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Teratogenicity Testing Methods and Protocols Methods in Molecular Biology 2753 Luís Félix
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Cancer Cytogenetics Methods and Protocols Methods in Molecular Biology 1541 Desconocido
University of Hertfordshire Hatfield, Hertfordshire, UK
For further volumes: http://www.springer.com/series/7651
For over 35 years, biological scientists have come to rely on the research protocols and methodologies in the critically acclaimed Methods in Molecular Biology series. The series was the first to introduce the step-by-step protocols approach that has become the standard in all biomedical protocol publishing. Each protocol is provided in readily-reproducible step-bystep fashion, opening with an introductory overview, a list of the materials and reagents needed to complete the experiment, and followed by a detailed procedure that is supported with a helpful notes section offering tips and tricks of the trade as well as troubleshooting advice. These hallmark features were introduced by series editor Dr. John Walker and constitute the key ingredient in each and every volume of the Methods in Molecular Biology series. Tested and trusted, comprehensive and reliable, all protocols from the series are indexed in PubMed.
TeratogenicityTesting
Methods and Protocols
Edited by Luís Félix
Centre for the Research and Technology of Agro-Environmental and Biological Sciences (CITAB), Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal
Editor
Luı´sFe ´ lix
Centre for the Research and Technology of Agro-Environmental and Biological Sciences (CITAB)
Universidade de Tra ´ s-os-Montes e Alto Douro (UTAD)
Vila Real, Portugal
ISSN 1064-3745ISSN 1940-6029 (electronic)
Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-0716-3624-4ISBN 978-1-0716-3625-1 (eBook) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3625-1
This work is subject to copyright. All rights are solely and exclusively licensed by the Publisher, whether the whole or part of the material is concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation, computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed.
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The registered company address is: 1 New York Plaza, New York, NY 10004, U.S.A.
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Preface
Teratology explores the causes, mechanisms, and patterns of exposure to naturally occurring and synthetic chemical agents and physical agents that lead to abnormal development and birth defects. The vulnerability of the developing embryo or fetus to temporary and permanent harm has long been a subject of inherent interest. However, teratology only developed as a discipline in the 1930s, when the first report of developmental defects in a mammalian species was published. Nowadays, the Food and Drug Administration estimates that each year around 120,000 babies (approximately 3–5% of live births) present some kind of birth defect. Current evidence suggests that, during pregnancy, around 70% of women take at least one prescription drug particularly during the period of organogenesis in the first trimester, which can be harmful to the unborn fetus. Some pregnant women require ongoing medical treatments, and avoidance of pharmacological treatment is sometimes not possible. A significant number of experimental reports have helped to expand the current knowledge of pharmacological and pharmacokinetic mechanisms from early exposure to drugs. These have been accompanied by an evolving knowledge of different physiologic systems driven by advances in technology and scientific instrumentation. However, despite these modern approaches, in over 65% of cases, there are still difficulties in identifying the actual cause of the congenital defect.
The second edition of this book provides a compilation of different laboratory techniques and tests to assess the risks to embryo-fetal development from drug exposure during early developmental stages. The goal is to provide a single source for core techniques of teratology screening that is a straightforward and accessible guide for researchers in all stages of the research cycle. The methods present the theoretical framework along with an analytical approach, as well as different troubleshooting approaches.
The book begins with an introduction to the basic principles of teratogenicity testing including concepts and terminology that will provide the basis for the subsequent chapters. In addition, new notions on the use of bioinformatics are included. The following chapters of the book present both in vitro and in vivo methods, complementary techniques in the study of the teratogenic and fetotoxic effects of drugs. The current development and application of in vitro models for teratogenic screening to predict toxicity in embryonic animals and humans comprise the use of in vitro screening methods, described in the first methodological chapters. In vivo animal tests have long been used as effective methods to prevent and study harmful effects of compounds, since research in humans and/or in primates is limited due to ethical reasons. Some types of animal models have been used in teratogenic studies, in particular the use of alternative animal models such as the nematode Caenorhabditis elegans, the fruit fly Drosophila melanogaster, the frog model Xenopus laevis, and the tropical fish Danio rerio, among others. In this book, a variety of well-established in vivo tests are described and offer solutions for evaluating the efficacy and the teratogenicity of compounds in preclinical trials before human safety testing.
Overall, the methods described in this book integrate a battery of tests that can be performed in cells, organs, tissues, and animal models for evaluating toxicity and/or safety of compounds in early developmental stages with the goal of estimating, preventing, or minimizing the teratogenic potential of drugs.
Vila Real, PortugalLuı ´ s Fe´lix
1 Updating an Overview of Teratology
Ana Margarida Calado, Fernanda Seixas, and Maria dos Anjos Pires
2 Guidelines on Developmental Toxicity Tests: Brief Insights
Sofia Alves-Pimenta, Luı ´ sFe´lix, Bruno Colac¸o, Paula A. Oliveira, and Carlos Vena ˆ ncio
3 Development Features on the Selection of Animal Models for Teratogenic Testing .
Sofia Alves-Pimenta, Bruno Colac¸o, Paula A. Oliveira, and Carlos Vena ˆ ncio
4 Virus as Teratogenic Agents
Ana Margarida Calado, Fernanda Seixas, and Maria dos Anjos Pires
5 The Future of the Teratogenicity Testing 143 Muhsin Aydin, Banu Guven Ezer, and Eyyup Rencuzogullari
6 The First Steps on AOPs’ Concepts, Development, and Applications in Teratology .
Leonardo Vieira, Terezinha Souza, and Davi Farias
7 Machine Learning to Predict Teratogenicity: Theory and Practice.
Latifa Douali
8 Human Pluripotent Stem Cell-Based Assays to Predict Developmental
Madhura Banerjee, Aritrika Das, Prarthana Chatterjee, and Satarupa Banerjee
9 Developmental Toxicity Using the Rat Whole Embryo Culture
Zeliha Fazliogullari 10 A Modified Murine Embryonic Stem Cell Test for Evaluating the Teratogenic Effects of Drugs
Mahshid Hodjat and Mohammad Abdollahi 11 Teratogenic Effects of Drugs on Primary Lymphocytes Assessed by Flow Cytometry
Ahmad Salimi and Zhaleh Jamali
12 Assessment of the Teratogenic Effect of Drugs on the Chicken Embryo 251 Lucas Rosa Fraga, Maikel Rosa de Oliveira, Karina Maria Wermann, and Neil Vargesson
13 Daphnia magna as a Model Organism to Predict the Teratogenic Effect of Different Compounds
Monalisa Mishra 14 Caenorhabditis elegans as an In Vivo Model Organism to Elucidate
Zhenglu Wang
15 Enduring Ethanol-Induced Behavioral Alterations in Caenorhabditis elegans After Developmental Lead Exposure
Lucı ´ a E. Fernandez-Hubeid, Paula A. Albrecht, Michael Aschner, and Miriam B. Virgolini
16 Exploration of Teratogenic and Genotoxic Effects on Model Organism Drosophila melanogaster
Seekha Naik and Monalisa Mishra
17 Ecotoxicological Assessment of Seaweed-Based Crop Biostimulant on Earthworm Eudrilus eugeniae Kinb .
Kanagaraj Muthu-Pandian Chanthini and Sengottayan Senthil-Nathan
18 Evaluation of the Ecotoxicology of Seaweed-Based Biopesticide Used in Combat of the Polyphagous Pest Using Eudrilus eugeniae Kinb
35 Whole-Mount RNA In Situ Hybridization of Zebrafish Embryos 543 I ˙ smail € Unal, Derya Cansız, Merih Beler, A. Ata Alturfan, and Ebru Emekli-Alturfan
