hosszú időköz marad az utolsó lapig üresen. A Kálozdy-családnak nem volt több nő-tagja. A legutolsó megint egy kis arczkép. Ágnes lenne gyermekkorában, hanem azóta ugyancsak sokat változott. Kék szemei a tiszta fény helyett bizonyos csillogó fátylat kaptak, melynek mintha mindig volna valami rejtegetni valója; arczkifejezése pedig bár kevésbbé szeretetteljes, sokkal hódítóbb; a dacznak amaz árnyalata, mely már akkor mintha felette lebegett volna, mélyebb szenvedélyek képében látszik lelkére borulni; és a kedves kis fehér bodros ingecskét ma drága csipkék helyettesítik
hószin vállain. A kis képet Béla festette. Sorra nézték és mindenki talált rajta valami dícsérni valót. Ki az arczképen, ki eredetijén.
– Milyen fáin egy munka, – jegyezte meg a tiszteletes asszony. Az én gyerekeim is tanultak pingálni a rektor úrtól. De Áron nem tud mást, csak tulipánt; Ézsau meg emeletes házat. Hanem már ez dicső, fáin egy munka. Mintha csak igazi piktor festette volna.
Eufrozina kisasszony esze az ingó-bingó szürke loknik alatt hamisabb dolgokon járt. El is mondta a mit gondolt.
– Béla, Béla hiába! Neki csak nincs mása messze földön. Úgy-e bizony Ágneska, ez a képecske volt a legelső vallomása?
Ágnes nem pirult el az évődésre. Egyet mosolygott a nagy karszékben, melyben csöndesen hintázott, s nagy hirtelen igy szólt:
– És az utolsó is.
Kerekesné néni megbosszankodva igazgatta pápaszemét. Ezt neki kellett volna mondania. Hanem tartogatott ő még erre az alkalomra valami egyebet.
– Ej, ej, hát olyan kevés szavu az úrfi, – mondá. Pedig bizony, ha Ágneska előtt meg nem nyílik a szája, akkor némának kell lenni neki. Hanem hát igaz, hallottam én úgy fülhegygyel Dunaszögről valamit. Hogy Béla úrfi a gazdája leányának nagyon tette volna a szépet. Mind ilyenek a férfiak, egytől-egyig ilyenek. A Móricz is csak ilyen volt, Fruzsinka hugom, annak idejében. Sohase búsuljon utána. A’ bizony. Hogy hát ott nem jóban törné a fejét az én szerelmes öcsém! A tiszteletes aszszony különben többet tudhat róla, mert az Ézsau már ott jár iskolába.
Ahhoz a zavarhoz, a mibe ez a kérdezősködés a szerény és alázatos papnét hozta, semmit sem lehet hasonlítani.
– Ézsau, esedezem, még igen kis gyerek az effélékhez, –dadogta. Ő csak emeletes házakat rajzol és mással nem igen törődik. Különben a világ igen rossz ám, esedezem, és sok mindent kitalál, a mi nem is úgy van.
Mire elvégezte mentegetődzését, Ágnes már elmenekült a világosság elől. Egy kis sarok-divánra ült a szemérmes papkisasszony mellé, kinek az ó-testamentomban elfogult, puritán apja Rákhel nevet adott.
– Édes Rákhel, – beszélt hozzá könnyed szivességgel a szép leány, oly régen voltam már Kálozdon, hogy azt sem tudom, mikor láttam útoljára. Gondolom, kora tavaszszal. Most is olyan szép-e a kertje, mint rendesen? szépek-e a lángtulipánok, melyek hagymáját tavaly hozta tőlünk a káplán úr?
Rákhel nem igen ügyelt e tudakozódásra. Hallott-e az asszonyok beszédéből valamit, vagy a drága melltű és suttogó csipkék hatották meg, vagy csak lelkében merültek föl csábító képek, elég az hozzá, hogy reczés keztyűbe bujtatott kezét, felelet helyett, csöndesen rátette Ágnesnek ölében pihenő rózsás ujjaira, és egy nagyot sóhajtott:
– Óh Ágnes kisasszony, milyen boldog kegyed!
