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Mass spectrometry based chemical proteomics First Edition Tao
Mass Spectrometry-Based Approaches for Treating Human Diseases and Diagnostics (Advances in Experimental Medicine and Biology, 1443) 1st Edition Thiago VeranoBraga
University of Hertfordshire Hatfield, Hertfordshire, UK
For further volumes: http://www.springer.com/series/7651
For over 35 years, biological scientists have come to rely on the research protocols and methodologies in the critically acclaimed Methods in Molecular Biology series. The series was the first to introduce the step-by-step protocols approach that has become the standard in all biomedical protocol publishing. Each protocol is provided in readily-reproducible step-by step fashion, opening with an introductory overview, a list of the materials and reagents needed to complete the experiment, and followed by a detailed procedure that is supported with a helpful notes section offering tips and tricks of the trade as well as troubleshooting advice. These hallmark features were introduced by series editor Dr. John Walker and constitute the key ingredient in each and every volume of the Methods in Molecular Biology series. Tested and trusted, comprehensive and reliable, all protocols from the series are indexed in PubMed.
Mass Spectrometry-Based Proteomics
Edited by Kris Gevaert
VIB-UGent Center for Medical Biotechnology, Ghent, Belgium
Editor Kris Gevaert
VIB-UGent Center for Medical Biotechnology
Ghent, Belgium
ISSN 1064-3745ISSN 1940-6029 (electronic)
Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-0716-3456-1ISBN 978-1-0716-3457-8 (eBook) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3457-8
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This Humana imprint is published by the registered company Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature.
The registered company address is: 1 New York Plaza, New York, NY 10004, U.S.A.
Paper in this product is recyclable.
Preface
Selected state-of-the-art protocols for contemporary mass spectrometry-based proteomics are described in this book and can be used by both novices in the field of proteomics as well as specialists.
One protocol describes how the overall proteome coverage is increased by using different proteases. Those interested in the cellular surfaceome will find here a protocol in which an alternative method for surface biotinylation is described. Proteins are organized in larger complexes, which can be studied by different means, including proximity-induced biotinylation, abduction of complexes in viral-like particles, and thermal proteome profiling, protocols for which are provided in this book. Protein functions and localization are very often determined by modifications, and the reader will find updated protocols for identifying protein N-terminal acetylation, protein processing by proteases, protein N-glycosylation, and protein phosphorylation in this book. Over recent years, researchers are increasingly focusing on clinical proteomics, and we have provided protocols for automated preparation of clinical samples, the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded samples, and protocols for the isolation of extracellular vesicles and for the monitoring of selected protein modifications in clinical samples. Finally, we touch upon structural proteomics by providing a state-of-the-art protocol for hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.
Ghent, BelgiumKris Gevaert
1 Increasing the Overall Proteome Coverage by Combining Protein Digestion by Tryp-N and Trypsin 1
Jade I. Hawksworth, Lode Denolf, Evy Timmerman, and Kris Gevaert
2 Cell Surface Biotinylation Using Furan Cross-Linking Chemistry 11 Esperanza Ferna ´ ndez, Laia Miret-Casals, Annemieke Madder, and Kris Gevaert
3 Studying Cellular Dynamics Using Proximity-Dependent Biotinylation: Somatic Cell Reprogramming
Reuben Samson, Francesco Zangari, and Anne-Claude Gingras
4 Virotrap: Trapping Protein Complexes in Virus-Like Particles
George D. Moschonas, Margaux De Meyer, Delphine De Sutter, Evy Timmerman, Petra Van Damme, and Sven Eyckerman
5 Thermal Proteome Profiling for Drug Target Identification and Probing of Protein States
Patricia Sauer and Marcus Bantscheff
6 Improved Coverage of the N-Terminome by Combining ChaFRADIC with Alternative Proteases
Xuehui Jiang, Ying Lao, Victor Spicer, and Rene´ P. Zahedi
7 Sensitive and High-Throughput Exploration of Protein N-Termini by TMT-TAILS N-Terminomics 111
Konstantinos Kalogeropoulos, Louise Bundgaard, and Ulrich auf dem Keller
8 The Global Acetylation Profiling Pipeline for Quick Assessment of Protein N-Acetyltransferase Specificity In Cellulo
Thierry Meinnel, Jean-Baptiste Boyer, and Carmela Giglione
9 Systems-Wide Site-Specific Analysis of Glycoproteins
Kathirvel Alagesan and Emmanuelle Charpentier
10 Targeted Profiling of Protein Phosphorylation in Plants
Xiangyu Xu, Kris Gevaert, Ive De Smet, and Lam Dai Vu
11 Automated Sample Preparation for Mass Spectrometry-Based Clinical Proteomics
Torsten Muller, Mauro A. Cremonini, Georg Kliewer, and Jeroen Krijgsveld
12 Proteomics-Based Analysis and Diagnosis of Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Amyloidosis Samples 213 Delphi Van Haver, Ame´lie Dendooven, and Francis Impens
13 A Robust and Clinically Applicable Sample Preparation Protocol for Urinary Extracellular Vesicle Isolation Suitable for Mass Spectrometry-Based Proteomics 235
Leyla A. Erozenci, Irene V. Bijnsdorp, Sander R. Piersma, and Connie R. Jimenez
14 Density-Based Fractionation of Cell-Conditioned Medium to Prepare Proteomics Grade Extracellular Vesicles
Quentin Roux, Sarah Deville, and An Hendrix
15 Mass Spectrometry-Based Analysis of Histone Posttranslational Modifications from Laser Microdissected Samples 271 Roberta Noberini and Tiziana Bonaldi
16 Phosphoproteomics After Guanidinium Thiocyanate Extraction of Tissue Biopsies .
Frank Rolfs, Richard R. de Goeij-de Haas, Jaco C. Knol, Sander R. Piersma, and Connie R. Jimenez
17 Probing Antibody Structures by Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry 303 Zuzana Kalaninova ´ , Luka ´ s ˇ Fojtı ´ k, Josef Chmelı ´ k, Petr Nova ´ k, Michael Volny ´ , and Petr Man
Contributors
KATHIRVEL ALAGESAN • Max Planck Unit for the Science of Pathogens, Berlin, Germany
ULRICH AUF DEM KELLER • Department of Biotechnology and Biomedicine, Technical University of Denmark, Lyngby, Denmark
MARCUS BANTSCHEFF • Cellzome GmbH, GlaxoSmithKline (GSK), Heidelberg, Germany
IRENE V. BIJNSDORP • Department of Urology, Amsterdam UMC, Location VUMC, Amsterdam, The Netherlands
TIZIANA BONALDI • Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy; Department of Oncology and Haematology-Oncology, University of Milano, Milan, Italy
JEAN-BAPTISTE BOYER • Universite´ Paris Saclay, CEA, CNRS, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), Gif-sur-Yvette, France
LOUISE BUNDGAARD • Department of Biotechnology and Biomedicine, Technical University of Denmark, Lyngby, Denmark
EMMANUELLE CHARPENTIER • Max Planck Unit for the Science of Pathogens, Berlin, Germany; Institute for Biology, Humboldt University, Berlin, Germany
JOSEF CHMELI ´ K • Institute of Microbiology of the Czech Academy of Sciences, Prague, Czech Republic
MAURO A. CREMONINI • Agilent Technologies Italy, Milan, Italy
RICHARD R. DE GOEIJ-DE HAAS • Department Medical Oncology, OncoProteomics Laboratory, Cancer Center Amsterdam, Amsterdam UMC, Location VUmc, Amsterdam, The Netherlands
MARGAUX DE MEYER • VIB-UGent Center for Medical Biotechnology, Ghent, Belgium; Department of Biochemistry and Microbiology, Ghent University, Ghent, Belgium; Department of Biomolecular Medicine, Ghent University, Ghent, Belgium; iRIP Unit, Department of Biochemistry and Microbiology, Ghent University, Ghent, Belgium
IVE DE SMET • Ghent University, Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Ghent, Belgium; VIB Center for Plant Systems Biology, Ghent, Belgium
DELPHINE DE SUTTER • VIB-UGent Center for Medical Biotechnology, Ghent, Belgium; Department of Biomolecular Medicine, Ghent University, Ghent, Belgium
AME ´ LIE DENDOOVEN • Department of Pathology, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium; Laboratory for Experimental Medicine and Pediatrics, Antwerp University, Edegem, Belgium
LODE DENOLF • VIB-UGent Center for Medical Biotechnology, Ghent, Belgium; Department of Biomolecular Medicine, Ghent University, Ghent, Belgium
SARAH DEVILLE • Laboratory of Experimental Cancer Research, Department of Human Structure and Repair, Ghent University, Ghent, Belgium; Cancer Research Institute Ghent, Ghent, Belgium
LEYLA A. EROZENCI • Department of Medical Oncology, OncoProteomics Laboratory, Cancer Center Amsterdam, Amsterdam UMC, Location VUMC, Amsterdam, The Netherlands; Department of Urology, Amsterdam UMC, Location VUMC, Amsterdam, The Netherlands
SVEN EYCKERMAN • VIB-UGent Center for Medical Biotechnology, Ghent, Belgium; Department of Biomolecular Medicine, Ghent University, Ghent, Belgium
ESPERANZA FERNA ´ NDEZ • VIB-UGent Center for Medical Biotechnology, Ghent, Belgium; Department of Biomolecular Medicine, Ghent University, Ghent, Belgium
LUKA ´ S ˇ FOJTI ´ K • BioCeV-Institute of Microbiology of the Czech Academy of Sciences, Vestec, Czech Republic; Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Prague, Czech Republic
KRIS GEVAERT • VIB-UGent Center for Medical Biotechnology, Ghent, Belgium; Department of Biomolecular Medicine, Ghent University, Ghent, Belgium
CARMELA GIGLIONE • Universite´ Paris Saclay, CEA, CNRS, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), Gif-sur-Yvette, France
ANNE-CLAUDE GINGRAS • Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health, Toronto, ON, Canada; Department of Molecular Genetics, University of Toronto, Toronto, ON, Canada
JADE I. HAWKSWORTH • VIB-UGent Center for Medical Biotechnology, Ghent, Belgium; Department of Biomolecular Medicine, Ghent University, Ghent, Belgium
AN HENDRIX • Laboratory of Experimental Cancer Research, Department of Human Structure and Repair, Ghent University, Ghent, Belgium; Cancer Research Institute Ghent, Ghent, Belgium
FRANCIS IMPENS • VIB-UGent Center for Medical Biotechnology, Ghent, Belgium; Department of Biomolecular Medicine, Ghent University, Ghent, Belgium; VIB Proteomics Core, Ghent, Belgium
XUEHUI JIANG • Manitoba Centre for Proteomics and Systems Biology, Winnipeg, MB, Canada
CONNIE R. JIMENEZ • Department of Medical Oncology, OncoProteomics Laboratory, Cancer Center Amsterdam, Amsterdam UMC, Location VUMC, Amsterdam, The Netherlands
ZUZANA KALANINOVA ´ • BioCeV-Institute of Microbiology of the Czech Academy of Sciences, Vestec, Czech Republic; Department of Biochemistry, Faculty of Science, Charles University, Prague, Czech Republic
KONSTANTINOS KALOGEROPOULOS • Department of Biotechnology and Biomedicine, Technical University of Denmark, Lyngby, Denmark
GEORG KLIEWER • German Cancer Research Center (DKFZ), Heidelberg, Germany; Heidelberg University, Medical Faculty, Heidelberg, Germany
JACO C. KNOL • Department Medical Oncology, OncoProteomics Laboratory, Cancer Center Amsterdam, Amsterdam UMC, Location VUmc, Amsterdam, The Netherlands
JEROEN KRIJGSVELD • German Cancer Research Center (DKFZ), Heidelberg, Germany; Heidelberg University, Medical Faculty, Heidelberg, Germany
YING LAO • Manitoba Centre for Proteomics and Systems Biology, Winnipeg, MB, Canada
ANNEMIEKE MADDER • Organic and Biomimetic Chemistry Research Group, Department of Organic and Macromolecular Chemistry, Ghent University, Ghent, Belgium
PETR MAN • BioCeV-Institute of Microbiology of the Czech Academy of Sciences, Vestec, Czech Republic
THIERRY MEINNEL • Universite´ Paris Saclay, CEA, CNRS, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), Gif-sur-Yvette, France
LAIA MIRET-CASALS • Organic and Biomimetic Chemistry Research Group, Department of Organic and Macromolecular Chemistry, Ghent University, Ghent, Belgium
GEORGE D. MOSCHONAS • VIB-UGent Center for Medical Biotechnology, Ghent, Belgium; Department of Biochemistry and Microbiology, Ghent University, Ghent, Belgium
TORSTEN MU ¨ LLER • German Cancer Research Center (DKFZ), Heidelberg, Germany; Heidelberg University, Medical Faculty, Heidelberg, Germany