36 Quantitative Real-Time PCR Method to Evaluate Gene Expression in Zebrafish Embryos 553
Merih Beler, Derya Cansız, I ˙ smail € Unal, and Ebru Emekli-Alturfan
37 Microarray Analysis to Determine Gene Expression Changes in Zebrafish Embryos
563 I ˙ smail € Unal, Merih Beler, Derya Cansız, and Ebru Emekli-Alturfan
38 Cell-Free DNA and Next-Generation Sequencing for Prenatal Diagnosis .
. 583 Klaus Rieneck
General Terms Used in Teratology ....... ....... ....... ........ ....... ........ 611
Ana Margarida Calado, Fernanda Seixas, and Maria dos Anjos Pires
Index
Contributors
MOHAMMAD ABDOLLAHI • Department of Toxicology and Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Tehran University of Medical Sciences (TUMS), Tehran, Iran; Toxicology and Diseases Group, Pharmaceutical Sciences Research Center (PSRC), Tehran University of Medical Sciences (TUMS), Tehran, Iran
PAULA A. ALBRECHT • Departamento de Farmacologı ´ a Otto Orsingher, Facultad de Ciencias Quı ´ micas, Universidad Nacional de Cordoba, Cordoba, Argentina
FIKRET ALTINDAG ˘ • Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Van Yu¨zu¨ncu¨ Yıl University, Van, Turkey
A. ATA ALTURFAN • Department of Medical Biochemistry, Faculty of Medicine, Istanbul University-Cerrahpas¸a, Istanbul, Turkey
AHMET ATA ALTURFAN • Department of Medical Biochemistry, Faculty of Medicine, Istanbul University-Cerrahpas¸a, Istanbul, Turkey
SOFIA ALVES-PIMENTA • Department of Animal Science, School of Agrarian and Veterinary Sciences (CECAV), University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal; Animal and Veterinary Research Centre (CECAV), Associate Laboratory for Animal and Veterinary Sciences (AL4AnimalS), University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal
MARIA DOS ANJOS PIRES • Animal and Veterinary Research Centre (CECAV), UTAD, and Associate Laboratory for Animal and Veterinary Science (AL4Animals), Department of Veterinary Sciences, School of Agrarian and Veterinary Sciences (ECAV), University of Tra ´ s-os-Montes e Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal
MICHAEL ASCHNER • Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY, USA
MUHSIN AYDIN • Department of Biology, Science and Letters Faculty, Adiyaman University, Adiyaman, Turkey
SATHEESWARAN BALASUBRAMANIAN • Molecular Toxicology Laboratory, Department of Biotechnology, Bharathiar University, Coimbatore, Tamil Nadu, India
MADHURA BANERJEE • School of BioSciences and Technology, Vellore Institute of Technology, Vellore, India
SATARUPA BANERJEE • School of BioSciences and Technology, Vellore Institute of Technology, Vellore, India
MERIH BELER • Department of Biochemistry, Institute of Health Sciences, Marmara University, Istanbul, Turkey
ANA MARGARIDA CALADO • Animal and Veterinary Research Centre (CECAV), UTAD, and Associate Laboratory for Animal and Veterinary Science (AL4Animals), Department of Veterinary Sciences, School of Agrarian and Veterinary Sciences (ECAV), University of Tra ´ s-os-Montes e Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal
DERYA CANSIZ • Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Istanbul Medipol University, Istanbul, Turkey
JOAO SOARES CARROLA • Centre for the Research and Technology of Agro-Environmental and Biological Sciences (CITAB), University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro (UTAD), Quinta de Prados, Vila Real, Portugal; Institute for Innovation, Capacity Building and Sustainability of Agri-food Production (Inov4Agro), Vila Real, Portugal
MATHEUS CARVALHO • Post-Graduation Program in Biochemistry, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Federal University of Ceara ´ , Fortaleza, Brazil
KANAGARAJ MUTHU-PANDIAN CHANTHINI • Sri Paramakalyani Centre for Excellence in Environmental Sciences, Manonmaniam Sundaranar University, Tenkasi, Tamil Nadu, India; Sri Paramakalyani Centre for Excellence in Environmental Sciences, Manonmaniam Sundaranar University, Alwarkurichi, Tenkasi, Tamil Nadu, India
PRARTHANA CHATTERJEE • School of BioSciences and Technology, Vellore Institute of Technology, Vellore, India
THEODOROS G. CHATZIMITAKOS • Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, University of Ioannina, Ioannina, Greece
BRUNO COLAC¸O • Department of Animal Science, School of Agrarian and Veterinary Sciences (CECAV), University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal; Animal and Veterinary Research Centre (CECAV), Associate Laboratory for Animal and Veterinary Sciences (AL4AnimalS), University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal
MAIBAM DAMAYANTI DEVI • Department of Botany, Manipur University, Imphal, India
ARITRIKA DAS • School of BioSciences and Technology, Vellore Institute of Technology, Vellore, India
LATIFA DOUALI • Centre of Education and Training Professions (CRMEF) of MarrakechSafi, Marrakech, Morocco
EBRU EMEKLI-ALTURFAN • Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Dentistry, Marmara University, Istanbul, Turkey
DAVI FARIAS • Post-Graduation Program in Biochemistry, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Federal University of Ceara ´ , Fortaleza, Brazil; Department of Molecular Biology, Federal University of Paraı ´ ba, Joao Pessoa, Brazil; Post-Graduation Program in Natural and Synthetic Bioactive Products, Health Sciences Centre, Federal University of Paraı ´ ba, Joa ˜ o Pessoa, Brazil
ZELIHA FAZLIOGULLARI • Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Selcuk University, Konya, Turkey
LUI ´ S FE ´ LIX • Centre for the Research and Technology of Agro-Environmental and Biological Sciences (CITAB), University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal; Institute for Innovation, Capacity Building and Sustainability of Agri-food Production (Inov4Agro), University of Tra ´ s-os Montes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal
LUCI ´ A E. FERNANDEZ-HUBEID • IFEC-CONICET, Cordoba, Argentina; Departamento de Farmacologı ´ a Otto Orsingher, Facultad de Ciencias Quı ´ micas, Universidad Nacional de Cordoba, Cordoba, Argentina
LUCAS ROSA FRAGA • Instituto de Cieˆncias Ba ´ sicas da Sau ´ de, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil; Centro de Pesquisa Experimental, Hospital de Clı ´ nicas de Porto Alegre, Porto Alegre, Brazil
ISABEL GAIVAO • Veterinary and Animal Research Centre (CECAV), University of Tra ´ s-osMontes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal; Department of Genetics and Biotechnology, University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal
GIOVANNA CA ˆ MARA GIUDICELLI • Post-Graduation Program in Genetics and Molecular Biology, Genetics Department, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil; Bioinformatics Core, Hospital de Clı ´ nicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brazil
JULIA DO AMARAL GOMES • Post-Graduation Program in Genetics and Molecular Biology, Genetics Department, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil; Laboratory of Genomic Medicine, Center of Experimental Research, Hospital de Clı ´ nicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brazil
ABBAS GU ¨ NGO ¨ RDU ¨ • Laboratory of Environmental Toxicology, Department of Biology, Faculty of Arts and Science, Inonu University, Malatya, Turkey
BANU GUVEN EZER • Department of Biology, Institute of Graduate Education, Adiyaman University, Adiyaman, Turkey
MAHSHID HODJAT • Dental Research Center, Dentistry Research Institute, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran; Department of Toxicology and Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Tehran University of Medical Sciences (TUMS), Tehran, Iran
ZHALEH JAMALI • Department of Addiction Studies, School of Medicine, Shahroud University of Medical Sciences, Shahroud, Iran; Student Research Committee, School of Medicine, Shahroud University of Medical Sciences, Shahroud, Iran
SENGODAN KARTHI • Sri Paramakalyani Centre for Excellence in Environmental Sciences, Manonmaniam Sundaranar University, Alwarkurichi, Tenkasi, Tamil Nadu, India; Department of Entomology, College of Agriculture, Food and Environment, University of Kentucky, Lexington, KY, USA
REEMA KHANGEMBAM • Department of Zoology, Manipur University, Imphal, India
MINE KO ¨ KTU ¨ RK • Department of Organic Agriculture Management, Faculty of Applied Sciences, Igdir University, Igdir, Turkey; Research Laboratory Application and Research Center (ALUM), Igdir University, Igdir, Turkey
ISAAC KONIG • Center for Environmental and Human Toxicology, Department of Physiological Sciences, College of Veterinary Medicine, University of Florida, Gainesville, FL, USA; Department of Chemistry, Federal University of Lavras (UFLA), Minas Gerais, Brazil
THAYNE WOYCINCK KOWALSKI • Post-Graduation Program in Genetics and Molecular Biology, Genetics Department, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil; Laboratory Genetics Unit, Medical Genetics Service, Hospital de Clı ´ nicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brazil; Teratogens Information System, Medical Genetics Service, Hospital de Clı ´ nicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brazil; Laboratory of Genomic Medicine, Center of Experimental Research, Hospital de Clı ´ nicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brazil; Bioinformatics Core, Hospital de Clı ´ nicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brazil; Post-Graduation Program in Medical Sciences, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil
MARIANA CAIPIRA LEI • Animal and Veterinary Department, University Institute of Health Sciences, CESPU, CRL, Gandra, Portugal
IOANNIS LEONARDOS • Department of Biological Applications and Technologies, University of Ioannina, Ioannina, Greece
ANA LUZIO • Centre for the Research and Technology of Agro-Environmental and Biological Sciences, CITAB and Inov4Agro, Institute for Innovation, Capacity Building and Sustainability of Agri-food Production, Quinta de Prados, Vila Real, Portugal; University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro, Quinta de Prados, Vila Real, Portugal
MARIA EDUARDA MAIA • Post-Graduation Program in Biochemistry, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Federal University of Ceara ´ , Fortaleza, Brazil; Department of Molecular Biology, Federal University of Paraı ´ ba, Joao Pessoa, Brazil
RAFAEL XAVIER MARTINS • Post-Graduation Program in Biochemistry, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Federal University of Ceara ´ , Fortaleza, Brazil; Department of Molecular Biology, Federal University of Paraı ´ ba, Joa ˜ o Pessoa, Brazil
CHRISTOPHER J. MARTYNIUK • Center for Environmental and Human Toxicology, Department of Physiological Sciences, College of Veterinary Medicine, University of Florida, Gainesville, FL, USA; Genetics Institute, Interdisciplinary Program in Biomedical Sciences Neuroscience, University of Florida, Gainesville, FL, USA
MONALISA MISHRA • Neural Developmental Biology Lab, Department of Life Science, NIT Rourkela, Rourkela, Odisha, India
SANDRA M. MONTEIRO • Centre for the Research and Technology of Agro-Environmental and Biological Sciences, CITAB and Inov4Agro, Institute for Innovation, Capacity Building and Sustainability of Agri-food Production, Quinta de Prados, Vila Real, Portugal; University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro, Quinta de Prados, Vila Real, Portugal
SEEKHA NAIK • Neural Developmental Biology Lab, Department of Life Science, NIT Rourkela, Rourkela, India
MAIKEL ROSA DE OLIVEIRA • Instituto de Cie ˆ ncias Ba ´ sicas da Sau ´ de, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil
PAULA A. OLIVEIRA • Animal and Veterinary Research Centre (CECAV), Associate Laboratory for Animal and Veterinary Sciences (AL4AnimalS), University of Tra ´ s-osMontes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal; Centre for the Research and Technology of Agro-Environmental and Biological Sciences (CITAB), University of Tra ´ s-osMontes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal; Institute for Innovation, Capacity Building and Sustainability of Agri-food Production (Inov4Agro), University of Tra ´ s-os Montes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal; Department of Veterinary Sciences, School of Agrarian and Veterinary Sciences (ECAV), University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal
KSHETRIMAYUM OPHELIA • Department of Botany, Manipur University, Imphal, India
EKAMBARAM PERUMAL • Molecular Toxicology Laboratory, Department of Biotechnology, Bharathiar University, Coimbatore, Tamil Nadu, India
MARIA DOS ANJOS PIRES • Animal and Veterinary Research Centre (CECAV), UTAD, and Associate Laboratory for Animal and Veterinary Science (AL4Animals), Department of Veterinary Sciences, School of Agrarian and Veterinary Sciences (ECAV), University of Tra ´ s-os-Montes e Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal
RAMAKRISHNAN RAMASUBRAMANIAN • Sri Paramakalyani Centre for Excellence in Environmental Sciences, Manonmaniam Sundaranar University, Alwarkurichi, Tenkasi, Tamil Nadu, India
MARIANA RECAMONDE-MENDOZA • Bioinformatics Core, Hospital de Clı ´ nicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brazil; Post-Graduation Program in Informatics, Informatics Institute, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil
EYYUP RENCUZOGULLARI • Department of Biology, Science and Letters Faculty, Adiyaman University, Adiyaman, Turkey
ONDINA RIBEIRO • Centre for the Research and Technology of Agro-Environmental and Biological Sciences (CITAB), University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro (UTAD), Quinta de Prados, Vila Real, Portugal; Institute for Innovation, Capacity Building and Sustainability of Agri-food Production (Inov4Agro), Vila Real, Portugal