Kerekesné néni épen akkor tüzeskedett legjavában:
– Na már, édes öcséim, akármit beszéltek, én, a mit mondtam, olyan bizonyos helyről hallottam, mintha csak pecsétes írásból olvastam volna.
Történt-e még több ellenvetés is, vagy megnyugodtak mindnyájan a néni pecsétes írásában, Ágnes már nem tudhatta meg, mert halk lépésekkel, észrevétlen odahagyta a szobát.
Végigment a hosszú folyosón, le a földszintre, kinyitotta a nagy utczaajtót s egy kis időre megállt a kőlépcsőkön előtte. A legszebb nyári esték egyike volt. Lágy suttogással bolyongott a szellő, az erdők és mezők friss illatával szárnyain. A hold a tölgyek őrző hadseregét köröskörül ezüst pánczélba öltöztette. Keleten egy halavány csillag ragyogott. Felülről a nagy teremből lehangzott a zaj, lárma, heveskedés, melyet Benedek úr egy-egy türelmetlen szava el-elcsöndesített. Mindig Béla aggasztotta; hol késhetik ennyi ideig? Legkésőbben hét órakor itthonn kellett volna lenniök. A konyhában sustorgott a zsír, és hangosan panaszkodott Kata asszony, hogy
minden oda lesz, ha még soká nem jönnek. Palkó hordta föl a pinczéből a borokat és egy-egy jobb fajta palaczkról édes vigyorgás közt tisztította útközben a pókhálót. A féleszű Péter a ház végében mozsarát igazgatta, melynek az örvendetes perczben meg kell dördűlnie. A kis Pirók gyerek a torony-ablakon kandikált ki, hogy idején megránthassa a harang-kötelet, a mint a hegyháton megpillantja az öreg János kocsijának két ismerős lámpását.
– Édes Rákhel, – beszélt hozzá könnyed szivességgel a szép leány.
Mindez Ágnes mögött volt; előtte messzire kéjes, titokteljes, igézetes csönd. Egy-két perczig állt csak a lépcsőn, azután
megindúlt a kert hosszában, ki az országút felé. Eleinte csöndes léptekkel, maga körül tekintgetve haladt. Minél jobban távolodott a kastélytól, annál inkább vesztette nyugalmát. Hosszan tartotta lecsüggesztve fejét; majd föl-fölkapta és élesen kémlelte az országút végetlen fehér szalagját, melylyel az ég fölékesítette a hegyet. Aranyos haját végig simította és el-elbámult hol az útra, hol a kastély kivilágított ablakainak egyre távolodó csillagaira. Merengéséből közeledő lódobogás riasztotta föl. Megfordult és vissza akart sietni, de már késő volt. A lovag megpillantotta és ámulva kiáltotta el magát mögötte:
– Higyjek-e szemeimnek? Kegyed az, Ágnes kisasszony? Hát a kálozdi éjtszakáknak is vannak villijei? Vagy hogy is hítták csak az éjjeli tündéreket?! Ah Istenem, én még mindig csak olyan ostoba vagyok ám. Jó estét, jó estét.
– Jó estét, báró. Nemde ilyen szép estét lehetetlen falak közt tölteni?
A lovag a lány mellett megállította paripáját. Nem volt már fiatal ember. Az arcza sok ránczot vetett, hanem lovagcsizmái káprázatosan csillogtak a holdfénynél és darútolla vígan lengett.
– Lehetetlen, teljes lehetetlen, – válaszolt gyors, hadaró beszéddel a leánynak. Engem is kicsalt és Bucephalus szívességéből már a gadóczi tó mellől jövök. Pompás telivér. Egyenes vonalban származik Dárius király híres csataménjétől. Vagy melyiké is volt a sok közül az a régi híres Bucephalus? Ah, én igazán… Hanem most nincs kegyelem kisasszony. Én Bucephalus szívességéből elfogtam kegyedet, és tüstént vallania kell. Nos hát, miről gondolkodott magányos bolyongásában ezen az ábrándos estén?
