SH2 Domains
Functional Modules and Evolving Tools in Biology
Edited by Teresa Carlomagno
School of Biosciences, College of Life and Environmental Sciences, University of Birmingham, Birmingham, United Kingdom
Maja Köhn
Signalling Research Centres BIOSS & CIBSS, University of Freiburg, Freiburg, Germany
Editors Teresa Carlomagno
School of Biosciences, College of Life and Environmental Sciences
University of Birmingham Birmingham, United Kingdom
Maja Ko ¨ hn
Signalling Research Centres BIOSS & CIBSS
University of Freiburg Freiburg, Germany
ISSN 1064-3745ISSN 1940-6029 (electronic)
Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-0716-3392-2ISBN 978-1-0716-3393-9 (eBook) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3393-9
© The Editor(s) (if applicable) and The Author(s), under exclusive license to Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2023
This work is subject to copyright. All rights are solely and exclusively licensed by the Publisher, whether the whole or part of the material is concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation, computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not imply, even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations and therefore free for general use.
The publisher, the authors, and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty, expressed or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been made. The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
This Humana imprint is published by the registered company Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature.
The registered company address is: 1 New York Plaza, New York, NY 10004, U.S.A.
Paper in this product is recyclable.
Preface
SH2 domains are essential mediators of phosphotyrosine signaling pathways: they bind to disordered protein stretches containing phosphorylated tyrosine residues, thereby regulating the activity of several proteins, including kinases and phosphatases. Being involved in numerous cellular functions, SH2 domains have evolved to accommodate selectivity and specificity for diverse peptide sequences. Despite their small sizes and decades of structural and biophysical studies, the relationships between sequence, structure, dynamics and function of SH2 domains remain nebulous and are thus subject of active research.
In this book, we compile recent methods to study a variety of aspects related to understanding and modulating the biological function and mechanism of SH2 domains. In Part I, we present methodology aimed at determining the structures and dynamics of SH2 domains and their complex with phosphopeptides both in solution and in the crystal. These studies are indispensable to understand how structure and dynamic properties determine binding selectivity and specificity.
In Part II, we present methods to understand the biophysical properties and predict interactions of SH2 domains by either measuring or calculating the affinity of phosphopeptides to SH2 domains, by detecting transient binding events, and by interrogating protein databases to discover new SH2 domains binding motifs.
In Part III, we turn our attention to inhibitors of SH2 domains, leading the way for chemical tool development and drug discovery. The chapter presents methods to block SH2 domains by covalent linkage to phosphopeptides, to screen for small-molecule binders to SH2 domains and to determine their selectivity, as well as methods to synthesize a specific class of SH2 domain inhibitors with a macrocyclic peptide scaffold. In addition, we describe methods to study lipid recognition by SH2 domains, a property that is fundamental for the activity of SH2 domains at the plasma membrane.
In Part IV, we describe how to evolve and/or engineer SH2 domains with specific binding properties. These methods are important to develop SH2 domains into tools for cell and molecular biology, drug discovery, and even diagnostics.
Finally, SH2 domains are part of larger proteins, whose function they regulate through a plethora of mechanisms, including localization and enzymatic site blockage. In Part V, we describe how to measure the regulation of protein tyrosine phosphatase activity through allosteric binding of peptides to SH2 domains, a biochemical assay to study the interaction of SH2 domain–containing proteins with phosphopeptides at the membrane, and how to use phosphopeptides as baits to discover new SH2 domain–containing proteins.
We hope that this collection of methods will facilitate biophysical and biochemical research in this exciting, varied, and versatile class of regulatory and signaling domains.
Birmingham, United KingdomTeresa Carlomagno Freiburg, GermanyMaja Ko¨hn
PART ISTRUCTURE AND DYNAMICS OF SH2 DOMAINS
1 Methods for Structure Determination of SH2 Domain–Phosphopeptide Complexes by NMR 3
Vittoria Nanna, Michelangelo Marasco, John P. Kirkpatrick, and Teresa Carlomagno
2 NMR Methods to Study the Dynamics of SH2 Domain–Phosphopeptide Complexes .
Michelangelo Marasco, John P. Kirkpatrick, Vittoria Nanna, and Teresa Carlomagno
3 Crystal Structure Analysis of SH2 Domains in Complex with Phosphotyrosine Peptides .
Miki Senda and Toshiya Senda
4 Revealing Allostery in PTPN11 SH2 Domains from MD Simulations 59 Massimiliano Anselmi and Jochen S. Hub
5 Structure Determination of SH2–Phosphopeptide Complexes by X-Ray Crystallography: The Example of p120RasGAP
Amy L. Stiegler and Titus J. Boggon
PART II BIOPHYSICS AND BIOINFORMATICS OF SH2 DOMAIN–PHOSPHOPEPTIDE BINDING
6 Fluorescence Anisotropy and Polarization in the Characterization of Biomolecular Association Processes and Their Application to Study SH2 Domain Binding Affinity 93 Sara Bobone, Claudia Storti, Paolo Calligari, and Lorenzo Stella
7 Computational Evaluation of Peptide–Protein Binding Affinities: Application of Potential of Mean Force Calculations to SH2 Domains . . . .
113 Paolo Calligari, Lorenzo Stella, and Gianfranco Bocchinfuso
8 NMR Relaxation Dispersion Experiments to Study Phosphopeptide Recognition by SH2 Domains: The Grb2-SH2–Phosphopeptide Encounter Complex
Fabio C. L. Almeida, Karoline Sanches, Icaro P. Caruso, and Fernando A. Melo
9 Using Linear Motif Database Resources to Identify SH2 Domain Binders 153 Hugo Sa ´ mano-Sa ´ nchez, Toby J. Gibson, and Lucı ´ a B. Chemes
10 Using Surface Plasmon Resonance to Study SH2 Domain–Peptide Interactions .
Gabrielle M. Watson, Menachem J. Gunzburg, and Jacqueline A. Wilce
PART III SMALL-MOLECULE BINDERS AND INHIBITORS OF SH2 DOMAINS
11 Inhibitor Library Screening of SH2 Domains Through Denaturation-Based Assays .
Elvin D. de Araujo, Anna Orlova, Qirat F. Ashraf, Richard Moriggl, and Patrick T. Gunning
12 Dissecting Selectivity Determinants of Small-Molecule Inhibitors of SH2 Domains Via Fluorescence Polarization Assays 225 Angela Berg, Julian Grab, Barbara Klu ¨ ver, and Thorsten Berg
13 Lipid Binding of SH2 Domains
Wonhwa Cho, Kyli Berkley, and Ashutosh Sharma
14 Exploring the Binding Interaction Between Phosphotyrosine Peptides and SH2 Domains by Proximal Crosslinking
Rui Wang, Yishu Bao, and Jiang Xia
15 Synthesis and Biochemical Evaluation of Monocarboxylic GRB2 SH2 Domain Inhibitors
Tao Xiao, Min Zhang, and Haitao Ji
PART IV ENGINEERING SH2 DOMAINS
16 Engineering of SH2 Domains for the Recognition of Protein Tyrosine O-Sulfation Sites
Sean Paul Waldrop, Wei Niu, and Jiantao Guo
17 Engineering SH2 Domains with Tailored Specificities and Affinities
307 Gregory D. Martyn, Gianluca Veggiani, and Sachdev S. Sidhu
PART V SH2-DOMAIN CONTAINING PROTEINS AND REGULATION OF ACTIVITY
18 Measuring Protein Tyrosine Phosphatase Activity Dependent on SH2 Domain-Mediated Regulation 351 Pablo Rios, Azin Kiani, and Maja Ko¨hn
19 Peptides as Baits for the Coprecipitation of SH2 Domain-Containing Proteins
Azin Kiani, Pablo Rios, and Maja Ko¨hn
20 Biomolecular Condensation of SH2 Domain-Containing Proteins on Membranes
Longhui Zeng and Xiaolei Su
Contributors
FABIO C. L. ALMEIDA • National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO)/National Center for Nuclear Magnetic Resonance (CNRMN), Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil; Institute of Medical Biochemistry –IBqM, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
MASSIMILIANO ANSELMI • Theoretical Physics and Center for Biophysics, Saarland University, Saarbru¨cken, Germany
QIRAT F. ASHRAF • Department of Chemical and Physical Sciences, University of Toronto Mississauga, Mississauga, ON, Canada; Department of Chemistry, University of Toronto, Toronto, ON, Canada
YISHU BAO • Department of Chemistry, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, SAR, China
ANGELA BERG • Institute of Organic Chemistry, Leipzig University, Leipzig, Germany
THORSTEN BERG • Institute of Organic Chemistry, Leipzig University, Leipzig, Germany
KYLI BERKLEY • Department of Chemistry, University of Illinois at Chicago, Chicago, IL, USA
SARA BOBONE • Department of Chemical Science and Technologies, University of Rome Tor Vergata, Rome, Italy
GIANFRANCO BOCCHINFUSO • Department of Chemical Science and Technologies, University of Rome Tor Vergata, Rome, Italy
TITUS J. BOGGON • Department of Pharmacology, Yale University, New Haven, CT, USA; Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, New Haven, CT, USA; Yale Cancer Center, Yale University, New Haven, CT, USA
PAOLO CALLIGARI • Department of Chemical Science and Technologies, University of Rome Tor Vergata, Rome, Italy
TERESA CARLOMAGNO • School of Biosciences, University of Birmingham, Birmingham, UK; Institute of Cancer and Genomic Sciences, University of Birmingham, Birmingham, UK
ICARO P. CARUSO • National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO)/ National Center for Nuclear Magnetic Resonance (CNRMN), Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil; Multiuser Center for Biomolecular Innovation (CMIB), Department of Physics, Sao Paulo State University (UNESP), Sao Jose do Rio Preto, Sao Paulo, Brazil