KLAUS RIENECK • Department of Clinical Immunology, Laboratory of Blood Genetics, Copenhagen University Hospital, Copenhagen, Denmark
AHMAD SALIMI • Department of Pharmacology and Toxicology, School of Pharmacy, Ardabil University of Medical Sciences, Ardabil, Iran; Traditional Medicine and Hydrotherapy Research Center, Ardabil University of Medical Sciences, Ardabil, Iran
KIRANKUMAR SANTHAKUMAR • Zebrafish Genetics Laboratory, Department of Genetic Engineering, SRM Institute of Science and Technology, Kattankulathur, Chengalpattu, Tamil Nadu, India
DE ´ RCIA SANTOS • Centre for the Research and Technology of Agro-Environmental and Biological Sciences, CITAB and Inov4Agro, Institute for Innovation, Capacity Building and Sustainability of Agri-food Production, Quinta de Prados, Vila Real, Portugal; University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro, Quinta de Prados, Vila Real, Portugal
FERNANDA SEIXAS • Animal and Veterinary Research Centre (CECAV), UTAD, and Associate Laboratory for Animal and Veterinary Science (AL4Animals), Department of Veterinary Sciences, School of Agrarian and Veterinary Sciences (ECAV), University of Tra ´ s-os-Montes e Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal
SENGOTTAYAN SENTHIL-NATHAN • Sri Paramakalyani Centre for Excellence in Environmental Sciences, Manonmaniam Sundaranar University, Alwarkurichi, Tenkasi, Tamil Nadu, India
NARAYANAN SHYAM-SUNDAR • Sri Paramakalyani Centre for Excellence in Environmental Sciences, Manonmaniam Sundaranar University, Alwarkurichi, Tenkasi, Tamil Nadu, India; Department of Zoology, Sri Paramakalyani College, Alwarkurichi, Tenkasi, Tamil Nadu, India
HARIDOSS SIVANESH • Sri Paramakalyani Centre for Excellence in Environmental Sciences, Manonmaniam Sundaranar University, Alwarkurichi, Tenkasi, Tamil Nadu, India
CHRISTOPHER L. SOUDERS II • Center for Environmental and Human Toxicology, Department of Physiological Sciences, College of Veterinary Medicine, University of Florida, Gainesville, FL, USA
JULIANA ALVES COSTA RIBEIRO SOUZA • Department of Molecular Biology, Federal University of Paraı ´ ba, Joao Pessoa, Brazil; Post-Graduation Program in Natural and Synthetic Bioactive Products, Health Sciences Centre, Federal University of Paraı ´ ba, Joao Pessoa, Brazil
TEREZINHA SOUZA • Department of Molecular Biology, Federal University of Paraı ´ ba, Joao Pessoa, Brazil; Post-Graduation Program in Biochemistry, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Federal University of Ceara ´ , Fortaleza, Brazil
CONSTANTINE D. STALIKAS • Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, University of Ioannina, Ioannina, Greece
VETHAMONICKAM STANLEY-RAJA • Sri Paramakalyani Centre for Excellence in Environmental Sciences, Manonmaniam Sundaranar University, Alwarkurichi, Tenkasi, Tamil Nadu, India
SONALI THOKCHOM • Department of Zoology, Manipur University, Imphal, India
DUYGU OZHAN TURHAN • Laboratory of Environmental Toxicology, Department of Biology, Faculty of Arts and Science, Inonu University, Malatya, Turkey
ISMAIL UNAL • Department of Biochemistry, Institute of Health Sciences, Marmara University, Istanbul, Turkey
ANA M. VALENTIM • i3S – Instituto de Investigac¸a ˜ o e Inovac¸a ˜ o em Sau ´ de, Universidade do Porto, Porto, Portugal; IBMC – Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, Porto, Portugal
NEIL VARGESSON • Institute of Medical Sciences, School of Medicine, Medical Sciences and Nutrition, University of Aberdeen, Aberdeen, UK
CARLOS VENA ˆ NCIO • Department of Animal Science, School of Agrarian and Veterinary Sciences (CECAV), University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal; Animal and Veterinary Research Centre (CECAV), Associate Laboratory for Animal and Veterinary Sciences (AL4AnimalS), University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal; Centre for the Research and Technology of AgroEnvironmental and Biological Sciences (CITAB), University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal; Institute for Innovation, Capacity Building and Sustainability of Agri-food Production (Inov4Agro), University of Tra ´ s-os Montes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal
FERNANDA SALES LUIZ VIANNA • Post-Graduation Program in Genetics and Molecular Biology, Genetics Department, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil; Teratogens Information System, Medical Genetics Service, Hospital de Clı ´ nicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brazil; Laboratory of Genomic Medicine, Center of Experimental Research, Hospital de Clı ´ nicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brazil; Post-Graduation Program in Medical Sciences, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil
LEONARDO VIEIRA • Post-Graduation Program in Biochemistry, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Federal University of Ceara ´ , Fortaleza, Brazil; Department of Molecular Biology, Federal University of Paraı ´ ba, Joao Pessoa, Brazil
RAQUEL S. F. VIEIRA • Centre for the Research and Technology of Agro-Environmental and Biological Sciences (CITAB), University of Tra ´ s-os-Montes and Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal; Institute for Innovation, Capacity Building and Sustainability of Agrifood Production (Inov4Agro), UTAD, Vila Real, Portugal
S. VINOTH • Zebrafish Genetics Laboratory, Department of Genetic Engineering, SRM Institute of Science and Technology, Kattankulathur, Chengalpattu, Tamil Nadu, India
MIRIAM B. VIRGOLINI • IFEC-CONICET, Cordoba, Argentina; Departamento de Farmacologı ´ a Otto Orsingher, Facultad de Ciencias Quı ´ micas, Universidad Nacional de Cordoba, Cordoba, Argentina
ZHENGLU WANG • West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, People’s Republic of China
KARINA MARIA WERMANN • Instituto de Cieˆncias Ba ´ sicas da Sau ´ de, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil; Centro de Pesquisa Experimental, Hospital de Clı ´ nicas de Porto Alegre, Porto Alegre, Brazil
SANGEETA YANGLEM • Department of Botany, Manipur University, Imphal, India
THANGAL YUMNAMCHA • Department of Botany, Manipur University, Imphal, India
Chapter 1
Updating an Overview of Teratology
Ana Margarida Calado, Fernanda Seixas, and Maria dos Anjos Pires
Abstract
In this chapter, the authors aim to update an overview of the principles of teratology, beginning with the definition of teratology, the critical point at which this process occurs, and some of the most common etiological agents that improve our understanding of teratology.
Modern teratology has greatly improved in recent years with advances in new methods in molecular biology, toxicology, animal laboratory science, and genetics, increasing our knowledge of ambient influences. Nevertheless, there is a lot to do to reduce the influence of hazardous intervening agents, whether they target our genetics or not, that can negatively affect pregnancy and induce congenital development disorders, including morphological, biochemical, or behavioral defects.
Certain agents might indeed be related to certain defects, but we have not been able to identify the cause of most congenital defects, which highlights the importance of finding and testing out new genetics techniques and conducting laboratory animal science to unravel the etiology and pathogenicity of each congenital defect.
Teratology (from Greek, teratos, meaning “monster”) is the science that studies birth defects, congenital malformations, and congenital developmental disorders (CDDs). These defects could be noticeable or remain latent until another time, and they result from the conjugation effects of internal and external factors during prenatal developmental processes [1].
Congenital disorders and malformations were long ago described by Assyrian and Babylonian astrologists and by the physicians and philosophers of the Hippocratic era. In the medieval age, they were considered supernatural phenomena, terata, from which the term teratology derived. Teratology started as an independent science in the 1930s with the publication of the first
studies reported in pigs born with eye defects, which are correlated with diet deficiencies in vitamin A in their mothers during pregnancy [2].
The etiological factors of these anomalies can be divided into internal factors (genetics, around 30%), external or environmental factors (15%), and combinations of environmental conditions and genetic susceptibilities, which account for most of the etiologies of these defects (55%) [1].
The concept of teratology was postulated by Wilson in 1973 as having sixth principle (revised by [2]): (1) susceptibility to the teratogen agents on the genotype of the conceptus and the manner in which this interacts with adverse environmental factors; (2) susceptibility to teratogenesis varies with the developmental stage of the embryo at the time of exposure to an adverse influence; (3) teratogenic agents act in specific ways (mechanisms) on developing cells and tissues to initiate sequences of abnormal developmental events (pathogenesis); (4) the adverse influence on developing tissues depends on the nature of the influence (agent); (5) the four manifestations of deviant development are death, malformation, growth retardation, and impaired function; and the manifestations of deviant development increase in frequency and degree as dosage increases from no-effect to the totally lethal level [2].
These anomalies are the results of a developmental disturbances in organs or tissues, depending on the gestation period that these factors act on (Fig. 1). The crucial developmental period that is susceptible to malformations is the first part of gestation (e.g., in human, the first 8 weeks, whereas in dogs, the first 12 days), before the first consultation with a medical professional and often even before the identification of the pregnancy [1]. This is the embryonic period during which three germ layers (the endoderm, mesoderm, and ectoderm) develop into tissues and organs (via blastogenesis and organogenesis). The neuronal tissues and sense organs continue to develop during the next period (the fetal period) until birth [3]. Defects during blastogenesis tend to be severe, are frequently lethal, and tend to involve several parts of the developing organism. On the other hand, defects during organogenesis tend to involve single structures. Despite modern approaches to molecular biology and genetics, along with the most advanced diagnostic techniques, we are still not able to identify the actual cause in more than 50% of all congenital defects. About 2–3% of newborns have a single major malformation, and 0.7% have multiple major defects. Minor defects can occur in approximately 15% of all newborns, most of them without detriment to the health of the newborn, but some of them are associated with major anomalies [1]. The frequency of defects is much higher prenatally, and defects are the causes of the majority of spontaneous aborting in the beginning of pregnancy. More than 80% of malformed conceptuses are lost during the
Fig. 1 Critical periods in human development: (a) curve of teratogenic susceptibility during the gestation period; (b) schematic representation of the critical phases of teratogenicity in organs and tissues during the embryonic and fetal periods. Blue represents the higher-sensitivity period and yellow the lower-sensitivity period. (Adapted from refs. 1, 8)
embryonic period and more than 90% before birth. Over the past few decades, there has been a rapid expansion of methods for detecting many types of disorders prenatally. In recent years, health professionals have gained considerable knowledge on potential teratogenic agents (genetic, physical, chemical, or biological) and maternal conditions (diseases or occupancy conditions) and disseminated this scientific information to the general population, who have since become aware of the possible risk exposure just before, during the first period of, or even throughout all pregnancy period.
2 Etiological Agents
The risk factors of developing malformations can be classified into genetic, environmental, modifiable (e.g., smoking and prepregnancy obesity), and nonmodifiable (genetic polymorphisms) factors [4]. In all etiological conditions, the development stage of the
4AnaMargaridaCaladoetal.
conceptus and its genetical status are fundamental. In some cases, the etiological agent could be extremely deleterious and could seriously transform the fetus, whereas in other cases, the fetus might not be harmed (Table 1).
2.1 Genetic Factors
The genetics of the germinal cells condition the success of the conceptus. The mother’s genetics, diseases, and occupation (see the report in the following item, “maternal conditions”) are considered as determinants in the teratology process. The importance of the father for the success of the conceptus or in the teratology process was, in the past, often forgotten, as the mechanism leading to this alteration was not well understood. Recently, however, the father’s influence on the development of teratogenesis has been reaffirmed by new information on epigenetic regulation. Epigenetic regulation via methylation and histone modification is one of the main mechanisms by which the genetic defects transfer their actions to the next generation. Also, changes in micro-RNA (miRNA) are being proposed as possible mechanisms. Some of these alterations suffered in the preconception period lead to accumulations that can have negative consequences for more than one generation [5].