ROBERTA NOBERINI • Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy
PETR NOVA ´ K • BioCeV-Institute of Microbiology of the Czech Academy of Sciences, Vestec, Czech Republic
SANDER R. PIERSMA • Department of Medical Oncology, OncoProteomics Laboratory, Cancer Center Amsterdam, Amsterdam UMC, Location VUMC, Amsterdam, The Netherlands
FRANK ROLFS • Department Medical Oncology, OncoProteomics Laboratory, Cancer Center Amsterdam, Amsterdam UMC, Location VUmc, Amsterdam, The Netherlands
QUENTIN ROUX • Laboratory of Experimental Cancer Research, Department of Human Structure and Repair, Ghent University, Ghent, Belgium; Cancer Research Institute Ghent, Ghent, Belgium
REUBEN SAMSON • Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health, Toronto, ON, Canada; Department of Molecular Genetics, University of Toronto, Toronto, ON, Canada
VICTOR SPICER • Manitoba Centre for Proteomics and Systems Biology, Winnipeg, MB, Canada
EVY TIMMERMAN • VIB-UGent Center for Medical Biotechnology, Ghent, Belgium; Department of Biomolecular Medicine, Ghent University, Ghent, Belgium; VIB Proteomics Core, Ghent, Belgium
PETRA VAN DAMME • Department of Biochemistry and Microbiology, Ghent University, Ghent, Belgium; iRIP Unit, Department of Biochemistry and Microbiology, Ghent University, Ghent, Belgium
DELPHI VAN HAVER • VIB-UGent Center for Medical Biotechnology, Ghent, Belgium; Department of Biomolecular Medicine, Ghent University, Ghent, Belgium; VIB Proteomics Core, Ghent, Belgium
MICHAEL VOLNY ´ • BioCeV-Institute of Microbiology of the Czech Academy of Sciences, Vestec, Czech Republic
LAM DAI VU • Ghent University, Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Ghent, Belgium; VIB Center for Plant Systems Biology, Ghent, Belgium; VIB-UGent Center for Medical Biotechnology, Ghent, Belgium; Department of Biomolecular Medicine, Ghent University, Ghent, Belgium
XIANGYU XU • Ghent University, Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Ghent, Belgium; VIB Center for Plant Systems Biology, Ghent, Belgium
RENE ´ P. ZAHEDI • Manitoba Centre for Proteomics and Systems Biology, Winnipeg, MB, Canada; Department of Internal Medicine, University of Manitoba, Winnipeg, MB, Canada; Department of Biochemistry and Medical Genetics, University of Manitoba, Winnipeg, MB, Canada; CancerCare Manitoba Research Institute, Winnipeg, MB, Canada
FRANCESCO ZANGARI • Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health, Toronto, ON, Canada; Department of Molecular Genetics, University of Toronto, Toronto, ON, Canada
Increasing the Overall Proteome Coverage by Combining Protein Digestion by Tryp-N and Trypsin
Jade I. Hawksworth, Lode Denolf, Evy Timmerman, and Kris Gevaert
Abstract
Mass spectrometry-based proteomics combining more than one protease in parallel facilitates the identification of more peptides and proteins than when a single protease is used. Trypsin cleaves proteins C-terminally to arginine and lysine, while its mirroring protease Tryp-N cleaves N-terminally to the same amino acids. Here, we combine trypsin and Tryp-N with the commercially available S-Trap columns, which purify protein samples and catalyze digestion. Comparison of trypsin or Tryp-N coupled with S-Trap columns demonstrates plasma and cell lysate proteins unique to one protease. We thus suggest the use of both proteases in a complementary manner to obtain deeper proteome coverage.
Key words Proteases, Trypsin, Tryp-N, S-Trap, Mass spectrometry
1 Introduction
Bottom-up proteomics consists of proteome digestion using a (specific) protease, followed by liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis of the resulting peptide mixture, and identification of proteins through reconstitution of peptide sequences using bioinformatics [1]. By far, the most commonly used protease in bottom-up proteomics is trypsin, which cleaves C-terminally to arginine and lysine (Fig. 1). However, there is evidence that the use of multiple proteases with different specificities facilitates the identification of more peptides and more proteins, thus leading to a more complete proteome coverage [2]. The recently described protease Tryp-N, which cleaves N-terminally and thus not C-terminally to arginine and lysine (Fig. 1), was repor ted to be complimentary to trypsin [3, 4]. Comparison of digestions by trypsin or Tryp-N determined that more proteins could be identified using a combination of both proteases than with trypsin alone [4]. Tryp-N could particularly be useful for the study of N-terminally acetylated peptides, as non-N-terminal
Fig. 1 Cleavage sites for trypsin and Tryp-N. This exemplar protein Costars Family Protein ABRACL was identified in MCF7 cell lysate. Potential trypsin cleavage sites are denoted by a blue arrow, while potential Tryp-N cleavage sites are denoted with an orange arrow. In this exemplar protein, the Tryp-N N-terminal peptide (orange) was found, but the tryptic N-terminal peptide was not. R = arginine, K = lysine
peptides generated upon Tryp-N digestion are more basic due to the presence of both a primary alpha-amino group and a N-terminal basic amino acid, which are thereby efficiently separated from N-terminally acetylated peptides via a simple strong cation exchange (SCX) step at acidic pH [5]. N-terminal protein modifications such as N-terminal acetylation are of high biological relevance as these direct protein location, activity, and degradation. Not surprisingly, methods for N-terminal peptide enrichment have been published [6], but further protocols could still contribute to the field. Tryp-N has also been validated for use on the Alzheimer’s disease-related protein tau, and over 80% of peptides found were unique to either trypsin or Tryp-N [3].
Here, Tryp-N was combined with the S-Trap protocol [7, 8], a commercially available column that can be used on many sample types. While Tryp-N-digested peptides tend to contain more missed cleavage sites than tryptic peptides [3], the S-Trap facilitates more effective protease activity and fewer missed cleavages than digestion in solution [7], thus making it ideal to be used in conjunction with Tryp-N.
In brief, in this method proteins are reduced and alkylated and then captured on the S-Trap column (Fig. 2). Using a simple on-column protocol, proteins are washed, digested, peptides eluted, and dried prior to analysis by LC-MS/MS. The S-Trap washing steps remove the need for further sample purification, and the S-Trap protocol is both quick and simple. MS analysis of Tryp-N-digested peptides identifies about 70% as many proteins as trypsin when digestion takes place in solution [4]; however, we found a similar number of proteins using trypsin and Tryp-N when digestion took place in conjunction with the S-Trap (Fig. 3). Both proteases identified unique proteins and peptides, while N-terminally acetylated peptides were only found with Tryp-N, supporting a role for Tryp-N to be used in parallel to trypsin.
Fig. 2 Experimental design. After reduction and alkylation in lysis buffer, full length proteins and proteases are captured in the pores within the S-Trap. This affinity is lost after digestion with trypsin or Tryp-N and the resulting peptides are eluted off the column in three stages
Fig. 3 Tryp-N and trypsin digestion of an MCF-7 cell lysate and human plasma identify shared and unique proteins and peptides. For a comparison of the proteins identified with trypsin (blue) or Tryp-N (yellow), proteins which were identified in at least two of three technical replicates are visualized in a Venn diagram. On a peptide level, both total peptides and unique N-terminally acetylated (Nt-ace) peptides with a start position of 1 or 2 were counted and visualized
2 Materials
All organic solvents and reagents are liquid chromatography grade and analytical grade, respectively. All water must be ultrapure, with a maximum resistance of 18.2 mΩ/cm at 25 °C. Wherever percentages are stated for buffers, the remainder of the buffer should be
2.1 Sample Preparation
2.2 Digestion Buffers
made up with water. Where solutions of two densities are combined, the buffer should be made up to its final stated volume in a measuring cylinder or volumetric flask.
1. 100 mM sodium hydroxide (NaOH): mix 3.99 mg NaOH powder with 1 mL water in a plastic container (see Note 1).
2. Reduction buffer: 120 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP). Mix 34.4 mg of TCEP powder into 1 mL of water. Use 100 mM NaOH and a pH meter to adjust the pH of the solution from 2.5 to pH 8.0–8.5 (see Note 2). Aliquot remaining TCEP out into small volumes and store at -20 °C.
3. Alkylation buffer: 625 mM iodoacetamide (IAA). Mix 57.8 mg IAA into 0.5 mL of water (see Note 3).
1. Trypsin digestion buffer: 0.25 μg/μL trypsin. Resuspend 20 μg trypsin gently on ice in 80 μL of 25 mM TEAB (see Note 4).
2. RapiGest solution: Dissolve 1 mg vial of RapiGest in 100 μL MQ water (see Note 5).
3. Tryp-N digestion buffer: 0.25 μg/μL Tryp-N, 0.1% RapiGest, 1 mM CaCl2, and 50 μM ZnCl2. Add 40 μL of 0.5 μg/μL Tryp-N and 8 μL 1% RapiGest to 32 μL MQ water (see Note 6).
2.3 S-Trap Protocol
2.4 Mass Spectrometry
2.5 Equipment
1. Lysis buffer: 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 100 mM triethylammonium bicarbonate (TEAB). Dissolve 10 μg SDS in 10 μL of 1 M TEAB and 80 μL of water.
2. Binding/wash buffer: 100 mM TEAB in 90% methanol. To make 8 mL of binding/wash buffer add 0.8 mL of 1 M TEAB into 7.2 mL of methanol (see Note 7).
3. Elution buffer 1: 50 mM TEAB. Combine 15 μL of 1 M TEAB with 285 μL of water.
1. Calculate the volume of a liquid sample needed for 100 μg protein. Combine with 11.5 μL of lysis buffer. Make the sample up to 23 μL with MQ water. Alternatively, dissolve a cell pellet/ solid sample in 11.5 μL of lysis buffer and 11.5 μL of MQ water (see Note 10).
2. Add 1 μL of 120 mM TCEP. Incubate at 55 °C for 15 min. Cool sample down quickly on ice (see Note 11). The sample must return to room temperature (RT) before continuing with the protocol.
3. Add 1 μL of 625 mM IAA and incubate for 15 min at RT in the dark (see Note 3).
4. Add 2.5 μL of phosphoric acid to the sample and vortex to acidify the sample for a final pH of below 1 (see Note 12).
5. Put each S-Trap into a 2 mL Eppendorf tube for waste flowthrough.
6. Pipette 165 μL of binding/wash buffer onto the S-Trap column, pipetting to the top of the narrow stem (see Note 13).
7. Trap proteins in column by centrifugation at 4000 g for 30 s and recentrifuge again if not all sample enters the S-Trap.
8. Pipette 150 μL binding/wash buffer onto the S-Trap column, and centrifuge at 4000 g for 30 s. Repeat twice more, rotating 180° after each centrifugation step (see Note 14).
9. Centrifuge the S-Trap column at 4000 g for 1 min, which should remove all binding/wash buffer (see Note 15).
10. Move the S-Trap column to a clean 2 mL sample tube.
11. Add 20 μL of digestion buffer to each sample, containing 5 μg protease (see Note 16).
12. Place the cap on the S-Trap without fully tightening the screw top to limit evaporative buffer loss while preventing formation of a vacuum within the S-Trap (see Note 17).
13. Incubate overnight at 37 °C, without agitation (see Note 18).
1. Add 40 μL of elution buffer 1 to the top of the stem of the S-Trap.
2. Centrifuge at 4000 g for 1 min and collect eluate.
3. Add 40 μL of elution buf fer 2 to the top of the stem of the S-Trap.
4. Centrifuge at 4000 g for 1 min and collect eluate.
5. Add 40 μL of elution buffer 3 to the top of the stem of the S-Trap.
3.3 Mass Spectrometry
3.4 Data Analysis
6. Centrifuge at 4000 g for 1 min and collect eluate.
7. Pool eluate from all three steps, dry down under vacuum, and resuspend in suitable MS solvent.
1. Determine the peptide concentration (see Note 19).
2. Load an appropriate amount of the peptide mixture onto the LC column.
3. For LC-MS/MS analysis, we coupled an Ultimate 3000 RSLC nanoLC (Thermo Fisher Scientific) in-line to an Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific) mass spectrometer, equipped with a pneu-Nimbus dual ion source. However, many other MS systems optimized for proteomic analysis would be suitable.
