Gen tri lieu by nguyen trung xin

LêI NãI §ÇU Sau sù kiÖn träng ®¹i - th¸ng 6 n¨m 2000 khi tr×nh tù ph¸c th¶o bé gen ngêi ®· ®îc c«ng bè , tÊt c¶ mäi ngêi trªn hµnh tinh ®Òu chê ®îi mét ngµy nµo ®ã con ngêi cã thÓ trÞ ®îc çc bÖnh nan y vµ ngµy ®ã ®· ®Õn . HiÖn nay ngßi ta cã thÓ chÈn ®o¸n vµ ®iÒu trÞ ®îc çc bÖnh b»ng c«ng nghÖ DNA . Sù xuÊt hiÖn cña ®Çu dß DNA cïng víi PCR ®· gi¶i quyÕt ®îc nhiÒu vÊn ®Ò bøc thiÕt cña Y häc , ch¼ng h¹n nh thay v× ph¶i chê ®îi hµng tuÇn lÔ ®Ó cã mét xÐt nghiÖm vÒ vi khuÈn lao th× nay c«ng viÖc ®ã chØ mÊt vµi giê thËm chÝ cã thÓ sím h¬n n÷a . §iÒu nµy gióp Ých cho çc bÖnh nh©n ®îc ®iÒu trÞ sím h¬n vµ tr¸nh ®îc sù l©y lan trong céng ®ång . Víi ph¬ng ph¸p ch÷a bÖnh b»ng gen hay gäi v¾n t¾t lµ gen trÞ liÖu ®· ch÷a ®îc nhiÒu bÖnh di truyÒn nh bÖnh x¬ nang , bÖnh ®au c¬ Duchenne , bÖnh Huntington , Héi chøng gÉy nhiÔm s¾c thÓ X , U nguyªn bµo vâng m¹c , bÖnh Alzheimer , bÖnh x¬ cøng teo c¬ cét bªn , bÖnh tiÓu ®êng , bÖnh ung th v.v.. Trong t¬ng lai çc bÖnh nh Cholesterol cao cã tÝnh chÊt gia ®×nh, çc bÖnh vÒ gan , bÖnh Lesh- Nyhan , bÖnh Gaucher vµ bÖnh a ch¶y m¸u còng sÏ ®îc xö lý b»ng gen trÞ liÖu . Míi ®©y nhãm nghiªn cøu t¹i Trêng §¹i häc California , Los Angles ®· sö dông liposom ®îc bao bëi polyethylen glycol (PEG) ®Ó ®a vµo tËn çc tÕ bµo n·o . ViÖc chuyÓn gen vµo n·o lµ mét thµnh c«ng rÊt cã ý nghÜa , nã t¹o tiÒm n¨ng cho viÖc trÞ çc bÖnh Parkinson (New Scientist . Com-March 20, 2003) §iÒu mµ mäi ngêi ®ang chê ®îi nhÊt cã lÏ lµ çc bÖnh ung th vµ c¨n bÖnh thÕ kû HIVAIDS . Cho tíi th¬× ®iÓm nµy nhiÒu bÖnh ung th ®· ®îc trÞ b»ng gen trÞ liÖu vµ ®· ®em l¹i nh÷ng kÕt qu¶ kh¶ quan . Víi bÖnh AIDS , ngêi ta còng thu ®îc nh÷ng kÕt qu¶ rÊt khÝch lÖ . Ch¼ng nh÷ng thÕ çc thÕ hÖ vac xin AIDS ®ang ®îc thö nghiÖm , ch¾c chóng ta ai còng chê ®îi çi gi©y phót mµ vac xin AIDS sÏ thµnh c«ng nh çc lo¹i vac xin Viªm gan B , vac xin Cóm hay mét lo¹i vac xin hiÖn ®¹i nµo ®ã ®ang ®îc lu hµnh . Cuèn s¸ch nµy dµnh cho çc b¸c sÜ l©m sµng , nh÷ng ngêi ®ang ngµy ®ªm theo dâi çc c¨n bÖnh ë tõng bÖnh nh©n , lóc nµo hä còng chê ®îi mét ph¬ng ph¸p h÷u hiÖu nhÊt ®Ó cøu sèng ngêi bÖnh . Tuy vËy , s¸ch còng gióp Ých cho tÊt c¶ nh÷ng ai quan t©m tíi Gen trÞ liÖu mét ph¬ng phÊp ch÷a bÖnh míi hiÖn ®ai vµ ®Çy tiÒm n¨ng . S¸ch còng giíi thiÖu çc dîc phÈm ®îc bµo chÕ theo kiÓu C«ng nghÖ DNA . Ph©n tö Antisene lµ mét chÕ phÈm thuèc hoµn toµn míi chøa ®ùng nhiÒu tiÒm n¨ng ®¸ng ®îc quan t©m . §©y kh«ng chØ ®¬n thuÇn lµ vÊn ®Ò khoa häc mµ cßn lµ mét lÜnh vùc kinh tÕ hÊp dÉn mµ çc nhµ ho¹ch ®Þnh chÝnh s¸ch cÇn quan t©m v× lîi nhuËn thu ®îc tõ c«ng nghÖ gen lµ khæng lå . S¸ch còng ®Ò cËp tíi viÖc lµm trong s¹ch m«i trêng , ph¸ vì chu kú dÞch bÖnh cña çc c«n trïng vµ çc t¸c nh©n g©y bÖnh nguy hiÓm kh¸c v.v.. PhÇn cuèi cña cuèn s¸ch chóng t«i cã ®Ò cËp tíi mét sè lÜnh vùc míi trong c«ng nghÖ DNA nh Tin -Sinh häc . Sù xuÊt hiÖn cña tin sinh häc lµm chóng ta an t©m r»ng , mÆc dï ta cßn nghÌo , trang thiÕt bÞ thiÕu thèn , nhng chóng ta vÉn cã thÓ b¾t tay ngay vµo lÜnh vùc gen trÞ liÖu ®Ó ch÷a trÞ bÖnh cho çc bÖnh nh©n . §iÒu ®ã thËt dÔ hiÓu , v× thêi ®¹i ngµy nay tÊt c¶ mäi c«ng viÖc ®Òu mang tÝnh chÊt toµn cÇu , c«ng nghÖ DNA nãi chung hay Gen trÞ liÖu nãi riªng còng kh«ng ngoµi quy luËt Êy . Víi lßng mong mái chuyÓn t¶i çc th«ng tin cËp nhËt nhÊt trong lÜnh vùc gen trÞ liÖu tíi tÊt c¶ çc b¹n ®äc , mÆc dï ®· cè g¾ng rÊt nhiÒu nhng ch¾c ch¾n kh«ng tr¸nh khái çc thiÕu sãt , mong b¹n ®äc lîng thø . Nh©n ®©y , chóng t«i xin chan thµnh çm ¬n Gi¸o s §µo §×nh §øc , nguyªn Phã ViÖn Trëng ViÖn Y häc l©m sµng nhiÖt ®íi ®· ®äc b¶n th¶o vµ ®ãng gãp nhiÒu ý kiÕn bæ Ých ®Ó hoµn thiÖn cuèn s¸ch . Chóng t«i còng ch©n thµnh çm ¬n Nhµ xuÊt b¶n Y häc ®· t¹o mäi ®iÒu kiÖn thuËn lîi ®Ó cuèn s¸ch sím tíi tay ®äc gi¶ . T¸c gi¶ xin ch©n thµnh çm ¬n nh÷ng ý kiÕn ®ãng gãp x©y dùng ®Ó cuèn s¸ch ngµy cµng ®îc hoµn chØnh h¬n . Hµ néi th¸ng 7 n¨m 2005. T¸c gi¶

Môc lôc Lêi nãi ®Çu Môc lôc Ch¬ng I : Nh÷ng kh¸i niÖm c¬ b¶n vÒ gen trÞ liÖu 1.1.S¬ lîc vÒ gen trÞ liÖu 1.2.Kh¸i niÖm vÒ phÐp ch÷a bÖnh b»ng gen 1.3.C¬ chÕ cña gen trÞ liÖu 1.4.Çc lo¹i gen trÞ liÖu 1.5. Nh÷ng bÖnh cã thÓ sö dông ®îc gen trÞ liÖu 1.5.1.§iÒu trÞ çc bÖnh di truyÒn 1.5.1.1.Çc bÖnh di truyÒn g©y nªn bëi çc locut gen ®¬n 1.5.1.2.Çc bÖnh do rèi lo¹n di truyÒn çc locut ®a gen 1.5.2. §iÒu trÞ çc bÖnh do nhiÔm trïng Ch¬ng II : Nguyªn lý c¬ b¶n cña gen trÞ liÖu 2.1.Nguyªn lý cña gen trÞ liÖu 2.1.1.Çc tÕ bµo chñ 2.1.1.1.NhiÔm s¾c thÓ cña vi khuÈn 2.1.1.2.Virut 2.1.2.Çc Enzym giíi h¹n 2.1.3. Ligaza 2.1.4.Plasmid 2.2. Çc thÝ nghiÖm vÒ DNA t¸i tæ hîp 2.3. Nh÷ng bµn c·i vÒ tÝnh an toµn trong gen trÞ liÖu 2.4. T¬ng lai cña c«ng nghÖ DNA t¸i tæ hîp 2.5. Nh÷ng tiÕn bé ®¸ng kÓ trong GTL hiÖn nay Ch¬ng III : çc ph¬ng ph¸p cña c«ng nghÖ DNA 3.1. Thu thËp gen 3.2. Sù lùa chän çc Vec t¬ 3.3. Sù lùa chän çc tÕ bµo chñ 3.4. Sù biÓu hiÖn cña gen 3.5. TËp hîp çc s¶n phÈm cña gen 3.6. Th viÖn gen 3.6.1.ThiÕt lËp mét th viÖn gen 3.6.2.Sµng läc th viÖn gen 3.6.3. Th viÖn cDNA Ch¬ng IV : Ph©n tÝch vµ chÈn ®o¸n b»ng DNA 4.1. Më ®Çu 4.2. Ph¬ng ph¸p ph©n tÝch DNA 4.2.1. §Çu dß DNA 4.2.2.Ph¶n øng tæng hîp chuçi (PCR) 4.2.3. KhuÕch ®¹i tÝn hiÖu 4.2.4. Ph©n tÝch RFLP 4.3. ChÈn ®o¸n çc bÖnh truyÒn nhiÔm 4.3.1. ChÈn ®o¸n Héi chøng thiÕu hôt miÔn dÞch m¾c ph¶i 4.3.2. ChÈn ®o¸n bÖnh Lao 4.3.3. ChÈn ®o¸n bÖnh Lyme 4.3.4. ChÈn ®o¸n bÖnh u nhó vµ çc bÖnh kh¸c 4.4. Ph¸t hiÖn çc bÖnh do di truyÒn 4.4.1. BÖnh x¬ nang 4.4.2.BÖnh ®au c¬ Duchenne 4.4.3.BÖnh Huntington 4.4.4. Héi chøng gÉy nhiÔm s¾c thÓ X 4.4.5. U nguyªn bµo vâng m¹c 4.4.6. BÖnh Alzheimer 4.4.7. BÖnh s¬ cøng teo c¬ cét bªn 4.4.8. BÖnh tiÓu ®êng 4.4.9. BÖnh ung th 4.4.10. Ng©n hµng gen 4.5. øng dông gen trÞ liÖu trong l©m sµng 4.5.1. §iÒu trÞ bÖnh thiÕu hôt miÔn dich tæ hîp trÇm träng (SCID)

4.5.2. Gen trÞ liÖu trong chèng ung th 4.5.3. Nh÷ng nç lùc hiÖn t¹i vµ t¬ng lai 4.5.3.1.Thay thÕ gen khiÕm khuyÕt trong bÖnh x¬ nang 4.5.3.2. BÖnh Cholesterol cao cã tÝnh chÊt gia ®×nh 4.5.3.3. GTL víi çc tÕ bµo gan 4.5.3.4. GTL trong Héi chøng thiÕu hôt miÔn dÞch m¾c ph¶i 4.5.3.6. BÖnh Lesh-Nyhan 4.5.3.7. BÖnh Gaucher vµ bÖnh a ch¶y m¸u 4.6. B¶o hiÓm an toµn trong gen tril liÖu Ch¬ng V : Çc Dîc phÈm chÕ t¹o theo c«ng nghÖ DNA 5.1. më ®Çu 5.2.Thay thÕ çc protein ngêi 5.2.1. Insulin 5.2.2. Hormon sinh trëng cña ngêi 5.2.3. YÕu tè VIII 5.3. TrÞ liÖu trªn ngêi 5.3.1. ChÊt ho¹t ho¸ Plasminogen cña m« 5.3.2. Interferon 5.3.3. Çc ph©n tö Antisene 5.4.Vac xin 5.4.1. Vac xin viªm gan B 5.4.2. Vac xin AIDS 5.4.3. Çc lo¹i vac xin kh¸c 5.5. §éng vËt chuyÓn gen vµ nh÷ng øng dông thùc tiÔn cña §VCG 5.5.1. Nh÷ng kh¸i niÖm vÒ ®éng vËt chuyÓn gen vµ nh÷ng øng dông cña chóng 5.5.2. §a DNA vµo çc tÕ bµo ®éng vËt cã vó 5.5.3. T¹o çc ®éng vËt theo ý muèn 5.5.3.1. Chuét mang hÖ thèng miÔn dÞch cña ngêi 5.5.3.2. Chuét mang ung th 5.5.3.3. Çc ®éng vËt chuyÓn gen kh¸c 5.5.3.4. Çc chÊt ph¶n øng sinh häc tõ ®éng vËt 5.5.3.5. Hemoglobin ngêi tõ lîn 5.5.3.6. Çc s¶n phÈm kh¸c cña ®éng vËt chuyÓn gen 5.5.4.çc chÊt thay thÕ m«i trêng Ch¬ng VI : Dù ¸n bé gen ngêi 6.1 ý nghÜa Y sinh häc 6.2. Dù ¸n bé gen ngêi cã nhiÒu môc ®Ých 6.3.Tr×nh tù ph¸c th¶o cña bé gen ngêi ®· ®îc th«ng b¸o th¸ng 6 n¨m 2000. 6.4.Hai nhãm sö dông çc ph¬ng ph¸p kh¸c nhau 6.5. ViÖc x¸c ®Þnh tr×nh tù bé gen ngêi ®· ®em l¹i Ých lîi cho çc ph¸t hiÖn míi 6.6. HÇu hÕt bé gen ngêi ®· ®îc x¸c ®Þnh tr×nh tù 6.7. §· x¸c ®Þnh ®îc r»ng bé gen ngêi m· cho kho¶ng 30.000-40.000 protein 6.8. ChØ cã 1,1% ®Õn 1,5% bé gen ngêi dïng ®Ó m· cho protein 6.9. CÊu tróc cña çc nhiÔm s¾c thÓ ngêi thay ®æi rÊt lín 6.10. Çc gen cña ngêi ho¹t ®éng nhiÒu h¬n çc gen cña çc tæ chøc ®¬n gi¶n h¬n . 6.11. HÖ protein ngêi phøc t¹p h¬n ®éng vËt cã x¬ng sèng 6.12. Çc tr×nh tù lÆp chiÕm trªn 50% bé gen ngêi 6.13. Nh÷ng ph¸t hiÖn kh¸c ®¸ng quan t©m 6.14 .LËp kÕ ho¹ch cho nh÷ng c«ng viÖc tiÕp theo vÒ bé gen ngêi vµ çc tæ chøc kh¸c 6.15 Nh÷ng liªn quan tíi hÖ protein , c«ng nghÖ sinh häc vµ tin sinh häc 6.16. Nh÷ng liªn quan tíi Y häc Gi¶i thÝch mét sè tõ chuyªn m«n Phô lôc Tin-Sinh häc : Kh¸i niÖm vµ øng dông MÉu dß Axit Nucleic Nh÷ng s¸ch tham kh¶o chÝnh

Ch¬ng I Nh÷ng kh¸i niÖm c¬ b¶n vÒ Gen trÞ liÖu (ph¬ng ph¸p ch÷a bÖnh b»ng gen) . 1.1.Lù¬c sö vÒ gen trÞ liÖu: Çi mèc lÞch sö lµ ngµy 14 th¸ng 9 n¨m 1990 khi çc nhµ khoa häc viÖn søc khoÎ quèc gia Hoa kú tr×nh bµy ph¬ng ph¸p gen trÞ liÖu (GTL) trªn mét c« bÐ 4 tuæi tªn lµ Ashanti Desiva .Khi míi sinh ra em ®· m¾c mét bÖnh di truyÒn hiÕm gÆp - bÖnh thiÕu hôt miÔn dÞch tæ hîp trÇm träng (severe combined immune deficiency –SCID) ,v× em bÞ tæn th¬ng hÖ miÔn dÞch ngay tõ ph«i thai . TrÎ em m¾c chøng bÖnh nµy thêng ph¸t triÓn rÇm ré çc bÖnh nhiÔm trïng vµ hiÕm khi tån t¹i tíi tuæi trëng thµnh . Mét bÖnh th«ng thêng nh bÖnh thuû ®Ëu còng cã thÓ ®e do¹ tÝnh m¹ng , v× thÕ Ashanti ph¶i giam m×nh trong mét phßng kÝn , tr¸nh tiÕp sóc víi mäi ngêi trõ nh÷ng ngêi trong gia ®×nh . Em ®îc gi÷ trong m«i Trêng v« trïng vµ ph¶i dïng mét lîng lín kh¸ng sinh ®Ó chèng träi l¹i çc bÖnh th«ng thêng .

H×nh 1.1. .¶nh 2 bÖnh nh©n ®Çu tiªn ®îc ®iÒu trÞ bÖnh b»ng gen . C« g¸i phÝa bªn tr¸i lµ Cynthia cßn phÝa bªn ph¶i lµ Ashanti. C¶ hai c« g¸i nµy ®Òu cã cuéc sèng b×nh thêng do ®· nhËn ®îc çc tÕ bµo biÕn ®æi gen ®Ó ®Èy lui bÖnh do thiÕu hôt ADA vµo cuèi 1990 vµ ®Çu 1991 . TÊm ¶nh ¶nh nµy xuÊt hiÖn trªn t¹p chÝ Time vµo gi÷a 1993. Trong tiÕn tr×nh gen trÞ liÖu , çc b¸c sÜ ph¶i rót hÕt b¹ch cÇu ra khái c¬ thÓ Ashanti , råi ®Ó çc tÕ bµo nµy ph¸t triÓn ë phßng thÝ nghiÖm vµ ®a çc gen ®· bÞ mÊt vµo . Çc tÕ bµo ®· ®îc söa ®æi di truyÒn sÏ ®îc thÊm nhËp qua m¹ch m¸u bÖnh nh©n . §iÒu thËt vui mõng lµ çc test phßng thÝ nghiÖm (labor) cho thÊy hÖ thèng miÔn dÞch cña Ashanti sau khi ®îc trÞ liÖu ®· kh¸ h¼n lªn , em kh«ng cßn bÞ c¶m cóm thêng xuyªn n÷a vµ ®îc phÐp tíi Trêng råi ®îc tiªm chñng c¶ vacxin ho gµ n÷a . Sau Ashanti lµ Cynthia 9 tuæi còng m¾c bÖnh suy gi¶m miÔn dÞch tæ hîp trÇm träng còng ®îc cøu ch÷a b¨ng GTL vaß cuèi 1990 ®Çu 1991. Tuy nhiªn, víi GTL th× kh«ng thÓ chÜ xö lý mét lÇn v× çc b¹ch cÇu ®· dîc xö lý di truyÒn chØ cã thÓ ho¹t ®éng ®îc trong vßng vµi th¸ng nªn liÖu tr×nh ph¶i lËp ®i lËp l¹i nhiÒu lÇn . Còng cÇn ph¶i nhÊn m¹nh r»ng ,tuy ®· ®¹t ®îc mét sè thµnh tùu trong GTL, nhng nh÷ng g× mµ ta thu ®îc vÉn cßn rÊt bÐ nhá so víi sù l¹c quan trong mét c©u chuyÖn dµi. N¨m 1999 vÊp ph¶i mét khã kh¨n v« cïng lín víi sù cè Jesse Gelsinger 18 tuæi bÞ chÕt khi tham gia GTL v× bÖnh di truyÒn do thiÕu hôt enzym Ornithin Transcarboxylaza (OTCD) .Jesse bÞ chÕt sau 4 ngµy trÞ liÖu v× cã sù ®¸p øng miÔn dÞch m·nh liÖt víi vËt mang Adenovirut dÉn ®Õn c¬ thÓ bÞ huû ho¹i nghiªm träng . Mét sù kiÖn träng ®¹i n÷a lµ th¸ng 1 n¨m 2003 , FDA ra lÖnh t¹m dõng tÊt c¶ çc GTL cã sö dông vec t¬ Retrovirut trong çc tÕ bµo nguån cña m¸u. Së dÜ cã sù cè nµy lµ do sau khi mét em bÐ ngêi Ph¸p khi xö lý b»ng GTL l¹i ph¸t bÖnh gièng nh bÖnh b¹ch cÇu (Leukemia) . §iÒu ®¸ng nãi lµ c¶ 2 em bÐ ®Òu ph¸t bÖnh gièng nhau khi dïng GTL ®iÒu trÞ thµnh c«ng bÖnh

thiÕu hôt miÔn dÞch tæ hîp nghiªm träng SCID hay cßn gäi lµ héi chøng “Bubble Baby” vµo th¸ng 8 n¨m 2003. Còng v× lý do nµy nªn Uû ban cè vÊn sinh häc cña FDA còng bµn luËn vÒ kh¶ n¨ng cã thÓ ®Þnh lîng sè gen trÞ liÖu cã sö dông Retrovirut ®Ó ®¶m b¶o sù an toµn cho GTL. Con ®êng ®i tíi sù phª chuÈn ®Ó thùc hiÖn mét qui tr×nh GTL gÆp biÕt bao khã kh¨n trë ng¹i v× cßn rÊt nhiÒu vÊn ®Ò cÇn tranh c·i. KhÝa c¹nh Sinh häc cña GTL rÊt phøc t¹p vµ nhiÒu kü thuËt cßn ph¶i ph¸t triÓn thªm còng nh çc bÖnh cÇn ph¶i ®îc hiÓu ®Çy ®ñ h¬n n÷a tríc khi muèn øng dông phÐp trÞ bÖnh b»ng gen . ViÖc tranh c·i c«ng khai xung quanh vÊn ®Ò liÖu cã nªn sö dông nh÷ng chÊt liÖu (material) do c«ng nghÖ gen cho con ngêi hay kh«ng th× qu¶ lµ qu¸ phøc t¹p .Tham gia tranh luËn vÒ vÊn ®Ò nµy cã ®ñ çc chuyªn gia ë nhiÒu lÜnh vùc kh¸c nhau nh Sinh häc , Qu¶n lý nhµ níc, Y häc , TriÕt häc , ChÝnh trÞ vµ T«n gi¸o v.v.. Mçi lÜnh vùc nh×n nhËn mét kh¸c v× thÕ cã rÊt nhiÒu vÊn ®Ò cÇn ph¶i tranh luËn . MÆc dï gÆp nhiÒu trë ng¹i , nhng GTL vÉn cã nh÷ng bíc tiªn ®¸ng ghi nhËn . ChØ tÝnh ®Õn cuèi 1994 ®· cã h¬n 500 bÖnh nh©n ®îc ®iÒu trÞ b¨ng GTL víi nhiÒu lo¹i bÖnh kh¸c nhau , trong ®ã sè ngêi bÞ ung th ®îc ®iÒu trÞ víi liÖu ph¸p nµy chiÕm tíi 69% ( n¨m 2001) , bÖnh HIV-AIDS 11,8%. Cho tíi nay sè bÖnh ®îc ®iÒu trÞ b»ng GTL ngµy cµng nhiÒu , ngoµi çc bÖnh ung th, SCID, hµng lo¹t bÖnh kh¸c còng ®· sö dông GTL nh x¬ nang, thiÕu m¸u do hång cÇu h×nh lìi liÒm, bÖnh l·o ho¸ sím , bÖnh m¸u khã ®«ng, bÖnh thiÕu hôt trÇm träng enzym OTG ( do mét gen trªn NST giíi tÝnh X ), bÖnh Huntington ( ch÷a b»ng antisens RNA) (New scientist .Commarch 13.2003) . Kü thuËt t¹o ra çc Liposom cã kÝch thíc siªu nhá (kho¶ng 25 nm) dÔ dµng mang çc gen qua lç mµng nh©n , hoÆc sö dông vec t¬ Liposom ®îc bao bëi mét líp vá polyethylen glycol –PEG ®a çc gen vµo tÕ bµo n·o ®Ó ch÷a çc bÖnh Parkinson.v.v..(New Scientist .Com –May 12-2002) 1.2.Kh¸i niÖm vÒ phÐp ch÷a bÖnh b»ng gen: Gen lµ ®¬n vÞ c¬ së cña th«ng tin di truyÒn .ThuËt ng÷ gen dïng nh mét ®o¹n cña th«ng tin di truyÒn ®îc phiªn m· sang mét RNA ®¬n lÎ vµ tiÕp ®ã th«ng tin tõ ph©n tö nµy ®îc dÞch m· sang mét protein nhÊt ®Þnh . Gen n»m trªn çc nhiÔm s¾c thÓ (NST) (vÞ trÝ trªn NST n¬i mét gen cô thÓ ®Þnh vÞ gäi lµ locut cña gen ®ã) . ë çc sinh vËt lìng béi , çc NST s¾p xÕp thµnh çc cÆp t¬ng ®ång t¹i çc vÞ trÝ t¬ng øng tån t¹i çc d¹ng kh¸c nhau cña cïng mét gen gäi lµ ALEN. CÊu tróc cña mét gen bao gåm 3 vïng chÝnh : Vïng ®iÒu khiÓn , vïng mang m· di truyÒn vµ vïng kÕt thóc . Vïng ®iÒu khiÓn cã mét sè tr×nh tù ®Æc hiÖu ®iÒu khiÓn ho¹t ®éng cña gen. Vïng mang m· chøa çc th«ng tin dØ truyÒn , ®îc phiªn m· sang RNA th«ng tin (mRNA) . Gen cÊu tróc cã thÓ ®îc dÞch m· t¹o nªn çc s¶n phÈm lµ protein . Vïng kÕt thóc mang çc tr×nh tù ph©n biÖt gi÷a çc gen vµ çc tr×nh tù kÕt thóc qu¸ tr×nh phiªn m· . CÊu tróc cña gen cßn bao gåm mét sè cÊu tróc ®Æc thï n»m ë tríc,sau hoÆc trong gen nh çc tr×nh tù ®iÒu hoµ, vïng t¨ng cêng , vïng bÊt ho¹t (silencer) , vïng ®Öm (spacer). S¶n phÈm cña gen lµ protein mang nh÷ng chøc n¨ng quan träng nhÊt cña sù sèng vµ t¹o nªn cÊu tróc cña çc tÕ bµo . Khi gen bÞ biÕn ®æi th× çc protein ®îc m· ho¸ bëi çc gen ®ã kh«ng cã kh¶ n¨ng thùc hiÖn nh÷ng chøc n¨ng th«ng thêng cña chóng - ®ã lµ nguyªn nh©n cña çc bÖnh di truyÒn . PhÐp ch÷a bÖnh b»ng gen hay cßn gäi lµ gen trÞ liÖu –gen liÖu ph¸p v.v.. lµ mét kü thuËt nh»m chuÈn x¸c l¹i çc gen bÞ khiÕm khuyÕt (lµ nguyªn nh©n ph¸t sinh ra bÖnh ). Çc nhµ nghiªn cøu ®a ra mét sè ph¬ng ph¸p ®Ó chuÈn x¸c l¹i çc gen lçi nh sau : *§a mét gen ho¹t ®éng b×nh thêng vµo mét vÞ trÝ kh«ng ®Æc hiÖu trongbé gen (genome) ®Ó thay thÕ çc gen kh«ng cßn chøc n¨ng . §©y lµ çch phæ biÕn nhÊt . *Mét gen dÞ thêng cã thÓ ®îc ®æi b»ng mét gen b×nh thêng th«ng qua t¸i tæ hîp t¬ng ®ång . *Mét gen dÞ thêng cã thÓ ®îc söa ch÷a th«ng qua ®ét biÕn chän läc ngîc (selective reserse mutation) ®Ó chuyÓn gen trë l¹i chøc n¨ng b×nh thêng cña nã . *§iÒu hoµ mét gen ®Æc biÖt nµo ®ã ®· bÞ biÕn ®æi (møc ®é ®ãng, më gen). * §a mét gen b×nh thêng vµo tÕ bµo ho¹t ®éng ®ång thêi víi çc gen g©y bÖnh ®Ó h¹n chÕ t¸c ®éng cña gen g©y bÖnh hoÆc hç trî cho çc gen bÞ h háng , *§a mét gen bÊt ho¹t vµo tÕ bµo thay thÕ cho mét gen b×nh thêng nµo ®ã nh»m h¹n chÕ çc s¶n phÈm kh«ng cÇn thiÕt cña gen lµnh nh»m t¹o mét tr¹ng th¸i míi cho tÕ bµo. 1.3. C¬ chÕ cña Gen trÞ liÖu: Trong hÇu hÕt çc nghiªn cøu vÒ gen trÞ liÖu , mét gen “b×nh th¬ng” ®uîc ®a vµo bé gen(genome) ®Ó thay thÐ mét gen “kh«ng b×nh thêng”-gen g©y bÖnh .Ph©n tö chuyªn chë “Carrier” ®îc gäi lµ Vec t¬ lµm nhiÖm vô chuyÓn gen trÞ liÖu tíi çc tÕ bµo ®Ých cña bÖnh nh©n . HiÖn nay, Vec t¬ th«ng thêng lµ çc Virut ®· ®îc biÕn ®æi gen mang DNA cña ngêi khoÎ m¹nh . Virut ph¸t triÓn dÇn dÇn vµ çc gen cña chóng ®îc chuyÓn tíi çc tÕ bµo ngêi ®·

nhiÔm bÖnh . Ngêi ta cè g¾ng t¹o ra çc lîi thÕ cña kh¶ n¨ng nµy vµ vËn dông genome virut ®Ó lo¹i bá çc gen g©y bÖnh vµ ®a çc gen trÞ liÖu vµo c¬ thÓ ngêi bÖnh . Çc tÕ bµo ®Ých cña bÖnh nh©n (ch¼ng h¹n nh çc tÕ bµo gan hoÆc phæi ) sÏ bÞ nhiÔm víi çc vec t¬ virut . Çc vec t¬ sau ®ã l¹i “bèc dì”çc vËt liÖu di truyÒn cña nã cã chøa çc gen trÞ liÖu vµo çc tÕ bµo ®Ých. Sù sinh s«i n¶y në cña çc protein “cã chøc n¨ng”®îc t¹o ra tõ çc gen trÞ liÖu sÏ hoµn tr¶ tr¹ng th¸i b×nh thêng cña tÕ bµo ®Ých . 1.4.Çc lo¹i gen trÞ liÖu : VÒ mÆt lý thuyÕt cña GTL , ngêi ta ph©n biÖt gi÷a GTL ®èi víi tÕ bµo Soma vµ GTL ®èi víi çc tÕ bµo mÇm (germ) lµm nhiÖm vô sinh s¶n . DÜ nhiªn chØ cã çc tÕ bµo mÇm th× míi cã thÓ mang çc gen truyÒn tõ thÕ hÖ nµy sang thÕ hÖ kh¸c Xung quanh vÊn ®Ò nµy cã nhiÒu ý kiÕn kh¸c nhau: Mét sè ngêi ph¶n ®èi bÊt kú mét thao t¸c nµo cña GTL cho dï lµ cã ý ®Þnh tèt (VII , Rifkin 1983) . Mét sè kh¸c th× ®ång ý TLG ®îc dïng cho çc tÕ bµo soma nhng l¹i do dù ®èi víi çc tÕ bµo mÇm v× cha nh×n tríc ®îc çc hËu qu¶ ®èi víi çc thÕ hÖ t¬ng lai . Cßn mét sè kh¸c l¹i cho r»ng ®é an toµn còng nh sù ®iÒu hoµ trong GTL còng cÇn ph¶i uèn n¾n thêng xuyªn theo n¨m th¸ng vµ ph¶i ®îc sù chÊp thuËn cña lu©n lý . LiÖu ph¸p gen Soma (Somatic Gene Therapy) lµ ph¬ng ph¸p ®iÒu trÞ thay hoÆc sa ch÷a çc gen háng, gen g©y bÖnh cña çc tÕ bµo soma trong c¬ thÓ bÖnh nh©n. LiÖu ph¸p gen soma cã thÓ sö dông mét sè lo¹i tÕ bµo nh lympho(lymphocyte),nguyªn bµo sîi(Fibroblast),tÕ bµo gèc (stem cells), tÕ bµo m¸u(hematocyte), tÕ bµo biÓu b×(keratinocyte)... LiÖu ph¸p nµy ®· ®îc ¸p dông víi mét sè lín bÖnh nh©n m¾c çc bÖnh hiÓm nghÌo nh ung th ,thiÕu hôt miÔn dÞch tæ hîp trÇm träng (SCID) , thiÕu m¸u do hång cÇu h×nh lìi liÒm, x¬ nang v.v.. LiÖu ph¸p gen tÕ bµo mÇm (Germline Gene Therapy) lµ ph¬ng ph¸p ®iÒu trÞ , söa ch÷a hay thay thÕ çc gen háng cho giao tö (tinh trïng hoÆc tÕ bµo trøng) ®a çc tÕ bµo mÇm trë l¹i tr¹ng th¸i sinh lý b×nh thêng . TLG tÕ bµo mÇm cã thÓ theo 2 çch : a.§iÒu trÞ çc ph«i ë giai ®o¹n ®Çu (pre embryo) cã çc khuyÕt tËt di truyÒn nghiªm träng. b.§iÒu trÞ çc tÕ bµo mÇm (tinh trïng hay tÕ bµo trøng ) cña nh÷ng ngêi cã khuyÕt tËt vÒ mÆt di truyÒn mµ nh÷ng khuyÕt tËt nµy cã thÓ truyÒn l¹i cho çc thÕ hÖ sau . Çch tiÕp cËn nµy ®ßi hái sù thµnh th¹o vÒ kü thuËt . Tuy nhiªn, vÊn ®Ò nµy cßn nhiÒu tranh c·i chñ yÕu v× lý do ®¹o ®øc vµ cã sù liªn quan tíi viÖc nh©n b¶n ngêi . 1.5.Nh÷ng bÖnh cã thÓ sö dông ®îc GTL. HiÖn nay nh÷ng bÖnh nµo cã thÓ øng dông ®îc ph¬ng ph¸p ch÷a bÖnh b»ng gen ? §©y lµ mét c©u hái mµ nhiÒu ngêi quan t©m . Chóng ta nhí l¹i r»ng cuèi n¨m 1993 GTL ®· ®îc sö dông cho çc bªnh thiÕu hôt miÔn dÞch tæ hîp nghiªm träng ,bÖn¾utng Cholesterol cã tÝnh chÊt gia ®×nh,bÖnh nang x¬ vµ bÖnh Gaucher. Cho tíi nay phÇn lín çc protocol ®îc ¸p dông cho çc bÖnh ung th vµ mét sè Ýt híng tíi bÖnh AIDS . Còng cã mét sè bÖnh ®îc bµn luËn ®Ó sö dông GTL nh bÖnh Parkinson vµ bÖnh Alzheimer, bÖnh viªm khíp , çc bÖnh vÒ tim (VII, Wolff 1993). Dù ¸n bé gen ngêi ®ang nç lùc x¸c ®Þnh vÞ trÝ cña tÊt c¶ çc gen trong bé gen ngi¬× , sau ®ã tiÕp tôc x¸c ®Þnh çc gen g©y bÖnh di truyÒn . Còng trong dù ¸n nµy Eve Nichols ®· ®a ra çc tiªu chuÈn lùa chän çc bÖnh sö dông GTL nh sau : 1.Çc bÖnh nÆng ®ang ®e do¹ sù sèng mµ kh«ng cã çch cøu ch÷a 2.Ph¶i x¸c ®Þnh râ rµng çc tæ chøc, m« vµ çc tÕ bµo bÞ nhÔm bÖnh . 3.B¶n sao b×nh thêng cña çc gen khuyÕt tËt ph¶i ®îc ph©n lËp vµ t¸ch dßng . 4.Çc gen b×nh thêng cã thÓ ®îc ®a vµo tõng bé phËn nhá cña tÕ bµo m« bÞ bÖnh. HoÆc khi ®a mét gen vµo mét m« ®Ých nh tuû x¬ng ch¼ng h¹n th× nã sÏ lµm thay ®æi qu¸ tr×nh diÔn tiÕn ë çc m« bÞ bÖnh . 5. Gen cã thÓ ®îc chuyÓn tíi mét vÞ trÝ thÝch hîp khi ®ã nã sÏ chØ ®¹o viÖc tæng hîp mét lîng protein cã chøc n¨ng b×nh thêng ®Ó t¹o nªn mét sù kh¸c biÖt ®Æc biÖt. 6.Çc kü thuËt ®îc ¸p dông ph¶i ®îc x¸c nhËn lµ an toµn ( III,Nichols 1988,p.18) Cho tíi nay GTL cã thÓ ®îc øng dông trong ç c bÖnh cô thÓ nh sau : 1.5.1.§iÒu trÞ çc bÖnh di truyÒn ( inherited disorders) . 1.5.1.1.Víi çc bÖnh di truyÒn g©y nªn bëi çc locut gen ®¬n (monogenic ). Nh÷ng bÖnh nµy thêng g©y tö vong ë giai ®o¹n sím vµ ®Ó l¹i çc di chøng cho çc thÕ hÖ sau. Møc ®é di truyÒn lµ 100% . Mét sè bÖnh ®iÓn h×nh lµ : -ThiÕu hôt miÔn dÞch tæ hîp trÇm träng (SCID) -ThiÕu m¸u do hång cÇu h×nh lìi liÒm (Sickle cell anemia) -BÖnh a ch¶y m¸u (Hemophilia) 7

-BÖnh x¬ nang (cystic fibrosis) vµ viªm phæi cÊp. -BÖnh Parkinson -BÖnh Gaucher. -BÖnh rèi lo¹n m·n tÝnh chøc n¨ng tæ chøc h¹t (chronic granulomatoses disease) 1.5.1.2. Çc bÖnh do rèi lo¹n di truyÒn çc locut ®a gen (polygenic) §©y lµ nhãm bÖnh g©y bëi nhiÒu gen thuéc çc locut kh¸c nhau . Tuú theo møc ®é h háng hoÆc mÊt chøc n¨ng gen cña mét hay nhiÒu gen (alelle) mµ møc ®é biÓu hiÖn bÖnh cã kh¸c nhau . Nh÷ng bÖnh nµy chØ di truyÒn l¹i cho thÕ hÖ sau díi 100%.Cã thÓ kÓ qua çc bÖnh sau ®©y: -BÖnh tim bÈm sinh (Congenital Heart disease) -Ung th -BÖnh tiÓu ®êng (Diabetes) -BÖnh nghiÖn rîu (Alcoholism) -BÖnh t©m thÇn ph©n liÖt (Schizophrenia) -BÖnh cã hµnh vi ph¹m téi (Criminal behavior) 1.5.2.§iÒu trÞ çc bÖnh do nhiÔm trïng : GTL ®· ®¹t hiÖu qu¶ cao trong viÖc ®iÒu trÞ çc bÖnh nhiÔm trïng do vi khuÈn vµ virut nh ung th gan, lao , HIV-AIDS ,viªm gan B ... Trong t¬ng lai kh¶ n¨ng GTL sÏ ®iÒu trÞ ®îc nhiÒu bÖnh truyÒn nhiÔm víi hiÖu qu¶ vµ chÊt lîng cao , cøu sèng ®îc nhiÒu ngêi bÖnh . PhÐp ch÷a bÖnh b»ng gen lµ mét ph¬ng ph¸p míi ,cã hiÖu qu¶ cao nhng hiÖn nay vÉn bÞ h¹n chÕ v× nã qu¸ phøc t¹p, tèn kÐm vµ b¾t buéc ®ßi hái ph¬ng tiÖn kü thuËt hiÖn ®¹i. ChÝnh v× vËy cho tíi nay ph¬ng ph¸p nµy chØ míi giíi h¹n trong çc bÖnh hiÓm nghÌo vµ chØ cã çc níc ph¸t triÓn víi tiÒm lùc kinh tÕ cao míi cã ®iÒu kiÖn ¸p dông. DÜ nhiªn cßn nhiÒu vÊn ®Ò kh¸c n÷a nh hÖ sè an toµn vµ nh÷ng hËu qu¶ ngoµi ý muèn cña gen trÞ liÖu ...còng lµm cho ngêi ta thËn träng h¬n khi sö dông kü thuËt nµy . Víi çc níc ®ang ph¸t triÓn th× gen trÞ liÖu míi chØ giíi h¹n ë nh÷ng thùc nghiÖm, cha cã chiÕn lîc ph¸t triÓm rÇm ré .Níc ta còng vËy, liÖu ph¸p gen cßn rÊt xa l¹ víi çc thÇy thuèc , chóng ta cha s½n sµng tiÕp nhËn mét “vò khÝ” míi hiÖn ®¹i ,hiÖu qu¶ vît tréi h¬n h¼n çc ph¬ng ph¸p kh¸c .§· ®Õn lóc chóng ta ph¶i ®Æt ra mét chiÕn lîc ph¸t triÓn cã ®Þnh híng cô thÓ vÒ gen trÞ liÖu , v× nã cã nhiÒu lîi thÕ vît tréi vµ ch¾c ch¾n sÏ mang l¹i h¹nh phóc cho tÊt c¶ mäi ngêi .

Ch¬ng II Nguyªn lý c¬ b¶n cña Gen trÞ liÖu 2.1. Nguyªn lý cña gen trÞ liÖu GTL lµ ®a mét gen míi (cßn gäi lµ gen liÖu ph¸p) vµo trong tÕ bµo ngêi lµm cho nã g¾n ®óng vµo vÞ trÝ cÇn söa ch÷a cña bé gen vµ ho¹t ®éng mét çch b×nh thêng trong tÕ bµo .Çc gen trÞ liÖu nµy t¹o ®îc çc s¶n phÈm cã kh¶ n¨ng h¹n chÕ hoÆc k×m h·m sù t¸c ®éng cña çc gen háng , do ®ã lµm gi¶m çc biÓu hiÖn cña bÖnh .§©y chÝnh lµ kü thuËt di truyÒn (genetic engineering) hay cßn gäi lµ thao t¸c gen (gene manipulation) hay t¸ch dßng gen (gene cloning), c«ng nghÖ DNA t¸i tæ hîp (recombitant DNA technology) , s÷a ®æi di truyÒn (genetic modification) hoÆc cßn gäi lµ di truyÒn häc míi (new genetics). MÆc dï nhiÒu kü thuËt ®a d¹ng vµ phøc t¹p ®îc sö dông nhng çc nguyªn lý cña kü thuËt di truyÒn kh¸ ®¬n gi¶n . C¬ së cña c«ng nghÖ nµy lµ th«ng tin di truyÒn m· ho¸ trong DNA tån t¹i ë d¹ng çc gen . Çc th«ng tin nµy cã thÓ söa ®æi theo nhiÒu çch kh¸c nhau ®Ó ®¹t tíi nh÷ng môc ®Ých nhÊt ®Þnh trong nghiªn cøu c¬ b¶n còng nh øng dông trong y sinh häc . §iÓm mÊu chèt cña kü thuËt di truyÒn lµ t¸ch chiÕt mét ®o¹n DNA riªng biÖt tõ hÖ gen ( ®ã lµ b¶n chÊt cña t¸ch dßng gen ). Víi GTL qu¸ tr×nh nµy bao gåm 4 bíc sau ®©y : 1.T¸ch dßng gen trÞ liÖu (t¹o ra çc ®o¹n DNA). 2. Chän vec t¬ chuyÓn gen phï hîp víi gen trÞ liÖu vµ nèi chóng l¹i víi nhau . 3. T¹o çc vec t¬ t¸i tæ hîp vµ ®a çc vec t¬ mang gen trÞ liÖu vµo tÕ bµo chñ vµ nh©n lªn . 4. Chän läc çc tr×nh tù (sequence) quan t©m ,theo dâi sù ho¹t ®éng vµ nh÷ng biÓu hiÖn cña gen trÞ liÖu. Chóng ta h·y lít qua ®«i nÐt vÒ c¬ së sinh häc cña c«ng nghÖ DNA . 2.1.1.Çc tÕ bµo chñ (organnisms) : C«ng nghÖ DNA míi ®· t¹o dùng ®îc kh¶ n¨ng nghiªn cøu trªn vi khuÈn vµ virut (H×nh 2.1.)

H×nh 2.1.Vi khuÈn phôc vô con ngêi. ¶nh hiÓn vi ®iÖn tö mét mÉu Pseudomonas. Anad Chakrabarty ®· sö dông Pseudomonas biÕn ®æi gen s¶n xuÊt ra çc enzym ph©n huû dÇu vµ lµm s¹ch m«i trêng. Nh÷ng sinh vËt nµy cã thÓ nu«i cÊy ®îc mét çch dÔ dµng vµ viÖc kh¶o s¸t Ho¸ sinh còng ®îc thùc hiªn mét çch dÔ dµng trong èng nghiÖm.Vi khuÈn ®îc dïng phæ th«ng nhÊt trong 9

c«ng nghÖ DNA lµ Escherichia Coli.ViÖc sö dung réng r·i ®Çu dß vi khuÈn lµ mét biÕn cè lÞch sö .Nh÷ng c«ng tr×nh nghiªn cøu trªn nh÷ng sinh vËt nµy qua hµng mÊy thËp kû ®· cho phÐp çc nhµ sinh häc hiÓu râ h¬n vª mÆt Ho¸ sinh, h×nh th¸i, sinh lý,vµ di truyÒn häc cña chóng h¬n bÊt cø sinh vËt nµo kh¸c (kÓ c¶ con ngêi) v× chóng dÔ dµng ®îc nu«i cÊy vµ kh«ng ph¶i lµ yÕu tè g©y bÖnh cho con ngêi . E. Coli ®· trë thµnh con ngùa thå cho çc thÝ nghiÖm trong c«ng nghÖ DNA . 2.1.1.1.NhiÔm s¾c thÓ cña vi khuÈn ®Æc biÖt thÝch hîp cho çc thÝ nghiÖm DNA bëi v× nã chØ thuÇn cã DNA , cßn ë çc tÕ bµo nh©n chuÈn nh çc tÕ bµo ®éng vËt th× phøc t¹p h¬n v× NST cã chøa nhiÒu protein g¾n chÆt vµo DNA . H¬n n÷a , NST cña vi khuÈn lµ hoµn toµn ®¬n lÎ nªn nã cã thÓ tù biÓu hiÖn ®îc mµ kh«ng bÞ lÊn ¸t bëi NST thø hai . Ngîc l¹i NST cña çc tÕ bµo nh©n chuÈn l¹i lµ cÆp ®«i vµ thêng mét trong sè ®ã lµ tréi . Thªm n÷a lµ NST cña vi khuÈn thêng n»m tù do trong tÕ bµo chÊt v× thÕ nghiªn cøu nã dÔ dµng h¬n . Trong khi ®ã NST cña çc tÕ bµo nh©n chuÈn th× l¹i cã mµng nh©n bao quanh nh©n nªn c«ng viÖc kh¶o s¸t gÆp nhiÒu khã kh¨n h¬n . Mét lý do kh¸c n÷a lµ m· di truyÒn cña çc sinh vËt nµy lµ rÊt phæ th«ng nªn vi khuÈn cã thÓ biÓu hiÖn DNA ngo¹i lai tõ bÊt kú c¬ thÓ nµo dï dµi ®Õn mÊy nÕu nh ®· g¾n ®îc vµo DNA cña vi khuÈn . Trªn thùc tÕ, mét gen ngo¹i lai khi ®· g¾n vµo NST cña vi khuÈn th× nã sÏ ®îc sao chÐp vµ phiªn m· chÜnh x¸c gièng y nh DNA vi khuÈn mÑ. 2.1.1.2.Virut : Çc virut thêng ®îc dïng trong çc thÝ nghiÖm c«ng nghÖ DNA . Nh÷ng h¹t siªu vi nµy bao gåm Ýt hoÆc nhiÒu ®o¹n RNA hoÆc DNA ®îc bao trong mét çi ¸o protein vµ tuú thuéc vµo tõng lo¹i virut mµ cã lo¹i cßn cã c¶ mét líp lipid bao quanh. Virut sao chÐp mét çch ®¬n ®éc trong çc tÕ bµo sèng. ë ®ã chóng lét bá phÇn vá protein cña m×nh vµ sö dông cç m¸y ph©n tö cña tÕ bµo ®Ó t¹o nªn çc virut míi .Virut DNA hay RNA ho¹t ®éng nh mét gen vµ chØ ®¹o sù tæng hîp çc h¹t virut míi . Khi ®ã çc virut RNA hay DNA t¸c ®éng nh mét RNA th«ng tin cung cÊp çc m· (Codon) cho çc protein enzym vµ çc thµnh phÇn cÊu tróc cña virut . §«i khi virut kh«ng tù sao chÐp tøc kh¾c mµ nã l¹i g¾n vµo NST cña tÕ bµo chñ vµ trë thµnh mét bé phËn cña bé gen tÕ bµo . DNA cña Herpesvirus ch¼ng h¹n , nã cã thÓ héi nhËp vµo bé gen cña tÕ bµo thÇn kinh vµ ë l¹i ®ã nhiÒu n¨m g©y nªn sù x©m nhiÔm tuÇn hoµn herpes .Còng t¬ng tù nh vËy, virut g©y héi chøng thiÕu hôt miÔn dich trªn ngêi HIV chóng lét bá ¸o trªn tÕ bµo råi RNA cña chóng ho¹t ®éng nh mét çi khu«n tæng hîp DNA. DNA nµy tù cµi vµo genome cña tÕ bµo chñ. Nh vËy, tÕ bµo ®· trë thµnh vËt mang virut DNA vµ bÞ bÖnh HIV. Kh¶ n¨ng virut cµi ®îc vµo bé gen cña tÕ bµo chñ ®· lµm çc nhµ c«ng nghÖ DNA chó ý , hä nh×n nhËn nã nh lµ mét çch ®Ó mang gen vµo trong tÕ bµo . Nh÷ng nghiªn cøu ë nh÷ng n¨m 1950 còng chøng minh r»ng t¸i tæ hîp gen còng cã thÓ x¶y ra gi÷a çc vi khuÈn vµ virut. Çc thÝ nghiÖm cña Griffith víi vi khuÈn vµo n¨m 1928 ®· lµm râ sù t¸i tæ hîp gen vµ dÉn tíi sù ph¸t hiÖn cña Avery vÒ DNA lµ mét ph©n tö cã liªn quan trong t¸i tæ hîp. Còng trong nh÷ng n¨m 1950 , çc nhµ vi khuÈn häc ®· ph¸t hiÖn ra çc vËt chÊt di truyÒn tõ çc m¶nh vì vi khuÈn cã thÓ ®a ®uîc vµo çc vi khuÈn sèng , ®ã lµ mét hiÖn tîng tù nhiªn . HiÖn tîng nµy chÝnh lµ sù biÕn n¹p (transforrmation). MÆc dï sù biÕn n¹p chØ x¶y ra víi tû lÖ Ýt h¬n 1% trong mét quÇn thÓ vi khuÈn , nhng ®iÒu nµy ®· dÉn ®Õn nh÷ng thay ®æi s©u s¾c trong di truyÒn häc . Trong sù biÕn n¹p, mét sè vi khuÈn cho (donnor) bÞ vì ra vµ DNA cña chóng ®îc lé ra thµnh çc m¶nh . Khi cã mét vi khuÈn nhËn (recipient) th× mét ®o¹n DNA chuçi kÐp chøa kho¶ng 1020 gen cã thÓ ®i qua v¸ch vµ mµng tÕ bµo cña chóng . Mét enzym lµm hoµ tan mét chuçi cña DNA vµ chuçi cßn l¹i th× ®æi chç cho ®o¹n DNA chuçi ®¬n trong NST vi khuÈn nhËn . Çc gen ngo¹i lai nµy sau ®ã tù biÓu lé trong qu¸ tr×nh tæng hîp protein ®Ó hoµn tÊt sù biÕn n¹p. Díi çc ®iÒu kiÖn tù nhiªn, sù biÕn n¹p x¶y ra ë nh÷ng c¬ thÕ cã DNA t¬ng tù .Mét trong sè çc hÖ qu¶ cã thÓ lµ lµm t¨ng tÝnh g©y bÖnh cho c¬ thÓ nhËn (trong thÝ nghiÖm Griffith’s pneumococci) . Mét hÖ qu¶ kh¸c cã thÓ lµ ph¸t triÓn tÝnh kh¸ng thuèc . §iÒu ®ã , cã thÓ gi¶i thÝch ®îc mét sè vi khuÈn ®· kh¸ng thuèc trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y nh thÕ nµo .

H×nh 2.2. CÊu tróc cña c¸c Virut (a) Virut thùc vËt (virut kh¶m cñ c¶i ®á). (b) Virut kh¶m thuèc l¸ .(c) Bacteriophage . TiÕp tôc nh÷ng nghiªn cøu trong nh÷ng n¨m 1950 ngêi ta ®· chØ râ r»ng vi khuÈn còng cã thÓ ®îc t¸i tæ hîp bëi qu¸ tr×nh liªn hîp (conjugation) .

H×nh 2.3, C¬ chÕ trong ®ã mét Retrovirut nh HIV cã liªn quan víi tÕ bµo vËt chñ . Acid Nucleic cña Retrovirut lµ RNA.Enzymphiªn m· ngîc tæng hîp mét ph©n tö DNA chuèi kÐp th¼ng (ds DNA), sau ®ã hîp nhÊt víi vµo bé gen tÕ bµo chñ nh mét Provirut. ë nh÷ng thêi ®iÓm sau ®ã (giê, ngµy , tuÇn hoÆc dµi h¬n nòa) RNA polymeraza tõ vËt chñ sÏ sao chÐp provirut thµnh d¹ng genome RNA cña Retrovirut .Khi ®ãng gãi víi protein th× genome nµy t¹o nªn mét bé c¸c Virut míi ra khái tÕ bµo nµy ®Ó g©y nhiÔm c¸c tÕ bµo míi vµ tiÕp tôc chu tr×nh. Sù ph¸t hiÖn cña Joshua Lederberg, Francois Jacob vµ Elie Wollman ®· cã ¶nh hëng s©u s¾c tíi viÖc nghiªn cøu . Trong khi liªn hîp 2 vi khuÈn , mét cho vµ mét nhËn tiÕn l¹i gÇn nhau vµ nèi víi nhau bëi mét cÇu bµo chÊt (cytoplasmic) . Sau ®ã DNA chuçi ®¬n tõ vi khuÈn cho ®i qua cÇu bµo chÊt ®Ó tíi vi khuÈn nhËn .

H×nh 2.4. BiÕn n¹p trong tÕ bµo vi khuÈn .(a) Mét ®o¹n DNA gi¶i phãng tõ mét tÕ bµo cho ®· chÕt .(b)§o¹n DNA ®i vµo c¸c tÕ bµo nhËn ®ang sèng. (c)Mét chuçi bÞ hoµ tan vµ (d) chuçi cßn l¹i thÕ mét ®o¹n cña chuçi trong NST tÕ bµo nhËn vµ biÕn n¹p tÕ bµo nµy. BiÕn n¹p ®îc nghiªn cøu s©u tõ nh÷ng n¨m 1950 vµ ®· ®îc chøng minh nh÷ng ®iÒu x¶y ra trong phßng thÝ nghiÖm vµo nh÷ng n¨m 1970. ë ®©y nã cã thÓ hîp nhÊt víi NST vi khuÈn nhËn (rÊt hiÕm) , hoÆc cã thÓ tån t¹i ë tÕ bµo chÊt díi d¹ng mét vßng DNA di ®éng tù do (xem phÇn Plasmid). Nh÷ng gen míi thu nhËn tõ vi khuÈn cho sau nµy tù nã biÓu hiÖn (H×nh 2.5.)

H×nh 2.5. Sù hîp nhÊt trong vi khuÈn. Hai tÕ bµo Escherichia Coli nèi víi nhau qua cÇu t¬ng bµo .Nh÷ng tÕ bµo phÝa bªn ph¶i cã l«ng trªn bÒ mÆt ®ã lµ çc tÕ bµo cho . Çc tÕ bµo phÝa bªn tr¸i lµ çc tÕ nhËn .Sù hîp nhÊt t¹o thuËn lîi cho viÖc vËn chuyÓn çc chÊt liÖu di truyÒn tõ tÕ bµo nµy sang tÕ bµo kh¸c .§ã lµ mét ph¬ng ph¸p mµ vi khuÈn thu ®îc çc gen cho phÐp nã kh¸ng l¹i nhiÒu lo¹i thuèc . Sù liªn hîp nh ®· m« t¶ x¶y ra gi÷a çc tÕ bµo tõ çc loµi kh¸c nhau cña vi khuÈn , ch¼ng h¹n nh gi÷a Salmonella vµ Shigella .(ngîc l¹i, sù biÕn n¹p chØ x¶y ra gi÷a çc tÕ bµo cã bé gen gièng nhau). Nh v©y, sù liªn hîp cã thÓ coi nh viÖc ®a mét gen vµo çc vi khuÈn kh«ng cã quan hÖ di truyÒn vµ coi nh ®ã lµ sù t¸i tæ hîp cña çc mÉu ph©n kú (divergent) réng. D¹ng thø ba cña t¸i tæ hîp ®îc ph¸t hiÖn vµo nh÷ng n¨m 1950 lµ cña Joshua Ledeberg vµ Norton Zinder. Nh÷ng nhµ nghiªn cøu nµy ®· ph¸t hiÖn ra r»ng virut cã thÓ truyÒn DNA cho çc tÕ bµo vi khuÈn vµ t¸i tæ hîp cã hiÖu qu¶ çc tÕ bµo nµy . Qu¸ tr×nh nµy gäi lµ sù chuyÓn n¹p (transduction). Trong chuyÓn n¹p , mét virut lµ bacteriophage (®¬n gi¶n gäi lµ phage) chui vµo mét tÕ bµo vi khuÈn vµ trao ®æi DNA cña nã víi NST vi khuÈn .Råi çc virut nµy cã thÓ ®îc th¸o gì khái NST vi khuÈn , nh vËy nã cã thÓ mang theo mét ®o¹n nhá DNA cña vi khuÈn . Khi virut sao chÐp nã tù t¸i b¶n DNA cña chÝnh nã còng nh DNA vi khuÈn vµ ®ãng gãi DNA vµo trong çc phage míi .Vµ khi virut chui nµo trong mét vi khuÈn míi nã sÏ tù g¾n vµo NST vi khuÈn vµ mang theo DNA cña vi khuÈn ®· ®îc g¾n tõ tríc . Nh vËy vi khuÈn míi nµy ®· ®îc t¸i tæ hîp , hay cßn gäi lµ sù chuyÓn n¹p (transduction). ChuyÓn n¹p lµ mét sù kiÖn Ýt x¶y ra ë çc tÕ bµo vi khuÈn , khã t×m ®îc çc vÝ dô . Tuy nhiªn, tiÒm n¨ng cña chuyÓn n¹p th× rÊt to lín bëi v× nhiÒu virut cã thÓ trao ®æi trong çc tÕ bµo vËt chñ khi phage chuyÓn n¹p .Ch¼ng h¹n nh Bacillus diphteria lµ nh÷ng bÕn c¶ng cho bacteriophage m· ho¸ cho viÖc t¹o ra çc ®éc tè cña chÝnh sinh vËt nµy . Salmonnella g©y nhiÔm trïng thùc phÈm còng ®îc hiÓu lµ vËt vËn chuyÓn bacteriophage . §èi víi ngêi th× çc herpesvirus cã thÓ tån t¹i trong çc tÕ bµo thÇn kinh nh ®· ®Ò cËp ë trªn .Virut g©y thuû ®Ëu, virut g©y nhiÔm mononucleosis vµ HIV lµ çc virut ®· ®îc nghiªn cøu kü lìng , nã cã thÓ cµi a xit nucleic cña chóng vµo trong çc tÕ bµo cña ngêi.