Constitutional chromosomal anomalies that arise during gametogenesis in the parents and abnormalities that arise in early embryogenesis affect the majority of an organism’s cells and result in teratology events in newborns [6]. Constitutional chromosomal abnormities occur in 20–50% of human conceptuses, and those rates are considerably higher in the conceptuses of other species [6]. Most abortions in the first period of gestation in humans have abnormal chromosome constitutions [7]. Duplications of chromosomes (e.g., trisomies) have been reported for all chromosomes, and most of them are lethal during gestation. Nevertheless, some newborns with trisomies for chromosomes 9, 13, 18, or 21, are viable and born [6].
Other chromosomal conditions are found in individuals with anomalies, such as deletions, duplications, rearrangements such as translocations, and inversions or even aneuploidies. Most of them are correlated with spontaneous early abortions or the death of the conceptus in various periods of pregnancy. The frequency of cytogenetics errors in embryos (in humans, before 8 weeks of age) ranges from 54.3% to 81.3%, and higher rates of anomalies were reported in growth-disorganized embryos. In human fetuses (those in the post-8-week developing age), only 1.7–30.4% present with chromosomal anomalies, though this rate is higher in fetuses with abnormal morphologies [6].
Finding correlations between chromosomal and epigenetics alterations and environmental or parental conditions remains the ongoing goal of studies in this field, and some have been demonstrated as correlates e.g., ionizing radiation and chemicals, viruses, medications, and some maternal conditions.
Table 1
Teratogenic agents and their effects on fetuses and embryos after exposure
Teratogens Associated Congenital Malformations
Phenylketonuria Several central nervous system (CNS) defects, developmental delay, microcephaly, heart defects, low birth weight
Diabetes mellitus Fetal death, several CNS defects, anencephaly, spina bifida, hydrocephaly, heart and kidney defects, skeleton malformations situs inversus, VACERL association
Mechanical forces Amniotic band syndrome and sequence, curvature abnormalities, vertebral fusions, altered vertebral shapes
Anticonvulsants Clubfoot, cleft lip/palate, hypospadias, ventricular septal defects, teratology of Fallot, patent ductus arteriosus (PDA), the transposition of the great vessels (TGA), microcephaly, genitourinary anomalies
Genetic inheritances, a variety of maternal disorders or diseases, and deficiencies affect developing embryos. When people with an inherited metabolic disorder reach childbearing age, they must be counseled on the potential impacts of pregnancy on such conditions and the impact of their conditions on pregnancy and the outcomes for their children. The potential teratogenicity of abnormal or elevated metabolites in people with metabolic diseases remains poorly defined or unknown. For most conditions and most metabolites, there is simply not enough available evidence for us to draw any firm conclusions on teratogenicity [8–10].
2.2.1 Phenylketonuria (PKU)
Phenylketonuria (PKU) is one of the most common metabolic diseases affecting women, caused by an autosomal recessive condition. PKU is marked by a deficiency in the enzyme phenylalanine hydroxylase, which converts the dietary amino acid phenylalanine to tyrosine. High maternal phenylalanine levels are teratogenic to developing fetuses. The effects of maternal PKU syndrome include developmental delays (92%), microcephaly (73%), cardiac defects (12%), low birthweight (40%), neuronal loss, corpus callosum hypoplasia, facial dysmorphic features (e.g., anteverted nares and wide nasal bridge), and cognitive and behavioral problems [9, 11–15]. Some cases of lobar holoprosencephaly and anencephaly have also been described, as have delays in the myelinization process [16].
Numerous studies have supported these effects in animal models, including evidence that exposing neonatal rats to phenylalanine and/or its metabolites results in a concentration-dependent reduction in the size of the cerebellum and the thinning of the molecular layer, an increase in neural-tube-closure defects, an increase in cerebral cell death, a decrease in cell proliferation and cell-cycle arrest, and a reduction in fetal astrocyte proliferation [16–20].
Unlike some harmful substances that affect fetuses only during a single trimester, excess phenylalanine is associated with a significantly increased risk of congenital heart disease in weeks 0–8; brain, fetal, and postnatal growth retardation; wide nasal bridges; anteverted nares in weeks 8–12; and dose-dependent neurologic deficits throughout all 40 weeks of pregnancy [9]. The specific mechanisms by which phenylalanine causes brain damage are not completely understood, but its effects on the central nervous system are known to be proportional to the levels of phenylalanine and to the age-based stage of brain growth and development [21, 22].
People with PKU should therefore be educated and advised to plan their pregnancies in order to obtain good metabolic control over their phenylalanine levels before conception. Fortunately, with appropriate specialist management, the teratogenic risk can be eliminated if pregnant people maintain a restricted protein diet during the first trimester, and then, as the fetus grows and protein tolerance increases, protein intake will need to be increased according to the fetus’s needs [9, 10, 23].
2.2.2 Diabetes Mellitus
Maternal insulin-dependent diabetes has long been associated with fetal death (up to 17%) and multiple congenital malformations affecting multiple organ systems. Congenital anomalies, including defects of the heart, central nervous system, kidneys, and skeleton; anencephaly; spina bifida; hydrocephaly; situs inversus; caudal dysplasia; and the various anomalies included in VACTERL association. VACTERL is an acronym that refers to the relatively common, nonrandom occurrence of costovertebral segmentation defects, anal atresia/stenosis, cardiac malformations, tracheoesophageal
8AnaMargaridaCaladoetal.
fistula, esophageal atresia, renal anomalies, and limb abnormalities [24, 25]. Individuals diagnosed with VACTERL association typically have at least three of these characteristic features [25]. The minor physical abnormalities associated with maternal diabetes include flattened nasal bridges, excess skin folds on the neck, and tapered fingers with hyperconvex nails [8, 26].
The teratogenic mechanism in diabetes remains unknown, and insulin appears to have no teratogenic effect. Diabetes leads to situations such as hypo-and hyperglycemia, the loss of normal homeostasis, and fat and protein metabolism disorders. The gastrulation and neurulation stages of development are particularly sensitive to hypoglycemia and result in growth retardation as well as cranial and caudal neural tube defects (NTDs). Hyperglycemia leads to the inhibition of the myoinositol uptake, which is essential to embryonic development during the gastrulation and neurulation stages of embryogenesis [26, 27].
The mechanisms underlying the association between maternal diabetes and congenital heart defects may also differ between people with pregestational diabetes and people with gestational diabetes. The critical period of heart development is between the third and seventh weeks of gestation. Pregnant people with pregestational diabetes would have a diabetic intrauterine environment during this critical period of heart development and present a high incidence of congenital heart anomalies. On the other hand, gestational diabetes does not develop until between the 24th week and 28th week of gestation, after the critical period of heart development. However, pregnant people with gestational diabetes still show significant prevalences of every congenital heart disease, hypoplasia, left heart syndrome, Ebstein malformation, and single ventricle defects [28, 29]. Hyperglycemia plays a role as a promoter of oxidative stress by increasing reactive oxygen species that promote the occurrence of genetic changes and abnormalities in the usual pattern of apoptosis in cardiac cells, particularly in the neural crest, which is a key part of cardiac development [30–32].
2.2.3 Hypothyroidism and Hyperthyroidism
The fetus is dependent on its small supply of thyroxine from their pregnant parent until 10–12 weeks of gestation (within the first third of gestation in other species), when the fetal thyroid gland starts secreting thyroid hormones. By 20 weeks of gestation, the fetal thyroid gland becomes responsive to thyroid stimulating hormone (TSH) from its own pituitary gland, but the function of the thyroid gland remains relatively lazy. Hypothyroidism during pregnancy is usually asymptomatic, but it needs to be detected and treated to prevent adverse outcomes. Thyroxine is critical for many aspects of fetal brain development, including neurogenesis, neuronal migration, axon and dendrite formation, myelination, synaptogenesis, and neurotransmitter regulation [33–35].
2.2.4 Hypoparathyroidism and Hyperparathyroidism
On the other hand, uncontrolled hyperthyroidism is associated with serious neonatal morbidity, mortality, and maternal complications, including miscarriage, hypertension, preterm delivery, placental abruption, heart failure, and thyroid storm. Fetal and neonatal complications include stillbirth, cardiovascular abnormalities, urogenital malformations, low birth weight, goiters, hyperthyroidism, and hypothyroidism. These risks can be avoided or decreased by administering the appropriate treatment for maternal hyperthyroidism. Antithyroid drugs, such as methimazole and propylthiouracil, cross the placenta and therefore serve as treatments for both maternal hyperthyroidism and fetal hyperthyroidism [36–41]. In animal models, namely rats, maternal hypothyroidism affects fetal and neonatal development, possibly interrupting neuronal migration and inducing the formation of periventricular heterotopia in the brain [42].
Primary hyperparathyroidism (PHPT) is the third-most-common endocrine disorder, after diabetes and thyroid diseases. Hyperparathyroidism is usually as the result of sporadic parathyroid adenomas and carcinomas, and it can also be associated with multiple endocrine neoplasia, genetic syndromes, and metabolic diseases. Fetuses in parents with untreated PHPT may suffer from complications secondary to the harmful effects of hypercalcemia [43–45]. Fetal complications include intrauterine growth restriction, fetal death, preterm delivery, and low birth weight. In the postpartum period, neonatal tetany has been reported in 50% of neonates born from untreated pregnant parents. The newborn hypocalcemia is due to fact that the placental transfer of the elevated calcium levels causes the suppression of the fetal parathyroid glands. Upon delivery, the calcium transfer stops, but the involute parathyroid glands cannot maintain adequate calcium levels. The hypocalcemia is transient, lasting up to 3–5 months (in humans), but it can be managed with calcium and vitamin D supplements [46, 47]. Of greater concern is the rarer development of permanent hypoparathyroidism in a few offspring. Complications associated with primary hyperparathyroidism in pregnancy have been reported (in humans) to occur in up to 67% of pregnant parents and 80% of fetuses. Fetal complications include intrauterine growth retardation, low birth weight, preterm delivery, intrauterine fetal demise, postpartum neonatal tetany, and permanent hypoparathyroidism. A fourfold decrease in perinatal complications may be achieved with appropriate therapy [43, 47–49].
Pregnant parents with untreated hypoparathyroidism may have transient hyperparathyroidism during the fetal and neonatal periods. The fetal parathyroid hyperplasia that occurs in response to low maternal and fetal serum calcium concentrations is mediated by maternal parathyroid dysfunction. Bone demineralization and
2.3 Physical Agents
2.3.1 Ionizing Radiation
subperiosteal reabsorption occur in the long bones, causing pulmonary artery stenosis, ventricular septal defects, and muscle hypotonia [50, 51].
Radiation exposure can be expressed as an “absorbed dose,” which represents the radiation energy absorbed by an organ or tissue per unit of mass, typically measured in milligrays (mGy). In biology, the term equivalent dose considers the radiation weighting factor relevant for the biological effect of the absorbed radiation on a specific organ [52]. Fetal radiation exposure can cause two types of adverse effects: deterministic (nonprobabilistic) and stochastic (probabilistic). Deterministic effects occur after a threshold dose has been reached and include intrauterine growth restriction, miscarriage, intellectual disabilities, low intelligence quotients, and congenital malformations. There is no threshold dose for stochastic effects, although the probability of their occurrence rises as the dose exposure increases. In general, the fetal dose of radiation is described as a tissue dose, although this is not always uniform. Fetal radiation < 50 mGv is generally considered negligible according to studies demonstrating that fetal exposure to a dose of < 50 mGy does not affect pregnancy outcomes compared with control populations. Experimental studies in animals have shown that doses of < 100 mSv have no effect on the embryo/fetus in the preimplantation stage, in organogenesis, or in the fetal period [53, 54].