LUCI ´ A B. CHEMES • Structural and Computational Biology Unit, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany; Instituto de Investigaciones Biotecnologicas, Universidad Nacional de San Martı ´ n (UNSAM) – Consejo Nacional de Investigaciones Cientı ´ ficas y Te´cnicas (CONICET), San Martı ´ n, Argentina; Escuela de Bio y Nanotecnologı ´ as (EByN), Universidad Nacional de San Martı ´ n, San Martı ´ n, Argentina
WONHWA CHO • Department of Chemistry, University of Illinois at Chicago, Chicago, IL, USA
ELVIN D. DE ARAUJO • Department of Chemical and Physical Sciences, University of Toronto Mississauga, Mississauga, ON, Canada
TOBY J. GIBSON • Structural and Computational Biology Unit, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany
JULIAN GRAB • Institute of Organic Chemistry, Leipzig University, Leipzig, Germany
PATRICK T. GUNNING • Department of Chemical and Physical Sciences, University of Toronto Mississauga, Mississauga, ON, Canada; Department of Chemistry, University of Toronto, Toronto, ON, Canada
MENACHEM J. GUNZBURG • Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University, Melbourne, VIC, Australia
JIANTAO GUO • Department of Chemistry, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE, USA; The Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication (NCIBC), University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE, USA
JOCHEN S. HUB • Theoretical Physics and Center for Biophysics, Saarland University, Saarbru¨cken, Germany
HAITAO JI • Drug Discovery Department, H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Tampa, FL, USA; Departments of Oncologic Sciences and Chemistry, University of South Florida, Tampa, FL, USA
AZIN KIANI • Faculty of Biology, Institute of Biology III, University of Freiburg, Freiburg, Germany; Signalling Research Centres BIOSS and CIBSS, University of Freiburg, Freiburg, Germany; Faculty of Chemistry and Pharmacy, University of Freiburg, Freiburg, Germany
JOHN P. KIRKPATRICK • School of Biosciences, University of Birmingham, Birmingham, UK
BARBARA KLU ¨ VER • Institute of Organic Chemistry, Leipzig University, Leipzig, Germany
MAJA KO ¨ HN • Faculty of Biology, Institute of Biology III, University of Freiburg, Freiburg, Germany; Signalling Research Centres BIOSS and CIBSS, University of Freiburg, Freiburg, Germany
MICHELANGELO MARASCO • Molecular Pharmacology Program, Sloan Kettering Institute for Cancer Research, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, USA
GREGORY D. MARTYN • Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, Toronto, ON, Canada; Department of Molecular Genetics, University of Toronto, Toronto, ON, Canada
FERNANDO A. MELO • Multiuser Center for Biomolecular Innovation (CMIB), Department of Physics, Sao Paulo State University (UNESP), Sao Jose do Rio Preto, Sao Paulo, Brazil
RICHARD MORIGGL • Institute of Animal Breeding and Genetics, University of Veterinary Medicine, Vienna, Austria
VITTORIA NANNA • BMWZ and Institute of Organic Chemistry, Leibniz University Hannover, Hannover, Germany; School of Biosciences, University of Birmingham, Birmingham, UK
WEI NIU • Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of NebraskaLincoln, Lincoln, NE, USA; The Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication (NCIBC), University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE, USA
ANNA ORLOVA • Institute of Animal Breeding and Genetics, University of Veterinary Medicine, Vienna, Austria
PABLO RIOS • Faculty of Biology, Institute of Biology III, University of Freiburg, Freiburg, Germany; Signalling Research Centres BIOSS and CIBSS, University of Freiburg, Freiburg, Germany
HUGO SA ´ MANO-SA ´ NCHEZ • Structural and Computational Biology Unit, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany; Zhejiang University School of Medicine, International Campus, Zhejiang University, Haining, China; Biomedical Sciences, Edinburgh Medical School, The University of Edinburgh, Edinburgh, UK
KAROLINE SANCHES • Medicinal Chemistry, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University, Parkville, VIC, Australia; ARC Centre for Fragment-Based Design, Monash University, Parkville, VIC, Australia
MIKI SENDA • Structural Biology Research Center, Institute of Materials Structure Science, High Energy Accelerator Research Organization (KEK), Tsukuba, Ibaraki, Japan
TOSHIYA SENDA • Structural Biology Research Center, Institute of Materials Structure Science, High Energy Accelerator Research Organization (KEK), Tsukuba, Ibaraki, Japan
ASHUTOSH SHARMA • Department of Chemistry, University of Illinois at Chicago, Chicago, IL, USA
SACHDEV S. SIDHU • Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, Toronto, ON, Canada; Department of Molecular Genetics, University of Toronto, Toronto, ON, Canada
LORENZO STELLA • Department of Chemical Science and Technologies, University of Rome Tor Vergata, Rome, Italy
AMY L. STIEGLER • Department of Pharmacology, Yale University, New Haven, CT, USA
CLAUDIA STORTI • Department of Chemical Science and Technologies, University of Rome Tor Vergata, Rome, Italy
XIAOLEI SU • Department of Cell Biology, Yale School of Medicine, New Haven, CT, USA; Yale Cancer Center, Yale University, New Haven, CT, USA
GIANLUCA VEGGIANI • Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, Toronto, ON, Canada
SEAN PAUL WALDROP • Department of Chemistry, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE, USA
RUI WANG • Department of Chemistry, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, SAR, China
GABRIELLE M. WATSON • The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, VIC, Australia
JACQUELINE A. WILCE • Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University, Clayton, VIC, Australia
JIANG XIA • Department of Chemistry, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, SAR, China
TAO XIAO • Drug Discovery Department, H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Tampa, FL, USA; Departments of Oncologic Sciences and Chemistry, University of South Florida, Tampa, FL, USA
LONGHUI ZENG • Department of Cell Biology, Yale School of Medicine, New Haven, CT, USA
MIN ZHANG • Drug Discovery Department, H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Tampa, FL, USA; Departments of Oncologic Sciences and Chemistry, University of South Florida, Tampa, FL, USA
3 Methods
3.1 Expression of the Protein
3.2 Protein
13C-and 15N-edited NMR experiments of 13C,15N-labeled biomolecules are sufficient to study systems up to 25 kDa, such as SH2 domains. Isotopic enrichment is achieved by growing cell cultures in minimal medium, where 15NH4Cl and 13C-glucose are the only source of nitrogen and carbon, respectively. We will describe a general expression protocol for Escherichia coli, which is the most common expression organism to produce isotope-labeled proteins. Most SH2 domains are expressed in bacterial hosts as soluble protein [6]. Whenever recombinant proteins expressed in bacteria aggregate, have low expression, or are insoluble or misfolded, other expression systems should be considered as an alternative, such as insect cells [7], yeast [8], or mammalian cells [9]. A standard expression protocol in E. coli is as follows:
1. Transform the expression plasmid into the appropriate E. coli expression line. The expression plasmid should encode for the protein tagged with a 6× His or other affinity tag to allow for target protein isolation. Some fusion proteins such as SUMO, thioredoxin, or glutathione S-transferase (GST) can improve solubility, help folding, and prevent the precipitation of the target protein in inclusion bodies.
2. Prepare a 50 mL overnight preculture by picking a colony from the plate and adding it to LB medium supplemented with the appropriate antibiotics, and shake it overnight at 37 °C.
3. The following day, spin down the appropriate amount of preculture according to the volume of main culture to grow. The dilution factor between the preculture and the main culture is 1:100. Resuspend the pellet in the M9 minimal medium supplemented with antibiotics and add it to 500 mL of medium in a 2 L flask. Grow the cells to OD600 of 0.6 at 37 °C with shaking at 250 rpm. Induce protein expression with the appropriate induction agent (i.e., 1 mM IPTG), and express according to pre-established optimal conditions of temperature and time. To save costs, the optimization of the expression protocol can be done with non-isotopically labeled material.
4. Harvest the cells by centrifugation at 3500 × g for 20 min and store the pellets at -20 °C.
1. Thaw the cell pellet on ice and resuspend it in lysis buffer.
2. Disrupt the cells by sonication or French press.
3. Centrifugate the lysate for 1 h at 18,500 × g and 4 °C t remove the cell debris. The target protein should be contained in the supernatant.
3.3 NMR Spectroscopy
3.3.1 NMR Sample Preparation
4. Using an FPLC system, His-tagged proteins can be purified by immobilized metal ions affinity chromatography (IMAC) columns, like HisTrap column (we use columns from Cytiva). Load the supernatant onto the column pre-equilibrated with wash buffer. Wash the column until the absorbance at 280 nm reaches the baseline, and elute the His-tagged protein with the elution buffer.
5. We advise to remove the affinity tag before NMR analysis. For this purpose, a cleavage site should be designed between the affinity tag and the protein sequence. Common proteases are human rhinovirus 3C, tobacco etch virus (TEV), and thrombin. The protease should contain the same tag as the target protein for the following purification step. If the protease needs specific buffer conditions for the cleavage, then add a desalting step before the overnight incubation with the protease. Otherwise, directly dialyze overnight against 2 L of wash buffer.
6. After the cleavage, run a second IMAC-based purification to separate the tag and the protease from the target protein.
7. Perform a size exclusion chromatography (SEC) run as the last purification step. Pool the fractions from the second IMAC purification and concentrate to a final volume of 1–2 mL. Load the sample on a gel filtration column (we use the Superdex 75 pg column from Cytiva). NMR experiments require high purity. If the protein is still not pure after gel filtration, alternative purification steps should be considered, such as ion exchange chromatography (see Note 5).