1. Analyze raw files (LC-MS/MS output files) using a suitable software. We use MaxQuant (Max Planck Institute of Biochemistry) and MASCOT (Matrix Science), with settings that are described below, but other software for MS data analysis can be used based on one’s data analysis requirements.
2. In MaxQuant, run two analyses, searching separately for trypsin and Tryp-N peptides (see Note 20). Missed cleavages should be set to 2, and label free quantification (LFQ) on. Set the number of processors to (ideally) the number of samples to allow simultaneous analysis of all samples. Select modifications, and set an appropriate database for peptide and protein identification (see Note 21).
3. MaxQuant output files are filtered in Perseus. After loading LFQ data into the main column, use the function “Filter rows based on categorical column” to remove contaminants and reverse sequences and proteins which were identified by site only. Transform data by log2 and complete statistical analysis depending on data characteristics (see Note 22). Both cell lysate and plasma demonstrate a pool of proteins shared between the proteases and proteins unique to each protease (Fig. 3).
4. N-terminally acetylated peptides can be identified from raw files using MASCOT. For trypsin, the protease is set to “Semi-Tryp,” so only one trypsin digestion site is needed per peptide, and set the parameters for the Tryp-N search similarly. Set missed cleavages to 2. Choose appropriate peptide modifications, MS search settings, and human database for peptide and protein identification (see Note 23).
5. MASCOT output data can be analyzed using any software with data processing and statistical capacity (see Note 24). Here, MASCOT analysis of the raw MS output data demonstrates 31 N-terminal acetylated peptides from the cell lysate proteome found only after Tryp-N digestion, and 3 N-terminal acetylated peptides found in plasma only with Tryp-N (Fig. 3).
4 Notes
1. NaOH must be stored in plastic, at room temperature (RT) and in the dark.
2. A pH of 8.0–8.5 is required for alkylation, and even a small volume of unadjusted TCEP can affect sample pH.
3. IAA is sensitive to light so make up this solution fresh for each experiment, exposing the IAA to as little light as possible. To maintain IAA activity, we transport the fresh solution in an Eppendorf tube wrapped in tin foil. Pipette quickly, and place an inverted ice box/polystyrene box over the whole sample holder as soon as possible.
4. To ensure trypsin is fully suspended, pipette the digestion buffer slowly in and out of the trypsin vial. Freeze any leftover trypsin in aliquots at -20 °C for future use. Avoid freeze-thaw cycles wherever possible as protease activity decreases with each cycle.
5. RapiGest should be stored at 4 °C and used within a week. We have used RapiGest in accordance with the ProtiFi Tryp-N datasheet and as was demonstrated previously [4]. However, in another study, sodium deoxycholate reduced missed cleavages from 14% to less than 6% [5]. A third paper lists no detergent in the Tryp-N digestion buffer [3]. Optimize this step according to the generated data.
6. Tryp-N is a metalloprotease, and metal salts are thus required in the digestion buffer. If Tryp-N is sourced from ProtiFi, the only current commercial supplier, the metal salts CaCl2, and ZnCl2 are already present within the protease buffer at concentrations of 2 mM and 100 μM, respectively, and thus do not need to be added to the digestion buffer.
7. The densities of TEAB and methanol are different. Add roughly half of the TEAB, then the methanol, and make the final volume up to 8 mL with TEAB.
8. Put 100 μL ACN into a measuring cylinder or volumetric flask. Add 150 μL water and then make volume up to 300 μL with ACN.
9. Ultrafiltered water is recommended for MS solvents and samples which will be injected directly into the MS. Any impurities and volatile solvents from previous steps are removed by the S-Trap and drying down, respectively, but any contaminants at this stage can enter the MS instrument.
10. We worked with 100 μg of protein from both plasma and cell lysate. This is the maximum amount of protein recommended for the S-Trap Micro. Other sizes can be used when the mass of
the sample falls outside of 1–100 μg. If a different S-Trap column is used, it is important to appropriately modify the volumes of each buffer when moving to an S-Trap column with a different capacity. When using the S-Trap Micro, it is important that all samples added to the column have a volume of 23 μL. Samples with a larger volume can be loaded in multiple centrifugation steps.
11. If SDS precipitates when the sample is cooled, warm to RT before continuing.
12. The pH must be below 1 for effective sample capture. Add more acid if the pH is above 1. We recommend optimizing this step with your sample type prior to starting an experiment.
13. Add all sample to the S-Trap column, including any insoluble sample.
14. Make a mark on the outside of the lip of the top of the S-Trap. Use this mark to rotate S-Traps by 180° between each centrifugation step. Wash should be optimized for different sample types, e.g., if sample is more viscous, further washing may be needed. The supernatant will be collected in the Eppendorf tube during each wash step, and this liquid needs to be discarded before it touches the bottom of the S-Trap. If the supernatant reaches the bottom of the S-Trap, this will prevent the sample from moving down the column.
15. Centrifuge the S-Trap column again if any liquid is visible above the filter.
16. Proteases and digestion buffers can be optimized, and ProtiFi has tested commonly used proteases for compatibility with the S-Trap.
17. Creating a vacuum prevents buffers from moving through S-Trap. The S-Trap Micro has no pressure vents, so it is important not to tightly lid the columns. Also, the S-Trap filter must not dry out. To prevent this, incubate the samples either in a water bath or in a stationary heat block with several unlidded Eppendorf tubes of water.
18. While the product sheet and one paper recommend shorter, higher temperature digestions for Tryp-N [4], we found 37 °C overnight to be optimal, providing the highest number of peptide and protein identifications. Digestion conditions of 37 °C overnight were also used in references [3, 5].
19. Peptide concentrations can be measured with the Lunatic UV-Vis spectrophotometer (Unchained Labs) [9], our instrument of choice for determining peptide and protein concentration, however the Lunatic spectrophotometer was found be unreliable when preparing samples with the S-Trap protocol. The reason for this remains unknown, but we postulate it may
be due to incompatibility of the S-Trap buffer with the Lunatic chip or instrumentation. Utilizing the LC-MS/MS and columns used within our lab, 1.5 μg peptide provides an optimal TIC of 1.0E08 to 9.9E09.
20. Do not set the number of processors to more than the number of cores available on the computer. When configuring protease searches, choose semi-trypsin or semi-Tryp-N as this allows to identify peptides with only one tryptic/Tryp-N cleavage site. In fact, some N-and C-terminal peptides would only have one tryptic/Tryp-N cleavage site, and not setting this setting to “semi” would remove these from the dataset.
21. In this case, the following protein modifications were set: oxidation (M), acetyl (protein N-term) and carbamidomethyl (C). Set the maximum number of modifications per peptide to 5. We used the Swiss-Prot human database 2022, UPhuman9609.fasta [10].
22. After MaxQuant and Perseus, we compared the number and identity of proteins identified using each protease.
23. Modifications in MASCOT can be set as fixed or variable. In this analysis, carbamidomethylation (C) is a fixed modification, while N-terminal acetylation and oxidation (M) are variable modifications. Set appropriate MS settings according to the mass spectrometer used. In this case, this includes a maximum of two missed cleavages, a MS/MS tolerance of 20 mmu and a peptide tolerance of 10 ppm. An appropriate human database should be chosen for peptide and protein identification; here, this is the same Swiss-Prot human 2022 database as indicated above [10].
24. We use RStudio to count modifications and visualize data from MASCOT. Any program with data visualization tools would be suitable.
Acknowledgments
This work was supported by the Stichting Alzheimer Onderzoek (SAO-FRA, Belgium), awarded to Kris Gevaert.
References
1. Aebersold R, Mann M (2016) Massspectrometric exploration of proteome structure and function. Nature 537(7620): 347 – 355. https://doi.org/10.1038/ nature19949
2. Swaney DL, Wenger CD, Coon JJ (2010) Value of using multiple proteases for largescale mass spectrometry-based proteomics. J Proteome Res 9(3):1323–1329. https://doi. org/10.1021/pr900863u
3. Zhou M, Duong DM, Johnson ECB, Dai J, Lah JJ, Levey AI, Seyfried NT (2019) Mass spectrometry-based quantification of tau in humancerebrospinalfluidusinga
4. Wilson JP, Ipsaro JJ, Del Giudice SN, Turna NS, Gauss CM, Dusenbury KH, Marquart K, Rivera KD, Pappin DJ (2020) Tryp-N: a thermostable protease for the production of N-terminal argininyl and lysinyl peptides. J Proteome Res 19(4):1459–1469. https://doi. org/10.1021/acs.jproteome.9b00713
5. Chang CH, Chang HY, Rappsilber J, Ishihama Y (2020) Isolation of acetylated and unmodified protein N-terminal peptides by strong cation exchange chromatographic separation of TrypN-digested peptides. Mol Cell Proteomics 20:100003. https://doi.org/10.1074/mcp. TIR120.002148
6. Bogaert A, Gevaert K (2020) Protein aminotermini and how to identify them. Expert Rev Proteomics 17(7– 8):581 –594. https://doi. org/10.1080/14789450.2020.1821657
Ludwig KR, Schroll MM, Hummon AB (2018) Comparison of in-solution, FASP, and
S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. J Proteome Res 17(7): 2480 – 2490. https://doi.org/10.1021/acs. jproteome.8b00235
8. HaileMariam M, Eguez RV, Singh H, Bekele S, Ameni G, Pieper R, Yu Y (2018) S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. J Proteome Res 17(9): 2917 – 2924. https://doi.org/10.1021/acs. jproteome.8b00505
9. Maia TM, Staes A, Plasman K, Pauwels J, Boucher K, Argentini A, Martens L, Montoye T, Gevaert K, Impens F (2020) Simple peptide quantification approach for MS-based proteomics quality control. ACS Omega 5(12):6754–6762. https://doi.org/ 10.1021/acsomega.0c00080
10. Uniprot Consortium (2021) UniProt: the universal protein knowledgebase in 2021. Nucleic Acids Res 49(D1):D480–D489. https://doi. org/10.1093/nar/gkaa1100
Chapter 2
Cell Surface Biotinylation Using Furan Cross-Linking Chemistry
Esperanza Ferna ´ ndez, Laia Miret-Casals, Annemieke Madder, and Kris Gevaert
Abstract
A detailed study of the cellular surfaceome poses major challenges for mass spectrometry analysis. Surface proteins are low abundant compared to intracellular proteins, and their inefficient extraction in aqueous medium leads to their aggregation and precipitation. To tackle such problems, surface biotinylation is frequently used to tag surface proteins with biotin, allowing for their enrichment, leading to a more sensitive mapping of surface proteomes. We here detail a new surface biotinylation protocol based on furan-biotin affinity purification to enrich plasma membrane proteins for proteomics. This protocol involves biotinylation of cell surface membrane proteins on viable cells, followed by affinity enrichment using streptavidin beads, trypsin digestion, peptide cleanup, and LC-MS/MS analysis.
Key words Furan-biotin, Affinity purification, Plasma membrane proteins, LC-MS/MS, Proteomics, Sur faceome
1 Introduction
Plasma membrane proteins that are exposed to the extracellular space, collectively called the surfaceome, are responsible for cell homeostasis and the communication of a cell with its environment. The surfaceome is thereby involved in a vast variety of dynamic cellular processes such as ion and molecular transport, signal reception, and transduction, giving cells their shape and intercellular communication. Glycosylation, a modification occurring on over 90% of the surface proteins, when aberrant, is associated with Alzheimer’s disease [1] and cancer [2, 3]. The extracellular matrix, which is in close contact with the surfaceome, is known to be associated with neurodegeneration, cancer metastasis, and other diseases [4–6], and the surfaceome also reflects intracellular changes consequent of disease or infection that may affect protein
abundance, expose alternative proteoforms, and present antigens [7–9].
Surface proteins are a major target for biomedical research due to their utility as cellular markers of pathophysiological changes and their accessibility for pharmaceutical delivery. Membrane proteins comprise about 30% of the mammalian proteome and account for more than 60% of drug targets [10]. However, the identification of surface proteins via mass spectrometry (MS) poses several challenges. Surface proteins have structural domains that span membranes and contain a considerable number of hydrophobic amino acids [11]. Such hydrophobic stretches may promote protein aggregation and precipitation, leading to incomplete protein extraction and underrepresentation of hydrophobic membrane proteins in total cellular lysates. Chaotropes and detergents are used to counter these challenges but are often noncompatible with downstream mass-spectrometric (MS) analysis. Intrinsic properties of membrane proteins may also hinder their identification by MS as long hydrophobic stretches that lack polar residues important for proper ionization, and globular parts and extracellular loops that are heavily modified (e.g., by glycosylations) sterically hinder the proteases’ access, yielding too few and/or too long peptides for identification upon LC-MS/MS analysis [12].