Disabilities vary depending on the dose and the gestational age, where the first trimester is the period of greatest fetal vulnerability to radiation. Exposure during days 18–20 could result in ovum death. Doses between 1 and 2 Gy during organogenesis could cause severe fetal anomalies of the eyes and the nervous and skeletal systems. Doses > 2 Gy could cause death, and exposure for longer than 50 days after conception can result in intrauterine growth retardation [52–54].
This radiation can injure the developing embryo through cell death or chromosome injury. The severity of damage to the embryo depends on the dose absorbed and the stage of development at which the exposure occurred. Exposing a popular to chronic low-dose ionizing radiation results in disruptions to blastogenesis, neural tube defects (including anencephaly, microcephaly, and iniencephaly), encephaloceles, spina bifida, rachischisis, microphthalmia, alterations of body axes, conjoined twins, duplications, sacrococcygeal teratomas, diaphragmatic hernias, ectopia vesicae, severe genital malformations, intellectual impairment, and limb abnormalities [8, 53–57]. Evidence for these dose thresholds is based mainly on studies on large-scale radiation disasters, animal studies, and outcomes in women exposed to radiation for medical treatment [53, 54].
2.3.2 Hyperthermia
2.3.3 Mechanical Forces
Exposure to hyperthermic conditions during pregnancy appears to induce teratogenesis in all the tested species, including humans, although malformations differ depending on the species. The consequences of hyperthermia depend on the extent of temperature elevation, its duration, and the stage of fetal development when it occurred. All these effects seem to be mediated via altered expressions of heat-shock proteins [58, 59].
High temperatures and/or longer durations are most likely to cause abortions, while lower elevations cause embryonic death and resorption, or if the exposure occurs at this critical stage of development, then they cause embryogenetic abnormalities. Mild exposures during the preimplantation period and severer exposures during embryonic development and fetal development often result in prenatal death and abortion [60].
Central nervous system defects appear to be the most common consequences of hyperthermia in all species, and cell death or delay in the proliferation of neuroblasts is one major explanation for these effects. Although cardiovascular anomalies are most common in rats and skeletal malformations in mice, the development of the nervous system is especially vulnerable: In one study, a 2.5 °C elevation for 1 h during early neural tube closure in rats resulted in an increased incidence of craniofacial defects, whereas a 2–2.5 °C elevation for 1 h during early neurogenesis in guinea pigs caused an increase in the incidence of microcephaly [58].
In experimental laboratory animals, the most common defects are neural tube disorders, microphthalmia, cataracts, microencephaly, heart malformations, and craniofacial, skeletal, and tooth defects. Almost all these defects were found in humans, and they correlated with maternal fever or other forms of hyperthermia during pregnancy. A recent meta-analysis indicates that maternal hyperthermia during gestation is associated with an increased incidence of neural tube defects, showing that the neural tube is heat sensitive in human embryos too [61, 62]. In humans, there is evidence that an elevation of maternal body temperature of 2 °C for at least 24 h during fever can cause a range of developmental defects, but there is little information on the threshold for shorter exposures [59, 62].
Malformations of the uterus may restrict fetal movements, and the impact this mechanical force on the fetus is associated with congenital skeletal abnormalities. These abnormalities are classified as deformations or abnormal forms, shapes, or positions of body parts, which are caused by physical constraints. In one study, prolonged rigid paralysis induced severe defects in the spine, including curvature abnormalities, posterior and anterior vertebral fusions, and altered vertebral shapes [63]. Amniotic band syndrome and amniotic band sequence are relatively rare conditions, in which congenital anomalies occur as the results of the adherence and
12AnaMargaridaCaladoetal.
entrapment of fetal parts with coarse fibrous bands of the amniotic membrane. Most of this reported cases have atypical gestational histories. The frequency of this obstetric complication is not associated with fetal gender, genetic abnormality, or prenatal infection [64, 65]. The clinical manifestations are primarily distal deformities, such as constrictions of the limbs and fingers, syndactyly, acrosyndactyly, and phalangeal hypoplasia, pseudoainhum and limb and finger amputations. These manifestations show a predilection toward the hand, in particular the central digits, whereas the frequency and severity of thumb involvement are minimal [66]. The thumb is less vulnerable because it lies protected within the palm of the hand in utero, unlike the longer digits, which are more exposed, leading to amputations distal to the level of the proximal phalanx. Multiple malformations, such as clubfeet (30% of patients), leg length discrepancies (24%), other bone anomalies (12%), special craniofacial defects (such as cleft lips and palates) (8%), visceral and body wall defects, and anencephalies (5%) have been detected in 70% of infants with the Congenital constriction band disorder [67, 68].
2.4 Chemical Agents
2.4.1 Anticonvulsants
This issue is even more complex in that the physiology of the conceptus during pregnancy greatly changes from the first trimester to the third trimester. The lack of information on the appropriate dose for a particular drug in a particular species and the timing and duration of exposure of this to a sufficient number of pregnant people or animals could be among the causes of some teratological defects. There is insufficient scientific data to formulate conclusions on the safety and efficacy of several drugs and medications [69]. Concerns over potential fetal or neonatal teratogenicity and toxicity are often left unresolved because of the limited number of data obtained from a comprehensive sample of pregnant and lactating people and even of primate or other animal species in nature. Hence, conflicts may arise between the theoretical fear of adverse fetal or neonatal consequences and the general bias among most healthcare providers that the successful treatment of medical conditions in the pregnant parent is in the offspring’s best interest [70–73].
Most anticonvulsant drugs introduce a risk of abnormal or delayed physical development for infants who are exposed in utero. The following monotherapies have been associated with statistically significant risks of malformations and prenatal harms [70–75]:
• Primidone is teratogenic in rats, albeit not dose dependent, and it causes behavioral changes and increased fetal death.
• Carbamazepine causes major and minor congenital malformations.
• Clobazam induces prenatal growth retardation and preterm birth.
• Ethosuximide leads to major congenital malformations, cleft lips/palates, and clubfeet.
• Gabapentin can cause cardiac malformations and hypospadias.
• Phenobarbital induces major congenital malformations, prenatal growth retardation, and cleft lips/palates.
• Phenytoin leads to major congenital malformations, cleft lips/ palates, and clubfeet.
• Topiramate induces overall major congenital malformations, combined fetal losses, prenatal growth retardation, and cleft lips/palates.
• Valproate (VPA) causes major and minor congenital malformations, combined fetal loss, hypospadias, cleft lips/palates, clubfeet, neurodevelopmental changes, and intellectual disabilities. Studies have suggested that exposure to VPA during pregnancy is dose dependent. Its intake increases the risk of congenital malformation by about 11%, but this can increase up to 24% when the dose is greater than 1500 mg per day. The higher doses of valproate are associated with poorer overall cognitive abilities, known as fetal valproate spectrum disorder (FVSD) in humans. Valproate is also teratogenic in rhesus monkeys, rats, hamsters, and mice.
• Trimethadione is associated with fetal trimethadione syndrome in the form of multiple structural abnormalities in humans. This syndrome’s associations with trimethadione include a great diversity of anomalies, such as growth retardation, microcephaly, cleft lips and/or palates, unusual facies with V-shaped eyebrows, broad nasal bridges, epicanthal folds, anteverted nostrils, cardiovascular malformations (particularly ventricular septal defects, teratology of Fallot, patent ductus arteriosus, and transpositions of the great vessels), genitourinary, and gastrointestinal anomalies. In mice, trimethadione is teratogenic in a dose eight to 22 times than the human dose. Rats and rhesus monkeys also display signs of teratogenesis at up to ten times the recommended human dose.
The newer generation of anticonvulsants drugs, such as lamotrigine, levetiracetam, oxcarbazepine, and vigabatrin, were not associated with statistically significant risks to physical development. However, this does not mean that these agents are not harmful to the offspring of pregnant people administered with these agents. Additionally, there is insufficient evidence to make any conclusions on polytherapy with this newer generation anticonvulsants drugs because of a lack of studies reporting these combinations [73].
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mission de Bukit-Timah et aussi des Bouddhistes pieux qui sont l’élite de la société malaise.
On ignore, en général, la situation qu’on occupe réellement dans le monde. L’enterrement de ma mère me révéla la mienne et la pureté de ma douleur fut altérée par une satisfaction d’amour-propre immense.
Tout Singapour assista en masse à cet enterrement. Le Résident général se tenait à nos côtés avec la plupart des officiers. J’éclatai en sanglots quand je vis défiler le capitaine Mac-Nair, le directeur de la colonie pénitentiaire, suivi d’une délégation de forçats Malabariens et Lascars en uniformes neufs.
Ainsi le mal s’accompagne de bien et je me rappelle qu’en revenant du cimetière européen, derrière la pointe de la Batterie, je m’attendrissais sur mon importance et celle de ma propre famille.
Les facultés de mon père baissèrent avec une extrême rapidité. Il se mit à lire et ce fut l’origine de sa décadence. On est perdu par sa folie aussi sûrement que par sa vertu. Non content de voir le pasteur, il se mit à fréquenter assidûment les jésuites et certains prêtres catholiques. Je crois même qu’il eut des entretiens, au sujet de je ne sais quelles théories religieuses, avec des Mahométans et des Parsis.
Nous eûmes des froissements. Ce fut le moment où je pris connaissance de ma puissance de dompteur, où je commençai à faire ramper les fauves avec la fixité de mon regard et le sifflement de ma cravache. Il s’y mêlait une pensée de vengeance. Le fils de celle qui avait succombé à l’influence maligne d’un crapaud vaincrait par sa volonté les animaux les plus redoutables de la création. Cette pensée de vengeance ne fit que s’accroître quand mourut mon père.
Il lisait trop. Troublé par ses lectures, moralement débilité par elles, il se laissa mordre par un cobra. La fatalité voulut que l’on ne pût trouver ni la plante guaco, ni la graisse de Naja qui sont les antidotes du venin des cobras. En quelques heures, mon père, qui était un Hollandais pur sang, avait pris un teint jaune plombé qui le rendait pareil à un Malais de vieille race. Rien ne peut être plus
douloureux pour un fils que de voir son père changer brusquement d’origine à l’heure de la mort.
Le faste de l’enterrement ne m’apporta aucune consolation. Je savais qui j’étais.
Mon caractère changea. Je jetai à la porte quand ils se présentèrent : le pasteur, à cause de ses citations de livres, les jésuites, à cause de leur politesse exagérée, les bouddhistes, à cause de leur respect de la vie des bêtes. Je résolus de vivre avec des hommes. Il y a peu d’hommes. C’est à ce moment qu’Ali le Macassar entra chez moi, comme employé et devint mon compagnon. Je ne quittai plus ma cravache. Même la nuit, elle était à portée de ma main.