H×nh 2.6. ¶nh qua hiÓn vi ®iÖn tö cña mét Bacteriophage vµ vi khuÈn chñ cña nã- E.Coli .NhiÒu Bacteriophage cã thÓ g¾n vµo bÒ mÆt tÕ bµo vi khuÈn . Trong h×nh phage ®ang sao chÐp trong vi khuÈn vµ cã thÓ nh×n thÊy nhiÒu thø trong tÕ bµo chñ . Qu¸ tr×nh biÕn n¹p, liªn hîp, vµ chuyÓn n¹p cho phÐp vi khuÈn thu ®îc nh÷ng mÊu DNA míi vµ duy tr× ®îc çc ®Æc tÝnh di truyÒn . Trong nh÷ng n¨m 1950 , çc nhµ sinh häc ph©n tö lÇn ®Çu tiªn sö dông tõ “t¸i tæ hîprecombined” ®Ó chØ çc vi khuÈn ®· biÕn ®æi gen vµ cã DNA míi .DÇn dÇn, tõ “recombinant DNA” trë thµnh thuËt ng÷ Ho¸ sinh . Cho tíi nay, DNA t¸i tæ hîp dïng ®Ó chØ çc ph©n tö DNA cã chøa çc thµnh phÇn DNA tù nhiªn còng nh mét sè DNA ngo¹i lai g¾n vÜnh viÔn vµo ph©n tö gèc . Nh÷ng thùc nghiÖm víi vi khuÈn trong nh÷ng n¨m 1950 ®· chøng minh r»ng t¸i tæ hîp lµ mét kh¶ n¨ng x¶y ra trong tù nhiªn . Çc nhµ khoa häc b¾t ®Çu ®Æt ra vÊn ®Ò lµ cã thÓ thùc hiÖn sù t¸i tæ hîp t¬ng tù trong phßng thÝ nghiÖm kh«ng ? 2.1.2.Çc enzym giíi h¹n: C«ng tr×nh ®îc quan t©m lín trong nh÷ng n¨m 1950 vÒ DNA lµ c«ng tr×nh cña Salvador Luria cïng céng t¸c ®· cung cÊp b»ng chøng lµ E.Coli cã thÓ kh¸ng l¹i sù ph¸ huû bëi bacteriophage . Tøc lµ nã cã thÓ”h¹n chÕ” sù sao chÐp bëi virut . N¨m 1962, Werner Arber vµ nhãm céng t¸c ®É chøng minh r»ng cã mét hÖ thèng enzym h¹n chÕ sù sao chÐp cña virut do nã c¾t bá DNA cña phage tríc khi nã tíi tÕ bµo chÊt cña vi khuÈn . Hä ®· ph©n lËp ®îc enzym ®ã tõ E.Coli vµ ®Æt tªn lµ endonucleaza. Enzym nµy c¾t DNA cña virut nhng kh«ng c¾t DNA cña vËt chñ vi khuÈn bëi v× nã ®· cã sù c¶i biÕn tríc tiªn ë DNA vi khuÈn b»ng çch g¾n thªm çc nhãm metyl vµo DNA vi khuÈn . V× endonucleaza”h¹n chÕ” sù sao chÐp cña virut (vµ bëi v× nã lµm khëi ®éng vÞ trÝ”h¹n chÕ” sù sao chÐp trªn ph©n tö DNA) nªn dÇn dÇn ®îc gäi lµ enzym c¾t giíi h¹n (restriction enzyme). Nhãm nghiªn cøu cña Arber ®· ph¸t hiÖn ra r»ng enzym c¾t giíi h¹n cña hä Ýt cã gi¸ trÞ thùc tiÔn trong thao t¸c DNA v× nã c¾t DNA ë nhiÒu vÞ trÝ . V× thÕ cho tíi n¨m 1970 Hamilton Smith vµ céng t¸c l¹i ph©n lËp ®îc mét enzym giíi h¹n míi tõ vi khuÈn Haemophilus influenzae . Enzym nµy c¾t ph©n tö DNA ë nh÷ng ®iÓm cã thÓ ®o¸n tríc ®îc v× vÞ trÝ t¸c ®éng cña nã chÝnh x¸c h¬n enzym cña Arber. Khi sö dông enzym nµy Daniel Nathan vµ nhãm nghiªn cøu cña «ng ®· ph©n lËp ®îc DNA tõ mét virut trªn khØ gäi lµ Simian virut 40 (hay SV40) vµ chøng minh r»ng enzym cña vi khuÈn nµy cã thÓ dïng ®Ó c¾t DNA virut ë mét vµi vÞ trÝ nµo ®ã (H×nh 2.7.).

H×nh 2.7.Çc Enzym giíi h¹n . (a) Werner Arber , Hamilton Smith vµ Daniel Nathans nhËn gi¶i Nobel n¨m 1978 vÒ Sinh lý häc vµ y häc víi c«ng tr×nh vÒ çc enzym giíi h¹n . (b) Ho¹t tÝnh cña çc enzym giíi h¹n (hoÆc Endonucleaza) . Enzym giíi h¹n çt 2 chuçi cña ph©n tö DNA ®Ó t¹o thµnh 2 m¶nh . (c)VÞ trÝ nhËn d¹ng cña mét vµi enzym giíi h¹n. Mòi tªn chØ chøc n¨ng cña nh÷ng enzym giíi h¹n kh¸c nhau . Lu ý r»ng ë vÞ trÝ nhËn d¹ng ®Æc biÖt tr×nh tù nucleotit cña 2 chuçi DNA ch¹y theo híng ®èi nghÞch nhau . Sù ®èi xøng nµy gäi lµ ®èi xøng quay 2 chiÒu .Còng lu ý r»ng 2 enzym HaeIII vµ Smal t¹o ra çc m¶nh víi çc ®Çu kh«ng s¾c (blunt) trong khi ®ã enzym EIoRIvµ HindIII t¹o nªn çc ®Çu ®ung ®a . Nh÷ng ®Çu ®ung ®a nµy cÇn cho kü thuËt g¾n gen . Do nh÷ng c«ng tr×nh nµy mµ Arber,Smith vµ Nathan ®· ®îc nhËn gi¶i thëng Nobel vÒ sinh lý häc vµ y häc n¨m 1978. Nhê çc thµnh tùu nghiªn cøu trong nhiÒu n¨m , çc nhµ c«ng nghÖ DNA thÊy r»ng hä cã thÓ sö dông çc enzym giíi h¹n ®Ó c¾t nhá ph©n tö DNA theo ý muèn bÊt kÓ tõ nguån gèc nµo . ThËt vËy, enzym c¾t giíi h¹n tõ vi khuÈn cã thÓ dïng ®Ó c¾t mét ph©n tö DNA ë ®iÓm X , bÊt chÊp nã lµ DNA cña thùc vËt, ®éng vËt hay ngêi. Ch¼ng h¹n nh ®èi víi mét sè çc virut th× mét enzym cã thÓ c¾t ®îc DNA cña çc virut kh¸c nhau ë r©t nhiÒu vÞ trÝ .Thùc tÕ lµ cã trªn 1.200 enzym çt giíi h¹n ®· ®îc ph©n lËp vµ lµm tinh khiÕt tõ vi khuÈn .Enzym thuéc nhãm

nµy t¸c ®éng vµo nhiÒu tr×nh tù nucleotit kh¸c nhau : cã kho¶ng 75 enzym ®· trë thµnh th¬ng phÈm . C¸c enzym c¾t giíi h¹n gäi tªn theo quy íc quèc tÕ nh sau: Ch÷ ®Çu tiªn viÕt ch÷ in hoa chØ tªn chi hoÆc loµi vi khuÈn mµ tõ ®ã c¸c enzym giíi h¹n ®îc ph©n lËp (ch÷ nghiªng) B¶ng.2.1.

Hai ch÷ tiÕp theo viÕt ch÷ thêng chØ gièng vi khuÈn (còng ch÷ nghiªng) , tiÕp theo lµ lµ mét ch÷ hoa chØ chñng vi khuÈn vµ cuèi cïng lµ sè La m· chØ thø tù enzym giíi h¹n ®îc t×m ra . Ch¼ng h¹n nh çc enzym díi ®©y : EcoRI tõ Escherichia (E) co(co) chñng RY13(R) Endonucleaza thø nhÊt (I) BamHI tõ Bacillus(B) amyloliquifaciens(am) chñng H(H) endonucleaza thø nhÊt (I) HindIII tõ Haemophilus (H) influenzae(in) chñng Rd(d) endonucleaza thø III (III) Víi mét c¬ chÕ cha ®îc x¸c ®Þnh , enzym giíi h¹n quÐt trªn ph©n tö DNA vµ dõng l¹i khi nã nhËn d¹ng ®îc mét tr×nh tù cña 4 hay 6 nucleotit . Tr×nh tù nhËn d¹ng (recognition sequence) nh tªn gäi cña nã lµ n¬i mµ ph©n tö DNA bÞ ph©n c¾t .Tr×nh tù nhËn d¹ng biÓu lé sù ®èi xøng 2 vßng , ®iÒu ®ã cã nghÜa lµ çc nucleotit ë ®u«i tr×nh tù nµy lµ bæ cøu cho çc nucleotit ë mét ®Çu kh¸c (H.4.8c). Thùc chÊt 2 chuçi cña xo¾n kÐp l¹i cã cïng mét tr×nh tù nucleotit ch¹y theo híng ®èi nghÞch däc theo chiÒu dµi cña tr×nh tù . NhiÒu enzym giíi h¹n chØ c¾t ë çc vÞ trÝ ë phÇn ®u«i , nhng

mét sè enzym giíi h¹n kh¸c l¹i c¾t c¶ nh÷ng vÞ trÝ ë cuèi cña nh÷ng chuçi ®¬n , tøc lµ kh«ng cè ®Þnh (h 4.8c). Sù s¾p xÕp ®éc quyÒn nucleotit trªn 2 chuçi cã 2 t¸c dông: 1. V× tr×nh tù nhËn d¹ng lµ gièng nhau trªn c¶ 2 chuçi (mÆc dï ch¹y tr¸i chiÒu nhau), nªn çc enzym giíi h¹n nhËn d¹ng vµ c¾t ®îc ë c¶ 2 chuçi cña DNA v× thÕ nã c¾t ®îc c¶ 2 chuçi xo¾n kÐp . 2. Nh÷ng vÞ trÝ mµ 2 chuçi ®îc c¾t thêng kh«ng ph¶i lµ ®èi nghÞch trùc tiÕp v× thÕ nã cã thÓ c¾t ®îc mét vµi nucleotit ë çc ®Çu cuèi cïng . C¬ së cña sù xª dÞch nµy lµ sù bæ cøu lÉn nhau cña çc nucleotit . Mét ®iÒu quan träng cÇn nhí lµ bÊt kú mét c¾t bá nµo bëi enzym giíi h¹n ®Òu x¶y ra ë cïng mét vÞ trÝ nhËn d¹ng bÊt kÓ nguån gèc cña DNA tõ ®©u (H×nh 2.8.)

H×nh 2.8. ThiÕt lËp mét ph©n tö DNA t¸i tæ hîp ®i tõ 2 vßng DNA xa l¹ . Enym giíi h¹n EcoRI t¸ch DNA ë c¶ 2 vßng bëi v× mÆc dÇu chóng kh«ng cã quan hÖ víi nhau nhng nh÷ng vßng nµy vÉn cã çc vÞ trÝ nhËn d¹ng gièng nhau . Çc vßng b©y giê trë nªn th¼ng . T¹i ®iÓm nµy çc ®Çu cã thÓ nèi víi nhau ®Ó t¹o nªn ph©n tö DNA ®¬n dµi . Sù g¾n kÕt nµy ®îc xóc t¸c bëi DNA Ligaza . Nh÷ng sù liªn kÕt nh thÕ lµ c¬ së cho sù t¸i tæ hîp gen tæng hîp . Mét ®iÒu n÷a còng rÊt quan träng ®ã lµ vÞ trÝ nhËn d¹ng cã Ýt nhÊt lµ mét trªn bÊt kú mét DNA nµo ®Ó cho bÊt kú nguån DNA nµo còng cã thÓ sö dông ®îc . Mçi m¶nh DNA cã çc nucleotit ®u ®a (dangling) gäi lµ “®Çu dÝnh-stickly ends” lµ kÕt qu¶ cña sù t¸c ®éng bëi enzym. Vµ bëi v× çc ®Çu cña chuçi ®¬n lµ bæ cøu cho nhau nªn chóng cã thÓ cÆp ®«i víi nhau hoÆc víi çc ®o¹n DNA kh¸c cã ®Çu dÝnh bæ cøu. §Æc tÝnh thø hai nµy t¹o cho enzym giíi h¹n trë thµnh mét c«ng cô v« gi¸ ®èi víi c«ng nghÖ gen –tøc lµ dï nguån gèc DNA cã thÓ lµ cña vi khuÈn, chim, hoÆc cña c©y mao l¬ng vµ dï dµi ®Õn mÊy ®i n÷a th× thÝ çc ®Çu dÝnh cña çc ®o¹n DNA nµy vÉn lµ bæ cøu. 2.1.3.Ligaza : Çc ®o¹n DNA bæ cøu kh«ng thÓ tù liªn kÕt víi nhau . §iÒu ch¾c ch¾n lµ liªn kÕt hydro sÏ ®îc h×nh thµnh gi÷a çc baz¬ bæ cøu . Nhng nh÷ng liªn kÕt nµy kh«ng ®ñ bÒn ®Ó kÕt nèi çc ®u«i nµy víi nhau mét çch v« tËn ®Æc biÖt lµ trong çc ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é sinh lý . §Ó thùc hiÖn viÖc g¾n l©u dµi çc ®Çu cuèi cña DNA th× ph¶i sö dông mét enzym , ®ã lµ DNA ligaza.

LÇn ®Çu tiªn ngêi ta ph©n lËp ®îc mét DNA ligaza tõ bacteriophage T4, nã cã thÓ g¾n çc bé khung ho¸ häc cña çc chuçi DNA do h×nh thµnh mét liªn kÕt ho¸ häc gi÷a nhãm phot phat 5’tù do cña çc ®o¹n nucleotit víi ph©n tö deoxy ribozacña nucleotit kÕ tiÕp. §ã chÝnh lµ liªn kÕt phot pho dieste (phosphodiesster bond)-mét liªn kÕt ®ång ho¸ trÞ bÒn v÷ng h¬n liªn kÕt hydro gi÷a çc baz¬ ni t¬ ®èi nghÞch . Liªn kÕt phot pho dieste tån t¹i ë tÊt c¶ çc nucleotit t¹o nªn çc ph©n tö DNA míi (H×nh 2.9.)

H×nh 2.9. Çc liªn kÕt ®Ó dÝnh çc ®o¹n DNA víi nhau trong ph©n tö DNA t¸i tæ hîp . Liªn kÕt hydro lµ liªn kÕt yÕu gi÷a çc baz¬ bæ cøu , cßn liªn kÕt bÒn v÷ng ®îc t¹o bëi Ligaza . Liªn kÕt nµy nèi çc bé khung cña chuçi DNA . DNA ligaza ®îc ph©n lËp lÇn ®Çu tiªn vµo n¨m1960. Nã ch¼ng nh÷ng cã trong çc virut mµ cßn cã c¶ trong çc tÕ bµo nh©n chuÈn vµ E.Coli. Nã nèi çc ®o¹n DNA víi nhau vµ tham gia cïng çc enzym kh¸c trong sù tæng hîp DNA . Enzym nµy còng gióp cho viÖc söa ch÷a DNA do nã g¾n l¹i çc m¶nh vì cña DNA, nhê vËy mµ lµm håi phôc l¹i çc vÕt th¬ng cña tÕ bµo . Trong c«ng nghÖ DNA nã ®ãng vai trß lµ sù g¾n kÕt cuèi cïng trong çc chuçi sù kiÖn dÉn ®Õn sù h×nh thµnh mét ph©n tö DNA t¸i tæ hîp (H4.11) 2.1.4.Plasmid Nh÷ng n¨m ®Çu cña nh÷ng n¨m 1970, Paul Berg vµ céng t¸c t¹i Trêng §¹i häc Stanford ®· kh¶o s¸t kh¶ n¨ng sö dông çc enym giíi h¹n ®Ó lµm thay ®æi cÊu tróc cña DNA. Nhãm nghiªn cøu cña Berg ®· ph©n lËp ®îc NST cña E.Coli vµ c¾t nhá ph©n tö DNA b»ng enzym giíi h¹n . Tuy nhiªn , DNA cã çc ®u«i ®¬n gi¶n nªn rÊt khã g¾n vµo çc DNA ngo¹i lai ch¼ng h¹n nh virut (còng t¬ng tù nh viÖc g¾n mét viªn g¹ch vµo cuèi mét bøc têng) . MÆc dÇu v©þ, nguêi ta ®· th¾ng lîi trong viÖc t¹o ra ph©n tö DNA t¸i tæ hîp ®Çu tiªn. Sau ®ã Berg ®· ®îc chia gi¶i Nobel ho¸ häc n¨m 1980 do nh÷ng cèng hiÕn cña m×nh . Còng vµo thêi ®iÓm ®ã cã 2 sù kiÖn ®· x¶y ra lµm mét cuéc çch m¹ng trong c«ng nghÖ DNA . Sù kiÖn thø nhÊt lµ Herbert Boyer t¸ch chiÕt ®îc enzym gÝ¬i h¹n EcoRI c¾t bá çc ®u«i nh kiÓu th¸o çc lç méng . Sù kiÖn thø hai x¶y ra ë Labo Stanley Cohen thuéc Trêng §¹i häc Stanford . Cohen ®· thu thËp ®îc çc d÷ liÖu trªn çc vßng DNA nhá bÐ thÊy ë tÕ bµo chÊt cña vi khuÈn (kh«ng thÊy ë çc sinh vËt cã cÊu tróc phøc t¹p) . Çc vßng DNA ®ã chÝnh lµ Plasmid . Plasmid n»m ngoµi NST vi khuÈn vµ chøc n¨ng cña nã cha ®îc hiÓu râ ®Çy ®ñ . Plasmid chøa Ýt th× mét t¸ mµ nhiÒu th× hµng hµng tr¨m gen (vi khuÈn cã kho¶ng vµi ngµn gen trong NST) nã chiÕm kho¶ng 20% th«ng tin di truyÒn cña c¬ thÓ . Mét ®iÒu râ rµng lµ plasmid kh«ng cÇn thiÕt cho sù sinh trëng cña vi khuÈn vµ khi lo¹i bá nã ®i th× còng ch¼ng g©y h¹i g× cho vi khuÈn .

H×nh 2.10. Ho¹t tÝnh cña DNA Ligaza . DNA Ligaza g¾n çc ®o¹n DNA víi nhau b»ng çch liªn kÕt gèc phot phat ë vÞ trÝ 5 cña ®o¹n nµy víi vÞ trÝ 3 cña ph©n tö Deoxyriboza tiÕp theo. §ã chÝnh lµ liªn kÕt photphodieste. Liªn kÕt nµy ch¾c h¬n liªn kÕt Hydro , nã h×nh thµnh gi÷a çc nucleotit ®èi dÊu . N¨m 1972, Cohen thiÕt lËp ®îc mét plasmid míi tõ mét plasmid cã tõ tríc ë E.Coli. Plasmid míi nµy cã 3 ®Æc tÝnh quan träng : 1.Nã cã mét vÞ trÝ nhËn d¹ng ®¬n lÎ ë chç EcoRI ph©n c¾t , v× thÕ mµ x¸c ®Þnh ®îc n¬i mµ plasmid sÏ më ra . 2.Cã mét tr×nh tù nucleotit gäi lµ ®iÓm gèc sao chÐp (origin of replication) , tr×nh tù Êy thóc ®Èy sù sao chÐp cña plasmid trong c¬ thÓ tóc chñ . 3.Chøa mét gen kh¸ng tetraxyclin . V× vËy çc vi khuÈn chøa plasmid nµy th× kh¸ng l¹i tetraxyclin , cßn nh÷ng vi khuÈn kh¸c kh«ng cã plasmid ®ã sÏ chÕt khi cã mÆt tetraxyclin .Cohen ®Æt tªn plasmid ®ã lµ pSC101 (“SC”tøc lµ Stankey Cohen). Mét ®Æc trng quan träng kh¸c cña plasmid Cohen lµ dÔ dµng cµi vµo tÕ bµo tóc chñ .

Cohen ®· ph¸t hiÖn ra r»ng cã thÓ cµi çc plasmid vµo çc vi khuÈn míi b»ngo çch treo nã trong dung dÞch Canxi clorua , sau ®ã l¹i nhanh chãng lµm nãng vi khuÈn tíi 42 C . Víi çch xö lý nh vËy th× v¸ch vµ mµng sinh chÊt cña vi khuÈn sÏ më ra , cho phÐp plasmid ®i qua ®Ó vµo tÕ bµo chÊt cña vi khuÈn . Khi ë bªn trong vi khuÈn th× mét plasmid ®¬n tù nã nh©n lªn ®Ó t¹o nªn hµng t¸ plasmid míi . NÕu plasmid chøa mét gen ngo¹i lai th× gen nµy ®îc sao chÐp cïng víi nh÷ng phÇn cßn l¹i cña ph©n tö . V× çc vi khuÈn cã chøa çc plasmid còng ®îc nh©n lªn – thêng cø 20 phót mét lÇn vµ mçi mét vi khuÈn míi l¹i cã vµi plasmid míi . DÜ nhiªn lµ tríc ®ã vi khuÈn ®· s¶n sinh hµng triÖu thÕ hÖ con ch¸u råi . Mét quÇn thÓ nh thÕ xuÊt ph¸t tõ mét tÕ bµo cha mÑ ®îc gäi lµ mét dßng (clone). TÊt c¶ çc tÕ bµo trong cïng mét dßng ®Òu cã çc plasmid ®ång nhÊt . Còng t¬ng tù nh vËy, hiÖn nay cã hµng triÖu b¶n sao cña cïng mét gen ngo¹i lai. V× thÕ gen còng ph¶i t¸ch dßng . Kh«ng ph¶i tëng tîng nhiÒu còng hiÓu ®îc r»ng plasmid lµ çc vËt mang hay lµ çc vec t¬ ®èi víi gen ngêi trong çc thÝ nghiÖm c«ng nghÖ DNA. Giai ®o¹n hiÖn t¹i lµ tËp hîp çc thÝ nghiÖm DNA t¸i tæ hîp ®· lµm thay ®æi tiÕn tr×nh lÞch sö Ho¸ sinh . 2.2. çc thÝ nghiÖm vÒ DNA t¸i tæ hîp Theo mét sè sö gia th× nguyªn lý cña c«ng nghÖ DNA gièng nh chiÕc b¸nh sanwich ë bê biÓn Waikiki .N¨m 1972, x¶y ra sù kiÖn nh sau : khi Herbert Boyer ph¸t biÓu trong mét héi nghÞ

khoa häc ë Hawai vÒ enzym giíi h¹n EcoRI th× Stanley Cohen còng tham gia héi nghÞ nhng víi c¬ng vÞ lµ thÝnh gi¶ . Sau khi kÕt thóc diÔn thuyªt Cohen mêi Boyer ¨n tra vµ béc b¹ch r»ng hä cã thÓ céng t¸c víi nhau trong hµng lo¹t çc thÝ nghiÖm . Sau ®ã 2 nhµ nghiªn cøu ®· ngåi l¹i víi nhau vµ xem xÐt çc thÝ nghiÖm ®Ó ®a cång nghÖ DNA vµo mét kû nguyªn míi . Cohen chØ ®¹o thµnh c«ng çc thÝ nghiÖm víi plasmid , nhng «ng l¹i gÆp khã kh¨n khi c¾t më réng çc plasmid vµ enzym EcoRI cña Boyer dêng nh lµ mét gi¶i ph¸p lý tëng v× thÕ Cohen ngá ý cïng hîp t¸c nghiªn cøu . Hä dïng plasmid cña Cohen vµ enzym cña Boyer ®Ó thùc hiÖn t¸i tæ hîp DNA plasmid . Tríc tiªn, hä sÏ tiÕn hµnh tæ hîp 2 plasmid ®Ó t¹o nªn mét plasmid ®¬n.NÕu thµnh c«ng hä sÏ ®a DNA ngo¹i lai vµo plasmid ®Ó t¹o nªn mét ph©n tö DNA t¸i tæ hîp . Boyer ®ång ý vµ b¾t ®Çu vµo c«ng viÖc . Çc thÝ nghiÖm cña Boyer vµ Cohen ®îc tiÕn hµnh vµo n¨m 1973, sau 20 n¨m Watson vµ Crick c«ng bè trªn b¸o vÒ lÞch sö cÊu tróc DNA . Plasmid mµ Boyer vµ Cohen sö dông lµ pSC101 (H×nh 2.11.).

H×nh 2.11. ¶nh hiÓn vi ®iÖn tö cña Plasmid vi khuÈn . Lu û r»ng DNA ë d¹ng vßng khÐp kÝn . Mét sè vßng l¹i níi láng , trong khi ®ã cã çc vßng l¹i so¾n chÆt . Trong çc thÝ nghiÖm ®Çu tiªn, Boyer vµ Cohen ®· tæ hîp thµnh c«ng pSC101 víi pSC102 vµ t¸ch dßng víi çc tÕ bµo E.Coli. Çch tiÕp cËn cña hä thËt lµ thó vÞ . Plasmid pSC101 cã mét gen kh¸ng chÊt kh¸ng sinh kanamyxin . Khi çc plasmid t¸i tæ hîp ®· hîp nhÊt ®îc víi vi khuÈn th× vi khuÈn nµy béc lé kh¶ n¨ng di truyÒn míi tøc lµ h¹n chÕ ®îc t¸c dông cña c¶ tetraxyclin vµ kanamyxin. Råi tíi l« thÝ nghiÖm thø hai víi DNA ngo¹i lai (H×nh 2.12)

H×nh 2.12. Çc thÝ nghiÖm cña Boyer-Cohen n¨m 1973 .(a) Plasmid pSC101 ®îc më ra b»ng enzymr giíi h¹n EcoRI ë ®iÓm chØ mòi tªn .Plasmid cã chøa gen kh¸ng tetracyclin ®îc m« h×nh lµ tet .(b)DNA tõ cãc Xenopus Laevi còng ®îc xö lý víi EcoRI vµ ®· thu ®îc çc ®o¹n DNA ngo¹i lai .Lu ý r»ng EcoRI t¸c ®éng ë nh÷ng vÞ trÝ nhËn d¹ng gièng nhau ë vec t¬ Plasmid vµ ë DNA cho .(c)Çc ®o¹n DNA cho g¾n víi plasmid ®· më vµ x¶y ra sù bæ cøu çc baz¬ . (d) Khi thªm DNA Ligaza , plasmid sÏ ®ãng l¹i vµ h×nh thµnh ph©n tö DNA t¸i tæ hîp. (e) Plasmid ®îc ®a vµo çc tÕ bµo E.Coli nhËy c¶m víi tetracyclin (tets) b»ng çch xö lý tÕ bµo víi hîp chÊt can xi . Çc tÕ bµo E.Coli ®· biÕn n¹p . Çc plasmid sÏ nh©n lªn trong tÕ bµo vµ m· cho çc protein chuyªn ho¸ bëi DNA cña cãc .(f) Khi vi khuÈn ®îc nu«i cÊy trong m«i Trêng cã tetracyclin th× çc tÕ bµo cã chøa plasmid t¸i tæ hîp sÏ ph¸t triÓn vµ t¹o çc khuÈn l¹c . §iÒu ®ã x¶y ra bëi v× nã cã gen kh¸ng l¹i tetracyclin .Vi khuÈn cã chøa plasmid b×nh thêng kh«ng cã gen kh¸ng tetracyclin sÏ kh«ng t¹o ®ù¬c khuÈn l¹c trong m«i trêng . Boyer vµ Cohen thu thËp mét gen tõ çc tÕ bµo cãc Ch©u Phi Xenopus Laevis .Gen nµy m· ho¸ cho mét ®o¹n protein dïng ®Ó tæng hîp RNA riboxom . Hä sö dông EcoRI ®Ó c¾t DNA cña cãc , sau ®ã còng dïng enzym nµy ®Ó më plasmid pSC101. Së dÜ dïng EcoRI cho c¶ hai bëi v× çc ®u«i cña chóng ®Òu t¬ng tù nhau. Çc ®o¹n DNA cña cãc ®îc trén víi DNA plasmid vµ sù cÆp ®«i gi÷a çc baz¬ bæ cøu x¶y ra trªn c¶ 2 ®o¹n DNA . Thªm DNA ligaza vµo th× çc plasmid ®îc t¸i sinh tuÇn hoµn trõ trêng hîp b©y giê plasmid l¹i chøa çc DNA ®· ®îc cµi vµo tõ cãc .Çc nhµ nghiªn cøu gäi plasmid t¸i tæ hîp nµy lµ Chimera. TiÕp theo , ngêi ta xem xÐt kh¶ n¨ng m· ho¸ protein cña çc DNA ngo¹i lai . B»ng çch sö dông çc kü thuËt tiªu chuÈn Cohen ®· ®a plasmid vµo trong çc tÕ bµo E.Coli vµ ®Æt vi khuÈn vµo m«i trêng ®Ó ph¸t triÓn .Vi khuÈn vµ plasmid t¸i tæ hîp cña chóng ®îc sao chÐp tõng phót vµ tríc ®ã çc tÕ bµo E.Coli ®· t¹o ra thªm mét protein cho RNA riboxom mµ th«ng thêng protein nµy chØ ®îc t¹o nªn tõ çc tÕ bµo cña cãc .ë ®©y E.Coli ®· tæng hîp nªn protein cña nã vµ tæng hîp thªm c¶ protein cña c¬ thÓ kh¸c (X .laevis) . Çc ph¬ng tiÖn truyÒn th«ng quèc gia ®· cæ ®éng cho nh÷ng thµnh c«ng cña Boyer vµ Cohen.Thùc chÊt hai nhµ khoa häc nµy ®· ph¸ vì hµng rµo ng¨n çch gi÷a çc mÉu sinh häc t¸ch biÖt vµ më ra mét kû nguyªn míi hiÖn ®¹i cña cång nghÖ DNA . V× vËy mét quan s¸t 21

viªn ®· ghi chó nh sau C«ng nghÖ sinh häc tríc Cohen ( BBC Before Boyer-Cohen) vµ nay lµ sau Cohen ( ABC tøc lµ After Boyer-Cohen) Çc nhµ sinh häc ®· nhanh chãng xem xÐt çc mèi liªn quan cña c«ng nghÖ DNA t¸i tæ hîp vµ khÈn tr¬ng tiÕn hµnh çc thÝ nghiÖm thao t¸c gen .Vµ chØ trong mÊy tuÇn çc nhµ khoa häc ®· ph¸t hiÖn ra sù chuyÓn gen vµ cè g¾ng vît qua çc ph©n çch vÒ mÉu .Trong mét thÝ nghiÖm ngêi ta ®· chuyÓn gen cña Staphylococcus Aureus cho E.Coli. Çc nhµ khoa häc kh¸c l¹i cã ý ®Þnh ph©n lËp çc gen ngêi vµ ®a vµo plasmid cña vi khuÈn . Cßn sè kh¸c th× ®i s©u vµo çc mèi liªn quan chÆt chÏ gi÷a çc thÝ nghiÖm trong c«ng nghÖ DNA . Ch¼ng h¹n nh ngêi ta suy luËn r»ng çc gen cã thÓ ®îc ®a vµo çc tÕ bµo sèng ®Ó gi¶i to¶ sù thiÕu hôt di truyÒn còng nh cã thÓ t¹o ®îc mét lîng lín protein dîc phÈm hiÕm . Ngêi ta íc väng cã ®îc nh÷ng nguån n¨ng lîng sinh häc rÎ tiÒn hay trÎ em sinh ra kh«ng bÞ khuyÕt tËt. Dêng nh kh«ng cã giíi h¹n trong nÒn c«ng nghÖ míi nµy . VÒ ph¬ng diÖn kü thuËt Trong Gen trÞ liÖu ngêi ta sö dông 2 ph¬ng ph¸p chuyÓn gen : Ph¬ng ph¸p chuyÓn gen ngoµi c¬ thÓ (ex vivo ) vµ ph¬ng ph¸p chuyÓn gen trùc tiÕp vµo c¬ thÓ (in vivo) . Mét sè kü thuËt thêng dïng trong gen trÞ liÖu lµ : Kü thuËt vi tiªm , Kü thuËt ®iÖn xung , kü thuËt b¾n gen , kü thuËt liposom , kü thuËt viªn gen v.v.. Nh÷ng vÊn ®Ò nµy chóng ta sÏ bµn luËn sau . 2.3.Nh÷ng bµn c i vÒ tÝnh an toµn trong gen trÞ liÖu. MÆc dï sèt s¾ng víi c«ng nghÖ DNA nhng nhiÒu nhµ khoa häc ®· c¶nh b¸o vÒ nh÷ng hËu qu¶ nguy hiÓm cña c«ng nghÖ nµy ®· gîi ý cÇn ph¶i thËn träng h¬n víi çc xu híng nghiªn cøu . Ch¼ng h¹n nh ®· cã sù b¸o ®éng khi nhãm nghiªn cøu cña Paul Berg dù ®Þnh ®a mét gen tõ virut g©y ung th vµo E.Coli.Çc ®ång nghiÖp cña «ng ®· v¹ch ra rµnh m¹ch r»ng çc tÕ bµo E.Coli t¸i tæ hîp tõ phßng thÝ nghiÖm khi ®· vµo c¬ thÓ ngêi (ë ®ã chóng vÉn sèng mét çch b×nh thêng) th× nã sÏ biÓu lé çc gen ung th . Berg ®· ph¶i xem xÐt nh÷ng lêi ph¶n ®èi ®ã vµ ®· huû bá thÝ nghiÖm nµy . Nhng nh÷ng vÊn ®Ò vÒ tÝnh an toµn vÉn lu«n ®îc ®Æt ra . ChØ míi gÇn ®©y th«i çc nhµ sinh häc ph©n tö l¹i b¾t ®Çu th¶o luËn vÒ çc vÊn ®Ò liªn quan ®Õn c«ng nghÖ DNA trong mét héi nghÞ ®îc tæ chøc díi sù b¶o trî cña viÖn hµn l©m khoa häc quèc gia .Tíi n¨m 1974 , mét sù kiÖn cha hÒ thÊy ®· x¶y ra , ®ã lµ mét bøc th cã c¶ ch÷ ký cña Paul Berg vµ 9 nhµ khoa häc kh¸c xuÊt hiÖn ®ång thêi trªn 3 t¹p chÝ khoa häc uy tÝn nhÊt ThÕ giíi viÕt b»ng tiÕng Anh ®ã lµ Science, Nature vµ Proceedings of the National Academy of Science. Bøc th ®· chØ râ çc nguy h¹i tiÒm tµng cña c«ng nghÖ DNA t¸i tæ hîp . Bøc th cã ®o¹n viÕt: Nh÷ng tiÕn bé míi ®©y trong kü thuËt ph©n lËp vµ ghÐp nèi çc ®o¹n DNA tíi nay ®· cho phÐp kiÕn t¹o çc ph©n tö DNA cã ho¹t tÝnh sinh häc in vitro. MÆc dï nh÷ng thÝ nghiÖm nµy cã vÎ t¹o thuËn lîi cho çc gi¶i ph¸p vÒ çc vÊn ®Ò thùc tiÔn vµ lý thuyÕt quan träng trong sinh häc nhng viÖc t¹o nªn çc d¹ng DNA míi mµ b¶n chÊt sinh häc cña çc phÇn tö cña chóng kh«ng thÓ dù ®o¸n ®îc mét çch ®Çy ®ñ Cã mét vÊn ®Ò liªn quan rÊt nghiªm tóc lµ mét sè trong çc ph©n tö DNA nµy cã thÓ ®îc chøng minh lµ cã nguy h¹i vÒ mÆt sinh häc

H×nh 2.13. C«ng nghÖ DNA víi viÖc t¸ch dßng gen ngêi vµ çc s¶n phÈm protein s¶n xuÊt víi sè lîng lín ®îc m· ho¸ bëi gen nµy. Bøc th tiÕp tôc hái ý kiÕn çc nhµ sinh häc ph©n tö trªn toµn ThÕ giíi liÖu cã “tù nguyÖn tr× ho·n”mét sè thÝ nghiÖm vÒ DNA cho tíi khi cã mét héi nghÞ quèc tÕ nhãm häp ®Ó th¶o thuËn vÒ çc nguy h¹i cã thÓ vµ çc biÖn ph¸p b¶o vÖ cÇn thiÕt hay kh«ng? Çc nhµ khoa häc còng nh¾c nhë cÇn ph¶i thËn träng víi çc thÝ nghiÖm cã liªn quan tíi viÖc ®a mét gen kh¸ng chÊt kh¸ng sinh vµo plasmid vµ g¾n mét gen ung th vµo bÊt kú mét ph©n tö chÊt mang DNA nµo . §©y lµ lÇn ®Çu tiªn çc nhµ khoa häc thuéc nhiÒu lÜnh vùc kh¸c nhau ®ßi h¹n chÕ çc nghiªn cøu mÆc dï ch¼ng cã b»ng chøng nµo chøng minh nã lµ nguy hiÓm . MÆc dï qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp kh«ng vi ph¹m luËt ph¸p , nhng çc nhµ khoa häc toµn ThÕ giíi vÉn ph¶i ®¨ng ký çc dù ®Þnh trong çc thÝ nghiÖm khoa häc cña m×nh.Th¸ng 2-1975 , mét nhãm gåm 139 nhµ nghiªn cøu tõ 17 quèc gia ®· häp mÆt trong 4 ngµy ë Asilomar , mét trung t©m vÒ héi nghÞ ë Pacific Grove , California nh»m ®a ra nh÷ng híng dÉn vµ çc khuyÕn ço cho viÖc chØ ®¹o çc thÝ nghiÖm trong c«ng nghÖ DNA . Mét trong sè nh÷ng ®iÒu tríc tiªn nh÷ng cö to¹ ph¶i lµm lµ cam ®oan víi c«ng chóng r»ng vi khuÈn dïng cho çc thÝ nghiÖm DNA tÊi tæ hîp lµ nh÷ng nßi ®Æc biÖt vµ “®· gi¶i trõ qu©n bÞ” nªn chóng kh«ng cßn tån t¹i ngoµi phßng thÝ nghiÖm . Çc nhµ khoa häc còng vËt lén víi t×nh tr¹ng khã xö nhÊt ®ã lµ thiÕu çc b»ng chøng ®Ó hoÆc ñng hé hoÆc ph¶n ®èi vÒ b¶n chÊt g©y nguy h¹i cña çc c«ng tr×nh vÒ DNA . Cuèi cïng , çc nhµ nghiªn cøu ®· chän biÖn ph¸p nh¾c nhë vµ ho¹ch ®Þnh chÝnh s¸ch cho çc c«ng tr×nh cña hä . Çc thÝ nghiÖm DNA t¸i tæ hîp ph¶i lu«n xem xÐt tíi çc rñi ro ë çc møc ®é thÊp, trung b×nh vµ cao vµ quyÕt ®Þnh r»ng bÊt kú mét thÝ nghiÖm nµo mµ cã rñi ro (nh Berg

®· nªu) ®Òu ph¶i ®îc chØ ®¹o mét çch chÆt chÏ cho tíi khi cã mét ph¬ng ph¸p tèt h¬n . ChiÕn lîc nµy bao hµm c¶ trong lÜnh vùc vËt lý còng nh sinh häc vµ u tiªn nhiÒu cho viÖc ph¸t triÓn çc chñng vi khuÈn kh«ng cã kh¶ n¨ng sèng ë bªn ngoµi phßng thÝ nghiÖm . KhuyÕn ço Asilomar dÉn tíi viÖc h×nh thµnh mét Uû ban cè vÊn vÒ DNA t¸i tæ hîp t¹i viÖn søc khoÎ quèc gia Hoa kú(NIH). Uû ban nµy sÏ ®a ra çc híng dÉn ®Çy ®ñ song song víi çc khuyÕn ço Asilomar.N¨m th¸ng tr«i qua , mäi ®iÒu ®· ®îc s¸ng tá tríc c«ng chóng lµ çc nhµ nghiªn cøu vÒ DNA kh«ng xa rêi çc ®¹o luËt x· héi. 2.4.T¬ng lai cña c«ng nghÖ DNA t¸i tæ hîp Nh÷ng thÝ nghiÖm ®îc thùc hiÖn n¨m 1972 vµ nh÷ng n¨m sau ®ã ®· t¸c ®éng s©u s¾c tíi çch suy nghÜ cña çc nhµ di truyÒn häc . Tríc nh÷ng thµnh c«ng vÒ çc thÝ nghiÖm t¸ch gen , çc nhµ di truyÒn häc suy luËn qua çc nghiªn cøu cña m×nh r»ng tÊt c¶ nh÷ng ®iÒu mµ hä hiÓu vÒ ®Æc ®iÓm vµ sù biÓu hiÖn cña gen cho tíi giê hä ®Òu cã thÓ thao t¸c ®îc . C«ng nghÖ DNA cho phÐp çc nhµ di truyÒn häc hiÓu ®îc cÊu tróc , chøc n¨ng còng nh sù ®iÒu hoµ gen vµ b¾t ®Çu ®i s©u vµo di truyÒn Ho¸ sinh çc bÖnh l·o khoa . §i ®«i víi nh÷ng th¾ng lîi trong c«ng nghÖ DNA th× ®ång thêi còng xuÊt hiÖn thªm çc nguyªn lý cña c«ng nghÖ sinh häc . C«ng nghÖ sinh häc lµ mét nÒn c«ng nghiÖp réng lín vµ hoµn toµn míi trong ®ã sinh häc ph©n tö cã thÓ tham gia gi¶i quyÕt çc vÊn ®Ò vÒ « nhiÔm, çc chÒ phÈm thùc phÈm , n¨ng lîng vµ sù tæng hîp çc lo¹i dîc phÈm míi . Çc nhµ Ho¸ sinh sím ®Ó ý tíi vi khuÈn , coi ®ã lµ çc nhµ m¸y ho¸ häc t¬ng lai vµ suy luËn r»ng cã thÓ lËp ch¬ng tr×nh cho DNA ®Ó tæng hîp mét sè lîng kh«ng h¹n chÕ çc chÊt cã ý nghÜa ®èi víi c«ng nghiÖp , kinh tÕ vµ y häc. Sau nh÷ng n¨m 1970, mét sè høa hÑn ®· thµnh hiÖn thùc, nhiÒu nhµ m¸y ®· b¾t ®Çu ¸p dông kü thuËt DNA ®Ó s¶n xuÊt nhiÒu s¶n phÈm h÷u Ých. Ch¼ng h¹n nh n¨m 1980, mét c«ng ty ®· thu ®îc insulin tõ vi khuÈn t¸i tæ hîp víi nh÷ng gen cña çc tÕ bµo tuþ ngêi . Mét c«ng ty kh¸c còng ®· sö dông çc tÕ bµo vi khuÈn ®Ó t¹o ra interferon –mét chÊt øc chÕ virut mµ th«ng thêng chØ ®îc t¹o ra tõ çc tÕ bµo cña ngêi . NhiÒu c«ng ty kh¸c còng ®· t¸i tæ hîp DNA trong vi khuÈn ®Ó cho vi khuÈn nµy cã thÓ t¹o nªn çc chÊt nh hormon sinh trëng cña ngêi , hay mét vacxin cho mét bÖnh nµo ®ã cña ®éng vËt hoÆc çc enzym hoµ tan trong dÇu Trong nh÷ng n¨m 1980, nhiªu s¶n phÈm kh¸c cña c«ng nghÖ DNA ®îc dù b¸o lµ hiÖn thùc hoÆc lµ cã kh¶ n¨ng trë thµnh hiÖn thùc . Çc vi khuÈn t¸i tæ hîp ®îc dïng trong viÖc lo¹i th¶i çc chÊt ®éc h¹i , hoµ tan çc chÊt khã tan trong níc nh tãc ch¼ng h¹n . Vi khuÈn t¸i tæ hîp ®· tæng hîp ®îc çc enzym hoµ tan côc m¸u ®«ng cña ngêi lµ Urokinaza vµ hormon cña thËn lµ erythropoietin . Hµng tr¨m c«ng ty trªn ThÕ giíi ®· øng dông c«ng nghÖ DNA trong c«ng nghiÖp . NhiÒu nhµ khoa häc ®· ph¸t biÓu mét çch l¹c quan vÒ mét t¬ng lai trong ®ã sù thô tinh sÏ lµ lçi thêi , thùc vËt cã thÓ sö dông çc ®éc tè vi khuÈn ®Ó xua ®uæi c«n trïng vµ hoa mµu cã thÓ ®îc trång cÊy mµ kh«ng bÞ ph¸ h¹i cña s¬ng gi¸ . Tíi nh÷ng n¨m 1990, çc nhµ nghiªn cøu ®· ®i qu¸ xa so víi viÖc cµi mét DNA ngo¹i lai vµo çc tÕ bµo vi khuÈn vµ c«ng nghÖ DNA ®· ph¸t triÓn trong rÊt nhiÒu lÜnh vùc . Ch¼ng h¹n nh in dÊu v©n DNA lµ mét d¹ng míi cña ph¸p y ®· ®îc çc hÖ thèng ph¸p luËt chÊp thuËn . Trong gen trÞ liÖu con ngêi ®· ®îc truyÒn vµo çc gen ngo¹i lai ®Ó ch÷a çc bÖnh .Hay ®éng vËt biÕn ®æi gen cã ®îc hÖ thèng miÔn dÞch cña ngêi .Råi dù ¸n t×m hiÓu tr×nh tù Baz¬ çc gen ®¬n cña ngêi H¬n bÊt kú mét kü thuËt nµo kh¸c , c«ng nghÖ DNA sÏ cho nh©n lo¹i c¬ héi lµm chñ ®îc nh÷ng ph©n tö ®· t¹o nªn chÝnh hä. CÊc nhµ khoa häc thÝch thó khi con ngêi cµng hiÓu râ h¬n n÷a vÒ c¬ thÓ m×nh còng nh çc ®éng t¸c nh bß, b¬i léi , ch¹y nh¶y hay bay lîn v.v.. Khã thÊy nh÷ng vÊn ®Ò vÒ sù tån t¹i cña con ngêi mµ l¹i kh«ng ®ông tíi c«ng nghÖ DNA còng nh çc vÊn ®Ò chÝnh trÞ næi lªn ®ßi hái ph¶i cã çc gi¶i ph¸p cã tÝnh toµn cÇu.Ch¼ng h¹n nh liÖu c«ng nghÖ DNA cã cho phÐp ®Ó gen can thiÖp vµo viÖc “c¶i biÕn gièng nßi” hay kh«ng? Hay çc vÊn ®Ò thuéc ®¹o ®øc , nh÷ng b¨n kho¨n vÒ tinh thÇn sÏ cßn cßn tõng bíc n¶y sinh trªn con ®êng ®i tíi cña DØ truyÒn häc . Nhng cã mét ®iÒu mµ ai còng ph¶i thõa nhËn lµ c«ng nghÖ DNA ®· ®i vµo cuéc sèng con ngêi vµ trë thµnh mét trong nh÷ng øng dông cã tÝnh thuyÕt phôc nhÊt . 2.5.Nh÷ng tiÕn bé ®¸ng kÓ trong gtl hiÖn nay : *Nhãm nghiªn cøu Trßng §¹i häc California , Los Angeles sö dông Liposome ®îc bao polyme Polyethylen glycol (PEG) ®Ó ®a vµo n·o . ViÖc chuyÓn gen vµo çc tÕ bµo n·o lµ mét thµnh c«ng rÊt cã ý nghÜa bëi v× çc vec t¬ virut lµ qu¸ lín ®· vît qua ®îc hµng rµo gi÷a n·o vµ m¸u . Thµnh c«ng nµy ®· t¹o tiÒm n¨ng cho viÖc trÞ çc bÖnh Parkinson .(20/3/2003 New Scientist .Com –March 20, 2003 ). *Sù can thiÖp cña RNA hay çc gen lÆn cã thÓ lµ mét ph¬ng ph¸p míi ®Ó ®iÒu trÞ bÖnh Huntington. ( New Scientist . Com –March 13, 2003). 24

*Phong ph¸p TLG theo çch söa ch÷a nh÷ng sai sãt trong RNA th«ng tin cña çc gen khiÕm khuyÕt . Kü thuËt nµy lµ tiÒm n¨ng ®iÒu trÞ çc bÖnh vÒ m¸u nh bÖnh thiÕu m¸u vïng biÓn , bÖnh x¬ nang ( mét bÖnh di truyÒn t¸c ®éng tíi çc tuyÕn ngo¹i tiÕt ) vµ mét sè bÖnh ung th . ( New Scientist ,Com –october 11, 2002.) *TLG dïng trong ®iÒu trÞ bÖnh X-SCID . Tuy nhiªn , viÖc nµy ®· dõng l¹i khi mét bÖnh nh©n ë Ph¸p bÞ m¾c bÖnh b¹ch cÇu (Leukemia) . (New Scientist .Com – October 3, 2003). *Çc nhµ nghiªn cøu ë Trêng §H Case Western vµ Copernicus Therapeutics cã thÓ t¹o ®îc çc liposome nhá tíi 25 nanomet , nã cã thÓ mang DNA trÞ liÖu qua çc lç ë nh©n tÕ bµo (New Scientist . Com – May 12, 2002) *Çc tÕ bµo h×nh lìi liÒm ®· ®iÒu trÞ thµnh c«ng trªn chuét ( The Science –March 18, 2002).

Ch¬ng III Çc ph¬ng ph¸p cña c«ng nghÖ DNA 3.1.Thu thËp gen Çc tÕ bµo cña c¬ thÓ sèng bao gåm hµng ngh×n gen hoÆc nhiÒu h¬n n÷a.C¬ thÓ chóng ta cã tíi 100.000 gen trong bé gen (genome ).NÕu chØ cÇn nghiªn cøu mét gen ®¬n th× nhiÖm vô cña nhµ Ho¸ sinh còng rÊt lín bëi v× mét gen còng ®· cã tíi hµng ngh×n milimet chiÒu dµi DNA . Tuy nhiªn, c«ng viÖc nµy trë nªn thËt ®¬n gi¶n nhê sö dông mét enzym c¾t giíi h¹n(restriction enzyme) , çc enzyme nµy cã thÓ c¾t çc ph©n tö DNA ë çc vÞ trÝ ®Æc hiÖu , ®iÒu ®ã cho phÐp çc nhµ sinh Ho¸ t¸ch riªng ®îc çc ®o¹n DNA.ViÖc sö dông nhiÒu enzym giíi h¹n ®· lµm t¨ng kh¶ n¨ng nghiªn cøu çc gen n»m trªn nh÷ng ®o¹n DNA nµy . Tuy nhiªn nhê sö dông çc ph©n tö RNA th«ng tin (mRNA) nªn còng kh«ng cÇn thiÕt ph¶i t×m b»ng ®îc mét gen ®Æc hiÖu trong çc ®o¹n DNA . Nh ta biÕt , biÓu hiÖn gen th«ng qua sù tæng hîp protein trong tÕ bµo liªn quan tíi sù m· ho¸ cña çc ph©n tö mRNA . Khi ta muèn t¸ch mét gen tæng hîp protein X th× ta ph¶i t×m kiÕm çc tÕ bµo ho¹t ho¸ t¹o nªn protein X ®Ó t¸ch ra çc ph©n tö mRNA tõ tÕ bµo chÊt cña tÕ bµo .Khi ®· x¸c ®Þnh ®îc chÝnh x¸c çc tÕ bµo cÇn nghiªn cøu , lóc nµy ta ph¸ vì tÕ bµo , çc thµnh phÇn cña tÕ bµo ®îc xö lý b»ng hµng lo¹t çc ph¬ng ph¸p lý ho¸ häc vµ thu ®îc çc chÊt nh protein, çc chÊt bÐo, carbohydrat vµ acid nucleic . Çc ph©n tö mRNA ®îc thu thËp nhê lîi thÕ cña çc ®u«i poly-A (poly –A tails), phÇn RNA cã tíi 150-200 nucleotit chøa adenin (v× thÕ míi cã tªn lµ poly A) . PhÇn lín mRNA ®Òu g¾n víi çc h¹t xenluloza mµ trªn bÒ mÆt cña chóng cã nhiÒu m¶nh acid nucleic chøa thimin “poly –T”. Çc m¶nh vì cßn l¹i sÏ ®îc röa ®Ó lo¹i ®i . Vµ b©y giê cã thÓ thu thËp çc ph©n tö mRNA tõ çc h¹t xenluloza ®Ó cã ®îc mRNA c« ®Æc . Sau khi ®· cã ®îc mRNA tinh khiÕt th× nh÷ng th«ng tin Ho¸ sinh mµ nã chøa ®ùng cã thÓ chuyÓn ngîc l¹i trong DNA . §Ó thùc hiÖn ®îc bíc nµy , çc tr×nh tù cña çc baz¬ ni t¬ trong mRNA ®îc sö dông nh mét çi khu«n ®Ó tæng hîp çc tr×nh tù baz¬ bæ cøu trong DNA . Mét enzym gäi lµ Enzym phiªn m· ngîc (Reverse transcriptase) gióp cho viÖc tæng hîp nµy . Chóng ta nhí l¹i r»ng vµo nh÷ng n¨m 1970 Howard Temin vµ David Baltimore ®· ph¸t hiÖn ra vÒ enzym phiªn m· ngîc , ngêi ta sö dông RNA nh mét çi khu«n ®Ó tæng hîp mét ph©n tö DNA bæ cøu . Khi sö dông enzym phiªn m· ngîc ®Ó t¹o nªn çc ph©n tö DNA th× ®ßi hái ph¶i cã mét chÊt måi (Primer)-hay lµ cÇn sù cã mÆt cña çc tr×nh tù nucleotit khëi ®Çu .

ChÊt måi nµy bao gåm çc chuçi nucleotit cña Thimin (polyT), çc chuçi nµy g¾n víi ®u«i poly A cña mRNA vµ ho¹t ®éng nh mét vÞ trÝ khëi ®Çu cho sù tæng hîp DNA. Sau ®ã reverse transcriptase dÞch chuyÓn däc theo çc ph©n tö mRNA m· ho¸ cho mét ph©n tö DNA bæ cøu víi mRNA ( complementary DNA= cDNA) .PhÇn cuèi cDNA cã mét nucleotit vßng xo¾n ng¾n ®îc ®a vµo nhê mét enzym , lý do t¹i sao vÉn cha râ .NÕu chuçi ®¬n cDNA lµ phï hîp víi mong muèn th× vßng xo¾n nucleotit nµy sÏ ®îc lo¹i bá bëi enzym nucleaza vµ cDNA cã thÓ t¸ch khái çc khu«n mRNA ë d¹ng tinh khiÕt.