1. Identification of the optimal buffer. The identification of the optimal sample buffer for the NMR experiments is critical to ensure protein stability throughout the long measurements. Thermal shift assays (TSA) are an efficient way to screen different buffer conditions and additives by monitoring protein unfolding during thermal denaturation [10]. In TSAs protein unfolding is detected by monitoring the change in fluorescence intensity of a fluorescent, hydrophobic dye, which binds to the denatured protein. Although phosphate-containing buffer might yield optimal stability of SH2 domains, it is not recommended to use these buffers for binding assays, as high concentrations of phosphate ions in the buffer might compete with phosphopeptide binding. Whenever possible, a slightly acidic pH is preferred for NMR experiments to reduce the chemical exchange rate of the amide hydrogens with the aqueous solvent.
2. Add to the protein in the optimized buffer 10% of D2O and 50 μM DSS (sodium trimethylsilylpropanesulfonate).
3. The NMR sample concentration for measuring 3D experiments should be as high as possible (ideally between 300 μM and 1 mM). The volume required differs based on which type of NMR tube is used (see Note 4).
4. Before starting any relevant experiments for structure determination, test the protein sample stability. NMR experiments such as 3D NOESY have long acquisition times (from two or three days to a week). The protein must be stable at room temperature during the entire course of the NMR experiment. The best way to monitor the protein stability is to record a 1D 1H spectrum and a 15N-HSQC spectrum at regular time intervals. If the spectra remain identical, the sample does not change with time. If the protein undergoes degradation, sharp, poorly dispersed peaks appear in the 15N-HSQC spectrum.
5. Characterize the protein–peptide complex by NMR titrations. Follow the changes induced by the binding of the phosphopeptide to the protein by measuring a 15N-HSQC spectrum for each titration point. The endpoint of an NMR titration is reached when, upon addition of further ligand, the positions of the peaks no longer change (see Note 6).
6. Evaluate the kinetics of the binding event. In general terms, the binding of the protein (P) and the ligand (L) to form the complex (PL) is described by the equation:
where kon and koff are the association and dissociation rate constants, respectively.
The binding equilibrium is described by the dissociation constant KD, defined as
where [P], [L], and [PL] are the molar concentrations of, respectively, protein, ligand, and complex at the equilibrium.
The dissociation constant KD can also be written as the ratio of the dissociation rate and association rate constants (Eq. 3):
NMR experiments do not report directly on kon and koff rates but rather on the exchange rate kex:
ex = k on ½L þ k off
The term chemical exchange refers to all phenomena observed in NMR spectroscopy when a system interconverts
3.3.2 NMR Experiments
between at least two distinct states over time. An example of chemical exchange is the equilibrium between the free and bound states of a protein in the presence of a ligand. Three exchange regimes are distinguishable depending on the magnitude of the exchange rate relative to the difference in NMR frequencies between the free and bound states (Δν):
Slow exchange regime:
Intermediate exchange regime:
Fast exchange regime:
By monitoring the changes in the 15N-HSQC spectrum of the protein upon titration of the ligand, determine the exchange regime of the protein–ligand complex under investigation (Fig. 1). If during the titration the intensities of the peaks of the apo protein species diminish and new peaks appear elsewhere in the spectrum, with their intensity increasing with the ligand concentration, the complex is in the slow exchange regime. The new peaks represent the ligand-bound state of the protein. If the peaks of the protein species move across the spectrum without significantly changing in intensity or linewidth as the ligand concentration increases, the complex is in the fast exchange regime. In this case, a generic NMR property A measured for the protein peaks at each titration point is a population-weighted average of A in the free and ligand-bound protein species:
Finally, if the protein peaks broaden or completely disappear at low ligand concentrations and reappear at higher ligand concentrations, the complex is in the intermediate exchange regime.
The stoichiometry and KD of the protein–peptide complex determine how the NMR sample should be prepared (see Subheading 3.3.2). Studying systems in the intermediate exchange regime can be challenging due to line-broadening.
NMR structure determination is based on the measurement of interatomic distances between hydrogens; thus, it is essential to assign all hydrogen resonances of both the protein and the peptide. The most common assignment approach relies on the combination of experiments that correlate resonances via through-bond or through-space interactions between the respective nuclei.
Fig. 1 Exchange regimes and corresponding 15N-HSQC spectra. Changes in the appearance of the protein peaks in a 15N-HSQC spectrum upon addition of increasing quantities of the peptide depend on the exchange regime of the complex. In each panel, a schematic peak is shown over a series of 15N-HSQC spectra measured after each peptide addition (left). The intensities of the peaks are shown on the (right). The peaks of the free and bound protein species are in red and purple, respectively. The protein peaks at peptide–protein ratios below the protein saturation value are in yellow, green, and blue. (a) Slow exchange: the peak corresponding to the free protein (red) diminishes in intensity as the peak corresponding to the bound protein (purple) appears elsewhere in the spectrum and increases in intensity with the ligand concentration. (b) Intermediate exchange: upon addition of the peptide ligand, the protein peak moves continuously from the position corresponding to the free state towards the position corresponding to the bound protein. At the same time, the peak either
1. Assign the resonances of the protein backbone atoms (1HN, 15N, Cα,Cβ, and C′). This step relies on the 2D 15N-HSQC and three-dimensional (3D) triple-resonance experiments HNCACB, HN(CO)CACB, and HNCO (Fig. 2)[11–13]. In the NMR sample used for the assignment of protein resonances, the phosphopeptide should be added in amounts that guarantee protein saturation. The HNCACB experiment correlates the amide 1HN and 15N resonances to the carbon resonances of 13Cα and 13Cβ of both the same amino acid and the preceding one. The HN(CO)CACB experiment correlates the amide 1HN and 15N resonances to the carbon resonances of the 13Cα and 13Cβ of only the preceding amino acid. A sequential link can be made when a pair of peaks appear at the same 13Cα and 13Cβ frequencies in both the HNCACB and HN(CO)CACB experiments. Certain amino acids, such as glycine, serine, threonine, and alanine, have characteristic Cα and Cβ chemical shifts making them easy to identify. If a sequential stretch of amino acids is identified that represents a unique motif in the protein sequence, the amide resonances can be unambiguously assigned to the corresponding residues, thus providing starting points for the sequential assignment. The HNCO spectrum facilitates the identification of overlapped peaks in the 15N-HSQC spectrum and allows the assignment of the carbonyl carbon C′ in the backbone, which is useful to predict the dihedral angles φ and ψ of the corresponding peptide bond.
2. Assign the chemical shifts of protein aliphatic side-chain hydrogens. This assignment step is performed through a combination of HN(CO)CACB, H(CCCO)NH-TOCSY, and HCCHTOCSY experiments (Fig. 3). The H(CCCO)NH-TOCSY correlates 1HN and 15N amide resonances of one residue (residue i) with all side-chain hydrogens of the preceding residue (residue i - 1) [14–16]. As mentioned before, the HN(CO)CACB provides the Cα and Cβ frequencies of residue i - 1. Using the combination of H(CCCO)NH-TOCSY and HN (CO)CACB, the Hα-Cα peaks of each residue can be assigned in the 13C-HSQC spectrum. The HCCH-TOCSY experiment is a double resonance experiment that correlates the 13C and 1H frequencies of C-H groups to all other hydrogens in the side chain of the same residue.
Fig. 1 (continued) broadens or completely disappears at low ligand concentrations and reappears at higher ligand concentrations. (c) Fast exchange: upon addition of the peptide ligand, the protein peak moves continuously from the position corresponding to the free state towards the position corresponding to the bound protein without changes in the linewidth other than those expected from the increased rotational correlation time of the complex
Fig. 2 2D and 3D spectra required for the assignment of the protein backbone resonances. (a) 15N-HSQC spectrum of the 13C,15N-labeled N-SH2 domain of PLCγ1 in complex with a phosphopeptide. Each amide group in the protein, with the exception of proline, yields a peak in the spectrum. Well-dispersed peaks in this spectrum indicate that the protein is folded. (b) 3D experiments for protein backbone assignment can be depicted as a 2D 15N-HSQC spectrum whose peaks are spread (in some experiments multiple times) along a third axis representing the 13C dimension. (c) Peaks in 3D spectra are commonly visualized as strips. For each pair of 1H and 15N resonances in the 15N-HSQC spectrum, the strip shows the 13C frequencies in the full vertical dimension and the 1H frequency of the pair in the horizontal dimension. The 15N dimension is perpendicular to the plane of the strip and determines from which1H,13C plane of the 3D spectrum the strip originates. Left, example strip from an HNCACB experiment. Note the presence of two Cα peaks (blue) and two Cβ peaks (green). Right, example of sequential assignment based on the HNCACB and HN(CO)CACB experiments. In the strips generated from the HN(CO)CACB spectrum, the Cα and Cβ peaks are in red and in yellow, respectively. Residue i can be connected to residue i - 1 because a pair of peaks appears at the same Cα and Cβ frequencies in both experiments. Residue i can be identified as a glycine since it yields only a Cα peak (no Cβ) at a characteristic frequency
Fig. 3 2D and 3D spectra required for the assignment of the protein side-chain resonances. (a) 13C-HSQC spectrum of the 13C,15N-labeled N-SH2 domain of PLCγ1 in complex with a phosphopeptide (left). Expansion of one region of the 13C-HSQC (right). The Hα resonance indicated by the dashed line is found in the H(CCCO)NH-TOCSY experiment (panel b), correlated to the 15N and 1H resonances of the amide group of the following residue: the same 15N and 1H resonances show a peak with the Cα frequency indicated by the dashed line in the HN(CO)CACB spectrum (panel c). (d) Ideally, the HCCH-TOCSY experiment yields strips for all side-chain carbon resonances, connecting all side-chain hydrogen resonances. In the example shown, the diagonal peak is centered on the Hα and Cα resonances of V628, and the cross peaks correlate this Hα and Cα pair with all side-chain hydrogens of the same residue (Hα, Hβ, Hγ1, Hγ2)
3. Assign the chemical shifts of protein aromatic side-chain hydrogens. This assignment is accomplished through 2D (HB)CB (CGCD)HD and 2D (HB)CB(CGCDCE)HE experiments, which correlate the Cβ resonance of an aromatic residue with the resonances of either hydrogen Hδ or hydrogens Hδ and Hε of the same residue, respectively [17]. Once the chemical shifts of the aromatic side-chain hydrogens are known, the corresponding carbon resonances can be assigned from a 13C-HSQC spectrum.