Mais tout ce que je viens de dire de la mort de mes parents n’est rien. Le duel n’était pas engagé. Le vrai mystère ne m’enveloppait pas encore. Ce n’est qu’un an plus tard que je devais rencontrer le Tigre. Je ne parle pas de ceux dont ma ménagerie était pleine, mais de l’unique, du mien, de celui qui était, par rapport à ses pareils, ce que j’étais moi-même aux hommes, un maître.
LA JEUNE FILLE A L’ÉCHELLE
Je n’ai jamais été l’amant d’Eva. Je n’ai jamais eu la seule femme que j’ai vraiment aimée. Pourquoi se refusa-t-elle à moi avec cette obstination insensée, c’est ce que je ne suis jamais arrivé à comprendre. Était-ce par respect du sacrement du mariage qui devait nous réunir ? Je ne le crois pas. Était-ce par vertu naturelle ?
Peut-être tout ce qu’il me fut donné d’apprendre par la suite sur ses caprices insensés ne fut qu’une suite de calomnies inventées pour ternir une vie immaculée. Était-ce par amour pour moi ? C’est bien possible et il faut toujours croire l’hypothèse la plus favorable.
Peu de temps après la soirée que j’avais passée avec mon cousin de Goa dans la fumerie d’opium de Singapour, je partis pour Batavia. Ali le Macassar m’accompagnait. Nous allions prendre livraison d’un couple de panthères et faire achat d’une collection de ces poissons aveugles qui vivent dans les lacs souterrains de Java et que les éruptions volcaniques font, dans certains cas très rares, apparaître à la lumière.
J’estime qu’il est toujours sage de ne pas faire étalage de richesses et une de mes plus grandes joies, quand je quitte Singapour, est de ne plus sentir autour de moi cette atmosphère de curiosité que donne la célébrité.
Au lieu de descendre dans le quartier européen, à l’hôtel des Indes où la table d’hôte réunit le soir les hauts fonctionnaires hollandais et les étrangers de marque, je suivis Ali le Macassar, au sortir du bateau, après les formalités de la douane, dans le vieux Batavia et je pris une chambre non loin du port, dans une pension d’assez minable aspect. Je prétends qu’un homme peut être bien en n’importe quel endroit du monde s’il transporte avec lui une
couverture propre et une moustiquaire sans trou, avec sa cravache, bien entendu, pour le défendre.
Ma chambre était à un premier étage assez élevé qui donnait sur une cour d’où montait une haleine fétide provenant d’un amoncellement de détritus décomposés par l’extrême chaleur. Un coolie malais venait à peine de déposer ma valise dans la chambre, quand, incommodé par le caractère immonde de l’odeur, je m’approchai de la fenêtre pour la fermer.
A cet instant, un parfum délicat, subtil, féminin, une émanation de chevelure et de soie embaumée s’éleva jusqu’à moi, remplaçant l’odeur immonde. Surpris, j’ouvris la fenêtre et je me penchai.
Il y avait une échelle contre le mur et d’une fenêtre voisine une jeune fille venait de sortir et descendait légèrement les degrés. C’était une Européenne qui semblait vêtue avec élégance. Je remarquai le châle chinois aux broderies éclatantes qui s’enroulait autour de son corps en le dessinant, une torsade de cheveux noirs noués négligemment, et une main d’une petitesse extrême qui tenait le barreau de l’échelle.
Au bruit que je fis, elle leva la tête. J’aperçus un visage d’une perfection extraordinaire, un visage un peu enfantin et ingénu avec d’immenses yeux de flamme à la fois purs et terribles. Il y eut sur ce visage une expression de surprise, d’allégresse aussi, je crois, puis une gaîté y parut. J’entendis un éclat de rire, lancé comme un bouquet de fleurs de cristal dans la répugnante cour et la jeune fille disparut.
Je refermai la fenêtre et je méditai sur l’extraordinaire présence d’une jeune fille de cette qualité dans le bouge pour Chinois moyens et maîtres d’équipage en congé où je me trouvais. Pourquoi cette jeune fille descendait-elle par une échelle au lieu de prendre l’escalier ? Fuyait-elle un danger malgré son allure paisible ? Me connaissait-elle ?
La beauté de ses traits m’avait causé une profonde impression. Les yeux fixés sur la fenêtre, je demeurai immobile assez longtemps. Tout d’un coup je perçus le bruit de ma porte qu’on
ouvrait. Je crus que c’était Ali le Macassar et je ne bougeai pas. J’eus une sensation de froid dans le cou à côté de l’oreille.
Je pensai tout de suite à la chute d’un de ces odieux lézards de maison tombé du plafond sur mon épaule. Je fis un mouvement et je vis qu’il y avait, non un lézard, mais le canon d’un revolver qui m’effleurait. Un homme inconnu était entré et tenait ce revolver à la hauteur de ma tête.
Cet homme n’était pas jeune. Il portait une barbe et je vis au tremblement de sa main et à ses yeux exorbités qu’il était complètement hors de lui.
La possibilité d’être frappé tout à coup par la mort m’a toujours donné dans le danger la singulière sensation du vide absolu, de la suppression de toute matière autour de moi.
— Je viens chercher Eva, me cria l’homme du fond d’un espace illimité.
Et comme il agitait son revolver, je remarquai qu’il était maigre et extrêmement velu.
— Eva ! appela-t-il encore.
Brusquement il se baissa et regarda sous le lit.
— Je ne sais pas de qui vous voulez parler, dis-je en regrettant de ne pas avoir profité de cette seconde d’inattention pour bondir sur lui et le désarmer.
— Vous avez rougi, reprit-il, vous savez où elle est, mais je la retrouverai.
Effectivement j’avais rougi, ayant reçu de ma mère ce signe d’une sensibilité supérieure.
J’allais protester contre le caractère insensé de ses questions et de ses menaces, lorsque les murs se rapprochèrent brusquement autour de moi, la matière avec ses qualités compactes m’environna de nouveau. Le danger venait de disparaître en même temps que le revolver et que l’homme.
J’entendis le bruit d’une clef qu’on tournait. Alors mon indignation éclata. Je me précipitai sur la porte et la secouai en vain. L’inconnu
m’avait enfermé et venait d’emporter la clef.
Je rouvris la fenêtre et d’une voix retentissante j’appelai Ali le Macassar qui devait occuper une chambre à quelque distance de la mienne. Il y était heureusement encore. Sa silhouette taciturne s’encadra dans la tristesse du mur et cette vue me calma.
Ali était une épaisse brute aux actions mesurées et à la compréhension difficile. Il avait une grande admiration pour moi et son dévouement m’était assuré. Il agissait avec lenteur et supportait sans peine les injures qui lui étaient adressées personnellement. Mais il ne fallait pas que moi, son maître, je fusse mis en cause en sa présence, car il tombait alors dans des colères insensées et accomplissait des actions d’une violence inouïe. Cette perte de la raison dans la colère est du reste une curieuse particularité de presque tous les habitants de l’île de Macassar.
Je me représentai en une seconde le drame qui pouvait se dérouler dans l’hôtel si Ali furieux se mettait en tête de venger son maître prisonnier. Je me mis à rire en le voyant et comme s’il s’agissait d’une plaisanterie, je le priai de descendre et d’appliquer l’échelle contre ma fenêtre en lui disant que c’était par ce moyen que je voulais sortir. Il ne trouva là rien de saugrenu et il disparut.
Mais il y eut, au même instant, un cri terrible dans la cour. Je vis l’homme maigre apparaître, saisir l’échelle et la briser d’un seul coup sous son pied avec une vigueur qui faillit me faire crier bravo ! Ali devait descendre l’escalier pendant ce temps et les deux hommes allaient, à coup sûr, en venir aux mains sans qu’il me fût possible de faire quoi que ce soit.
Je songeai sérieusement à sauter au risque de me briser un membre. Ma porte se rouvrit avec fracas et l’insensé se précipita à nouveau dans ma chambre. Il avait toujours son revolver à la main, mais comme il ne le braquait pas sur moi et que la situation était moins dangereuse, je cherchai l’occasion de le saisir à bras-lecorps. Derrière lui, surgit Ali qui, ayant vu l’échelle brisée, venait demander mes ordres.
Je compris que la sagesse était dans l’observance d’un calme parfait et que tout, même une humiliation, valait mieux que la perte de raison d’Ali.
— Laisse-nous, dis-je avec douceur. Monsieur est venu me faire une visite et j’ai à causer avec lui.
Ali referma la porte. Il y eut le bruit métallique du revolver sur le plancher. L’homme s’était laissé tomber sur un siège et il pleurait abondamment. Les larmes coulaient dans sa barbe qui, je le remarquai alors, devait être grisonnante mais avait été teinte en un noir trop vif.
— Elle s’est enfuie par l’échelle, balbutia-t-il. Je vous demande pardon, monsieur Mais je vous en supplie, laissez-la moi. Je ne peux pas vivre sans elle.
— J’ai vu, en effet, une jeune fille, répondis-je, descendre tout à l’heure d’une manière inusitée. Mais je vous donne ma parole d’honneur que je ne la connais pas et que je ne suis pour rien dans son départ.
Ce qu’il y a de plus émouvant dans les larmes c’est que celui qui les répand a subitement envie de se moucher et que cela lui fait faire une grimace pitoyable. L’homme que j’avais devant moi était un malheureux qui ne m’inspirait que du mépris.
Je le mis à son aise en lui renouvelant l’assurance que la créature que j’avais aperçue sur l’échelle m’était parfaitement inconnue.
— Et c’est bien dommage ! pensai-je en faisant hypocritement un geste qui signifiait que je n’attachais aucune importance aux femmes, en général.
Alors il me raconta qu’il s’agissait d’une noble jeune fille hollandaise qu’il avait séduite. Naturellement, la discrétion la plus élémentaire l’empêchait de me dire son nom.
Cette jeune fille s’était rendue à Singapour pour les affaires de son père. Quand elle était revenue, elle était changée à son égard.
Elle parlait sans cesse de Rafaël, dompteur et propriétaire d’un grand magasin d’animaux, qu’elle avait vu là-bas.
— Les femmes, ajouta-t-il, en me fixant de ses yeux gris, comme pour me faire avouer la vérité, travestissent souvent les choses pour vous rendre jaloux. Vous avez passé une nuit près d’elle, dans une réunion… peut-être une fumerie d’opium…
Je riais intérieurement de l’audace de ce malheureux homme qui voulait lutter par le regard avec moi. Lutter avec l’œil du dompteur !
Mais alors, au fond de ma mémoire, surgit brusquement un souvenir. Une fumerie d’opium !
Je revis la bosse du chameau et la porte du Tigre que j’avais passée un soir en compagnie de mon cousin de Goa.