H×nh 3.1. Ph¬ng ph¸p chung ®Ó t¹o DNA bæ cøu (cDNA) (a) çc tÕ bµo tæng hîp protein nh çc tÕ bµo tuþ ®îc gi÷ cÈn thËn vµ mRNA ®îc t¸ch chiÕt ra tõ nh÷ng tÕ bµo nµy , (b)mRNA ®îc xö lý víi enzym Transcriptaza ngîc . Enzym nµy sö dông nh÷ng m· baz¬ ni t¬ trong RNA ®Ó tæng hîp chuçi bæ cøu cña DNA . cDNA sau ®ã l¹i dïng ®Ó tæng hîp mét chuçi DNA bæ cøu víi chuçi thø nhÊt . §Ó t¹o ®îc mét gen ®Ó lång vµo tÕ bµo , ngêi ta ph¶i t¹o ra çc ph©n tö DNA chuçi kÐp . §Ó hoµn tÊt qu¸ tr×nh nµy , vßng xo¾n nucleotit ph¶i ®îc ®Æt ®óng chç , khi ®ã ph¶i dïng enzym DNA Polymeraza . Enzym nµy sö dông nucleotit vßng nh mét chÊt måi vµ di chuyÓn xuèng ph©n tö DNA . Sö dông ph©n tö nµy nh mét çi khu«n ®Ó tæng hîp ph©n tö DNA bæ cøu . Lóc nµy vßng xo¾n ®îc lo¹i ®i nhê nucleaza vµ kÕt qu¶ lµ ®îc mét ph©n tö cDNA xo¾n kÐp t¬ng tù nh gen m· ho¸ nguyªn gèc ph©n tö mRNA . Tuy nhiªn , ph©n tö cDNA kh«ng cã intron (trong gen nguyªn gèc th× vÉn cã) mµ nã chØ chøa çc exon ( H×nh 3.2)

H×nh 3.2. Sù h×nh thµnh mét ph©n tö cDNA chuçi kÐp (bíc 1)RNA chÝn ®îc ph©n lËp víi ®u«i poly-A trong phßng thÝ nghiÖm . Transcriptaza ngîc vµ Deoxynucleotit ®îc sö dông ®Ó tæng hîp DNA bæ cøu (cDNA) trong ®ã cã ®u«i poly-T bæ cøu .(Bíc 2) ph©n tö RNA ®îc ph©n huû bëi kiÒm , cÆn cDNA cã çc vßng h×nh çi kÑp tãc ë ®Çu 3 .(Bíc3) cDNA võa ®ãng vai trß lµ khu«n võa lµ primer cho sù tæng hîp mét chuçi cDNA bæ cøu .(Bíc4) vßng h×nh cÆp tãc vÉn g¾n víi nh©n ®Ó t¹o mét cDNA chuèi kÐp phï hîp ®Ó cµi vµo mét vec t¬. Çc cDNA chØ cã çc Exon. §Ó cho çc cDNA cã chøc n¨ng trong çc tÕ bµo nhËn , çc ph©n tö nµy ph¶i cã kh¶ n¨ng tù nh©n ®«i. Díi çc ®iÒu kiÖn b×nh thêng , çc ®o¹n DNA ngÉu nhiªn kh«ng t¸i b¶n ®îc trong tÕ bµo sèng .Lý do lµ enzym DNA polymeraza chØ ®îc khëi ®éng nÕu cã mÆt mét tr×nh tù ®Æc biÖt cña çc baz¬ lµ çc gèc sao chÐp ( origin of replication) . Mµ çc origin of replication l¹i ®îc cung cÊp bëi çc DNA chÊt mang (carrier) , n¬i mµ çc cDNA g¾n vµo . Çc chÊt mang (carrier) thêng lµ çc vec t¬. 3.2.Sù lùa chän çc vec t¬. §èi víi çc thÝ nghiÖm c«ng nghÖ DNA th× çc vec t¬ thêng ®îc dïng lµ çc plasmid. Plasmid lµ mét DNA d¹ng vßng khÐp kÝn n»m ngoµi NST . §¸ng quan t©m lµ çc plasmid cña vi khuÈn (H ×nh 3.3.) , cßn víi çc tÕ bµo nh©n chuÈn nh çc tÕ bµo ®éng vËt vµ thùc vËt th× kh«ng cã plasmid .

H×nh 3.3. ¶nh.hiÓn vi ®iÖn tö hiÖn râ plasmid nh lµ mét ph©n tö DNA §iÒu hoµ . Trong h×nh Plasmid lµ nh÷ng vßng nhá .Ph©n tö DNA ®îc ph©n lËp tõ lôc l¹p cña c©y xanh cã cÊu tróc vßng lín ë gi÷a h×nh. Chøc n¨ng cña plasmid cha ®îc hiÓu ®Çy ®ñ . Tuy nhiªn çc nhµ khoa häc x¸c nhËn r»ng plasmid kh«ng cÇn cho sù tån t¹i cña tÕ bµo . Vµo nh÷ng n¨m 1970, çc nhµ khoa häc Stanley Cohen vµ çc céng t¸c ®· ph¸t hiÖn r»ng plasmid cã thÓ ®îc më ra vµ g¾n ®îc vµo çc ®o¹n DNA ®Ó t¹o nªn plasmid t¸i tæ hîp hay cßn gäi lµ chimera . Çc chimera chøa çc origin of replication ®ßi hái bëi DNA polymeraza.Qu¸ tr×nh g¾n thªm mét ®o¹n cDNA vµo plasmid ph¶i sö dông rÊt nhiÒu enzym giíi h¹n . Çc enzym giíi h¹n qóet trªn çc xo¾n kÐp cña plasmid cho tíi khi nhËn ra ®îc tr×nh tù baz¬ ®Æc hiÖu . Sau ®ã plasmid ®îc më ra ë d¹ng ngo»n ngßeo , lo¹i ®i 4 baz¬ trªn mçi sîi ®· bÞ c¾t . 4 baz¬ nµy g¾n láng lÎo víi çc baz¬ bæ cøu trªn ph©n tö cDNA ®· ®îc më .TiÕp theo, enzym ligaza g¾n bé khung ph«t ph¸t , ®êng cña plasmid vµ cDNA. Ngêi ta lÊy DNA ligaza tõ bacteriophage T4 ®Ó t¹o ra liªn kÕt bÒn v÷ng vµ lµm æn ®Þnh chimera ®Ó ®a vµo çc tÕ bµo tiÕp nhËn míi . Plasmid cµng nhá cµng cã lîi cho c«ng nghÖ DNA v× plasmid nhá Ýt bÞ h h¹i h¬n çc plasmid lín khi tr¶i qua qu¸ tr×nh ph©n lËp.H¬n n÷a, mét plasmid nhá cã thÓ g¾n víi tÕ bµo vËt chñ h÷u hiÖu h¬n. Giíi h¹n vÒ kÝch cì plasmid ph¶i tÝnh sao cho çc ph©n tö cDNA kh«ng qu¸ lín cã thÓ ®îc cµi vµo . Theo chøc n¨ng çc gen trªn plasmid ngêi ta chia ra nhiÒu lo¹i plasmid nh plasmid giíi tÝnh (F) , plasmid kh¸ng kh¸ng sinh (R) , plasmid col (cã gen m· ho¸ Colicin)... Plasmid ph¸t hiÖn ®Çu tiªn ë E.Coli cã ký hiÖu lµ ColE1.Tõ çc plasmid tù nhiªn ph©n lËp ®îc ngêi ta ®· t¹o nªn nhiÒu thÕ hÖ plasmid nh©n t¹o kh¸c nhau víi nhiÒu ®Æc ®iÓm quÝ thuËn lîi cho viÖc t¸ch dßng . Plasmid thÕ hÖ thø nhÊt lµ nh÷ng plasmid ®Çu tiªn ®îc sö dông ®Ó t¸ch dßng vec t¬ pSC101 (Stanley&Cohen ,1973),ColE1(Hershfield,1974) . Plasmid thÕ hÖ thø hai ®îc t¹o ra b»ng çch tËp hîp çc ®Æc tÝnh quÝ cña nhiÒu plasmid tù nhiªn hoÆc g¾n thªm çc gen chØ thÞ ®Ó ®îc mét plasmid míi . Tiªu biÓu cho plasmid thÕ hÖ nµy lµ pBK322 (Bolivar vµ céng t¸c ,1977). Plasmid pBK322 cã kh¶ n¨ng t¸i b¶n cao , cho phÐp g¾n çc ®o¹n DNA cã tíi 6kb vÉn ho¹t ®éng b×nh thêng . Plasmid thÕ hÖ thø ba lµ nh÷ng plasmid m¹nh ,kÝch thíc rÊt nhá vµ mét polylinker (polycloning site ) rÊt ®îc a chuéng trong c«ng nghÖ gen .Polylinker lµ mét ®o¹n polynucleotit tæng hîp mang mét chuçi çc vÞ trÝ nhËn d¹ng duy nhÊt cña nhiÒu lo¹i RE (restiction Enzyme) Nhãm çc plasmid pUC ®iÓn h×nh lµ pUC18 ®îc c¶i biªn tõ pBK322 , kÝch thíc kho¶ng 2.686bp mang gen ApR vµ mét phÇn gen lacZ , xen gi÷a gen lacZ lµ polylinker. çc plasmid nhãm nµy chØ kh¸c nhau vÒ ®é dµi cña polylinker.Plasmid nhãm pUC cã kÝch thíc nhá , vïng polylinker cho phÐp g¾n bÊt kú mét tr×nh tù DNA l¹ nµo . Nhãm plasmid pSP vµ Gemini cã kÝch thíc kho¶ng 3.000bp, mang çc gen ApR vµ polylinker , kh«ng mang gen lacZ. Vec t¬ pSP mang promoter ®Æc trng cho RNA ë hai bªn vïng polylinker (pSP64,pSP56,Gemini...) u ®iÓm næi bËt cña plasmid nhãm nµy lµ cho phÐp

phiªn m· c¸c ®o¹n DNA ng¾n trong vec t¬ t¹o nªn nhiÒu RNA, c¸c RNA nµy ®îc dïng lµm mÉu dß hay ®Ó nghiªn cøu cÊu tróc , chøc n¨ng cña RNA.

H×nh 3.4. Tæng hîp vµ sö dông Cosmid ,(a) DNA thu nhËn tõ Bacteriophage Lamda ,(b) DNA më ra vµ çc ®o¹n cDNA ®îc cµi vµo nhê enzym ,(c) t¹o thµnh Cosmid,(d) Çc m· di truyÒn chøa cosmid cho yÕu tè nµy ®i vµo vi khuÈn vµ nh vËy lµ hoµ víi vi khuÈn ,(e) ë ®©y nãgöi th«ng ®iÖp ®Ó h×nh thµnh mét thÓ gièng plasmid cã mang cDNA. Mét vec t¬ kh¸c còng hay dïng lµ çc Cosmid . Cosmid lµ mét ®o¹n DNA ®îc t¹o ra b»ng çch cµi mét ph©n tö cDNA vµo gi÷a çc tr×nh tù Cos ë cuèi çc ph©n tö DNA . Ph©n tö DNA dïng ®Ó t¹o Cosmid ®îc lÊy tõ virut, thêng lµ bacteriophage lamda , nã sao chÐp ®îc trong vi khuÈn . Çc virut nh bacteriophage cã chøa çc m· di truyÒn cho çc yÕu tè cho phÐp thÊm nhËp tÕ bµo khi sao chÐp . Khi ë bªn trong tÕ bµo chñ , DNA d¹ng th¼ng cña virut göi th«ng ®iÖp tíi çc vßng gièng plasmid do g¾n vµo çc tr×nh tù Cos cña nã . Sö dông Cosmid còng gièng nh s©u chØ vµo kim råi kÕt l¹i çc ®Çu láng lÎo ®Ó t¹o nªn mét Plasmid . Çc Cosmid cã kh¶ n¨ng vËn chuyÓn çc ®o¹n DNA lín vµo bªn trongbtÕ bµo v× chóng cã kh¶ n¨ng thÊm nhËp vµo tÕ bµo mét çch dÔ dµng Vec t¬ thø 3 lµ mét Virut ®· ®îc thiÕt kÕ l¹i ®Ó mang çc mÈu DNA ngo¹i lai nh cDNA.Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y çc virut cã RNA nh Retrovirut ®· ®îc dïng ®Ó chuyªn chë çc gen tíi çc tÕ bµo cña ngêi. Virut cã thÓ ®îc thiÕt lËp cho viÖc vËn chuyÓn m· di truyÒn cu¶ çc ®o¹n vi khuÈn ®Ó sö dông nã nh çc t¸c nh©n g©y miÔn dÞch vµ thêng gäi lµ vacxin vec t¬ vi khuÈn .Nã ®¹i diÖn cho sù tiÕp cËn míi víi viÖc tiªm chñng cho mét quÇn thÓ d©n c réng lín vµ ®ã còng lµ nguyªn nh©n ®Ó l¹c quan vÒ çc vac xin t¬ng lai . Mét virut ®îc sö dông réng r·i víi t çch lµ mét vec t¬ ®ã lµ Bacteriophage hay ®¬n gi¶n gäi lµ Phage .MÆc dï kh«ng cÇn thiÕt x¶y ra , nhng bé gen cña phage thêng tù sao chÐp trong tÕ bµo chÊt cña vi khuÈn . NhiÒu d¹ng cña phage bé gen cña nã l¹i g¾n víi çc NST cña Vi khuÈn vµ n»m l©u dµi ë ®ã . V× v©y bé gen cña phage cã thÓ dïng ®Ó chuyÓn cDNAtíi mét NST vi khuÈn . Mét qu¸ tr×nh t¬ng tù nh vËycòng x¶y ra ë çc virut cña mét loµi thùc vËt hay çc virut cña ®éng vËt (tøc lµ retrovirut) víi çc tÕ bµo vËt chñ . H¬n n÷a , ®Ó cã mét ®iÓm gèc cho sù sao chÐp (origin of replication) th× mét vec t¬ thêng chØ cã mét vÞ trÝ ®¬n , n¬i dµnh cho enzym giíi h¹n ®Æc biÖt , mÆc dï enzym cã thÓ c¾t vec t¬ ë r¸t nhiÒu ®iÓm . Vec t¬ nµy cßn cã mét bé phËn gièng nh maker gene (dÊu chuÈn gen) gióp cho vec t¬ cã thÓ ®Þnh vÞ ®îc trong çc tÕ bµo. Gen kh¸ng kh¸ng sinh lµ mét dÊu chuÈn thÝch hîp bëi v× çc tÕ bµo cã dÊu chuÈn vÉn cßn tån t¹i khi xö lý víi kh¸ng sinh cßn nh÷ng tÕ bµo kh«ng cã dÊu chuÈn th× sÏ bÞ chÕt. Gi¶ thiÕt lµ cµi ®îc mét gen th× maker gene ph¶i ho¹t ®éng . Mét yÕu tè kh¸c lµm t¨ng gi¸ trÞ cña vec t¬ nµy lµ tÝnh thÝch nghi cña nã víi çc tÕ bµo vËt chñ . TÝnh æn ®Þnh cña vec t¬ cã thÓ ®¹t ®îc b»ng çch khi muèn ®a mét gen vµo th× ph¶i kiÓm so¸t chÆt chÏ thêi ®iÓm ®a gen vµo sao cho ®óng thêi kú phiªn m· , ch¼ng h¹n nh trong thêi kú tÕ bµo sinh trëng nhanh .Tiªu ®iÓm kiÓm so¸t sù biÓu hiÖn gen trong cång nghÖ DNA lµ sù ho¹t ®éng ë vÞ trÝ promoter –mét tr×nh tù baz¬ t¹o nªn sù h×nh thµnh RNA th«ng tin . TÝnh æn ®Þnh còng ®¹t ®îc b»ng çch sö dông NST thay v× çc vec t¬ plasmid . §Ó gi¶m bít kh¶ n¨ng mÊt toµn bé plasmid , çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· ®a vµo çc tÕ bµo mét lîng lín plasmid gäi lµ “high copy number-nhiÒu b¶n sao” v× cã sù cè mÊt çc tÕ bµo cã chøa plasmid trong lóc ph©n chia tÕ bµo .

H×nh 3.5. .Bacteriophage Lamda Phage ®i vµo çc tÕ bµo vi khuÈn , ë ®ã lâi DNA cña nã g¾n víi NST cña vi khuÈn . Khi tæ hîp víi DNA ngo¹i lai , phage ®ãng vai trß nh mét vec t¬ cho DNA ®ã. Mét çch kh¸c ®Ó duy tr× plasmid lµm cho çc tÕ bµo phô thuéc plasmid ph¶i sèng tiÕp tôc . Ch¼ng h¹n nh mét gen cho mét enzym cÇn thiÕt nµo ®ã cã thÓ ®îc ®a vµo plasmid cïng víi mét gen kh¸c. Plasmid sÏ cµi vµo tÕ bµo çc gen cña enzym cÇn thiÕt ®ã. §Ó tån t¹i, çc tÕ bµo ph¶i cã plasmid (vµ gen ®Ó t¹o ra çc enzym) . V× thÕ chØ cã çc tÕ bµo cã plasmid th× míi tån t¹i ®îc khi ph©n chia tÕ bµo .Còng cã thÓ lµ cÇn ph¶i hîp nhÊt mét gen kh¸ng kh¸ng sinh vµo plasmid . Vµ nh vËy th× chØ çc tÕ bµo cã chøa plasmid kh¸ng l¹i kh¸ng sinh míi tån t¹i cßn çc tÕ bµo kh¸c th× sÏ bÞ chÕt . 3.3.Lùa chän çc tÕ bµo chñ B¶n chÊt cña vec t¬ còng quan träng nh b¶n chÊt cña çc tÕ bµo hay c¬ quan vËt chñ . Mét ®ßi hái kh¸c lµ çc tÕ bµo vËt chñ ph¶i thÝch hîp ®îc víi viÖc nu«i cÊy trong phßng thÝ nghiÖm vµ cã kh¶ n¨ng hîp nhÊt víi çc vËt chÊt di truyÒn cña vec t¬ . Vµ çc nhµ Ho¸ sinh còng ph¶i cã kh¶ n¨ng kiÓm so¸t ®îc sù biÓu hiÖn gen trong çc tÕ bµo chñ vµ thu thËp ®îc çc s¶n phÈm cña gen . Mét trong sè çc ph¬ng tiÖn vËn t¶i lín nhÊt ®èi víi sù biÓu hiÖn protein lµ vi khuÈn Escherichia Coli (H×nh 3.7a). Nh ®· ®Ò cËp ë çc ch¬ng tríc, vi khuÈn ®· ®îc sö dông réng r·i ngay tõ trong çc thÝ nghiÖm ®Çu tiªn cña c«ng nghÖ DNA v× ngêi ta ®· qu¸ hiÓu vÒ vi khuÈn .§èi víi virut th× ngêi ta còng sö dông çc t liÖu nghiªn cøu tõ nh÷ng n¨m ®Çu 1950 . TÝnh di truyÒn cña chóng ®· ®îc x¸c lËp trong çc thÝ nghiÖm vÒ biÕn n¹p (transformation) vµ céng hîp

(conjugation) trong nh÷ng n¨m 1960 vµ nã ®· ®îc dïng ®Ó giÉi m· qu¸ tr×nh tæng hîp protein trong nh÷ng n¨m 1960 vµ 1970. H¬n n÷a , çc tÕ bµo E.Coli ®îc sö dông réng r·i cßn do chóng cã tèc ®é t¸i b¶n ®Æc biÖt cao .Trong ®iÒu kiÖn lý tëng, cø 20 phót vi khuÈn nµy l¹i nh©n ®«i mét lÇn . Khi vi khuÈn t¸i sinh th× plasmid vµ çc gen ®îc cµi vµo còng ®îc t¸i sinh .Vµ trong nhiÒu giê th× sÏ cã mét quÇn thÓ cã tíi hµng triÖu çc con ch¸u cña vi khuÈn còng nh hµng triÖu b¶n sao cña çc plasmid biÕn ®æi gen .Nh÷ng qï©n thÓ nh vËy gäi lµ colony(khuÈn l¹c) vµ gäi lµ dßng (clone) ®èi víi plasmid vµ gen . Tõ lãng cña c«ng nghÖ DNA gäi lµ gen “®· ®îc t¸ch dßng”(gene have been cloned).ViÖc t¸ch dßng gen ë çc tÕ bµo ®éng vËt th× chËm h¬n nhiÒu bëi b× çc tÕ bµo nµy nh©n lªn víi tèc ®é chËm so víi çc tÕ bµo E.Coli. MÆc dï E.Coli lµ con ngùa thå (Workhorse) cña di truyÒn ph©n tö , nhng nh÷ng vi khuÈn nµy còng cã nh÷ng ®iÓm bÊt lîi .Ch¼ng h¹n nh mét sè chñng E.Coli còng g©y bÖnh tiªu ch¶y ë trÎ em vµ çc kh¸ch du lÞch (traveler’s diarrhea). H¬n n÷a thµnh tÕ bµo cña çc tÕ bµo E.Coli cßn cã c¶ çc néi ®éc tè mµ çc néi ®éc tè nµy l¹i cã h¹i cho con ngêi. Çc néi ®éc tè còng khã lo¹i ra khái çc chÕ phÈm thuèc . E.Coli còng chØ t¹o ra ®îc mét lîng t¬ng ®èi Ýt protein , ®©y lµ ®iÓm yÕu lµm gi¶m gi¸ trÞ cña nã trong c«ng nghÖ DNA . Mét sinh vËt kh¸c ®îc biÕn ®æi , ®ã lµ vi khuÈn Bacillus Subtilis (H×nh 3.7b) . Sinh vËt h×nh chiÕc gËy nµy kh«ng g©y bÖnh . N¨m 1958 nã ®îc biÕn n¹p trong çc thÝ nghiÖm Griffith vµ tõ sau ®ã di truyÒn vi khuÈn ®· ®îc nghiªn cøu thÊu ®¸o h¬n . Chñng B.Subtilis s¶n xuÊt protein mét çch tÝch cùc vµ chñng nµy ®· ®îc dïng trong c«ng nghiÖp s¶n xó©t çc kh¸ng sinh , çc chÊt diÖt c«n trïng vµ çc enzym c«ng nghiÖp . Plasmid cña B.Subtilis vµ sù tÊn c«ng cña virut sÏ ®îc ®Ò cËp kü trong çc ch¬ng sau. Trong nh÷ng trêng hîp x¸c ®Þnh , ngêi ta muèn sö dông çc tæ chøc nh©n chuÈn – tøc lµ çc tÕ bµo cã nh©n , çc c¬ quan tö vµ phøc t¹p h¬n çc vi khuÈn nh©n trÇn . Sinh vËt thÝch hîp trong trêng hîp nµy lµ nÊm mem Saccharomycess Cerevisiae (H×nh 3.7c). NÊm men kh«ng g©y bÖnh , ®· ®îc th¨m dß kü cµng vÒ mÆt di truyÒn vµ ®· ®îc sö dông mét çch thêng qui trong qu¸ tr×nh lªn men vµ lµm b¸nh m× . Sö dông çc tæ chøc nh©n chñan th× tèt h¬n cho viÖc s¶n xuÊt çc protein cho ngêi bëi v× çc protein kh¸ phøc t¹p l¹i ®îc s¶n xuÊt bëi çc tæ chøc phøc t¹p h¬n . Mét vi sinh vËt nh©n chuÈn kh¸c lµ nÊm còng ®îc sö dông trong c«ng nghÖ DNA , chóng ta sÏ xem xÐt sau. Trong mét sè çc thÝ nghiÖm cña c«ng nghÖ DNA l¹i ®ßi hái çc tÕ bµo ®éng vËt cã vó (§VCV) . Khi sö dông çc tÕ bµo ®éng vËt cã vó sÏ cã mét lîi thÕ lµ tr¸nh ®îc çc ®éc tè nh khi sö dông vi khuÈn . Çc nhµ Ho¸ sinh còng ph¸t hiÖn r»ng mét sè protein lµ qu¸ lín vµ qu¸ phøc t¹p nÕu ph¶i tæng hîp b»ng vi khuÈn (ch¼ng h¹n nh çc chÊt ho¹t ho¸ plasminogen cña m«) . V× çc protein phøc t¹p cã xu híng cuén l¹i kh«ng ®óng quy çch trong vi khuÈn vµ sù khiÕm khuyÕt nµy cã thÓ dÉn tíi sù t¹o thµnh çc s¶n phÈm kh«ng cã ho¹t tÝnh . Vi khuÈn cßn cã thÓ thiÕu hÖ enzym cã liªn quan tíi sù c¶i biÕn protein tíi d¹ng cuèi cïng cña nã nh viÖc g¾n thªm ph©n tö cachohydrat ch¼ng h¹n .

H×nh 3.6. Çc tÕ bµo chñ lµ vi sinh vËt dïng cho c«ng nghÖ DNA ,(a) Escherichia Coli ,(b) Bacillus subtilis , (c) Saccharomyces cerevisiae . Mét bÊt lîi khi lµm viÖc víi çc tÕ bµo §VCV lµ thao t¸c rÊt khã kh¨n vµ ®¾t tiÒn so víi viÖc sö dông çc tÕ bµo vi khuÈn . ViÖc nu«i cÊy çc tÕ bµo §VCV còng rÊt phøc t¹p vµ viÖc cµi çc 32

ph©n tö vec t¬ vµo çc tÕ bµo §VCV lµ cùc kú phøc t¹p. Tuy nhiªn, çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· ph©n chia ra nhiÒu ®êng híng ®Ó hoµn tÊt viÖc tæng hîp protein trong çc tÕ bµo §VCV b»ng çch sö dông çc tr×nh tù promoter, nh÷ng vec t¬ míi ,vµ c¶ nh÷ng ph¬ng ph¸p míi ®Ó bµi xuÊt protein . Khi vec t¬ ®· ®îc chuÈn bÞ råi th× viÖc cµi nã vµo çc tÕ bµo hay tæ chøc tiÕp nhËn t¬ng ®èi dÔ dµng . Plasmid vµ Cosmid sÏ th©m nhËp vµo çc tÕ bµo khi lµm nãng lªn hay lµm l¹nh ®i xen kÏ cïng víi sù cã mÆt cña can xi clorua vµ virut x©m nhËp vµo tÕ bµo trong lóc çc qu¸ tr×nh sao chÐp cña chóng vÉn diÔn ra mét çch b×nh thêng . Mét ph¬ng ph¸p kh¸c dïng ®Ó cµi lµ ®¹n sinh häc biological bullistic” , çc ph¬ng ph¸p vi tiªm (microsyring injection) sÏ ®îc bµn sau. 3.4.Sù biÓu hiÖn cña gen Khi ®· chuÈn bÞ ®îc vec t¬ vµ cµi ®îc vµo çc tÕ bµo hay tæ chøc cña vËt chñ th× çc nhµ c«ng nghÖ DNA ph¶i ý thøc tíi viÖc xem xÐt vÒ mÆt Ho¸ sinh v× nã cßn gãp phÇn vµo sù thµnh , b¹i cña c¶ qu¸ tr×nh. Nh÷ng bíc nµy còng ph¶i thËn träng nh çc bíc tríc bëi v× çc qu¸ tr×nh sinh ho¸ cßn liªn quan tíi sù biÓu hiÖn gen bªn trong tÕ bµo . Mçi bø¬c nh thÕ phô thuéc vµo sù ®Þnh vÞ chiÕn lîc (strategic location), tøc lµ ph¶i ®Æt chÝnh x¸c gen cÇn cµi vµo ®óng vÞ trÝ trªn plasmid (H5.9) . Khi enzym RNA polymeraza phiªn m· DNA thµnh mRNA th× còng lµ lóc b¾t ®Çu qu¸ tr×nh ®Þnh vÞ mét vÞ trÝ nhËn d¹ng trªn ph©n tö DNA .VÞ trÝ nµy gäi lµ vÞ trÝ promoter (promoter site), ®ã lµ mét tr×nh tù baz¬ nãi lªn r»ng enzym ®· b¾t ®Çu tæng hîp mRNA .Enzym nµy sau ®ã di chuyÓn däc theo ph©n tö DNA vµ tæng hîp mRNA cho tíi khi ®Õn m· kÕt thóc. §Ó cã sù biªu hiÖn gen th× vÞ trÝ promoter ph¶i ®îc ®Æt ®óng dÊu (spot) trªn vec t¬ cã liªn quan víi gen.

H×nh 3.7. Vai trß cña Vec t¬ ch¼ng h¹n nh plasmid m· ho¸ Insulin. Plasmid cã çc vÞ trÝ ®Ó khëi ®Çu sù h×nh thµnh mRNA (promoter), nã cho phÐp g¾n víi Riboxom vµ kÕt thóc sù t¹o thµnh mRNA (terminator) . Trong çc tÕ bµo nh©n chuÈn th× mRMA më ®Çu ®îc c¶i biÕn b»ng çch lo¹i ®i nh÷ng intron ®Ó t¹o thµnh ph©n tö mRNA cuèi cïng . VÞ trÝ kÕt thóc (termination site) còng cã tÇm quan träng nh vÞ trÝ promoter. §©y lµ m· cña çc baz¬ tÝn hiÖu kÐt thóc qu¸ tr×nh phiªn m· . §iÒu nµy thËt lµ h÷u Ých v× ®· ®Æt mét tÝn hiÖu h÷u hiÖu ngay sau gen ®Ó ng¨n ngõa viÖc ®äc lÊn c¶ sang çc gen bªn c¹nh .Gen mong muèn sÏ ®îc ®Æt thËt chÝnh x¸c gi÷a vÞ trÝ promoter vµ vÞ trÝ kÕt thóc ®Ó ®¶m b¶o cho sù phiªn m· hîp lý . H¬n n÷a, ®èi víi çc vÞ trÝ promoter vµ vÞ trÝ kÕt thóc th× çc vec t¬ ph¶i chøa mét tr×nh tù baz¬ cho vÞ trÝ g¾n riboxom (ribosomal binding site). VÞ trÝ nµy lµ cÇn thiÕt bëi v× bëi v× ph©n tö mRNA ®îc m· ho¸ bëi gen ph¶i ®îc g¾n víi riboxom vµ ®Ó lµm ®îc ®iÒu ®ã th× cÇn ph¶i cã mét tr×nh tù baz¬ bæ cøu víi nã trªn riboxom .NÕu viÖc g¾n kh«ng thµnh c«ng th× pha dÞch m· ®Ó tæng hîp protein sÏ kh«ng x¶y ra vµ gen kh«ng ®îc biÓu hiÖn. Mét vÊn ®Ò kh¸c cÇn ph¶i xem xÐt ®èi víi sù biÓu hiÖn gen cã liªn quan tíi sù tæng hîp çc ph©n tö mRNA.ë vi khuÈn toµn bé tr×nh tù DNA ®îc phiªn m· thµnh ph©n tö mRNA .Nhng

®èi víi çc tÕ bµo ®éng vËt nh©n chuÈn th× kh«ng ph¶i nh vËy. Trong çc tÕ bµo nµy cßn cã mét sè vïng m· gäi lµ intron , çc intron sÏ ®îc lo¹i khái ph©n tö mRNA më ®Çu (preliminary mRNA) tríc khi trë thµnh mRNA cuèi cïng .Vïng m· cßn l¹i lµ çc exons (v× chóng ®îc biªu hiÖn –expressing). V× vËy çc mRNA ®îc t¹o ra bëi çc tÕ bµo nh©n chuÈn trªn thùc tÕ lµ tõ tËp hîp cña çc exons .Çc nhµ c«ng nghÖ DNA sÏ cßn ph¶i gi¶i quyÕt vÊn ®Ò nµy bëi v× vi khuÈn kh«ng cã enzym ®Ó lo¹i çc intron khái çc ph©n tö mRNA . V× thÕ, thËt lµ khã kh¨n khi sö dông vi khuÈn ®Ó biÓu hiÖn çc gen ®i tõ çc tÕ bµo cña ngêi . Çch mu trÝ ®Ó kh¾c phôc t×nh tr¹ng khá sö nµy lµ sö dung DNAbæ cøu (complementary DNA = cDNA) ®i tõ sù phiªn m· ngîc cña mRNA . cDNA ®îc tæng hîp tõ sù phiªn m· ngîc th× kh«ng cã intron mµ chØ cã çc exons .Çc cDNA ®îc tæng hîp nh thÕ cã thÓ dÔ dµng cµi ®îc vµo çc vi khuÈn . Mét çch kh¸c liªn quan tíi vÊn ®Ò intron-exons lµ tæng hîp mét gen nh©n t¹o (artificial gene) víi çc khèi kiÕn tróc nucleotit . Ph¬ng ph¸p nµy ®i tõ çc tiªu chuÈn Ho¸ sinh cæ ®iÓn tøc lµ sö dông çc tr×nh tù amino axit cña protein nh mét c¬ së ®Ó suy ra tr×nh tù baz¬ cho sù tæng hîp DNA. §iÒu nµy ®ßi hái ph¶i biÕt ®îc toµn bé tr×nh tù amino axit cña protein . Tøc lµ çc m· di truyÒn cña çc amino axit sÏ ®îc hiÖn râ vµ sau ®ã th× g¾n çc nucleotit ®Æc trng l¹i víi nhau .Cã mét sè gen ®· ®îc tæng hîp theo çch nµy . Ngêi ta gäi nã lµ oligonucleotit (oligo theo gèc ch÷ Hy l¹p cã nghÜa lµ Ýt) tøc lµ muèn ®Ò cËp tíi çc gen cã kÝch thíc nhá . Çc oligonucleotit cã thÓ cµi ®îc vµo çc vec t¬ vµ dïng ®Ó biÓu hiÖn protein, nhng ph¬ng ph¸p nµy rÊt khã .Mét trong nh÷ng th¸ch thøc kh¸c lµ ph¶i tæng hîp ®îc çc vÞ trÝ g¾n promoter, termination vµ riboxom . Çc oligonucleotit ®· ®îc sö dông nh lµ c¬ së cña çc ph©n tö antisen . Tuy nhiªn , viÖc s¶n xuÊt çc protein hiÕm khi chØ dõng ë giai ®o¹n g¾n çc amino axit l¹i víi nhau mµ cßn ph¶i tr¶i qua çc bíc c¶i biÕn tiÕp theo, ®ã lµ vÊn ®Ò mµ çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®ang lu t©m . Trêng hîp Insulin ch¼ng h¹n th× mét tæ hîp gåm 35 amino axit ph¶i ®îc c¾t bá tõ çc ph©n tö Insulin sím (early insulin) tríc khi gi÷ l¹i çc amino axit ®Ó t¹o nªn 2 chuçi dÝnh víi nhau . Vi khuÈn th× kh«ng cã kh¶ n¨ng c¶i biÕn nµy nªn çc nhµ c«ng nghÖ DNA ph¶i biÕn ®æi vi khuÈn ®Ó chóng t¹o nªn 2 chuçi t¸ch biÖt , sau ®ã 2 chuçi nµy sÏ ®îc g¾n l¹i víi nhau b»ng çc qu¸ tr×nh Ho¸ sinh t¸ch biÖt ë ngoµi vi khuÈn . Mét c¶i biÕn kh¸c cã thÓ x¶y ra lµ çc chuçi protein ®îc thªm vµo mét ph©n tö cacbohydrat ®Ó h×nh thµnh nªn ph©n tö glycoprotein. Hai d¹ng Interferon –hîp chÊt kh¸ng virut ®Òu lµ glycoprotein . Vi khuÈn kh«ng cã kh¶ n¨ng g¾n thªm cacbohydrat vµo protein nh kh¶ n¨ng cña çc gen ngêi nªn vi khuÈn kh«ng ®îc dïng ®Ó s¶n xuÊt interferon . §Ó gi¶i quyªt khóc m¾c nµy çc nhµ c«ng nghÖ DNA l¹i ph¶i sö dông tíi çc tÕ bµo ®éng vËt. Trong c«ng nghÖ DNA ngêi ta lu«n mong muèn lµm t¨ng s¶n lîng s¶n phÈm (H×nh 3.9..).Bíc nµy ®ßi hái ph¶i t¨ng møc ®é biÓu hiÖn gen . §Ó thùc hiÖn ®iÒu ®ã ph¶i cã nhiÒu gi¶i ph¸p .Ch¼ng h¹n nh cã thÓ t¨ng sè lîng plasmid trong vi khuÈn ( cµng nhiªu plasmid th× cµng cã nhiÒu mRNA vµ nhiÒu protein) .Còng cã thÓ “lËp chiÕn c«ng” b»ng çch n©ng cao hiÖu lùc cña çc tÝn hiÖu ho¸ häc tõ vÞ trÝ promoter ®Ó khëi ®Çu sù biÓu hiÖn gen , hoÆc t¨ng lùc g¾n mRNA víi riboxom b»ng çch can thiÖp vµo gen phô tr¸ch vÞ trÝ g¾n víi riboxom .Çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· kh¶o s¸t tÊt c¶ çc ph¬ng ph¸p nµy . Mét ph¬ng ph¸p kh¸c lµm t¨ng sù biÓu hiÖn gen lµ dïng çc m· lîi thÕ nhÊt cho mét protein ®Æc biÖt ë mét tæ chøc ®Æc biÖt .§iÒu hiÓn nhiªn lµ cã cã nhiÒu m· cho mét amino axit , ®iÒu quan träng lµ ph¶i biÕt ®îc m· nµo lµ thÝch hîp víi tæ chøc nµy .DÜ nhiªn sÏ cã mét Ýt m· sÏ kh«ng thÝch hîp . Tuy nhiªn, çc tÕ bµo s¶n xuÊt ra protein cã thÓ cho ra çc s¶n phÈm ho¹t ho¸ tÕ bµo ®¾t tiÒn (ch¼ng h¹n nh trong sù ph©n chia tÕ bµo) vµ nh÷ng tÕ bµo “s¶n xuÊt” nµy cã thÓ gÆp bÊt lîi khi cã mÆt çc tÕ bµo “b×nh thêng”. Çc nhµ c«ng nghÖ DNA v× thÕ vÉn ®ang chê ®îi mét quÇn thÓ tÕ bµo sÏ ®îc thiÕt lËp tríc khi cã ý ®Þnh muèn më réng tèi ®a sù biÓu hiÖn gen vµ ch¾c ch¾n r»ng vÉn cha cã sù tranh ®ua tÕ bµo trong kû nguyªn nµy . Gen promoter cã thÓ ®îc kiÓm so¸t b»ng çch “cÊm” sù biÓu hiÖn cña gen cÊu tróc cho tíi khi nã r¬i ®óng thêi ®iÓm gen ®îc biªu hiÖn . 3.5.TËp hîp çc s¶n phÈm cña gen Sù khÝch lÖ cña Ho¸ sinh ®èi víi sù biÓu hiÖn gen ®· lµm çc s¶n phÈm gen ®îc tÝch tô cµng nhiÒu . NhiÖm vô lóc nµy lµ ph¶i tËp hîp l¹i çc s¶n phÈm gen. Qu¸ tr×nh nµy cã thÓ lµ phøc t¹p h¬n ta tëng bëi v× mét s¶n phÈm gen thêng lµ ngo¹i lai ®èi víi tÕ bµo s¶n xuÊt ra nã. Ch¼ng h¹n nh Insulin ngêi ,nã kh«ng ph¶i lµ mét s¶n phÈm protein th«ng thêng cña vi khuÈn .ThËt vËy, víi mét protein ngo¹i lai nh vËy th× vi khuÈn cã enzym proteaza, enzym nµy nhËn d¹ng vµ c¾t bít mét phÇn ph©n tö protein .ChÝnh v× ho¹t tÝnh nµy cña enzym mµ nã lµm h¹n chÕ rÊt lín kh¶ n¨ng s¶n xuÊt insulin. 34

§Ó gi¶m bít sù huû ho¹i tiÒm tµng çc s¶n phÈm gen çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· sö dông çc chñng vi khuÈn kh«ng cã enzym proteaza. HiÖn ngêi ta thêng dïng Escherichia Coli. TÊt nhiªn nã lµ mét chñng tèt nhÊt bëi v× nã thiÕu hoµn toµn enzym proteaza . Nhng nh÷ng vi khuÈn nµy cã thÓ bÞ chÕt nÕu thiÕu sù b¶o vÖ nghiªm ngÆt .Mét ph¬ng ph¸p míi gi¶i quyÕt ®îc vÊn ®Ò nµy lµ lµm mét cÇu ch× gi÷a çc s¶n phÈm gen vµ çc protein nguyªn b¶n kh¸c cña tÕ bµo .Ph¬ng ph¸p nµy ®· ®îc sö dông ®Ó s¶n xuÊt insulin vµ hormon sinh trëng cña ngêi . Ph¬ng ph¸p míi nhÊt lµ sö dông çc tæ chøc mµ ë ®ã çc protein ngo¹i lai ®îc tÝch tô l¹i mét çch tæng thÓ trong tÕ bµo chÊt vµ nh vËy tr¸nh ®îc t¸c ®éng cña proteaza. ViÖc t¸ch chiÕt çc protein nµy còng lµ mét v¸n ®Ò,bëi v× çc ph¬ng ph¸p t¸ch chiÕt cã thÓ lµm gÉy çc ph©n tö protein . Mét vÊn ®Ò còng cÇn ®îc gi¶i quýªt ®ã lµ sù mÊt m¸t protein trong lóc sù biÓu hiÖn gen vÉn ®ang tiÕp tôc x¶y ra .Çc s¶n phÈm gen cã thÓ ®îc tÝch tô bªn trong tÕ bµo chÊt cña tÕ bµo hoÆc cã thÓ ®îc ®a ra m«i Trêng bªn ngoµi tÕ bµo .ViÖc cho ra çc s¶n phÈm gen cã lîi thÕ lµ cã thÓ lµm t¨ng s¶n lîng s¶n phÈm ,dÔ dµng phôc håi vµ cã thÓ lµm tinh khiÕt ®îc .V× vËy cÇn ph¶i nç lùc t×m kiÕm çc ph¬ng ph¸p h÷u hiÖu trong viÖc “xuÊt khÈu”çc s¶n phÈm .Cã rÊt nhiÒu c«ng tr×nh ®· nh»m vµo Bacillus Subtilis , mét vi khuÈn thêng “xuÊt khÈu” mét lîng lín protein . Çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· kh«n khÐo ®a vµo Bacillus subtilis çc tr×nh tù tÝn hiÖu ®Ó kÝch thÝch sù tiÕt (secretion) mµ vÉn thêng thÊy ë çc mÉu Bacillus kh¸c .Çc vi khuÈn nµy sau ®ã mãc vµo çc s¶n phÈm gen mét peptid tÝn hiÖu ®Ó kÝch thÝch sù xuÊt khÈu (H×nh 3.8.)

H×nh 3.8. Sö dông tr×nh tù tÝn hiÖu vµ peptid tÝn hiÖu .(a)Vec t¬ dïng trong tæng hîp protein cã chøa mét tr×nh tù tÝn hiÖu m· cho mét peptid tÝn hiÖu , nã sÏ g¾n víi çc s¶n phÈm , (b) peptid tÝn hiÖu khÝch lÖ sù xuÊt khÈu çc s¶n phÈm gen ra m«i trêng bªn ngoµi , (c) Khi ®· xuÊt khÈu peptid nµy sÏ ®îc lo¹i ®i vµ s¶n phÈm gen ®îc håi phôc . Peptid tÝn hiÖu nµy sÏ ®îc lo¹i ®i khi çc s¶n phÈm gen ®îc lµm tinh khiÕt. Nhê viÖc sö dông çc tr×nh tù vµ çc peptid tÝn hiÖu nªn ®· n©ng cao ®îc kh¶ n¨ng thu lîm çc s¶n phÈm gen khi ®Æt çc tÕ bµo trong çc ®iÒu kiÖn s¶n xuÊt protein. Qu¸ tr×nh nµy thÝch hîp víi viÖc s¶n xu©t Insulin vµ çc nghiªn cøu xa h¬n n÷a . 3.6.Th viÖn gen Çc nhµ c«ng nghÖ DNA sÏ ph¶i ®èi mÆt víi mét nhiÖm vô träng ®¹i lµ ph©n lËp çc gen tõ çc tÕ bµo gèc ®Ó phôc vô cho thÝ nghiÖm ë tõng thêi ®iÓm .§iÒu ®ã cã nghÜa lµ çc gen ph¶i ®îc gi÷ an toµn trong nh÷ng kho chøa sau khi chóng ®îc ph©n lËp tõ DNA cña tÕ bµo vµ ®îc lµm tinh khiÕt. Çc kho chøa nµy ®îc gäi lµ th viÖn gen (gene libraries). Mçi th viÖn lµ mét tËp hîp cña çc tÕ bµo sèng. §Ó tiÕn hµnh thµnh lËp mét th viÖn gen ngêi ta ph¶i thu thËp ®îc mét khèi lîng lín tÕ bµo cã chøa çc gen mong muèn. Ch¼ng h¹n nh çc tÕ bµo tuþ ngêi cã çc gen cña Insulin .VÊn ®Ò lµ ë chç çc tÕ bµo tuþ ph¶i cã kho¶ng 100.000 gen (tÝnh theo toµn bé tÕ bµo) vµ trong sè 100.000 gen cã mÆt th× cã kho¶ng 5% -10% thuéc DNA cña tÕ bµo ,sè cßn l¹i kho¶ng 90-95% lµ çc gen lÆp kh«ng cã chøc n¨ng . V× thÕ gen cña Insulin ph¶i ®îc ph©n lËp tõ mét khèi lîng rÊt lín DNA . B©y giê chóng ta hay xem vÊn ®Ò nµy ®îc hoµn thiÖn nh thÕ nµo ?. 3.6.1.ThiÕt lËp mét th viÖn.

§Ó thiÕt lËp mét dßng tÕ bµo cã çc gen insulin çc nhµ c«ng nghÖ DNA ph¶i b¾t ®Çu b»ng viÖc thu lîm çc gen nµy .§Ó lµm ®îc ®iÒu ®ã, ngêi ta ph¶i sö dông mét dÉy çc enzym giíi h¹n ®Ó c¾t çc DNA tÕ bµo tuþ thµnh nh÷ng ®o¹n nhá . Mçi ®o¹n nhá nµy thêng nhá h¬n mét gen cì trung b×nh vµ chøa kho¶ng 4000 baz¬ ni t¬ , kho¶ng 4 kilobaz¬ (kb).Mét NST cì trung b×nh cña ngêi cã kho¶ng 100.000 kb , v× thÕ nªn mçi NST ph¶i ®îc c¾t thµnh 25.000 ®o¹n , mçi ®o¹n dµi 4 kb.V× ngêi cã 23 NST kh¸c nhau cho mçi tÕ bµo nªn tæng sè cña çc ®o¹n 4kb sÏ lµ 575.000 ®o¹n. Trong sè 575.000 ®o¹n nµy cã gen Inssulin . B©y giê mét tæ chøc vËt chñ sÏ lùa chän çc ®o¹n nµy, ch¼ng h¹n nh Escherichia Coli hay Bacillus mét vi khuÈn ®êng ruét cua ngêi . Plasmid cña E.Coli sÏ ®îc ph©n lËp vµ çc ®o¹n DNA tõ çc tÕ bµo tuþ sÏ ®îc cµi vµo çc plasmid (H 5.12). Çc plasmid t¸i tæ hîp (bao gåm tÊt c¶ çc ®o¹n) sau ®ã l¹i ®îc cµi vµo çc tÕ bµo E.Coli vµ sau ®ã ®îc kÝch thÝch cho nã nh©n lªn. Nãi mét çch tæng qu¸t lµ çc tÕ bµo E.Coli b©y giê trë thµnh çc kho chøa tÊt c¶ DNA cña çc tÕ bµo tôy ngêi . TËp hîp çc tÕ bµo nµy chÝnh lµ mét th viÖn .Vµ nh vËy, çc tÕ bµo sÏ cã kho¶ng 575.000 cuèn s¸ch trong mét th viÖn . Lo¹i th viÖn gen nµy gäi lµ genomic library (Th viÖn Bé gen) . Nhng cuèn s¸ch nµo cña th viÖn nµy cã cã chøa çc gen ®Ó s¶n xuÊt insulin? §Ó tr¶ lêi c©u hái nµy ta ph¶i sµng läc trong th viÖn. Sù sµng läc sÏ x¸c ®Þnh ®îc gen ®Ých ®Æc hiÖu mµ trong trêng hîp nµy lµ Inssulin . Qu¸ tr×nh nµy sÏ nhËn diÖn ra çc tr×nh tù ®Æc biÖt cña çc vËt liÖu di truyÒn bªn trong çc tÕ bµo ®· biÕn n¹p . 3.6.2.Sµng läc th viÖn gen ViÖc sµng läc mét quÇn thÓ tÕ bµo trong mét th viÖn gen tøc lµ xem xÐt tíi çc vËt liÖu vµ th«ng tin di truyÒn cã thÓ cña nã. Ch¼ng h¹n nh , khi sµng läc çc tÕ bµo s¶n xuÊt Insulin ch¼ng h¹n th× ngêi ta ph¶i sö dông çc ph©n tö mRNA ®Æc hiÖu. Ph©n tö mRNA nµy cã çc tr×nh tù baz¬ bæ cøu víi çc tr×nh tù baz¬ cña gen Insulin. Khi nã ho¹t ®éng nh mét d¹ng ®Çu dß”probe” gen , mRNA sÏ g¾n ®Æc hiÖu víi gen Insulin . NÕu ®Çu dß cã g¾n mét ®ång vÞ phãng x¹ th× sÏ thÊy cã sù tÝch tô phãng x¹ cao ë n¬i ®ang x¶y ra ph¶n øng .

H×nh 3.9. ThiÕt lËp mét th viÖn gen ,(a) DNA ®îc ph©n lËp tõ çc tÕ bµo cña m« (ch¼ng h¹n nh çc tÕ bµo tuþ),plasmid lÊy tõ çc tÕ bµo chñ (ch¼ng h¹n nh vi khuÈn) ,(b)sö dông mét enzym giíi h¹n ®Æc biÖt ®Ó ph©n gi¶i DNA tÕ bµo vµ mét enzym giíi h¹n t¬ng tù còng ®îc dïng ®Ó më çc plasmid . KÕt qu¶ cña sù ph©n gi¶i lµ më ®îc plasmid vµ çc ®o¹n DNA ®îc nh©n lªn theo mÉu tõ 1 ®Õn 9 ,(c)çc ®o¹n DNA g¾n víi plasmid ®· më g¾n l¹i víi nhau ®Ó t¹o nªn plsssmid t¸i tæ hîp . Lu ý r»ng çc plasmid më thu nhËn ®îc nhiÒu ®o¹n DNA , (d)plasmid t¸i tæ hîp ®îc cµi vµo vi khuÈn míi, chóng sÏ n»m ë ®ã vµ nh©n lªn khi cã sù nh©n lªn cña tÕ bµo. QuÇn thÓ tÕ bµo vi khuÈn nµy lµ th viÖn gen .Çc tÕ bµo kh¸c nhau trong quÇn thÓ cã chøa çc ®o¹n DNA kh¸c nhau . Kh«ng ph¶i tÊ c¶ çc tÕ bµo ®Òu chøa cïng mét ®o¹n DNA vµ mét sè tÕ bµo cã c¶ çc b¶n sao ®îc nh©n lªn cña plasmid t¸i tæ hîp do sù sao chÐp cña plasmid . Th viÖn nµy cã thÓ ®îc sµng läc theo ch¬ng tr×nh m« t¶ ë h×nh tiÕp theo. §Ó tiÕn hµnh sµng läc, çc tÕ bµo E.Coli biÕn n¹p sÏ ®îc nu«i cÊy trong mét ®Üa Petri ë phßng thÝ nghiÖm cã chøa gel nu«i dìng . Trong vßng 1-2 ngµy cã thÓ nh×n thÊy çc khuÈn l¹c trªn bÒ mÆt gel. Lý tëng lµ çc khuÈn l¹c chØ chøa çc tÕ bµo ®îc cµi chØ víi DNA cña ngêi th«i. 37

Tuy nhiªn, çc tÕ bµo còng cã thÓ cã c¶ çc plasmid b×nh thêng (kh«ng cã çc gen cña ngêi) hoÆc còng cã thÓ cã çc plasmid t¸i tæ hîp.V× vËy, mçi khuÈn l¹c l¹i ph¶i ®em kiÓm tra xem nã ®· ®îc cµi gen Insulin cha ?

H×nh 3.10. Dïng kü thuËt bäc b¶n sao ®Ó sµng läc çc khuÈn l¹c vi khuÈn . Çc khuÈn l¹c cña vi khuÈn ®îc nu«i cÊy trªn mét ®Üa Petri cã chøa gel nu«i dìng , ®©y lµ ®Üa gèc . (a) Dïng mét m¶nh v¶i v« trïng ®Æt lªn trªn çc khuÈn l¹c th× mét sè vi khuÈn tõ mçi khuÈn l¹c ®îc chuyÓn sang tÊm v¶i . Sau ®ã tÊm v¶i nµy ®îc ®a vµo mét ®Üa Petri míi cã gel nu«i dìng . ñ çc gel nu«i dìng nµy th× çc khuÈn l¹c sÏ xuÊt hiÖn v× vËy mµ t¹o ra ®îc mét b¶n sao cña mét ®Üa gèc . (b) Kü thuËt nµy cã thÓ ®îc dïng ®Ó sµng läc çc vi khuÈn kh¸ng ampicillin (cã chøa gen kh¸ng ampicillin) ®ang ph¸t triÓn trªn mét ®Üa cã chøa vi khuÈn kh¸ng tetracyclin . V× bäc B¶n sao chøa ampicillin nªn chØ çc vi khuÈn kh¸ng ampicillin míi mäc ®îc . §èi chiÕu víi çc ®Üa gèc sÏ biÕt ®îc vi khuÈn nµo cã gen kh¸ng c¶ tetracyclin vµ ampicillin . Muèn cã çc b¶n sao vi sinh cña mét ®Üa ®Ó dïng cho çc c«ng viÖc sau nµy , çc nhµ Ho¸ sinh ®· sö dông mét kü thuËt ®îc gäi lµ “bäc çc b¶n sao”(-replica plating)(H×nh 3.10) .Kü thuËt nµy ®· ®îc Joshua vµ Esther Lederberg ph¸t triÓn tõ n¨m 1952. Kü thuËt nµy lµ Ðp mét m¶nh g¹c v« trïng vµo gel sau ®ã l¹i nhÊn nã vµo mét ®Üa Petri míi cã gel nu«i dìng ®Ó thiÕt lËp mét ®Üa “lµm viÖc”(-working) . B»ng çch lµm nh vËy tøc lµ ®· sao ®îc mét ®Üa gèc . B©y giê cã thÓ ph©n tÝch çc mÉu cña çc khuÈn l¹c kh¸c nhau tõ çc ®Üa” lµm viÖc”®Ó t×m ra gen ®Ých . Cã nhiÒu kiÓu ph©n tÝch. §èi víi çc gen Insulin th× sö dông ®Çu dß mRNA g¾n phãng x¹ . Tríc tiªn, lÊy mét mÉu vi khuÈn tõ mét khuÈn l¹c nghi ngê ( ®îc gi÷ an toµn) vµ DNA cña nã ®îc c¾t thµnh tõng ®o¹n vµ ®îc ph©n lËp trªn giÊy läc nitroxenluloza ®Æc biÖt.Dïng ph¬ng ph¸p ®iÖn di (electrophoresis) ®Ó t¸ch chiÕt. Sau ®ã dïng çc ®Çu dß ®Ó ®Ó xem nã cã ph¶n øng víi mét ®o¹n DNA bÊt kú nµo kh«ng (tõ çc tÕ bµo nµy).Còng gièng nh viÖc lÊy tay ph¶i mß tay tr¸i , ë ®©y çc ®Çu dß ®îc trén cïng víi çc ph©n tö DNA ®Ó t×m ra phÇn bæ cøu cña nã .NÕu nh ho¹t tÝnh phãng x¹ kh«ng ®îc tÝch tô th× çc nhµ kü thuËt cã thÓ x¸c ®Þnh ®îc r»ng kh«ng cã ph¶n øng x¶y ra vµ kh«ng cã gen Insulin.Cßn nÕu ho¹t tÝnh phãng x¹ l¹i tÝch tô ë mét ®Çu th× çc DNA nµy ®îc x¸c ®Þnh nh lµ mét “cuèn s¸ch trong th viÖn” ( –library book)trong ®ã chøa ®ùng çc th«ng tin di truyÒn (H×nh3.11)

H×nh 3.11. Dïng ®Çu dß gen ®Ó ®Þnh vÞ gen Insulin . Saukhi mét b¶n sao cña gen nguyªn gèc ®îc hoµn tÊt (H×nh tríc) , DNA tõ khuÈn l¹c vi khuÈn thu nhËn ®îc sÏ cho biÕt nh÷ng tÕ bÇo nµy cã chøa çc gen Insulin mong muèn hay cha . Khi nã g¾n víi gen kia th× tÝn hiÖu phãng x¹ sÏ ph¸t ra ®Ó chØ r»ng ®· x¶y ra sù liªn kÕt .Trong h×nh nµy th× ®Çu dß ®· g¾n víi ®o¹n #5 , ®ã lµ gen Insulin. ë thêi ®iÓm nµy , khuÈn l¹c ch×a kho¸ (key) sÏ ®Þnh vÞ ë çc ®Üa “lµm viÖc”.Víi ph¬ng ph¸p kiÓm tra kinh ®iÓn , khuÈn l¹c trong çc ®Üa gèc còng cã thÓ ®îc x¸c ®Þnh xem cã çc gen Insulin hay kh«ng. Çc nhµ c«ng nghÖ DNA muèn lµm viÖc víi çc gen Insulin ®îc t¸ch chiªt tõ çc tÕ bµo h¬n lµ víi çc tÕ bµo tuþ nguyªn gèc . 3.6.3.Th viÖn cDNA Tríc khi lu l¹i kh¸i niÖm th viÖn gen , cÇn ph¶i lu ý r»ng vÉn cßn tån t¹i mét d¹ng thø hai cña th viÖn , d¹ng nµy bao gåm çc ph©n tö DNA bæ cøu (complementary DNA=cDNA) .Th viÖn cDNA cña çc tæ chøc (ch¼ng h¹n nh E.Coli), nã mang çc ®o¹n DNA cã chøc n¨ng tÕ bµo ®Æc hiÖu.(ngîc l¹i , th viÖn genomic th× chøa çc gen m· ho¸ cho çc chøc n¨ng chung cña tÕ bµo ). Çc gen ®Æc hiÖu th× n»m ë çc th viÖn cDNA bëi v× th viÖn cDNA ®îc tæng hîp tõ qu¸ tr×nh phiªn m· ngîc (transcription) ®i tõ çc th«ng tin ®Æc hiÖu trong mRNA . §Ó sµng läc th viÖn cDNA ngêi ta ph¶i sö dông mét ®Çu dß ®Æc biÖt . §Çu dß nµy ®îc chuÈn bÞ tõ çc plasmid ®· ®îc ph©n lËp cïng víi cDNA cña nã cµi tõ çc tæ chøc vËt mang (carrier organisms). Çc cDNA plssmid sau ®ã ®îc sö lý ho¸ häc sao cho tõ 2 chuçi ®¬n ®îc chuyÓn thµnh d¹ng chuçi kÐp .Çc chuçi nµy ®îc g¾n vµo giÊy läc nitro xenluloza .ë ®©y cã sù pha trén çc ph©n tö mRNA víi giÊy läc .Çc ph©n tö mRNA nµy lµ bæ cøu cho rÊt nhiÒu tr×nh tù gen , v× bÊt kú mét ph©n tö mRNA nµo lµ bæ cøu ®èi víi DNA th× chóng sÏ g¾n ®îc. Cßn çc ph©n tö mRNA kh¸c sÏ ®îc loaÞ khái giÊy läc . Nh÷ng ph©n tö cßn n»m ë giÊy läc lµ mét quÇn thÓ t¬ng tù çc ph©n tö mRNA g¾n víi çc ph©n tö DNA chuçi ®¬n . Tæ hîp nµy sau ®ã ®îc lÊy ra khái giÊy vµ t¸ch ra ®îc RNA. TiÕp theo, mRNA l¹i ®îc g¾n vµo mét hÖ thèng tÕ bµo tù do cïng çc chÊt liÖu cÇn thiªt cho sù tæng hîp protein.V× thÕ çc protein ®îc t¹o ra lµ x¸c ®Þnh . Ngîc l¹i,tõ çc protein sÏ cho çc th«ng tin vÒ çc m· di truyÒn. Vµ lµm nh vËy th× çc tÕ bµo chÊt mang (carrier cells) ®· ®îc x¸c ®Þnh bëi v× nã cã chøa cDNA ®èi víi mét protein ®Æc biÖt . V× cDNA ®· ®îc x¸c ®Þnh theo ph¬ng ph¸p nµy nªn nã cã thÓ dïng nh mét ®Çu dß gen ®Ó sµng läc tr×nh tù DNA hay RNA cho mét quÇn thÓ tÕ bµo .Ch¼ng h¹n nh , çc s¶n phÈm ®îc t¸ch chiªt tõ mét quÇn thÓ tÕ bµo mµ ngêi ta cha bÝªt cã thÓ cho g¾n trªn giÊy trªn giÊy läc cã cDNA ®· biÕt . NÕu x¶y ra sù g¾n bæ cøu th× cDNA trong th viÖn cña mét quÇn thÓ tÕ bµo cha biÕt sÏ ®îc x¸c ®Þnh . Cßn nÕu kh«ng x¶y ra ph¶n øng th× ph¶i sö dông çc ®Çu dß kh¸c cho ®Õn khi x¶y ra sù g¾n kÕt . Mét kü thuËt hiÖn ®¹i lµ replica plating technique (kü thuËt bäc çc b¶n sao) ®îc dïng ®Ó sµng läc mét th viÖn genomic hay cDNA .Trong qóa tr×nh nµy, çc khuÈn l¹c cña çc tæ chøc vËt mang (carrier organisms) sÏ ®îc nu«i cÊy trªn mÆt gel ®Üa petri. Nhng ph¶i thay v¶i v«

trïng b»ng giÊy läc xenluloza ®Ó thu lîm çc b¶n sao cña khuÈn l¹c .GiÊy nitro xenluloza ®îc Ðp vµo bÒ mÆt çc khuÈn l¹c ®Ó cã ®îc çc mÉu sao , sau ®ã giÊy ®îc lµm ít bëi dung dÞch NaCl ë nhiÖt ®é cao (65oC ) ®Ó gi¶i phãng DNA khái tÕ bµo vµ t¸ch çc chuçi ra ( tøc lµm biÕn tÝnh) . B©y giê th× çc ®Çu dß gen cã ho¹t tÝnh phãng x¹ ®îc ®a vµo ®Ó xem n¬i nµo x¶y ra sù g¾n bæ cøu . §Ó t¹o ®iÒu kiÖn cho viÖc g¾n kÕt th× ph¶i ñ ë ®iÒu kiÖn thÝch hîp (thêng 24 g×¬ ) cho ph¶n øng x¶y ra . Sau thêi kú ñ , çc tê giÊy ®îc röa ®Ó lo¹i bá çc chÊt phãng x¹ vµ çc ®Çu dß d thõa . Sau ®ã giÊy läc l¹i ®îc kÑp gi÷a çc tê phim x quang . Ho¹t tÝnh phãng x¹ ë d¹ng h¹t beta sÏ ®îc gi¶i phãng khái çc ®Çu dß phãng x¹ ®Ó vµo çc phim X quang vµ hiÖn lªn ë phim nµy . Sau khi röa phim , vïng cã ho¹t tÝnh phãng x¹ sÏ cã çc vÕt sÉm. B»ng çch so s¸nh vÞ trÝ çc khuÈn l¹c cña nã trªn çc ®Üa chuÈn (original), çc nhµ c«ng nghÖ DNA cã thÓ x¸c ®Þnh ®îc çc khuÈn l¹c cã chøa DNA. Mét ph¬ng ph¸p kh¸c dïng ®Ó sµng läc th viÖn gen lµ viÖc sù dông çc lîi thÕ cña thiÕu hôt dinh dìng .Ch¼ng h¹n nh mét vi khuÈn “®ét biÕn” chØ cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn trong m«i trêng khi nã ®îc cung cÊp a xit amin Histidin (Çc vi khuÈn ®ét biÕn kh«ng cã kh¶ n¨ng tù tæng hîp Histidin). Mét ph¬ng ph¸p kh¸c còng ®ù¬c sö dông lµ çc gen kh¸ng thuèc. Ph¬ng ph¸p cuèi cïng lµ lµm ®«ng kh« tÕ bµo . §îc duy tr× theo kiÓu nµy çc tÕ bµo c¶m thÊy “dÔ chÞu” vµ çc th«ng tin di truyÒn dÔ dµng ®îc kh«i phôc.