4. Use 2D double-13C,15N-filtered-NOESY and 2D double-13C,15N-filtered-TOCSYexperiments to assign the resonances of the bound unlabeled peptide [18]. With the term filtered,we indicate the rejection of the signals from hydrogens attached to an isotope-labeled heteroatom (13Cor 15N). Hence, the filter elements in the double-13C,15N-filtered-NOESY and TOCSY select signals arising from protons attached to 12Cor 14N nuclei. Since the protein is 15N,13C-labeled, the double-filtered experiments yield only signals from the unlabeled peptide. Other unlabeled species in solution containing hydrogens, such as the buffer components, are best replaced by the corresponding deuterated species (see Note 7). The double-13C,15N-filtered-TOCSY experiment correlates all hydrogens located within the same amino acid of the peptide. The assignment is based on pattern recognition of the cross peaks. The identified amino acids can be linked sequentially using the double-13C,15N-filtered-NOESY, which correlates each hydrogen with all nearby hydrogens in the peptide. For complexes with a low KD, use a slight excess of protein to maximize the amount of bound peptide in solution. For complexes with a KD in the μM–mM range, prepare a sample that contains as much protein in excess as necessary to saturate the peptide.
5. Measure interatomic distances from multidimensional NOESY spectra. The most widely used set of structural restraints in structure determination by NMR consists of inter-hydrogen distances derived from multidimensional NOESY spectra. The intensities of peaks correlating the frequencies of two hydrogen atoms in these NOESY spectra (the NOE peaks) can be converted into internuclear distances of the correlated atom pairs (see Note 8).
In the structure calculation of a protein–peptide complex, we distinguish three sets of distance restraints: intramolecular protein NOEs, intermolecular protein–peptide NOEs, and intramolecular peptide NOEs.
To obtain these distances, record the following experiments:
Intramolecularprotein NOEs:3DNOESY-15N-HSQCand 3DNOESY-13C-HSQC,whichyieldbothintramolecular
Fig. 4 The protein–peptide complex is depicted on the left-hand side with its isotope labeling pattern; 1H atoms are shown bound to the corresponding heteroatom, either NMR active (13C and 15N) in the protein or NMR inactive (12C and 14N) in the peptide. A schematic representation of different NOESY experiments is given on the right-hand side. Diagonal peaks and intramolecular NOE cross peaks from the protein and the peptide are colored in blue and red, respectively. Intermolecular NOE cross peaks are colored in purple. (a) Scheme of a plane from a NOESY-15N/13C-HSQC spectrum; it contains both intramolecular protein (blue) and intermolecular protein–peptide (purple) NOE peaks. (b) Scheme of a plane from a 13C,15N-filtered-NOESY-13C/15N-HSQC spectrum; it contains only intermolecular protein–peptide NOEs (purple). (c) Scheme of 2D double-13C,15N-filtered-NOESY spectrum; it contains exclusively intramolecular peptide NOEs
protein and intermolecular protein–peptide NOE peaks and hence distances; [ – ](see Note 9). 21 19
Intermolecular protein–peptide NOEs:3D 13C,15N-filteredNOESY-13C-HSQC and 3D 13C,15N-filtered-NOESY-15N-HSQC [18], which yield intermolecular protein–peptide NOEs (Fig. 4); (see Note 10).
Intramolecular peptide NOEs: 2D double-13C,15N-filteredNOESY, which yields exclusively intramolecular peptide NOEs [18]. (see Note 11).
6. Perform structure calculations. Supply the chemical-shift assignments and the list of NOE cross-peaks (positions and intensities) from the NOESY spectra to the software ARIA, a program for automated NOE assignment and structure calculation (see Note 12). The first step of the iterative protocol in an ARIA run is the calibration; it consists in the calculation of a scale factor C (named calibration factor) that is applied in the conversion of the peak intensities into distances. We have described that for complexes in fast exchange regime the conversion of the NOEs into distances is not accurate. To reduce the errors in the calculation of the scale factor, the intermolecular NOEs require a different calibration procedure (see Note 13). In addition to the distance restraints derived from NOESY spectra, ARIA can integrate dihedral angle restraints for the protein backbone that can be predicted from the backbone chemical shifts using software such as TALOS-N [22] or DANGLE [23]. Informative resources on ARIA are available elsewhere [3, 24]. At the end of the ARIA run, inspect the list of violated restraints, and reanalyze the spectra to correct erroneous assignments or wrongly selected NOE cross peaks. Run ARIA again with the corrected input data, and repeat this cycle until the structure ensemble and the restraint violation list pass standard quality control criteria established for NMR structure calculations [25].
7. Assess the quality of the structure with independent structure validation tools. These tools detect possible distortions in the geometry of the protein by comparing it to parameters derived from high-resolution protein structures. A useful validation resource is the web server PSVS (protein structure validation software suite), which integrates several widely used structure quality evaluation tools [26].
8. Deposit the final structural data in publicly available databases. After validation of the structure ensemble, deposit chemicalshift information in the BioMagResBank (BMRB) and the coordinates of the structure ensemble as well as the NOE data in the Protein Data Bank (PDB).
4 Notes
1. The final trace-element solution turns a golden color.
2. The CaCl2 and the trace-element mix should be added after the filtration to avoid the precipitation of salt on the filtering membrane.
3. It is possible to protect the peptides from proteolysis by protecting the N-and C-termini with acetyl and amide groups, respectively.
4. NMR tubes are available in various diameters and shapes. The most common diameters are 5 and 3 mm: these tubes require a sample volume of 500–650 μL and 170–180 μL, respectively. Shigemi tubes are usually chosen when a limited amount of sample is available since they require smaller volumes (around 300 μL for a 5-mm diameter Shigemi tube). In principle, the signal-to-noise ratio (S/N) decreases with the diameter of the tube (for a solution at constant concentration). However, the concomitant decrease in volume allows for the preparation of more concentrated solution (for the same amount of protein, providing that the protein is soluble at the higher concentration) and performs better in the presence of salty buffers (the loss of S/N with salty buffers being less severe than would be expected simply from the relative sample volumes). It is important to add the proper volume in each NMR tube since insufficient volume may cause sub-optimal magnetic field homogeneity in the active volume and consequently spectra with poor resolution and line shape. For samples in salty buffers, 3 mm tubes should be preferred.
5. To reach the concentration required for the NMR sample, proteins are often concentrated after the SEC run using centrifugal concentrators. The filters of new concentrators are protected with glycerol, which must be removed by at least three washes with ultrapure water or buffer.
6. The protein spectrum is sensitive to pH, salt concentration, volume, and solvent of the ligand stock (e.g., DMSO). Appropriate controls should be measured. The concentration of the peptide stock solution should be high to minimize the volume change during the titration (do not exceed 10%).
7. Since deuterated buffers are expensive, it is preferable to prepare only the final sample in deuterated NMR buffer. We usually perform a buffer exchange by ultrafiltration. The protein sample is diluted tenfold in deuterated NMR buffer and reconcentrated to the initial volume using a centrifugal concentrator. The dilution–concentration process is repeated multiple times (at least three) to completely remove the protonated buffer. The phosphopeptide stock solution can be directly prepared using the deuterated buffer.
8. The inter-hydrogen distances obtained from the NOE intensities should be corrected for spin diffusion. This is done through integration of the relaxation matrix in the ARIA protocol.
9. In the protein–peptide complex used for structure determination by NMR, the protein is uniformly 15N,13C-labeled and the peptide is unlabeled. The NOESY-15N-HSQC and NOESY-13C-HSQC correlate 1H-15N and the 1H-13C groups with the resonances of nearby hydrogen atoms, respectively. Hence, the NOESY-15N-HSQC and 3D NOESY-13C-HSQC experiments show cross peaks arising from both intramolecular protein NOEs and protein–peptide intermolecular NOEs (wherein the 1H-15N and the 1H-13C groups belong to the protein). In other words, the two experiments detect NOEs between proximal hydrogen atoms as long as at least one of them is directly bound to a 13Cor 15N atom. Since the peptide is unlabeled and the amount of peptide with 13C and 15Nin natural abundance can be neglected, no intra-peptide NOEs are detected in these experiments. The vast majority of peaks stem from intramolecular protein NOEs. For these experiments, it is fundamental to maximize the peptide-bound population of the protein. For protein–peptide complexes with a low KD (~100 times lower than the concentration of the complex), full saturation is achieved by adding peptide in slight excess with respect to the stoichiometric ratio of the two species in the complex. Complexes with low KD have slow koff values and thus the NMR peaks of the protein are usually in the slow exchange regime. If the peaks of the protein are found to be in the fast exchange regime during peptide titration experiments, the KD is usually in the μM–mM range. The relative amount of peptide–protein necessary to reach protein saturation (i.e., no further movement of the protein peaks upon addition of more quantity of the peptide) depends on the total concentration of the species and must be determined in the preliminary NMR titration experiments. For KD values in the mM range, saturation of the protein might require as much as a 100-fold excess of peptide.