– Ha már csakugyan nincs mentség, báró úr, hát megvallom, arról gondolkodtam, hogy milyen szép lenne, ha véletlenül valami tündér-lovagot hozna elém a véletlen az elátkozott királyfiak családjából.
– Ah, ah, kisasszony Szót sem érdemel. Hisz én valósággal… Tudom jól, hogy csak a bókot akarta visszaadni. Merre kísérjem?
– Csak tartson arra báró úr, a merre útja vezet, – mondá a lány. Én haza indulok és szívesen megyek egyedűl.
– S tovább fog ábrándozni a tündér-lovagról, nemde? Igaza van, Ágnes kisasszony, tökéletes igaza. Én igen ostoba vagyok kegyedhez képest. Hanem azért csak nyujtsa ide a kezét és tegyen boldoggá.
A szép leány megtette a báró úr kedvét és a nagy lovag-keztyűk közül alig birta kiszabadítani kis kezeit. A lovag, – Bucephalus szívességéből – sebes vágtatást iramodott tova. Ágnes egyetlen pillantást sem vetett utána.
– Minő nyomorultak ezek mindnyájan Bélához képest! – suttogta és izgatottan rázva meg szőke fürteit, tovább kémlelte az útat hosszan, mereven, mosolytalanúl és hangosan dobogó szívvel.
Semmi hang, semmi jel semerre. Már Ivánfi báró Dárius fajzata is messze járt. Mintha a várakozó leány egyszerre megijedt volna a nagy nesztelenségben, hirtelen vissza indult a kastély felé. Csodálatos volt a bűvös éjtszakának e tündéri tüneménye, rejtelmes lelkével, melynek forrongó titkait még a holdsugaraknak sem árulta el. Arcza még mindig meg tudta őrízni, hogy érthető szavakat ne írhasson rá ama láthatatlan belső kéz, mely hol tolmácsunk, hol árulónk. Csak a fürge szellő, mely keble körül a lengő csipkékkel játszott, – csak az tudhatott meg valamit. De ezt senkinek másnak nem árulta el, mint az erdők bús dalnokának, kinek kicsiny szívét minden hang után féltjük a megszakadástól.
Ágnes már fele útján lehetett a kastélynak, mikor a harang megkondult és Péter elsütötte mozsarát. Összerezzent. Visszatekintett s a mint sebes közeledve megpillantotta ő is az országúton a két homályos csillagot, s meghallotta az öreg János ostorának vidám pattogását, futásnak eredt. Már hallotta a kocsi robogását s a lovak zaját is. A kastély ablakai megnyiltak; mindegyikben a kikoplaltatott vendégek örvendve váró arcza. Mikor
a főbejáráshoz ért, már ott találta Benedek urat, ki Istókra támaszkodva, lesietett kedvencze elé.
Még egy-két ostorpattogás és János olyan pompásan odajárt a várakozók elé, hogy különben sem kellett. Az ajtó azonban soká nem nyilt meg, mintha üresen jött volna. Odafönn az ablakban Bárándy úr gyakorlott torka egy harsány éljent kisérlett meg, mely általános viszhangra talált. A zajra lassan megmozdult a kocsi ajtaja és kilépett a várvavárt.
– Béla, – kiáltott a lépcsőről eléje az öreg úr, – hol a pokolban kóvályogtatok ennyi ideig? No csak gyere most ide, ölelj meg és máskor korábban kelj.
– Bátyám, – szólalt meg tompa, fojtott hangon az érkezett –bátyám, jó estét. Jót neked és mindnyájatoknak.
– Adjon isten, öcsém, adjon, fiam!