H×nh 3.12..Ph¬ng ph¸p sµng läc mét th viÖn DNA , (a) çc tæ chøc mang vËt chñ cã chøa çc gen mong muèn ®îc nu«i cÊy trªn gel nu«i dìng. ë ®©y nã sÏ h×nh thµnh çc khuÈn l¹c .(b) Dïng mét tÖp giÊy läc nitroxenluloza ®Ët lªn trªn ®Ó cã ®îc mét b¶n sao çc khuÈn l¹c, (c) bãc giÊy läc nitroxenluloza ra khái mÆt gen ®Ó lÊy çc khuÈn l¹c vi khuÈn ,(d) GiÊy ®îc xö lý ®Ó ng¾t tÕ bµo vµ t¸ch ra çc chuçi DNA . Sau ®ã ®Æt vµo mét tói chÊt dÎo bÞt kÝn víi dung dÞch cã chøa ®Çu dß gen cã chÊt phãng x¹ .§Çu dß nµy ®Æc hiÖu víi gen mong muèn vµ sÏ ph¶n øng víi DNA bæ cøu trong thêi kú ñ .(e) giÊy ®îc Ðp víi phim x quang. NÕu phãng x¹ ph¸t ra do cã sù t¬ng t¸c ®Çu dß-gen thÝ nã sÏ ho¹t ho¸ phim X quang, (f) vïng tèi xuÊt hiÖn ë nh÷ng n¬i cã sù t¬ng t¸c x¶y ra .(g) Phim X quang ®îc so s¸nh víi ®Üa gèc ®Ó x¸c ®Þnh xem çc khuÈn l¹c nµo chøa DNA ph¸t ra phãng x¹. Nh÷ng khuÈn l¹c nµy sÏ cã vi khuÈn cã çc gen mong muèn. Nh ®· ®Ò cËp ë trªn , cã nhiÒu vÊn ®Ò n¶y sinh trong c«ng nghÖ DNA ®· ®îc gi¶i quyÕt nhê çc gi¶i ph¸p thÝch hîp . Çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· thao t¸c gen gÇn gièng nh çc ®å ch¬i Ho¸ sinh vµ ®· th¾ng lîi trong viÖc thu ®îc çc gen theo sù ®Æt cäc. Sù ph¸t triÓn thµnh c«ng çc ph¬ng ph¸p Ho¸ sinh ®· dÉn tíi hµng lo¹t th¾ng lîi trong viÖc sö dông mét çch thùc tiÔn c«ng nghÖ DNA ®Ó c¶i thiÖn chÊt lîng cuéc sèng con ngêi .

Ch¬ng IV Ph©n tÝch vµ chÈn ®o¸n b»ng DNA 4.1.Më ®Çu. Tõ nh÷ng n¨m 1950 , çc nhµ khoa häc ®· ph¸t hiÖn ra nhiÒu kü thuËt míi dïng ®Ó phan tÝch vµ lµm çc test trong y häc . Ch¼ng h¹n nh tríc kia ngêi ta t×m thÊy çc kh¸ng thÓ liªn quan tíi mét bÖnh nµo ®ã ë mét bÖnh nh©n th× ngµy nay hä cã thÓ x¸c ®Þnh ®îc tæ chøc (vËt) g©y bÖnh b»ng çc ph¬ng ph¸p mµ çc thÕ hÖ tríc ®©y kh«ng thÓ tëng tîng ®îc . Trong nhiÒu Trêng hîp , khi cÇn chÈn ®o¸n mét bÖnh cã thÓ chØ tËp trung vµo chÝnh tæ chøc nµy th«i chø kh«ng cÇn ph¶i xem xÐt çc b»ng chøng kh¸c. Trung t©m cña kü thuËt míi nµy lµ ph©n tö DNA .Ngµy nay ngêi ta cã thÓ t¸i t¹o l¹i DNA trong mét èng nghiÖm , hay t¸ch nã ra thµnh tõng m¶nh , x¸c ®Þnh thµnh phÇn, thay ®æi cÊu 42

tróc , chuyÓn ®æi çc m¶nh vµ lËp b¶n ®å gen cña nã . Nh÷ng nguyªn lý thu lîm ®îc tõ nh÷ng thÝ nghiÖm ®· ®îc ¸p dông ®Ó x¸c ®Þnh çc bÖnh truyÒn nhiÔm , t×m dÊu vÕt çc téi ph¹m, sµng läc ung th ë ngêi lín vµ çc bÖnh di truyÒn ë ph«i , ®¶m b¶o søc khoÎ cho céng ®ång b»ng viÖc x¸c ®Þnh çc yÕu tè g©y bÖnh trong m«i trêng . NhiÒu kü thuËt ®· ®îc më ra trong ®ã cã ph¶n øng tæng hîp chuçi (polymerase chain Reaction- PCR). Tríc nh÷ng n¨m 1985 hiÕm khi ®îc nghe thuËt ng÷ PCR;Víi nh÷ng tiªu chuÈn hiÖn nay , mét phßng thÝ nghiÖm DNA mµ kh«ng cã mét m¸y PCR th× còng gièng nh mét v¨n phßng kh«ng cã m¸y photocopy . Thùc tÕ , chøc n¨ng cña m¸y PCR gièng nh lµ mét m¸y photocopy. NÕu ta lÊy mét m¶nh DNA råi ®Ó nã tù ®éng sao chÐp th× sÏ cã hµng triÖu b¶n ®îc sao chØ trong kho¶ng 3 gií ®ång hå . Mét yÕu tè cÇn thiÕt kh¸c trong viÖc ph©n tÝch DNA lµ mét ®o¹n DNA gäi lµ ®Çu dß DNA (hay cßn gäi lµ ®Çu dß gen) .§îc ph¸t triÓn tõ nh÷ng n¨m 1970 , ®Çu dß DNA ®· “s¨n lïng” ®îc mét ®o¹n bæ cøu cña nã trong c¶ mét ®Çm lÇy çc tÝn hiÖu vµ vËt liÖu tÕ bµo mµ ë ®ã cã çc ®o¹n DNA ®Þnh vÞ . ViÖc theo dâi mét gen hay tËp hîp çc gen lµ mét nhiÖm vô v« cïng to lín v× khi ®ã ngêi ta ph¶i xem xÐt toµn bé bé gen ngêi . Chóng ta h·y tëng tëng r»ng çc chuçi bæ cøu cña DNA nh lµ mét con ®êng cao tèc 2 chiÒu . NÕu chóng ta nèi ®u«i víi ®u«i cña 46 nhiÔm s¾c thÓ víi nhau th× con ®êng cao tèc nµy sÏ cã chiÒu dµi bao quanh ®îc 3 triÖu vßng tr¸i ®Êt (kho¶ng 65 tû dÆm) . VËy mµ mét ®Çu dß DNA cã thÓ ph¸t hiÖn hiÖu qu¶ trªn chiÒu dµi tíi vµi ngµn dÆm . Chóng ta ®· thÊy ®îc nh÷ng thµnh qu¶ mµ PCR vµ ®Çu dß DNA thu ®îc trong ph©n tÝch vµ chÈn ®o¸n bÖnh. Trong nhiÒu trêng hîp , çc kü thuËt nµy lµ bæ sung cho çc ph¬ng ph¸p ph©n tÝch truyÒn thèng . Trong nh÷ng Trêng hîp kh¸c th× nã l¹i ®îc dïngnh çc ph¬ng ph¸p thay thÕ . Nhng trong mét sè chÈn ®o¸n cã thÓ ®îc thùc hiÖn mµ kh«ng cÇn tíi çc kü thuËt cã liªn quan tíi DNA. 4.2.Ph¬ng ph¸p ph©n tÝch DNA. N¨m 1961 Sol Spiegelman vµ Edward Hall ®· ph¸t hiÖn ra r»ng DNA chuçi ®¬n cã thÓ g¾n víi mét chuçi bæ cøu cña RNA t¹o nªn mét ph©n tö DNA-RNA chuçi kÐp . 20 n¨m sau, çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· ¸p dông nguyªn lý nµy cho ph©n tö DNA-DNA (tèt h¬n ph©n tö DNA-RNA) vµ t×m ra kh¶ n¨ng sö dông chuçi DNA ®Ó nhËn d¹ng mét ph©n tö DNA bæ cøu ë gi÷a mét hçn hîp çc ph©n tö DNA kh¸c . Nã còng gièng nh mét chiÕc ch×a kho¸ ®· t×m ®óng æ kho¸ .DÇn dÇn hä ®· ®a vµo ®îc mét yÕu tè quan träng trong ph©n tÝch çc baz¬ cña DNA , ®ã lµ mét chuçi DNA gäi lµ ®Çu dß DNA . 4.2.1.§Çu dß (MÉu dß) DNA. §Çu dß DNA lµ mét ph©n tö DNA chuçi ®¬n t¬ng ®èi nhá , nã cã thÓ nhËn d¹ng vµ g¾n ®îc vµo mét ph©n tö bæ cøu cña DNA hoÆc mét ®o¹n cña mét ph©n tö DNA lín (h×nh 7.1) .Bëi v× Baz¬ cña DNA lu«n cÆp ®«i A víi T vµ G víi C nªn mét ®Çu dß DNA cã thÓ t¬ng t¸c cao ®Æc biÖt víi çc tr×nh tù cña a xit nucleic trong çc ph©n tö DNA ®Ých . Gièng nh tay tr¸i t×m tay ph¶i , ph©n tö DNA ®Çu dß trén lÉn vµo gi÷a çc chuçi DNA cho ®Õn khi ®Þnh vÞ ®îc mét chuçi hoÆc mét phÇn cña chuçi mµ nã bæ cøu , råi nã g¾n vµo chuçi ®ã hoÆc mét phÇn cña chuçi ®ã .

H×nh 4.1. Ho¹t ®éng cña mét ®Çu dß gen : §Çu dß gen lµ mét ®o¹n DNA chuçi ®¬n . Khi g¾n víi mét ph©n tö DNA cã mét vÞ trÝ bæ cøu th× ®Çu dß gen sÏ t×m ra ®îc vÞ trÝ ®Ó g¾n . NÕu cã mét ph©n tö phãng x¹ hoÆc mét nguyªn tö ®îc g¾n vµo ®Çu dß nµy th× ho¹t tÝnh phãng x¹ sÏ tÝch tô ë vÞ trÝ g¾n vµ tÝn hiÖu nµy nãi r»ng ph¶n øng ®· x¶y ra . Lu ý trong h×nh vÏ chØ râ çc baz¬ cña mét ®Çu dß bæ cøu çc baz¬ cña ®o¹n DNA nh thÕ nµo . Sù ho¹t ®éng cña ®Çu dß g¾n chÆt víi Sinh ho¸ häc DNA . Trong nh÷ng ®iÒu kiÖn x¸c ®Þnh cña phßng thÝ nghiÖm ph©n tö DNA chuçi kÐp cã thÓ ®îc lµm ruçi th¼ng ra vµ kh«ng g¾n víi nhau n÷a . Çc ®iÒu kiÖn ®ã lµ :Lµm nãng lªn tíi trªn 90 C hoÆc ®a DNA tíi pH cao h¬n 10,5 hoÆc ®a thªm vµo mét hîp chÊt h÷u c¬ nh urª hoÆc formaldehyt. Khi ®ã liªn kÐt Hydro gi÷a çc cÆp baz¬ bÞ bÝªn mÊt vµ sù bæ cøu ®îc thùc hiÖn . Qu¸ tr×nh nµy gäi lµ sù biÕn tÝnh . Tuy nhiªn , sù biÕn tÝnh cã thÓ ®îc håi nguyªn . NÐu trong nh÷ng ®iÒu kiÖn ®Æc biÖt vÒ nång ®é muèi, nhiÖt ®é vµ pH cña phßng thÝ nghiÖm 2 ph©n tö DNA chuçi ®¬n sÏ g¾n víi nhau ®Ó t¹o thµnh d¹ng cÆp ®«i nguyªn b¶n . Qu¸ tr×nh nµy gäi lµ sù “lai” –(Hybridization) hay lµ sù “hoµn nguyªn”–(renaturation) , ®ã lµ trung t©m cña viÖc sö dông ®©ï dß DNA .Díi nh÷ng ®iÒu kiÖn ®îc kiÓm so¸t chÆt chÏ sÏ h×nh thµnh cÆp ®«i DNA bÒn v÷ng khi sù bæ cøu çc cÆp baz¬ hoµn h¶o däc theo toµn bé chiÒu dµi cña chuçi DNA . V× thÕ ®Çu dß DNA sÏ t¹o ®îc mét s¶n phÈm æn ®Þnh chØ trªn chuçi ®ã víi çc chuçi DNA bæ cøu cña nã . Khi sö dông víi môc ®Ých lµm test th× ®Çu dß DNA thêng ®îc g¾n vµo mét chÊt ph¸t hiÖn , ch¼ng h¹n nh mét chÊt ®ång vÞ phãng x¹ . Khi ®Çu dß g¾n vµo DNA bæ cøu cña nã th× çc ®ång vÞ phãng x¹ còng g¾n däc theo vµ sù tÝch tô cña çc ho¹t tÝnh phãng x¹ cho biÕt r»ng sù g¾n kÕt ®· ®îc thùc hiÖn . Tuy nhiªn, tríc khi ®a ®Çu dß vµo th× DNA ®Ých ®· ®îc ph©n lËp vµ c¾t nhá ra tõng m¶nh . §Çu dß dÊu chuÈn sÏ s¨n t×m ®o¹n bæ cøu cña nã trong çc ph©n tö DNA chuçi ®¬n . Khi øng dông trong c«ng nghÖ hiÖn ®¹i , ®Çu dß DNA cã thÓ ph¸t triÓn ®Ó ph¸t hiÖn bÊt kú mét tr×nh tù a xit nucleic nµo . ThËm chÝ còng cã nh÷ng Trêng hîp kh«ng cÇn ph¶i biÕt tr×nh tù cña çc baz¬ trong DNA ®Ých . Ch¼ng h¹n nh DNA trong mét tÕ bµo cã thÓ ®îc khÝch lÖ ®Ó h×nh thµnh ph©n tö RNA th«ng tin bæ cøu (mRNA) . Nh÷ng ph©n tö mRNA nµy sau ®ã ®îc ph©n lËp vµ cho g¾n víi enzym Transcriptaza ngîc cïng víi çc nucleotit t¬ng øng vµ çc vËt liÖu kh¸c .Transcriptaza ngîc ®îc dïng ®Ó ph©n lËp mRNA víi t çch nh lµ mét çi khu«n nã sÏ tæng hîp mét ph©n tö bæ cøu cña DNA . DNA míi nµy còng ®ång nhÊt víi çc phÇn chøc n¨ng cña DNA (exon) trong viÖc tæng hîp protein ë mét thêi ®iÓm nhÊt ®Þnh . Ph©n tö DNA míi nµy cßn ®îc dïng nh mét ®Çu dß ®Ó ph¸t hiÖn DNA cña nh©n (khi cÇn ph¶i ®Þnh lo¹i) . Mét ®Çu dß cã thÓ cã chiÒu dµi chØ díi 10 baz¬ hoÆc cã khi lªn tíi h¬n 10.000 baz¬. Râ rµng lµ, ®Çu dß ph¶i cã kh¶ n¨ng g¾n (hoÆc lai) víi DNA ®Ých . Nhng ®iÒu quan träng lµ ®Çu dß sÏ kh«ng lai víi çc ph©n tö a xit nucleic kh¸c còng cã mÆt ë ®ã . Vµ ph©n tö ®Çu dß ®Ých (probe –target molecule)(hoÆc ph©n tö lai) nÕu ®îc h×nh thµnh th× sù g¾n kÕt nµy ph¶i æn ®Þnh .

Trong nh÷ng n¨m 1980, ®iÒu l¹c quan cña viÖc sö dông ®Çu dß lµ ®· gi¶i quyÕt ®îc vÊn ®Ò lu«n lu«n thiÕu DNA trong mÉu ®Ó lµm test . Tuy nhiªn, nÕu thiÕu DNA ®Ých th× çc tÝn hiÖu phãng x¹ g¾n víi ®Çu dß sÏ kh«ng ho¹t ®éng tèt . V× thÕ ®iÒu quan träng lµ ph¶i khuÕch ®¹i DNA ®Ých . Kü thuËt khuÕch ®¹i DNA ®îc gäi lµ ph¶n øng tæng hîp chuçi (polymerase chain Reaction) –(PCR). 4.2.2.Ph¶n øng tæng hîp chuçi -(PCR). PCR ®îc Cetus Corporation ph¸t triÓn n¨m 1984, nã cho phÐp çc nhµ c«ng nghÖ DNA t¸i t¹o ra hµng tû b¶n sao cña mét chuçi ®¬n DNA chØ trong vßng mÊy giê ®ång hå (sù ph©n chia cña tÕ bµo ung th còng ph¶i mÊt hµng th¸ng míi ®¹t tíi con sè nµy). §Ó nh©n mét ph©n tö DNA víi PCR ®ßi hái ph¶i cã 4 vËt liÖu sau : 1.Ph©n tö DNA ®Ých (cã thÓ ®îc khuÕch ®¹i); 2.Çc chuçi ng¾n DNA måi “primer” ®· biªt , nã x¸c ®Þnh ®o¹n ph¶i sao vµ t¹o c¬ së cho viÖc b¾t ®Çu qu¸ tr×nh sao chÐp ; 3.DNA polumeraza , mét enzym híng dÉn sù sù sao chÐp DNA trong tÕ bµo sèng nhng kh«ng khëi ®éng ®îc qu¸ tr×nh sao chÐp; 4. Mét hçn hîp çc nucleotit -®ã lµ çc khèi vËt liÖu ®Ó x©y dùng nªn axit nucleic tõ ®ã mµ t¹o nªn çc DNA míi .

H×nh 4.2. Ph©n tÝch b»ng PCR : (a) DNA lÊy tõ mét tÕ bµo ®Æt vµo mét èng nghiÖm cã çc vËt liÖu thÝch øng . (b) Enzym DNA polymeraza nh©n ®«i hµng triÖu lÇn DNA ®Ých . (c) Víi sù nh©n lªn çc b¶n sao DNA , ®Çu dß DNA cña mét tr×nh tù baz¬ ®Æc biÖt dÔ dµng ®Þnh vÞ vÞ trÝ g¾n bæ cøu cña nã . §Ó çc khèi vËt liÖu nµy g¾n kÕt víi nhau , PCR ph¶i tiÕn hµnh theo 3 bíc , tÊt c¶ ®Òu tù ®éng trªn m¸y PCR . Bíc thø nhÊt : DNA ®Ých ®îc lµm nãng lªn ®Ó bÎ gÉy çc liªn kÕt gi÷a 2 chuçi vµ lµm ph©n tö ruçi th¼ng ra . Tíi bíc thø hai : Gi¶m nhiÖt ®é cho chÊt måi g¾n vµo DNA ®Ých . Nh vËy nã ®· x¸c ®Þnh ®îc vïng ph¶i sao chÐp . ChÊt måi lµ tÝn hiÖu b¾t ®Çu hay lµ dõng l¹i qu¸ tr×nh sao chÐp . Bíc thø 3 :DNA polymeraza xóc t¸c sù h×nh thµnh çc ph©n tö DNAchuçi ®¬n khi cã çc chuçi DNA ®Ých nh lµ çc khu«n . Sù tæng hîp ®îc b¾t ®Çu ë ®èm dÊu chuÈn bëi DNA måi. Khi enzym di chuyÓn däc theo mçi chuçi nã sÏ ®äc çc tr×nh tù cña çc baz¬ , råi sö dông nã nh mét çi khu«n ®Ó g¾n vµo mét chuçi bæ cøu vµ t¹o nªn chuçi nucleotit míi (ph¶n øng chuçi). DNA polymeraza ®îc sö dông ë ®©y lµ mét enzym chÞu nhiÖt ®Æc biÖt cã tªn lµ Tag Polymeraza . Enzym nµy lÊy tõ mét vi khuÈn chÞu nhiÖt Thermus aquaticus , lÇn ®Çu tiªn ®îc Thomas Brock ph©n lËp trong nh÷ng n¨m 1980 . Sù dung n¹p nhiÖt cña Tag polymeraza rÊt quan träng ®èi víi qu¸ tr×nh bëi v× enzym nµy sÏ kh«ng ph¶i thay thÕ sau mçi bíc ®îc lµm nãng lªn . KÕt thóc bíc 3 ®· cã 4 chuçi DNA (ban ®Çu chØ cã 2 chuçi) .

Khi qu¸ tr×nh tiÕp tôc , PCR sÏ lËp l¹i 30-60 lÇn . Mçi chu kú ®Òu b¾t ®Çu víi viÖc lµm nãng hçn hîp (bíc 1). Mçi chu kú mÊt kho¶ng 1-2 phót vµ mçi ®o¹n DNA míi sÏ nh mét çi khu«n cho çc b¶n sao . V× thÕ sè b¶n sao cña DNA t¨ng lªn kh«ng ngõng . Víi 2 chuçi DNA gèc sÏ cã hµng triÖu , hµng tû çc b¶n sao kh¸c . Tuy nhiªn PCR còng cßn tån t¹i nhiÒu vÊn ®Ò . Tríc tiªn lµ vÊn ®Ò dÝnh bÈn . NÕu DNA cã dÝnh çc chÊt bÈn th× nh÷ng chÊt bÈn nµy còng ®îc khuÕch ®¹i cïng víi çc DNA ®Ých . §Ó lo¹i trõ kh¶ n¨ng nµy , cÇn ph¶i hÕt søc thËn träng khi chuÈn bÞ mÉu .Thêng ph¶i chuÈn bÞ mÉu ë çc phßng thÝ nghiÖm m¹nh , trang bÞ ®¾t tiÒn . Mét vÊn ®Ò n÷a lµ PCR kh«ng ®Þnh lîng ®îc . PCR chØ cã thÓ x¸c ®Þnh xem mét ®o¹n DNA ®Æc hiÖu nµo ®ã cã mÆt hay kh«ng mµ th«i chø kh«ng ®Þnh lîng ®îc sè chuçi lµ bao nhiªu . Vµ v× PCR cßn qu¸ míi nªn còng cÇn ph¶i cã thêi gian ®Ó tiªu chuÈn ho¸ . MÆc dÇu cã mét vµi trë ng¹i nh vËy nhng PCR ®îc sö dông ®Ó kÕt nèi víi ®Çu dß , ®ã lµ niÒm hy väng trong t¬ng lai . ThËt vËy, n¨m 1989 theo tÝnh to¸n dù b¸o çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· thu ®îc vµi tr¨m tû Dola mçi n¨m víi c«ng nghÖ nµy . 4.2.3.KhuÕch ®¹i tÝn hiÖu. Ph¶n øng tæng hîp chuçi ho¹t ®éng trªn nguyªn t¾c khuÕch ®¹i ®Ých ; tøc lµ DNA ®Ých ®îc khuÕch ®¹i tríc khi thªm ®Çu dß vµo .Mét nguyªn lý thay thÕ lµ khuÕch ®¹i tÝn hiÖu . Theo nguyªn lý nµy cho mét lîng nhá nhÊt DNA g¾n víi ®Çu dß , sau ®ã tÝn hiÖu ®îc khuÕch ®¹i ®Ó chØ r»ng ph¶n øng ®· hoµn tÊt . §Ó cã ®îc sù khuÕch ®¹i th× ph¶i cã 2 sù tiÕp cËn chung . Thø nhÊt lµ ph¶i lµm gi¶m “®é ån” nÒn b»ng çch lo¹i ®i çc DNA d thõa . §iÒu ®ã ®îc thùc hiÖn b»ng çch t¸ch phøc hîp ®Çu dß ®Ých (target –probe Complex) khái hçn hîp DNA cã çc t¹p chÊt . §Ó thùc hiÖn viÖc t¸ch chiªt , çc chuçi nucleotit thymidin (Poly –T) ®îc g¾n víi çc h¹t tõ tÝnh . Çc chuçi bæ cøu cña Adenozin nucleotit (poly –A) sau ®ã l¹i ®îc g¾n vµo ®Çu dß DNA . Sau khi ®Çu dß DNA cã c¬ héi g¾n víi DNA ®Ých cña nã th× thªm çc h¹t Poly-T vµo . B©y giê th× baz¬ adenin cña phøc hîp ®Çu dß sÏ g¾n vµo baz¬ thymin cña çc h¹t nµy .Çc h¹t sau ®ã l¹i ®îc t¸ch khái hçn hîp cã mang çc phøc hîp ®Çu dß -®Ých .Nh vËy nã ®· ®îc c« ®äng l¹i vµ t¸ch ra khái DNA t¹p chÊt . §iÒu ®ã cã nghÜa lµ tÝn hiÖu (®Çu dß DNA phãng x¹) ®· ®îc khuÕch ®¹i . VÊn ®Ò thø hai lµ khuÕch ®¹i vËt ph¸t hiÖn (detector) cã g¾n víi tÝn hiÖu , tøc lµ khuÕch ®¹i ph©n tö DNA ®Çu dß . §Ó thùc hiÖn ®îc môc ®Ých nµy ph¶i sö dông mét ®Çu dß thø hai cho DNA ®Ých . §Çu dß nµy ®îc thiÕt lËp tõ mét RNA cã mét cÊu tróc bËc 3 ®éc quyÒn . §Çu dß nµy ho¹t ®éng víi Q-beta –replicaza, mét enzym xóc t¸c sù sao chÐp RNA . §Çu dß RNA g¾n víi DNA ®Ých cïng víi DNA ®Çu dß . Khi liªn kÕt 3 gåm RNA-DNA-DNA ®îc t¸ch ra khái hçn hîp th× thªm Q-beta replicaza vµo . Enzym nµy sÏ sao chÐp ®Çu dß RNA . Nh vËy ®· khuÕch ®¹i ®îc vËt ph¸t hiÖn (RNA) còng nh tÝn hiÖu(®Çu dß) vµ mét lîng lín RNA cã thÓ ®îc ph¸t hiÖn b»ng çc kü thuËt tiªu chuÈn .

H×nh 4.3. Chi tiÕt mét ph¶n øng tæng hîp chuçi (PCR) . (a) Dïng nhiÖt ®Ó t¸ch ph©n tö DNA chuçi kÐp {(ds) DNA }. Trong chu kú 1. Mét hçn hîp nucleotit , enzym Polymeraza vµ mét ®o¹n måi DNA ®îc thªm vµo .(b) polymeraza níi réng ®o¹n måi vµ t¹o nªn 2 ph©n tö DNA chuçi kÐp {(ds) DNA }. (c) Qu¸ tr×nh ®îc lËp l¹i vµ ë cuèi chu kú 2 sÏ cã 4 ph©n tö DNA . LËp l¹i chu kú 3 sÏ t¹o ®îc tÊt c¶ 8 ph©n tö DNA . Çc chuçi cø t¨ng lªn dÇn ë çc chu kú tiÕp theo . HÖ thèng ®Çu dß RNA cã lîi thÕ v× nã rÊt nhanh , mçi vßng sao chÐp RNA chØ mÊt 15 ®Õn 20 gi©y .Kü thuËt nµy còng ®îc dïng ®Ó ®Þnh lîng DNA ®Ých vµ çc nhµ nghiªn cøu ®· chÊp nhËn nã ®Ó ph¸t hiÖn RNA .

DÜ nhiªn víi bÊt kú mét kü thuËt míi nµo còng cã nh÷ng vÊn ®Ò cÇn ph¶i gi¶i quyÕt tríc khi nã trë thµnh trô cét trong çc Labo chÈn ®o¸n . 4.2.4.Ph©n tÝch RFLP. Còng cã thÓ kh«ng cÇn thiÕt ph¶i x¸c ®Þnh mét gen ®Æc biÖt nÕu nã lµ sù biÕn ®æi thÝch øng . Sù biÕn ®æi nh vËy gäi lµ tÝnh ®a h×nh theo chiÒu dµi ®o¹n giíi h¹n (restriction fragment length polymorphism) hay lµ RFLP ®äc lµ “rif –lip” . RFLP lµ mét ®o¹n DNA dïng ®Ó lµm dÊu chuÈn mét gen ®Æc hiÖu . RFLP hiÓn nhiªn kh«ng cã chøc n¨ng trong sinh lý häc tÕ bµo . NhiÒu RFLP ®Þnh vÞ mét çch ngÉu nhiªn kh¾p trªn çc NST cña ngêi nh mét d¹ng r¸c di truyÒn .Nã cã t¸c dông nh mét dÊu chuÈn gen khi mét gen ®Æc biÖt cha ®îc t¸ch dßng hoÆc cã khã kh¨n khi lµm viÖc víi nã (H×nh 4.4.)

H×nh 4.4. Ph¸t hiÖn mét RFLP .Ç thÓ thø nhÊt cã 3 vÞ trÝ nhËy c¶m víi HindII cho nªn sÏ t¹o ®îc 2 ®o¹n . §o¹n thø nhÊt 2 kilobaz¬ (Kb) cßn ®o¹n thø hai 4 Kb . Ç thÓ thø hai thiÕu mét vÞ trÝ nh¹y c¶m (H ) cã thÓ do ®ét biÕn di truyÒn . V× thÕ enzym giíi h¹n HindIII ®îc thªm vµo nã chØ c¾t ph©n tö DNA ë 2 vÞ trÝ vµ t¹o nªn mét ®o¹n 6 Kb. Lu û r»ng ®Çu dß DNA ®èi víi ®o¹n DNA nµy n»m gi÷a vÞ trÝ H vµ H cã çc baz¬ bæ cøu cho c¶ ®o¹n nªn nã sÏ ph¶n øng víi çc ®o¹n 2 Kb,4 Kb, vµ 6 Kb .V× thÕ ®Çu dß cã thÓ ®îc dïng ®Ó ph¸t hiÖn tÊt c¶ 3 ®o¹n .Çc ®o¹n ®ã lµ çc RFLP. §Ó RFLP cã thÓ sö dông nh mét dÊu chuÈn nã ph¶i çch xa gen Ýt h¬n 5x106 cÆp baz¬ (hoÆc 5 Centimorgans). NÕu RFLP vµ gen ë trong kho¶ng çch nµy th× ch¾c ch¾n lµ chóng ®· g¾n víi nhau vµ truyÒn l¹i tÊt c¶ cho çc thÕ hÖ sau .Çc nhµ c«ng nghÖ ®· thèng kª víi 95% ®é tin cËy r»ng nÕu mét ç thÓ cã RFLP th× ngêi tra sÏ t×m ra ®îc gen ®ã . §Ó t×m hiÓu b¶n chÊt cña RFLP chóng ta ph¶i hiÓu r»ng ®ã lµ ®o¹n DNA ®Æc biÖt cã thÓ cã kÝch thíc thay ®æi . §o¹n nµy ®îc gäi lµ ®a h×nh (dÞch theo v¨n häc tøc lµ “nhiÒu thÓ lo¹i” (many forms) . Chóng ta h·y xem xÐt vÝ dô sau ®©y :§o¹n DNA kÐo dµi tõ ®iÓm A ®Õn F , trong ®ã çc ch÷ kÐp chØ çc ®iÓm c¾t cña enzym giíi h¹n . -A- BB -CC –DD –EE –FB©y giê ta thªm vµo mét hçn hîp çc enzym giíi h¹n (b,c,d vµ e)nã sÏ c¾t ph©n tö DNA ë çc ch÷ kÐp .KÕt qu¶ lµ ®îc 5 ®o¹n cã kÝch cì th« nh nhau : -A-B

B-C

C-D

D-E

E-F

Qua nh÷ng kho¶ng thêi gian rÊt dµi , ph©n tö DNAcã sù thay ®æi , sù thay ®æi tù ®éng trong cÆp baz¬ mµ nã kh«ng chÞu t¸c ®éng bëi c¸c qu¸ tr×nh Ho¸ sinh hay sinh lý häc mµ bëi sù t¸c ®éng

cña enzym .V× thÕ sù biÕn ®æi trong mét cÆp baz¬ cã thÓ x¶y ra ë çc ®o¹n cña DNA vµ t¹o ®îc çc ph©n tö sau : -A-BB - CC – DX – EF –FNÕu b©y giê chóng ta xö lý ph©n tö nµy víi hçn hîp enzym giíi h¹n (b,c,d,e) kÕt qu¶ sÏ cho çc ®o¹n sau : -A –B

B–C

C-DX – E 3

E- F 4

CÇn ph¶i lu ý r»ng kÕt qu¶ t¸c ®éng cña enzym chØ cho ra 4 ®o¹n , bëi v× enzym “d”kh«ng cã ho¹t tÝnh ë vÞ trÝ DX(v× tõ nguyªn gèc DD ®· ®æi thµnh DE). Cßn mét ý nghÜa thùc tiÔn n÷a lµ ®o¹n { C-DX-E} L¹Þ ng¾n h¬n 3 ®o¹n kia .Nh vËy çc ®o¹n DNA cã kÝch cì kh¸c nhau , chÝnh sù kh¸c nhau vÒ kÝch cì nµy t¹o nªn sù ®a h×nh . ThuËt ng÷ RFLP lµ ®i tõ “Restriction Enzyme” cßn FL tøc lµ “fragment length”. §Ó sö dông RFLP trong ph©n tÝch DNA , çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· n¾m lÊy lîi thÕ lµ hä ®· biÕt tríc chiÒu dµi çc cÆp baz¬ cña mét RFLP ®Æc hiÖu . Ngêi ta lÊy çc tÕ bµo tõ mét ngêi vµ ph©n lËp DNA , råi xö lý nã víi hçn hîp enzym giíi h¹n . Sau ®ã ®a hçn hîp nµy vµo trong m¸y ®iÖn di , khi ®ã çc polymorphism sÏ ®îc t¸ch ra theo kÝch cì . Qu¸ tr×nh t¸ch chiÕt nµy sÏ cho ra mét mÉu çc b¨ng gièng nh m· (Code) çc Bar trong mét siªu thÞ .Khi ph©n tÝch mÉu , çc b¨ng sÏ ph¶n ¸nh cã hay kh«ng cã RFLP ®Æc hiÖu , v× nã phô thuéc vµo tÝnh di truyÒn cña ç thÓ . NÕu sö dông RFLP dÊu chuÈn th× ch¾c ch¾n tíi 95% lµ cã mÆt gen nµy . Trong thùc tÕ , mét NST ®Æc biÖt vµ çc gen cña nã cã thÓ truyÒn tõ thÕ hÖ nµy sang thÕ hÖ kh¸c cïng víi RFLP dÊu chuÈn . Khi ph©n tÝch mét gen g©y bÖnh , mÉu RFLP cña mét ç thÓ sÏ ®îc so s¸nh víi mÉu RFLP cña nh÷ng ngêi b×nh thêng còng nh cña nh÷ng ngêi bÞ t¸c ®éng bëi gen nµy .Nhøng sù so s¸nh nh vËy cho phÐp x¸c ®Þnh ®îc ç thÓ ®ã cã hay kh«ng cã RFLP vµ gen g©y bÖnh . Çc th«ng tin nµy còng t¹o ®îc çc quyÕt ®Þnh quan träng víi çc bÖnh di truyÒn . 4.3.ChÈn ®o¸n çc bÖnh truyÒn nhiÔm. Çc test chÈn ®o¸n dùa trªn c¬ së ®Çu dß vµ PCR ®Òu xuÊt ph¸t tõ çc thùc tiÔn trong qu¸ khø .Víi kû nguyªn ®¬ng ®¹i , çc thuèc thö cho çc test cã 2 d¹ng chung : Çc thuèc thö sinh ho¸ dïng ®Ó ph¸t hiÖn çc enzym ®Æc hiÖu vµ kh¸ng thÓ dïng ®Ó ph¸t hiÖn protein .Sù hiÖn diÖn cña ®Çu dß DNA lµ mét líp hoµn toµn míi cña çc thuèc thö chÈn ®o¸n bëi v× nã ch¼ng ph¸t hiÖn enzym còng nh protein mµ l¹i lµ tr×nh tù gen .Vµ ®Ó sö dông mét çch hiÖu qu¶ ®Çu dß DNA th× cÇn ph¶i cã mét lîng lín DNA míi ®ñ lµm test vµ PCR ®· ®¸p øng ®îcyªu cÇu nµy .C«ng nghÖ khuÕch ®¹i vµ ph¸t hiÖn cña DNA ngµy nay cho phÐp lµm ®îc mét sè test chÈn ®o¸n çc bÖnh truyÒn nhiÔm vµ nã kh«ng ngõng ph¸t triÓn . 4.3.1.ChÈn ®o¸n Héi chøng thiÕu hôt miÔn dÞch m¾c ph¶i . Sö dông ®Çu dß DNA vµ PCR cã thÓ ph¸t hiÖn ®îc virut g©y thiÕu hôt miÔn dÞch trªn ngêi (Human immunodeficiency Virut)-(HIV) . Virut nµy g©y nªn héi chøng thiÕu hôt miÔn dÞch m¾c ph¶i (AIDS) . Tõ n¨m 1985 trë l¹i ®©y FDA míi chØ cÊp phÐp cho test ph¸t hiÖn HIV dùa trªn c¬ së kh¸ng thÓ. Test ho¹t ®éng dùa trªn sù pháng ®o¸n khi mét ngêi ph¬i nhiÔm HIV th× kh¸ng thÓ do c¬ thÓ t¹o ra cã thÓ ph¸t hiÖn ®îc trong phßng thÝ nghiÖm .Nhng diÒu bÊt tiÖn lµ ph¶i mÊt vµi tuÇn c¬ thÓ míi t¹o ra ®ñ lîng kh¸ng thÓ ®Ó lµm ®îc mét test d¬ng tÝnh . T¹m thêi th× test vÉn lµ ©m tÝnh mÆc dï HIV ®· cã mÆt trong c¬ thÓ (Test ©m tÝnh gi¶ -“false – negative Test” ) . Víi viÖc ®a vµo mét ®Çu dß DNA vµ PCR nã t¹o kh¶ n¨ng cho test trùc tiÕp h¬n ®èi v¬Ý sù hiÖn diÖn cña HIV .Trong chu kú x©m nhiÔm cña nã , HIV tån t¹i nh mét ®o¹n DNA nèi vµo NST cña çc tÕ bµo chñ . Çc tÕ bµo thuéc hÖ miÔn dÞch cña mét bÖnh nh©n ®îc biÕt nh çc Lympho –T . §Ó thùc hiÖn mét test chÈn ®o¸n trùc tiÕp ngêi ta ph¶i thu thËp çc lympho –T tõ bÖnh nh©n vµ ph¸ vì mét çch an toµn DNA . Sau ®ã khuÕch ®¹i bëi PCR , tõ ®ã cã thÓ thu ®îc hµng nöa miligam DNA ®Ó dïng cho test .(Khèi lîng DNA kh«ng ®îc khuÕch ®¹i chØ cã kho¶ng 1 triÖu s¶n phÈm cuèi cïng) .B©y giê th× cho ®Çu dß vµo . Tr×nh tù baz¬ cña ®Çu dß sÏ bæ cøu víi tr×nh tù baz¬ cña DNA virut . NÕu cã mÆt DNA virut th× ®Çu dß sÏ ®Þnh vÞ ®îc vµ g¾n vµo nã . Sù g¾n kÕt nµy ®îc b¸o bëi tÝn hiÖu tÝch tô ho¹t tÝnh phãng x¹ . KÕt qu¶ ®ã lµ mét test d¬ng tÝnh .

Bëi v× çc kü thuËt chÈn ®o¸n HIV míi h¬n , x¸c ®Þnh tèt h¬n so víi viÖc dïng kh¸ng thÓ virut nªn çc thµy thuèc cã thÓ tin tëng h¬n vÒ tr¹ng th¸i søc khoÎ cña bÖnh nh©n. Çc thuèc ®îc kª ra x¸c thùc h¬n vµ çc gi¶i ph¸p nh»m tr¸nh sù lan truyÒn HIV sÏ ®îc thù hiÖn sím h¬n . Kü thuËt nµy còng gióp cho y tÕ céng ®ång x¸c ®Þnh ®îc t×nh h×nh dÞch tÔ cña AIDS dÔ dµng h¬n bëi v× hä cã thÓ hiÓu râ h¬n ai ®· cã Virut mµ vÉn cha xuÊt hiÖn kh¸ng thÓ . ChÈn ®o¸n HIV b»ng ®Çu dß cßn cã thÓ ph¸t hiÖn chÝnh x¸c h¬n sù x©m nhiÔm HIV lóc s¬ sinh . Ph¬ng ph¸p truyÒn thèng lµ Test s¬ sinh xem cã kh¸ng thÓ HIV kh«ng .§iÒu r¾c rèi lµ ë chç kh¸ng thÓ nµy cã thÓ tõ m¸u cña mÑ truyÒn qua nhau thai vµ nh vËy râ rµng lµ mÑ cã thÓ bÞ nhiÔm HIV nhiÒu h¬n lµ trÎ s¬ sinh .B»ng çch sö dông test chÈn ®o¸n trùc tiÕp DNA g¾n víi HIV, ngêi ta cã thÓ ph¸t hiÖn ®îc HIV trong çc tÕ bµo cña trÎ s¬ sinh vµ viÖc chÈn ®o¸n sím h¬n rÊt nhiÒu . HÖ qu¶ cña sù tiÕp cËn nµy lµ çc nghiªn cøu tõ n¨m 1992. Khi ®ã çc nhµ nghiªn cøu ®· ph¸t hiÖn trong mét ngµy sinh cã 23 trÎ em d¬ng tÝnh víi HIV khi ®îc test víi ®Çu dß DNA vµ cã 19 em lµ ©m tÝnh . Ngµy nay test ®Çu dß DNA lu«n ®îc çc thÇy thuèc ®ßi hái . Tuy nhiªn test nµy cßn ®¾t vµ cha ®îc phª chuÈn bëi FDA vÒ khèi lîng DNA dïng cho test . Vµ sù phª chuÈn nµy ®îc thùc hiÖn vµo nh÷ng n¨m 1990 vµ khi ®ã nã sÏ trë thµnh mét ph¬ng tiÖn chÝnh ®Ó x¸c ®Þnh HIV . 4.3.2.ChÈn ®o¸n BÖnh lao . Çc Test chÈn ®o¸n bÖnh lao hiÖn nay cÇn ph¶i vµi tuÇn míi hoµn tÊt bëi v× vi khuÈn lao Mycobacterium Tubercolosis nh©n lªn rÊt chËm , t¸i sinh mét tÕ bµo ph¶i mÊt 24 giê .Trong khi chê ®îi chÈn ®o¸n , çc thÇy thuèc ph¶i quyÕt ®Þnh ®iÒu trÞ dùa trªn çc nguån th«ng tin rÊt h¹n chÕ . §iÒu ®ã dÉn ®Õn viÖc lµm mÊt hiÖu lùc cña thuèc kª ®¬n vµ søc khoÎ cña bÖnh nh©n tåi tÖ h¬n . H¬n n÷a , bÖnh nh©n nµy cã thÓ truyÒn bÖnh cña m×nh sang ngêi kh¸c khi ®ang chê ®îi kÕt qu¶ xÐt nghiÖm . XuÊt ph¸t tõ con ®om ®ãm , çc nhµ nghiªn cøu ®· ph¸t triÓn mét Test chÈn ®o¸n hoµn toµn míi vµ giÇu tëng tîng ®èi víi bÖnh lao , test nµy còng gióp cho viÖc ph¸t hiÖn çc chñng ®Æc biÖt cña M. Tuberculosis kh¸ng thuèc .C¬ së cña sù tiÕp cËn nµy lµ enzym Luciferaza cña ®om ®ãm . Enzym nµy sÏ ph¸t ra tia s¸ng trong vi khuÈn lao ®ang sèng .

H×nh 4.5. Ph¸t hiÖn vi khuÈn lao Mycobacterium tubercolosis . (a) Bacteriophage (phage) ®Æc hiÖu cho M. tuberculosis cã mang gen s¶n xuÊt ra luciferaza ®îc ®a vµo m«i trêng nu«i cÊy cïng víi vi khuÈn . NÕu vi khuÈn lµ M. tuberculosis th× phage sÏ g¾n vµo thµnh tÕ bµo vµ bé gen (genome) cña phage vµo vi khuÈn . (b) Bé gen cña Phage cã gen Luciferaza ®îc cµi

vµo NST cña vi khuÈn . (c) Vi khuÈn b¾t ®Çu tæng hîp luciferaza . (d) Khi thªm luciferin vµ ATP vµo m«i Trêng th× enzym nµy sÏ ph©n gi¶i luciferin .(e) KÕt qu¶ cña sù ph©n gi¶i lµ ph¸t ra mét chíp s¸ng ®iÒu ®ã chØ r»ng vi khuÈn ®ã chÝnh lµ M. tuberculosis. NÕu lµ vi khuÈn kh¸c th× sÏ kh«ng cã chíp s¸ng ph¸t ra . Qu¸ tr×nh nµy x¶y ra nh sau : Mét Bacteriophage ®Æc hiÖu cho M.Tubercolosis ®îc mang gen Luciferaza bëi c«ng nghÖ di truyÒn . (Phage ®«i khi còng ®îc hiÓu lµ Mycophage còng nh Luciferase reporter phage). Sau ®ã mÉu phage ®îc nu«i cÊy cïng víi mét vi khuÈn cha biÕt . NÕu m«i Trêng cã M. Tuberculosis th× phage sÏ th©m nhËp vµo vi khuÈn vµ cµi vµo NST cña vi khuÈn ®ã cïng víi gen luciferaza .Vi khuÈn nµy ngay lËp tøc b¾t tay vµo viÖc tæng hîp luciferaza . B©y giê th× thªm vµo m«i trêng nu«i cÊy mét hîp chÊt g¾n víi Luciferaza lµ Luciferin cïng víi ph©n tö ATP n¨ng lîng cao . NÕu cã mÆt Luciferaza th× enzym nµy sÏ ph©n gi¶i luciferin vµ kÕt qu¶ lµ cã mét chíp s¸ng ph¸t ra . Dïng mét c«ng cô chuyªn dïng (luminometer) ®Ó ph¸t hiÖn tia s¸ng sÏ cho ngay kÕt qu¶ trong m«i trêng nu«i cÊy cã vi khuÈn lao hay kh«ng . KÕt qu¶ nµy gióp cho çc thÇy thuèc hoµn tÊt viÖc chÈn ®o¸n . §Ó x¸c ®Þnh ®é nh¹y c¶m hay kh¸ng thuèc th× quy tr×nh còng t¬ng tù nh trªn chØ trõ viÖc ®a thªm thuèc vµo m«i Trêng nu«i cÊy . NÕu vi khuÈn nhËy c¶m víi thuèc th× nã sÏ bÞ chÕt vµ nãi mét çch v¨n vÎ lµ “®Ìn hÕt s¸ng” (light go out) . Cßn nÕu chñng kh¸ng thuèc th× nã vÉn tiÕp tôc sèng vµ s¶n xuÊt ra Luciferaza . Mïa xu©n 1993, çc nhµ khoa häc ë New York k Albert Einstein College of Medicine and the University of Pittsburgh ®· th«ng b¸o ph¸t triÓn ®îc test nµy trªn t¹p chÝ Nature . Khi tõ “successful Test” ®îc ®¨ng t¶i trªn çc trang nhÊt cña çc t¹p chÝ th× viÖc chÈn ®o¸n bÖnh lao ®· trë nªn hÕt søc s¸ng sña . 4.3.3.ChÈn ®o¸n bÖnh Lyme. BÖnh Lyme lµ mét vÝ dô kh¸c cña bÖnh g©y ra bëi vi khuÈn cã thÓ ph¸t hiÖn ®îc b»ng ®Çu dß vµ kü thuËt PCR .§ã lµ mét bÖnh cña m« liªn kÕt g©y ra bëi xo¾n khuÈn Borrelia burgdorferi. Hµng n¨m ë Mü cã tíi 10.000 ngêi trong 45 bang m¾c bÖnh sèt, da næi ban vµ çc triÖu chøng kh¸c liªn quan. Nh÷ng ngêi nµy kh«ng ®îc ®iÒu trÞ ngay b»ng kh¸ng sinh mét çch å ¹t vµ diÔn tiÕn cña bÖnh lµ lµm ®uèi søc , ®«i khi g©y viªm khíp nÆng vµ çc di chøng thÇn kinh . Xo¾n khuÈn rÊt khã nh×n thÊy díi kÝnh hiÓn vi quang häc vµ gÇn nh kh«ng cã kh¶ n¨ng nu«i cÊy trong phßng thÝ nghiÖm , B. burgdorferi còng kh«ng ph¶i lµ ngo¹i lÖ (H×nh 4.6.) .

H×nh 4.6. Borrelia burgdorferi qua hiÓn vi ®iÖn tö quÐt ,®ã lµ xo¾n khuÈn g©y bÖnh Lyme . C«ng nghÖ DNA ngµy nay cã thÓ ph¸t hiÖn nhanh vi khuÈn nµy . N¨m 1975 khi lÇn ®Çu tiªn bÖnh nµy ®îc x¸c ®Þnh , viÖc chÈn ®o¸n chØ dùa trªn çc çc triÖu chøng , çc quan s¸t dÞch tÔ (tøc lµ nÕu bÞ ve bÐt c¾n) vµ çc test kh¸ng thÓ . Ph¶i nãi r»ng ch¼ng cã ph¬ng ph¸p nµo lµ hoµn toµn tin cËy vµ khi cha ®îc chÈn ®o¸n th× viÖc ®iÒu trÞ sÏ bÞ chËm trÔ . Tuy nhiªn , çc nhµ khoa häc ë phßng thÝ nghiÖm thuéc federal Rocky Mountain

ë Montana ®· thµnh c«ng trong viÖc sö dông PCR ®Ó khuÕch ®¹i DNA xo¾n khuÈn , hä dïng ®Çu dß DNA ®Ó ph¸t hiÖn Ýt nhÊt lµ 5 xo¾n khuÈn trong mét mÉu m¸u cña mét bÖnh nh©n . §©y lµ mét test bÊt thêng bëi sè xo¾n khuÈn trong m¸u thêng rÊt Ýt . Thªm mét gi¸ trÞ n÷a cña test lµ nã ph¸t hiÖn ®îc c¶ nh÷ng chñng chØ kh¸c nhau chót Ýt cña B. burgdorferi cã g©y ph¶n øng d¬ng tÝnh . §iÒu nµy rÊt quan träng bëi v× kh«ng cÇn thiÕt ph¶i dïng test kh¸ng thÓ ®Ó x¸c ®Þnh tÊt c¶ çc chñng . H¬n n÷a , test nµy cßn cßn cã thÓ ph©n biÖt ®îc B. burgdorferi tõ çc mÉu Borrelia g©y c¶m øng çc triÖu chøng cña bÖnh Lyme . Còng b»ng viÖc x¸c ®Þnh xo¾n khuÈn trùc tiÕp (h¬n lµ gi¸n tiÕp qua kh¸ng thÓ) , çc nhµ nghiªn cøu sÏ cã kh¶ n¨ng nghiªn cøu sù ph¸t triÓn bÖnh lý häc cña bÖnh . Ch¼ng h¹n nh ®iÒu quan träng lµ ph¶i hiÓu ®îc liÖu xo¾n khuÈn thùc sù cã mÆt ë giai ®o¹n muén cña bÖnh khi ®· cã çc biÕn chøng hay lµ çc biÕn chøng ®ã lµ do çc ®o¹n xo¾n khuÈn cßn n»m l¹i sau khi nã ®· ®îc lo¹i trõ ? 4.3.4.ChÈn ®o¸n bÖnh u nhó vµ çc bÖnh kh¸c . Mét Test ®· ®îc FDA phª chuÈn lµ test ®Çu dß DNA dïng ®Ó x¸c ®Þnh virut g©y u nhó ë ngêi (human papilloma virut –HPV) Virut nµy g©y nªn bÖnh môn c¬m sinh dôc (genital warts) ViraPap kit lµ mét test dïng ®Çu dß DNA t×m HPV trong çc mÉu cña m« lÊy tõ cæ tö cung phô n÷ .Còng gièng nh test AIDS , mét ®Çu dß DNA cã mét tr×nh tù baz¬ bæ cøu víi mét tr×nh tù baz¬ cña DNA cã ë mÉu m« . (Sù kh¸c biÖt hiÓn nhiªn lµ DNA tõ virut g©y u nhó trªn ngêi chø kh«ng ph¶i lµ virut AIDS) . Bëi v× mét sè HPV còng liªn quan tíi ung th cæ tö cung , v× thÕ test nµy ®· ®îc çc thÇy thuèc c«ng nhËn lµ cã thÓ sö dông ®Ó x¸c ®Þnh virut vµ lµm gi¶m bít kh¶ n¨ng g©y ung th . Nh÷ng n¨m gÇn ®©y ph¸t triÓn nhiÒu thuèc kh¸ng virut míi (ch¼ng h¹n nh acyclovir , ganciclovir) ®· lµm t¨ng nhu cÇu vÒ çc test míi cho çc bÖnh g©y bëi virut . Së dÜ nh vËy v× viÖc ®iÒu trÞ cã thÓ ®îc b¾t ®Çu sím nÕu ®· x¸c ®Þnh ®îc bÖnh .ë çc thËp kû tríc çc test còng ®îc lµm phÇn nµo víi nh÷ng ngêi m¾c çc bÖnh do virut . Test HIV vµ HPV lµ nh÷ng test tríc nhÊt trong sè çc test mµ chóng ta mong ®îi . Çc test ®Çu dß DNA ®èi víi viªm gan B , virut herpes simplex vµ çc test cho çc bÖnh g©y bëi virut tuyÕn níc bät còng ®· ë trong giai ®o¹n thùc nghiÖm vµ chóng sÏ ®îc ®a vµo sö dông trong l©m sµng nh÷ng n¨m tíi . Test viªm gan B nay ®· trë thµnh th¬ng phÈm ®îc sö dông trªn kh¾p hµnh tinh . Mét test dùa trªn c¬ së ph©n tÝch b»ng ®Çu dß DNA còng ®îc dïng cho çc bÖnh viªm quanh r¨ng . BÖnh viªm quanh r¨ng (periodontal disease) lµ mét bÖnh nhiÔm trïng g©y tho¸i ho¸ lîi dÉn ®Õn rông r¨ng . Mét c«ng ty c«ng nghÖ sinh häc ®· ph¸t triÓn mét ®Çu dß DNA ®Ó ph¸t hiÖn 3 mÉu vi khuÈn thêng liªn quan víi bÖnh nµy . Sù ph¸t hiÖn hiÖu qu¶ lµ ch×a kho¸ ®Ó chÈn ®o¸n bÖnh sím , n©ng cao hiÖu qu¶ ®iÒu trÞ vµ phßng ngõa t«t h¬n viÖc rông r¨ng . 4.4.Ph¸t hiÖn çc bÖnh do di truyÒn . Çc test dùa trªn c¬ së DNA còng cã gi¸ trÞ trong viÖc ph¸t hiÖn sù tiÒm tµng cu¶ çc bÖnh di truyÒn . Çc bÖnh di truyÒn thêng kh«ng thÓ chÈn ®o¸n ngay ®îc cho ®Õn tËn khi xuÊt hiÖn ®Çy ®ñ çc triÖu chøng cña nã .Tuy nhiªn, çc test DNA l¹i cã kh¶ n¨ng x¸c ®Þnh c¬ së di truyÒn cña nh÷ng bÖnh nµy .Nh÷ng ngêi m¾c çc bÖnh di truyÒn sÏ ®îc t vÊn vÒ çc vÊn ®Ò trong t¬ng lai còng nh ®îc khuyªn b¶o ®Ó lµm sao h¹n chÕ sù di truyÒn cña gen nµy . §ång thêi còng x©y dùng çc ph¬ng ph¸p ch÷a bÖnh b»ng gen . Tríc hÕt chóng ta h·y ®Ò cËp tíi mét sè bÖnh di truyÒn mµ ®Çu dß DNA ®· ®îc sö dông mét çch h÷u hiÖu trong nh÷ng n¨m qua . 4.4.1.BÖnh x¬ nang (Cystic Fibrosis). X¬ nang lµ mét bÖnh cã thÓ dïng ®Çu dß DNA ®Ó x¸c ®Þnh gen g©y bÖnh .Ngêi m¾c bÖnh x¬ nang s¶n xuÊt ra chÊt nhÇy dÝnh bÊt thêng lµm chÑn ®êng h« hÊp . (®Ó gióp trÎ kh¹c ra çc chÊt nhÇy ,cha mÑ ph¶i vç vµo lng nã nhiÒu lÇn). Hµng n¨m æ Hoa kú cã trªn 30.000 Trêng hîp trÎ em bÞ bÖnh x¬ ho¸ . Trong nh÷ng ®iÒu kiÖn b×nh thêng mét protein (®îc m· bëi mét gen ) lµm nhiÖm vô ®iÒu hoµ hÊp thu níc , gi÷ cho çc chÊt nhÇy ch¶y tù do däc theo bÒ mÆt cña ®êng h« hÊp . NÕu mét protein khiÕm khuyÕt (do mét gen khiÕm khuyÕt) ®îc tæng hîp th× níc sÏ ra khái bÒ mÆt ®êng h« hÊp vµ lµm cho chÊt nhÇy nµy cµng dÇy lªn .Mét kh¶o s¸t t¹i Mü cho thÊy cã 12 triÖu ngêi mang 2 b¶n sao gen khiÕm khuyÕt dÉn ®Õn bÖnh x¬ nang . N¨m 1989 bÖnh x¬ nang ®îc Francis Collin ë Trêng §¹i häc Michigan vµ Lap –chee Tsui ë viÖn nhi Toronto x¸c ®Þnh gen g©y bÖnh x¬ ho¸ n»m ë NST sè 7 cña ngêi . Sau ®ã Ýt l©u , ®Çu dß DNA ®îc ph¸t triÓn ®Ó gióp cho viÖc ®Þnh vÞ gen nµy .ViÖc tæng hîp mét ®Çu dß DNA lµ bíc quan träng ®Çu tiªn ®Ó cho phÐp çc nhµ nghiªn cøu t¹o ra ®îc çc b¶n sao b×nh thêng vµ bÊt b×nh thêng cña gen . N¨m 1990, çc nhµ nghiªn cøu ®· ®a çc gen CF b×nh thêng vµo vµo çc tÕ bµo bÞ bÖnh cña çc bÖnh nh©n x¬ nang trong çc èng nghiÖm trong phßng thÝ nghiÖm .Hä thËt sù tho¶ m·n khi thÊy çc tÕ bµo nµy ho¹t ®éng gièng nh çc tÕ bµo b×nh thêng .Ch¼ng h¹n nh mét ®Æc trng 52

cña x¬ nang lµ clo-rua kh«ng ®îc vËn chuyªn qua çc kªnh cña mµng tÕ bµo . Nhng trong çc thÝ nghiÖm ë labo th× çc kªnh më ra vµ clo-rua ®i ra ®i vµo mét çch tù do trong tÕ bµo . Khi gen CF ®îc x¸c ®Þnh , çc nhµ t vÊn cã thÓ ®Ó ngêi ta hiÓu r»ng con ch¸u hä còng sÏ mang çc gen CF trong çc b¶n sao . (H×nh 4.7.)