10. Isotope filtering approaches come in useful to distinguish between the intramolecular protein NOEs and the protein–peptide intermolecular NOEs as well as to detect the intrapeptide NOEs. In 13C,15N-filtered-NOESY-13C-HSQC and 13C,15N-filtered-NOESY-15N-HSQC experiments, a filter element selects NOEs arising between hydrogen pairs provided that only one of the hydrogen atoms in the pair is directly attached to a 13C or 15N atom, thus enabling selective detection of intermolecular protein–peptide NOEs [18]. For tightly binding peptides, which usually have a KD much lower than the concentration of the species in solution, the sample should be prepared with a slight excess of peptide to ensure that the protein is fully bound. The chemical-shift positions of the intermolecular NOEs measured in such conditions correspond
Another random document with no related content on Scribd:
már két gorombaságot mondott nekem, de mind a kétszer összecsókolt utána – es war ja nicht bös gemeint – mondta s egy perczre el nem hágy, mióta megbocsájtottam neki. Roppant férfias mozdulatok, bizonyos férfiaknak, meg az asszonyoknak tetszik. Én nekem is… bár egy kicsit olyan, mint egy elszabadult csikó.
Ezek a főbb alakok. Férfiak? Hansi, a bátyja, Niki és Stapszi (Istenem, de meguntam már őket), egy Gysenburg-Stachberg, a család feje, egy kis uralkodó herczeg, Ausztria legnagyobb partieja. Míg a férfiak vadásznak, addig a lányok őt vadászszák, «mert én jobb szeretem a vad libáknál a szelídeket», súgta nekem ebéd alatt, ezzel igen nagy bizalmat árult el irántam. De mit folytassam tovább, mind egyformák, legalább nékem. *
Augusztus 16-án.
Sándort alig látom. Egész nap vadászik. Este halálra ki van merülve. De hát ez már vadászatoknál így szokás. Ebéd után vele lehetnék, de ha ő nem, én sem.
Ma este Pepi jött le hozzám. Én fáradt voltam, le akartam feküdni. Tulajdonkép nem tudom miért, de rosszkedvű voltam. Azt hiszem, a Katinka-ligetre gondoltam, azért. Pepi leült ágyam szélére.
– Látod, édes gyermekem, ha én te lennék, másképen élnék.
– Hiszen én olyan formán élek, mint te, csak mindenből kevesebbet.
– Néked édes Minim – mondta s hangja színtelen lett – nincs okod arra, hogy úgy élj, mint én. Te… boldog is lehetsz.
Csodálkozva néztem reá. Kissé furcsa volt, hogy így, első látásra olyan húrt pendít meg, melyből élettörténetére vonhatok következtetést.
– Látod, te szép vagy, én sohasem voltam. (Ebben igaza van.) A te férjed derék ember, s nem volt okod, miért ne menj szerelemből hozzá (ez is igaz), te fiatal vagy… nézd. Én, a híres Pepi herczegné,
ki egész Bécset mulattatja, kinek kalandjairól két ország beszél, hiszed-e, ha elmondom – soha boldog nem voltam. Mit ér egy ilyen élet? Reggeltől estig hajsza, hogy a szív csendjét befödje. Mit ér? Menj haza férjeddel, kérd bocsánatát. Mert a hiba benned kell hogy legyen. Ismertem Sándort rég, a Bálványosyak között a legtöbbet ér. Menj haza vele s hagyj minket tánczolni a mi korpára épült tündérvárainkban.
Én megcsókoltam a kezét. *
Augusztus 18-án.
Sándorral párbeszéd.
– Menjünk haza, Sándor, én már úgy vágyom haza.
– A hogy akarja, pár napig azonban még nem lehet, most, hogy a vadászatra a meghivást elfogadtam s én egy más vadász helyét elfoglalom, itt kell maradnunk végig.
– De én… én, úgy akarom!
– Mini maga parancsol s én… cselekszem, – mondta Sándor s megcsókolta homlokomat.
De azért itt maradtunk, ő győzedelmeskedett.
*
Augusztus 19-én.
Szemtelenség, szemtelenség. Ime Elektől ez a levél: «Édes Mini!
Tudja, hogy szeretem. Tudja attól a percztől, hogy a Katinkaligetben megcsókoltam a kezét. Tudom jól, hogy a maga lelke az én lelkemhez hasonló, s hogy a Sándor és maga között áthidalhatatlan örvény van, mert nincsenek egy anyagból. Szeretem. Maga volt az első, ki lelkemet felgyújtotta. Maga adott vissza önmagamnak. Nem
tudja, mily üres volt életem, mielőtt megláttam. Az egész világban csak a szép érdekelt, s magában megtaláltam azt, a ki az asszonyban visszaadja ezt nékem. Nem szépségéről beszélek. Lelkéről. Van valami a tekintetében, a miből érzem, egy velem, egynek kell lennie, akár akarja, akár nem. Talán sohasem fog rólam többé hallani. De ezt meg kellett írnom. Tán tudja, hogy egy nagybátyám meghalt, váratlan óriási vagyon örököse lettem. Gazdagabb vagyok ma, mint Sándor. Ha ez egy év előtt történik, ma már nőm. De hát ezelőtt nemcsak szegény, de büszke is voltam. Kerültem magát. Ma megmondom azt, a mit úgy is tud. Későn találtunk egymásra, nagyon késő… Ne halljon rólam többet. Egy nagyobb afrikai utat teszek – az Isten áldja. Elek.»
Ezt a levelet merte nékem írni. Hát azt hiszi, most már majd írni fogok neki, hogy kérni fogom, térjen vissza. Soha – Sándoré testemlelkem. És boldoggá fogom tenni, mert megérdemli. Az Elek útjait az Isten vezérelje!
* Augusztus 20-án.
Pepinél.
– Mondd, mit tennél, ha házasságod után 3 hóra a férjed elhanyagolna – a saját hibádból – s egy más ember üldözne szerelmével?
– Megmondanám férjemnek, – mondá Pepi, – az agyonlőné azt, a ki «üldöz szerelmével» s ez energikus actiója által ismét visszatérne hozzám.
Ezen gondolkozom.
* Augusztus 21-én.
Nem, nem. A mit Pepi mond, az mégis lehetetlen. A skandalum, aztán meg Sándornak is történhetne baja. És Eleknek? Ezzel nem
törődnék? Ha tudnám. Levelét nem téptem el; pedig mindig megbosszant, ha újra átolvasom.
*
Augusztus 22-én.
A vadászatok utolsó estéjén nagy bál. Roppant körülvettek, szép voltam s okosabb, mint ezek a jó bécsi dámák, kik gorombaságukkal akarják szellemi hiányaikat fedezni. Persze az egy Pepit kivéve, ki csak úgy csillogott-villogott a jókedvtől, szellemtől s a gyémántoktól. Folyton tánczolt. Tánczközben megérintette toll legyezőjével a vállamat, «menj haza, Mini… még nem késő», súgta angolul. Pedig milyen szép egy ilyen bál!
Sándor nem tánczolt, egy sarokban ült az öreg herczegnővel s annyira elmerült a beszélgetésbe, hogy engem észre sem vett. Megunt volna?
Holnap haza megyünk. *
Augusztus 24-én.
Elutaztunk. A vasuton Sándor elmondta, hogy Elek nagy örökséget csinált. Én majd csak hogy a szavába nem vágtam, hogy tudom.
Aztán… észrevettem magamat. És most e perczben közeledjek hozzá? Hazugságra állva kezdjem el a boldogságot… Nem, nem. Pedig hazudni tudok, jó iskolában nőttem fel erre. De ilyen esetekben nem. Éreztem, hogy egy borzasztó árny tolult közénk. Sándor pedig meleg volt velem s jóságos… Azt mondta, csak azért tartotta távol magát tőlem, nehogy azt mondhassák: ezek csak úgy, mint a fürediek, hogy én vagyok a dologban a hibás. Úgy akarta feltűntetni, mintha ez kettőnk közös megegyezése lenne.
– És úgy-e, ha ez így is volt, ezentúl nem lesz így, – mondta s közelebb húzódott hozzám s lágyan, olyan lágyan, mint azokban az időkben rég, nézett a szemembe. És én e két szemében valami
olyan igen fájdalmas vonást láttam meg, és én e két szem kifejezését, tekintetét, melegségét nem birtam el többet. E perczben igen tudom hogy lehettünk volna ketten még. De hát az a harmadik! Hátha a Pepi tanácsát elfogadnám… igaz, ha megmondanék neki mindent. Nem, nem birom. Félek, félek.
Sándor át akart ölelni – s én visszavonulva a kupé egyik sarkába, sírva fakadtam – s nem hagytam magam. Azt hiszem, hogy nagyon boldogtalan vagyok.
Augusztus 26-án.
Igen, boldogtalan. Átolvasom e naplót idáig. Mi lesz velem? Most itt vagyok, hol boldog voltam pár napig; hol boldogíthattam volna valakit. De hogyan? Hiszen egész életem hazugság az első pillanattól kezdve. Ez az Elek-féle levél csak megvilágította azt, a mit már oly rég éreztem. Minden a lelkemben, egész életem csak hazugság. Megszülettem. A gyermekszoba már a hazugság páráival telítve. Hazudtam akkor, midőn anyám s atyám kezét naponta megcsókoltam, mert nem tisztelhettem őket. Hazudtam, midőn a myrtuskoszorúval oda álltam az oltár elé, mert ha testem szűzi volt is, lelkem tele volt szenynyel. Hazudtam a nagy világban, mert csak mesteri hazudozással lehettem mindig az első. Hamisnak, hazugnak kellett lennem, hogy nyerjek. Hazudtam, midőn hűséget s szerelmet igértem ennek a becsületes embernek. Hazudtam önmagammal szemben, midőn most azóta azt hittem, hogy a mulatság iránt van érzékem csak, hazudtam néha még akkor is önmagamnak, midőn el akartam magammal hitetni, hogy boldog vagyok.