A köszvény és vénség sok durva szivet lágyított már meg. Benedek úr is olyan meleg és szív szerint való öleléssel karolta magához öcscsét, a milyet még Istók sem látott tőle soha, és még ő is képtelen lenne megmagyarázni. A vénség, a köszvény!
– Nézd, fiam, nézd, itt van Ágnes is. Mind vártunk rád és aggódtunk már érted.
– Köszönöm, Ágnes, köszönöm. Ti igen jók vagytok hozzám, –mondá Béla és kezet nyujtott a leánynak. Ez a kéz azonban hideg volt, mint a jég, s a mint ama másiknak, ki jegygyűrűjét viselte, meleg érintését érzé, fagyos borzongás futott át az ifju egész testén, és abban a perczben némán, szótlanul, jaj nélkül leroskadt a lépcső hideg kövére.
– Mi az, mi bajod? – kiabált a bátya. – Az ördögbe is, elestél? Mért nem ügyelsz a lábad alá? Hé, kelj föl! Mi ez? Világot, világot gyorsan!
Kata asszony rögtön künn termett a gyertyával. Iszonyat volt a leomlott ifju arczára tekinteni.
VII. FEJEZET.
Temetés; – vajjon feltámadás is?
Béla már régi szobájában pihent egy ódon karosszékben. Csupa mosoly, gyöngédség és barátság volt minden körülötte. Az asztalon egy sokágú tartóból derült világosság áramlott minden sarokba. Az ágyon nagy virágos terítő; a falon fölötte szépen rendbe aggatott vivó készülékek, kardok, keztyük, álarczok és két pisztoly; távolabb nehány csinos tájkép: mind verőfényes részlet legelésző nyájakkal és ebédvivő parasztasszonyokkal! A kis könyvtárból díszes, aranyos ruhába öltöztetett remekírók csillognak elő; az asztalon szép virágbokréta, csupa mezei virágból, melyet a messzi réteken a kis Pirók-gyerek szedegetett és kötözött össze. És e vidám környezetben fekszik ő félig élve, félig holtan. Inkább oltanák ki a gyertyákat, semhogy a fiatal, szép, beszédes szemek helyett ama beesett kék foltokra ontsák világukat. Feje mozdulatlanul nyugodott a szék támláján, arcza rémes sárgára vált, fényes fekete haja kuszán csüngött homlokára, lélekzetvétele meg-megakadt és alig volt észrevehető.
Mellette ült Benedek úr és érthetetlen szavakat mormogott. A kegyes Eulália kisasszony egy illatos üvegcsével óhajtott segíteni. Heroikusabb szert tartogatott hátul egy dézsában Palkó, kinek arczán mintha megfagyott volna az örök nevetés, Kurz doktor úr nagyon sürgölődött és beszélt mindent össze-vissza, melynek vége csak az volt, hogy a városi doktorok nagy hire nem ritkán tökéletesen alaptalan, és ha Béla úr korábban kerül az ő kezére, bizonyosan nem jut ennyire a dolog. Az ájulás soká tartott; a beteg csak nem akart ébredni. Benedek úr már kezdte veszteni fogyatékos türelmét és mérgelődve szidta az orvost.
– A pokolba is, tán csak nem halt még meg? Hozza hát már valahára életre. A fecsegésétől ugyan itéletnapig sem jön magához.
Palkó, hol az a dézsa?
Demokritos orvosi közbelépésére nem volt szükség. Kurz úr addig forgolódott Béla körül, míg végre is meglett az az elégtétele, hogy felnyitotta szemeit.
– Na tessék! – mondá diadallal a doktor.
– Ránk ijesztettél, ficzkó, – édeskedett az ébredőnek az öreg, új lélekzethez jutott, táguló mellel. Ránk ijesztettél. Mi az ördög lelt ilyen hirtelenséggel?
– Kedves bátyám, – szólalt meg halk, szenvedő hangon az ifju, –csak a hosszú kocsiút volt oka az egésznek; egy kissé megszédültem. De már vége, teljesen vége mindennek. Köszönöm mindnyájatoknak. Bocsássatok meg.