A travers les formes couchées auprès des petites lampes, j’avais distingué confusément un visage de femme. La jeune fille à l’échelle avait franchi avant moi la vieille porte en bois sculpté, et elle m’avait vu dans ce lieu vil, parmi les nuages de la fumée détestable. Elle était là, dans quelle compagnie et pourquoi ?
Je l’ignorais. Et à partir de ce moment, la créature qui s’appelait Eva, la délicieuse jeune fille au châle chinois, fut indissolublement liée dans mon esprit à une idée de tigre, de tigre sculpté dans une porte. Mais ceci n’était qu’un commencement, car elle devait être liée à tout jamais à une idée de tigre vivant, de tigre javanais et de quel tigre !
J’allais rougir. J’allais me trahir. Je me détournai et j’affirmai avec force qu’il y avait quelque méprise ou peut-être une de ces inventions habituelles aux femmes pour éveiller la jalousie, hypothèse que mon interlocuteur venait du reste de formuler luimême.
Il me crut, il se leva et passa à plusieurs reprises sa main dans sa barbe qui était mouillée. Il me renouvela ses excuses. C’était la vue de l’échelle qui avait éclairé son esprit.
En constatant la disparition d’Eva, qu’il avait, une heure avant, laissée dans sa chambre, il était descendu précipitamment pour
questionner l’hôtelier. Celui-ci ne put le renseigner, mais lui apprit, en s’en glorifiant, l’arrivée de Rafaël, le fameux dompteur de Singapour. L’hôtelier avait dit Rafaël tout court, car on nomme volontiers les hommes célèbres par leur petit nom seulement. Il pensa que cette arrivée, qui coïncidait avec le brusque départ de la jeune fille, ne pouvait être fortuite. Il se dit que j’étais venu la lui prendre et il m’assura qu’il était décidé à nous donner la mort à tous deux et à se tuer après.
Je me contentai de sourire. La pitié triomphait en moi.
Ce pauvre homme maigre, qui était d’origine italienne et qui s’appelait Giovanni, me fit un résumé naïf de sa vie qui n’avait pour moi aucun intérêt. Il était second de navire et ce titre lui paraissait très important. C’était son amour qui le retenait à Batavia et qui lui avait fait refuser plusieurs offres brillantes d’armateurs.
Il ajouta que les femmes avaient toujours joué le rôle principal dans sa vie et alors il se mit à se caresser la moustache et à la relever d’une façon complètement ridicule.
Il avait l’air fort pauvre. L’hôtel où il était descendu en était la preuve et cette preuve se complétait par l’aspect de ses souliers qui avaient l’air très anciens. J’eus envie de lui offrir de l’argent, mais je n’osai, craignant de le blesser. Il fut convenu que je l’aiderais dans la recherche d’Eva et nous nous quittâmes bons amis.
Je n’aspirais qu’à ne plus en entendre parler et à m’occuper des poissons aveugles, habitants des lacs souterrains de Java. Mais ma destinée était écrite à côté de celle d’Eva et par conséquent de la sienne.
Cet Italien, second de navire, n’était qu’un misérable calomniateur, un inventeur de mensonges étranges. Il vint me l’avouer lui-même quelques jours après, au moment où je déployais la moustiquaire pour faire la sieste du milieu de la journée.
Il avait calomnié la charmante Eva et il en avait du remords. Elle n’avait jamais été sa maîtresse, il me le jurait sur l’honneur. Cette jeune fille était absolument pure. Elle n’était venue le voir que pour une affaire, car elle s’occupait des affaires de son père, et si elle
était sortie de sa chambre au moyen d’une échelle, c’était par fantaisie et par goût naturel du sport. Lui, poussé par une inqualifiable vanité, avait voulu faire croire à une liaison avec elle. Il m’en demandait pardon humblement.
Durant qu’il parlait, il ne se montrait nullement humble. Il avait, au contraire, l’air arrogant et satisfait. Sa voix avait une intonation volontairement monotone, comme quelqu’un qui récite une leçon et veut donner la sensation qu’il récite une leçon.
Il frisait sa moustache d’une manière tout à fait insupportable et l’extrême chaleur faisait couler sur son visage des gouttes de sueur qui mouillaient sa barbe aussi ridiculement que ses larmes, quelques jours auparavant. Je remarquai que cette barbe avait été teinte récemment en un noir éclatant.
— D’ailleurs, j’ai revu Eva, conclut-il en baissant les yeux.
Il ne vit pas le coup d’œil que je jetai sur ma cravache.
— Je vous ai dit ce que je devais vous dire, ajouta-t-il, sur le seuil de la porte.
— Cela me paraît tout à fait vraisemblable, répondis-je avec mauvaise humeur.
Et c’était vrai. J’étais sûr que la merveilleuse Eva n’avait pas appartenu à ce minable individu velu et déjà vieillissant.
En ce temps-là, je pouvais encore avoir une certitude en cette matière, ignorant que les femmes n’ont ni goût, ni dégoût, mais sont les servantes de l’occasion qui passe et les esclaves de ceux qui insistent.
Pourtant je ne m’endormis pas à l’heure brûlante de la sieste. Séparé du monde par le tissu de rêve de la moustiquaire, je voyais les poissons aveugles avec leurs nageoires difformes et leurs phosphorescences diaprées, disparaître dans des ténèbres d’indifférence. Ni l’âge, ni la rayure, ni le prix des panthères ne comptaient pour moi. La ville de Batavia avec ses formidables avenues et ses jardins équatoriaux, celle de Singapour avec ses villas sur pilotis et son triple port, la Malaisie avec ses îles sauvages,
ses volcans et ses forêts vierges, toute la terre que l’on dit ronde et qui a l’air si plate, tournait autour d’un visage de jeune fille qui riait au pied d’une échelle.
Mais ce devait être là ma dernière rêverie paisible. Je l’affirme, c’était encore un homme ordinaire qui faisait la sieste dans cette pauvre chambre d’hôtel, un homme qui n’avait encore en lui que des passions moyennes. Mais celui qui devait être brûlé par une inconcevable haine de l’espèce animale, l’homme du Tigre, ne devait naître qu’un peu plus tard.
L’ÉTRANGE INDIGOTERIE
J’ai toujours plu aux femmes. Mademoiselle Whampoa, la fille du plus riche négociant chinois de Singapour, m’avait, en quelque sorte, fait demander en mariage par son père.
Les Whampoa sont une grande famille de Chine, car il y a dans ce pays des aristocraties d’une ancienneté formidable, dont nous n’avons, nous, Européens, aucune idée. J’avais répondu de façon évasive, parce que si la jeune fille était jolie, bien qu’un peu petite, elle passait pour cultivée et je crois même qu’elle était poète ou quelque chose d’approchant, ce qui la rendait tout à fait impossible pour moi.
Une jeune veuve anglaise, que des spéculations de terrains avaient enrichie, recevait parfois mes visites et les attendait avec impatience. On disait qu’elle avait eu quelques aventures. Mais je n’attache pas d’importance à ces vétilles et je prétends qu’un homme qui est un homme dans le sens élevé du mot ne doit pas s’occuper si la femme qu’il aime a, de-ci, de-là, quelques écarts de conduite. L’essentiel est de les ignorer et de faire claquer sa cravache si quelque sot essaie d’éveiller votre jalousie par des racontars calomnieux.
Je fus passionnément aimé par une rouquine javanaise d’une maison de danse du quartier neuf de Singapour. Je crois bien qu’elle se serait tuée pour moi si je ne m’étais pas très habilement entendu avec sa mère pour la doter et lui faire épouser un pauvre diable qui l’emmena dans l’île Madura.
Je ne fus donc pas surpris de l’impression favorable que j’avais produite sur Eva et je prolongeai mon séjour à Batavia dans l’espoir de la rencontrer. Mais au bout de quelques semaines, n’en ayant
aucune nouvelle, j’allais me rembarquer pour Singapour avec mes poissons aveugles et mes panthères.
Je venais de donner mes ordres à Ali pour le transport des animaux quand, au moment où j’allais sortir de mon modeste hôtel, je me trouvai en présence d’un jeune Javanais, vêtu avec une extrême recherche, qui m’interpella par mon nom.
Ce jeune homme me fut aussitôt antipathique par sa politesse glaciale, ses mains trop soignées, son allure efféminée.
Il portait un sarong de soie et son kolambi bleuâtre avait des broderies orange sur les manches. Contrairement à l’usage de tous les habitants du pays, aucun kriss n’était suspendu à sa ceinture. L’absence du turban ou du mouchoir autour de la tête que prescrit la loi de l’Islam me fit penser qu’il devait être bouddhiste ou professer une de ces bizarres religions hindoues.
Ce jeune homme était du reste un serviteur, un simple serviteur. Il n’avait eu aucune peine, me dit-il, à me découvrir à Singapour, tant il est difficile à certains hommes de vivre cachés.
Il venait de la part de son maître, monsieur Varoga, le propriétaire d’une grande indigoterie située sur les confins du district de Djokjokarta et de celui de Solo, et dont le nom ne m’était du reste pas inconnu.
Il avait franchi la grande distance qui sépare ces régions de Batavia pour me transmettre une invitation. M. Varoga m’invitait à une chasse exceptionnelle. Ses plantations étaient hantées par un tigre d’une taille prodigieuse et d’une audace comme on n’en avait jamais connu.
Les bruits du gong, la lumière des flambeaux, rien ne l’effrayait. On venait de célébrer dans tous les villages de l’île de grandes fêtes en l’honneur de la suppression de l’esclavage sur les possessions hollandaises. M. Varoga avait fait tirer, ce soir-là, cinquante coups d’un petit canon qu’il avait fait venir d’Europe pour ces sortes de cérémonies. Eh bien ! le bruit du canon n’avait pas effrayé le tigre, qui avait enlevé une femme à quelques centaines de pas de l’endroit où le canon tirait.
Les trois villages qui entouraient l’indigoterie étaient terrorisés. On avait inutilement creusé un grand nombre de pièges. M. Varoga était trop âgé pour chasser lui-même. Il avait entendu dire qu’un célèbre spécialiste d’animaux sauvages était de passage à Batavia. C’était sur lui qu’il comptait pour le débarrasser de ce monstre.
Cette proposition était flatteuse et tentante. Il s’y ajoutait l’attrait de la possession du tigre si on le prenait vivant. J’objectai tout de suite la longueur d’un voyage de plus de quatre cents kilomètres à travers les terres. Mais le jeune Javanais sourit avec une ironie qui voulait dire que de telles contingences n’existaient que pour des hommes vulgaires comme moi.
M. Varoga possédait une de ces étonnantes chaloupes à vapeur qui se moquent de l’absence des vents et de la présence des pirates malais sur leurs longs praos, et cette chaloupe me transporterait le lendemain à Samarang où des chevaux nous attendaient. Il suffirait alors de deux étapes pour atteindre l’indigoterie par la grande route de Djokjokarta.
Mes affaires me rappelaient à Singapour où mon employé principal, un homme myope et borné, dirigeait ma maison en mon absence. Je venais d’être avisé par une lettre de lui qu’il était malade et qu’il m’attendait impatiemment.