Due to their lower abundance compared with cytosolic proteins, enrichment of surface proteins either exploiting their physicochemical properties, applying affinity-based methods, or chemically labeling the extracellular regions is highly recommended to increase the overall sensitivity of detection. Biotin is one of the most widely used molecules for protein labeling prior to their downstream analysis [13]. It has strong affinity for avidin and streptavidin with a dissociation constant of about 10-15 M, and this interaction is highly resistant to chaotropic agents and high concentrations of detergents and salts [14]. Biotin can be coupled to several chemical moieties that target specific chemical groups, such as free amines of lysine residues and N-termini [15, 16], carboxyl groups of aspartate and glutamate residues and C-termini [17], sulfhydryl group of cysteine residues [18], and glycans [19, 20], all present in surface-exposed regions of membrane proteins. A broadly applied method to label the surfaceome is the use of an N-hydroxysuccinimide ester of biotin (NHS-biotin) that targets the accessible primary amines exposed on surface proteins [15]. Following cell lysis, biotinylated proteins are enriched by pull-down with streptavidin or captured by an anti-biotin antibody and digested into peptides for LC-MS/MS analysis [15, 21].
We here describe the development of a new labeling method for surface-exposed residues (Fig. 1). We explored the possibility of using D-biotin coupled to a furan moiety (furan-biotin) to target surface-exposed lysine, cysteine, and tyrosine residues exposed on membrane proteins. The furan moiety can act as chemical warhead
Fig. 1 Scheme of the method to enrich surface proteins following their linkage to the furan-biotin compound. (1) Furan-biotin is cross-linked to surface proteins; (2) cells are lysed and proteins solubilized following standard procedures; (3) surface proteins, cross-linked to furan-biotin are captured by avidin beads; (4) captured proteins are digested on beads; (5) peptides are cleaned up from undigested proteins and digestion reagents; and (6) eluted peptides are analyzed by LC-MS/MS. NBS: N-bromosuccinimide (red dot, biotin; green dot, avidin; gray dot, bead)
that can be triggered into a keto-enol in a selective and spatiotemporally controlled way upon the production of singlet oxygen [22, 23] or by adding N-bromosuccinimide [24, 25]. Furanoxidation cross-linking has been extensively applied for several intermolecular cross-link applications in vitro: DNA-, RNA-, or PNA-interstrand cross-linking [22, 26], cross-linking DNA-peptide complexes [27], cross-linking of protein partners [28], as well as in vivo on living cells: ligand-cell surface receptor cross-linking [29]. More recently, we used the well-known heterodimeric E3/K3 coiled coil system to identify new nucleophilic partners to react with a furan moiety and form a covalent bond. We demonstrated that lysine, cysteine, and tyrosine are suitable nucleophiles for the keto-enol moiety generated upon furan oxidation [30]. We here show how furan-biotin can be used as a novel chemical label for affinity-based enrichment of plasma membrane proteins (Fig. 1).
The scheme of the synthesis of the furan-biotin compound is shown in Fig. 2.
1. Weigh 879 mg of D-biotin (3.60 mmol, 1.4 equivalents), and transfer it to a three-neck round-bottom flask (capacity 250 mL).
2. Add a magnet to the three-neck round-bottom flask containing the D-biotin.
3. Add 40 mL of dry CH2Cl2 to D-biotin under inert atmosphere (N2 gas) in the three-neck round-bottom flask, and stir it on a magnetic stir plate.
4. Dissolve 227.5 μL of furfurylamine (250 mg, 2.57 mmol, 1 equivalent) in 40 mL of dry CH2Cl2 in a three-neck roundbottom flask (capacity 100 mL) under inert atmosphere (N2 gas).
Fig. 2 Reaction conditions between D-biotin and furfurylamine. A solution of furfurylamine in dry CH2Cl2 was added over a solution of D-biotin in dry CH2Cl2 under an inert atmosphere (N2 gas). Then, HBTU was added and slow addition of DIPEA followed
3.2 Surfaceome Labeling
5. Add the solution of furfurylamine in dry CH2Cl2 via the cannula over the solution of D-biotin in dry CH2Cl2 under inert atmosphere (N2 gas) while stirring.
6. Weigh 1.95 g of HBTU (5.14 mmol, 2 equivalents).
7. Add HBTU in one portion to the furfurylamine and D-biotin mixture in dry CH2Cl2 while stirring under inert atmosphere (N2 gas).
8. Add 1.76 mL of DIPEA (10.28 mmol, 4 equivalents) to the mixture slowly while stirring under inert atmosphere (N2 gas).
9. Stir the reaction mixture at room temperature for 3 h under inert atmosphere (N2 gas) and a white precipitate will appear (urea).
10. Remove the urea from the reaction using the Buchner filter funnel, and collect the filtered liquid in the filter flask.
11. Transfer the filtered liquid in a round-bottom flask, and evaporate CH2Cl2 under reduced pressure using the rotary evaporator.
12. Dilute the crude reaction mixture with ethyl acetate (200 mL), and wash subsequently with saturated aqueous NaHCO3 (150 mL), H2O (150 mL), saturated aqueous NH4Cl (twice 150 mL), H2O (150 mL), and finally brine (150 mL) using the separating funnel.
13. Dry the organic layer over MgSO4, filter, and concentrate under reduced pressure using the rotary evaporator.
14. Purify furan-biotin on an Agilent 218 SEMI-PREP system with a UV-VIS dual wavelength detector using a Prepak cartridge (Delta-pak C18 100A) and a two solvent system, solvents A and B, at a flow rate of 65 mL/min. Elute the column with a linear gradient from 100% solvent A to 100% solvent B over 100 min. Collect and lyophilize the fractions containing furan-biotin (which elute at 32% solvent B, 32 min, see Note 3).
The labeling of the surfaceome can be performed on a wide range of mammalian cells (see Note 4). Here, we provide a method to label MCF7 human breast cancer cells (#HTB-22™, ATCC).
1. Grow mammalian cells in 100 mm Petri dishes until they reach a confluency of about 80%.
2. Remove the growth media, and wash the cells with 10 mL of PBS. Repeat this step twice.
3. Dilute 50 μL of the furan-biotin stock solution in 5 mL of ice-cold PBS, and add it to the cells (see Notes 5 and 6).
4. Immediately add 50 μL of 50 mM NBS in PBS and mix gently.
5. Incubate the plates for 15 min on ice with gentle agitation.
6. Remove the labeling solution and wash three times with 10 mL of ice-cold PBS (see Note 7).
3.3 Biotin Pull-Down 1. Add 1 mL of cell lysis buffer to the plates.
2. Harvest the cells with cell scrapers and collect them in a 1 mL Eppendorf tube.
3. Sonicate at 30 kHz for 2 s and repeat nine times (see Note 8).
4. Put the tubes in an end-over-end rotator for 30 min at 4 °C.
5. Centrifuge the cell lysates for 10 min at 14,000 × g at 4 °C.
6. Collect the supernatant and determine the protein concentration using the Bio-Rad DC Protein Assay Kit.
7. Take a volume of supernatant corresponding to 2 mg of protein material and adjust the volume to 2 mL with lysis buffer.
8. Add the lysate to 50 μL of avidin resin that was washed three times with ice-cold cell lysis buffer (see Note 9).
9. Incubate the lysate with the beads in an end-to-end rotator for 2.5 h at 4 °C.
10. Pellet the beads for 3 min at 800 × g at 4 °C.
11. Discard the supernatant (unbound material) and wash the beads with 1 mL of pull-down washing buffer. Incubate the washing buffer with the beads in an end-over-end rotator for 15 min at 4 °C.
12. Repeat step 11 twice.
13. Wash the beads with 1 mL of urea washing buffer for 15 min at room temperature.
14. Pellet the beads for 3 min at 800 × g at 4 °C, and discard the supernatant.
15. Add 1 mL of reduction and alkylation buffer and incubate the beads in an end-over-end rotator for 20 min at room temperature in the dark (see Notes 10 and 11).
16. Pellet the beads for 3 min at 800 × g at 4 °C and discard the supernatant.
17. Add 1 mL of pull-down washing buffer and mix the beads by inversion.
18. Pellet the beads for 3 min at 800 × g at 4 °C and discard the supernatant.
19. Repeat step 17 with 1 mL of TEAB washing buffer (see Note 12).
20. Pellet the beads for 3 min at 800 × g at 4 °C and discard the supernatant.
3.4 Cleanup of Peptides
21. Resuspend the beads in 200 μL of TEAB buffer and add 1.5 μg of trypsin.
22. Incubate the mixture overnight at 37 °C in a thermo shaker with constant agitation.
23. Pellet the beads and collect the supernatant (containing the peptides) into a LoBind 1.5 mL Eppendorf tube and dry them completely under vacuum.
1. Redissolve the peptides in 120 μL of solvent A.
2. Pre-equilibrate the Bond-Elut OMIX C18 tips with 150 μLof the pre-equilibration solvent by pipetting fresh solvent for five times.
3. Remove the pre-equilibration solvent by pipetting 150 μLof solvent A for 5 times (see Note 13).
4. Pipet the peptide solution for 20 times to let the peptides bind to the C18 beads.
5. Wash the peptides by pipetting 150 μL of solvent A for three times.
6. Elute the peptides by pipetting 70 μL of solvent B for ten times.
7. Repeat step 6, and combine both eluates.
8. Transfer the peptides to an HPLC vial and dry completely under vacuum (see Note 14).
3.5 Data Analysis
3.5.1 Search Settings for Peptides and Proteins
Data analysis includes the creation of peak list files from the recorded mass spectra and their search against a protein sequence database. In our lab, we typically use the MaxQuant search engine with the MaxLFQ algorithm, a generic method for label-free protein quantification [31]. Any other search engine and data analysis package able to perform these tasks can also be used.
1. Set fixed modifications to S-carbamidomethylation of cysteine residues.
2. Set variable modifications to methionine oxidation (sulfoxide) and N-terminal protein acetylation.
3. Set enzyme setting to Tryp/P to identify trypsin cleavages at Arg or Lys that is followed by Pro residue.
4. Set missed cleavages to two (see Notes 15 and 16).
5. Label-free quantification of proteins was set to a minimum of two peptides (razor + unique).
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letzteren ermöglichen die Verbreitung der Fischarten aus einem Flusssystem in ein benachbartes. Hierzu kommen die allmählichen Veränderungen, welchen die Konturen des Festlandes im Laufe der geologischen Perioden unterworfen sind und welche die weitläufige Trennung von ursprünglich eng verbundenen Landmassen bewirken, während sie anderseits Länder, die von einander entfernt gelegen haben, durch Landbrücken mit einander verbinden können. Dies sind die Umstände, welche die Verbreitung der Fischarten des süssen Wassers herbeizuführen pflegen.
[LXXII] Es kommt auch vor, dass einzelne Seefische, welche den Aufenthalt im Süsswasser vertragen, sich gelegentlich in die Ströme verirren und in diesen weit aufwärts schwimmen, z. B. die Flunder, die Lamprete. Indessen sind diese Fische nicht zur Süsswasserfauna zu rechnen, vielmehr als Meerfische zu betrachten.
Das Gebiet, mit dessen Süsswasserfischen wir uns hier zu beschäftigen haben[9], möge so begrenzt sein, dass es die Flusssysteme, welche v o m R h e i n b i s z u r M e m e l an den Südküsten der Nord- und Ostsee münden, sowie das D o n a u g e b i e t [10] umfasst. Ausserhalb des so umschriebenen Gebietes liegt von deutschen Ländern nur der zum Etschgebiet gehörige Teil von Tirol[11]. Das so umgrenzte deutsche Fischgebiet gehört bezüglich seiner Fischarten dem europäisch-nordasiatischen Gebiete an, liegt also nach S c l a t e r s [12] zoogeographischer Einteilung in der paläarktischen Region. Unter den Fischarten des Gebietes sind daher am stärksten vertreten die Familien der in dieser Region so verbreiteten Cypriniden und Salmoniden.