– Hála az égnek, – suttogta Eulália kisasszony és sietett eltávolítani a heroikus szerekkel együtt Palkót.
Béla bocsánatot kért még egyszer és sokszor hogy nem mehet ki az üdvözlésére összesereglett társaságba; de egy kissé gyöngének érzi még magát. Csak mulassanak nélküle kedvökre; ő majd oda fog gondolni. Ha kegyesek lennének most magára hagyni, legjobban kipihenné magát és reggelig egészen jól lesz. Nem, nem fekszik le az ágyba; az ülés sokkal jobban esik neki. Köszönt, szivéből köszönt mindenkit. Euláliát még visszaintette az ajtóból:
– Köszöntöm Móricz bátyót, köszöntöm Sádi Danit, köszöntöm a tiszteletest, köszöntöm Ürmöst, – az nincs itt? Kár. Köszöntöm Ágnest is; mondja meg neki.
Egyedül maradt. Megtették kedvét, csak a szomszéd szobában telepítették le a kis Pirókot, hogy legyen valaki mégis közelében. Az ajtó becsukódott. Nemsokára a másik is, azután a harmadik. Egy ideig még élénk hangok hallatszottak ide a képes teremből. Bárándy Gáspár úr minduntalan fölemelte stentori szavát, és kétségkívül a legjobbakat kivánta, mert harsány és szünni nem akaró éljeneket keltett. Majd hangok zürzavara, pohárkoczintások, a pokolba kergetett ijedtség vidám hahotái hatottak ide. A falu két rongyos
czigánygyereke is szerencsét próbált és czinczogni kezdett a folyosón; de Palkónak – jóllehet kedve ellenére – csakhamar ki kellett tenni a szűrüket.
Béla a vén szék karjára könyökölve, órákat töltött mozdulatlanul.
Nagy csöndesen, félénk ajtónyitással betekintgettek hozzá egyszer Benedek úr, egyszer Eulália néni és többször is Istók. Azt hitték mind, hogy aluszik nyugton, csöndesen. Pedig nem aludt. Arcza el volt rejtve. Félt, hogy az éj áruló szellemei megismerik rajta a Kainbélyeget. Az utat Dunaszögtől Kálozdig tompa érzéketlenségben töltötte; a fák, emberek, szekerek, falvak, rétek és erdők váltakozó képei zavart bódulatba ejtették lelkét, és néhány rövid órára megőrizték szivét amaz éles gyiloktól, melynek meg kellett benne forgattatnia. De végre otthon és egyedül volt. Itt minden ismerős vala ránézve, csak ő egyedül idegen maga előtt. A kábultság sűrű fátyola lehullott elméjéről és látta – magát. Nincs szörnyűbb, mint a lélekmardosás, vagy boldogtalanság egy gyötrő pillanatában nem ismerni magunkra, és tudni, hogy mi vagyunk az, a kit nem ismerünk. Ha nem lenne a hasonlat nagyon kicsinyes, szeretnék a himlőből fölkelt szépség példájával élni a tükör előtt. Mit zuzzon össze, magát-e, vagy a tükröt? És ha összezuzza, visszatér-e ezzel az, a mi eltünt?!