Hazudtam Eleknek, midőn úgy tettem, hogy nem ismerem fel szerelmét, álnok vagyok ma, midőn ezt a levelet folyton magamnál hordom, hogy senki rá ne találjon, s midőn mosolyogva hazudok néki derült, nyugodt boldogságot, hogy ne tudjon meg semmit. Hazugságon állok, erre épült lelkem egész világa, erre jövőm… s most hogy boruljak én egy becsületes ember keblére s hogy élhessek az oldalán.
Ha bevallanék néki mindent? Pedig ez lenne az egyetlen mód a boldogulásra. Hogy legyen? Nincs erőm, nincs erőm, hogy gőgös büszkeségemet megtörjem, hogy kicsinynyé váljak előtte s meghajtsam fejemet, én, ki mindig s mindenütt az első voltam s ehhez vagyok szokva.
Folyton kerülöm, pedig vele szeretnék lenni, vele, hogy elbirjam azt, hogy az a levél úgy hiszem kiégeti a szívem egész érzésvilágát…
Augusztus 27-én.
Mamától egy levél. Leírom… mentségemül. «Légy mindig jó férjeddel. Látod, sokat köszönhetsz néki, hallom minden oldalról, hogy debut-d épp oly jól sikerült Füreden, mint Ausztriában. Ez nem kis dolog; és kivált így a «mézes hetek» alatt. Büszke vagyok rád, jól neveltelek. Érted, hogy kell az emberekkel bánni s hogy lehet mindig s minden körülmények között – nyakukra hágni, s erős kézzel ragadni meg az «elsőség» kormánygyeplőjét. Örülök, hogy boldogságod mellett «tenni» is rá érsz. Én tán azért nem értem rá soha, mert boldogtalanságom elfoglalt. A papa? Olyanabb az olyannál, multkor a bécsi angol követ tiszteletére ebédet adtam, képzeld, nem jött el, mint háziúr. Nem tudtam hová lenni szégyenletemben, ismét egy újat kezdett… De hát hogy értenéd meg, mibe kerül nékem ez a mosoly, a melylyel semmit, de semmit sem akarok meglátni, s a melylyel mindent, de mindent elfedek…»
Ez a mosoly, ez is hazugság. Hát ez a mi sorsunk? Boldogtalanság, szerencse, boldogság, minden csak hazug módon viselve?
* Szeptember 2-án.
Félek tőle. Ma oly jó volt velem, oda jött hozzám, mikor sirtam, rá tette erős kezét a homlokomra s lassan felemelte fejemet. Szemeim kifejezését kereste.
– Miért sír? Tán boldogtalan? Lássa, én nem lehetek mindig emberek között, nem bírom ki a léhaságukat.
– Hát azt hiszi, – akartam kiáltani neki, de megakadt a szó a torkomon. Ha én most oda mehetnék hozzá, s megcsókolva nyugodt, tiszta homlokát, azt mondanám neki: «Bocsáss meg, én szegény, bűnös asszony vagyok, ki hazudtam néked akkor, midőn az oltár előtt álltunk. De ma igaz szívvel mondhatom néked, hogy szeretlek, s te vagy boldogságom, mindenem.» De az igazság lenne-e ez? Hisz még az a levél, a mit az a másik írt, mindig megvan, még megcsalom minden felkelő nappal, még napról napra mélyebben sülyedek a sárba.
Ha több ember lenne körültünk, igyekezném magamat új alakban mutatni, de vele szemben az igazságot csak is ezzel a levél felmutatásával kéne kezdenem. És erre képes soha sem leszek.
Szeptember 10-én.
Azt hiszem, igen boldogtalanná teszem. Azt hiszem, tönkre teszem átkos viselkedésemmel. Úgy hitte, unom magamat; egy hétig tele volt a ház vendéggel. Ekkor napokig nem is mutattam magamat. Ekkor megkorholt, kemény volt velem. S még ilyen perczekben érzem legközelebb magamat hozzá. Ilyenkor nem félek a szemébe tekinteni, ilyenkor oly jól esik, hogy lágyan, melegen tekint a szavai sulyos értelmeinek daczára reám. De aztán, s ez a bökkenő, hogy nem szólok ellen s megalázkodom, megteszem, a mit mond, mintha elszégyelné magát, bocsánatot kér ilyenkor tőlem: s ez a bocsánatkérés már épp elviselhetetlen.
*
Szeptember 15-én.
Határozottan rosszul néz ki s beteg. Ma elvitt kocsin arra a birtokra, a melyet nékem szánt még akkor. Ott egy új cottageszerű házat építtetett, azt mutatta meg nékem. A nagy fáczányos szélén áll a kis épület. A mesterek három hónapig dolgoztak csak rajta.
Természetes fa- s téglából készült kis emeletes alkotmány, gerendás tornáczokkal, czinóberszínű ajtók- s gerendaszélekkel. A terrasseokon angol piros fonott bútorok, nehány salon, s egy nagy hálószoba, a főépületben. Az utolsó szobában – az arczképe. Akkor festette Sargeant, a nagy angol mester, mikor jegyben jártunk. A hasonlóság feltünő, de a mellett ijesztő látni, mennyit öregedett azóta. Mi baja lehet? Arczbőre sárgás, szemei beestek, haja deresedni kezd. Én teszem tönkre? Boldogtalan volna? Annyira meghatott a kép, hogy a mellére borultam, s nem akartam sem az eredetit, sem a portrait-t látni.
Pedig ma majdnem derült volt máskorhoz képest arczkifejezése. Látszott arczán, hogy boldog, hogy e birtokot a házzal együtt végleg átadhatja nékem. Ha én most ezt igaz szívvel, tiszta szemmel fogadhatnám el, ha egyenesen szemébe tekintve így szólhatnék neki: – Köszönöm férjem, ajándékod nagy értékü és nemes, vedd érte szerelmemet, a melynél többel nem birok.
Ha ezt mondhattam volna néki!
* Szeptember 20-án.
Nem, határozottan nem irok többé naplót. Ez átkos papiron szoktam rá a hazudozásra, s most, hogy lelkem igazságos képét irom le, napról napra nem birom el a sulyát. Bele bolondulok.
Nem jó az embernek igen mélyen tekinteni bele a lelke világába. Addig, mig külső éltemet írtam le benne, mulattatott a dolog. Aztán –igen, kimondom, szégyeltem, – ma, megörjít.
Nem irok többet.
* Október 3-án.
Indulunk. Mától kezdve megint elkezdem az írást. Nem birom ki. Hogy ha még le sem írom, a mit érzek, úgy egészen egyedül
vagyok. Igy legalább megkönnyit az, a mit énemből kipusztítok az által, hogy papirra vetem.
Indulunk. Tegnapelőtt mondta Sándor, hogy el van tökélve délolaszországi s algieri útját megtenni. Én eleinte elleneztem (már megint hazudtam, nem mondhattam, hogy azért nem akartam menni, mert Elek is ott lesz). Sándor azt hitte, a pesti világot sajnálom, megigérte, hogy Cannesba visz a tavaszi hónapokra. Pfuj, milyen véleménye van rólam, de megérdemlem. Legyen ez a bünhödésem. Nem ellenkeztem tovább, nem is mondtam ellent. Higyjen rólam annyi rosszat, a mennyit lehet. Az sem lesz elég…
Október 6-án.
Az utolsó pillanatban egyedül oda szaladtam a partra, előttem a Körös, tovább a Katinkaliget, s a láthatárig a puszta. Mit mindent hagyott itt, a mit nem tudtam életté átváltoztatni… * Október 10-én.
Ime Pest: Egész nap itteni barátnőim járnak be hozzám, mindegyik irigyen nézi ezüst útikészletemet (csak a multkor kaptam Sándortól), megnézték ékszertokjaimat, elbámulva látják óriás solitair gyémántokból összefoglalt nyaklánczaimat, diadémjeimet. Egy se volt arra kiváncsi, hogy itt belül milyen a világ. Mama irigyen megcsodált, azt találta, sohasem voltam ily szép, még a papa is beczézgetett. Mindenki rontott. Harmadik napja vagyunk itt s s három ebédmeghívásunk volt.
Én? előkerestem azt a könyvjegyzéket, a melyet egyszer Elek adott nekem, s rendeltem vagy 50 kötet franczia és angol könyvet. Olvasni fogok az úton. Én azt hiszem, az olvasás eltávolít majd önmagamtól, pedig erre szükségem van.
* Október 12-én.
Fiuméban. Sándor a hogy megérkeztünk, átöltözködött s unokatestvéréhez, a kormányzóhoz ment. Én a legegyszerűbb ruhámban, a komornám kiséretében, bejártam a várost. Olyan furcsa, kéjes érzés fogott el. Úgy éreztem, mintha ébredni kezdene valami a lelkemben, ez az arany napsugár, ezek a babérerdők, a végtelenség, ez a néptömeg, mely körülvesz s a mely nem ismer… Ime, tán ez legtöbbet ér. Hisz mióta megvagyok, üveg szekrénybe voltam kiállítva. Mindig tudta mindenki, vagy legalább tudni vélte, hogy mit teszek, mit gondolok s érzek. Itt senki, senkisem ismer. Lementem a horvát part egy osteriájába, leültem a szőlőlugas szélén, s belenéztem a messzehaladó tenger kék vizébe. Mily szép, szép az élet! Úgy éreztem, az életerő beleszalad a lelkembe… nini, szavalok! Most veszem észre. Nem hiába, hogy egész út alatt a Taine «Italie»-ját olvastam.