Der Ursprung dieser Familien ist ein fast entgegengesetzter zu nennen. Die C y p r i n i d e n bilden etwa ein Dritteil aller bekannten Süsswasserfische der Gegenwart. G ü n t h e r [13] nimmt an, dass sie ihren Ursprung in der Alpenregion genommen haben, welche die gemässigten und tropischen Teile Asiens scheidet. Von hier breiteten sie sich nach Norden und Süden, nach Osten und Westen aus. Australien nebst Celebes und die übrigen ozeanischen Inseln, sowie
Südamerika wurden von ihnen nicht erreicht. In der Gegend unseres Gebietes fanden sie sich schon in der Tertiärzeit vor. Die S a l m o n i d e n dagegen scheinen ihren Ursprung im kalten Norden genommen und während der Eiszeit sich in einzelnen Vertretern weit nach Süden verbreitet zu haben. Die meisten Arten finden sich auch jetzt in den nördlichen Teilen unserer Hemisphäre und auch die Arten unseres Gebietes beschränken sich fast durchgehends auf kühle Gegenden der Gewässer.
Nicht gering an Zahl sind in unserem Gebiet auch die Vertreter der Familie der P e r c i d e n . Diese Familie ist weit verbreitet im Süsswasser und in den Meerküstengegenden aller Regionen. Ihre Reste findet man in den Ablagerungen seit der Tertiärzeit.
Die Zahl der im Gebiet vertretenen Familien der Fische beträgt vierzehn, aus ihnen gehören hierher vierzig Gattungen mit siebzig bis achtzig Arten. Die überwiegende Zahl gehört, wie überall im Süsswasser zu den K n o c h e n f i s c h e n .
Aus der Familie der P e r c i d e n kommen vor die Gattungen der Barsche, Zander, Streber und Kaulbarsche. Der F l u s s b a r s c h (Perca fluviatilis L.)[LXXIII] ist nicht nur durch das ganze Gebiet verbreitet, sondern findet sich durch ganz Europa, Nordasien und Nordamerika. Er ist bei uns einer der gemeinsten Fische, und fehlt kaum in irgend einem Tümpel. Der Z a n d e r oder S c h i l l (Lucioperca sandra C.) ist ein östlicher Fisch, welcher sich von Osteuropa aus nach Westen verbreitet zu haben scheint. Er findet sich ursprünglich nicht im Rheingebiet und im Gebiet der Weser. Obwohl er in den Seen, in denen er vorkommt, vortrefflich wächst und daher durchaus nicht als ausschliesslicher Flussfisch bezeichnet werden kann, so findet man ihn doch in zahlreichen von den von ihm bewohnten Hauptströmen weit abgelegenen Seen desselben Flussgebietes nicht, was darauf schliessen lässt, dass seine Ausbreitung spät nach dem Ende der Eiszeit, wenn auch während des Bestehens der Verbindung zwischen Elbe, Oder und Weichsel erfolgt ist. Eine nahe verwandte Art ist L. volgensis Pall., die sich in der Donau und ihren grossen ungarischen Nebenflüssen, sowie in den übrigen Flüssen des pontisch-kaspischen Gebietes findet. Ganz auf die Donau, bezw. auf das pontische Gebiet beschränken sich die Arten der S t r e b e r
(Aspro zingel C. und A. streber Syb.), welche gelegentlich auch in den Zuflüssen der obern Donau gefunden werden. Von den Kaulbarschen ist der gemeine K a u l b a r s c h (Acerina cernua L.) durch das Gebiet, durch ganz Mitteleuropa und Sibirien verbreitet. Auch er fehlt bei uns kaum in irgend einem Gewässer. Der ihm verwandte S c h r ä t z e r (Acerina schrätzer L.) dagegen findet sich ausschliesslich in den Zuflüssen des Schwarzen Meeres, also auch im Donaugebiet.
[LXXIII] Da für die vorliegende Abhandlung nur ein im Verhältnis zu dem weiten Umfange des Themas geringer Raum zur Verfügung gestellt werden konnte, so musste auf die Beschreibung der einzelnen Fischarten sowie auf Abbildungen verzichtet werden Man findet mehr oder weniger ausführliche Beschreibungen in den im Litteraturverzeichnis angeführten Werken von Heckel und Kner, von Siebold, Benecke u a ; neuerdings sind mehrere Werke[14] erschienen, welche eine zum Bestimmen der Fischarten bequeme Übersicht der Hauptmerkmale bieten, sowie Auszüge aus dem Beneckeschen Werke[15] , welche die meisten deutschen Fische in guten Abbildungen geben.
Während die Perciden ziemlich gleichmässig im Salzwasser und in den süssen Gewässern verbreitet sind, gehört die Familie der C o t t i d e n fast ausschliesslich dem Meere an. Ein Vertreter dieser Familie, der K a u l k o p f (Cottus gobio L.), lebt auch in den süssen Gewässern der paläarktischen Region, während er im Meere nur in der salzarmen Ostsee östlich von Gotland vorkommt. Wenig verschieden von ihm ist der C. poecilopus Heck.[16], welcher sich in den Gewässern der Karpathen aufhält, sonst nur noch aus den Pyrenäen bekannt ist. Gleichfalls aus den Küstengegenden des Meeres stammt die Familie der S t i c h l i n g e (Gasterosteiden), welche meist Bewohner des Seewassers wie des Süsswassers sind. Wir haben in unseren süssen Gewässern zwei Stichlingsarten, von denen die kleinere (Gasterosteus pungitius) vornehmlich in den süssen Gewässern der Küstengegenden vorkommt, die grössere (G. aculeatus) auch die mehr im Binnenlande belegenen Gewässerteile bewohnt, ohne dass beide Arten indessen sich ausschliessen. Man unterscheidet bei beiden Arten je zwei Varietäten, von denen die
eine (trachurus) an den Seiten des Schwanzes ebenso wie an den Körperseiten Knochenplatten trägt und längere Stacheln besitzt, während die zweite (leiurus) kleinere Stacheln und einen unbewehrten Schwanz hat. Beide Stichlingsarten sind durch das ganze Gebiet mit Ausnahme der Donau und ihrer Zuflüsse verbreitet. Über unser Gebiet hinaus findet sich der kleine Stichling an allen Küsten der Nordmeere, der grosse Stichling durch ganz Europa mit Ausnahme des pontischen Gebietes, sowie in Algier und in Nordamerika[17].
Zu einer echten Seefischfamilie, den D o r s c h e n (Gadoiden), gehört ferner ein anderer unserer verbreitetsten Fische, die A a l q u a p p e oder R u t t e (Lota vulgaris C.), welche sowohl in Flüssen und Bächen, als auch in tieferen Seen der paläarktischen Region sich überall verbreitet findet. Als einzigen Vertreter einer überaus zahlreichen Familie des Süsswassers, der S i l u r i d e n , besitzen wir den We l s oder S c h a i d e n (Siluris glanis L.), der durch Osteuropa bis zum Rhein und in Nordasien verbreitet ist. Die Siluriden bilden nach G ü n t h e r ein Vierteil aller bekannten Süsswasserfische. Ihre Heimat ist anscheinend in Ostindien zu suchen; von dort haben sie sich durch die süssen Gewässer fast aller Gegenden, besonders aber in den Tropen, verbreitet.
Von C y p r i n i d e n [18] besitzt unsere Fauna, abgesehen von lokalen Varietäten und Bastardformen, etwa dreissig Arten. Man hat die zahlreichen Arten der Cypriniden zu Gruppen zusammengestellt. Zu der Gruppe der Cypriniden gehören der Karpfen, die Karausche, die Barben und die Gründlinge.
Der K a r p f e n (Cyprinus carpio L.) stammt anscheinend aus Südosteuropa, wo er im Gebiete des Pontus und des Caspisees bis weit nach Mittelasien hinein wild lebt. In Europa, neuerdings auch in Nordamerika ist er durch die Fischzucht jetzt weit verbreitet. Die Teichwirtschaft, welche in Böhmen sich besonders stark entwickelt hat, hat mehrere Varietäten erzeugt. Zu diesen gehört der Lederkarpfen, welcher keine Schuppen trägt, der Spiegelkarpfen (C. rex cyprinorum), welcher an jeder Körperseite nur eine Reihe sehr grosser Schuppen trägt, der blaue Karpfen, der Goldkarpfen (Carpe d’or), dessen rötlicher Schimmer nach C a r b o n n i e r von der
Lachsfarbe seines Fleisches herrührt, der galizische Karpfen u. a. Die K a r a u s c h e (Carassius vulgaris Nils.) ist über das ganze Gebiet wie überhaupt in der paläarktischen Region verbreitet. Sie bewohnt stehende und langsam fliessende Gewässer mit weichem Grunde.
Als Giebel bezeichnet man im Gegensatz zu der hochrückigen sog. Seekarausche die schlankeren Formen, welche sich in kleinen Gewässern entwickeln. Eine nahe verwandte Karauschenart, vielleicht nur eine Abart unserer gewöhnlichen Karausche, ist der aus Japan und China stammende G o l d f i s c h (Carassius auratus), der in zahlreichen Varietäten (Teleskopfisch, Schleierfisch) jetzt auch in Europa gezogen wird[19].
Zu den artenreichsten Gattungen der Süsswasserfische gehören die B a r b e n , von denen man etwa 200 meist tropische Arten kennt. In unserem Gebiet ist allverbreitet nur die auf Mitteleuropa beschränkte Flussbarbe (Barbus fluviatilis Ag.), die Seen und Flüsse bewohnt. Eine andere Art (Barbus Petenyi Heck.) ist in den Karpathenflüssen, auch in der Weichsel gefunden worden. Neuerdings glaubt man sie auch in der Lohe, einem Oderzufluss, aufgefunden zu haben[20]. Der G r ü n d l i n g (Gobio fluviatilis C.) ist über ganz Europa verbreitet, wo er in fliessenden und stehenden Gewässern vorkommt. Eine verwandte Art, Gobio uranoscopus Ag., bewohnt die Nebenflüsse der Donau, sowie einzelne Gewässer der obern Weichsel.
Aus der Gruppe der Rhodeina kommt bei uns ein typischer Vertreter, der B i t t e r l i n g (Rhodeus amarus Bl.), vor, der über ganz Europa verbreitet ist.
In reicherer Zahl finden sich in Deutschland die Abramidina, zu denen die Bressenarten, der Blei, Rapen, Uklei, die Ziege und das Moderlieschen gehören. Der B r e s s e n oder B r a c h s e n (Abramis brama L.) findet sich in ganz Mitteleuropa, mit Ausnahme der Alpen. Ebenso verbreitet ist die Z ä r t h e (A. vimba L.), doch scheint sie vom Rheingebiet ausgeschlossen zu sein. Einen viel engeren Verbreitungsbezirk haben der S e e r ü s s l i n g (A. melanops H.) und der P l e i n z e n (A. sapa), welche auf das pontische Gebiet beschränkt sind. Die Z o p e (A. ballerus) findet sich in den Unterläufen der Ströme und in den grossen Seen im Gebiet allenthalben. Sehr
gemein in Seen und Flüssen ist der B l e i oder G ü s t e r (Blicca Björkna L.), der in Mittel- und Nordeuropa vorkommt. Seltener, aber in den grösseren Gewässern des Ostens ebenfalls überall verbreitet, ist die Z i e g e oder der S i c h l i n g (Pelecus cultratus L.); westlich von der Oder scheint dieser Fisch zu fehlen. Dagegen ist der U k l e i oder die L a u b e (Alburnus lucidus Heck.) über ganz Mitteleuropa bis nach Frankreich verbreitet. Nicht weniger verbreitet, aber selten und vielfach übersehen ist der S c h n e i d e r (A. bipunctatus Bl.). Dagegen ist die nahe verwandte M a i r e n k e (A. mento Ag.) auf das pontische Gebiet beschränkt. Der R a p e n oder S c h i e d (Aspius rapax Ag.) und das M o d e r l i e s c h e n , M u t t e r l o s k e n oder M o t k e n (Leucaspius delineatus Sieb.) sind dagegen im Gebiete überall zu finden.
Die grosse Gruppe der Leuciscina enthält ebenfalls mehrere Arten des Gebietes, die Plötzen, Rotaugen, Döbeln, Orfen, Schleien, Nasen, Elritzen und Strömer. Die P l ö t z e (Leuciscus rutilus L.) ist im ganzen Gebiet wie in ganz Mittel- und Nordeuropa verbreitet und einer der gemeinsten Fische. Dagegen ist der F r a u e n n e r f l i n g (L. virgo Heck.) auf die Donau beschränkt, während der F r a u e n f i s c h (L. Meidingeri Heck.) zu jenen Bewohnern der tiefen Alpenseen gehört, welche nur zur Zeit der Laichablage gefangen werden können, sonst aber ihr Leben in unzugänglichen Tiefen verbringen. Eine ähnliche Verbreitung wie die Plötze hat das mit ihr oft verwechselte R o t a u g e oder die R o t f e d e r (Scardinius erythrophthalmus L.). Auch die O r f e (Idus melanotus Heck.) ist über das ganze Gebiet verbreitet. Eine schöne Varietät derselben ist die Goldorfe (var miniatus). Der D ö b e l oder A i t e l (Squalius cephalus L.) und der H ä s l i n g oder H a s e l (S. leuciscus L.), sowie die E l r i t z e oder P f r i l l e (Phoxinus laevis Ag.) sind ebenfalls im Gebiete, namentlich in fliessenden Gewässern, überall zu finden.