H×nh 4.7. Di truyÒn gen g©y bÖnh x¬ nang .BÖnh x¬ nang theo di truyÒn , tøc lµ bÖnh ®îc ph¶t triÓn khi cã cã mÆt 2 gen di truyÒn . Trong h×nh , c¶ bè vµ mÑ ®Òu mang gen di truyÒn (c) ®èi víi bÖnh x¬ nang nhng hä ®Òu kh«ng bÞ bÖnh bëi v× mçi ngêi ®Òu cã mét gen tréi (C) trong ®iÒu kiÖn b×nh thêng .Con ®îc di truyÒn theo tõng cÆp , mét b¶n sao tõ bè vµ mét b¶n sao tõ mÑ . V× thÕ cã 4 kh¶ n¨ng x¶y ra : 3 con b×nh thêng bëi v× chóng cã mét gen tréi (2 con cã mang gen CF) cßn mét con di truyÒn c¶ 2 gen g©y bÖnh vµ v× thÕ bÖnh ph¸t triÓn . Trong nh÷ng th¸ng tríc khi sinh cÇn ph¶i lµm test trªn çc m« thai thu ®îc b»ng thñ thuËt chäc mµng èi qua bông . Çc tÕ bµo cña thai ®îc ph©n lËp tõ çc mÉu cña dÞch mµng èi bao thai . Trong Trêng hîp lµ l«ng nhung mµng ®Öm th× mÉu l¸y tõ mµng ®Öm (líp phñ nµy gièng nh mµng ®Öm bao quanh thai) .Çc tÕ bµo tõ mµng ®Öm cho çc th«ng tin t¬ng tù nh çc tÕ bµo tõ dÞch mµng èi vµ v× mµng ®Öm ®îc h×nh thµnh tríc mµng èi nªn sù ph¸t hiÖn gen CF bÖnh lý cã thÓ ®îc thùc hiÖn sím h¬n . Mét bíc tiÕn míi vÒ b¶n chÊt ®· ®îc th«ng bµo n¨m 1992. Thay v× lÊy çc tÕ bµo cña thai ®Ó lµm Test x¸c ®Þnh gen CF, çc nhµ khoa häc ®· thµnh c«ng lµm test nµy trªn ph«i ë giai ®o¹n 8 tÕ bµo .Trong nghiªn cøu nµy çc ph«i ®îc thô tinh in vitro trong phßng thÝ nghiÖm . V× bè mÑ cã mang çc gen CF nªn sÏ cã 1 trong 4 c¬ héi ®Ó thai m¾c bÖnh . Çc nhµ nghiªn cøu ®· lÊy çc tÕ bµo tõ mçi ph«i vµ x¸c ®Þnh b»ng ®Çu dß DNA xem chóng cã hai , mét hay kh«ng cã b¶n sao nµo cña gen CF. Nh÷ng ph«i cã 1 hoÆc kh«ng cã b¶n sao nµo sÏ ®îc cÊy trë l¹i tö cung cña mÑ . ChÝn th¸ng sau , thËt vui mõng khi mét ®øa trÎ ra ®êi hoµn toµn khoÎ m¹nh . 4.4.2.BÖnh ®au c¬ Duchenne. Sù khiÕm khuyÕt gen còng liªn quan tíi bÖnh ®au c¬ Duchenne (tªn cña Guillaume Duchenne, nhµ thÇn kinh häc ngêi Ph¸p ®· m« t¶ bÖnh nµy n¨m 1968). Nh÷ng ngêi m¾c bÖnh nµy th× c¬ cña hä thiÕu mét protein lµm c¨ng c¬ Dystrophin (®îc vÝ nh v÷a x©y dùng) . ThiÕu dystrophin th× c¬ thÊm nhËp víi çc m« kh¸c , vµ bÞ gi·n ra . N¨m 1986 çc nhµ nghiªn cøu ë Trêng §¹i häc Harvard ®· x¸c ®Þnh ®îc gen m· cho dystrophin . §©y lµ mét trong nh÷ng gen lín nhÊt ®îc x¸c ®Þnh trong bé gen ngêi . BÖnh ®au c¬ Duchenne lµ mét bÖnh ®Æc biÖt , ph¸t triÓn ngÊm ngÇm ë trÎ em . Râ rµng lµ nh÷ng ®øa trÎ nµy sinh ra vÉn ph¸t triÓn mét çch b×nh thêng cho tíi kho¶ng 3 tuæi . Sau ®ã

dÇn dÇn ch©n cña chóng trë nªn kh«ng v÷ng vµng v× kh«ng cßn lùc vµ kh«ng kiÓm so¸t ®îc c¬ . §Õn 10 tuæi th× ph¶i gi÷ trªn ghÕ cã b¸nh xe ®Èy vµ thêng chÕt ë løa tuæi lªn 10 . Trong y häc hiÖn ®¹i , ngêi ta dïng ®Çu dß DNA ®Ó x¸c ®Þnh mét ®o¹n DNA n»m gÇn gen khiÕm khuyÕt g©y ra bÖnh ®au c¬ . §o¹n nµy chÝnh lµ RFLP . Nh ®· ®Ò cËp ë trªn , RFLP lµ mét ®o¹n dÊu chuÈn cña DNA víi nhiÒu d¹ng , mçi d¹ng cã mét chiÒu dµi kh¸c nhau . NÕu cã mÆt RFLP th× ch¾c ch¾n tíi 95% lµ cã gen g©y bÖnh ®au c¬ Duchenne. §Ó øng dông ph©n tÝch RFLP trong bÖnh Duchenne ngêi ta ph¶i thu thËp DNA tõ nhiÒu ngêi cã quan hÖ hä hµng gåm cha mÑ, «ng bµ , c« d× .v.v..MÉu RFLP tõ nh÷ng ngêi nµy ®îc sö dông ®Ó thiÕt lËp mÉu cho toµn thÓ gia ®×nh . RFLP cña mçi ç nh©n sÏ ®îc so s¸nh víi çc mÉu cña nh÷ng ngêi bÞ ¶nh hëng vµ kh«ng bÞ ¶nh hëng bëi gen g©y bÖnh ®Ó xem nã phï hîp víi mÉu nµo nhÊt . Lu ý quan träng r»ng kh«ng cã mét test chung nµo cho RFLP v× RFLP gi÷a çc gia ®×nh lµ kh¸c nhau . RFLP còng ®îc sö dông nh çc dÊu chuÈn ®Ó x¸c ®Þnh çc bÖnh di truyÒn . 4.4.3.BÖnh Huntington. Çc ®Çu dß DNA víi çc dÊu chuÈn RFLP còng ®îc sö dông ®Ó ph¸t hiÖn bÖnh Huntington .Chóng ta ®Òu biÕt bÖnh nµy ®· giÕt chÕt ca sÜ nh¹c folk (d©n gian ) Woody Guthrie n¨m 1967 .Huntington lµ mét bÖnh cã tõ khi mang thai vµ kh«ng ch÷a trÞ ®îc , nã huû ho¹i çc tÕ bµo n·o . TiÕn triÓn cña bÖnh lµ lµm háng hÖ thèng thÇn kinh vµ thêng dÉn ®Õn sù ®Ëp ph¸ ,di chuyÓn uèn Ðo , ®iªn vµ chÕt .(tªn cò cña bÖnh nµy lµ Huntington’s “cholereia” , cholereia theo gèc hy l¹p tøc lµ sù nh¶y móa tøc lµ sù di chuyÓn uèn Ðo). BÖnh nµy ®îc mang tªn George Huntington, b¸c sÜ ngêi Mü ®· nghiªn cøu bÖnh nµy håi ®Çu thÕ kû 20. Ngµy nay chóng ta biÕt r»ng bÖnh Huntington do mét gen khiÕm khuyÕt n»m s¸t ®Ønh NST sè 4 . Gen nµy ®îc ph©n biÖt bëi sè lÇn lÆp l¹i cña cËp 3 –CAG m· cho glutamin. ë phiªn b¶n b×nh thêng cña gen nµy th× cÆp 3 CAG lÆp l¹i tõ 11-34 lÇn , cßn ë bÖnh nh©n Huntington th× lÆp l¹i tíi 42-66 lÇn. (Còng gièng nh héi chøng gÉy nhiÔm s¾c thÓ X – mét bÖnh vËn ®éng khã kh¨n do tuû sèng tiÓu n·o sÏ ®îc ®Ò c¹p díi ®©y). Tuy nhiªn møc ®é cña sù lÆp l¹i cã liªn quan tíi tuæi cña bÖnh nh©n .Nh÷ng bÖnh nh©n trÎ th× cÆp 3 nµy lÆp l¹i nhiÒu h¬n . BÖnh xuÊt hiÖn do mét protein bÞ biÕn ®æi cÊu h×nh hoÆc bÞ khiÕm khuyÕt , protein nµy lµm chÕt çc tÕ bµo trong h¹ch c¬ b¶n (basal ganglia)- mét vïng quan träng nhÊt cña n·o ®èi víi chøc n¨ng vËn ®éng . Khi dïng ®Çu dß DNA ®Ó x¸c ®Þnh gen g©y bÖnh Huntington lÇn ®Çu tiªn James Gusella (H×nh 4.8.) ®· ®Þnh vÞ ®îc mét RFLP gi¸p ranh vaß n¨m 1984. Gusella vµ ®ång nghiÖp ®· dïng mét ®Çu dß DNA ®îc thiÕt kÕ lµ G8 dïng ®Ó t×m çc RFLP nghi ngê . Nhng hä l¹i kh«ng biÕt ch¾c ch¾n lµ RFLP cã g¾n víi G 8 ®óng hay kh«ng . ThËt may lµ hä cã mét gia ®×nh rÊt lín ®Ó nghiªn cøu –mét gia ®×nh sèng gÇn hå Maracaibo ë Venezuela . Gia ®×nh nµy bÞ suy tho¸i bëi cã mét phô n÷ bÞ t¸c ®éng bëi bÖnh Huntington , ngêi nµy di c tõ ch©u ¢u tíi ®©y tõ n¨m 1800. C«ng tr×nh cña nhµ t©m lý häc l©m sµng Nancy Wexler vµ Gusella cïng ®ång nghiÖp cã thÓ chØ râ nßi gièng cña gia ®×nh nµy qua 7 thÕ hÖ vµ sö dông ®Çu dß G8 hä ®· ph¸t hiÖn r»ng RFLP cã mÆt ë nh÷ng n¬i x¶y ra bÖnh . Mét ®iÒu râ rµng lµ cã sù t¬ng quan chÆt chÏ gi÷a RFLP vµ bÖnh Huntington . Khi t×m kiÕm RFLP dÊu chuÈn víi bÖnh Huntington , nhãm cña Gusella ®Æt kÕ ho¹ch sÏ tiÕn hµnh x¸c ®Þnh gen Huntington trong 10 n¨m . Çc nhµ nghiªn cøu ®· chuÈn bÞ çc tÕ bµo lai gi÷a ngêi vµ chuét trong ®ã mçi tÕ bµo chØ cã mét Ýt nhiÔm s¾c thÓ cña ngêi . Sau ®ã hä ph©n lËp DNA tõ çc NST ®· biÕt trong nh÷ng tÕ bµo nµy vµ g¾n nã víi ®Çu dß DNA G8 ®Ó xem sù g¾n kÕt cã x¶y ra kh«ng .KÕt qu¶ nghiªn cøu cña hä chØ râ r»ng DNA tõ çc tÕ bµo cã chøa NST sè 4 cña ngêi g¾n víi ®Çu dß G8.V× thÕ hä kÕt luËn NST sè 4 cã mang gen g©y bÖnh Huntington. N¨m 1993, nhãm cña Gusella héi th¶o quèc tÕ víi 6 ®¬n vÞ nghiªn cøu ®· th«ng b¸o r»ng hä ®· ®Þnh vÞ ®îc gen Huntington lµ n»m c¹nh ®Ønh cña NST sè 4 . Cho tíi 1996 vÉn cha cã Test trùc tiÕp cho gen Huntington , do ®ã RFLP dÊu chuÈn vÉn tiÕp tôc ®îc sö dông ®Ó t×m kiÕm gen khiÕm khuyÕt qua çc thÕ hÖ liªn tiÕp (test chÈn ®o¸n chÝnh gen ®ã th× vÉn cha cã thÓ, mét phÇn bëi gen nµy qu¸ phøc t¹p). ViÖc biÕt ®îc mét ngêi nµo ®ã cã gen dÊu chuÈn rÊt quan träng bëi v× bÖnh Huntington thêng ch¼ng cã triÖu chøng g× cho tíi tuæi trung niªn , vµ cho tíi thêi ®iÓm ®ã rÊt cã thÓ gen nµy ®· ®îc truyÒn l¹i cho thÕ hÖ sau råi .Tuy nhiªn , ®Æc trng nµy g©y bëi mét gen tréi , cho nªn chØ cã mÆt mét gen lµ bÖnh cã thÓ ®îc biÓu hiÖn . Hµng n¨m ë Mü cã tíi 20.000 ngêi m¾c bÖnh nµy . §èi víi Nancy Wexler , c«ng viÖc ë Venezuela vÉn tiÕp tôc . Hµng n¨m c« ®Òu trë l¹i hå Maracaibo vµ lÊy ®îc nhiÒu d÷ liÖu vµ thu ®îc nhiÒu mÉu m¸u ®Ó bæ sung thªm çc çc sè liÖu vµo biÓu ®å sù gia t¨ng cña bÖnh trong ®¹i gia ®×nh nµy .H¬n 12.000 ngêi trong ®¹i gia ®×nh hiÖn nay ®· ®îc lµm test vµ biÓu ®å vÒ nßi gièng ®¹i gia ®×nh nµy che lÊp c¶ 2 phÝa hµnh lang bªn ngoµi cña Trêng §¹i häc Colombia . §èi víi Nancy Wexler , c«ng viÖc nµy cßn cã sù quan t©m ç nh©n bëi v× b¶n th©n c« còng mang trong m×nh mét gen g©y bÖnh Huntington . 54

4.4.4.Héi chøng gÉy nhiÔm s¾c thÓ X . Mét bÖnh di truyÒn n÷a còng sö dông ®Çu dß DNA , ®ã lµ héi chøng gÉy nhiÔm s¾c thÓ X. DÊu hiÖu ®iÓn h×nh cña héi chøng nµy lµ cã sù chËm trÔ vÒ tinh thÇn (mental retardation). Mét kh¶o s¸t cho thÊy hµng n¨m ë Hoa kú cã 2000 phô n÷ vµ 1000 thanh niªn m¾c héi chøng nµy . Héi chøng nµy ®îc gäi nh vËy bëi v× nhiÔm s¾c thÓ X cña tÕ bµo (NST giíi tÝnh ë c¶ nam vµ n÷) cã mét ®èm nhá, t¹i ®ã NST cã thÓ ®îc c¶m øng m¹nh mÏ díi çc ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm . N¨m 1991, çc nhµ nghiªn cøu ®· ®Þnh vÞ ®îc gen bÖnh lý n¾m c¹nh ®èm nµy . Khi hä t¸ch dßng gen bÖnh lý vµ kiÓm tra tr×nh tù baz¬ cña nã hä ®· ph¸t hiÖn ®îc mét ®o¹n dµi trong ®ã cã 3 baz¬ ni t¬ ®îc lËp l¹i nhiÒu lÇn .Çc gen b×nh thêng th× ®o¹n lËp l¹i ng¾n cßn ë nh÷ng ngêi cã héi chøng gÉy nhiÔm s¾c thÓ X th× cã mét ®o¹n cùc dµi ®îc lÆp l¹i (gièng nh mét ®µn accordion ®ang më ) . V× gen b×nh thêng ho¹t ®éng trªn n·o nªn nÕu cã mét gen bÖnh ho¹t ®éng th× cã thÓ g©y nªn sù chËm trÔ tinh thÇn . Tuy nhiªn , vÒ c¬ chÕ th× vÉn cha râ . Cho tíi n¨m 1991 ®Ó ph¸t hiÖn héi chøng gÉy nhiÔm s¾c thÓ X ngêi ta ®· nu«i cÊy çc tÕ bµo b¹ch cÇu cña mét ngêi bÖnh trong phßng thÝ nghiÖm vµ kiÓm tra b»ng hiÓn vi xem cã ph¶i nhiÔm s¾c thÓ X bÞ gÉy hay kh«ng . Vµ còng n¨m ®ã mét c«ng ty c«ng nghÖ sinh häc th«ng b¸o ®· chÕ t¹o ®îc test ®Çu dß DNA ®Ó ph¸t hiÖn gen khiÕm khuyÕt nµy . Th«ng b¸o ®îc ®a ra sau mét th¸ng ph¸t hiÖn ®îc gen nµy . §Çu dß nµy ®· bÝt l¹i çc nucleotit lÆp l¹i vµ x¸c ®Þnh ®îc çc tÕ bµo sÏ ph¸t triÓn héi chøng gÉy nhiÔm s¾c thÓ X . 4.4.5.U nguyªn bµo vâng m¹c . U nguyªn bµo vâng m¹c lµ mét bÖnh ung th hiÕm gÆp ë m¾t , hµng n¨m cã kho¶ng 200 trÎ em Hoa kú bÞ t¸c ®éng bëi bÖnh nµy . MÆc dÇu thêng ph¶i phÉu thuËt lo¹i bá nh·n cÇu , nhng mét sè ph¬ng ph¸p kÐm hiÖu qu¶ h¬n còng ®îc øng dông trong ch÷a trÞ nh tia x¹, phÉu thuËt la ze , lµm ®«ng l¹nh v.v.. nÕu ®îc ph¸t hiÖn sím . Trong nh÷ng n¨m 1970 , çc nhµ nghiªn cøu quan s¸t thÊy r»ng con cña nh÷ng bÖnh nh©n m¾c bÖnh u nguyªn bµo vâng m¹c còng ph¸t triÓn bÖnh u nguyªn bµo vâng m¹c .Vµ râ rµng lµ khuynh híng dÉn tíi ung th nµy cã thÓ ®îc di truyÒn . Tíi nh÷ng n¨m 1980 , nh÷ng cuéc kh¶o s¸t cã sö dông ®Çu dß DNA ®· ®Þnh vÞ ®îc ®o¹n DNA bÞ mÊt (®o¹n DNA bÞ ®ét biÕn) ë vïng q14 cña NST sè 13 ë nh÷ng bÖnh nh©n u nguyªn bµo vâng m¹c (H×nh 4.8.) . Sau ®ã ngêi ta thÊy bÖnh cã liªn quan tíi sù khiªm khuyÕt cña NST .

H×nh 4.8. Sù ph¸t triÓn cña u nguyªn bµo vâng m¹c . (a) ë ngêi b×nh thêng ®o¹n q14 cña NST sè 13 cã chøc n¨ng . (b) khi mét NST bÞ ®ét biÕn ë vïng q14 th× vÉn lµ ngêi b×nh thêng nhng cã mang gen u nguyªn bµo vâng m¹c . (c) Khi c¶ 2 NST ®Òu bÞ ®ét biÕn th× bÖnh míi ph¸t triÓn . Cuèi cïng tíi n¨m 1986 , çc nhµ nghiªn cøu ë Massachusetts Eye and Ear Infirmary ë Boston ®· ph©n lËp ®îc gen ®iÒu khiÓn bÖnh u nguyªn bµo vâng m¹c . Mét ®iÒu râ rµng lµ gen nµy c¶m øng ung th kh«ng ph¶i b»ng sù cã mÆt cña nã (nh ®· thÊy ë çc gen g©y ung th kh¸c) mµ bëi sù v¾ng mÆt hay mÊt chøc n¨ng cña nã (do mét ®o¹n bÞ mÊt do ®ét biÕn ).Trong Trêng hîp nµy , gen b×nh thêng chÝnh lµ gen kh¸ng ung th . Sù kh¸m ph¸ ra gen g©y ung th nguyªn bµo vâng m¹c lµ khuynh híng lín trong khoa häc bëi v× nã quan t©m tíi çc gen ung th do bÞ tho¸i ho¸ . ( Chóng ta ®· biÕt râ gen g©y ung th ®i tõ çc gen tiÒn ung th sau ®ã míi chuyÓn thµnh gen ung th ). Çc gen ung th tho¸i ho¸ lµ çc gen ®îc ®ãng l¹i vÜnh viÔn . Tuy nhiªn , muèn x¶y ra ung th th× ph¶i cã 2 b¶n sao . Khi cã ®ét biÕn hay cã sù sai sãt ngÉu nhiªn khi sao chÐp th× sÏ t¹o nªn mét gen thø hai g©y ung th . ViÖc s¨n lïng çc gen g©y ung th tho¸i ho¸ kh¸c vÉn ®ang ®îc tiÕp tôc . 4.4.6.BÖnh Alzheimer. Alzheimer lµ bÖnh tho¸i ho¸ ë n·o . Hµng n¨m cã tíi 2,5 triÖu ngêi Mü bÞ t¸c ®éng bëi bÖnh nµy .Nã lµ nguyªn nh©n g©y chÕt ®øng hµng thø 4 ®èi víi nh÷ng ngêi g×a ë Mü .Tªn cña bÖnh ®îc lÊy theo tªn cña nhµ thÇn kinh häc ngêi §øc Alois Alzheimer nh÷ng n¨m ®Çu 1990. §ã lµ mét bÖnh ®i cïng víi viÖc mÊt chøc n¨ng trÝ tuÖ (lo¹n trÝ) , mÊt trÝ nhí vµ mÊt hÕt çc kh¶ n¨ng nãi chung . BÖnh nh©n thêng kh«ng nãi ®îc , ®i l¹i khã kh¨n hoÆc kh«ng híng ®îc tíi nh÷ng ®iÒu thÝªt yÕu nhÊt cña hä . Qua nhiÒu n¨m , çc nhµ khoa häc kh«ng gi¶i thÝch ®îc nguyªn nh©n cña bÖnh Alzheimer . Tíi n¨m 1987 , çc nhµ nghiªn cøu ë mét vµi viÖn ®· x¸c ®Þnh ®îc mét gen ®Æc hiÖu c¶m øng çc m« n·o ®Æc trng cho bÖnh nµy . HÇu nh ®ång thêi , çc nhãm khoa häc kh¸c còng th«ng bµo r»ng nhê viÖc sö dông ®Çu dß DNA hä ®· ®Þnh vÞ ®îc mét dÊu chuÈn di truyÒn (genetic

marker) cña bÖnh nµy trªn NST sè 21 cña ngêi .MÆc dÇu çc ph¸t hiÖn nµy kh«ng gîi ý ®îc r»ng tÊt c¶ çc trêng hîp Alzheimer ®Òu cã liªn quan tíi di truyÒn , nhng hä còng chØ râ cã Ýt nhÊt lµ mét d¹ng Alzheimer gia ®×nh (familial Alzheimer’s disease) (FAD) lµ cã thÓ ®îc di truyÒn . Gen FAD ®¸p øng cho viÖc s¶n xuÊt mét protein cã tªn lµ Amyloid . Amyloid lµ thµnh phÇn chÝnh cña çc m¶ng chÕt cña çc sîi thÇn kinh ( ®· chÕt) , nã sÏ kÑp chÆt n·o cña bÖnh nh©n . Cho tíi thêi ®iÓm nµy Amyliod vÉn cha ph¶i lµ ch×a kho¸ cho sù hiÓu biÕt vÒ Alzheimer . RÊt cã thÓ lµ gen Amyloid cïng víi çc yÕu tè m«i trêng kh¸c sÏ lµm cho bÖnh biÓu hiÖn . NhiÒu nhµ thÇn kinh häc th× l¹i cho r»ng Alzheimer cã liªn quan tíi mét virut nµo ®ã . 4.4.7. BÖnh s¬ cøng teo c¬ cét bªn (Amyotrophic lateral sclerosis ). S¬ cøng teo c¬ cét bªn (ALS) lµ mét bÖnh tho¸i ho¸ neuron vËn ®éng cña n·o vµ d©y xo¾n (spiral cord) . ALS t¸c ®éng kho¶ng 5000 ngêi Mü hµng n¨m vµ thêng ®îc gäi lµ bÖnh Lou Gehrig . §ã lµ mét ngêi Mü ®Çu tiªn ë New York bÞ bÖnh nµy. . Do bÞ huû ho¹i neuron vËn ®éng nªn dÉn ®Õn c¬ bÞ yÕu , vµ ngêi bÖnh ph¶i “bß” råi chÕt . Héi chøng nµy thêng x¶y ra ë løa tuæi tõ 35-70 tuæi vµ thêng chÕt sau 3-5 n¨m . Cã kho¶ng 5%-10% ALS lµ di truyÒn l¹i cho thÕ hÖ sau , cßn nh÷ng trêng hîp kh¸c th× “rêi r¹c” . MÉu di truyÒn nµy ®· thu hót çc nhµ di truyÒn ph©n tö víi bÖnh ALS tõ nh÷ng n¨m 1980 vµ cùc ®iÓm lµ 1993 , hä ®· ph¸t hiÖn ra gen cña d¹ng di truyÒn nµy ®ã lµ ALS gia ®×nh (familial ALS) . Trong çc ®iÒu kiÖn b×nh thêng , gen b×nh thêng gäi lµ sod1 , m· cho enzym superoxit dismutaza. Enzym nµy gióp tÕ bµo lo¹i trõ çc ph©n tö cã ho¹t tÝnh o xy ho¸ cao vµ cã ®éc tÝnh ®ã lµ çc gèc tù do . (Çc gèc tù do ®· ¶nh hëng ®Õn bÖnh Parkinson, Alzheimer vµ çc qu¸ tr×nh liªn quan tíi tuæi t¸c ). ThiÕu superoxit dismutaza th× lîng gèc tù do t¨ng cao vµ neuron bÞ huû ho¹i do nhiÔm ®éc , dÇn dÇn dÉn tíi ALS . Mét nhãm nghiªn cøu vÒ gen ®îc thµnh lËp n¨m 1993 gåm 31 nhµ khoa häc tõ 4 quèc gia , ®øng ®Çu lµ Robert Brown vµ Robert Horvitz . Nhãm nghiªn cøu tríc tiªn tËp trung vµo gen superoxit dismutaza ë NST sè 21 , sau ®ã ph¸t hiÖn ra gen nµy bi ®ét biÕn ë nh÷ng bÖnh nh©n tõ 13 gia ®×nh cã çc thµnh viªn m¾c bÖnh ALS . Hä thÊy ®ét biÕn xÈy ra ë 11 vÞ trÝ kh¸c nhau . Mçi ®ét biÕn ®Òu dÉn ®Õn viÖc lo¹i ®i mét amino axit ë phÇn ch×a kho¸ cña enzym (trung t©m ho¹t ®éng) .DNA cña nh÷ng ngêi b×nh thêng th× kh«ng bÞ ®ét biÕn . Dùa trªn çc kÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy ALS cã liªn quan tíi sù khiÕm khuyÕt trong ho¹t ®éng cña enzym superoxit dismutaza vµ dÉn tíi sù tÝch tô çc gèc tù do . Chóng ta còng biÕt cã rÊt nhiÒu loaÞ thuèc nh vitamin C, E cã kh¶ n¨ng lo¹i trõ çc gèc tù do vµ còng thËt dÔ hiÓu khi nã ®îc dïng ®Ó lµm gi¶m sù t¸c ®éng cña ALS . 4.4.9.BÖnh tiÓu ®ê ng. Nh÷ng ngêi m¾c bÖnh tiÓu ®êng kh«ng sö dông ®îc Glucoza trong qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ vµ còng khã thu nhËn n¨ng lîng ho¸ häc mµ nã cã . Díi çc ®iÒu kiÖn b×nh thêng , tuþ s¶n sinh ra hormon Insulin ®Ó thóc ®Èy chuyÓn ho¸ Glucoza .ë bÖnh tiÓu ®êng typ I (ph¸t sinh khi cßn trÎ) th× chøc n¨ng cña nh÷ng tÕ bµo s¶n xuÊt ra insulin cña tuþ lµ kh«ng thÝch øng , nã kh«ng t¹o ®îc ®ñ lîng Insulin ®Ó ®¸p l¹i víi sù trao ®æi n¨ng lîng (sù tiªu hao n¨ng lîng ). Trong Trêng hîp nµy khi tiªm insulin ®îc s¶n xuÊt b»ng c«ng nghÖ di truyÒn th× bÖnh sÏ thuyªn gi¶m .Cßn trong tiÓu ®êng typ II (ph¸t sinh khi trëng thµnh) th× c¬ thÓ mÊt kh¶ n¨ng sö dông insulin ngay c¶ khi çc tÕ bµo tuþ s¶n xuÊt ®ñ lîng insulin . TiÓu ®êng typ II Ýt nguy hiÓm nhng l¹i t¸c ®éng tíi 10 triÖu ngêi Mü hµng n¨m . Cã thÓ ®iÒu trÞ bÖnh nµy b»ng çch kiÓm so¸t träng lîng vµ chÕ ®é ¨n . MÆc dï nguyªn nh©n ph¸t sinh bÖnh th× vÉn cha ®îc x¸c ®Þnh , nhng theo thuyÕt ®ang thÞnh hµnh th× kh¼ng ®Þnh lµ do çc tÕ bµo cña c¬ thÓ kh«ng ph¶n øng víi insulin bëi v× thiÕu vÞ trÝ receptor cÇn thiÕt trªn bÒ mÆt tÕ bµo cña chóng . V× insulin thêng thóc ®Èy glucoza ®i vµo çc tÕ bµo cña c¬ thÓ , do ®ã nÕu thiÕu çc vÞ trÝ receptor nµy th× chøc n¨ng cña insulin kh«ng cßn n÷a . Mét d¹ng kh«ng phæ biÕn tiÓu ®êng typ II lµ tiÓu ®êng l¹i ph¸t sinh ë nh÷ng ngêi trÎ (maturity –onset diabetes of the young ) (MODY). TiÓu ®êng typ II thêng ph¸t triÓn sau tuæi 25 ®Õn 30 , cßn MODY l¹i ph¸t sinh ngay khi cßn lµ thanh niªn hay díi 20 tuæi . N¨m 1992 , çc nhµ nghiªn cøu ë Trêng §¹i häc Chicago ®øng ®Çu lµ Graem Bell th«ng b¸o r»ng MODY cã thÓ ph¸t triÓn ®îc lµ do sù khiÕm khuyÕt mét gen cã liªn quan tíi enzym Glucokinaza. Çc nhµ nghiªn cøu ®· theo ®uæi mét dÉy çc nghiªn cøu kÕt hîp cïng víi çc nhµ khoa häc Ph¸p . Hä ®· x¸c ®Þnh ®îc mét gen ®Æc hiÖu trªn NST sè 7 . §ã lµ gen ®¸p øng cho viÖc s¶n xuÊt Glucokinaza. Râ rµng çc tÕ bµo tuþ ®ßi hái enzym nµy ph¶i ph¸t hiÖn ®îc nång ®é glucoza trong m¸u . Nhãm cña Bell chØ râ r»ng cã mét gen khiÕm khuyÕt ®· lµm cho bÖnh nh©n MODY s¶n xuÊt kh«ng ®ñ Glucokinaza vµ thiÕu enzym nµy th× viÖc tiÕt insulin cña tuþ bÞ ph¸ vì . (§©y lµ mét 57

quan ®iÓm míi vÒ sù ph¸t triÓn bÖnh tiÓu ®¬ng v× cho r»ng nã kh«ng phô thuéc vµo vÞ trÝ çc receptor hoÆc do thiÕu insulin ). Trong nh÷ng nghiªn cøu kÕ tiÕp çc nhµ nghiªn cøu còng x¸c ®Þnh ®îc sù khiÕm khuyÕt cïng mét gen trong mét gia ®×nh bÞ tiÓu ®êng typ II d¹ng phæ th«ng h¬n . Khi tr×nh diÔn nh÷ng kÕt qu¶ cña m×nh , nhãm cña Bell ®· sö dông PCR ®Ó khuÕch ®¹i nh÷ng phÇn m· cho gen glucokinaza trong çc mÉu DNA lÊy tõ nh÷ng ngêi b×nh thêng vµ nh÷ng ngêi bÞ bÖnh tiÓu ®êng . Sau ®ã hä sµng läc çc chÊt liÖu di truyÒn b»ng ®Çu dß DNA ®Ó ph¸t hiÖn çc ®ét biÕn . Çc nhµ khoa häc ®· ph¸t hiÖn r»ng cã sù kh¸c nhau vÒ mét baz¬ ni t¬ ®¬n ë DNA nh÷ng ngêi bÞ tiÓu ®êng . Sô ph¸t hiÖn nµy gîi l¹i h×nh ¶nh vÒ bÖnh thiÕu m¸u do çc tÕ bµo h×nh lìi liÒm ®· ®îc ®Ò cËp ë trªn . Vµ thËt dÔ hiÓu , ®Ó söa ch÷a nh÷ng khiÕm khuyÕt nµy th× chØ cã thÓ nhê tíi gen trÞ liÖu . N¨m 1993 çc nhµ khoa häc quèc tÕ ®· x¸c nhËn nh÷ng kÕt qu¶ nµy vµ con sè ®ét biÕn ®· lªn tíi vµi t¸ . 4.4.10.Ph¸t hiÖn bÖnh ung th . Râ rµng lµ çc d¹ng x¸c ®Þnh cña bÖnh tiÓu ®êng cã liªn quan ®Õn mét yÕu tè di truyÒn vµ còng râ rµng lµ sù ph¸t triÓn cña ung th lµ kÕt qu¶ t¸c ®éng cña çc yÕu tè ngÉu nhiªn cïng çc th¶m ho¹ cña m«i trêng , tøc lµ nã còng lµ mét s¶n phÈm cña di truyÒn .Ch¼ng h¹n nh çc nhµ ung th häc ®· tÝnh to¸n cã kho¶ng 10% ngêi bÞ u h¾c s¾c tè th× ngay tõ bÈm sinh ®· nh¹y c¶m víi ung th .ViÖc ph¸t hiÖn çc gen ®Æc hiÖu hiÓn nhiªn lµ cã sù liªn quan gi÷a viÖc ph¸t hiÖn ra nh÷ng ngêi dÔ m¾c ung th vµ viÖc ph¸t triÓn çc çch ®iÒu trÞ míi . Çc nhµ khoa häc ®· t×m thÊy mét vµi gen cã thÓ nh¹y c¶m víi u h¾c s¾c tè n»m ë NST sè 1 vµ sè 9. Çc gen liªn quan tíi mét lo¹i ung th kh¸c còng ®îc ph¸t hiÖn . Gen ®ã cã tªn lµ p53 (bëi v× protein ®îc gen nµy m· ho¸ cã TLPT lµ 53 kilodalton) . Mét çch hiÓn nhiªn , ®ã lµ mét gen kiÒm chÕ khèi u (tumor suppressing gene) .Gen nµy lÇn ®Çu tiªn ®îc t¸ch dßng vµo n¨m 1986 , p53 ®· cho mét h×nh ¶nh chung cho tÊt c¶ çc khèi u vµ ung th , cã thÓ vÝ gen nµy nh mét ngêi g¸c cöa cho DNA cña tÕ bµo . Khi cã sù huû ho¹i trong DNA cña tÕ bµo (tøc lµ sù huû ho¹i dÉn ®Õn h×nh thµnh khèi u) th× p53 m· cho mét protein g¾n däc theo DNA bÞ huû ho¹i nµy vµ øc chÕ sù sao chÐp . V× ho¹t ®éng theo kiÓu nh thÕ nªn p53 cho phÐp tÕ bµo cã thêi gian ®Ó söa ch÷a DNA cña nã , nh vËy tr¸nh ®îc viÖc truyÒn çc gen g©y ung th , çc gen lçi tíi çc tÕ bµo con ch¸u trong ph©n bµo cã t¬ (mitosis). Nh vËy p53 ho¹t ®éng nh mét gen øc chÔ khèi u nh»m tr¸nh cho tÕ bµo kh«ng bÞ ung th ho¸ . Vai trß cña p53 l¹i cµng ®¸nh gi¸ cao bëi v× nã phôc håi l¹i çc phiªn b¶n ®· bÞ biÕn ®æi trong çc tÕ bµo ung th cña çc bÖnh nh©n ung th kÕt trµng ,ung th vó , ung th n·o, x¬ng , phæi , da , bµng quang vµ ung th cæ tö cung . §Çu dß DNA vµ PCR lµ nh÷ng kü thuËt chÝnh dïng ®Ó x¸c ®Þnh gen nµy. N¨m 1992, çc nhµ nghiªn cøu ë Trêng §¹i häc John Hopkins ®· ph©n lËp ®îc 4 protein ®îc m· bëi p53 vµ íc ®Þnh r»ng chøc n¨ng øc chÕ phô thuéc vµo h¬n mét protein ®¬n (tøc phô thuéc vµo nhiÒu protein ®¬n). VÊn ®Ò vÒ nguån gèc cña p53 còng ®îc nhiÒu nhµ nghiªn cøu qua t©m . Nguyªn nh©n chñ yÕu vÉn lµ çc ®éc tè cña m«i trêng lµm thay ®æi gen p53 ®Ó t¹o nªn çc d¹ng ®ét biÕn vµ mét bíc ®i sai vÒ sinh ho¸ trong sù sao chÐp DNA còng cã thÓ lµ mét nghuyªn nnh©n . H¬n n÷a , nh÷ng ®ét biÕn nµy l¹i cã nhiÒu kh¶ n¨ng di truyÒn l¹i v× thÕ nã ñng hé cho quan ®iÓm cho r»ng cã nh÷ng d¹ng ung th ®îc di truyÒn trong çc gia ®×nh . Ngêi ta cã thÓ chèng l¹i ®îc sù sao chÐp qu¸ møc nµy , tuy nhiªn hiÖn tîng ung th qu¶ thËt qu¸ phøc t¹p nªn con ®êng ®i tíi trong viÖc chÈn ®o¸n vµ ®iÒu trÞ ung th vÉn lµ vÊn ®Ò rÊt nan gi¶i . 4.4.8.Ng©n hµng gen §Çu dß DNA cã kh¶ n¨ng víi nhiÌu môc ®Ých nh ta ®· thÊy , nhng nã cha cã kh¶ n¨ng x¸c ®Þnh ®îc v« sè çc bÖnh nh ung th vó , phæi hay çc d¹ng ung th th«ng thêng kh¸c . Tiªn liÖu mét ngµy nµo ®ã ®Çu dß DNA sÏ cã kh¶ n¨ng mêi mäi ngêi tíi chç lu tr÷ DNA cña hä ®ã lµ ng©n hµng gen . Muèn thiÕt lËp mét ng©n hµng gen th× ph¶i cã mét viÖn s½n sµng t¸ch chiÕt , lµm ®«ng kh« ,vµ tËp hîp DNA cña tõng ngêi .ë San francisco cã Ýt nhÊt mét bÖnh viÖn tham gia ch¬ng tr×nh nµy . Tuy nhiªn , ph¶i lo kinh phÝ ®Ó lÊy m¸u tõ mçi ç nh©n vµ DNA cña b¹ch cÇu sÏ ®îc lu trong kho . Khi ®Çu dß ph¸t hiÖn mét bÖnh nµo ®ã ph¸t triÓn th× DNA ®ã ®îc lµm tan vµ test çc gen g©y bÖnh .Theo çc nhµ nghiªn cøu , ng©n hµng gen thÝch hîp cho nh÷ng ngêi muèn biÕt liÖu hä cã mang mét gen nguy hiÓm nµo kh«ng nh ung th vó ch¼ng h¹n .MÆc dÇu sù co r·n cña bÖnh tËt cßn phô thuéc vµo sù t¬ng t¸c phøc t¹p gi÷a gen vµ çc yÕu tè m«i trêng , nhng mét ngêi phô n÷ khi biÕt r»ng m×nh cã mang dÊu chuÈn di truyÒn vÒ ung th vó th× cã thÓ lµm gi¶m thiÓu nh÷ng ruØ ro b»ng çch thay ®æi l«Ý sèng ch¼ng h¹n .§Ó kÕt luËn xem çc dÊu chuÈn gen cã mÆt hay kh«ng th× ph¶i ph©n tÝch DNA tõ nh÷ng ngêi hä hµng Ýt nhÊt tõ 2 thÕ hÖ , bao gåm 58

c¶ mét sè ngêi m¾c bÖnh . Ng©n hµng gen ®¶m b¶o r»ng cã thÓ thu thËp ®îc DNA tõ nh÷ng ngêi hä hµng khi hä vÉn ®ang cßn sèng .DÜ nhiªn khi biÕt cã mét dÊó chuÈn cña mét bÖnh nµo ®ã th× ngêi ta kh«ng khái b¨n kho¨n , nhng ®èi víi nhiÒu ngêi th× sù thiÕu hiÓu biÕt vÉn nhiÒu h¬n lµ sù sî h·i . 4.5. øNG DôNG GEN TRÞ LIÖU TRONG L¢M SµNG. 4.5.1. §iÒu trÞ bÖnh thiÕu hôt miÔn dÞch tæ hîp trÇm träng (SCID). Hµng n¨m t¹i Hoa kú cã kho¶ng 40 trÎ em m¾c bÖnh ThiÕu hôt miÔn dÞch tæ hîp trÇm träng (SCID) . Mét nöa sè bÖnh nh©n THMDTHTT ®îc nghiªn cøu thÊy cã mét gen khiÕm khuyÕt trong çc tÕ bµo , v× thÕ nã kh«ng m· ®îc cho mét enzym ®Æc hiÖu .NÕu thiÕu gen b×nh thêng th× enzym kh«ng ®îc tæng hîp . Enzym ®ã lµ Adenozin Desaminaza (ADA). Enzym nµy gióp cho viÖc ph©n giaØ çc s¶n phÈm axit nucleic cña tÕ bµo . NÕu kh«ng cã ADA trong lympho T th× mét enzym Kinaza sÏ chuyÓn ®æi mét s¶n phÈm chuyÓn ho¸ thµnh ®éc tè , vµ ®éc tè nµy sÏ ph¸ huû lympho T . Lympho T lµ mét tÕ bµo rÊt cÊn thiÕt cña hÖ miÔn dÞch , nã ch¼ng nh÷ng tham gia trùc tiÕp trong çc ®¸p øng miÔn dÞch mµ cßn kiÓm so¸t sù ho¹t ®éng cña lympho B –lo¹i tÕ bµo s¶n sinh kh¸ng thÓ . V× thÕ thiÕu hôt ADA sÏ lµm cho c¬ thÓ mÊt c¬ chÕ b¶o vÖ cña c¶ 2 lo¹i tÕ bµo lympho . DÜ nhiªn khi mÊt kh¶ n¨ng b¶o vÖ th× bÖnh nh©n kh«ng cã kh¶ n¨ng chèng l¹i sù x©m nhiÔm cña çc bÖnh .ChÕt v× çc bÖnh truyÒn nhiÔm lµ hËu qu¶ cña bÖnh SCID. Mïa hÌ 1990 , çc nhµ nghiªn cøu thuéc viÖn quèc gia y tÕ Hoa kú (National Institute of Health –NIH) ®· nhËn thö øng dông GTL ®èi víi bÖnh thiÕu hôt ADA . (Gen ADA n»m trªn NST sè 20 cña ngêi vµ cã 32.000 cÆp baz¬ , 12 exon) . §øng ®Çu nhãm nghiªn cøu lµ R.Michael Blaese , W. French Anderson vµ Kenneth Culver .Çc nhµ nghiªn cøu ®· ®a gen ADA vµo çc tÕ bµo lympho cña çc bÖnh nh©n SCID ®· ®îc chän läc . §Ó thùc hiÖn viÖc ®ã çc nhµ nghiªn cøu ph¶i rót hÕt çc tÕ bµo lympho ra khái bÖnh nh©n vµ ph¬i bÇy çc tÕ bµo cã hµng tû retrovirut cã mang çc gen s¶n xuÊt ADA .Sau khi çc gen ADA ®· ®îc ®a vµo NST cña tÕ bµo lympho th× çc tÕ bµo nµy sÏ ®îc ®a trë l¹i cho bÖnh nh©n . NÕu mäi viÖc xu«ng xÎ , çc gen ADA sÏ m· cho enzym ADA vµ lo¹i trõ sù thiÕu hôt enzym nµy . Sau vµi tuÇn l¹i lËp l¹i qui tr×nh nµy bëi v× çc tÕ bµo lympho chØ tån t¹i trong c¬ thÓ vµi th¸ng . §Ó ®îc phª chuÈn thùc nghiÖm ADA çc nhµ khoa häc ph¶i xin ý kiÕn cña nhiÒu c¬ quan chøc n¨ng , trong ®ã cã Uû ban cè vÊn DNA t¸i tæ hîp cña viÖn NIH (NIH recombinant DNA advisory Commitee-RAC) , ý kiÕn cña Human Gene Theory Subcommitee of RAC (tiÓu ban lý thuyªt GTL cña RAC) , thø 3 lµ sù phª chuÈn cña gi¸m ®èc NIH vµ thø 4 lµ ý kiÕn phª chuÈn cña FDA . C«ng viÖc nµy ph¶i mÊt 3,5 n¨m míi hoµn tÊt . Cuèi cïng , vµo 14-9-1990 çc tÕ bµo biÕn ®æi gen ®Çu tiªn ®· ®îc ®a vµo m¹ch m¸u cña mét c« bÐ 4 tuæi lµ Ashanti . Mïa xu©n 1991, Blaese th«ng b¸o víi uû ban GTL r»ng çc tÕ bµo lympho ®· ®îc thiÕt lËp l¹i (®îc c«ng nghÖ ho¸) ®· sèng ®îc trong hÖ tuÇn hoµn cña c« g¸i nµy . H¬n n÷a l¹i cã b»ng chøng lµ çc tÕ bµo nµy tån t¹i cßn tèt h¬n c¶ çc tÕ bµo lympho cña c« ta .Tuy nhiªn, lîng ADA ®îc t¹o ra bëi çc tÕ bµo lympho biÕn ®æi gen ph¶i t¨ng dÇn dÇn theo thêi gian vµ ph¶i ®¹t tíi 18% møc b×nh thêng . Thªm vµo ®ã ngêi ta còng thÊy kh¶ n¨ng s¶n xuÊt ra kh¸ng thÓ cña c« g¸i nµy còng t¨ng lªn ®¸ng kÓ . Trong mét cuéc trß chuyªn víi cha cña c« g¸i «ng ®· m« t¶ gen ADA ®îc cµi vµo nh lµ mét “gen cêi” (laughing gene) vµ “nã lµ mét ®øa trÎ h¹nh phóc h¬n nh÷ng ngêi kh¸c” «ng nãi , “Bëi v× ch¸u ®îc khoÎ h¬n” . Còng vµo thêi ®iÓm ®ã mét c« g¸i thø hai 9 tuæi lµ Cynthia còng ®îc trÞ liÖu theo çch nµy . LiÖu tr×nh b¾t ®Çu tõ 30-1-1991 . Víi bÊt kú mét ph¬ng ph¸p ®iÒu trÞ nµo còng vËy ®Òu cã çc mét vµi ý kiÕn tr¸i ngîc , víi GTL trªn bÖnh nh©n thiÕu hôt ADA còng vËy .Ch¼ng h¹n nh ngêi ta ®ßi hái cÇn ph¶i ban hµnh nh÷ng quy ®Þnh ®Çy ®ñ vÒ tÝnh an toµn bëi v× çc bÖnh nh©n SCID rÊt dÔ bÞ tæn th¬ng víi çc bÖnh truyÒn nhiÔm . H¬n n÷a , t×nh tr¹ng cuéc sèng cµng bÞ ®e do¹ nÕu virut trî gióp (vec t¬) l¹i bÞ nhiÔm bÈn trong khi chuÈn bÞ vec t¬ . Vµ nÕu kh«ng duy tr× ®îc m«i trêng v« trïng trong lóc ®ang s¶n xuÊt vµ qu¶n lý çc vec t¬ th× còng cã thÓ dÉn ®Õn bÞ x©m nhiÔm . Còng cã nh÷ng ý kiÕn ®èi nghÞch cho r»ng viÖc tiÕn hµnh thay thÕ ph¶i ®îc tiÕn hµnh nh thÕ nµo ®ã ®Ó cho Ýt m¹o hiÓm h¬n . Ch¼ng h¹n nh ®Ó cÊy thµnh c«ng tuû x¬ng th× ph¶i cho nã “ngÊm”dÇn vµo bÖnh nh©n nh÷ng tÕ bµo b×nh thêng cã mang gen ADA cã chøc n¨ng . Mét vÊn ®Ò cÇn ph¶i lu ý ®èi víi quy tr×nh nµy lµ tuû x¬ng cña ngêi nhËn vµ ngêi cho ph¶i rÊt phï hîp víi nhau (thêng lµ anh chÞ em ruét). Mét vÊn ®Ò kh¸c lµ sù lo¹i th¶i tæ chøc ghÐp cña bÖnh nh©n .Nh÷ng ngêi ®Ò xíng ra GTL th× tranh luËn r»ng c¬ chÕ lo¹i th¶i cã thÓ kh«ng x¶y ra ®èi víi GTL bëi v× nã ®îc truyÒn l¹i chÝnh nh÷ng tÕ bµo cña c¬ thÓ m×nh . Mét ph¬ng ph¸p kh¸c cña GTL lµ thay thÕ enzym .Nh÷ng n¨m ®Çu 1990 , FDA ®· phª chuÈn cho phÐp sö dông ADA tinh khiÕt g¾n víi çc ph©n tö hãa häc polyetylen glycol (polyethylene glycol –PEG). Çc ph©n tö PEG cã t¸c dông kÐo dµi sù ho¹t ®éng cña ADA trong c¬ thÓ . KÕt 59

qu¶ lµ nh÷ng ph©n tö PEG-ADA cã thÓ tiªm ®îc cho nh÷ng bÖnh nh©n SCID ®Ó gi¶m nhÑ sù thiÕu hôt ADA . Nh÷ng kh¶o s¸t ®¸nh gi¸ thuèc hiÖn nay tiªu tèn kho¶ng 50.000 USD hµng n¨m , ®ã lµ mét h×nh ¶nh râ nÐt ®Ó chèng l¹i viÖc dïng thuèc thay v× sö dông GTL. Th¸ng 9-1991 lµ thêi ®iÓm ngät ngµo ®Æc biÖt cho 2 c« bÐ .C¶ hai c« ®îc tiÕp nhËn çc tÕ bµo biÕn ®æi gen ®Òu ®îc ®Õn trêng , mét tíi nhµ trÎ cßn mét th× vµo líp 5 . C¶ hai c« g¸i ®Òu biÓu lé lµ hÖ thèng miÔn dÞch dÒu ®îc phôc håi râ rÖt .Mét tê b¸o ®¨ng trªn trang nhÊt víi tiªu ®Ò trë l¹i Trêng häc víi nh÷ng gen míi” . §iÒu ®¸ng vui lµ hiÖn nay c¶ hai c« g¸i nµy ®Òu sèng mét çch b×nh thêng nh bao nhiªu ngêi khoÎ m¹nh kh¸c . 4.5.2. Gen trÞ liÖu trong chèng ung th . Còng trong buæi gÆp mÆt taÞ n¬i phª chuÈn cho çc thÝ nghiÖm ADA , Uû ban cè vÊn DNA t¸i tæ hîp cña NIH còng phª chuÈn mét thÝ nghiÖm thø 2 trong GTL .ThÝ nghiÖm nµy ®Ò cËp tíi viÖc rót çc tÕ bµo lympho cña bÖnh nh©n ung th ra vµ cµi vµo çc tÕ bµo ®ã gen kh¸ng ung th . Çc tÕ bµo ®· ®îc thiÕt kÕ l¹i nµy sau ®ã l¹i ®îc ®a trë l¹i cho bÖnh nh©n víi hy väng lµ t¸c nh©n kh¸ng ung th cã thÓ giÕt mét çch chän läc çc tÕ bµo ung th . Nhãm khoa häc nµy ®îc dÉn ®Çu bëi Steven Rosenberg thuéc NIH cïng çc ®ång nghiÖp, W. French Anderson (ngêi ®· tham gia trong thÝ nghiÖm ADA) .Trong quy tr×nh thÝ nghiÖm nµy , çc nhµ khoa häc ®· sö dông mét d¹ng lympho lµ lympho th©m nhËp khèi u (tumor infiltrating lymphocytes TIL) .§ã lµ nh÷ng tÕ bµo ®Æc biÖt cña hÖ miÔn dÞch . Díi çc ®iÒu kiÖn b×nh thêng , TIL ®îc kÝch thÝch bëi çc yÕu tè ho¸ häc cña çc tÕ bµo ung th råi ®i vµo çc khèi u r¾n ch¾c vµ ph¸ huû çc tÕ bµo khèi u . Mét vò khÝ phô trî quan träng lµ çc yÕu tè ho¹i tö khèi u ( Tumor necrosis factor TNF ) ®îc g¾n vµo çc t¸c nh©n kh¸ng ung th . TNF lµ mét s¶n phÈm protein cña ®¹i thùc bµo - çc tÕ bµo cña m« gièng nh amip sÏ tham gia vµo viÖc ph¸ huû çc tÕ bµo ung th .Protein TNF cã thÓ ®îc s¶n xuÊt bëi c«ng nghÖ di truyÒn vµ cã thÓ ®îc dïng ®Ó n©ng cao kh¶ n¨ng kh¸ng ung th cña çc lympho bÞ khèi u th©m nhËp . Rosenberg cïng ®ång nghiÖp dù ®Þnh sÏ ®iÒu trÞ cho nh÷ng bÖnh nh©n u h¾c s¾c tè tiÕn triÓn (malignant melanoma) –d¹ng ung th da nguy hiÓm thêng kh«ng ®¸p øng víi bÊt cø çch ®iÒu trÞ nµo . Trong gen trÞ liÖu , çc nhµ khoa häc ®· lÊy mét m¶nh m« ung th cña bÖnh nh©n . Hä còng ph©n lËp TIL tõ m¸u cña bÖnh nh©n . Çc TIL nµy sau ®ã ®îc nu«i cÊy cïng víi çc tÕ bµo tõ m« bÞ khèi u ®Ó kÝch thÝch TIL vµ n©ng cao tÝnh lùa chän cña çc tÕ bµo u h¾c s¾c tè cña bÖnh nh©n . Råi thªm c¶ mét hçn hîp gäi lµ Interleukin-2 . Interleukin-2 lµ mét protein cña tÕ bµo lympho , nã cã t¸c dông thóc ®Èy nhanh sù nh©n lªn cña TIL .B©y giê ®Õn c«ng ®o¹n cµi gen .Çc nhµ nghiªn cøu ®· trén TIL ®· ®îc kÝch thÝch víi mét sè vec t¬ retrovirut cã mang gen TNF (yÕu tè ho¹i tö khèi u) .Çc vec t¬ nµy x©m nhËp vµo tÕ bµo chÊt cña TIL vµ mang gen TNF vµo trong NST . Çc TIL c«ng nghÖ ho¸ sau ®ã ®îc nu«i cÊy mét thêi gian ®Ó t¹o nªn mét quÇn thÓ cña lympho thÊm nhËp khèi u s¶n xuÊt TNF (TNF producing tumor – infiltrating lymphocytes ). Råi tiÕp tôc kiªn nhÉn ®i vµo çc bíc tiÕp theo cña thÝ nghiÖm . Çc TIL t¹o TNF ®îc c«ng nghÖ ho¸ sÏ ngÊm dÇn vµo hÖ tuÇn hoµn cña bÖnh nh©n . Víi kh¶ n¨ng ®îc t¨ng cêng nã sÏ ph¸ huû çc tÕ bµo ung th vµ cã kh¶ n¨ng lùa chän víi çc tÕ bµo u h¾c s¾c tè , TIL sÏ tÊn c«ng çc tÕ bµo ung th vµ chuyÓn giao t¸c nh©n kh¸ng ung th TNF cña chóng . Nh÷ng bé phËn khoÎ m¹nh cña c¬ thÓ cã thÓ ®îc phßng tr¸nh bëi v× TIL kÝch thÝch mét çch chän läc viÖc t×m kiÕm çc tÕ bµo u h¾c s¾c tè . N¨m 1995 nhãm nghiªn cøu cña Rosenberg ®· thµnh c«ng trong viÖc cho thÊm çc tÕ bµo ®· c«ng nghÖ ho¸ vµo h¬n chôc bÖnh nh©n bÞ u h¾c s¨c tè .Th¾ng lîi nµy ®ñ ®iÒu kiÖn ®Ó tr¶ lêi c©u hái liÖu TIL ®îc thÊm vµo ®· ®Þnh vÞ ®ñ sè lîng ë vÞ trÝ bÞ u cha hoÆc lµ vÊn ®Ò sè lîng TNF cÇn trong trÞ liÖu cho bÖnh nh©n . §Ó tr¶ lêi c©u hái nµy vµ nh÷ng vÊn ®Ò kh¸c , nhãm cña Rosenberg ®· lµm thÝ nghiÖm víi çc d¹ng vec t¬ míi víi môc ®Ých lµm t¨ng kh¶ n¨ng cña TIL ®èi víi sù ®Þnh vÞ . Mét kiÓu GTL chèng ung th kÐm phæ th«ng h¬n còng ®îc phª chuÈn vµo n¨m 1993 ®èi víi çc thÝ nghiÖm trªn l©m sµng .C«ng tr×nh nµy ®îc thùc hiÖn bëi trung t©m y häc Methodist ë thµnh phè Iowa víi ngêi ®øng ®Çu lµ Michael blaese vµ Kenneth Culver. Hä ®· ®a vµo çc tÕ bµo u n·o mét gen m· cho enzym Thymidin kinaza . Enzym nµy ®îc mét sè vi sinh vËt sö dông trong tæng hîp DNA khi ph©n chia tÕ bµo vµ nã cã thÓ ngõng ho¹t ®éng bëi thuèc Ganciclovir. §iÒu hy väng lµ çc tÕ bµo ung th sÏ g¾n víi çc gen nµy vµ trë nªn phô thuéc vµo sù ho¹t ®éng cña thymidin Kinaza khi ph©n bµo vµ sÏ nh¹y c¶m víi ganciclovir råi chÕt . Gen Thymidin Kinaza thêng ®îc gäi lµ gen “tù s¸t” . Ganciclovir còng ®îc dïng ®Ó tiªu diÖt çc khèi u .