Elek, ha látna, csodálkozna rajtam. De tán nem annyira, mint én magam csodálkozom. Oly jól esett ez a frissen fejt tej, úgy éreztem, az igazság emlőjéből szivom! Azt hiszem, a mit látni fogok, közelebb fog az igazhoz hozni. Furcsa, hogy majd a művészetek segítségével kell hozzá jutnom. Tanulni akarok, fejlődni. Szeretnék az lenni, a mi vagyok, megszakítani a régi énemmel minden összeköttetést.
A kormányzóéknál igen boldog ebéd volt (ritkán használom e szót «boldog!»). Igen rokonszenves emberek. A governatore még igen fiatal ember, van valami igazán fejedelmi abban, a mit mond, abban a mit tesz. Felesége komoly, szép asszony.
Olyan komolyan nézett rám – hogy lesütöttem szemeimet. És –közvetlenül. Ez már haladás. Míg férjeink politizáltak, karon fogott, megmutatta a nagy, de roppant nyomott palota minden zege-zugát. Különös összeállítás, nagy aerarisch bútorok, s aztán ezek között olasz, velenczei ritkaságok. Úgy látszik, erre sokat tartanak. Furcsa, ezt soha sem láttam otthon. Peddig ezzel is mennyit szórakozik, tanul és felejt az ember Ezeknek meg még erre sem volt szükségük, mert hisz boldogok, s van teendőjük elég. A gyermekekhez is bementünk. Komoly gyerekek, szinte már ezek is reprezentálnak.
Milyen különös, ezeknél minden olyan – igaz benyomást tesz.
Kiültünk egy terrasse-ra s hosszan elbeszélgettünk.
– Mondd, – kértem hirtelen, – hogy tanultad meg az igazság útját járni?
A fiatal asszony jóságosan mosolygott, nem felelt rá semmit, de szeméből láttam, hogy úgy született benne. Aztán tárgyakról beszéltünk. Minden egyes bútornak története van, mindegyikről tud valamit elmondani. Mennyit kellett hogy tanuljon, hogy érezze mindezt, hogy lássa, mi a szép, mi az összhangzatos.
Kiültünk egy terrassera.
– Hogy irigyellek, hogy Rómába, Nápoly- s Szicziliába mentek, –mondta.
– Hogy irigyellek, hogy itt maradhatsz, – viszonoztam elszólva magamat.
– Mit irigyelsz rajtam, hisz néked is megvan mindened, mit kivánsz, férjed szeret, vagyonod nagyobb a mienknél, tehetsz annyi jót, mennyit akarsz, s élvezhetsz, a mennyit szemed és szád kiván. Mi kell több ennél? Még gyermeked nincs, de hát ez is csak idő kérdése. És te szabad is vagy, mi pedig kötelességünknek élünk.
A két utolsó mondata szeget ütött a fejembe. Gyermekem, hátha lesz nékem is! Tán majd a kis fejére rá tett kézzel még el is mondhatok néki mindent.
És kötelességem is lesz akkor. Most nincs? De ha nem birom, nem tudom betölteni!
Október 14-én.
Róma. Milyen furcsa volt tegnap a kis hajón vele együtt neki indulni a tengernek. Még soha sem voltam tengeren. Nyolczkor este lassan siklott ki a hajó a megvilágított fiumei kikötőből, oly csendes, oly nyugodt volt az éjszaka, és én úgy szerettem volna, ha nagy, igen nagy veszedelembe jutnék vele. Ha terhes felhők környékeznének, ha villám, mennydörgés elnyomná a szavunk. Hogy így közel-közel simulhassak hozzá még egyszer, s elfogadhassam védelmét, őszinte szeretettel, ragaszkodással.
A tenger bámulatos csendes volt. S Anconától Rómáig napfényes idő. Este értünk Rómába. A Hotel Quirinalban ember ember hátán, villanyvilágítás, nyüzsgés. Késő éjjel csendesek voltak az utczák.
Hát ez Róma?
Október 18-án.
Rómáról nem merek írni. Azt hiszem, ostobaságokat mondanék, így hát csak Stendhalt s Tainet olvasom s azokat igyekszem
Rómában feltalálni. Pedig furcsa, minden más hatást tesz rám. Valószinüleg éretlen vagyok még.
Már két nagy ebéden voltunk. Sándornak mindenütt vannak rokonai. Az olasz rokonok! Gracié, majd felfalnak, olyan édeskések mind. Voilá une race qui ne me plait pas! Egy angolnéval, Lady Stanleyval ismerkedtem meg. Az vonzott hozzá, a mit az olaszoknál nem találtam meg: az igazság.
Október 20-án.
Istenem, Istenem, hát nem lesz ennek vége. Elek ismét írt. Azt mondja, Kairóból az arab pusztába expeditióra készül. S nem bir magával, hozzám fordul egy kis érdeklődésért. Mit tehetek én érte?
Levele tele van Rómával s Rómán keresztül minden sorából szerelme beszél, a melyet azonban nem említ. Így hát megmérgezi nékem Rómát. Délután a Campagnában voltunk… nem birtam magammal, e végtelenül szomorú mezőkből, e szürkés hangulatból annyira az Elek szavai beszéltek hozzám, hogy megkértem Sándort, forduljunk vissza, rosszul érzem magamat. S most itthon vagyok a kis szobámban – a villanyfény besugárzik idáig az iróasztalomig, s azért csak az a nagy, néma, csendes Campagna előttem… tovább még keletnek az az ismeretlen sivatag, s azon egy ember, ki megy, tán vesztét keresve…
* Október 24-én.
Ha gyermekem lenne Sándortól, minden jobbra fordulna. Ma bementem a Szent-Péter-templomba, ezért imádkoztam. Meghallgatott-e az Úr? Ah! hiszen vallásom sincs, ezt is kiölték belőlem. Az a czinizmus, a mely megölte bennem a szerelem iránti érzéket, elvitte magával vallásomat is. Senkiben, semmiben nem hiszek. De igen, Sándorban… Hát akkor?
*
November 3-án.
Palermóban. Megyünk, megyünk – az én szemeim nyitva s azért nem látok semmit, nem hallok semmit, nem vágyom semmire. Olvasom Baudelairet… Mint a mákony. Szeretném, ha mind e fény, pompa érdekelne. De mi közöm mindehhez? * November 16-án.
Megint egy levél Elektől, megérkezett a Szentföldre. Arra kért már akkor, hogy oda feleljek neki, s miután semmi hir rólunk, azt mondja, érzi, igaza volt, hogy megirta szerelmét, mert vagy tőlem kellett volna pár sornak jönni, vagy Sándortól egy levélnek, a melyben élethalál-párbajra hivja. Egyik sem jött, sem igen, sem nem. Tehát szavait félig meghallgattam.
És igaza van, úgy van. Megcsaltam férjemet – és tán –önmagamat is?
* November 18-án.
Nem, nem fogok mindig ezzel foglalkozni. Ez ostobaság s eredménytelen.
Egy óriási parkban kocsiztunk, a mely Katinka-ligetre emlékeztetett. Vagy csak minden a mit látok, azzá hasonul át, a mi bennem van. Ma Verlaine-t vettem meg, az Elek kedvencz költőjét. Mint lánynak megvolt, hogy férjhez mentem – akkor azt hittem – nem lesz könyvekre, vagy legalább ilyenre szükségem, nem vittem magammal. Éjjel olvasni fogom.
* November 19-én.
Egész éjjel Baudelairet olvastam, mint olaj a tüzre ez a könyv. Magamra olvastam benne. «Comme vous êtes loin paradis
parfumé!» Volt-e ilyen paradicsomom valaha? Voltam-e gyermek, fiatal, mint mások. Rothadás vett körül, hogy meglettem, s a rothadás légköre tápláló légköröm.
*
November 24-én.
Nem értem, nem ismerek magamra. Napról-napra közönyösebb leszek. A külvilág nem érdekel. Úgy ülök a nagy ebédeken, estélyeken mint egy bálvány, szemeim kerekre tágulnak, nem mondok semmit, nem hallgatom azt, a mit beszélnek, nem látok, nem hallok, semmi érdekem, sem kedvem semmihez.
Este Baudelaire-re, Verlaine-re örülök.
*
November 30-án.
Nagy jelenetem volt Sándorral. Ez az ember tönkre megy mellettem. Napról-napra sápadtabb arczkifejezése. Girgentibe mentünk. Én a hajó egy sarkában egy Zólát olvastam (nagyon érdekel ez az író, ha utamba akadna, lehet, hogy vissza adna önmagamnak) Sándor a másik sarkában a Times-t. Így egész Sziczilián keresztül. Este későn érkeztünk.
Kocsin, zekegő úton a szállodáig, ott vár a megrendelt ebéd, en tête á tête. Ettől most mindig félek. Sándor két üveg pezsgőt megiszik egyedül, én pár osztrigát eszem, s hallgatunk. Aztán különkülön lefekszünk. Másnap nagy szél kerekedik, én nem merek kimenni a szállodából, félek, hogy nevralgiát kapok. Sándor egyedül nézi meg a görög templomokat. Este vissza Palermóba.
Így lesz hát ez az út végig? Hogy vissza érkeztünk, kijelentettem neki, hogy én nem megyek tovább, már unom ezt a hajszát, aztán meg… Elek Biskrában. El fogom kerülni, bármibe kerül. Sándor nem tágított, nyugodtan azt mondta, ő megigérte Eleknek, hogy deczember végét ott együtt töltik s így megyünk. Megyünk. Igen… én pár perczig zokogtam, sírtam, aztán – mintha fénysugár szaladt
volna át a lelkemen, végre is, miért ne, menjünk. Hisz úgy jobb lesz. Jobb szembe nézni az ellenséggel, így ártalmatlanabb. És aztán ki is fogom magyarázni vele a dolgot úgy, hogy baj nélkül megértethetem magamat Sándorral. De hát ez már megint csak nem lesz az igazság…
Sándor meghallgatta végelhatározásomat s ott hagyott: megyünk, volt az utolsó szava.