Sehr sporadisch trifft man dagegen den S t r ö m e r (Telestes Agassizii Val.) an, der ausser im Rhein und in den Zuflüssen der Donau neuerdings auch in einem kleinen Oderzufluss am Zobten aufgefunden ist[21]. Die N a s e (Chondrostoma nasus L.) ist ein osteuropäischer Fisch, welcher in den Flussgebieten der Nordsee mit Ausnahme der Elbe (wie der Zander) fehlt. Eine andere Nasenart, C. Genei Bon., welche im allgemeinen auf Südeuropa
beschränkt ist, wird von S i e b o l d auf Grund eines gelegentlichen Vorkommens zur Fauna des Rheins gerechnet.
Die S c h l e i e (Tinca vulgaris C.) ist ein in ganz Europa verbreiteter Fisch weichgründiger Gewässer.
Zweifelhaft ist es, ob man zu den Cypriniden auch die kleine Gruppe der Acanthopsiden oder S c h m e r l e n zu rechnen hat, die sich namentlich durch ihre knöcherne Schwimmblasenhülle und durch den Bau ihrer Unterschlundknochen von den ihnen sonst nahestehenden Cypriniden unterscheiden. Aus unserer Fauna gehören hierher die Steinbeisser, Schlammpeitzker und Schmerlen.
Der S t e i n b e i s s e r (Cobitis taenia L.) findet sich durch ganz Europa, die S c h m e r l e (C. barbatula L.) auch in Asien, der S c h l a m m p e i t z k e r (C. fossilis L.) endlich in Asien und dem östlichen Europa mit Einschluss unseres Gebietes.
Eine ganz isolierte Stellung nimmt die kleine Familie der Umbriden ein, welche nur aus zwei Süsswasserarten besteht, von denen die eine im mittleren Nordamerika, die andere, der H u n d s f i s c h (Umbra Crameri Müll.), in einigen Nebengewässern der unteren Donau (Neusiedler See, Plattensee u. a.) und anscheinend auch in anderen Teilen des Pontischen Gebietes sich vorfindet.
Die Familie der S a l m o n i d e n [22] ist bei uns durch fünf Gattungen vertreten, deren Arten grossenteils zur Varietätenbildung neigen, sodass eine Übereinstimmung unter den Fischkundigen über die Abgrenzung der Arten in mehreren Fällen noch nicht erzielt ist. Die meisten Arten sind als Sport- und Speisefische hochgeschätzt und werden als Edelfische bezeichnet. Die Gattungen, welche hierher gehören, sind: die Maränen oder Renken, die Aesche, der Stint, die Saiblinge und die Forellen und Lachse.
Es ist schon erwähnt, dass die Salmoniden sich anscheinend von Norden her verbreitet haben, dass sie noch jetzt im Norden die stärkste Artentwickelung besitzen und in unserem Gebiet meist kühle Wohnplätze aufsuchen. Solche finden die Bewohner der Seen in den sehr tiefen Seen der Alpen und in einigen norddeutschen Seen, in Tiefen, in welchen beständig eine Temperatur von nur 2–6° C. herrscht. Grösstenteils Bewohner solcher Seen sind die Maränen
oder Coregonen. N ü s s l i n [23] hat die Arten derselben nach der Form der Schnauze und der Bezahnung der Kiemenbögen geschieden; nach diesem System hat man zu unterscheiden: den N o r d s e e s c h n e p e l (Coregonus oxyrhynchus L.), einen Wanderfisch, der die Nordsee bewohnt und ihre Ströme zur Laichzeit aufsucht, die k l e i n e M a r ä n e (C. albula L.), die in den tieferen Seen der baltischen Seenplatte von Holstein bis nach Russland hinein, sowie in den skandinavischen Seen lebt, den K i l c h oder K r o p ff e l c h e n (C. hiemalis Jur.) aus der Tiefe des Bodensees und des Ammersees, den O s t s e e s c h n e p e l (C. lavaretus L.), der die Ostsee bewohnt und in den Buchten und Haffen derselben laicht, die M a d ü m a r ä n e (C. maraena Bl.) aus dem Madüsee in Pommern, die B o d e n r e n k e (C. fera Jur.) aus den tiefen schweizerischen, oberösterreichischen und bayrischen Seen, die P u l s s e e m a r ä n e (C. generosus Peters)[24] aus dem Pulssee in der brandenburgischen Neumark[25] (Ostseeschnepel, Madümaräne, Bodenrenke und Edelmaräne werden von Anderen für Varietäten einer Art gehalten)[26], ferner den B l a u f e l c h e n (C. Wartmanni Bl.) aus den tieferen nordalpinen Seen, die Tr a u n s e e m a r ä n e (C. Steindachneri Nüssl.), P f ä ff i k o n e r M a r ä n e (C. Sulzeri Nüssl.) aus dem Traunsee bezw. Pfäffikoner See, und den G a n g f i s c h (C. macrophthalmus Nüssl.) aus dem Bodensee (die drei letztgenannten Arten werden von anderer Seite für Varietäten des Blaufelchen gehalten).
Die A e s c h e (Thymallus vulgaris Nils.) ist ein anderer Salmonide, der kleine, raschfliessende Flüsse im ganzen Gebiete bewohnt und über dasselbe hinaus durch Europa verbreitet ist; verwandte Formen finden sich in Nordasien und Nordamerika. Der S t i n t (Osmerus eperlanus L.) findet sich an den Küsten des nördlichen Teiles des Atlantischen Ozeans und in dessen Zuflüssen, in denen er laicht. Im Rhein ist er nicht beobachtet worden. In einigen norddeutschen Seen kommt er ebenfalls vor, ohne zum Meere zu wandern.
Die naheverwandten Gattungen der Saiblinge, Lachse und Forellen hat man nach S i e b o l d s Vorgange nach der Bezahnung des in der Gaumendecke liegenden Pflugscharbeins unterschieden. Das Pflugscharbein der Saiblinge (Salmo) hat eine bezahnte Platte, aber einen unbezahnten Stiel; das der Lachse (Trutta) hat einen
bezahnten Stiel bei unbezahnter Platte, während bei den Forellen (Trutta) sowohl Stiel wie Platte bezahnt sind. Der S a i b l i n g (Salmo salvelinus L.) bewohnt die tiefen Gebirgsseen Mittel- und Nordeuropas. Der ebenfalls zu den Saiblingen gerechnete H u c h e n (S. hucho L.) kommt ausschliesslich im Donaugebiete vor. Der L a c h s (Trutta salar L.) bewohnt den nordatlantischen Ozean, mit Ausschluss des Schwarzen Meeres und des Mittelmeeres, und steigt in die Flüsse, welche sich in die von ihm bewohnten Meere ergiessen, zum Laichen auf. Die Forellen unterscheidet man als B a c h f o r e l l e (T fario L.), S e e f o r e l l e (T lacustris L.) und M e e r f o r e l l e (T. trutta L.). Die beiden letzteren Arten sind ursprünglich wohl Abarten der Bachforelle[26], aber durch verschiedene Lebensweise und körperliche Abweichungen von ihr unterschieden. Während die Bachforelle in raschfliessenden Bächen im ganzen Gebiete lebt, bewohnt die Seeforelle die tiefen Gebirgsseen, die Meerforelle die Nord- und Ostsee; alle drei Arten laichen aber ausschliesslich in Bächen, in welche die See- und die Meerforelle zu diesem Zweck aufsteigen. Die Meerforelle hat also eine ähnliche Lebensweise wie der Lachs, mit dem sie deshalb oft verwechselt wird.
Die Familie der H e c h t e (Esociden) ist bei uns durch den allbekannten, in allen süssen Gewässern Europas, Nordasiens und Nordamerikas lebenden Esox lucius L. vertreten.
Aus der Familie der H e r i n g e (Clupeiden) sind zwei Wanderfische zu unserer Fauna zu rechnen, der M a i f i s c h (Alosa vulgaris C.) und die F i n t e (Alosa finta C.). Ersterer bewohnt die Küstengegenden im nördlichen Atlantischen Ozean, die letztere verbreitet sich noch mehr südlich und östlich bis zum Nil. Beide besuchen zum Laichen die Süsswasserströme. Die Weichsel wird indessen nur von der Finte besucht. Zur Familie der M u r ä n i d e n gehört unser A a l (Anguilla vulgaris Flem.), der in allen Flüssen lebt, die in den Nordatlantischen Ozean gehen, mit Einschluss des Mittelmeergebietes, mit Ausschluss aber der Pontischen Flüsse.
Wenden wir uns nun von den Knochenfischen zu den G a n o i d e n , so finden wir die Familie und Gattung der A c i p e n s e r i n e n [27] in mehreren Arten vertreten. Der S t ö r (Acipenser sturio L.) ist ein
Wanderfisch und bewohnt den Nordatlantischen Ozean mit Ausschluss des Mittelmeeres und seiner Nebenmeere, also auch des Schwarzen Meeres. Das letztere wird dagegen von mehreren verwandten Arten bewohnt. Es sind dies der G l a t t d i c k (A. glaber Heck.), der S c h e r g (A. stellatus Pall.), der D i c k (A. schypa Güldenst.), der Wa x d i c k (A. Güldenstädtii Brandt) und der H a u s e n (A. huso L.). Alle diese Störe wandern zur Laichzeit in die Flüsse, die letztgenannten in die Donau und die anderen Ströme des Pontusgebietes, der Stör in die europäischen und amerikanischen Flüsse seines Wohngebietes, um hier zu laichen. Mehr Standfisch ist der S t e r l e t (A. ruthenus L.), welcher die Pontischen Flüsse, ausserdem aber auch die in das Eismeer mündende Düna bewohnt und das Meer in der Regel nicht aufsucht.
Aus der Ordnung der C y c l o s t o m e n endlich, deren von den übrigen Fischen völlig abweichender Bau Anlass gegeben hat, diese Tiere von der Klasse der Fische ganz auszuschliessen, gehören zu unseren Süsswasserfischen zwei Vertreter der Familie der Petromyzontiden, das F l u s s n e u n a u g e (P. fluviatilis L.), ein Wanderfisch, der zum Zweck der Laichablage aus dem Meere in die Süsswasserströme wandert, wo seine Larve mehrere Jahre lang aufwächst, und das B a c h n e u n a u g e (P. Planeri Bl.), welches sein ganzes Leben in Bächen und kleinen Flüssen zubringt. Beide Arten sind durch die ganze arktische Region verbreitet.
Überblickt man die jetzige Ausbreitung unserer Fischarten, so lassen sich zwei Hauptrichtungen der Verbreitung erkennen, eine aus Nordwesten bezw. Nord und West kommende, und eine aus Südost bezw. Süd und Ost kommende. Der ersteren ausschliesslich gehören die Fische des nordatlantischen Küstengebietes an: die Stichlinge, Stint, Lachs, Nordseeschnepel, Meerforelle, Maifisch, Finte, Aal und Stör. Alle diese Fische sind von dem Gebiet des Schwarzen Meeres (Donaugebiet) ausgeschlossen, während demselben ausschliesslich angehören: Wolgazander, die Streber, Schrätzer, Seerüssling, Pleinzen, Mairenke, Frauennerfling, Hundsfisch, Huchen, Glattdick, Dick, Scherg, Waxdick und Hausen. Eine kleine Reihe von anderen Fischen weist auf allmähliche Verbreitung von Ost nach West hin: der Wels, der seine Westgrenze
im Rhein hat, die Zärthe, die westlich der Weser sich nicht findet, der Zander und die Nase, deren Verbreitung nach Westen mit der Elbe abschliesst, endlich die Ziege, welche nicht über die Oder hinaus nach Westen geht. Noch andere Fische finden sich im Gebiet stellenweise, so aus dem Süden eingewandert der Barbus Petenyi, der Gobius uranoscopus, der Strömer, das Chondrostoma Genei, aus dem Osten der Sterlet, ferner an gewisse Örtlichkeiten gebunden der karpathische Kaulkopf, der Ostseeschnepel, endlich die auf die tiefen Seen beschränkten Arten: der Frauenfisch, die kleine Maräne, die übrigen Felchen- und Renkenarten, der Seesaibling und die Seeforelle.