Gyász és lélekfurdalás maróbb és győzelmesebb szövetségre nem léptek soha, mint e szerencsétlen, gyönge lélek ellen. Két gondolat járta át belsejének minden zugát és zavaros sietséggel keresett fátyolt magának, melybe eltakartassék. Nem talált. Ziháló melle tanuskodott róla, milyen kétségbeesett volt ez a hajsza odabenn. Végre mozogni kezdtek kiszáradt, kicserepesedett ajkai és elsuttogták a borzasztó szót: Gyilkos vagy! Többé nincs fátyol, nincs menedék, nincs bocsánat; az itélet már ki van mondva fölötte. Ha a mennyei biró nem látna is be a vesékbe, nem tagadhatja többé: hallhatólag tett tanúságot maga ellen. De az elitéltetés bizonyossága még nem adta meg neki azt a pillanatnyi pihenést sem, mely minden bűnösnek megadatik. Még egy gondolat szorongatta szívét, és keresett utat ajakára: Te szeretted őt, mint senkit a világon, és ő szeretett téged, mint senki a világon! Már mind a kettőt maga előtt látta. A furiát, szikrázó szemeinek hegyes nyilaival, melyek zápor
gyanánt hullottak feléje, és kígyó-fürteivel, melyek kegyetlenül, vérére szomjazva marták. Mellette amaz édes alakot, melynek még most is volt mosolya számára, de kínosabb ama nyilaknál és kígyóknál. Mind a ketten megfogták kezét és egy irányban vezették.
Mind a ketten ugyanazt sugták fülébe: Mit keressz te itt?
Valóban, mit keres itt? Micsoda természetes következése a gyilkosságnak, mi a halálnak? A temetés. Temessünk hát. Elméje fényes láng volt, hivatva rá, hogy másoknak az igazság, magának a dicsőség útját mutassa. Megbénult akarata kioltottat. Fekete rögöt rá! Tehetségei az életre szépek és boldogítók; költeményei sok sziven könnyítettek volna; képei a századoknak rideg folyását egykét édes perczczel enyhíthették volna. Gyávasága legázolta őket. Hideg földet rájok! Szive jó, tele nemes föltétellel és eszményi hevülettel. A lélekerő fogyatékának egy kis nyilásán kicsorgott vére. Zöld hantot rá! Mind, mind semmivé téve, elpusztulva, legyilkolva hevernek. Temessük el, temessük el.
Béla megmozdult. Összeszedte végső erejét és fásult nyugalommal lépett íróasztalához. Leült és levelet írt. Istókhoz czímezte, kinek bölcseségében és gyöngédségében legtöbbet bízott. Egy tekintetet vetett kis ezüst órájára, mely szegény atyjáé volt egykor s melynek tartóját anyja hímezte ki gyöngygyel. Megakadt szeme egy kis könyvjelzőn is, melyről sohasem vallotta be itthon, hogy kitől kapta. A remény szinével volt rajta kivarrva, hogy: «Eddig.» Eddig és ne tovább! Óh, de hol van az az eddig és mi lesz az a tovább?! A gyertyák a nagy ágasbogas tartóban utolsókat lobogtak már és füstölve kezdett égni a papiros, melylyel meg voltak erősítve. A mezei virágokból kötött bokréta ott hervadt mellette. Béla kinyitotta az ablakot. Keleten már egy szürke csík mutatta, hogy a hajnal közeledik. Hüvös, éjjeli lég áradt be és a sötét vörös lángok kisérteties tánczot kezdtek. Minden csöndes volt köröskörül.
Béla még kitekintett a szomszéd szobába. A kis Pirók mély és nyugalmas álomba volt merülve. Semmi veszély nem fenyegeti. Ágya fölül levette az egyik pisztolyt és íróasztala elé lépve, ráfektette ujját a ravaszra. Keze semmit sem reszketett. És egy reszkető kéz
mégis erősebb volt, mint az övé. Oly gyorsan szorította meg, hogy egy pillanat alatt tehetetlenné lett.
Magából kikelt arczát elrémülten vetette vissza az ifju. Ágnes állt előtte tegnapesti öltözékében, oly lázasan égő szemekkel (mint kék égen a piros alkony) és kihevült tekintettel, a milyennel senki sem látta őt az életben soha, sem azelőtt, sem azután.
– Szerencsétlen, – kiáltá, – mit akartál?
Bélának elakadt a szava. A meglepetés lefegyverezte. Nyitott ajakkal, meredt szemekkel bámult a leányra, és keze, melyben a pisztolyt tartotta, erőtlenül hullott alá.