H×nh 4.9. Ganciclovirlµm gi¸n ®o¹n sù ph©n chia tÕ bµo nh thÕ nµo . (a) Enzym Thymidin Kinaza( trªn cïng) t¸c ®éng b»ng çch g¾n gèc photphat víi nucleozit ®Ó t¹o thµnh nucleotit .Thuèc Ganciclovir cã cÊu tróc t¬ng tù mét nucleozit , v× thÕ Thymidin kinaza kÕt hîp nhÇm víi Ganciclovir ®Ó t¹o thµnh mét nucleotit gi¶ . (b) Trong khi ph©n chia tÕ bµo th× mét enzym kh¸c lµ DNA polymeraza( díi cïng) sÏ g¾n víi nucleotit gi¶ nµy ®Ó ph¸t triÓn thµnh mét ph©n tö DNA khi tæng hîp DNA . Tuy nhiªn, çc nucleotit nµy l¹i thiÕu ®iÓm g¾n cho çc nucleotit tiÕp theo nªn viÖc kÐo dµi ph©n tö DNA bÞ dõng l¹i ®ét ngét . Bëi v× ®· kÕt thóc sù tæng hîp DNA nªn çc tÕ bµo kh«ng ph©n chia ®îc thµnh 2 tÕ bµo míi . Trong GTL, khi cµi mét gen Thymidin kinaza vµo mét tÕ bµo sÏ lµm cho tÕ bµo nh¹y c¶m víi sù t¸c ®éng cña ganciclovir . Ganciclovir sau ®ã sÏ øc chÕ sù ph©n chia tÕ bµo vµ giÕt chÕt tÕ bµo nµy . V× thÕ mµ Thymidin kinaza ®îc gäi lµ gen tù s¸t . Vec t¬ sö dông trong çc thÝ nghiÖm nµy lµ çc retrovirut ®· ®îc thiÕt kÕ l¹i víi gen s¶n xuÊt ra Thymidin kinaza lÊy tõ Virut herpes Simplex. Çc tÕ bµo n·o b×nh thêng th× kh«ng ph©n chia nhng çc tÕ bµo u th× ph©n chia m·nh liÖt vµ çc retrovirut cµi mét çch chän läc gen Thymidin kinaza vµo çc tÕ bµo u cña n·o .(Virut khi th©m nhËp vµo çc tÕ bµo b×nh thêng th× kh«ng ®îc nh©n lªn).§Ó cung cÊp ®ñ sè lîng virut , çc nhµ nghiªn cøu ®· ph¶i tiªm vµo bÖnh nh©n çc tÕ bµo da bÞ nhiÔm virut lÊy tõ mét con chuét .Nh÷ng tÕ bµo bÞ nhiÔm ®· phãng thÝch virut ra ngoµi c¬ thÓ víi mét tèc ®é ®Òu ®Òu .V× thÕ ch¾c ch¾n lµ virut cã kh¶ n¨ng nh©n lªn ë çc tÕ bµo khèi u , chÝnh v× thÕ mµ c¬ héi bÞ nhiÔm çc tÕ bµo khèi u t¨ng lªn . Nh÷ng tÕ

bµo chuét sÏ chÕt sau vµi ngµy do c¬ chÕ lo¹i th¶i b×nh thêng cña c¬ thÓ , cßn çc tÕ bµo bÞ nhiÔm khèi u th× l¹i b¾t ®Çu s¶n xuÊt ra thymidin kinaza . Khi ®îc tiªm Ganciclovir th× çc tÕ bµo nµy vµ khèi u ë n·o sÏ bÞ ph¸ huû . Çc thÝ nghiÖm vÉn cßn ®ang tiÕp tôc . 4.5.3.Nh÷ng nç lùc hiÖn t¹i vµ t¬ng lai. Ngay khi çc thÝ nghiÖm ®Çu tiªn vÒ GTL ®îc thùc hiÖn th× çc nhµ khoa häc ®· c«ng thøc ho¸ çc test s¾p tíi víi sù tiÕp cËn míi trong y häc . 4.5.3.1.Mét trong sè çc dù kiÕn lµ thay thÒ gen khiÕm khuyÕt trong bÖnh x¬ nang . VÊn ®Ò chÝnh ë çc bÖnh nh©n x¬ nang lµ çc ion clo rua cø cµng dÇy lªn trong çc tÕ bµo ë çc tæ chøc vµ çc nang cña c¬ thÓ .Çc ion b×nh thêng vÉn ®i ra khái tÕ bµo qua mét protein h×nh èng gäi lµ kªnh -®ã lµ mét protein ®iÒu hoµ vËn chuyÓn mµng çc nang (cystic transmembrane conductance regulator-CTCR ) . ë nh÷ng ngêi bÞ x¬ nang , protein CTCR kh«ng ®îc t¹o ra v× khiÕm khuyÕt gen v× thÕ çc ion bÞ tÝch tô trong çc tÕ bµo vµ rót níc trong çc tÕ bµo , khi ®ã çc chÊt nhÇy bÞ ®äng l¹i trªn çc ®êng dÉn cña c¬ thÓ , ®Æc biÖt lµ çc ®êng dÉn khÝ . §iÒu kiÖn nµy t¹o thuËn lîi cho vi khuÈn th©m nhËp (H×nh 4.10)

H×nh 4.10. Çc l«ng nhung gièng nh tãc mäc ra tõ çc tÕ bµo ®êng h« hÊp. B×nh thßng th× nh÷ng l«ng nµy dïng ®Ó bÉy bôi vµ çc vi sinh vËt , nhng trong bÖnh x¬ nang th× do d thõa çc chÊt nhÇy nªn nã dÝnh vµo nhau vµ mÊt chøc n¨ng bÉy bôi vµ vi sinh vËt .Do ®ã lµm cho ®êng h« hÊp dÔ bÞ nhiÔm trïng §iÓm næi bËt ë nh÷ng bÖnh nh©n x¬ nang lµ sÏ bÞ chÕt do nhiÔm trïng phæi v¸ ®êng h« hÊp tríc tuæi 30 . ViÖc ph¸t hiÖn ra gen khiÕm khuyÕt trong çc bÖnh nh©n x¬ nang lµ mét thµnh tùu ®¸ng ghi nhí cña n¨m 1989. Trong n¨m ®ã cã 2 nhãm nghiªn cøu dù ®Þnh trÞ liÖu thay thÕ gen khiÕm khuyÕt nµy . T¹i Trêng §¹i häc Iowa , çc nhµ khoa häc ®· sö dông thµnh c«ng vec t¬ Virut ®Ó cµi vµo phiªn b¶n gen b×nh thêng cña çc tÕ bµo phæi cña mét bÖnh nh©n , ®îc nu«i cÊy trong phßng thÝ nghiÖm . Çc tÕ bµo nµy sau ®ã ®· s¶n xuÊt ra protein CTCR – nã nh lµ çc kªnh ®Ó çc ion ®i qua mµng tÕ bµo vµ kÝch thÝch sù lo¹i th¶i çc ion clo rua d thõa . Nhãm thø hai lµm viÖc t¹i Trêng §¹i häc Michigan còng thu ®îc nh÷ng kÕt qu¶ t¬ng tù nhng víi çc tÕ bµo tuþ. (trong çc tÕ bµo tuþ , nÕu thiÕu protein nµy th× dÉn tíi viÖc gi¶i phãng d lîng enzym). §iÒu l¹c qua ®èi víi viÖc ®iÒu trÞ x¬ nang víi GTL cµng t¨ng lªn bëi n¨m 1991 ®· cã th«ng b¸o vÒ mét virut lµnh tÝnh th«ng thêng ®· gi¶m ho¹t lùc cã thÓ dïng ®Ó chuyÓn nh÷ng gen b×nh thêng vµo trong çc tÕ bµo ®Ých ®îc nu«i trong phßng thÝ nghiÖm.N¨m ®ã çc nhµ nghiªn

cøu t¹i viÖn huyÕt häc, tim ,phæi quèc gia Hoa kú ®· m« t¶ r»ng c¸c gen m· cho c¸c enzym cña ngêi cã thÓ ®îc g¾n víi virut ®êng h« hÊp Adenovirut (H×nh 4.11.)

H×nh 4.11. ¶nh qua hiÓn vi ®iÖn tö cña Adenovirut (x300.000) , mét d¹ng virut ®êng h« hÊp ®îc dïng nh mét vec t¬ trong GTL . Bï l¹i viÖc kh«ng cã kh¶ n¨ng sao chÐp , çc adenovirut nµy lµ mét vec t¬ thÝch hîp bëi v× nã x©m nhiÔm çc tÕ bµo cña ®êng h« hÊp (mÆc dÇu nã kh«ng ph¶i lµ Retrovirrus).Cã thÓ lµ çc Adenovirut gi¶m ho¹t lùc nµy cã thÓ vËn chuyÓn çc gen b×nh thêng vµo çc tÕ bµo ®êng h« hÊp cña çc bÖnh nh©n x¬ nang ®Ó thay thÕ cho çc gen khiÕm khuyÕt . Nh÷ng tiÕn bé trong nghiªn cøu còng t¨ng thªm nhiÒu tõ n¨m 1993. Tríc hÕt lµ nhãm çc nhµ sinh häc ph©n tö cña Anh quèc ®· th«ng b¸o r»ng hä ®· söa ch÷a ®îc sù khiÕm khuyÕt gen x¬ nang ë chuét . Sau ®ã ®Õn th¸ng 4-1993, Uû ban cè vÊn DNA t¸i tæ hîp cña NIH ®· phª chuÈn 3 thö nghiÖm GTL vÒ x¬ nang cã liªn quan tíi vec t¬ adenovirut.Tæ hîp nghiªn cøu nµy ®îc ®iÒu hµnh bëi 3 nhãm , mçi nhãm nghiªn cøu chän 10 bÖnh nh©n tuæi trªn 21 ë çc bÖnh viÖn Michigan , Lowa vµ Maryland . Hai nhãm ®· xÞt Adenovirut vµo trong mòi sau ®ã ®a vµo phæi cña bÖnh nh©n . Cßn nhãm thø 3 th× chØ xÞt vµo mòi bÖnh nh©n th«i . Môc tiªu ban ®Çu cña test lµ x¸c ®Þnh xem liÖu ph¬ng ph¸p trÞ liÖu cã kh¶ n¨ng lµm cho bÖnh nh©n t¹o ra ®îc çc protein ®Ó phßng chèng bÖnh x¬ nang hay kh«ng .Còng cÇn ph¶i lu ý r»ng Adenovirut kh«ng hîp nhÊt víi çc tÕ bµo nh Retrovirut v× thÕ bÊt kú kÕt qu¶ d¬ng tÝnh nµo cña test còng lµ do ®îc truyÒn l¹i . Cuèi 1994 ngêi ta ®· cµi ®îc gen nµy vµo çc tÕ bµo ë c¶ mòi còng nh ë phæi cña bÖnh nh©n x¬ nang . 4.5.3.2.Mét dù kiÕn kh¸c cña GTL lµ híng tíi çc bÖnh di truyÒn hiÕm gÆp , ®ã lµ bÖnh Cholesterol cao cã tÝnh chÊt gia ®×nh (familia hypercholesterol). Nh÷ng bÖnh nh©n nµy kh«ng cã kh¶ n¨ng lo¹i bá cholesterol trong m¸u . Céi nguån cña vÊn ®Ò lµ do mét gen khiÕm khuyÕt mµ b×nh thêng nã m· cho çc receptor cholesterol. Çc Receptor cholesterol lµ çc ph©n tö protein ë bÒ mÆt çc tÕ bµo gan nã bÉy cholesterol vµo m¸u vµ lo¹i nã ra khái hÖ tuÇn hoµn .NÕu thiÕu çc receptor nµy th× cholesterol vÉn n»m l¹i trong m¸u vµ tÝch tô l¹i lµm t¾c nghÏn ®éng m¹ch vµ tÜnh m¹ch. KÕt qu¶ lµ lµm t¨ng huyÕt ¸p vµ çc bÖnh tim ngay c¶ khi cßn rÊt trÎ . N¨m 1993 çc nhµ khoa häc ë Trêng §¹i häc Michigan th«ng b¸o r»ng hä ®· thµnh c«ng trong viÖc thay thÕ gen khiÕm khuyÕt dÉn ®Õn t¨ng cholesterol cã tÝnh chÊt gia ®×nh nµy . Çc nhµ khoa häc ®· lÊy mét mÉu çc tÕ bµo gan cña mét phô n÷ råi cho çc tÕ bµo nµy nhiÔm víi virut vec t¬ cã mang gen cña receptor b×nh thêng vµ cho thÊm nhËp çc tÕ bµo biÕn ®æi nµy

vµo bÖnh nh©n. KÕt qu¶ lµ møc cholesterol cña ngêi phô n÷ nµy gi¶m xuèng ®¸ng kÓ tíi møc lµm cho Uû ban cè vÊn t¸i tæ hîp DNA cho phÐp më réng thÝ nghiÖm thªm 5 bÖnh nh©n n÷a .

4.5.3.3.Mét híng kh¸c cña GTL cã liªn quan tíi çc tÕ bµo gan còng ®îc dù ®Þnh bëi çc nhµ nghiªn cøu ë Trêng §¹i häc Baylor. Dô kiÕn cña hä lµ ph©n lËp çc tÕ bµo gan tõ nh÷ng ngêi t×nh nguyÖn b×nh thêng råi nu«i cÊy nh÷ng tÕ bµo nµy trong phßng thÝ nghiÖm vµ ®¸nh dÊu chóng víi mét gen kh¸ng kh¸ng sinh . (Gen kh¸ng kh¸ng sinh thêng dïng lµm dÊu chuÈn bëi v× çc tÕ bµo tiÕp nhËn gen nµy cã thÓ ®îc test dÔ dµng vÒ søc ®Ò kh¸ng ®èi víi t¸c ®éng cña thuèc) . TiÕp theo lµ çc tÕ bµo ®· ®îc ®¸nh dÊu sÏ ®îc cÊy vµo mét ngêi tiÕp nhËn t×nh nguyÖn .Gen ®¸nh dÊu nµy sÏ cho phÐp çc nhµ nghiªn cøu x¸c ®Þnh çc tÕ bµo ®îc cÊy tån t¹i tèt nh thÕ nµo trong c¬ thÓ ngêi nhËn .§iÒu quan träng lµ ph¶i ®¸nh gi¸ ®îc sù sèng sãt cña çc tÕ bµo gan ®· ®îc nu«i cÊy bëi v× trong t¬ng lai cÊy ghÐp tÕ bµo cã thÓ thay thÕ cho viÖc ph¶i ghÐp toµn bé gan . Còng thËt dÔ hiÓu lµ quy tr×nh cÊy ghÐp tÕ bµo cã thÓ ®îc chÊp thuËn víi nh÷ng ngêi cã çc bÖnh chuyÓn ho¸ liªn quan tíi gan . Trong nh÷ng Trêng hîp nh vËy , çc tÕ bµo ®· ®îc ph©n lËp cã thÓ cã thÓ ®îc biÕn ®æi gen ®Ó t¹o nªn protein v× nÕu thiÕu çc protein nµy th× sÏ sinh ra çc bÖnh vÒ gan . 4.5.3.4.Gen trÞ liÖu còng cã thÓ lµm gi¶m nhÑ çc hiÖu øng cña héi chøng thiÕu hôt miÔn dÞch m¾c ph¶i (Acquired immune deficiency Syndrrome)-AIDS). N¨m 1993 Uû ban cè vÊn DNA t¸i tæ hîp (RAC) ®· phª chuÈn çc test l©m sµng trÞ liÖu víi viÖc chuyÓn gen míi vµo çc bÖnh nh©n nhiÔm HIV .Test nµy cã liªn quan tíi mét nßi ®ét biÕn cña HIVcã chøa çc gen khiÕm khuyÕt rev vµ env . Nßi nµy ®îc çc nhµ nghiªn cøu ë Trêng §¹i häc California ë San Diego t¹o ra . Nßi HIV ®ét biÕn nµy kh«ng sao chÐp ®îc bëi lÏ çc gen rev vµ env ®· bÞ khiÕm khuyÕt nªn kh«ng m· ®îc cho protein ®iÒu hoµ vµ protein vá bäc ngoµi cña virut , mµ c¶ 2 protein nµy ®Òu cÇn cho sù sao chÐp cña virut . §Ó sö dông çc virut ®ét biÕn nh lµ çc thiÕt bÞ trÞ liÖu , çc nhµ nghiªn cøu ®· t¸ch çc Lympho T ra khái bÖnh nh©n nhiÔm HIV vµ cµi çc virut ®ét biÕn vµo nh÷ng tÕ bµo nµy . Sau ®ã ngêi ta nu«i cÊy ®Ó cã mét sè lîng lín çc tÕ bµo nµy , råi sau ®ã l¹i tiªm trë l¹i cho bÖnh nh©n . Nh÷ng lympho –T cã chøa çc virut nµy kh«ng s¶n sinh ®îc virut míi , ngîc l¹i nã kÝch thÝch c¬ thÓ s¶n sinh ra çc tÕ bµo Lympho killer CD8 . Nh÷ng tÕ bµo nµy ®îc t¹o ra ®Ó ph¶n øng ®Æc hiÖu víi çc tÕ bµo bÞ nhiÔm HIV vµ trong çc test ë phßng thÝ nghiÖm thÊy chóng cã kh¶ n¨ng ph¸ huû çc tÕ bµo nµy . Hy väng ®iÒu ®ã còng x¶y ra trong c¬ thÓ . Mét d¹ng kh¸c cña GTL ®èi víi çc bÖnh nh©n nhiÔm HIV còng ®îc RAC phª chuÈn . Trong test nµy , çc gen m· cho çc protein HIV ®îc g¾n vµo DNA cña virut chuét nhng v« h¹i víi ngêi . Çc virut ®· ®îc c«ng nghÖ ho¸ nµy ®îc tiªm vµo nh÷ng ngêi nhiÔm HIV nhng kh«ng cã çc triÖu chøng biÓu hiÖn bÖnh .Çc nhµ nghiªn cøu tin tëng r»ng çc gen HIV sÏ kÝch thÝch çc tÕ bµo b×nh thêng cña c¬ thÓ s¶n xuÊt ra çc protein cña HIV . Çc protein nµy sÏ l¹i kÝch thÝch hÖ miÔn dÞch tiÕt ra çc kh¸ng thÓ HIV . Çc kh¸ng thÓ nµy cã thÓ phßng tr¸nh sù lan réng HIV trong c¬ thÓ bÖnh nh©n vµ biÕt tríc ®îc sù ph¸ huû cña çc lympho- T , ®ã lµ ®Æc trng th«ng thêng cña çc Trêng hîp AIDS tiÕn triÓn . Mét kiÓu kh¸c cña trÞ liÖu kh¸ng AIDS cã liªn quan tíi mét qu¸ tr×nh thùc nghiÖm t¹i phßng thÝ nghiÖm , nhng cha ®îc thùc hiÖn trªn l©m sµng . Qu¸ tr×nh nµy cã chñ ®Ých lÊy çc tÕ bµo bÞ nhiÔm HIV ®Ó t¹o ra çc kh¸ng thÓ kh¸ng HIV . Çc nhµ c«ng nghÖ DNA ë viÖn ung th Dana Father , Boston ®· tæng hîp ®îc gen cña kh¸ng thÓ F105 . Kh¸ng thÓ nµy ph¶n øng vµ g©y bÊt ho¹t gp 120-mét glycoprotein cã ë vá HIV cÇn cho viÖc g¾n HIV vµo çc tÕ bµo chñ . Çc nhµ khoa häc ®· tinh chÕ gen nµy sao cho çc ph©n tö kh¸ng thÓ ®îc t¹o ra ë líi néi chÊt (ER) cña tÕ bµo vµ mét thµnh phÇn cña mµng ë gp120 còng ®îc tæng hîp .Vµ hä cho thªm vµo mét ®o¹n gen ®Ó cho protein kh¸ng thÓ neo vµo líi néi chÊt vµ kh«ng rêi khái tÕ bµo (gièng kiÓu ho¹t ®éng cña kh¸ng thÓ ). §îc thiÕt lËp nh vËy nªn çc gen nµy ®îc g¾n vµo mét plasmid chuÈn vµ råi cµi vµo çc tÕ bµo nhiÔm HIV tõ çc ®éng vËt thÝ nghiÖm ë labo . ThËt sù thµnh c«ng , kh¸ng thÓ F105 ®· ®îc t¹o ra vµ t×nh tr¹ng dÞ thêng lµ çc tÕ bµo bÞ nhiÔm ®· t¹o ra ®îc kh¸ng thÓ chèng l¹i rÊt nhiÒu t¸c nh©n g©y nhiÔm cho nã . Sù tæng hîp gp120 gi¶m ghª gím vµ sù tæng hîp çc h¹t HIV còng chËm ®i d¸ng kÓ . §iÒu ®¸ng nãi lµ çc tÕ bµo nµy ch¼ng hÒ cã hiÖu øng g©y ®éc nµo c¶ .

4.5.3.5.Kh«ng dõng l¹i ë ®ã , trong çc thÝ nghiÖm víi çc tÕ bµo ë phßng thÝ nghiÖm , çc nhµ nghiªn cøu ë Trêng §¹i häc North Carolina®· thµnh c«ng trong viÖc thay thÕ mét gen b×nh thêng thay cho gen g©y thiÕu m¸u do tÕ bµo h×nh lìi liÒm .Gen ®îc cµi ®· m· cho mét globin b×nh thêng –mét thµnh phÇn cña hemoglobin , gen nµy bÞ khiÕm khuyÓt ë nh÷ng bÖnh nh©n thiÕu m¸u do tÕ bµo h×nh lìi liÒm .Tuy nhiªn nh÷ng tiÕn bé ®¹t ®îc trong viÖc ®iÒu trÞ bÖnh thiÕu m¸u do tÕ bµo h×nh lìi liÒm vÉn cßn rÊt chËm so víi sù mong ®îi . H¬n n÷a viÖc tæng hîp mét protein khÈn yÕu nh thÕ sÏ ®ßi hái ph¶i cã sù ®iÒu hoµ chÝnh x¸c sù ho¹t ®éng cña çc gen vµ sù kiÓm so¸t ®iÒu hoµ nµy hiÖn nay lµ ngoµi kh¶ n¨ng cña çc nhµ Ho¸ sinh . 4.5.3.6.Mét øng cö viªn kh¸c cña GTL lµ bÖnh Lesch – Nyhan . Hµng n¨m c¨n bÖnh hiÕm nµy t¸c ®éng íc tÝnh 2000 ngêi Mü . BÖnh nµy g©y bëi sù khiÕm khuyÕt mét gen lµm cho c¬ thÓ kh«ng tæng hîp ®îc mét enzym cã tªn lµ hypoxanthin-guanin-photphoribozyl transferaza (HPRT). ThiÕu HPRT th× sù chuyÓn ho¸ Guanin vµ Hypoxanthin bÞ ®×nh trÖ vµ t¹o nªn axit uric . KÕt qu¶ lµ g©y nªn bÖnh gout trÇm träng vµ huû ho¹i thËn , hay nh÷ng ®øa trÎ bÞ bÖnh bÞ liÖt n·o, tinh thÇn chËm ph¶t triÓn còng nh cã çc hµnh vi kü qu¸i nh thóc dôc kh«ng kiÓm so¸t ®îc dÉn ®Õn ®Ëp ph¸ , ¨n nãi sèng sîng , gËm vµo m«i vµ çc ngãn tay , ®Ëp ®Çu vµo têng v.v.. N¨m 1984 , çc nhµ khoa häc ë Trêng §¹i häc California ë San Diego ®· sö dông vec t¬ retrovirut ®Ó cµi çc gen s¶n xuÊt HPRT vµo trong çc tÕ bµo ngêi ®· ®îc ph©n lËp .Trong çc thÝ nghiÖm cña hä çc gen ®· lµm t¨ng mét çch ®¸ng kÓ møc enzym trong tÕ bµo . Tuy nhiªn , cho tíi thêi ®iÓm ®ã ngêi ta vÉn cha cã thùc nghiÖm nµo cÊy gen ®ã vµo c¬ thÓ ngêi .Mét vÊn ®Ò lín mµ çc nhµ khoa häc vÒ n·o ph¶i quan t©m lµ hä cha x¸c ®Þnh ®îc liÖu enzym nµy cã gi¶i to¶ ®îc nh÷ng hµnh vi bÊt thêng vµ sù liÖt n·o hay kh«ng vµ hä còng kh«ng biÕt ch¾c ch¾n lîng enzym then chèt trong c¬ thÓ lµ bao nhiªu . 4.5.3.7 Mét øng cö viªn kh¸c cña GTL lµ bÖnh Gaucher vµ bÖnh a ch¶y m¸u (hemophilia) . BÖnh Gaucher lµ mét bÖnh di truyÒn cña hÖ thÇn kinh trung ¬ng ®i cïng víi gan l¸ch to , mßn çc x¬ng dµi vµ vµng da ë ngêi lín . N¨m 1993 , RAC phª chuÈn mét test l©m sµng ®a vµo çc tÕ bµo bÖnh nh©n mét gen m· cho enzym glucocerebrosidaza (v× enzym nµy ®· bÞ mÊt hoÆc khiÕm khuyÕt). ViÖc t¹o ra enzym vµ sù ho¹t ®éng cña enzym nµy cã thÓ lµm gi¶m nhÑ triÖu chøng cña bÖnh . Test nµy hiÖn vÉn ®ang cßn tiÕp tôc . Trong bÖnh a ch¶y m¸u Hemophilia B th× bÖnh nh©n kh«ng s¶n xuÊt ®îc mét protein lµm ®«ng m¸u lµ factor IX (yÕu tè IX) , g©y nªn ch¶y m¸u qu¸ møc nh trong hemophilia A . N¨m 1993, çc nhµ nghiªn cøu cña Trêng §¹i häc Baylor th«ng b¸o hä ®· cµi thµnh c«ng çc gen cña factor IX vµo trong çc tÕ bµo gan cña chã . Mét Retrovirut ®îc dïng ®Ó ®a çc gen nµy vµo trong çc tÕ bµo ; çc nhµ nghiªn cøu thÊy retrovirut cã thÓ lµm cho gen cµi trùc tiÕp vµo çc ®éng vËt sèng . §Ó hoµn tÊt viÖc ®ã hä ®· gi¶i phÉu lÊy mét phÇn gan cña mét con chã , do dã nã kÝch thÝch çc tÕ bµo cßn l¹i ph©n chia nhanh chãng (nh khi håi phôc sau khi bÞ bÖnh hoÆc bÞ chÊn th¬ng ) . Çc nhµ c«ng nghÖ DNA sau ®ã tiªm çc retrovirut ®· c«ng nghÖ ho¸ qua tÜnh m¹ch cöa chÝnh cña gan dÉn trùc tiÕp vµo gan . Khi çc tÕ bµo gan ®îc nh©n lªn nã sÏ g¾n víi çc virut vµ hoµn tÊt viÖc cµi gen . Theo nhiÒu ®¸nh gi¸ th× çc bÖnh di truyÒn g©y nªn bëi sù khiÕm khguyÕt mét gen ®¬n lªn tíi con sè 2000 . Çc bÖnh di truyÒn lµm cho mét sè lín ngêi kh«ng ®îc hëng sù cíi xin còng nh mét sè lín trÎ em bÞ chÕt vµ chËm ph¸t triÓn tinh thÇn . H¬n n÷a hä cßn lµ mét g¸nh nÆng vÒ kinh tÕ cho x· héi vµ lµ håi chu«ng b¸o ®éng ®èi víi cuéc sèng con ngêi . Gen trÞ liÖu tá ra lµ mét ph¬ng ph¸p kh¸ h÷u hiÖu ®èi víi viÖc cøu ch÷a çc bÖnh di truyÒn . 4.6. b¶o hiÓm an toµn trong gen trÞ liÖu . VÊn ®Ò b¶o hiÓm an toµn trong GTL kh¸ phøc t¹p , ë ®©y chóng t«i chØ tr×nh bÇy mét çch v¾n t¾t nh÷ng quy ®Þnh t¹m thêi ë Hoa kú –mét quèc gia ®i hµng ®Çu trong GTL vµ còng lµ quèc gia cã nh÷ng quy chÕ rÊt chÆt chÏ ®èi víi mét ph¬ng thøc ®iÒu trÞ míi ®Çy tiÒm n¨ng nhng còng kh«ng Ýt rñi ro nµy . §Ó lµm l¾ng xuèng sù sî h·i ®èi víi GTL vµ ®¶m b¶o cã sù b¶o vÖ ®Æc biÖt cña x· héi , hiÖn nay ®· cã mét hÖ thèng xÐt duyÖt nhiÒu tÇng trong thao t¸c ®èi víi çc ®Ò nghÞ cña çc nhµ khoa häc . HÖ thèng nµy còng t¹o nh÷ng thêi c¬ thuËn lîi cho ®Çu vµo trong céng ®ång . §Ó theo ®uæi çc thÝ nghiÖm khoa häc , çc nhµ khoa häc ph¶i chøng minh ®îc r»ng çc gen

®îc cµi vµo kh«ng g©y t¸c h¹i trong çc m«. (ch¼ng h¹n nh hä ph¶i chØ râ ®îc r»ng çc gen cña vec t¬ virut sÏ kh«ng ho¹t ho¸ çc gen cña ngêi mµ nã cÇn ph¶i n»m yªn ). Hä còng ph¶i chøng minh vÒ ®é an toµn cña çc vec t¬ virut trªn ngêi , bëi v× còng dÔ hiÓu lµ mét vec t¬ cã thÓ ®îc cµi vµo mét ®iÓm trªn NST , ë ®ã nã cã thÓ lµm ®ét biÕn mét tÕ bµo do lµm sai tr×nh tù gen . Vµ hä còng ph¶i chøng minh ®îc r»ng çc virut trî gióp (helper) sÏ ph¶i ®îc lo¹i ®i toµn bé khái hçn hîp virut bëi v× çc virut gióp ®ì lµ xa l¹ víi çc m« cña ngêi nªn nã cã thÓ g©y bÖnh . Cßn mét vÊn ®Ò n÷a lµ viÖc cµi çc gen vµo çc tÕ bµo çc m« ®Æc biÖt . §Õn thêi ®iÓm 1996 , viÖc cµi çc tÕ bµo tuû x¬ng vÉn ®îc u tiªn nhÊt bëi v× çc nhµ khoa häc ®· tõng lµm çc c«ng viÖc lo¹i bá råi cÊy tuû x¬ng tõ trªn 20 n¨m nay . Mét trë ng¹i lín tiÕp theo lµ viÖc cµi çc gen vµo trong çc tÕ bµo kh«ng ph¶i lµ ®iÒu dÔ dµng nh çc tÕ bµo n·o bé ch¼ng h¹n .Thùc vËy,viÖc nh©n lªn mét gen ®¬n bÞ khiÕm khuyÕt sÏ ¶nh hëng tíi çc tÕ bµo cña n·o bé . Tõ 1984, hÖ thèng xÐt duyÖt nhiÒu tÇng cña GTL vÒ çc thÝ nghiÖm ®· cã nh÷ng tiÕn triÓn ®¸ng kÓ. Gi¸m thÞ hiÖp héi c«ng nghÖ DNA hiÖn nay ®· yªu cÇu bÊt kú mét nghiªn cøu nµo cã liªn quan tíi chñ thÓ con ngêi ®Òu ph¶i ®îc phª chuÈn cña héi ®ång xÐt duyÖt quèc gia nh÷ng ngêi kh¶o s¸t trong ®ã bao hµm c¶ nh÷ng vÊn ®Ò thuéc lu©n lý vµ an toµn sinh häc . Nh÷ng dù kiÕn vÒ GTL trªn ngêi cã thÓ ph¶i ®îc phª chuÈn bëi Uû ban cè vÊn DNA t¸i tæ hîp cña NIH (RAC). RAC sÏ thµnh lËp mét nhãm c«ng t¸c ®Æc biÖt vÒ çc dù kiÕn GTL trªn ngêi . Mét tiÓu ban vÒ GTL trªn ngêi ®· ®îc thµnh lËp , ®ã lµ mét nhãm gåm 4 nhµ khoa häc lµm viÖc trong çc labo , 3 nhµ khoa häc l©m sµng , 3 chuyªn gia vÒ lu©n lý vµ 2 chuyªn gia vÒ chÝnh s¸ch céng ®ång . Tõ 1994, RAC ®· phª chuÈn viÖc kh«ng cÇn ph¶i ®Ö tr×nh tÊt c¶ çc trêng hîp GTL mµ chØ cÇn phª chuÈn cho çc thÝ nghiÖm kh¸c thêng (®Æc biÖt). TiÓu ban GTL trªn ngêi cña RAC ®· chuÈn bÞ mét tµi liÖu t×m ra “nh÷ng ®iÓm cÇn xem xÐt” (points to consider) cho çc nhµ khoa häc lËp ra kÕ ho¹ch ®Ö tr×nh nh÷ng ®Ò nghÞ vÒ çc nghiªn cøu GTL trªn ngêi . Çc nhµ khoa häc ph¶i cung cÊp chi tiÕt çc th«ng tin vÒ bÖ nh mµ hä muèn ®iÒu trÞ , nh÷ng ph¬ng ph¸p trÞ liÖu gÇn nhÊt vµ c¶ gi¸ c¶ liªn quan tíi qu¸ tr×nh trÞ liÖu b»ng gen . Çc ®Æc tÝnh cña çc vËt liÖu di truyÒn dù ®Þnh sÏ ®îc cµi vµo ch¼ng h¹n nh nh÷ng b»ng chøng vÒ ®é tinh khiÕt , çc kÕt qu¶ trong labo trong nu«i cÊy tÕ bµo vµ trong ®éng vËt , çc t¸c dông phô cã thÓ trªn bÖnh nh©n vµ çc hiÖu øng ®ã sÏ ®îc gi¶m ®i tèi ®a nh thÕ nµo ;sù lùa chän çc ®Ò tµi ;nh÷ng b¶o vÖ riªng cho bÖnh nh©n nh thÕ nµo?. Çc vÊn ®Ò x· héi vµ lu©n lý nh tÝnh c«ng khai vµ nh÷ng ng¨n trë sù sî h·i cña céng ®«ng còng ®îc ®Ò cËp . VÒ quyÒn h¹n cña RAC còng ®îc quy ®Þnh râ n¨m 1993 khi gi¸m ®èc NIH Bernadine Healy ®· häp víi uû ban trong mét phiªn bÊt thêng ®Ó yªu cÇu t¨ng tèc quy tr×nh phª chuÈn GTL cho “lµm tõ thiÖn ” (compassionate use) ®èi víi nh÷ng ngêi èm yÕu liÒu m¹ng mét phen . Sau nhiÒu tranh luËn , Uû ban nµy ®· lµm cho NIH chÝnh thøc chÊp thuËn phª chuÈn vµ ®¸nh gi¸ nh÷ng ®Ò nghÞ GTL víi çc trêng hîp ®Æc biÖt . NIH còng chÝnh thøc khiÓn tr¸ch vÒ viÖc tham kh¶o çc ý kiÕn cña çc thµnh viªn RAC nÕu hä thÊy cÇn ph¶i cã ý kiÕn cho nh÷ng trêng hîp ®Æc biÖt. N¶y sinh nh÷ng kÕ ho¹ch cho GTL còng lµ nh÷ng ®Ò tµi ®îc FDA quan t©m ®Æc biÖt .C¬ quan nµy tham gia viÖc xÐt duyÖt bëi v× quyÒn h¹n cña nã lµ xem xÐt tÊt c¶ çc nghiªn cøu cã liªn quan ®Õn viÖc sö dông thuèc trªn ngêi . FDA còng rÊt quan t©m tíi tÝnh an toµn cña çc chÊt liÖu dïng trong thùc nghiÖm , hä lu«n xem xÐt mét çch tû mØ çc chÊt liÖu xem nã cã ®¸ng tin cËy ®Ó ®îc lËp l¹i trong çc thÝ nghiÖm tiÕp theo hay kh«ng . Trong th©m t©m çc nhµ klhoa häc th× cµng nhiÒu líp xÐt duyÖt th× sù phª chuÈn cµng chËm trÔ. §Ó gi÷ ®îc lßng tin cña céng ®ång , çc nhµ khoa häc vµ nh÷ng ngêi cã tr¸ch nhiÖm ph¶i cè g¾ng x¸c ®Þnh ®îc ®Þa chØ nhiÒu vÊn ®Ò khoa häc r¼m rèi vµ tham gia vµo mét sè vÊn ®Ò thuéc lu©n lý næi lªn khi øng dông GTL. Còng chÝnh v× thÕ mµ ph¶i mÊt 3,5 n¨m míi phª chuÈn ®îc thÝ nghiÖm ADA nh ta ®· ®Ò cËp ë phÇn trªn .Râ rµng lµ GTL ®ang ®îc “theo ®uæi nhng ph¶i hÕt søc thËn träng”.

5.1.Më ®Çu :

Ch¬ng V C¸c dîc phÈm chÕ t¹o theo c«ng nghÖ DNA .

Trong nh÷ng n¨m 1940,viÖc ph¸t triÓn vµ sö dông kh¸ng sinh ®· ®¸nh dÊu mét bíc chuyÓn tiÕp trong y häc .Tríc ®ã çc thÇy thuèc còng ®· gióp ®îc chót Ýt cho nh÷ng bÖnh nh©n bÞ tiªu ch¶y , th¬ng hµn , b¹ch hÇu vµ çc bÖnh truyÒn nhiÔm kh¸c . Tuy nhiªn, khi ®a kh¸ng sinh vµo hä ®· cã ®îc mét çch ®iÒu trÞ m¹nh vµ lµm lui bÖnh mét çch ®¸ng kÓ . Kh¸ng sinh ®· lµm thay ®æi tËn gèc rÔ trong y häc vµ ®· v¹ch ra mét híng míi trong ®iÒu trÞ mµ t¸c dông cña nã vÉn cßn kÐo dµi cho tíi tËn h«m nay . Tõ nh÷ng n¨m ®Çu 1980, mét thay ®æi tËn gèc kh¸c còng ®· x¶y ra trong viÖc ®iÒu trÞ çc bÖnh tiÓu ®êng vµ bÖnh a ch¶y m¸u . BÖnh tiÓu ®êng lµ do tuþ kh«ng s¶n xuÊt ®îc insulin , cßn bÖnh a ch¶y m¸u th× liªn quan tíi viÖc gan kh«ng cã kh¶ n¨ng s¶n xuÊt ra mét yÕu tè cÇn thiÕt cho sù ®«ng m¸u . C¶ Insulin vµ yÕu tè ®«ng m¸u ®Òu lµ protein vµ c¶ hai ®Òu cã thÓ ®îc thay thÕ b»ng nh÷ng nguån kh¸c .Ch¼ng h¹n nh , Insulin cã thÓ thu nhËn tõ tuþ ®éng vËt vµ yÕu tè ®«ng m¸u th× ®i tõ huyÕt t¬ng cña ngêi cho. Nhng ®iÒu ®¸ng tiÕc lµ viÖc viÖc thu nhËn protein nh thÕ th× rÊt d¾t ®á vµ cã thÓ dÝnh çc chÊt bÈn cã nguån gèc tõ vi sinh vËt v× thÕ nã cã thÓ g©y ph¶n øng dÞ øng cho bÖnh nh©n. Sù tiÕn c«ng cña c«ng nghÖ DNA : Trong h¬n 20 n¨m qua , çc nhµ khoa häc ®· øng dông c«ng nghÖ s«i ®éng nµy ®Ó ph¸t triÓn nh÷ng çch ®iÒu trÞ an toµn h¬n ®èi víi bÖnh tiÓu ®êng vµ bÖnh a ch¶y m¸u . Ch¼ng h¹n nh b©y giê cã thÓ thu nhËn ®îc insulin ngêi tõ vi khuÈn ®îc c«ng nghÖ ho¸ (H×nh 5.1)

H×nh 5.1.Tinh thÓ Insulin tinh khiÕt ®îc s¶n xuÊt tõ vi khuÈn . Çc tinh thÓ Insulin ngêi nµy ®îc tæng hîp bëi mét vi khuÈn ®êng ruét E.Coli b»ng c«ng nghÖ Ho¸ sinh b»ng viÖc mang gen vµ biÓu hiÖn gen t¹o Insulin . vµ ®· kh¶ thi viÖc ph©n lËp yÕu tè ®«ng m¸u tõ çc tÕ bµo ®éng vËt ®îc nu«i cÊy . Chóng ta sÏ xem xÐt c¶ 2 thµnh tùu nµy ë phÇn sau . Mét c¶i tiÕn kh¸c trong y häc lµ n©ng cao kh¶ n¨ng kh¸ng bÖnh cña c¬ thÓ . Ch¼ng h¹n nh , çc tÕ bµo cña c¬ thÓ nh ta ®· biÕt lµ nã cã thÓ tæng hîp ®îc çc chÊt kh¸ng virut nh interferon . Çc thÇy thuèc nhËn thÊy r»ng cung cÊp interferon cho c¬ thÓ lµ mét çch hiÖu qu¶ ®Ó ®iÒu trÞ çc bÖnh môn rép (herpes simplex), bÖnh sëi , thuû ®Ëu vµ viªm tuû x¸m . Çc nhµ c«ng nghÖ DNA hiÖn nay cã thÓ s¶n xuÊt ®îc Insulin víi sè lîng lín vµ cã thÓ thÊy tríc mét ngµy nµo ®ã Interferon ®îc sö dông ®Ó ch÷a çc bÖnh do virut còng ch¼ng kh¸c nµo ta dïng penicillin ®Ó trÞ vi khuÈn vËy . Mét çch m¹ng trong y häc còng cÇn ph¶i kÓ ®Õn lµ viÖc thiÕt kÕ çc lo¹i thuèc . Çc thÇy thuèc ®· ®îc sö dông çc s¶n phÈm ho¸ häc cña c«ng nghÖ DNA ®Ó lµm bÊt ho¹t mét ph©n tö ®¬n cã liªn quan tíi bÖnh . Nh÷ng lo¹i thuèc nh thÕ gäi lµ çc ph©n tö Antisene , nã ph¶n øng víi çc ph©n tö mRNA , bëi vËy lµm gi¸n ®o¹n qu¸ tr×nh tæng hîp protein . §èi víi viÖc phßng bÖnh , çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· mang tíi mét líp vac xin hoµn toµn míi . Çc vac xin míi h¬n sÏ kÝch thÝch hÖ miÔn dÞch hiÖu qu¶ h¬n vac xin cò vµ Ýt t¸c dông phô h¬n .Víi 2 lîi thÕ nh vËy çc vac xin míi sÏ phßng chèng tèt bÖnh tËt trong t¬ng lai. ViÖc lµm håi phôc vµ thay thÕ çc protein bÞ mÊt nh insulin vµ çc yÕu tè ®«ng m¸u ®· kÝch thÝch c¬ thÓ thùc hiÖn ®îc çc qu¸ tr×nh sinh lý b×nh thêng cña nã . Cã thÓ lµm t¨ng cêng c¬ chÕ b¶o vÖ cña c¬ thÓ víi interferon hoÆc n©ng cao kh¶ n¨ng kh¸ng l¹i çc x©m nhiÔm mét çch tù nhiªn . Vµ nhê viÖc sö dông çc thuèc antisene lµm bÊt ho¹t mét ph©n tö ®Æc hiÖu ®·

khÝch lÖ çc thÇy thuèc híng vµo çc chÊt cã liªn quan tíi mét bÖnh x¸c ®Þnh .Trong tÊt c¶ çc trêng hîp nh vËy , çc s¶n phÈm dîc ho¹t ®éng theo çch hîp lý vµ chóng ta dÔ dµng hiÓu ®îc ®iÒu ®ã . C«ng nghÖ DNA v× thÕ ®· mang tíi y häc mét çch tiÕp cËn t©n tiÕn ®Ó trÞ bÖnh chÝnh x¸c h¬n çc ph¬ng ph¸p kh¸c ë kû nguyªn tríc . Trong kû nguyªn ®ã liÒu lîng vµ çch pha chÕ thuèc cña çc thÇy thuèc còng ch÷a ®îc bÖnh , nhng hä l¹i ch¼ng hiÓu t¹i sao l¹i lµm nh vËy . B©y giê th× kh¸c , çc thÇy thuèc ch¼ng nh÷ng hiÓu kü cµng çc c«ng viÖc cña m×nh ®ang lµm mµ cßn dù kiÕn ®îc nh÷ng kh¶ n¨ng mµ hä sÏ lµm ®îc trong t¬ng lai . 5.2.thay thÕ çc protein cña ngêi . Mét tÕ bµo cña ngêi cã kho¶ng mét tr¨m ngµn gen , phÇn lín lµ ®Ó m· cho çc protein cÇn thiÕt cña c¬ thÓ . §iÒu thêng x¶y ra lµ mét gen bÞ khiÕm khuyÕt lµm cho protein ®îc tæng hîp ra kh«ng ®óng hoÆc hoµn toµn kh«ng ®îc tæng hîp .ThiÕu mét protein cã thÓ kh«ng ®¸ng lu ý l¾m , nhng ®«i khi sù thiÕu hôt nµy l¹i g©y nªn bÖnh . Sù thiÕu hôt nµy thêng lµ di truyÒn v× thÕ nãi chung bÖnh nh÷ng bÖnh nµy ®ªï liªn quan ®Õn di truyÒn . HiÖn nay cã thÓ ®iÒu trÞ ®îc çc bÖnh cã liªn quan ®Õn di truyÒn nÕu x¸c ®Þnh ®îc protein bÞ thiÕu hôt .Trong phÇn nµy chóng ta sÏ bµn luËn vÒ mét sè trêng hîp trong ®ã çc protein thiÕu hôt ®· ®îc ph¸t hiÖn vµ c«ng nghÖ DNA ®· tæng hîp vµ hoµn tr¶ çc protein ®· bÞ mÊt nh thÕ nµo . 5.2.1. INSULIN . Mét vÝ dô vÒ bÖnh cã liªn quan ®Õn di truyÒn lµ bÖnh tiÓu ®êng . D¹ng phæ biÕn nhÊt cña bÖnh nµy lµ do çc tÕ bµo Beta cña tuþ kh«ng s¶n xuÊt ®ñ lîng hormon insulin (H×nh 5.2)

H×nh 5.2.Ph©n tö Insulin . Insulin lµ mét protein gåm 2 chuçi polypeptid A vµ B .Chuçi A cã 21 amino axit . Chuçi B cã 31 amino axit .Çc chuçi nèi víi nhau ë nh÷ng ®iÓm ®Æc biÖt . Çc liªn kÕt ®îc h×nh thµnh gi÷a çc chuçi polypeptid lµ çc liªn kÕt Disunfit (-S-S-) . Insulin ®· ®îc Frederick Banting vµ Howard Best x¸c ®Þnh trong mét dÉy çc thÝ nghiÖm kinh ®iÓn thùc hiÖn vµo n¨m 1921 . Hormon nµy ®îc ph©n phèi bëi m¹ch m¸u ®Ó ®i tíi tÊt c¶ mäi tÕ bµo cña c¬ thÓ . Insulin cã tÇm quan träng ®¸ng kÓ ®èi víi c¬ thÓ bëi v× nã t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho sù hÊp thô glucoza cña tÕ bµo ®Ó sö dông trong trao ®æi n¨ng lîng .ThiÕu insulin th× glucoza vÉn n»m l¹i trong m¹ch m¸u vµ s¶n phÈm ATP ®Çy n¨ng lîng bÞ gi¶m xuèng nghiªm träng . Çc bÖnh nh©n tiÓu ®êng rÊt yÕu vµ rÊt mÖt mái bëi v× tÕ bµo kh«ng lÊy ®îc n¨ng lîng tõ glucoza . ThËn sÏ lo¹i glucoza d thõa ra khái m¹ch m¸u vµ th¶i vµo trong níc tiÓu .(“mellitus”cã nghÜa lµ ngät , tøc lµ glucoza cã trong níc tiÓu ). §Ó hoµ lo·ng glucoza th× thËn còng ph¶i th¶i ra mét lîng lín níc mét çch bÊt thêng . (ThuËt ng÷ diabetes ®i tõ ch÷ siphon tøc lµ mét thÓ tÝch lín níc ®· bÞ dÉn ra khái c¬ thÓ). TiÓu ®êng sÏ dÉn tíi sù h h¹i cña m¾t vµ mï còng nh çc bÖnh vÒ thËn , thÇn kinh bÞ huû ho¹i vµ çc bÖnh thuéc hÖ tuÇn hoµn trong ®ã cã c¶ ho¹i tö vµ ®ét quþ . Mét nguy h¹i n÷a cña tiÓu ®êng lµ h«n mª tiÓu ®êng , sù mÊt ý thøc do mÊt c©n b»ng pH do t¨ng ph©n gi¶i chÊt bÐo cña c¬ thÓ . Kho¶ng 60 triÖu ngêi trªn toµn ThÕ giíi bÞ bÖnh tiÓu ®êng . Hä ph¶i thêng xuyªn tiªm insulin ®Ó tr¸nh nh÷ng hËu qu¶ nghiªm träng cña bÖnh . Insulin lµ mét protein gåm 51 amino axit , gåm 2 chuçi nèi víi nhau . Chuçi A cã 31 amino axit , cßn chuçi B cã 20 amino axit . Nhê çc thÝ nghiÖm cña Banting vµ Best nªn insulin cã thÓ ®îc thu nhËn tõ tuþ cña lîn vµ bß tõ çc lß s¸t sinh . Insulin ®éng vËt còng t¬ng tù nh insulin cña ngêi , nã chØ kh¸c 1 hoÆc 3 amino axit (nh insulin cña lîn vµ tr©u bß). Sù kh¸c biÖt nµy lµm cho mét sè ngêi bÞ tiÓu ®êng dÞ øng víi çc insulin ®éng vËt . Mét vÊn ®Ò kh¸c lµ tÝnh dÔ tiÕp cËn – chØ cÇn 7 ®Õn 10 pound m« tuþ lîn lµ ®ñ lîng insulin ®Ó ®iÒu trÞ cho mét bÖnh nh©n trong mét n¨m . Cuèi nh÷ng n¨m 1970 , çc nhµ Ho¸ sinh ®· thÊy cã dÞp may ®Ó øng dông nguyªn lý cña c«ng nghÖ DNA ®Ó s¶n xuÊt insulin. Hä lÊy mét ®o¹n DNA tõ th viÖn gen råi g¾n gen cÊu tróc cña insulin nµy vµo plasmid cña vi khuÈn E.Coli vµ cµi vÞ trÝ promoter c¹nh gen cÊu tróc (H×nh 5.3)

H×nh 5.3. S¶n xuÊt Insulin ë E.Coli . (a) ¶nh hiÓn vi quÐt cña çc tÕ bµo E.Coli thu nhËn ®îc khi chóng ®ang s¶n xuÊt Insulin . Nh÷ng chç ph×nh trßn râ nÐt cã thÓ thÊy ë thµnh tÐ bµo , cã thÓ ®ã lµ h×nh ¶nh gi¶i phãng s¶n phÈm cña gen . H×nh bæ sung chØ çc tÕ bµo E.Coli b×nh thêng kh«ng cã çc chç ph×nh . (b)¶nh qua hiÓn vi ®iÖn tö víi l¸t c¾t siªu máng cña çc tÕ bµo E. Coli khi ®ang s¶n xuÊt Insulin . Nh÷ng thÓ næi lªn râ rÖt (mòi tªn) cã lÏ liªn quan tíi sù s¶n xuÊt m¹nh mÏ protein ®ang tiÕp tôc trong çc tÕ bµo nµy . VÞ trÝ promoter ®îc sö dông lÊy tõ Lac operon . Thay v× tæng hîp enzym promoting ®Ó tiªu ho¸ lactoza th× vÞ trÝ promoter laÞ khëi ®Çu cho viÖc s¶n xuÊt insulin cña ngêi . V× gen insulin lµ gen cña ngêi nªn insulin ®îc tæng hîp ch¾c ch¾n lµ insulin ngêi . Th¸ng 7-1980 cã 17 ngêi t×nh nguyÖn chÊp nhËn tiªm insulin c«ng nghÖ gen ë bÖnh viÖn Guy London .Cã lÏ hä lµ nh÷ng ngêi ®Çu tiªn nhËn ®îc çc chÕ phÈm dîc s¶n xuÊt theo c«ng nghÖ DNA . Insulin nµy ho¹t ®éng gièng nh çc insulin ®i tõ ®éng vËt theo çch truyÒn thèng vµ nh÷ng thÝ nghiÖm nµy ®· x¸c minh lêi tuyªn bè cña çc nhµ Ho¸ sinh r»ng c«ng nghÖ DNA cã thÓ ®îc dïng ®Ó t¹o ra çc chÊt cã gi¸ trÞ trong y häc còng nh th¬ng m¹i . Ngay tõ nh÷ng n¨m sau ®ã , viÖc s¶n xuÊt ®· t¨ng nhanh . Çc nhµ nghiªn cøu ®· cã sù söa ®æi plasmid vi khuÈn b»ng çch thªm mét ®o¹n ng¾n DNA vµo gi÷a vÞ trÝ promoter vµ gen cÊu tróc . §o¹n míi nµy híng dÉn tÕ bµo vi khuÈn g¾n vµo mét peptid tÝn hiÖu gåm 24 amino axit ë mét ®Çu cña ph©n tö insulin .Peptid tÝn hiÖu sÏ kÝch thÝch vi khuÈn tiÕt ra insulin vµo m«i trêng xung quanh khi nã ®ù¬c s¶n sinh , v× vËy gi¶i quyÕt ®îc mét trë ng¹i lµ ph¶i thu lîm insulin tõ bªn trong tÕ bµo . Peptid nµy sÏ ®îc t¸ch khái ph©n tö insulin khi nã ®i qua mµng tÕ bµo . Nh thÕ nghÜa lµ vi khuÈn l¹i tiÕp tôc tæng hîp insulin mét çch c«ng nghiÖp : Tøc lµ ®a thùc phÈm vµo vµo mét ®Çu cña thïng lªn men vµ insulin ®îc rót ra ë mét ®Çu kh¸c . ViÖc s¶n xuÊt insulin còng t¨ng n¨ng xuÊt bëi v× qu¸ tr×nh t¹o ra 2 chuçi cña insulin lµ t¸ch biÖt nhau . Trong c¬ thÓ ngêi mét ph©n tö lín lµ proinsulin ®îc tæng hîp ®Çu tiªn .Ph©n tö nµy gåm cã mét tr×nh tù tÝn hiÖu vµ 3 khu amino axit . Trong tæng hîp insulin tù nhiªn th× tríc tiªn tr×nh tù tÝn hiÖu sÏ ®îc lo¹i bá vµ t¹o nªn proinsulin. Sau ®ã mét ®o¹n gåm 33 amino axit

®îc c¾t bá bëi bé m¸y Golgi cña tÕ bµo vµ gi÷ l¹i 2 chuçi (A vµ B) nèi víi nhau h×nh thµnh nªn ph©n tö insulin .ViÖc tæng hîp proinsulin trªn vi khuÈn rÊt khã kh¨n vµ c¸c nhµ c«ng nghÖ DNA ®· thÊy r»ng hä cã thÓ tõng bíc ch¬ng tr×nh ho¸ cho vi khuÈn tõng chuçi t¸ch biÖt (A vµ B) (H×nh 5.4)

Hïnh 5.4. C¬ chÕ tæng hîp Insulin . Gen chuçi A cña Insulin ®îc cµi vµo plasmid cña mét tÕ bµo E.Coli ®îc nu«i cÊy cïng víi mét gen c¶m øng (i) , mét vÞ trÝ promoter (P) vµ mét gen operator(O). Mét tÕ bµo nu«i cÊy kh¸c ®îc thiÕt kÕ víi gen chuçi B cña insulin .Operon ®îc sö dông lµ Lac operon , v× thÕ lactoza ®îc dïng trong m«i trêng nu«i cÊy nh lµ mét chÊt c¶m øng . Çc tÕ bµo ®îc nu«i cÊy sÏ tæng hîp çc chuçi A vµ B mét çch biÖt lËp , sau ®ã chóng ®îc ph©n lËp ra . Khi nèi chuçi A víi B sÏ ®îc mét ph©n tö Insulin cña ngêi . Khi çc chuçi ®· ®îc tæng hîp th× ngêi ta chiÕt xó©t chóng tõ m«i trêng nu«i cÊy råi lµm tinh khiÕt vµ nèi b»ng ph¬ng ph¸p ho¸ häc víi çc liªn kÕt disunfit . KÕt qu¶ lµ ph©n tö insulin ®îc tæng hîp . N¨m 1986, c«ng ty Eli Lilly ®· ®îc phª chuÈn nh·n hiÖu Humulin , ®ã lµ insulin c«ng nghÖ DNA ®Çu tiªn ®îc phÐp sö dông réng r·i . ë thêi ®iÓm ®ã , viÖc sö dông thµnh c«ng c«ng nghÖ DNA ®· chøng minh r»ng kh«ng cßn lo l¾ng víi viÖc vi sinh vËt cã thÓ s¶n ra çc protein l¹ ®Ó dïng cho ngêi n÷a . Tuy nhiªn nh÷ng n¨m tiÕp theo ®ã còng cã nh÷ng ý kiÕn tranh c·i bëi v× çc nhµ khoa häc còng ®· ph¸t hiÖn ra ph¬ng ph¸p lµm thay ®æi cÊu tróc ho¸ häc cña insulin lîn ®Ó lµm cho nã gièng nh insulin cña ngêi . V× thÕ hiÖn nay insulin ngêi cã thÓ ®îc s¶n xuÊt theo 2 çch : C«ng nghÖ DNA vµ b»ng çch biÕn ®æi ho¸ häc . VËy insulin cña lîn ®îc biÕn ®æi hay insulin ®i tõ plasmid sÏ lµ insulin ®îc lùa chän , ®iÒu ®ã vÉn cßn cha râ .