Die übrigen Fische sind dem ganzen Gebiete gemeinsam. Eine kleine Zahl von ihnen ist über die ganze arktische Region (Nordasien, Europa und Nordamerika) verbreitet: Barsch, Aalquappe, Hecht, Fluss- und Bachneunauge. Einige finden sich allgemein im Norden der alten Welt: Kaulbarsch, Kaulkopf, Karausche und Bachforelle. Die übrigen gehören dem europäischen Gebiete nördlich von den Alpen an und sind teilweise bis Asien hinein verbreitet, nämlich die meisten Cypriniden, die Acanthopsiden sowie die Aesche.
Haben wir uns in dem bisherigen über die in unserm Gebiet vorkommenden Arten und ihre Verbreitung orientiert, so wenden wir uns nun zur Betrachtung der Lebensverhältnisse derselben, welche wir am besten an der Hand ihres Körperbaues[28] und ihrer Organe kennen lernen.
Die äussere Körperdecke, die H a u t , ist wie bei den höheren Wirbeltieren eine doppelte, indem sie aus der Oberhaut oder Epidermis und der Lederhaut oder dem Corium zusammengesetzt ist. Die Oberhaut besteht aus einer mehrschichtigen Lage von Zellen, deren äusserste Schichten zerfallen und in Gemeinschaft mit dem Schleim einzelner grosser Drüsenzellen die Oberfläche der Haut schlüpfrig machen. Die unter der Oberhaut liegende Lederhaut besteht aus Bindegewebsfasern und ist meist sehr zähe (Aal). In taschenförmigen Vertiefungen dieser Haut liegen die S c h u p p e n [29], Hornplättchen, welche sich meist dachziegelartig decken und einen dichten Schutzpanzer bilden (Perciden, Cypriniden, Salmoniden,
Clupeiden, Hecht). Bei dem Hundsfisch ist auch der Kopf mit Ausnahme der Schnauze mit Schuppen bedeckt, während derselbe bei den übrigen Fischen frei von Schuppen ist. Bei manchen Fischen sind die Schuppen so fein und die Oberhaut so dick, dass die Schuppen nicht ohne Weiteres erkannt werden können (Aal, bei dem sie in Zickzacklinien liegen, Aalquappe, Schleihe, Schmerlen). Die Stichlinge tragen an Stelle der Schuppen an den Seiten schmale dünne Knochenschienen, welche zusammenhängende Seitenpanzer bilden. Der Körper der Störe ist mit starken, mit scharfen Höckern versehenen Hautknochen als wirksamem Schutz besetzt. Ganz ohne Hautbewehrung sind von unseren Fischen die Kaulköpfe, der Wels und die Neunaugen.
D e r S i l b e r g l a n z , welchen die meisten Fische zeigen, wird dadurch hervorgerufen, dass die Oberfläche der Lederhaut (bezw. die Innenseite der Schuppen) mit einer Lage von mikroskopisch kleinen, krystallartig geformten Plättchen bedeckt ist, welche neben Kalk auch Guanin[30] enthalten[LXXIV]. Letzterer Stoff findet sich auch in der glanzlosen Haut der Neunaugen[31]. Bei manchen Fischen bringen die Glanzkörperchen, namentlich zur Laichzeit, schöne Interferenzfarben hervor (Stichling, Bitterling u. a.). Sie werden in der Farbenwirkung unterstützt durch die F a r b z e l l e n (Chromatophoren) [32], welche in der Lederhaut liegen. Die meisten Farbzellen sind mit schwarzem Farbstoff, viele auch mit rotem oder gelbem Farbstoff gefüllt. Die letzteren, Zooerythrin und Zoofulvin, kommen nach K r u k e n b e r g [33] auch bei den Vögeln vor, fehlen aber eigentümlicherweise ganz bei allen anderen Wirbeltierklassen. Die Farbzellen der Fischhaut haben in hohem Grade die Fähigkeit, sich bald fast punktförmig zusammenzuziehen, wodurch sie fast unsichtbar werden, bald sich wieder zu sternförmigen, weit ausgebreiteten Körpern auszudehnen und damit ihre Farbe zur Wirkung zu bringen. Auf diese Weise kann die Farbe der Fische sich der ihrer Umgebung anpassen und dadurch den Fisch vor Verfolgern schützen oder die Wachsamkeit seiner Beute täuschen. Dieser Farbwechsel ist von der eigenen Lichtempfindung des Fisches abhängig; geblendete Fische zeigen nach P o u c h e t [34] diese Farbanpassung nicht. Bei manchen Fischarten, namentlich Cypriniden (Karausche, Schleihe, Orfe, Barbe, Plötze), finden sich
Varietäten, denen die schwarzen Farbzellen ganz oder stellenweise fehlen, während die roten und gelben stark entwickelt sind. Diese Varietäten werden oft als Zierfische in Parkteichen gezogen. In seltenen Fällen sind auch die roten Farbstoffe nicht entwickelt (Albinismus), oder die Silberglanzkörperchen fehlen (Alampia). Normal fehlen die Glanzkörper beim Stint.
[LXXIV] Der Schuppenglanz mancher Cypriniden wird im grossen rein gewonnen zur Herstellung der Farbe künstlicher Perlen.
Seine Stütze erhält der Fischkörper durch die ihn der Länge nach durchziehende W i r b e l s ä u l e . Bei den Knochenfischen besteht dieselbe aus durchbohrten bikonkaven cylindrischen Knochenstücken, den Wirbeln, deren Innenräume durch die elastische Chorda ausgefüllt sind. Nach oben und unten setzen sich an jeden Wirbelkörper paarweise knöcherne Fortsätze an, die Rücken- und Bauchstrahlen. Die Rückenstrahlen jedes Wirbelkörpers bilden einen Kanal, indem sie an ihren oberen Enden mit einander verschmelzen. In dem so gebildeten Kanal an der Oberseite der Wirbelsäule liegt das Rückenmark. Die Bauchstrahlen verschmelzen nur im Schwanzteil des Fischkörpers mit einander zu einem Kanal, der die grossen Blutgefässe des Schwanzes[LXXV] aufnimmt. Im Vorderteil des Körpers bilden sie als Rippen die Stützen der Seitenwände der Leibeshöhle.
[LXXV] Diese Blutgefässe sticht man beim Schlachten grosser Fische an, die man durch Verblutung töten will.
Die K ö r p e r f o r m der Fische ist entweder eine seitlich mehr oder minder zusammengedrückte, oder mehr spindelförmig bis walzig. Erstere Form zeigen am stärksten ausgeprägt der Bressen und die Seekarausche, letztere der Aal und die Neunaugen, sowie die Aalquappe, der Schlammpeitzker, der Wels, der Kaulkopf, lauter Fische, die vorzugsweise am Grunde der Gewässer leben und sich gelegentlich auf demselben schlängelnd bewegen. Die hauptsächliche B e w e g u n g s a r t unserer Fische ist aber das
Schwimmen im freien Wasser, und hierzu ist der Fischkörper nicht nur selbst in geeigneter Weise geformt, sondern auch mit besonderen Anhängen versehen, den F l o s s e n . Die Flossen sind gebildet durch Häute, welche durch eingelagerte bewegliche knöcherne Spangen ausgespannt werden können, etwa wie ein Schirm oder ein mit Zeug bezogener Fächer. Man unterscheidet paarige Flossen, welche an den Seiten des Körpers stehen, und unpaare Flossen, welche in der Mittellinie des Rückens und des Schwanzes stehen.
Die paarigen Flossen sind meist zu zwei Paaren vorhanden, welche man nach ihrer gewöhnlichen Stellung als Brustflossen und Bauchflossen unterscheidet; sie entsprechen den Gliedmassen der höheren Wirbeltiere. Sie sind an Knochen befestigt, welche bei den Brustflossen mit dem Kopf, bei den Bauchflossen unter einander verbunden sind. Sie fehlen ganz den Neunaugen, während der Aal nur Brustflossen, keine Bauchflossen hat. Die unpaaren Flossen unterscheidet man je nach ihrer Lage als Rückenflossen, Schwanzflossen und Afterflossen. Rückenflosse und Afterflosse sind dadurch am Fischkörper befestigt, dass jeder Strahl der Flosse scharnierartig verbunden ist mit einer Knochenschiene von kreuzförmigem Querschnitt, welche im Körper des Fisches liegt und sich je an einen Rückenstrahl bezw. Bauchstrahl der Wirbelsäule anlehnt. Rückenflossen sind in Zweizahl vorhanden bei den Perciden, Aalquappe, Kaulkopf und den Neunaugen. Bei den Stichlingen sind die ersten Strahlen, ebenso wie die Bauchflossen, zu einzeln stehenden, teilweise zackigen Stacheln umgewandelt, welche als Waffen dienen. Bei den Salmoniden findet sich hinter der Rückenflosse eine kleine sogenannte Fettflosse, welche diese Familie von allen anderen einheimischen Fischen leicht unterscheiden lässt. Diese Fettflosse wird als ein Überbleibsel aus dem Larvenstadium des Fisches betrachtet; sie hat keine festen knöchernen Strahlen, wie die übrigen Flossen, sondern an deren Stelle nur weiche hornige Fäden, wie alle Flossen der Neunaugen, der Haie und Rochen und der eben ausgeschlüpften Jungen der Knochenfische. Die Afterflosse fehlt nur den Neunaugen. Sie beginnt stets kurz hinter der Afteröffnung. Die Schwanzflosse liegt bei den meisten Fischen mit dem grössten Teil unterhalb der Wirbelsäule.
Die trotzdem vorhandene Symmetrie des Schwanzes wird dadurch ermöglicht, dass die letzten Wirbelkörper zu einem Stiel verschmolzen und so nach oben gebogen sind, dass die Unterseite der Wirbelsäule und die an sie sich ansetzenden Schwanzflossenstrahlen nach hinten gerichtet sind.
Sehen wir uns nun nach den M u s k e l n um, welche die Bewegungen des Fisches bewirken, so finden wir zunächst zu beiden Seiten der Wirbelsäule starke Fleischmassen, welche leicht einen eigentümlichen Bau erkennen lassen. An jeden Wirbelkörper setzen sich beiderseits Muskelplatten an, welche hohlkegelförmig gewölbt sind, so dass ein Querschnitt durch den Fischkörper mehrere hinter einander liegende Muskelplatten ringförmig blosslegt. Die vier an einer Stelle der Wirbelsäule sich ansetzenden Muskelplatten bilden einen Muskelabschnitt (Myokamma). Die Muskelabschnitte sind unter sich durch dünne Bindegewebshäute (Ligamente) getrennt[LXXVI], die einzelnen Muskelbündel liegen in den Muskelabschnitten in der Längsrichtung des Fisches, ihre Enden setzen sich daher nicht an Knochen, wie die meisten Muskeln der höheren Wirbeltiere, sondern an Ligamente an (interligamentale Muskulatur). Die Muskelplatten bilden zusammen zwei grosse Seitenmuskeln, welche den grössten Teil des Fischkörpers einnehmen und die Bewegungen des Schwanzes bewirken. Neben den Seitenmuskeln treten die Muskeln des später zu betrachtenden Kopfes und die der Flossen an Umfang sehr zurück. Die Muskulatur der unpaaren Flossen besteht aus zahlreichen kleinen Muskelzügen, welche einerseits an die inneren Halteknochen der Flossen, anderseits an die Flossenstrahlen sich ansetzen (interosteale Muskulatur) und die letzteren aufrichten, niederziehen und seitwärtsbiegen können. Bei den paarigen Flossen wird die Ausbreitung und die fächelnde Bewegung, welche dieselben ausführen, durch stärkere Muskelbündel bewirkt, welche ebenfalls an den inneren Gerüstknochen dieser Flossen befestigt sind. Wie kommt nun mittels der Flossen und ihrer Muskeln die O r t s b e w e g u n g zu stande[35]? Die Flossen, die paarigen sowohl wie die unpaaren, sind für sich allein nicht im stande, den Fisch schwimmend zu erhalten, wie durch Versuche festgestellt ist. Die paarigen Flossen halten den Fisch, wenn er im freien Wasser
schwimmend steht, im Gleichgewicht, auch wirken sie mit bei Wendungen und bei der Rückwärtsbewegung sowie beim plötzlichen Aufhalten. Die unpaaren Flossen können durch leichte wellenförmige Bewegungen eine langsame Vorwärtsbewegung des Fisches bewirken. Das rasche Schwimmen der Fische dagegen wird durch Ruderschläge des Hinterleibes bewirkt, dessen Fläche, um den Widerstand des leicht ausweichenden Wassers zu erhöhen, durch Aufrichten der unpaaren Flossen vergrössert werden kann, wobei die Schwanzflosse hauptsächlich als Steuer dient. An diesen Bewegungen, welche durch abwechselnde Kontraktionen der beiden Seitenmuskeln vor sich gehen, nimmt der hintere Teil des Körpers teil, welcher durch eine durch die Vorderenden der Rückenflosse und der Afterflosse gelegte Ebene abgegrenzt wird. Der Körperteil vor dieser Ebene enthält die L e i b e s h ö h l e mit ihren Organen der Blutzirkulation, der Verdauung und der Fortpflanzung. Ein Z w e r c h f e l l trennt die kleine B r u s t h ö h l e , welche das Herz enthält, von der geräumigen Bauchhöhle.