– Azt hitted, – beszélt lihegve Ágnes, – hogy mindenkit megcsalsz? Nekem jobb szemem van mindenkinél. Az este csak én láttam kétségbeesésedet; csak én éreztem, hogy a veriték, melyet homlokodról letörültem, halálos volt. Kiszöktem szobámból és itt töltöttem ajtód előtt az éjtszakát, hogyha mozdulni hallak, melletted teremjek. És nem hiába jöttem, boldogtalan.
– Bocsáss Ágnes, te nem oldozhatod fel az én itéletemet. Bocsáss, bocsáss! – rimánkodott Béla és ki akarta jobb kezét szabadítani a leányéból.
– Nem oldozhatom fel? – válaszolt ez és minden erejét megfeszítette, hogy amaz elátkozott kéz ki ne tudjon menekülni bilincseiből. Nem oldozhatom fel? Az lehet; de kegyelemért könyöröghetek előtted. Ime könyörgök azért az életért, mely a világon a legdrágább előttem.
És térdre omlott Béla előtt.
– Ime térden állva esedezem és könyörgök érte, – folytatá. –Tudom, hogy ha szavamnak ereje lenne szived előtt, nem akartad volna megölni magadat. Tudom, hogy én vagyok oka lelked gyászának, és nem engedem, hogy gyilkosságba keverj. Én lemondok rólad, Béla. Lemondok öreg apámért, kit másodiknak találna golyód sziven. Magamra veszem haragját és téged
meghagylak szivében. Lemondok rólad és visszaadom szabadságodat. Hagyj el engem és légy boldog azzal, a kit szeretsz.
Térdre omlott Béla előtt.
– Azt már megöltem! – hörögte a szerencsétlen. Nézd minő véresek a kezeim!
– Boldogtalan! – sikoltott a lány.
Béla ismét összeszedte erejét és küzdeni kezdett a leánynyal. Felkaczagott, megvérezte kezét, keblén letépte ruháját, elrekedt, de nem tudott semmire menni. Ágnes ujra lelket kapott s egy pillanat alatt világossá lett minden lelke előtt.
– Béla, – mondá, és mintha hangjának rég zenéje csendült volna meg szavában, – hát annyira gonosz lennél, hogy megvetnéd a kiengesztelést? Óh mi lenne a világból, ha minden bűnös és szerencsétlen úgy tenne, mint te akartál? Ki lenne igaz gyámola a nyomorultaknak, és ki bocsátana meg szivéből a vétkeseknek? És az égi bocsánat az eltévedtek és megtérteknek minő nevetséges semmivé lenne!
Béla kifáradtan hanyatlott egy székre. A föltetszett hajnal első sugarait küldte a szobába. A kanászgyerek tülke megszólalt az udvaron. A szerencsétlen kezéből kiesett a pisztoly és egy nagy könycsepp jelent meg szemében.
VIII. FEJEZET.
Tanácstartások.