5.2.2. Hormon sinh trëng cña ngêi . Lïn (Dwarfism) lµ mét bÖnh rèi lo¹n chuyÓn ho¸ kh¸c cã thÓ ®iÒu trÞ b»ng c¸ch hoµn tr¶ mét protein mµ nã ®îc t¹o ra ë møc thÊp trong c¬ thÓ . BÖnh lïn x¶y ra khi tuyÕn Yªn , mét tuyÕn h×nh qu¶ ®Ëu ë ®¸y n·o kh«ng tiÕt ®ñ lîng hormon sinh trëng (Human growth hormone – HGH). Hormon nµy lµ mét protein kÝch thÝch sù sinh trëng cña toµn bé c¬ thÓ b»ng c¸ch lµm

t¨ng sù tiÕp nhËn amino axit cña tÕ bµo vµ kÝch thÝch tæng hîp protein . HGH còng thóc ®Èy viÖc sö dông çc chÊt bÐo ®Ó lµm nhiªn liÖu cho c¬ thÓ . Khi tuyÕn Yªn s¶n xuÊt kh«ng ®ñ HGH ngay tõ thuë nhá th× c¬ thÓ ph¸t triÓn chËm , khu«n mÆt mòm mÜm , gäi lµ trÎ “d mì”bông vµ cao kho¶ng 4 feet . MÆc dï trÝ n·o b×nh thêng nhng nh÷ng ngêi bÞ bÖnh nµy cã th©n h×nh kh«ng c©n xøng vµ rÊt lïn . NÕu hiÖn tîng lïn ®îc chÈn ®o¸n sím khi x¬ng cßn ®ang ph¸t triÓn th× cã thÓ tiªm ®îc HGH. ViÖc ®iÒu trÞ nµy rÊt tèn kÐm . Tuy nhiªn nÕu cã tõ 8 x¸c chÕt th× sè HGH cã thÓ ®ñ dïng ®iÒu trÞ trong mét n¨m cho mét ngêi (bÖnh nµy ph¶i ®iÒu trÞ tõ 8 ®Õn 10 n¨m ) . §iÒu nguy hiÓm lµ n·o cña nh÷ng x¸c chÕt cã thÓ bÞ nhiÔm bÖnh . V× thÕ n¨m 1985 viÖc sö dông çc m« cña x¸c chÕt ®· bÞ h¹n chÕ ë Hoa kú vµ ë Anh bëi v× cã kh¶ n¨ng l©y truyÒn héi chøng Creutzfeldt –Jacob (CJ) . BÖnh n·o nµy g©y nªn bëi mét virut hoÆc mét t¸c nh©n t¬ng tù virut . BÖnh nh©n bÞ run , chÊn ®éng , sa sót trÝ tuÖ vµ teo c¬ . ThËt vËy n¨m 1993 taÞ Ph¸p ®· cã 24 ca héi chøng CJ ®· ®îc x¸c ®Þnh ë nh÷ng ngêi ®îc tiªm HGH tõ çc m« cña çc x¸c chÕt . Çc nhµ c«ng nghÖ DNA ngµy nay cã thÓ s¶n xuÊt ®îc hormon sinh trëng qua c¬ chÕ cña c«ng nghÖ di truyÒn . Qu¸ tr×nh nµy còng t¬ng tù nh víi Insulin , tøc lµ : Gen HGH ®îc g¾n vµo plasmid vi khuÈn sau ®ã ®a vµo vi khu©n . Çc s¶n phÈm gen cña HGH trong trêng hîp nµy lµ ë m«i trêng ngoµi tÕ bµo . §Ó t¹o ®îc mét lîng thÝch hîp HGH , ®ßi hái çc nhµ c«ng nghÖ DNA ph¶i thay ®æi kü thuËt c¬ b¶n ®èi víi mét sè vÊn ®Ò Ho¸ sinh . Ph©n tö HGH tù nhiªn bao gåm 191 amino axit . Khi tæng hîp HGH tù nhiªn , mét ph©n tö trung gian cã thªm 26 amino axit ®îc m· bëi mét peptid tÝn hiÖu . Chuçi amino axit nµy dÇn dÇn sÏ ®îc c¾t ®i khi chóng ®îc tiÕt ra . §Ó tæng hîp gen HGH , ph©n tö mRNA m· cho HGH ®îc sö dông nh mét m« h×nh ®Ó tæng hîp ph©n tö DNA bæ cøu (cDNA). VÊn ®Ò nµy x¶y ra khi cDNA ®îc cµi vµo E.Coli .Vi khuÈn nµy ®¸p øng mét çch thÊt thêng bëi v× nã “kh«ng hiÓu” ý nghÜa cña peptid tÝn hiÖu nµy vµ nã kh«ng lo¹i ®îc peptid tÝn hiÖu khái ph©n tö HGH trung gian .Çc nhµ c«ng nghÖ DNA còng khã cã kh¶ n¨ng lo¹i ®i mét çch dÔ dµng peptid tÝn hiÖu nµy trong vi khuÈn . §Ó gi¶i quyÕt vÊn ®Ò nµy çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· lµm viÖc víi ph©n tö cDNA ®Ó c¾t ®i peptid tÝn hiÖu trªn HGH . Nhng ®¸ng tiÕc lµ kh«ng cã enzym giíi h¹n ®· biÕt nµo cã thÓ thùc hiÖn ®îc viÖc ®ã . VÊn ®Ò nµy ®· ®îc gi¶i quyÕt b»ng viÖc dïng enzym giíi h¹n EcolRI ®Ó lo¹i ®i tr×nh tù baz¬ cña peptid tÝn hiÖu 26 amino axit) khái ph©n tö cDNA vµ c¶ tr×nh tù cña 24 amino axit (tæng cæng lµ 50 amino axit). Sau ®ã çc tr×nh tù cña 24 amino axit ®îc tæng hîp vµ thay thÕ trªn ph©n tö cDNA ®Ó lËp c«ng thøc cña gen HGH ®Çy ®ñ (H×nh 5.5) . Khi thiÕu tr×nh tù peptid tÝn hiÖu nµy th× cã thÓ cµi gen nµy vµo çc tÕ bµo E.Coli ®Ó s¶n xuÊt HGH .

H×nh 5.5. Gen s¶n xuÊt HGH . Ph©n tö cDNA ®îc sö dông nh gen hormon sinh trëng cña ngêi (HGH) gåm cã mét tr×nh tù tÝn hiÖu mµ nã kh«ng ®îc phiªn trong vi khuÈn còng nh kh«ng ®îc lo¹i ®i mét çch thÝch ®¸ng b»ng biÖn ph¸p ho¸ häc . (a) §Ó gi¶i quyÕt vÊn ®Ò nµy ngêi ta sö dông enzym giíi h¹n EcolRI ®Ó lo¹i ®i gen tr×nh tù tÝn hiÖu cïng víi gen cho 24 amino axit trong ph©n tö HGH chÝn .(b) Sau ®ã gen cña tr×nh tù 24 amino axit ®îc tæng hîp mét çch t¸ch biÖt vµ g¾n vµo ph©n tö cDNA cßn l¹i bëi Ligaza. (c) Do cÊu tróc nh vËy nªn vec t¬ biÓu hiÖn (Plasmid) kh«ng cã tr×nh tù tÝn hiÖu ®Ó lµm gi¸n ®o¹n qu¸ tr×nh tæng hîp protein vµ . (d) Vec t¬ cã thÓ ®îc cµi vµo mét vi khuÈn nh E.Coli ch¼ng h¹n . Çc thÝ nghiÖm vÒ hormon sinh trëng cña ngêi ®· ®îc thùc hiÖn tõ 1985. Nh·n hiÖu Protropin cña c«ng ty Genentech lµ mét hormon tæng hîp ®· lµm t¨ng 3 lÇn tèc ®é t¨ng trëng cña nh÷ng trÎ em thiÕu hôt hormon ë n¨m thø nhÊt vµ t¨ng 2 lÇn ë n¨m thø 2 vµ thø 3 trong liÖu tr×nh trÞ liÖu . §Çu tiªn , hormon nµy chØ ®îc dïng cho nh÷ng trÎ em ®¹t chiÒu cao rÊt thÊp chØ vµo klho¶ng 3 % theo giíi tÝnh vµ løa tuæi .Ngµy nay ngêi ta m« t¶ ®ã lµ nh÷ng ®øa trÎ “rÊt thÊp”. §Ó ®¹t ®îc chiÒu cao b×nh thiêng ph¶i tiªm thuèc hµng ngµy trong nhiÒu n¨m , víi gi¸ kho¶ng 20.000 USD mçi n¨m . Vµ ®iÒu kh«ng vui cho çc nh÷ng ®øa trÎ cã th©n h×nh cùc kú thÊp naú lµ viÔn c¶nh thªm ®îc vµi inches víi gi¸ tiÒn ph¶i tr¶ nh vËy th× qu¶ lµ qu¸ ®¾t .

Còng dÔ hiÓu lµ HGH còng cã t¸c dông d¬ng tÝnh v¬Ý çc trÎ em cã møc hormon b×nh thêng nhng nhng l¹i bÞ r¬i xuèng nÊc chãt cña ®êng cong chiÒu cao chuÈn . N¨m 1990, NIH ®· ®ë ®Çu cho mét c«ng tr×nh nghiªn cøu kÐo dµi 10 n¨m víi 80 trÎ em “lïn”løa tuæi lªn 10 . Mét nöa trong sè ®ã ®îc tiªm hormon cßn mét nöa th× dïng thuèc Placebo . Tuy nhiªn, luËt sö dông thuèc ®· nªu râ nh÷ng nghiªn cøu vÒ tÇm vãc thÊp bÐ cã thÓ lµ mét bÊt lîi x· héi . Tuy nhiªn vÉn cã nh÷ng vÊn ®Ò tr¸i ngîc cho r»ng nh÷ng ngêi cã tÇm vãc thÊp còng cã thÓ ®îc ®iÒu trÞ nh mét bÖnh trong y häc th«ng thêng . Nh÷ng vÊn ®Ò nµy vÉn cßn ®ang tiÕp tôc nghiªn cøu . 5.2.3.YÕu tè VIII. ë Hoa kú , bÖnh di truyÒn cã liªn quan tíi sù ®«ng m¸u phæ biÕn nhÊt lµ bÖnh a ch¶y m¸u hemophilia A . BÖnh nµy t¸c ®éng ®Õn kho¶ng 10.000 nam giíi ë Hoa kú vµ do nguyªn nh©n khiÕm khuyÕt di truyÒn ®èi víi qu¸ tr×nh ®«ng m¸u . Sù khiÕm khuyÕt nµy lµm cho c¬ thÓ kh«ng cã kh¶ n¨ng s¶n xuÊt mét yÕu tè quan träng trong qu¸ tr×nh ®«ng m¸u , ®ã lµ yÕu tè VIII. Råi c«ng nghÖ DNA b¾t ®Çu ®îc øng dông khi mµ yÕu tè VIII ®îc thu thËp tõ çc ®¬n vÞ m¸u ngêi toµn phÇn (CÇn kho¶ng 800 pint (mçi pint 0,5 lit) lµ cã ®ñ yÕu tè ®«ng m¸u dïng cho mét bÖnh nh©n trong mét n¨m ) . Nhng ®¸ng tiÕc lµ , trong çc mÉu m¸u ®ã cã thÓ dÝnh c¶ çc t¸c nh©n g©y bÖnh nhÊt lµ tõ nh÷ng n¨m 1980 khi cã th¶m ho¹ HIV . Trong nh÷ng n¨m ®ã ®· cã hµng ngµn ngêi bÖnh a ch¶y m¸u khi ®îc truyÒn thuèc (yÕu tè ®«ng m¸u) ®· bÞ nhiÔm HIV vµ ph¸t triÓn thµnh AIDS . Sau nh÷ng n¨m 1980 , çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· nghiªn cøu tæng hîp ®îc yÕu tè VIII b»ng c«ng nghÖ di truyÒn . Hä biÕt r»ng gen cña yÕu tè VIII trªn ngêi n»m ë nhiÔm s¾c thÓ X , ë ®ã cã kho¶ng 186.000 cÆp baz¬ trong 26 exon xen víi nhiÒu intron (H×nh 5.6)

H×nh 5.6. Phøc hîp gen cña yÕu tè VIII . Gen nµy gåm 186 cÆp baz¬ (186 kb) tæ chøc trong 26 exon . Trong h×nh thÊy çc exon rÊt dµi . Xen lÉn çc exon lµ intron (Ýt th× 200 mµ nhiÒu th× tíi 32.000 cÆp baz¬ ) . Protein YÕu tè VIII cuèi cïng ®îc m· bëi gen lín tíi 2323 amino axit (Insulin chØ cã 51 amino axit). Sau ®ã hä ph©n lËp toµn bé mRNA (®îc m· bëi DNA ) vµ t¸ch riªng mRNA chÝn (chØ chøa exon kh«ng cã intron). mRNA chÝn nµy cã 9000 baz¬ vµ m· cho yÕu tè VIII-mét protein cã 2332 amino axit . Mét ph©n tö bæ cøu (cDNA) sÏ ®îc tæng hîp tõ mRNA nµy , sau ®ã ®îc cµi vµo çc tÕ bµo thËn cña chuét b¹ch, ë ®ã nã m· cho protein yÕu tè VIII. ViÖc sö dông çc tÕ bµo ®éng vËt cã vó lµ rÊt cÇn thiÕt bëi v× yÕu tè VIII rÊt lín vµ phøc t¹p , nã cã Ýt nhÊt 25 vÞ trÝ ë ®ã cã g¾n çc ph©n tö carbohydrat . N¨m 1992, hai phiªn b¶n cña yÕu tè VIII ®· ®îc s¶n xuÊt tõ 2 c«ng ty dîc phÈm vµ c¶ 2 ®Òu ®îc cÊp giÊy phÐp Recombinate –mét s¶n phÈm cña viÖn di truyÒn ë Cambridge, Massachusette vµ Kogenate -®îc s¶n xuÊt t¹i phßng thÝ nghiÖm Miles. 5.3.TRÞ liÖu trªn ngêi Høa hÑn cña c«ng nghÖ sinh häc cßn ®îc më réng sang lÜnh vùc ®iÒu trÞ bÖnh . Çc nhµ nghiªn cøu vµ çc thÇy thuèc ®ang ph¸t triÓn nh÷ng thuèc míi sö dông c«ng nghÖ DNA ®Ó ch÷a bÖnh . Hai vÝ dô vÒ çc thuèc ®ang s«i ®éng lµ yÕu tè plasminogen cña m« (tisue plasminogen factor –TPA) vµ Interferon . C¶ hai thuèc nµy ®Òu ®îc cung cÊp rÊt Ýt . Ngµy nay nã ®· ®îc s¶n xuÊt víi sè lîng ®ñ lín dïng trong ®iÒu trÞ . H¬n n÷a , mét líp hîp chÊt hoµn toµn míi gäi lµ çc ph©n tö Antisene còng ®îc ph¸t triÓn rÊt m¹nh . Trong phÇn nµy chóng ta sÏ t×m hiÓu vÒ qu¸ tr×nh s¶n xuÊt còng nh çch sö dông nh÷ng lo¹i thuèc nµy . 5.3.1.ChÊt ho¹t ho¸ plasminogen cña m« (tisue Plasminogen Activator – TPA). Trong nhiÒu n¨m qua , bÖnh nghÏn m¹ch vµnh ®· ®îc ®iÒu trÞ b»ng Streptokinaza vµ çc enzym kh¸c ®Ó ph¸ huû côc m¸u ®«ng trong m¹ch m¸u . Mét lo¹i thuèc míi ®îc thªm vµo trong danh môc thuèc ®iÒu trÞ lµ mét protein cã tªn lµ chÊt ho¹t ho¸ Plasminogen cña m« (TPA) . TPA lµ mét proteaza cã trong çc tÕ bµo ®éng vËt cã vó . Nã tù g¾n vµo çc côc m¸u ®«ng vµ kÝch thÝch çc thµnh phÇn kh¸c cña m¸u ®Ó ph©n gi¶i côc m¸u ®«ng mµ kh«ng lµm gi¶m kh¶ n¨ng ®«ng m¸u ë nh÷ng n¬i kh¸c trong c¬ thÓ . Mét enzym kh¸c còng liªn quan tíi sù ®«ng m¸u lµ Urokinaza , enzym nµy lµm gi¶m kh¶ n¨ng ®«ng m¸u kh¾p c¬ thÓ nªn g©y h©ô qu¶ lµ g©y chaû m¸u trong . TPA t¸c ®éng trong m¹ch m¸u , trong khi ®ã Urokinaza vµ

Strreptokinaza l¹i t¸c ®éng trùc tiÕp vµo çc æ t¾c nghÏn ; TPA t¸c ®éng nhanh h¬n urokinaza vµ strreptokinaza . TPA lµ thuèc ®Çu tiªn ®îc s¶n xuÊt b»ng çc tÕ bµo ®éng vËt nu«i cÊy . Trong nh÷ng n¨m 1980 , çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· tæng hîp ®îc ph©n tö DNA bæ cøu cho TPA vµ g¾n nã b»ng ph¬ng ph¸p Ho¸ sinh vµo mét plasmid tæng hîp . §Ó tæng hîp TPA , ngêi ta sö dông mét Plasmid cã chøa çc tr×nh tù gen cña TPA (ph©n tö cDNA) , mét tr×nh tù tÝn hiÖu vµ çc vÞ trÝ promoter vµ kÕt thóc . Sau ®ã ®a plasmid nµy vµo çc tÕ bµo ®éng vËt , çc tÕ bµo nµy sÏ tiÕt ra mét lîng lín TPA (H×nh 5.7) .

H×nh 5.7.S¶n xu©t chÊt ho¹t ho¸ plasminogen cña m« (TPA) trong çc tÕ bµo ®éng vËt . (a) Plasmid tæng hîp ®îc ®a vµo çc tÕ bµo ®éng vËt . (b) Thªm Methotrexate ®Ó chän ra nh÷ng tÕ bµo cã mang plasmid vµ cã kh¶ n¨ng s¶n xuÊt TPA cao . (c) Çc tÕ bµo ®îc chuyÓn vµo b×nh lªn men c«ng nghiÖp ®Ó s¶n xuÊt TPA ë ®ã çc tÕ bµo sÏ tiÕt TPA vµo m«i trêng xung quanh . Khi nu«i cÊy trong mét b×nh lªn men lín , çc tÕ bµo nµy sÏ cung cÊp ®ñ TPA cho nhu cÇu dîc phÈm . N¨m 1987 , c«ng ty c«ng nghÖ sinh häc Genentech ®· nhËn ®îc giÊy phÐp cña FDA cho nh·n hiÖu cña chÊt ho¹t ho¸ plasminogen cña m« lµ Activase . T¸c ®éng víi t çch lµ t¸c nh©n lµm tan khèi huyÕt , TPA béc lé ho¹t tÝnh cña mét proteaza do nã ph©n gi¶i mét enzym tiÒn th©n lµ plasminogen ®Ó chuyÓn thµnh plasmin . B¶n th©n plasmin còng lµ mét proteaza , nã ph©n gi¶i fibrin – mét protein h×nh thµnh trong côc m¸u ®«ng . Nh÷ng bÖnh nh©n cã nh÷ng dÊu hiÖu sím cña bÖnh tim vµ vµ ®ét quþ sÏ ®îc ®iÒu trÞ víi TPA . NhiÒu thÇy thuèc khuyÕn khÝch dïng chÕ phÈm nµy . Nhng cßn tån t¹i nh÷ng vÊn ®Ò kh¸c lµ nã vÉn kh«ng vît tréi h¬n h¼n streptokinaza vµ urokinaza . Tuy nhiªn TPA ®· lµm gi¶m çc t¸c dông phô so víi çc thuèc chèng ®«ng kh¸c , ®ã lµ ®iÒu ®¸ng ®îc tr©n träng . N¨m 1992, Genentech ®· thùc sù thu lîi tõ çc s¶n phÈm TPA . N¨m ®ã c«ng ty nµy thu ®îc trªn 230 tû USD khi b¸n s¶n phÈm nµy cho toµn ThÕ giíi . ThËt vËy , nhiÒu c«ng ty ®· thu ®îc nh÷ng thµnh qu¶ trong c«ng nghÖ DNA (b¶ng 5.1) B¶ng 5.1 Çc s¶n phÈm b¸n cña Dîc phÈm ®îc s¶n xuÊt theo c«ng nghÖ di truyÒn n¨m 1992 . s¶n phÈm

c«ng ty s¶n xuÊt

B¸n ë Mü

B¸n trªn ThÕ gií

Erythropoietin Vac xin viªm gan B

Amgen ;viÖn di truyÒn Biogen

600 260

(Tû USD) 1125 724

Insulin ngêi

Genentech

245

625

Hormon sinh trëng cña ngêi

Genentech, Biotechnology General

270

575

Interferon Alpha

Genentech, Biogen Wellcome .

135

565

YÕu tè kÝch thÝch Amgen khuÈn l¹c b¹ch cÇu h¹t.

295

544

YÕu tè ho¹t ho¸ plasminogen m« .

Genentech

180

230

YÕu tè kÝch thÝch khuÈn l¹c ®¹i thùc bµo –b¹ch cÇu h¹t .

Immunex, genetic institute .

Interferon Gamma

Genentech, Biogen

Interleukin -2

Immunex, Chiron

2055

4503

Tæng céng

N¨m ®ã cã 27 s¶n phÈm sinh häc cña c«ng nghÖ DNA ®îc b¸n ë Hoa kú vµ 270 thuèc ®iÒu trÞ kh¸c còng ®ang ®îc thö nghiÖm trªn l©m sµng . Erythropoeitin –mét hormon kÝch thÝch s¶n sinh hång cÇu ®· thu ®îc 1,1 tû USD khi b¸n s¶n phÈm nµy cho toµn ThÕ giíi vµ dÉn ®Çu vÒ çc lîi nhuËn tõ sinh häc . Mét t¸c nh©n trÞ liÖu kh¸c lµ Interferon còng ®øng vÞ trÝ hµng ®Çu trong çc s¶n phÈm ®îc b¸n trªn thÞ Trêng . Chóng ta sÏ bµn luËn vÒ ho¹t tÝnh vµ çch sö dông cña nã sau ®©y . 5.3.2.interferon . Interferon lµ mét chÊt kh¸ng virut lÇn ®Çu tiªn ®îc Alick Isaacs vµ Jean Lindenmann x¸c ®Þnh n¨m 1957 . Interferon kh«ng ph¶i lµ mét ®¬n chÊt mµ lµ mét nhãm gåm trªn 20 hîp chÊt cã cÊu tróc vµ chøc n¨ng t¸ch biÖt ®îc thiÕt kÕ víi 3 díi nhãm lµ Alpha, Beta vµ Gamma Interferon . Çc interferon ®Òu lµ protein , nhiÒu Interferon lµ Glycoprotein , tøc lµ chóng cã çc ph©n tö Carbohydrat g¾n vµo çc amino axit ë nh÷ng ®iÓm kh¸c nhau däc theo chuçi . Interferon ®îc t¹o ra bëi çc tÕ bµo kh¸c nhau cña c¬ thÓ sau khi chóng ®îc kÝch thÝch bëi Virut . Interferon ph¶n øng kh«ng ®Æc hiÖu víi çc virut kÓ c¶ virut ®· kÝch thÝch t¹o ra interferon ®Ó b¶o vÖ tÕ bµo . H¬n n÷a , nhiÒu interferon cßn tiªu diÖt ®îc çc tÕ bµo ung th . §iÒu ®¸ng tiÕc lµ interferon cña ngêi th× chØ ®îc t¹o ra bëi çc tÕ bµo cña ngêi th× míi cã t¸c dông cho ngêi , cßn çc interferon cña chã hay cña çc ®éng vËt kh¸c th× kh«ng cã t¸c dông . Interferon ®îc tÕ bµo t¹o ra sau khi virut gi¶i phãng axit nucleic cña nã vµo trong t¬ng bµo cña tÕ bµo .Interferon ®îc tiÕt ra tõ tÕ bµo vµ chóng g¾n vµo çc vÞ trÝ receptor trªn çc tÕ bµo n»m liÒn kÒ .Khi ®· ®i vµo ®îc tÕ bµo chóng sÏ s¶n xuÊt ra çc protein b¶o vÖ (h6.8) lµm øc chÕ sù sao chÐp cña virut b»ng nh÷ng çch mµ çc nhµ virut còng cha hiÓu ®îc ®Çy ®ñ (mÆc dÇu cã nh÷ng b»ng chøng lµ cã Ýt nhÊt mét protein b¶o vÖ tr¸nh cho sù x©m nhËp cña virut vµ mét protein kh¸c g¾n vµo mRNA m· bëi virut ).

(Tû US

Interferon ®· cã chiÒu dµi lÞch sö ®îc kiÓm chøng . Çc nhµ Ho¸ sinh rÊt quan t©m tíi sù ho¹t ®éng cña nã ngay tõ nh÷ng n¨m 1960 , nhng hä l¹i kh«ng thu thËp ®ñ lîng intrferon ®Ó nghiªn cøu v× thÕ viÖc nghiªn cøu trë nªn cùc kú khã kh¨n (CÇn trªn 90.000 pint m¸u (45.000 lit) míi thu ®îc 1 gam Interferon) . Tuy nhiªn , mét ®ét ph¸ lín x¶y ra n¨m 1980 khi çc nhµ c«ng nghÖ sinh häc Thuþ sÜ vµ NhËt b¶n gi¶i ®îc m· di truyÒn cña interferon alpha vµ hä ®· nèi mét ®o¹n DNA thÝch hîp vµo trong çc plasmid cña E.Coli. Çc interferon s¶n xuÊt tõ vi khuÈn lµm gi¶m bít triÖu chøng cho nh÷ng ngêi m¾c çc bÖnh gan , lµm h¹n chÕ sù l©y lan cña çc Herpes Zoster (BÖnh Zona) vµ lµm nhá l¹i mét sè khèi u .

H×nh 5.8. C¬ chÕ t¸c ®éng cña Interferon . Khi mät virut x©m nhËp tÕ bµo chñ th× axit nucleic cña nã sÏ kÝch thÝch DNA cña tÕ bµo s¶n xuÊt ra Interferon . Sau ®ã interferon ®i ra khái tÕ bµo ®Ó vµo mét tÕ bµo liÒn kÒ . ë ®©y nã kÝch thÝch DNA cña tÕ bµo m· cho mét d·y çc protein kh¸ng virut . Nh÷ng protein nµy xuÊt hiÖn ®Ó ng¨n ngõa sù sao chÐp v× thÕ mµ t¹o ra hiÖu øng b¶o vÖ trªn tÕ bµo . N¨m 1984, h·ng c«ng nghÖ sinh häc Thuþ sÜ b¾t ®Çu tiÕp thÞ Interferon . N¨m 1986 , FDA ®· phª chuÈn cho phÐp sö dông interferon alpha ®Ó ®iÒu trÞ mét thÓ bÖnh b¹ch cÇu (Leukemia) , n¨m 1988 FDA phª chuÈn dïng ®Ó ch÷a çc môn ®êng sinh dôc (genital Warts) . N¨m 1996 interferon ®îc phª chuÈn ®Ó ch÷a çc sac c«m Kaposi (mét d¹ng ung th m¸u vµ da ë çc bÖnh nh©n AIDS) còng nh bÖnh u h¾c s¾c tè , ®a u tuû vµ mét sè ung th thËn . Mét Inerferon kh¸c lµ interferon beta -1b còng ®îc cÊp phÐp n¨m 1993 dïng ®Ó ch÷a bÖnh ®a s¬ cøng . Nh×n nhËn Interferon lµ sù rùc s¸ng hay lµ tèi t¨m ®iÒu ®ã phô thuéc vµo viÔn c¶nh cña nã .Thªm n÷a lµ interferon cã thÓ sö dông trong l©m sµng ch÷a nhiÒu bÖnh do virut vµ çc bÖnh ung th . Çc nhµ khoa häc ®· chØ râ r»ng Interferon cã thÓ ®îc sö dông nh çc lo¹i thuèc xÞt ®Ó ng¨n chÆn çc bÖnh c¶m cóm th«ng thêng . VÒ nh÷ng bÊt lîi th× interferon cßn kh¸ ®¾t ®á v× vi khuÈn kh«ng thÓ tæng hîp ®îc mét glycoprotein lín nh interferon . §Ó kh¾c phôc t×nh tr¹ng nµy çc nhµ khoa häc ®· c¶m øng vi khuÈn ®Ó tæng hîp ra mét interferon lai (hybrid interferon) , ®iÒu ®ã cã nghÜa lµ interferon ®îc tæng hîp theo m· di truyÒn cña çc interferon kh¸c nhau ®îc nèi l¹i víi nhau . 5.3.3. Çc ph©n tö antisense. §Çu thÕ kû 20 , mét nhµ sinh ho¸ ®îc gi¶i thëng Nobel ®¸ng ®îc chó ý lµ Paul Ehrlich , «ng ®· ®a vµo y häc mét kh¸i niÖm “viªn ®¹n ma thuËt” (magic bullets). Ehrlich ®· mêng tîng ra mét thø thuèc cã kh¶ n¨ng tÊn c«ng çc vi sinh vËt mµ kh«ng g©y ra mét t¸c dông phô nµo trong c¬ thÓ . DÇn dÇn , Ehrlich ®· ®Þnh vÞ ®îc mét t¸c nh©n ho¸ trÞ liÖu ®èi víi bÖnh giang mai , vµ «ng ®· ®Æt mét viªn ®¸ t¶ng cho ho¸ trÞ liÖu hiÖn ®¹i . Çc nhµ nghiªn cøu DNA ngµy nay ®ang t×m kiÕm çc d¹ng kh¸c cña viªn ®¹n ma lùc nµy -®ã lµ mét ph©n tö ®Þnh híng vµo mét ®Ých trong tÕ bµo chø kh«ng ph¶i lµ vµo toµn bé tÕ bµo . DÜ nhiªn çi ®Ých ®ã kh«ng cã ë çc tÕ bµo khoÎ m¹nh vµ nã còng kh«ng cÇn thiÕt cho çc chøc 76

n¨ng cña tÕ bµo b×nh thêng . H¬n n÷a , nã lµ mét ph©n tö ho¸ häc chØ ®îc s¶n xuÊt ra khi tÕ bµo bÞ x©m nhiÔm . Cã thÓ lµ viªn ®¹n ma lùc ®· lo¹i th¶i ph©n tö ®Ých vµ hoµn tr¶ sù khoÎ m¹nh cho tÕ bµo . Ch¼ng h¹n nh chóng ta h·y xem xÐt çi g× sÏ x¶y ra khi mét ngêi bÞ nhiÔm HIV hay AIDS ? Trong trêng hîp nµy th× HIV n»m trong nh©n cña tÕ bµo bÞ nhiÔm nh mét ph©n tö DNA . ë ®©y HIV m· cho viÖc s¶n sinh çc virut míi . Nã ®îc sö dông nh mét çi khu«n ®Ó tæng hîp ph©n tö mRNA .TiÕng lãng trong Ho¸ sinh tøc lµ ph©n tö mRNA nµy mang th«ng tin “cã ý nghÜa” , tøc lµ th«ng tin nµy cã thÓ ®îc dïng ®Ó tæng hîp mét enzym cho viÖc s¶n xuÊt çc virut AIDS míi . §Ó lµm ngõng viÖc s¶n xuÊt çc h¹t HIV míi çc nhµ Ho¸ sinh ®· thiÕt kÕ mét ph©n tö mRNA tæng hîp Ph©n tö mRNA tæng hîp nµy cã mét tr×nh tù çc baz¬ ni t¬ bæ cøu víi çc ph©n tö cÇn ph¸t hiÖn (sense) .Ph©n tö mRNA tæng hîp nµy ®îc gäi lµ ph©n tö antisense. Khi dïng trong trÞ liÖu çc antisense ®i vµo çc tÕ bµo bÞ x©m nhiÔm vµ g¾n ®Æc hiÖu víi ph©n tö mRNA bæ cøu cña nã , gièng nh lÊy tay tr¸i n¾m lÊy tay ph¶i . Khi ph©n tö mRNA bÊt ho¹t th× sù tæng hîp cña virut ®îc kÕt thóc vµ sù x©m nhiÔm gi¶m ®i . N¨m 1992 , lÇn ®Çu tiªn ph©n tö Antisense ®îc dïng ®Ó kh¸ng l¹i HIV , bëi v× çc test víi çc tÕ bµo bÞ x©m nhiÔm trong phßng thÝ nghiÖm ®· cho kÕt qu¶ lµm gi¶m mét çch ®¸ng kÓ virut trong tÕ bµo ( H×nh 5.9).

H×nh 5.9. Ph©n tö Antisense dïng ®Ó lµm gi¸n ®o¹n sù sao chÐp cña virut trong çc tÕ bµo nhiÔm HIV .(a) Trong mét tÕ bµo bÞ x©m nhiÔm th× HIV n»m trong tÕ bµo ë d¹ng mét ph©n tö DNA gäi lµ provirut . Provirut sö dông mRNA m· cho protein ®Ó tæng hîp virut míi vµ sù x©m nhiÔm tiÕp tôc .(b) Ph©n tö Antisense cã mét tr×nh tù baz¬ bæ cøu víi mRNA ®ã . Khi nã vµo trong tÕ bµo th× ph©n tö Antisense hîp nhÊt víi mRNA (ph©n tö cÇn ph¸t hiÖn) vµ lµm bÊt ho¹t nã . V× kh«ng cã mRNA nªn kh«ng tæng hîp ®îc protein vµ sÏ kh«ng tæng hîp ®îc çc h¹t virut míi . VÒ lý thuyÕt th× sù x©m nhiÔm virut sÏ kÕt thóc . Mét øng dông thùc tiÔn kh¸c cña antisense RNA còng ®îc çc nhµ nghiªn cøu Anh th«ng b¸o n¨m 1988. Khi nghiªn cøu t¹o ra çc gièng cµ chua tèt h¬n çc nhµ nghiªn cøu ®· thµnh c«ng trong viÖc sö dông antisense RNA ®Ó kh¸o sù ho¹t ®éng cña çc gen lµm nÉu vµ lµm thèi cµ chua chÝn ; øc chÕ ®îc viÖc lµm nÉu th× cµ chua vµ nho sÏ ®îc vËn chuyÓn b»ng tÇu biÓn ®Ó ®i b¸n ë çc níc xa x«i . Çc ph©n tö antisense còng ®îc sö dông ®Ó lµm ®×nh chØ sù ho¹t ®éng cña çc t¸c nh©n g©y c¶m øng ung th Oncogenes . Ch¼ng h¹n nh n¨m 1989 , çc nhµ nghiªn cøu ë Trêng §¹i häc George town ®· sö dông thµnh c«ng antisense RNA ®Ó kho¸ sù biÓu hiÖn cña mét oncogene lµ raf . Gen nµy cã ë çc tÕ bµo ung th thanh qu¶n ®îc nu«i cÊy trong phßng thÝ nghiÖm . DNA cña antisense RNA ®îc cµi vµo çc tÕ bµo nµy sao cho çc tÕ bµo cã thÓ tù s¶n

xuÊt ra ph©ntö antisense . Çc nhµ ung th häc ®ang hy väng cã thÓ dõng sù ho¹t ®éng cña gen c¶m øng bÖnh b¹ch cÇu trong çc tÕ bµo tuû x¬ng b»ng çch cµi DNA m· cho antisense . Trêng hîp tèt nhÊt lµ cã thÓ ®a çc tÕ bµo ®· ®îc xö lý vµo tuû x¬ng cña bÖnh nh©n ®Ó tr¶ l¹i çc chøc n¨ng b×nh thêng cña tÕ bµo . §iÒu nµy còng rÊt thÝch hîp cho çc bÖnh nh©n ung th phæi . Trong nghiªn cøu antisense , çc nhµ nghiªn cøu ®· chó träng vµo mét thùc tÕ lµ chØ cã mét chuçi DNA m· cho mRNA cßn chuçi kia th× vÉn n»m yªn .Chuçi n»m yªn nµy lµ ph©n tö antisense tù nhiªn (natural antisense molecule) . ChÝnh v× thÕ çc nhµ khoa häc b¾t ®Çu víi mét b¶n sao DNA chuçi kÐp cña mét gen gèc , t¹o nªn mét d¹ng cã vai trß lµm ®¶o ngîc vµ ho¹t ho¸ ®îc chuçi n»m yªn . Nh vËy chuèi antisense ®îc chuyÓn thµnh mét chuçi cã ý nghÜa . Hä ®· hoµn tÊt viÖc chuyÓn ®æi ngîc nµy b»ng çch nèi vÞ trÝ promoter vµo c¹nh tr×nh tù mµ hä muèn tÕ bµo biÓu hiÖn vµ b»ng çch chuyÓn cùc cña bé x¬ng deoxyriboza-photphat .Chuçi nµy ®ang ®äc theo híng ngîc l¹i b©y giê cã promoter nªn l¹i ®äc theo híng thuËn chiÒu . Khi ®ã th× chuçi ho¹t tÝnh sÏ lµ antisense vµ trë nªn yªn lÆng .Ph©n tö ®îc m· bëi chuçi DNA ho¹t ho¸ míi lµ antisense RNA . Ngêi ®Çu tiªn cµi DNA ®Ó m· cho antisense RNA lµ Harold Weinstraub ë trung t©m ung th Fred Hutchinson , Seatle . Gi÷a nh÷ng n¨m 1980 , Weinstraub ®· nghiªn cøu sù ho¹t ®éng cña thymidin kinaza , mét enzym ®îc sö dông trong tæng hîp DNA . Nhãm cña Weinstraub ®· cµi ®îc mét ®o¹n DNA vµo trong çc tÕ bµo ®ang tæng hîp DNA ®Ó nh¾c nhë çc tÕ bµo s¶n xuÊt antisense kh¸ng l¹i mRNA m· cho Thymidin kinaza. Khi antisense RNA lµm t¾c nghÏn mRNA b×nh thêng th× sù tæng hîp thymidin kinaza bÞ dõng l¹i vµ sù tæng hîp DNA còng bÞ dõng l¹i mét çch bÊt ngê . Weinsraub lµ mét trong nh÷ng ngêi ®Çu tiªn chøng minh r»ng çc tÕ bµo nµy cã thÓ cèng hiÕn mét “ch¬ng tr×nh” Ho¸ sinh cho viªn ®¹n ma thuËt . Çc nhµ Ho¸ sinh còng cã thÓ tæng hîp ®îc nh÷ng ®o¹n nhá antisense DNA ®ång nhÊt ®Ó t×m hiÓu tr×nh tù cña DNA . Nh÷ng ®o¹n ng¾n nµy cã mét chuçi ®¬n DNA tæng hîp , chóng kh«ng ®i vµo nh©n vµ t¸c ®éng nh lµ mét DNA b×nh thêng .Tuy nhiªn , chóng l¹i ®i vµo tÕ bµo chÊt , ë ®ã chóng còng t¹o ®îc antisense RNA , tøc lµ chóng nhËn d¹ng ®îc vµ g¾n vµo çc tr×nh tù ®Ých trªn çc ph©n tö DNA . Nh÷ng ®o¹n DNA nhá nµy lµ çc oligonucleotit hay ®¬n gi¶n gäi lµ “oligo” . Çc oligo cã kho¶ng 15 cÆp baz¬ ®ñ ng¾n ®Ó ®i ®îc vµo çc tÕ bµo . ë ®©y chóng g¾n víi tr×nh tù mRNA bæ cøu cña chóng ®Ó t¹o thµnh ph©n tö lai mRNA:DNA . Sau ®ã enzym Ribonucleaza tÊn c«ng vµ ph©n huû ph©n tö lai nµy . Çc nhµ nghiªn cøu ®· sö dông oligo ®Ó kh¸ng l¹i çc virut AIDS , herpes Simplex vµ Influenza vµ kh¸ng l¹i trypanosoma brucei , protozoa g©y bÖnh ngñ ch©u Phi (H×nh 5..10)

H×nh 5.10 Hai ¶nh cña Trypanosoma brucei , mét protozoa g©y nªn bÖnh buån ngñ . Çc ph©n tö Antisense ®· sö dông cã mét sè kÕt qu¶ lµ ph¸ vì ®ùoc nh÷ng tæ chøc nµy trong c¬ thÓ . H×nh thø nhÊt lµ T.brucei trªn kÝnh hiÓn vi quang häc ; h×nh thø hai trªn hiÓn vi ®iÖn tö quÐt cña T.brucei . Trong c¶ 2 h×nh çc ®èi tîng ®Òu bao quanh çc tÕ bµo hång cÇu . Hä còng thiÕt kÕ oligo ®Ó ®i vµo tËn nh©n tÕ bµo vµ chóng tù Ðp vµo nh÷ng phÇn ®Ých ®Æc hiÖu trªn çc vßng xo¾n cña çc xo¾n kÐp DNA . Khi g¾n víi DNA th× nã trë thµnh mét oligo cÆp 3 (triplex) ®Ó ng¨n ngõa kh¶ n¨ng øc chÕ tæng gîp mRNA cña gen . B»ng çch nµy gen g©y bÖnh

cã thÓ ®îc dËp t¾t . Çc thö nghiÖm oligo trªn bÖnh nh©n bÖnh b¹ch cÇu vµ virut g©y khèi u còng ®ang b¨t ®Çu . §iÒu l¹c quan cña ph©n tö antisense lµ tÊt c¶ çc mèi liªn quan ®· ®îc ®Ò cËp tríc khi çc ph©n tö nµy ®îc sö dông trong thùc tiÔn . Tuy nhiªn çc ph©n tö ®îc s¶n xuÊt theo kiÓu nµy th× gi¸ thµnh kh¸ ®¾t vµ l¹i ph¶i sö dông víi liÒu lîng lín th× míi cã t¸c dông . Nh÷ng ph©n tö nµy cã thÓ ®i vµo trong çc tÕ bµo (chóng ph¶i hoµ tan trong lipit cña mµng tÕ bµo ) vµ ph¶i hoµ tan trong tÕ bµo chÊt (ph¶i hoµ tan trong níc ) vµ ph¶i kh¸ng l¹i ®îc sù ho¹t ®éng cña çc enzym cña tÕ bµo vµ ph¶i cã kh¶ n¨ng g¾n vµo çc ph©n tö mRNA ®Ých cña chóng . Ngoµi nh÷ng mèi liªn quan nµy , cßn rÊt nhiÒu vÊn ®Ò kh¸c n÷a : Ch¼ng h¹n nh ph©n tö antisense chØ híng vµo mRNA cña ngêi , vËy lµm thÕ nµo ®Ó thö test trªn ®éng vËt . Hay lµm sao çc nhµ nghiªn cøu cã thÓ x¸c ®Þnh ®îc r»ng oligo kh«ng tù hoµ nhËp víi DNA b×nh thêng ? Vµ liÖu oligo cã tÊn c«ng hÖ miÔn dich cña bÖnh nh©n hay kh«ng? Vµ chóng cã thÓ ®îc híng dÉn ®Ó tíi çc ®Ých tÕ bµo ®Æc hiÖu cña chóng nh thÕ nµo ? Cßn FDA l¹i quan t©m tíi ®iÒu antisense lµ “mét sinh vËt” hay lµ mét thø thuèc ? Çc ph©n tö antisense ®¹i diÖn cho mét øng dông hÊp dÉn cña c«ng nghÖ DNA vµ di truyÒn ph©n tö (mÆc dï nã lµ “di truyÒn cæ ®iÓn”) . Ýt nhÊt lµ ®· cã hµng chôc c«ng ty c«ng nghÖ sinh häc hiÖn nay ®ang nghiªn cøu vÒ çc øng dông cña chóng vµ çc nhµ c«ng nghÖ sinh häc ®· ra mét t¹p chÝ chuyªn ngµnh cã tªn lµ Antisense Rearch and development . §é chÝnh x¸c cña çc ph©n tö antisense lµm chóng ta hy väng r»ng chóng kh«ng g©y ra çc t¸c dông phô vµ antisense lµ mét tÊm g¬ng ®Ó khÝch lÖ trÝ tëng tîng cña çc nhµ nhµ thùc hµnh vÒ nhiÒu vÊn ®Ò quý gi¸ trong y häc vµ trong c«ng nghÖ . 5.4.Vac xin TruyÒn thèng kÓ laÞ r»ng nh÷ng thÇy thuèc Trung hoa ®· biÕt chñng ®Ëu ngay tõ ®Çu thÕ kû XI . Hä ®· c¹o vÕt th¬ng cña nh÷ng ngêi bÞ ®Ëu mïa råi thæi thø bét ®ã vµo mòi cña nh÷ng ngêi khoÎ m¹nh . KÕt qu¶ lµ nh÷ng ngêi nµy Ýt bÞ ®Ëu mïa khi dÞch bïng ph¸t . Mét ph¬ng ph¸p kh¸c còng cã hiÖu qu¶ nhng khoa häc h¬n lµ tiªm chñng . Ph¬ng ph¸p nµy ®îc ph¸t triÓn tõ nh÷ng n¨m 1700 bëi mét thÇy thuèc ngêi Anh tªn lµ Jenner. Jenner lu ý thÊy r»ng nh÷ng ngêi lµm ë trang tr¹i vµ nh÷ng ngêi v¾t s÷a , tøc lµ gÇn nh÷ng con bß th× bÞ mét bÖnh ®Ëu mïa thÓ nhÑ gäi lµ ®Ëu bß , hay lµ bÖnh ®Ëu bß . Hä cho r»ng nÕu ai ®· tù g©y cho m×nh bÖnh ®Ëu bß th× hä sÏ kh«ng bÞ bÖnh ®Ëu mïa nÆng . Jenner ®· theo ®uæi viÖc tiªm chñng nh÷ng ngêi t×nh nguyÖn víi çc chÊt liÖu lÊy tõ çc vÕt th¬ng ®Ëu bß . Sau ®ã mÊy tuÇn «ng ®· thÝ nghiÖm tiªm chñng víi çc chÊt liÖu cña ®Ëu mïa . ThËt lµ tuyÖt vêi lµ nh÷ng ngêi ®· ®îc tiªm chñng th× kh«ng bÞ ®Ëu mïa n÷a . N¨m 1798 Jenner ®· xuÊt b¶n mét cuèn s¸ch nhá lÞch sö nãi chi tiÕt nh÷ng lîi Ých cña viÖc tiªm chñng ®Ëu bß cho ngêi . Nh÷ng thÇy thuèc cã tiÕng ®· x¸c nhËn nh÷ng khuyÕn ço cña Jenner vµ chØ trong vµi n¨m ph¬ng ph¸p cña Jenner ®· ®îc øng dông trªn kh¾p ThÕ giíi . ChØ riªng ë Anh ®· cã trªn 10.000 ngêi ®îc tiªm chñng ®Çu nh÷ng n¨m 1800. Ch¼ng bao l©u dÞch ®Ëu mïa ®· l¾ng xuèng . ThËt vËy , bÖnh ®Ëu mïa kh«ng cßn t×m thÊy bÊt cø ®©u trªn ThÕ giíi tõ th¸ng 10 n¨m 1977. Çch ®©y h¬n 100 n¨m çc nhµ khoa häc ®· hiÓu ®îc c¬ së miÔn dÞch cña bÖnh ®Ëu mïa : §ã lµ çc virut ®Ëu bß kÝch thÝch hÖ miÔn dÞch cña c¬ thÓ ®Ó t¹o ra çc ph©n tö protein gäi lµ kh¸ng thÓ . Çc kh¸ng thÓ ®· lµm trung hoµ virut ®Ëu bß còng nh çc virut ®Ëu mïa nguy hiÓm chÕt ngêi . Çc vac xin hiÖn ®¹i còng ho¹t ®éng theo kiÓu Êy . Chóng huÊn luyÖn cho hÖ miÔn dÞch kh¶ n¨ng nhËn d¹ng çc tæ chøc ngo¹i lai vµ ®¸p øng b»ng kh¸ng thÓ vµ çc biÖn ph¸p b¶o vÖ kh¸c ®Ó gi÷ an toµn cho c¬ thÓ .Çc vac xin hiÖn ®¹i ®îc tinh chÕ tèt h¬n çc vac xin cña Jenner . Chóng bao gåm 3 d¹ng vËt liÖu : Vi khuÈn chÕt hoÆc bÊt ho¹t ; hoÆc lµ çc ®o¹n hay çc ph©n tö ®i tõ mét vi khuÈn .Trong ba lo¹i vac xin ®ã th× lo¹i thø 3 lµ an toµn nhÊt bëi v× nã kh«ng chøa vi khuÈn hoÆc virut ®Ó cã thÓ g©y ®îc bÖnh cho c¬ thÓ . Nh÷ng ph©n tö vi khuÈn hoÆc çc ®o¹n virut ®îc sö dông lµm vac xin ®Òu lµ çc m¶nh díi ®¬n vÞ (subunit) . Nh÷ng díi ®¬n vÞ nµy t¸c ®éng nh çc kh¸ng nguyªn , tøc lµ chóng kÝch thÝch hÖ miÔn dÞch cã ®¸p øng ®Æc hiÖu . MÆc dÇu çc kh¸ng nguyªn chØ lµ çc ph©n tö ho¸ häc , nhng chóng vÉn cã thÓ gîi ®îc mét ®¸p øng kh¸ng thÓ ®ñ m¹nh ®Ó chèng l¹i nh÷ng tæ chøc sèng ®· lät vµo trong c¬ thÓ . BÖnh viªm phæi do vi khuÈn lµ mét bÖnh ®· ®îc kh¸ng l¹i b»ng çc vac xin díi ®¬n vÞ (subunit) . Mét vac xin ®îc bµo chÕ tõ çc polysacarit vá cña streptococcus pneumoniae ( mét nguyªn nh©n chÝnh g©y viªm phæi) ®· ®îc cÊp phÐp n¨m 1983 . §iÒu ®¸ng tiÕc lµ kh«ng ph¶i tÊt c¶ çc v¸c xin díi ®¬n vÞ ®Òu th¾ng lîi nh nhau . Ch¼ng h¹n nh trong nh÷ng n¨m ®Çu vµ gi÷a 1980 , khi ®ã v¸c xin viªm gan B ®ùoc sö dông lµ lo¹i v¸c xin ®îc s¶n xu©t tõ çc m¶nh virut thu nhËn tõ m¸u ngêi , mµ nh vËy th× cã kh¶ n¨ng lµ trong m¸u sÏ cã HIV vµ nh÷ng ngêi ®îc tiªm vac xin nµy sÏ bÞ nhiÔm HIV . Lo¹i vac xin nµy ngµy nay kh«ng cßn dïng n÷a , thay vµo ®ã lµ mét lo¹i vac xin ®îc s¶n xuÊt b»ng c«ng nghÖ DNA .