[LXXVI] Beim Erwärmen des toten Fischkörpers lösen sich diese Häute unter Leimbildung auf, sodass die einzelnen Muskelplatten sich von einander trennen und leicht schollenartig auseinanderfallen In den Ligamenten liegen namentlich bei den Perciden und Cypriniden feine, spitze Stützknochen, Fleischgräten, welche sich als Knochen beim Kochen nicht auflösen.
Das H e r z [36] liegt, vom Herzbeutel umschlossen, dicht hinter dem Kopfe. Es besteht aus der muskulösen Herzkammer und der dünnwandigen Vorkammer, die durch ein Klappenventil getrennt sind. Der Vorkammer schliesst sich der Sinus venosus an, der das Venenblut aufnimmt und der Vorkammer zuführt. Aus der Herzkammer entspringt, mit einer Anschwellung (Bulbus aortae) beginnend, die Kiemenarterie, welche das venöse Blut aus dem Herzen in die Kiemen führt. Aus den Kiemen sauerstoffreich zurückkehrend sammelt sich das Blut in der grossen Körperarterie (Aorta descendens), aus welcher es sich in die Organe des Körpers verteilt. Das hier gebrauchte Blut wird zur Ausscheidung der nicht
gasförmigen Stoffwechselprodukte durch die Leber und die Niere geführt. Das Produkt der Leber[37], die G a l l e , sammelt sich in der Gallenblase und gelangt aus dieser in den Darm. Das Produkt der Nieren, der H a r n , wird durch die Harnkanälchen in die beiden Harnleiter und sodann in der Regel zunächst in eine Erweiterung des gemeinsamen Endteils derselben, die Harnblase, geführt, von wo er durch einen Ausführungsgang hinter dem After nach aussen gelangt. Bei den Fischen liegen die N i e r e n an der Decke der Bauchhöhle als zwei dicht an der Wirbelsäule durch die ganze Länge der Bauchhöhle sich erstreckende, grossenteils mit einander verschmolzene, dunkelrote, sehr weiche Organe. Sie dienen bei den Fischen nicht allein zur Harnabsonderung, sondern sie sind daneben, wie auch wahrscheinlich die zwischen den Eingeweiden liegende M i l z [38], die Vermehrungsstätten der roten Blutkörperchen[39].
Die Organe der Ernährung und ihre Hilfsorgane liegen teils in der Mundhöhle, teils in der Bauchhöhle. Die M u n d h ö h l e nimmt den unteren Teil des Kopfes ein, während in dem oberen, in einer Kapsel aus Knorpel (Neunauge, Stör) oder Knochen (bei den meisten Knochenfischen), das Gehirn eingebettet ist. Die Knochen, welche den vorderen Teil des Bodens des Hirnschädels bilden, sind das Dach der Mundhöhle, deren Seitenwände und Boden teils aus den Kiemenbögen und den ihnen homologen Knochenbögen, den Unterschlundknochen und dem Zungenbein, teils aus den Kieferknochen, und aus ihren häutigen und muskulösen Verbindungen bestehen. Die Öffnungen zwischen den Kiemenbögen führen in die Kiemenhöhlen, welche nach aussen durch die mehr oder minder beweglichen Kiemendeckel geschlossen sind.
Alle Knochen der Mundhöhle sind mit einander beweglich verbunden, sodass die Mundhöhle bedeutender Erweiterung fähig ist. Je nach der Nahrung des Fisches sind die Gestalt der Mundöffnung und die Bezahnung der Mundknochen verschieden. Die Perciden, Kaulköpfe, Aalquappe, Wels, auch manche Cypriniden, wie Rapen, Döbel, Orfe, ferner die Aesche, der Stint, die Salmo- und Trutta-Arten, Hecht und Aal haben ein breites, weit aufsperrbares Maul und, mit Ausnahme der Cypriniden, auf mehr
oder minder zahlreichen Knochen desselben teils nur feine Zähnchen, die in grosser Zahl mehr oder minder dicht beisammen stehen (Sammet-, Bürsten-, Hechelzähne, z. B. beim Aal, Barsch, Wels), teils zwischen diesen noch grössere Fangzähne (Zander, Hecht, Lachs, Forelle)[40]. Diese Fische sowie die Stichlinge nähren sich ausschliesslich, wie Lachs, Hecht, Wels und Zander, oder teilweise von Fischen, welche sie, auch wenn sie über die Mundhöhle hinausragen, mittels der Zähne festhalten können. Die meisten Cypriniden, Maränen und Clupeiden haben dagegen eine kleine rundliche oder mehr hohe als breite Mundöffnung, welche am Ende einer rüsselartig vorstreckbaren, häutigen Röhre liegt, die oben von den halbringförmigen Zwischen- und Oberkieferknochen, unten von dem Unterkiefer gestützt wird. Mittels dieses Saugrüssels schlürfen diese Fische ihre aus kleinen niederen Tieren bestehende Nahrung ein, nach welcher sie teils im freien Wasser, teils an den festen Gegenständen in demselben, den Pflanzen, Steinen, dem Holzwerk, oder auf dem Grunde suchen. Sie finden hier kleine Crustaceen aus den Ordnungen der Cladoceren, der Ostracoden, der Copepoden, ferner die das Wasser bewohnenden Larven vieler Insekten, namentlich der Mücken und Eintagsfliegen, auch Würmer, Rädertiere, kleine Weichtiere, nehmen wohl auch die schleimigen Massen der Kieselalgen und den für sie allerdings unverdaulichen Mulm zerfallener Pflanzenteile, Sand und Schlamm ein, verschonen auch nicht, wie hier gleich erwähnt sein mag, Eier und Brut von Fischen, selbst nicht die eigene Nachkommenschaft. Man unterscheidet die letztgenannte Gruppe von Fischen als Kleintierfresser oder Friedfische von den ersterwähnten Raubfischen[41].
Während die Kiemenspalten der breitmäuligen Fische ziemlich weit und nur mit weitläufig gestellten Zähnen versehen sind, sind die Kiemenspalten der engmäuligen Fische eng, meist kurz, die Kiemenbogen sind an der Innenseite mit je zwei Reihen dicht gestellter Stäbchen besetzt, welche in einander greifend einen reusenartigen Verschluss bilden, durch den wohl das in die Mundhöhle aufgenommene Wasser, nicht aber die feinkörnige Nahrung in die Kiemenhöhle entweichen kann. Am Gaumen vieler Cypriniden findet sich ein muskulöser Wulst, welcher Sinnesorgane
(Schmeckbecherchen) enthält. Jede Berührung dieses Organs bringt eine Anschwellung der berührten Stelle hervor. Es scheint auch durch seine Kontraktionen beim Aufsaugen der Nahrung mitzuwirken.
Am hinteren Abschluss der Mundhöhle haben die Cypriniden, welche sonst ganz zahnlos sind, auf den Unterschlundknochen stumpfe aber starke Zähne, deren bei den einzelnen Arten verschiedene Form ein vorzügliches Mittel zur Abgrenzung und Erkennung der Arten ist. Diesen Zähnen gegenüber steht am Gaumen eine harte Knorpelplatte. Zwischen den Zähnen und der Gaumenplatte wird die Nahrung zerdrückt. Die Zähne werden bei den Cypriniden nach v. S i e b o l d jährlich in der Laichzeit abgestossen und erneuert.
Abweichend von dem Maul der übrigen Fische ist das der Neunaugen gebaut. Es ist eine am vorderen Körperende gelegene Saugscheibe, welche mit mehreren zahntragenden Hornplatten ausgestattet ist. Es dient dem Fisch vornehmlich dazu, sich an feste Gegenstände oder an seine Beute anzusaugen. Die letztere wird dann mittels der Zähne angebohrt und ausgesaugt.
Das durch die Kiemenspalten abfliessende Wasser gelangt in die K i e m e n h ö h l e n , in welchen sich die Kiemenbögen befinden. Die Kiemenbögen bestehen aus gebogenen rinnenförmigen Knochenplatten mit nach unten gekehrten Rinnen. In diesen Rinnen laufen die Blutgefässe, welche das Blut aus dem Herzen in die Kiemen leiten, und andere, die das Blut aus den Kiemen dem Körper zuführen. In den Kiemenblättchen, welche an jedem Bogen in zwei Reihen dicht gedrängt stehen, tritt das kohlensäurehaltige Blut mit dem sauerstoffhaltigen Wasser in Gasaustausch, das Blut tritt sauerstoffreich in den Körper zurück, während das verbrauchte Atemwasser unter dem Kiemendeckel durch die Kiemenöffnung abfliesst und durch neues aus der Mundhöhle ersetzt wird. In der Regel sind vier Paar Reihen von Kiemenblättchen auf jeder Seite des Kopfes vorhanden. An der Innenseite des Kiemendeckels sitzt häufig noch eine sogenannte Nebenkieme (z. B. beim Stör), welche aber funktionslos ist. Die Acanthopsiden (Schlammpeitzker, Steinbeisser und Schmerle) können im Notfalle auch durch den
Darm die Atmung vollziehen, indem sie Luft einschnappen und durch den Darm treten lassen, wobei sie einen quietschenden Ton erzeugen. Die anderen Fische atmen dagegen hauptsächlich durch die Kiemen. Manche Fische, welche einen sehr fest schliessenden Kiemendeckel haben, wie der Aal und viele Cypriniden, können stundenlang, selbst tagelang ausserhalb des Wassers zubringen, ohne zu ersticken, indem die Wassermenge, welche in den nach aussen fest geschlossenen Kiemenhöhlen zurückgehalten ist, genügt, um die Aufnahme der durch den Mund eingeschnappten Luft durch die Kiemen zu vermitteln. Andere Fische, namentlich die mit sehr weiten Kiemenspalten und kurzen Kiemendeckeln versehenen Salmoniden, sterben aus dem Wasser genommen sehr bald ab. Bei den Neunaugen weichen auch die Kiemen von denen der anderen Fische ab. Sie sind nicht an Kiemenbögen befestigt, sondern bestehen jederseits in sieben Säckchen, welche durch ein festes Knorpelgerüst gestützt werden, und im Innern mit zahlreichen Kiemenfalten, welche die Stelle der Kiemenblättchen vertreten, bekleidet sind. Das Atemwasser wird aus der Mundhöhle durch einen besonderen Längskanal, welcher mit entsprechenden Seitenöffnungen versehen ist, zugeführt, und fliesst aus jedem Kiemensäckchen durch eine besondere Öffnung nach aussen ab. Die sieben äusseren Kiemenöffnungen samt dem Auge und dem einfachen Nasenloch sollen dem Fisch seinen Namen „Neunauge“ gegeben haben.
Ausser den Kiemen atmen die Fische auch durch die Haut, wie A v o n H u m b o l d t und P r o v e n ç a l [42] durch Versuche nachwiesen Kohlensäure wirkt nach diesen Forschern tödlich auf die Fische, während Stickstoff und Wasserstoff, wie bei den höheren Wirbeltieren, indifferent sind. In luftlosem (ausgekochtem) Wasser starben die eingesetzten Fische nach 1¾ bis 4 Stunden. Nach den genannten Untersuchungen berechnete Tr e v i r a n u s , dass die Schleihe, deren Sauerstoffbedürfnis für gering zu halten ist, für je 100 Gran Körpergewicht in 100 Minuten 0.01 cbcm Kohlensäure erzeugt, während Säugetiere das fünfzigfache an Kohlensäure produzieren.