A kálozdi kolostornak volt az emeleten egy kis sarok szobája, melyet a cselédek – egyéni felfogásuk szerint, – hol «kanczaláriának», hol «kanczelóriának» híttak. Honnan vette a nevét? A rengeteg fakalamárisban, mely kisebbféle sajtárnak is beillett – a hányszor csak, nagy ritkán szükség volt rá – mindig úgy kellett egy kis friss vizzel új életre hozni a kiszáradt, megpenészesedett tartalmat. A fehér papir ritkább vala itt a fehér hollónál, s a nélkülözhetetlen jegyzésekre a zsinegen függő kalendárium tiszta lapjai használtattak. Az összevisszafecskendezett lúdtollak két hegye rendesen úgy irtózott egymástól, mint a V szárai. De volt ott egy hatalmas butor, lebocsátható ajtókkal, kihuzható táblákkal és furfangos zárakkal, melyet mesterének ügyes keze különféle színű berakott fából csinos koszorúkkal és virágbokrétákkal ékesített. Ezt az ódon butort is szerteszét hasogatta már mai napság az idő kiméletlen keze; az egyik részéből lett kincses szekrény, a másodikból ékszertartó, a harmadikból iratpolcz, a negyedikből könyvtár, az ötödikből íróasztal. Még tükör is került belőle. Az ezer fiók felmondta egymásnak a barátságot; a szép egyetértésnek, melyben hajdan éltek, vége lett. Az egyikben pompás diópálinkát, a másikban borókavizet, a harmadikban meggyszeszt, a negyedikben szilvóriumot tartogatott Benedek úr. Itt üldögéltek ők gyakran naphosszat Istókkal és magyarázták egymásnak – hol az egyik, hol a másik fiók tartalmának nyomán – a világ folyását. Az írószekrény tetején egy régi-régi óra ketyegett, melynek poros, szürke lapját vedlett aranysárkányok tartották és megfakult aranyliliomok vették körül. E vén jószág az öreg nénék csöndesítő, békítő szerepet játszotta a szobában; a sokszor fölhangzó pörlekedésbe sohasem mulasztotta el rekedt, száraz szavával beleszólni: csitt, csitt, csitt, csitt. Minek veszekedtek;
ki tudja, meddig éltek?! Csitt, csitt, csitt! A kis szoba fekete bőrrel volt bebutorozva s egy szinehagyott zöld függönyön keresztűl sütött belé a nap. A falakon régi, beporosodott, megfakult arczképek kopott aranyos rámákban: ama híres, vak athlétának oroszlánfeje; a legnagyobb magyar vastag szemöldei és átható tekintete; aztán az a csodálatos szépségű arcz, melynek minden izma szolgálni tudott a nagy, izgató lélek akaratának, melyet csodálatosan beszédes szemei tükröztek. E szobában tartattak a családi tanácskozások; itt szőtte, fonta, vetette Istók hálóját kedvencze érdekében, kit már úgy tekintett, mintha a maga gyermeke lett volna; itt mondotta ki az itéleteket Benedek úr, és indokolta Istók az önérzetes tiszttartó, a himlőhelyes ispán, a vigyori Palkó, és a féleszű Péter fölött. Itt táplálták egymás reménységeit Béla nagy jövendője, fényes pályája iránt, mely a mostanság elhagyatott kastélyra az egész Kálozdybirtokon meg nem vásárolható dicsőséget hozand. Itt lepte meg apját Ágnes gyakorta, ha Bogádról átrándult, szépséget, mosolyt és fényt hozva magával ez ódon, rideg és sötét épületbe. Ez a szoba hallá zsörtölődéseit, kifakadásait, haragját egy vén szívnek, melyet a világ hűtlen örömei magára hagytak, mely igazságtalan s elégtételt vesz mindenkin, a kit sorsa körébe hozott; látta lopva élvezett apai örömeit és borongását, hogy sohasem hallhatja az «apa» szót; ismerte biztos számítását arra a boldogságra, melyhez annak boldogítása által fog jutni, ki az övé és még sem az; a régi életével immár leszámolt nemes reménykedését, hogy a kit utódjának választott, az nála különben, derekasabban és fényesebben fogja megfutni pályáját… Ilyenkor a harcz tüzében összetört oldalbordája bele-belesajdult az okoskodásba: hogy gondoljon rá is, hát ő mit vétett? – de az öreg elmordult magában, hogy az ördögbe is, az csak kötelesség volt, a mit akkoriban ezren és ezren megtettek s mindenki egyformán megtehetett, a kinek volt oldalbordája.
Itt folyt a Bélával teendőkre nézve is az a négyes tanácskozás, melyben Benedek úron kívül Kurz doktor, Istók és Ágnes vettek részt, az utóbbi a nagy karosszék hátára támaszkodva, melyben bátyjának hitt atyja elnökölt. Ama félelmes éj izgatottsága rég eltünt arczáról, lángja szemeiből, hogy soha, de soha vissza ne térjen többé. Halavány volt és tekintetén hiányzott az a