Most hát én… igen én, irok Eleknek, ez az egyetlen módja. * Deczember. 1-én.
Ime levelem:
«Édes Elek. Reménylem, soraim még Jeruzsálemben érnek. (De hát ha nem!) Hallgasd meg, a mit mondok. Nem szeretlek, nem is foglak soha. Nem akarlak látni se élve, se halva. Ne gyere utamba, mert kitérek előtted. Tudd meg, hogy tisztességes asszony vagyok s az is akarok maradni. Férjemet szeretem, s jövendőbeli gyermekeimnek akarok élni. Hogy megközelitesz, az gyalázatos dolog, s egész lelkem felháborodik, ha rágondolok. Mit akarsz velem? Testem nem lesz a tied, mint a hogy a lelkem nem az. Nem szóltam Sándornak, nem azért, mintha bármi módon vonzódnám hozzád, de mert nem akartam, hogy összeütközés lehessen köztetek. Nem akarom, hogy Sándort baj érje. Te mint könnyelmű lányt ismertél, mióta a szerelem (igen, az a szerelem!!) átváltoztatott, azóta sem érzésem, sem gondolatom nem az, a mi volt. Mi megyünk Biskrába, de megtiltom, érted, hogy oda gyere. Nyugalmamat nem adom semmiért. Az isten megáldjon s ez leszen első és utolsó levelem tehozzád. Bálványosy Mária.»
Mini helyett Máriát írtam alá. Ebből aztán kiérzi, hogy semmikép sem akarok vele bizalmas lábon állani. Magam vittem a levelet a póstára, csak időre érkezne még oda. Jaffáig innen 6 nap, onnan 2 Jeruzsálemig, ott 8–10 nap alatt. Decz. 12-ére ott lesz a levél s akkor még tudom, ott kapja, hiszen karácsonyt a Szentföldön tölti.
*
Deczember 3-án.
Átolvastam a levél fogalmazványát. – Istenem, milyen ügyetlenséget követtem el, hogy azt irom: «nyugalmamat nem adom»; hisz így többet árultam el, mint kellett volna, lelki állapotomról.
De most naplót sem irok egy darabig, ez is csak hiába izgat. A tárgyaknak fogok élni. Ugy mint egy utazó, – ki felejteni utazik.
Felejteni… mit?
*
Deczember 30-án.
Anya vagyok, bizonyos. Ennek sem tudok most már örülni. Félek a gyermektől. Hogy neveljem fel, ha nem tudok igaz lenni. Az ő életét is megmérgezzem, mint a hogy az enyémet megmérgezték?
Sándor, uram! ments meg.
* Tunis, január 4-én.
Éjjel-nappal a két férfi a fejemben. Nem látok semmit, csak őket. Éjjel róluk álmodom – úgy érzem, ketté tépik a szivemet. Mi lesz velem? Ha az Elek levelét olvasom, a Sándort is ott érzem az oldalamon. S félek mind a kettőtől s nem látok a lelkemben egyebet sötétségnél, némaságnál…
Biskra, január 6-án.
Sándor tegnap hirtelen hozzám fordult: «Az Elek barátom, bizom benne minden körülmény között… érted?» S mereven szemembe tekintett. Mit értett alatta – tán gyanakodott volna. Mikor árultam el magamat, vagy már rég gyanakszik? Egész testemben reszketek
még most is, midőn szemeinek tompa kifejezésére gondolok. S holnap, vagy tán ma már megjöhet. Mi lesz velem? Összezavarodott az elmém s nem látok tisztán érzéseim chaosában. Nem látom a helyest, a jót, nem tudom, mit érzek igazán, nem tudom, hogy lesz… Én uram! támogass, mert eltántorodom…
Biskra, január 8-án.
Istenem! Istenem. Tönkre, tönkre vagyok téve. A dolog így történt. Egy arab kávéházban voltunk, Sándor és én. Rendesen itt töltöttük az estéket már jó ideje, Sándort igen mulattatja az arabok fegyvertáncza, mindennap eljáratja velök.
Épp a fegyvertáncz közepén – én Uram Istenem – ki lép be az ajtón: Elek. Azt hittem, rám szakad a ház. Sándor tüstént abba hagyatta a vad tánczot, de a pokoli lárma után beállott csendet nem lehet a szívem csendjéhez hasonlítani.
De tovább. Elek odafordul Sándorhoz, kezet ad neki.
– Tudod-e, miért jöttem oly gyorsan? – mondta merészen, egyenesen a szemeim fehérébe tekintve, – mert Mini irt nekem.
– Ugyan? – kérdé Sándor fásultan, – s te erről nem is szóltál.
Azt hittem, szétszakad a szívem.
– Igen, megirtam, hogy ide jövünk, miután tudtam terveidet, –rebegtem halkan, nehogy Elek megmondja az igazságot, hogy így az összeütközést elkerüljem.
– Igen, Mini meg akart lepni téged s ezért irt, – mondta Elek még folyton rám nézve hidegen, közönyösen, tönkre téve tekintete által, –s én sietve jöttem.
– Jól tetted, – mondta Sándor, hirtelen kézszorítását viszonozva.
Ime, hazugságból hazugságba. – De ez még nem elég. Sándor éjjel sakálvadászatra készült. Ide rendelte Ali Ben Hamedet,
dragománját1) a kávéházba, ki vezeti. Itt vártunk reá. 10 óra után megjött.
– Elek, légy oly szives feleségemet haza kisérni a Hôtel Saharaba, te is ott vagy szállva úgy-e?
– Igen, mellettetek vettem szállást, – felelte Elek szemtelenül. Sándor kezet szorított vele, nekem megcsókolta kezemet s szemembe tekintett. Ha száz évig élek, nem felejtem el tekintetét. Mintha egész lelkét a lelkembe lehelte volna. Vagy csak azért láttam ezt így, mert magam végtelen izgatott voltam s mert tudtam, hogy most, most fog elválni minden… Nem tudom. Elment. És Elek most hozzám fordult: «Indulunk hát?» Karon fogott. Én nem akartam, hiába mondtam neki magyarul, hogy nem engedem. Megtette. Végre is a még népes utczában, a hol az arab Ouled Nailok2) házai előtt franczia katonatisztek árnyai suhantak el, nem téphettem ki magamat karjai közül. Elek a szó szoros értelmében vitt. A kis telep legnépesebb utczájába mentünk, a hol a téli éjszakán még ember ember hátán tolongott. És nem mertem szólni, egész testemben remegtem. Vitt, vitt. Egy európai kávéházba erővel bevonszolt. «Un caffé à madame, un verre de whisky à moi.» Úgy tett, mintha felesége lennék.
– Eljöttem, mert levelének sorai között olvastam. Ha szeretné férjét, akkor nyugodt lenne, nyugodtan odaadta volna levelemet neki, hisz «vér»-leány, ki nem fél egy párbaj esélyeitől. Maga ha szereti férjét, csak egy módon cselekedhetett volna, hiába mondja, hogy nem. A szerelem parancsol. Hiába minden törvény, hiába esküje, a mit mond. Az enyém, mert szeretem s mert viszont szeret.
És én gyenge báb csak hallgattam s mintha megszáradt volna a szó a torkomon, nem tudtam, nem tudtam rá felelni semmit.
– Azt mondja, nem ismerem azt, a mi ma. Csakis azt szeretem s nem azt, a minek lenni látszott. Maga még pár hó előtt nem önmaga volt, hanem társadalmi körének visszfénye. Egy szava nem jött szivéből s egy szó nem juthatott a szivéig, s így hogy választhatott
volna akkor a szíve szerint. Az enyém az Isten s emberek előtt. Akkor a Katinka-ligetben láttam már – s ma az enyém.
Hangja olyan áttetsző, tiszta lett, mint a fejünk felett elterülő égbolt, a melyen az afrikai ég miriad és miriadnyi csillagja ragyogott.
A mimóza-fák virágoztak, messzi, messziről szomorú dal hangzott, tán egy arab ház terrasseáról; fejem felett a tejút fenséges íve; szivem tágult, úgy éreztem, karjaim széttárulnak s átölelem az egész mindenséget, s szavam most is, mint mindig, máskép beszélt.
– Sándort tisztelem – kiáltottam (Istenem miért is ezt).
– Nem tisztelet kell nékem, de szerelem. – S vitt, vitt.
Úgy éreztem egész testem lelkem azon az egy karján csügg, a mely visz s a melynek ellenállani nem tudok. S nem tudtam. Felvitt. Szobánk egymás mellett… s a sötét éjszakában amazok ott nem láthatták, hogy az ő szobájába tértünk.
Hát miért is nem öntöttetek erélyt, szivet belém, ti, kikre ez rá volt bizva.
A Sándor gyermekével szivem alatt – ma az Elek szeretője vagyok. Ime az igazság.
Biskra, január 9-én.
Sándor délben jött haza, és furcsa, én nyugodtabb, s lehet mondani igazabb vagyok vele, mint voltam. Szinte kihivólag viselkedtem vele szemben. Kijelentettem, hogy áthurczolkodom a déli oldalra eső szobába, mert éjszaknak fázom. Sándor nem ellenkezett – pedig ez azt jelentette, hogy ágytól válunk. Nos igen, ha már így kellett hogy legyen, hát hadd legyen így. S legyen egészen. Kettős játékra már igazán képtelen volnék. Szivem alatt levő gyermeket említettem… ez aljas volt. De hát miért ne, ki egy olyan aljasságot el tudott követni, mint én tegnap, az már mindent pirulás nélkül elkövethet. Most hát előre – csuszszunk lefelé a lejtőn, nyitott szemmel, sans peur et sans reproche!