J’acceptai pourtant la proposition qui m’était faite, par vanité d’abord, l’homme est conduit par sa vanité — ensuite à cause d’un secret et inexplicable pressentiment.
Il fut convenu que j’amènerais Ali et que nous partirions le lendemain. Je hais les animaux, mais les végétaux m’inspirent un violent amour.
Je trouve que les montagnes sont belles à cause de leurs chevelures d’arbres et que les rivières n’ont d’attrait que parce qu’elles baignent des branches feuillues et de fabuleuses racines.
Quand nous eûmes dépassé le massif montagneux de Merbarou et de Mérapi ; quand, à droite et à gauche, le ciel fut coupé par les hautes lignes de forêts vierges barrant l’horizon, je cessai d’être irrité par l’ironie silencieuse du Javanais efféminé, mon cœur se mit à battre et je sentis descendre en moi le calme que me procure toujours une nature désordonnée.
Les aréquiers géants, les bois de teck, les banians centenaires nous enveloppaient de tous côtés et ensevelissaient sous leur voûte la route fragile comme un fil d’argent.
Les villages avaient l’air de poussières de brins de paille et parfois, sous un enchevêtrement de lianes, on apercevait les vestiges d’un temple, un éléphant de pierre, une théorie de colonnes, car l’île de Java, et en particulier cette région, abrita, paraît-il, l’antique civilisation d’un peuple constructeur d’édifices.
Puis la forêt, qui s’était rapprochée au point de nous écraser, recula un peu. Nous traversâmes des plantations de café et d’indigo, des bois de cotonniers. Le soir allait venir et les mouches à feu commençaient à sillonner l’air. Le serviteur javanais se rapprocha de moi et me montra un amoncellement d’ombres que nous allions atteindre.
— Nous sommes arrivés, fit-il.
Il y avait plusieurs banians dont les troncs étaient tellement hauts et d’une épaisseur si énorme qu’une vaste demeure moderne qui était à leur pied avait l’air toute petite.
Je vis des serviteurs courir avec empressement, mais sous la disproportion des arbres ils me firent l’effet d’être des enfants. Une femme, que je pris d’abord pour une naine, était au milieu d’eux.
Comme nous étions arrivés devant le perron, chacun retrouva sa grandeur naturelle et je m’aperçus que la maison était immense. Je mis pied à terre et je reconnus, du reste sans un grand étonnement, dans la femme qui m’avait paru minuscule et qui s’avançait vers moi en souriant avec aisance et en me tendant la main pour m’accueillir, la jeune fille à l’échelle.
Je dis que je n’éprouvai pas un grand étonnement parce que mon pressentiment n’avait fait que se préciser pendant le voyage, surtout dès que les premières ombres des forêts vierges s’étaient étendues à mes côtés, comme s’il y avait une liaison secrète entre cette créature vivante à laquelle je pensais et l’océan des végétaux bienveillants.
L’hospitalité de M. Varoga était royale. N’étais-je pas une sorte de roi des bêtes ?
Une foule de serviteurs me guettait pour combler mes moindres désirs et quand je sortis pour visiter les plantations, je m’aperçus que les indigènes avaient gardé la déplorable habitude ancienne de se prosterner devant les Européens. J’avais toujours envie de leur crier :
— Debout ! Vous êtes des hommes comme moi !
Mais je ne disais rien par respect pour les vieux usages et pour ne pas faire sourire la charmante Eva qui m’accompagnait et me faisait les honneurs de ses domaines.
Je voyais à peine monsieur Varoga. C’était un homme desséché et jaune de teint. Il ne quittait guère sa chambre, où il semblait mystérieusement occupé. Il n’apparaissait qu’aux repas. Il se confondait alors en amabilités, il me répétait que toute sa maison m’appartenait, mais dès que nous étions, sa fille et moi, installés sous la vérandah, il balbutiait quelques mots d’excuse et se hâtait de nous laisser.
Je tins, dès le premier jour, à visiter les pièges que l’on avait creusés pour le tigre. J’en fis enlever les épieux que l’on y met d’ordinaire et sur lesquels il se tue en tombant, car je tenais à le prendre vivant, et je fis modifier avec art la couche de feuilles dont ces pièges étaient recouverts.
J’examinai les lieux où, tour à tour, des bœufs, un cheval et deux femmes avaient été enlevés et je me rendis à tous les endroits du
voisinage où il y avait de l’eau et où le tigre était susceptible d’aller boire.
Eva venait avec moi, le chapeau de feutre sur les yeux et la jupe un peu au-dessus des genoux. Elle me répétait, en fixant sur moi ses immenses yeux enflammés, que rien n’était pressé et que son père et elle tenaient à me garder le plus longtemps possible.
Ali et l’insupportable Javanais, qui s’appelait Djath, nous accompagnaient dans nos courses. Ce Djath affectait toujours d’aller sans armes. Cette affectation était ridicule, car ne serait-ce qu’à cause des innombrables serpents qui peuplent les jungles, un couteau de chasse, au moins, est nécessaire. Mais il disait en souriant qu’il charmait les serpents en les appelant par leur nom.
Par leur nom ! Était-ce possible ? Et Eva, quand je haussais les épaules à ces sottises, m’affirmait que c’était vrai et je la surprenais lui jetant un tendre regard.
Ce Djath affectait encore d’être uniquement occupé, quand nous sortions, à faire un grand bouquet de champakas jaunes et de cette sorte de tubéreuse que les Malais appellent sundal-malam, c’est-àdire « intrigante de nuit », et qui passe pour avoir la propriété de donner à ceux qui en répandent sur leur corps des rêves voluptueux.
Quand nous rentrions, il remettait le bouquet qu’il avait cueilli à Eva. Celle-ci l’emportait aussitôt dans sa chambre, non sans un nouvel échange de regards.
J’en éprouvais une grande colère intérieure que je ne laissais pas voir et j’étais obligé de me rappeler qui j’étais pour ne pas sentir de la jalousie naître en moi.
Deux ou trois fois, comme j’étais seul avec Eva sous la vérandah, elle me dit en me montrant la grande forêt qui se dressait à l’horizon comme une impénétrable muraille :
— Vous savez, il faut bien prendre garde. La forêt de Mérapi n’est pas comme les autres forêts. C’est une des plus anciennes du monde et elle recèle de grands mystères.
Et je m’aperçus que je ne comprenais rien aux êtres et aux choses et que tout était singulier dans ce coin de terre de Java, non loin du mont Mérapi, à l’orée de la forêt de ce nom.
Il y avait un tigre qui rôdait autour des plantations et qui emportait des moutons, des bœufs et même des femmes. Il ne craignait pas le canon, il évitait les pièges et les indigènes qui l’avaient aperçu et que j’interrogeai à son sujet furent unanimes à me le dépeindre comme étant d’une grandeur surnaturelle.
Un jour, comme nous avions pénétré dans la forêt et que nous rentrions à l’heure du soleil couchant, — hâtivement, je dois le dire, parce que les dangers commencent avec la nuit — nous entendîmes un cri, ou plutôt un chant, une sorte de mélopée étrangement évocatrice et qui avait dans ses accents quelque chose de religieux. Je distinguai des paroles chantées qui correspondaient à peu près à ceci :
— Om, Mani, Padmé, Aum !
J’arrêtai mon cheval et je voulus revenir en arrière pour ramener le malheureux, sans doute égaré, qui errait seul dans la forêt, à l’heure où la nuit descend.
Mais Eva secoua la tête et me fit signe de continuer ma route.
— C’est Chumbul, le saint. Il habite très loin, de ce côté, en pleine forêt, et il ne se promène que la nuit.
— S’il sort la nuit, dis-je, comment n’est-il pas mangé par le tigre ou par les autres bêtes sauvages ?
A ces paroles, Eva se mit à rire et Djath, qui était derrière elle, fit de même, comme si j’avais dit une chose infiniment plaisante et invraisemblable.
Et nous repartîmes, tandis qu’au loin retentissait la voix de celui qui, non seulement errait seul, la nuit, dans la forêt, mais encore se signalait aux fauves par ses cris.
La conduite de monsieur Varoga à mon égard, la vie cachée qu’il menait dans sa chambre, me paraissaient énigmatiques, mais cela était encore le mystère qui devait s’expliquer le plus aisément.
Je fus réveillé plusieurs fois la nuit par des grondements formidables qui semblaient partir de l’intérieur de la terre. J’en eus des sueurs froides et dès l’aurore je courus dans la maison en demander l’explication. Ni les maîtres, ni les serviteurs ne s’étaient même aperçus de ces phénomènes. Cela tenait à la nature volcanique du terrain, me fut-il répondu, et rien de fâcheux ne résultait jamais pour les hommes de ces tonnerres souterrains.
Ce qui m’inquiétait le plus, c’était la véritable personnalité d’Eva, le mystère de son sourire, celui des rêveries dans lesquelles elle tombait, celui de ses gaîtés enfantines, celui de sa coquetterie à mon égard.
Elle s’était expliquée en riant, mais très franchement avec moi, au sujet de l’incident de l’échelle et ce qu’elle m’avait dit était marqué au sceau de la vraisemblance.
Son père voulait changer le commandant de la chaloupe à vapeur qui faisait le service de Samarang à Batavia pour ses affaires. Elle était allée voir ce second de navire qu’elle savait sans place en ce moment, pour lui proposer ce poste. Elle avait vu une échelle contre la fenêtre et elle avait trouvé amusant de descendre par ce moyen.
Elle avait appris, ensuite, que ce second était un étrange alcoolique, un maniaque se flattant de bonnes fortunes qui n’existaient que dans son imagination. Elle avait deviné qu’il était venu me trouver. Elle l’avait revu et elle avait exigé qu’il eût avec moi une nouvelle conversation pour démentir ses premiers propos.
Tout cela raconté avec enjouement comme une chose plutôt comique, parce qu’elle révélait l’étonnante psychologie de certains hommes fats, me paraissait véridique et me faisait regretter de ne pas avoir infligé un sévère châtiment au second de navire.
Oui, l’incident de l’échelle n’aurait été nullement compromettant s’il n’y avait pas eu, ensuite, un nouvel incident d’échelle. Le second de navire n’aurait plus existé dans mon esprit si je n’avais pas vu Djath, le Javanais, aux mains trop soignées, grimpant sur une échelle jusqu’à une fenêtre, la fenêtre de la chambre d’Eva.
Je veux dire les événements dans leur succession et comment certains mystères ont reçu une explication plausible, comment d’autres se sont compliqués jusqu’à participer des mystères de la nature même.
Mais le plus grand de tous, je me suis aperçu, par la suite, que je ne pourrai jamais le résoudre, parce que c’est celui qui est dans ma propre âme, dans la variété de ses changements, l’inconnu de ses manifestations et l’abîme intérieur des pensées humaines est plus profond que la mystérieuse forêt de Mérapi et que les chaos souterrains où les volcans puisent leur substance.