Lo¹i vac xin nµy ®ang ®îc sö dông mét çch réng r·i vµ ch¾c ch¾n nã sÏ cßn ®îc sö dông trong t¬ng lai . 5.4.1.Vac xin viªm gan B Vac xin viªm gan B thÕ hÖ míi ®îc s¶n xuÊt b»ng c«ng nghÖ DNA . Thµnh phÇn chÝnh cña vac xin nµy lµ protein bÒ mÆt cña virut viªm gan B ®ã lµ HBsAg (kh¸ng nguyªn bÒ mÆt viªm gan B) . Protein nµy lµ mét m¶nh virut thu nhËn tríc tõ m¸u ngêi vµ ®îc sö dông lµm vac xin . Çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· x¸c ®Þnh ®îc gen cña HBsAg vµ dïng çc tÕ bµo nÊm men ®Ó t¹o ra çc b¶n sao cña kh¸ng nguyªn ®Ó dïng trong vac xin díi ®¬n vÞ .NÊm men ®îc sö dông ®Ó s¶n xuÊt ra vac xin lµ Sacharomyces cereviciae –mét lo¹i nÊm men v« h¹i dïng trong lªn men vµ lµm b¸nh m× . §Ó t¹o çc díi ®¬n vÞ , gen HBsAg ®îc cµi vµo mét vec t¬ biÓu hiÖn (plasmid) tõ mét tÕ bµo nÊm men , çc nhµ Sinh ho¸ ®· sö dông vÞ trÝ promoter tõ gen cña nÊm men m· cho enzym alcohol dehydrogenaza; trªn vec t¬ plasmid cßn cã mét tr×nh tù kÕt thóc tõ gen nÊm men vµ mét nguyªn mÉu b¶n sao cña vi khuÈn . Thªm vµo ®ã , vec t¬ nµy cßn cã c¶ çc dÊu chuÈn (markers) kh¸ng kh¸ng sinh vµ mét gen chØ ph¸t triÓn ®îc khi cã mÆt mét amino axit l¬ xin . Plasmid ®îc cÊu tróc nh thÕ sÏ ®îc cµi vµo çc tÕ bµo nÊm men . Çc tÕ bµo nÊm men t¸i tæ hîp nµy sÏ ®îc chän ra b»ng çch nu«i cÊy trong m«i trêng kh«ng cã l¬ xin . Sau ®ã çc tÕ bµo sÏ ph¸t triÓn dÇy ®Æc trong çc b×nh lªn men c«ng nghiÖp . Mét trong sè çc protein mµ chóng s¶n xuÊt ra ®· ®îc x¸c ®Þnh lµ HBsAg . Díi ®¬n vÞ nµy hiÖn nay cã thÓ ®îc t¸ch chiÕt ra vµ sö dông lµm vac xin . N¨m 1987 , vac xin viªm gan B tæng hîp ®Çu tiªn ®· ®îc phÐp sö dông trong céng ®ång . Nh·n hiÖu Recombivax vµ Engerix –B lµ 2 s¶n phÈm cña 2 c«ng ty s¶n xuÊt vac xin . §ã lµ çc vac xin an toµn bëi nã kh«ng chøa toµn bé virut hoÆc virut ®· ®îc khö ho¹t tÝnh hoÆc lµm gi¶m hiÖu lùc. Vac xin nµy còng kh«ng cã kh¶ n¨ng g©y ph¶n øng dÞ øng víi çc thµnh phÇn cña m« sèng (bëi v× nã lµ vac xin chØ chøa çc virut ®· ®îc nu«i cÊy ) vµ nã còng kh«ng bÞ nhiÔm çc chÊt bÈn tõ çc thµnh phÇn cña nÊm men hoÆc lÉn çc protein kh«ng mong muèn . Ngay tõ nh÷ng n¨m ®Çu tiªn sö dông , v¸c xin nµy ®· trë thµnh mét vò khÝ ®îc chÊp thuËn ®Ó giíi h¹n sù lan trµn cña virut viªm gan B . Nã ®îc dïng ®Ó tiªm chñng cho nh÷ng ngêi lµm c«ng viÖc b¶o vÖ søc khoÎ nh çc b¸c sÜ , çc phÉu thuËt viªn , y t¸ , b¸c sÜ r¨ng miÖng , çc kü thuËt viªn trong phßng thÝ nghiÖm. Nã còng ®îc khuyÕn ço cho bÊt kú ai cã tiÕp sóc víi m¸u vµ çc chÊt tiÕt cña c¬ thÓ , ch¼ng h¹n nh çc kü thuËt viªn lµm nhiÖm vô cÊp cøu hay nh÷ng ngêi lµm c«ng viÖc tang lÔ , lÝnh cøu ho¶ , c«ng an v.v.. Çc b¸c sÜ nhi khoa còng khuyªn nªn dïng vac xin cho c¶ trÎ s¬ sinh , hiÖn nay ®· ®a vµo ch¬ng tr×nh tiªm chñng më réng cho trÎ s¬ sinh ë ViÖt nam . Nhng vÉn cßn tån taÞ mét vÊn ®Ò lµ liÖu cã ®¶m b¶o ch¾c ch¾n r»ng vac xin nµy ®· ®Õn víi tÊt c¶ nh÷ng ngêi cÇn ph¶i gióp ®ì kh«ng ? Vac xin t¸i tæ hîp ph¶i ®îc tiªm 3 lÇn trong thêi h¹n 6 th¸ng . Nhng cã nhiÒu ngêi ®· kh«ng ®îc tiªm ®ñ liÒu . VÊn ®Ò ®a “cµ chua viªm gan B’ vµo sö dông , çc nhµ khoa häc ë c«ng ty c«ng nghÖ sinh häc Texas ®· thµnh c«ng trong viÖc cµi gen viªm gan B vµo trong çc tÕ bµo cña c©y cµ chua . Nh÷ng c©y ®· ®îc c«ng nghÖ ho¸ nh thÕ sÏ s¶n xuÊt ra çc kh¸ng nguyªn viªm gan B cïng víi çc kh¸ng nguyªn cña chÝnh chóng . Çc nhµ c«ng nghÖ cña c«ng ty ®· nh×n thÊy tríc mét ngµy nµo ®ã viÖc tiªm chñng viªm gan B sÏ ®¬n gi¶n nh khi chóng ta ¨n cµ chua trong mét b÷a ¨n tra . 5.4.2.Vac xin AIDS. Nh÷ng kinh nghiÖm thu ®îc ®èi víi vac xin viªm gan B ®· khÝch lÖ çc nhµ khoa häc sö dông c«ng nghÖ DNA ®Ó s¶n xuÊt çc lo¹i vac xin kh¸c . u tiªn nhÊt trong sè ®ã lµ vac xin AIDS . Mét sè vac xin AIDS hiÖn nay ®ang ph¸t triÓn hoÆc ®ang trong giai ®o¹n thö nghiÖm . Trong vac xin nµy cã çc díi ®¬n vÞ , ®Æc biÖt lµ çc glycoprotein g¾n víi HIV . Cã 2 glycoprotein lµ gp 120 vµ gp 41 ë vá HIV. Tríc hÕt ta thÊy gp 120 cã mÆt ë nh÷ng mám nhän trong líp vá . Thø nh× lµ gp 41 n»m díi gp 120 . Khi HIV g¾n vµo tÕ bµo lympho trong c¬ thÓ th× ph©n tö gp 120 g¾n víi vÞ trÝ receptor . Sau ®ã ph©n tö gp 41g¾n vµo mµng tÕ bµo chñ vµ gióp cho virut ®i vµo tÕ bµo chÊt . Çc nhµ s¶n xuÊt vac xin nh×n nhËn qu¸ tr×nh nµy nh lµ mét con ®êng réng mªnh m«ng trong viÖc øc chÕ HIV . Hä còng ®· x¸c ®Þnh ®îc gen cña ph©n tö gp 120 vµ gp 41 vµ ®· cµi ®îc nh÷ng gen nµy vµo çc tÕ bµo E.Coli . Vi khuÈn nµy ®· s¶n xuÊt ra mét lîng lín gp 120 vµ gp 41 ®Ó sö dông nh mét vac xin . Khi tiªm vµo nh÷ng ngêi t×nh nguyÖn , çc glycoprotein sÏ kÝch thÝch t¹o kh¸ng thÓ ®Ó g¾n vµo çc glycoprotein t¬ng øng . KÕt qu¶ lµ trung hoµ çc vÞ trÝ g¾n gp 120 vµ gp 41 vµ tr¸nh cho HIV g¾n vµo çc lympho-T cña tóc chñ (H×nh .5.11)

H×nh 5.11. Vac xin kh¸ng HIV ho¹t ®éng nh thÕ nµo ? (a) Khi HIV g¾n víi tÕ bµo chñ cña nã th× ph©n tö gp 120 trong líp vá cña virut g¾n víi vÞ trÝ receptor CD4 trªn bÒ mÆt tÕ bµo chñ . (b) ViÖc g¾n khëi ®Çu nµy vÉn kh«ng che khuÊt ph©n tö gp 41 còng ë trªn vá virut . Khi gp41 g¾n vµo bÒ mÆt tÕ bµo chñ nã më ®êng tiÕn vµo cho virut . (c) Mét vac xin kh¸ng HIV cã thÓ chøa çc ph©n tö gp 120 vµ gp 41.Ph©n tö gp 120 sÏ kÝch thÝch hÖ miÔn dÞch cña c¬ thÓ ®Ó t¹o ra çc kh¸ng thÓ kh¸ng gp 120, tr¸nh t¹o liªn hîp gp20-CD4 .(d) Ph©n tö gp 41 còng kÝch thÝch hÖ miÔn dÞch ®Ó t¹o ra çc kh¸ng thÓ kh¸ng gp41. Çc kh¸ng thÓ nµy tr¸nh cho sù liªn hîp Virut tÕ bµo .NÕu phßng chèng ®îc sù liªn hîp nµy th× sù x©m nhiÔm sÏ kh«ng x¶y ra n÷a . Tríc khi vac xin AIDS trë thµnh hiÖn thùc th× cã v« sè çc vÊn ®Ò thiÕt thùc cÇn ph¶i gi¶i quyÕt .Ch¼ng h¹n nh çc ph©n tö gp120 vµ gp 41 lµ nh÷ng chÊt kÝch thÝch rÊt kÐm ®èi víi hÖ miÔn dÞch v× thÕ cÇn ph¶i ®Þnh vÞ ®îc mét ph©n tö chÊt mang (carrier) thÝch hîp . Råi cßn vÊn ®Ò test , bëi v× m« h×nh test trªn ®éng vËt nãi chung lµ kh«ng thÝch hîp ®èi víi çc thö nghiÖm v¸c xin . H¬n n÷a HIV vÉn cßn sèng trong çc tÕ bµo chñ dãi d¹ng mét ph©n tö DNA mµ çc kh¸ng thÓ th× l¹i kh«ng vµo ®îc bªn trong çc tÕ bµo chñ . Cßn mét vÊn ®Ì n÷a lµ HIV còng cã ®ét biÕn do ®ã nã còng lµm gi¶m t¸c dông cña vac xin . Cuèi cïng lµ sù th¸ch thøc vÒ liÒu lîng HIV cã thÓ kh«ng ®îc qu¶n lý bëi nh÷ng ngêi tiªm chñng mét çch m¹o muéi vac xin nµy . Tuy nhiªn, chØ riªng t¹i Hoa kú hiÖn nay cã tíi 20 triªô ngêi cÇn vac xin AIDS v× thÕ viÖc ph¸t triÓn vac xin nµy vÉn lµ mét u tiªn hµng ®Çu . §Õn thêi ®iÓm ®ang viÕt cuèn s¸ch nµy th× ®· cã nhiÒu vac xin AIDS ®ang ®îc thö nghiÖm trªn ngêi vµ chóng ta hy väng chóng sÏ sím ®îc sö dông mét çch hiÖu qu¶ vµ an toµn nh vac xin viªm gan B . 5.4.3.Çc lo¹i vac xin kh¸c . C«ng nghÖ DNA còng ®îc sö dông trong nghiªn cøu vac xin Influenza vµ herpes simplex. Mét d¹ng vac xin míi ®ang ®îc nghiªn cøu ®èi víi nh÷ng bÖnh nµy . Vac xin nµy bao gåm vac xin ®Ëu bß (®· ®îc Jenner sö dông) ®îc nèi víi bé gen (genome) cña mét sè virut .Virut ®Ëu bß lµ mét vËt mang tèt bëi v× chóng kh«ng nguy hiÓm vµ çc tÝnh chÊt Ho¸ sinh ®· ®îc biÕt râ . 81

H¬n n÷a, virut nµy kh«ng tiÒm tµng trong çc tÕ bµo cña c¬ thÓ (còng nh çc virut kh¸c nh herpesvirut) vµ thao t¸c t¬ng ®èi dÔ bëi v× chóng cã kÝch thíc lín . Vµ virut ®Ëu bß cã thÓ ®iÒu tiÕt ®îc çc ®o¹n DNA ngo¹i lai trong bé gen cña nã vµ khi gi¶i phãng vµo trong t¬ng bµo tÕ bµo chñ th× bé gen biÓu hiÖn thªm c¶ phÇn nã mang theo . Virut nµy nu«i cÊy ®îc t¬ng ®èi dÔ dµng vµ lµm gi¶m ®îc gi¸ thµnh chÕ t¹o . H¬n n÷a nã cã thÓ ®îc lµm ®«ng kh« vµ gi÷ ®îc nhiÒu n¨m , v× thÕ cho phÐp vËn chuyÓn ®i çc n¬i mµ kh«ng cÇn ph¶i gi÷ ë ®iÒu kiÖn l¹nh mµ vÉn kh«ng bÞ mÊt hiÖu lùc . Lîi thÕ quan träng cña viÖc sö dông vac xin ®Ëu bß t¸i tæ hîp lµ nã kÝch thÝch ®Ò kh¸ng rÊt cao . Ch¼ng h¹n nh vac xin díi ®¬n vÞ chØ kÝch thÝch çc lympho –B ®Ó t¹o kh¸ng thÓ . Th× vac xin virut toµn phÇn kÝch thÝch c¶ lympho –B lÉn lympho –T. Çc lympho –T tÊn c«ng vµ ph¸ huû çc tÕ bµo nhiÔm virut .ThËt vËy khi sö dông vac xin chøa virut toµn phÇn th× møc b¶o vÖ cña nã rÊt cao vµ tÝnh miÔn dÞch ®îc kÐo dµi h¬n . Virut ®Ëu bß lÇn ®Çu tiªn ®îc sö dông nh lµ mét chÊt mang ®· ®îc th«ng b¸o n¨m 1986 bëi çc nhµ virut häc Bernard Moss , Dennis Panicali vµ Enzo Paoletti. Tõ ®ã mét quy tr×nh gåm 2 bíc ®· c«ng nghÖ ho¸ çc vac xin díi ®¬n vÞ víi bé gen ®Ëu bß . Bíc thø nhÊt lµ tËp hîp vec t¬ cµi plasmid . Plasmid nµy cã chøa çc gen ngo¹i lai (ch¼ng h¹n nh herpesvirut ,virut thuû ®Ëu), mét promoter ®Ëu bß tù nhiªn kh¸c ®Ó híng plasmid vµo mét vïng ®Æc hiÖu trong bé gen ®Ëu bß . Plasmid t¸i tæ hîp nµy sau ®ã ®îc khuÕch ®¹i (nh©n lªn ) trong çc tÕ bµo E.Coli råi ®îc ph©n lËp vµ lµm tinh khiÕt . Çc plasmid nµy lµ çc vec t¬ cµi plasmid . Tíi bíc thø 2 , çc nhµ virut häc lÊy çc tÕ bµo ®éng vËt sèng cho kÝch thÝch nhiÔm víi çc virut ®Ëu bß vµ çc vec t¬ cµi plasmid . Khi virut nh©n lªn th× çc vec t¬ cµi plasmid tù hîp nhÊt ë mét ®iÓm chuyªn biÖt cho çc gen ®Ëu bß tù nhiªn trªn vec t¬ (H×nh 5.12)

H×nh 5.12. S¶n xuÊt vec t¬ ®Ëu bß ®Ó sö dông trong vac xin . (a) virut ®Ëu bß t¬i ®îc xö lý ®Ó lo¹i ®i DNA vµ cho thªm vµo çc gen viªm gan B (HEP) .(b) Sau ®ã çc gen tõ virut herpes Simplex(HER) vµ (c) vµ tõ virut Influenza (INF) ®îc g¾n vµo . Çc ®o¹n DNA ®Ëu bß sau ®ã ®îc ph©n dßng trong çc tÕ bµo E.Coli ®Ó t¨ng thªm sè lîng vµ s¶n xuÊt çc vec t¬ cµi plasmid . (d) Çc plasmid ®îc ®a vµo çc tÕ bµo chñ ®ång thêi víi çc virut ®Ëu bß , Virut ®Ëu bß nµy c¶m øng DNA cu¶ tÕ bµo m· cho çc virut dËu bß míi , (e) trong khi tæng hîp Virut , plasmid g¾n víi çc DNA ®Ëu bß b×nh thêng ®Ó s¶n xuÊt ra çc virut ®Ëu bß t¸i tæ hîp . (f) Çc virut ®îc gi¶i phãng ra tõ çc tÕ bµo ®îc sö dông nh çc vac xin .

Sù hîp nhÊt nµy x¶y ra ë vïng gen m· cho enzym Thymidin kinaza (TK) lµm cho gen nµy sÏ bÞ mÊt ®i vµ virut t¸i tæ hîp nµy sÏ kh«ng s¶n xuÊt ®îc Thymidin kinaza . Lµm mÊt kh¶ n¨ng nµy cã 2 t¸c dông lín : Thø nhÊt , v× kh«ng cã enzym nªn virut nµy x©m nhiÔm Ýt h¬n çc virut ®Ëu bß b×nh thêng . Thø 2 , cã thÓ nu«i ®îc çc tÕ bµo virut t¸i tæ hîp ®îc chän ra tõ çc quÇn thÓ khi thªm acyclovir vµo . Acyclovir lµ mét thuèc kh¸ng virut , nã tiªu diÖt çc tÕ bµo bÞ nhiÔm çc virut biÓu hiÖn thymidin kinaza .Thuèc nµy v« h¹i víi çc tÕ bµo nhiÔm çc virut mµ kh«ng tæng hîp enzym nµy . Tõ cuèi nh÷ng n¨m 1980 , çc vac xin kiÓu ®Ëu bß ®· ®îc s¶n xuÊt ®Ó kh¸ng l¹i bÖnh viªm gan B , herpes Simplex , Influenza , bÖnh sèt rÐt còng nh kh¸ng l¹i çc bÖnh d¹i ®éng vËt vµ çc bÖnh môn níc ë miÖng . Cho tíi thêi ®iÓm 1996 cha cã lo¹i vac xin nµo ®îc cÊp giÊy phÐp cña FDA bëi v× nã cßn liªn qua tíi vÊn ®Ò an toµn . (Tuy nhiªn , çc vac xin dùa trªn c¬ së virut ®èi víi bÖnh th¬ng hµn th× ®· ®îc cÊp phÐp tõ n¨m 1990). Çc tranh luËn cho r»ng virut t¸i tæ hîp ®ã cã thÓ ph¸t t¸n vµo ngêi vµ g©y nªn nh÷ng hËu qu¶ bÊt ngê hoÆc nh÷ng biÕn chøng ®e do¹ tíi cuéc sèng nh bÖnh viªm n·o ch¼ng h¹n . Nh÷ng ngêi ®Ò xíng ra lo¹i vac xin nµy ®· chØ râ r»ng hä ®· sµng läc cÈn thËn vÒ çc vÊn ®Ò tiÒm Èn cña vac xin còng nh lµm h¹n chÕ tíi møc cao nhÊt ®èi víi c¶ 2 vÊn ®Ò liªn quan .Mét vÊn ®Ò tiÒm Èn n÷a lµ vac xin nµy cã thÓ kh«ng cã hiÖu qu¶ ®èi víi nh÷ng ngêi ®· tiªm chñng vac xin ®Ëu bß ®Ó phßng tr¸nh bÖnh ®Ëu mïa . Tuy nhiªn , trÎ em b©y giê kh«ng cßn dïng vac xin nµy n÷a nªn ®iÒu nµy kh«ng cßn liªn quan g× n÷a trong t¬ng lai . §Ó tiÕp tôc çc vÊn ®Ò liªn quan tíi virut ®Ëu bß , mét c«ng tr×nh nghiªn cøu réng lín ®· ®îc thùc hiÖn víi viÖc sö dông virut Fowlpox nh mét chÊt mang . Mèi liªn quan gÇn gòi víi çc virut ®Ëu bß lµ virut Fowlpox chØ nh©n lªn ë chim . Çc thÝ nghiÖm cña Enzo Paoletti n¨m 1992 ®· x¸c ®Þnh r»ng virut Fowlpox vÉn cßn ®ñ ho¹t tÝnh ®Ó chuyÓn çc gen díi ®¬n vÞ thµnh t¸c nh©n g©y bÖnh d¹i . Mét chÊt mang kh¸c cã thÓ lµ mét vi khuÈn , çc nhµ c«ng nghÖ DNA hiÖn nay ®ang nghiªn cøu sö dông BCG ®Ó mang çc gen ký sinh trïng . BCG tøc lµ bacille Calmette Guerin , ®ã lµ mét chñng Bacillus lµnh tÝnh trªn ®éng vËt ®· ®îc dïng ë nhiÒu n¬i trªn ThÕ giíi (ngo¹i trõ ë Hoa kú) ®Ó g©y miÔn dÞch kh¸ng bÖnh lao . Çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· thiÕt kÕ l¹i Bacillus nµy b»ng çch thªm mét gen tõ ký sinh trïng protozoa Leishmania tropia . Ký sinh trïng nµy g©y bÖnh Leishmaniasis , mét bÖnh m¸u t¸c ®éng ®Õn quan ®éi trong cuéc chiÕn vïng vÞnh Ba t . BCG c«ng nghÖ ho¸ biÓu hiÖn gen ký sinh trïng trªn bÒ mÆt cña nã vµ c¶m øng ®¸p øng çc lympho –T . Çc test trªn ®éng vËt ®ang ®îc thùc hiÖn víi lo¹i vac xin nµy .Mét lo¹i vac xin toµn phÇn kh¸c ®îc chuÈn bÞ b»ng çch lµm thay ®æi bé gen cña tæ chøc . §Ó lµm t¨ng kh¶ n¨ng ®¸ng chó ý ®ã ngêi ta thÊy r»ng trong çc nghiªn cøu vÒ vac xin tríc ®ã çc nhµ khoa häc ®· chuÈn bÞ ®îc mét chñng g©y bÖnh yÕu b»ng çch kÐo dµi qu¸ tr×nh nu«i cÊy cã thÓ lµ sau nhiÒu tuÇn , nhiÒu th¸ng hay nhiÒu n¨m mét tæ chøc th× sÏ lµm cho tæ chøc Êy mÊt kh¶ n¨ng g©y bÖnh nhng vÉn gi÷ ®îc kh¶ n¨ng t¸c ®éng nh mét t¸c nh©n g©y miÔn dÞch . Ngµy nay çc nhµ c«ng nghÖ DNA cã thÓ c¾t bá çc gen cña mét tæ chøc m· cho çc protein c¶m øng bÖnh . Vac xin bÖnh t¶ lµ mét vÝ dô vÒ kü thuËt theo kiÓu nh thÕ ®· thu ®îc th¾ng lîi . BÖnh t¶ lµ mét bÖnh g©y ra bëi Vibrio Cholerae , nã cã trong níc vµ thùc phÈm bÞ nhiÔm bÈn . Khi vµo trong ®êng tiªu ho¸ cña ngêi , V.Cholerae s¶n xuÊt ra mét protein ®éc tè lµm c¶m øng çc tÕ bµo ë thµnh ®êng tiªu ho¸ , gi¶i phãng mét lîng lín natri, bicacbonat ,vµ çc ion kh¸c . Níc cuèn ®i cïng çc ion vµ bÖnh nh©n sím bÞ tiªu ch¶y å ¹t víi lîng níc bÞ mÊt tõ 8 ®Õn 10 Quart (®¬n vÞ ®o lêng cña Anh b»ng 1,14 lit) trong vßng vµi giê vµ tÝnh m¹ng bÖnh nh©n lu«n bÞ ®e do¹ . §Ó g©y miÔn dÞch chèng l¹i bÖnh t¶ , ngêi ta vÉn dïng vibrio Cholerae chÕt . N¨m 1992 , çc nhµ nghiªn cøu ë Trêng §¹i häc Maryland ®· x¸c ®Þnh ®îc gen cña protein ®éc tè nµy , sau ®ã lo¹i bá nh÷ng gen ®ã trong V. Cholerae t¹i phßng thÝ nghiÖm .(H×nh 5.13)

H×nh5.13. ¶nh qua kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö quÐt cña Vibrrio Cholerae . Vi khuÈn nµy ®îc chuÈn bÞ nh mét vac xin b»ng çch lo¹i bá khái nhiÔm s¾c thÓ mét gen cã tiÒm Èn g©y bÖnh . Çc vi khuÈn V. Cholerae bÞ yÕu ®i vµ thêng dïng ®Ó lµm vac xin t¶ . Mét vac xin t¶ míi hiÖn ®ang trong giai ®o¹n thö nghiÖm vµ triÓn väng sÏ cã mét vac xin kh¸c cã kÕt qu¶ tèt ra ®êi . Nh÷ng thÝ nghiÖm theo çch ®ã ®· lµm “tµn phÕ” çc t¸c nh©n g©y bÖnh toµn cÇu nh bÖnh sèt rÐt , bÖnh Leishmanniasis , bÖnh g©y buån ngñ vµ bÖnh s¸n m¨ng (Schitosomiasis). Mét tiÕp cËn míi ®èi víi nghiªn cøu vac xin ®· b¸o tríc r»ng sÏ cã nh÷ng thÕ hÖ vac xin t¬ng lai ®îc s¶n xuÊt theo c«ng nghÖ DNA . Ch¾c Edward Jenner cµng tù hµo víi nh÷ng thµnh qu¶ tõ nh÷ng nhµ khoa häc nèi tiÕp theo con ®êng cña «ng . 5.5. §éNG VËT CHUYÓN GEN Vµ NH÷NG øNG DôNG THùC TIÔN CñA §VCG. Kü thuËt di truyÒn ®· ¶nh hëng rÊt lín ®Õn viÖc nghiªn cøu cÊu tróc vµ biÓu hiÖn cña gen trong çc tÕ bµo ®éng vËt . Trong viÖc s¶n xuÊt protein t¸i tæ hîp nguån gèc ®éng vËt bËc cao thêng ®a l¹i nh÷ng kÕt qu¶ tèt nhÊt khi sö dông çc tÕ bµo ®éng vËt nu«i cÊy , v× nhiÒu khi chóng lµ vËt chñ duy nhÊt ®¶m b¶o cho sù biÓu hiÖn b×nh thêng cña çc gen ®éng vËt . §éng vËt chuyÓn gen ®· ®îc sö dông trong y häc vµ ®· thu ®îc nh÷ng kÕt qu¶ ®¸ng khÝch lÖ . DÜ nhiªn còng kh«ng tr¸nh khái nh÷ng hiÖu qu¶ kh«ng mong muèn . ViÖc s¶n xuÊt Insulin , çc chÊt ho¹t ho¸ plasminogen , çc yÕu tè ®«ng m¸u v.v.. ®Òu cã sù ®ãng gãp cña ®éng vËt chuyÓn gen . Díi ®©y chóng ta h·y xem xÐt chi tiÕt ®«i chót vÒ ®éng vËt chuyÓn gen còng nh nh÷ng øng dông c¬ b¶n cña nã trong y häc . 5.5.1. Nhòng kh¸i niÖm c¬ b¶n vÒ ®éng vËt chuyÓn gen vµ nh÷ng øng dông cña chóng. Ngµy nay, çc nhµ c«ng nghÖ sinh häc ®· t¹o ®îc mét nhãm lín çc ®éng vËt cã nh÷ng kh¶ n¨ng “kú diÖu” tëng chõng nh ®ã chØ lµ çc giÊc m¬ trong khoa häc , ch¼ng h¹n nh lîn cã thÓ tæng hîp ®îc hemoglobin ngêi , bß tæng hîp ®îc çc protein g¾n s¾t cña ngêi , dª cã thÓ s¶n xuÊt ra çc lo¹i thuèc ®Ó ch÷a bÖnh x¬ nang, hay çc ®éng vËt kh¸ng l¹i çc bÖnh kh«ng cã kh¶ n¨ng cøu ch÷a . §ã chÝnh lµ çc ®éng vËt chuyÓn gen . Nh÷ng con vËt nµy ®îc cÊy thªm mét hoÆc nhiÒu gen trong tÕ bµo . MÆc dï phøc t¹p vÒ kü thuËt , nhng quy tr×nh ®Ó t¹o dùng mét ®éng vËt chuûªn gen th× t¬ng ®èi ®¬n gØan . Çc gen ngo¹i lai , ch¼ng h¹n nh gen Hemoglobin ngêi sÏ ®îc tiªm vµo nh©n cña tÕ bµo trøng ®· thô tinh , sau ®ã ®îc nu«i cÊy vµ sµng läc . Sau ®ã ph«i ®îc ®a vµo çc “bµ mÑ ®Î thay” ®Ó cho nã ph¸t trÓn vµ sinh ®Î. DÜ nhiªn lµ rÊt hiÕm trêng hîp 84

mµ tÊt c¶ çc m¶nh ghÐp ®Òu phï hîp nh kiÓu xÕp h×nh ,vµ chØ khi ®ã míi cã ®îc mét ®éng vËt chuyÓn gen.Trong nh÷ng n¨m 1970, çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· miÖt mµi nghiªn cøu vÒ lÜnh vùc nµy , b¾t ®Çu víi vi khuÈn råi nÊm, protozoa tíi thùc vËt . Hä ®· ph¸ vì hµng rµo ng¨n çch cña con ngêi víi çc gen trÞ liÖu vµ ®· th¾ng lîi trong viÖc thu ®îc çc ®éng vËt chuyÓn gen . TÊt c¶ çc íc väng cña con ngêi dÇn dÇn ®îc ®¸p øng. 5.5.2.§a DNA vµo çc tÕ bµo ®éng vËt cã vó. §Ó t¹o ra mét ®éng vËt chuyÓn gen ngêi ta ph¶i sö dông çc ph¬ng ph¸p míi ®Ó ®a DNA vµo trong çc tÕ bµo ®éng vËt. Cho tíi gi÷a nh÷ng n¨m 1970, míi chØ cã mét çch lµ lai çc tÕ bµo soma . Trong kü thuËt nµy , 2 tÕ bµo kh«ng cã quan hÖ hä hµng (mét tÕ bµo chøa DNA thùc nghiÖm) hoµ vµo nhau vµ çc tÕ bµo nµy ®îc kÝch thÝch cho ph¸t triÓn vµ nh©n lªn . Nhng ®¸ng tiÕc lµ khi hai tÕ bµo hoµ nh©n vµo nhau th× thêng lo¹i mÊt ®i mét sè chÊt liÖu cña nhiÔm s¾c thÓ , trong ®ã cã c¶ DNA thùc nghiÖm. Vµ nh vËy lµ qu¸ tr×nh hîp nhÊt kh«ng thµnh c«ng . Trong nh÷ng n¨m gi÷a 1970 cã mét ph¬ng ph¸p míi sö dông can xi phot phat , ph¬ng ph¸p nµy ®îc çc nhµ nghiªn cøu thuéc Trêng §¹i häc Leiden Hµ lan ph¸t triÓn. Çc nhµ nghiªn cøu ®· trén çc ®o¹n DNA ngo¹i lai víi can xi phot phat ®Ó t¹o ra tña DNACan xi . Khi tña nµy ®îc trén víi çc tÕ bµo ®éng vËt nu«i cÊy th× çc tÕ bµo nµy sÏ thÊm vµo m¹nh h¬n rÊt nhiÒu so víi khi kh«ng dïng can xi . Sù kiÖn nµy cã kh¶ n¨ng dÉn tíi sù h×nh thµnh endocytosis trong tÕ bµo . Endocytosis lµ mét qu¸ tr×nh trong ®ã tÕ bµo h×nh thµnh mét líp mµng bao quanh çc ch©n gi¶ vµ ®Èy çc nang vµo trong bµo t¬ng cña nã. Nhng cã mét khã kh¨n lµ kh«ng cã çch nµo ®Ó x¸c ®Þnh xem tÕ bµo ®· ®îc g¾n lªn çc h¹t DNA- Can xi cha vµ bÊt kú mét tÕ bµo nµo biÕn n¹p th× còng bÞ mÊt ®i cïng víi ®¸m tÕ bµo kh«ng biÕn n¹p . Ngµy nay ph¬ng ph¸p vi tiªm ®îc sö dông réng r·i , nã rÊt ®¬n gi¶n vµ thao t¸c trùc tiÕp (H11.1) . Ngêi ta lÊy mét pipet thuû tinh m¶nh ®a vµo ngän löa lµm cho ®Çu mót cña nã bÞ nÊu ch¶y. Mét çch nhanh chãng , çc nhµ kü thuËt ®· t¹o ra ®îc mét ®Çu mót siªu m¶nh , ®êng kÝnh vµo kho¶ng tõ mét nöa ®Õn vµi micromet (1% ®êng kÝnh cña sîi tãc). Micropipet nµy ®¬n gi¶n lµ mét xy lanh cã ®Çu cùc m¶nh . Nã ®îc ®a vµo mét m¸y vi tiªm vµ ®îc hót ®Çy víi çc ®o¹n DNA hoÆc vec t¬ cã chøa gen ®Ó cµi. Çc nhµ thÝ nghiÖm kiÓm so¸t micropipet b»ng çch nh×n qua thÞ kÝnh cña mét kÝnh hiÓn vi vµ dïng pipet ®Ó kÑp tÕ bµo cho tíi khi thùc hiÖn ®îc viÖc tiªm .

H×nh 5.14 :Thùc hiÖn vi tiªm . TÕ bµo ë trung t©m ®îc gi÷ bëi mét vËt ë phÝa ph¶i . Mét microsyring cã DNA ®Ó cµi vµo tÕ bµo n»m ë phÝa tr¸i . Sù hîp nhÊt cña DNA víi bé gen cña tÕ bµo ®éng vËt cã thÓ ë møc cao hoÆc thÊp tuú thuéc vµo c¸c ®iÒu kiÖn thùc nghiÖm.

Thùc hiÖn vi tiªm rÊt mÊt thêi gian vµ tèn kÐm ®ång thêi cêng ®é lao ®éng l¹i cao. Tuy nhiªn, nã l¹i cã nhiÒu lîi thÕ bëi v× DNA Ýt bÞ mÊt h¬n so víi ph¬ng ph¸p dïng can xi vµ ph¬ng ph¸p nµy kh«ng ®o× hái mét çch tuyÖt ®èi vÒ dÊu chuÈn gen ®Ó chØ râ tÕ bµo nµo ®· ®a ®îc DNA vµo . Tuy nhiªn, tû lÖ hîp nhÊt DNA víi nh©n tÕ bµo ®éng vËt cã thÓ t¬ng ®èi cao, tuú thuéc vµo ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm .Nh ®· ®Ò cËp , ph¬ng ph¸p hîp nhÊt DNA trë thµnh mét c«ng cô thÝch hîp ®èi víi chuyÓn gen ®éng vËt. §èi víi çc ph¬ng ph¸p ®ßi hái cã dÊu chuÈn th× ngêi ta thêng dïng çc tÕ bµo ®éng vËt cã gen m· ho¸ cho enzym Thymidin kinaza(TK). Chøc n¨ng cña enzym TK trong çc tÕ bµo ®éng vËt lµ rót hÕt çc nucleotit thymidin tõ çc DNA ®· sö dông tõ tríc vµ hîp nhÊt chóng thµnh çc ph©n tö DNA míi . Th«ng thêng th× çc tÕ bµo ®éng vËt kh«ng cÇn enzym TK bëi v× chóng cã çch thay thÕ ®Ó hoµn thµnh môc ®Ých ®ã .V× vËy khi dïng çc chÊt øc chÕ (inhibitor) , çc nhµ c«ng nghÖ DNA cã thÓ giÕt chÕt çc tÕ bµo cã sö dông enzym TK vµ cho thÊy sù chuyÓn ho¸ thymidin b»ng çc ph¬ng ph¸p thay thÕ .Nh vËy nh÷ng tÕ bµo cßn sèng sãt sau qu¸ tr×nh chän läc nµy cã chøa çc ph©n tö thymidin lµ do chóng tù tæng hîp ®îc chø kh«ng ph¶i ®a tõ bªn ngoµi vµo. §Ó tæng hîp thymidin , çc tÕ bµo ph¶i cã çc s¶n phÈm th« tõ m«i trêng së t¹i . Tuy nhiªn, nÕu Hypoxanthin vµ aminopterin cã mÆt trong m«i trêng th× chóng sÏ øc chÕ tæng hîp thymidin vµ tÕ bµo kh«ng ph¸t triÓn ®îc . VËy b¾t buéc trong trêng hîp kh«ng cã thymidin trong m«i trêng th× çc tÕ bµo sÏ ph¶i sö dông çc chÊt trªn.Tuy nhiªn ®iÒu ®ã l¹i kh«ng x¶y ra , bëi v× çc tÕ bµo thiÕu enzym TK th× l¹i cÇn bæ sung thªm thymidin. V× vËy trong phßng thÝ nghiÖm mét m«i trêng bao gåm hypoxanthin (H), aminopterin(A) vµ Thymin(T) gäi lµ m«i Trêng HAT th× çc tÕ bµo kh«ng ph¸t triÓn ®îc (H×nh 5.15).

H×nh 5.15: Dïng dÊu chuÈn TK ®Ó x¸c ®Þnh xem gen ®· ®îc cµi cha. (a) Çc tÕ bµo ®éng vËt dïng enzym Thymidin Kinaza (TK) ®Ó thu nhËn thymidin tõ m«i trêng sinh trëng vµ t¹o nªn DNA cho çc tÕ bµo míi . Nh÷ng tÕ bµo nµy sÏ bÞ chÕt do k×m h·m sù ho¹t ®éng cña TK . (a)Nh÷ng tÕ bµo cßn sèng sãt lµ do sù thu nhËn thymidin b»ng çch sö dông çc gen X , Y vµ Z ®Ó m· cho thymidin trong tÕ bµo chÊt . Nh÷ng tÕ bµo nµy sö dông ®Ó cµi gen . (b) Çc tÕ bµo nµy ®îc ®a vµo m«i trêng cã chøa hypoxanthin (H) vµ aminopterin (A) , nh÷ng chÊt nµy øc chÕ sù tæng hîp thymidin do sù can thiÖp vµo ho¹t ®éng cña çc gen X , Y vµ Z . Vµ khi thiÕu thymidin th× tÕ bµo sÏ chÕt kÓ c¶ khi cã thymidin trong m«i trêng sinh trëng . (c) Gen TK ®îc g¾n vµo mét ®o¹n DNA ®Ó cµi vµo tÕ bµo. NÕu cµi thµnh c«ng th× gen TK sÏ cã chøc n¨ng .Vµ mÆc dï thiÕu H vµ A trong m«i trêng sinh trëng , nhng thymidin vÉn thu nhËn ®îc ®Ó t¹o thµnh DNA cho sù s¶n xuÊt tÕ bµo míi . Nh÷ng tÕ bµo nµy sÏ ph¸t triÓn vµ çc nhµ c«ng nghÖ cã thÓ ®¶m b¶o r»ng gen mong muèn ®· ®îc cµi vµo tÕ bµo . HiÖn nay, çc nhµ c«ng nghÖ DNA ®· cµi mét gen cña enzym TK vµo mét ®o¹n DNA råi l¹i cµi vµo çc tÕ bµo ®éng vËt .NÕu çc ®o¹n DNA vµ gen TK cña nã ®· cµi ®îc trong tÕ bµo th× gen TK nµy sÏ m· ho¸ cho enzym TK . Khi ®ã tÕ bµo cã thÓ sö dông enzym nµy trong m«i trêng HAT ®Ó thu nhËn thymidin tõ m«i trêng vµ t¹o thµnh DNA míi cho çc qu¸ tr×nh cña tÕ bµo vµ lµm cho nã ph¸t triÓn .

Nh vËy, theo suy diÔn th× nÕu tÕ bµo ph¸t triÓn tøc lµ nã ®· tiÕp nhËn ®îc gen TK . Ngîc l¹i nÕu tÕ bµo bÞ chÕt tøc lµ çc tÕ bµo kh«ng cã kh¶ n¨ng tiÕp nhËn gen TK vµ kh«ng t¹o ra ®îc enzym TK vµ chóng kh«ng sèng ®îc trong m«i Trêng HAT. N¨m 1977, Michael Wiger vµ ®ång nghiÖp ë Trêng §¹i häc Columbia ®· sö dông thµnh c«ng dÊu chuÈn TK ®Ó chøng minh sù hîp nhÊt cña çc gen virut víi çc tÕ bµo ®éng vËt. Khi sö dông can xi phot phat nh mét chÊt mang ngêi ta ®· lÊy çc gen tõ virut Herpes Simplex råi g¾n chóng vµo gen TK . Qua tña DNA-Canxi thÊy râ ®ã lµ çc tÕ bµo lÊy tõ mét con chuét ®· bÞ biÕn n¹p. Nh÷ng thÝ nghiÖm nµy chøng tá çc dÊu chuÈn TK sö dông cã hiÖu lùc ë çc tÕ bµo ®éng vËt . Mét dÊu chuÈn kh¸c còng sím ®îc ph¸t triÓn lµ dÊu chuÈn Alu (Alu marker). §©y lµ tr×nh tù lÆp cña çc cÆp baz¬ , nã cã tªn nh vËy v× enzym giíi h¹n Alu1 ®iÒu khiÓn dÊu chuÈn nµy .Cã kho¶ng 300.000 b¶n sao çc tr×nh tù Alu trong bé gen ngêi . Sè b¶n sao ë çc ®éng vËt kh¸c th× cã sù thay ®æi . B»ng viÖc sö dông çc ®Çu dß cã chÊt phãng x¹ ®· t×m ®îc sè çc tr×nh tù lÆp hiÖn diÖn vµ çc nhµ c«ng nghÖ DNA cã thÓ x¸c ®Þnh ®îc d¹ng DNA nµo cã mÆt . Ch¼ng h¹n nh muèn xem xÐt sù cã mÆt cña DNA ngêi trong bé gen cña ®éng vËt th× ngêi ta t×m kiÕm dÊu chuÈn Alu ngêi vµ x¸c ®Þnh cã bao nhiªu b¶n sao tån t¹i trong çc tÕ bµo thùc nghiÖm nµy .

H×nh 5.16: Nh÷ng ®éng vËt chuyÓn gen ®Çu tiªn . §©y lµ nh÷ng con chuét ®Î cïng løa , chuét bªn ph¶i lµ b×nh thêng cßn chuét bªn tr¸i cã gen cña hormon sinh trëng ®îc cµi vµo trong tÕ bµo v× thÕ nªn kÝch thíc hai con chuét kh¸c h¼n nhau.

Ph¬ng ph¸p hîp nhÊt DNA vµ viÖc sö dông çc dÊu chuÈn chän läc lµ rÊt cÇn thiÕt ®èi víi çc thÝ nghiÖm c«ng nghÖ sinh häc nh»m ph¸t triÓn çc ®éng vËt chuyÓn gen . 5.5.3..T¹o çc ®éng vËt theo ý muèn. N¨m 1983, 2 con chuét bÐ nhá dêng nh gièng nhau ®îc sinh ra tõ mét chuét mÑ .C¶ hai ®Òu cã mµu x¸m, m¾t ®en vµ chóng cã thÓ thay ®æi ®îc çc biÓu hiÖn nµy .Nh÷ng con vËt nµy kh¸c nhau vÒ mÆt di truyÒn . Mét con ph¸t triÓn víi kÝch thíc b×nh thêng cßn con kia th× trë nªn to lín cùc ®¹i . Con thø hai nµy ®· ph¸t triÓn víi bé gen ®· ®îc biÕn ®æi , ®ã lµ nh÷ng con vËt biÕn ®æi gen ®Çu tiªn (H11.3). Ralph Brinster ë Trêng §¹i häc Pensylvania vµ Richard Palmiter thuéc Trêng §¹i häc Washington lµ nh÷ng ngêi cã nh÷ng thÝ nghiÖm tiªn phong vÒ çc ®éng vËt biÕn ®æi gen . Brinster vµ Palmiter ®· ph©n lËp vµ t¸ch dßng gen m· ho¸ cho hormon sinh trëng cña chuét råi g¾n nã vµo mét promoter. Hä dïng promoter cña gen metallothionein (MT) (mét gen m· ho¸ protein g¾n kim lo¹i). Promoter nµy ®ãng m¹ch cho gen hormon sinh trëng khi promoter MT ®îc c¶m øng bëi mét kim lo¹i trong m«i trêng , ch¼ng h¹n nh kim lo¹i cadimi . Së dÜ nh vËy bëi v× ®Ó t¹o hormon trong mét m« ®Æc hiÖu th× ®Òu ph¶i bæ sung thªm cadimi-mét chÊt c¶m øng (kim lo¹i) dïng ®Ó kÝch thÝch promoter (MT) nh»m thóc ®Èy gen ngo¹i lai ho¹t ®éng (gen hormon). Khi sö dông kü thuËt nh thÕ nµy , Brinster vµ Palmiter ®· chuÈn bÞ mét plasmid chimeric cã chøa gen hormon sinh trëng vµ promoter MT. Sau ®ã hä ®a plssmid nµy vao mét tiÒn nh©n (pronuclei) cña trøng chuét ®· ®îc thô tinh . Sau thô tinh 12 giê , cã thÓ thu thËp çc tÕ bµo trøng ®· thô tinh tõ vßi tö cung cña chuét çi –tríc lóc cã sù ph©n chia tÕ bµo . Plasmid cã thÓ ®îc tiªm vµo tiÒn nh©n víi ph¬ng ph¸p vi tiªm. Khi ®· ®îc tiªm plasmid , nh÷ng trøng ®· thô tinh ®îc t¸ch ra vµ ®a vµo èng Fallopian cña mét chuét çi ®Î thay (surrogate). §Ó kÝch thÝch sù mang thai “mét çch tù nhiªn “chuét çi ®îc giao phèi víi mét chuét ®ùc ®· c¨t bá èng dÉn tinh. Sau khi ®Î, nh÷ng con chuét con ®îc lµm test xem ®· cã mÆt gen hormon sinh trëng hay cha . Khi çc gen ®· hîp nhÊt th× thªm Cadimi vµo m«i trêng ®Ó c¶m øng promoter MT vµ hormon sinh trëng ®îc tæng hîp . §iÒu lý thó víi çc nhµ nghiªn cøu lµ hä cã ®îc mét con chuét con ph¸t triÓn víi kÝch thíc gÊp ®«i kÝch thíc cña con chuét b×nh thêng.Tøc lµ con chuét con nµy ®· ®¹t kÝch cì cña mét con chuét lín . Tuy nhiªn , th¾ng lîi bíc ®Çu nµy l¹i bÞ l¾ng xuèng khi nhËn thÊy r»ng sù lín lªn vÕ kÝch cì vÉn cßn chøa ®ñ , bëi v× ®èi víi chuét chuyÓn gen cßn v« sè çc vÊn ®Ò vÒ sinh lý häc cÇn ph¶i gi¶i quyÕt nh mÊt kh¶ n¨ng sinh s¶n hay bÞ bÖnh ë çc c¬ quan, hoÆc vÊn ®Ò thøc ¨n ®èi víi ®éng vËt chuyÓn gen còng cÇn cã sù chuyÓn ®æi 5.5.3.1.Chuét mang hÖ thèng miÔn dÞch cña ngêi Nh÷ng thÝ nghiÖm cña Brinster vµ Palmiter ®· cæ vò çc nhµ khoa häc kh¸c theo ®uæi çc thÝ nghiÖm vÒ ®éng vËt chuyÓn gen . Mét trong sè çc kÕt qu¶ ®¹t ®îc lµ t¹o ®îc gièng chuét mang hÖ thèng miÔn dÞch cña ngêi (Human Mouse).§éng vËt nµy kh«ng ph¶i lµ s¶n phÈm cña vi tiªm gen , nãi mét çch chÝnh x¸c lµ kh«ng ph¶i lµ s¶n phÈm cña c«ng nghÖ DNA. §©y lµ mét ph«i cã çc tÕ bµo ngêi ®îc ph¸t triÓn cïng víi çc m« cña chuét vµ nh÷ng tÕ bµo ngêi sÏ trë thµnh mét bé phËn cña c¬ thÓ chuét. Çc thÝ nghiÖm vÒ chuét mang hÖ miÔn dÞch ngêi ®îc thùc hiÖn vµo n¨m 1988 do çc nhµ nghiªn cøu thuéc Trêng §¹i häc Stanford thùc hiÖn . DÉn ®Çu lµ Joseph M.McCun, nhãm nghiªn cøu nµy ®· lùa chän nh÷ng con chuét thiÕu hôt miÔn dÞch tæ hîp nghiªm träng (serve combined immunodeficiency –SCID) . §éng vËt nµy kh«ng ph¸t triÓn çc tÕ bµo cña hÖ thèng miÔn dÞch (na n¸ nh bÖnh thiÕu hôt miÔn dÞch ADA).

H×nh 5.17. Chuét cã hÖ thèng miÔn dÞch cña ngêi .(a) Çc nhµ nghiªn cøu ®a t m« tuyÕn øc ngêi vµo díi mµng cña thËn chuét th× nã kh«ng cã kh¶ n¨ng t¹o nªn hÖ miÔn dÞch. Tiªm m« h¹ch lympho vµo díi mµng cña thËn ®èi ngîc . (b) Çc tÕ bµo hÖ miÔn dÞch (tÕ bµo lympho T) ®îc tiªm qua ®u«i ®Ó tuÇn hoµn trong chuét . Nh÷ng tÕ bµo nµy ph¸t hiÖn çch ®Ó m« tuyÕn øc tiÕn gÇn tíi thËn . (c) Çc tÕ bµo hÖ miÔn dÞch ®· chÝn (lympho T chÝn) xuÊt hiÖn tõ m« tuyÕn øc vµ ®i vµo tuÇn hoµn råi tíi m« h¹ch lympho . Nh÷ng tÕ bµo nµy ®îc nh©n lªn trong m« h¹ch lympho vµ trë thµnh çc hµnh tinh cña hÖ miÔn dÞch . Çc nhµ nghiªn cøu ®· lÊy tuyÕn øc , çc h¹ch lympho vµ çc m« gan tõ ph«i ngêi bÞ sÈy thai ®Ó ®a vµo mµng tùa nh nang (capsulelike) bao quanh thËn chuét .Mét tuÇn sau ngêi ta cÊy çc tÕ bµo cña hÖ thèng miÔn dÞch cha chÝn tõ mét ph«i ngêi vµo chuét , hy väng r»ng çc tÕ bµo nµy sÏ chÝn trong c¬ thÓ chuét . Hai tuÇn sau khi cÊy ghÐp , chuét biÓu lé çc ®Æc tÝnh ®¸p øng miÔn dÞch víi c¶ lympho T vµ lympho B . Nh thÕ tøc lµ chuét ®· cã ®îc mét hÖ thèng miÔn dÞch cña ngêi . Chuét cã chøa hÖ thèng miÔn dÞch cña ngêi lµ mét tµi s¶n v« gi¸ ®èi víi nhiÒu thÓ lo¹i nghiªn cøu , ®Æc biÖt ®èi víi çc nghiªn cøu vÒ AIDS. Çc nhµ nghiªn cøu vÒ AIDS ®· bÞ h¹n chÕ nghiªm träng bëi thiÕu çc mÉu ®éng vËt tèt ®Ó lµm çc test trong phßng thÝ nghiÖm. Ch¼ng h¹n nh ch¼ng 90

cã ®éng vËt nµo trõ tinh tinh míi cã kh¶ n¨ng tiÕp xóc víi AIDS. Khi sö dông mét ®éng vËt cã çc tÕ bµo cña ngêi sÏ cho phÐp çc nhµ nghiªn cøu hiÓu ®îc çc vac xin thùc nghiÖm cã ®¸p øng hay kh«ng . H¬n n÷a, çc c«ng ty Dîc cã thÓ quan s¸t ®îc hiÖu øng cña çc thuèc míi tríc kh¶ n¨ng g©y nhiÔm cña HIV víi çc tÕ bµo cña hÖ thèng miÔn dÞch. 5.5.3.2.Chuét mang ung th (Oncomouse) Mét ®éng vËt kh¸c ®îc loan tin vµo n¨m 1988 lµ chuét mang ung th . Con chuét nµy ®îc Philip Leder thuéc Trêng §¹i häc Havard t¹o nªn . Leder ®· t¹o ra mét con chuét nh¹y c¶m cao víi ung th vó .Víi mét con chuét nh thÕ nã cho phÐp çc nhµ nghiªn cøu test chÝnh x¸c h¬n , hiÖu qu¶ h¬n çc t¸c nh©n g©y ung th (Carcinogens) còng nh ph¬ng ph¸p ®iÒu trÞ bÖnh ung th h¬n lµ víi nh÷ng con chuét b×nh thêng . H¬n n÷a , qua chuét bÞ g©y ung th sÏ lµm t¨ng sù hiÓu biÕt vÒ t¸c ®éng cña çc gen g©y ung th th nh thÕ nµo .

H×nh5.18: §éng vËt ®Çu tiªn ®îc nhËn b»ng s¸ng chÕ , ®ã lµ chuét mang ung th .B»ng s¸ng chÕ cña Trêng §¹i häc Havard vÒ ®éng vËt chuyÓn gen n¨m 1988.. Nhãm cña Leder nghiªn cøu gen g©y ung th cã tªn lµ c-myc .Trong nh÷ng nghiªn cøu tríc, çc nhµ nghiªn cøu ®· ghi chó r»ng gen nµy cã liªn quan ®Õn mét d¹ng u b¹ch huyÕt (lymphomas) ë trÎ em.Tuy nhiªn, víi sù cã mÆt cña virut g©y khèi u trªn vó chuét (mouse mammary tumor-MMT) th× gen nµy bÞ biÕn ®æi ®Ó c¶m øng ung th vó trªn çc ®éng vËt . Víi sù hiÓu biÕt nµy , çc nhµ nghiªn cøu ®· tæng hîp ®îc mét plasmid chimeric cã chøa c¶ virut MMT.Ngêi ta tiªm chimera vµo tiÒn nh©n cña çc tÕ bµo trøng chuét ®· thô tinh vµ cÊy çc tÕ bµo nµy vµo çc chuét mÑ mang thai hé . Nh÷ng chuét nµy kh«ng biÓu hiÖn bÞ ung th vó lóc cßn non , nhng khi trëng thµnh th× gen MMT sÏ ho¹t ®éng do nã ph¸ vì çc ho¹t ®éng b×nh thêng cña gen c-myc. BÖnh ung th vó ®· ®i theo vµ truyÒn l¹i cho tíi çc ®êi con ch¸u. Ngµy 12-4-1988 ®· ®i vµo lÞch sö khi c¬ quan vÒ çc b»ng s¸ng chÕ Hoa kú ®· c«ng nhËn b»ng s¸ng chÕ cho Havard vÒ chuét chuyÓn gen nh¹y c¶m víi ung th (H11.5). Nh÷ng con chuét nµy vµ çc thÕ hÖ con ch¸u cña chóng chÝnh thøc trë thµnh “Number 4.736.866 -®ã lµ nh÷ng ®éng vËt ®Çu tiªn ®îc nhËn b¸ng s¸ng chÕ (s¸ng chÕ ®Çu tiªn ®èi víi tæ chøc chuyÓn gen ®· ®îc thõa nhËn n¨m 1980 lµ vi khuÈn).

B¾ng s¸ng chÕ thø hai víi ®éng vËt còng lµ cña Leder vµ nhãm nghiªn cøu thuéc Trêng §¹i häc Havard cña «ng . N¨m 1991, çc nhµ nghiªn cøu ®· ph¸t triÓn mét con chuét ung th tuyÕn tiÒn liÖt khi nã ®· ph¸t triÓn . TuyÕn tiÒn liÖt lµ mét tuyÕn bao quanh ®êng tiÕt niÖu cña nam giíi (con ®ùc) rÊt dÔ bÞ ung th vµ thêng ph¶i phÉu thuËt c¾t bá .ë chuét th× b×nh thêng nã kh«ng x¶y ra trõ phi nã bÞ c¶m øng çc t¸c nh©n m«i trêng. Nhãm nghiªn cøu cña Leder ®· ph¸t triÓn mét mÉu chuét míi còng gièng nh ph¬ng ph¸p ®· xö lý víi nh÷ng con chuét tríc . Hä ghÐp gen g©y ung th int-2 vµo mét promoter virrut vµ cµi Chimera vµo çc trøng ®· thô tinh . KÕt qu¶ lµ nh÷ng con chuét nµy ®îc gäi lµ chuét tiÒn liÖt tuyÕn (prostate mice), biÓu lé râ rµng tuyÒn tiÒn liÖt ph×nh ®¹i ®óng nh ®· ®o¸n tõ tríc. 5.5.3.3.Çc ®éng vËt chuyÓn gen kh¸c. Mét ®éng vËt kh¸c ®îc t¹o ra theo ý muèn ®ã lµ chuét m¾c bÖnh Alzheimer . Postmortem ®· ph©n tÝch n·o cña nh÷ng ngêi bÞ bÖnh Alzheimer thÊy cã “nh÷ng tÊm” tÕ bµo thÇn kinh bÞ chÕt m¾c vµo çc sîi cña mét protein gäi lµ Amyloid .Vµi n¨m qua , çc nhµ nghiªn cøu ®· lµm tinh khiÕt ®îc amyloid vµ x¸c ®Þnh ®îc tr×nh tù amino axit cña chóng . Ngay sau ®ã mét protein tiÒn th©n ®· ®îc x¸c ®Þnh vµ tr×nh tù gen cña nã còng ®îc x¸c ®Þnh sau nµy . Qua tÊt c¶ çc thÝ nghiÖm , c©u hái vÒ mèi liªn quan cña amyloid trong bÖnh alzheimer vÉn cha ®îc gi¶i ®¸p . Nã lµ nguyªn nh©n cña bÖnh hay ®ã chØ lµ çc m¶nh vì cßn ®Ó l¹i bëi bÖnh nµy? Çc thÝ nghiÖm ®îc b¸o ço n¨m 1991 ®· lµm s¸ng tá vÊn ®Ò nµy.Nh÷ng nhµ c«ng nghÖ DNA n¨m Êy ®îc dÉn ®Çu bëi Jon Gordon ë bÖnh viÖn Mount Sinai New york ®· biÕn ®æi gen mét con chuét ®Ó nã cã dÊu hiÖu vµ triÖu chøng cña bÖnh Alzheimer. Nhãm cña Gordon ®· ®a çc gen tiÒn th©n amyloid vµo çc tÕ bµo trøng ®· thô tinh cña chuét vµ quan s¸t thÊy r»ng khi nh÷ng con chuét nµy trëng thµnh ®· tæng hîp ®îc Amyloid cña ngêi. Nhê ®Ëm ®é amyloid cã trong n·o cña ®éng vËt mµ ta cã ®îc cÊu h×nh ®Æc biÖt cña n·o víi çc tÊm amyloid trªn bÖnh nh©n Alzheimer . M« h×nh nµy ®· sao chÐp l¹i çc qu¸ tr×nh cña bÖnh mét çch chÝnh x¸c vµ lµm cho chóng ta hiÓu mét çch thùc tÕ vÒ c¨n bÖnh nµy . Mét trong sè nh÷ng mÆt chÕ phÈm nãng báng nhÊt trong di truyÒn ph©n tö ®¬ng thêi lµ chuét ®o v¸n (knockout mouse). §ã lµ mét con chuét mµ çc gen cho mét tæ chøc ®¬n lÎ hay mét hÖ thèng çc c¬ quan ®· bÞ lo¹i bá . Chuét knockout ®· t¹o nªn mét d¹ng míi cña çc thÝ nghiÖm cÊy ghÐp , çc thÝ nghiÖm mµ th¶i lo¹i kh«ng cßn lµ vÊn ®Ò nan gi¶i n÷a . Thùc vËy, v× çc ®éng vËt thÝ nghiÖm kh«ng cã hÖ miÔn dÞch nªn nã kh«ng lo¹i th¶i bÊt kú mét m« nµo ®îc cÊy ghÐp. §iÒu nµy rÊt quan träng bëi v× ë chuét bÞ SCID nguyªn b¶n vÉn cßn biÓu hiÖn lÎ tÎ mét vµi ho¹t tÝnh cña hÖ miÔn dÞch , ®ã còng lµ nguyªn nh©n g©y nguy hiÓm cho çc thÝ nghiÖm ®ang diÔn ra . L¹i trë vÒ çctin tøc tõ 1992 cña Ralph Brinster vµ Richard Palmiter cïng ®ång nghiÖp, ë thêi ®iÓm nµy ngêi ta ®· sö dông chuét knockout cã mét gen cã thÓ huû ho¹i gan cña ®éng vËt. Çc nghiªn cøu ®· ph¸t triÓn mét “gen tù s¸t (suicide gene), gen nµy cã thÓ giÕt mét çch chän läc çc tÕ bµo gan chuét . Theo sau sù chÕt cña çc tÕ bµo gan chuét, mét mÉu çc tÕ bµo gan ngêi ®îc cÊy vµo thay thÕ cho çc tÕ bµo gan chuét . B×nh thêng th× hÖ miÔn dÞch sÏ lo¹i th¶i nh÷ng tÕ bµo nµy , nhng v× sö dông çc tÕ bµo chuét knockout nªn sù lo¹i th¶i ®îc lo¹i trõ bëi v× chuét kh«ng cã hÖ thèng miÔn dÞch . Vµ nh vËy cã thÓ thay thÕ hoµn toµn c¶ mét c¬ quan nhê vµo c«ng nghÖ DNA. 5.5.3.4.Çc chÊt ph¶n øng sinh häc tõ ®éng vËt (Animal Bioreactor) MÆc dÇu çc ®éng vËt chuyÓn gen ®· ®îc quan t©m trong çc phßng thÝ nghiÖm vµ ®· ®em l¹i nh÷ng lîi Ých lín lao trong y häc , nhng c«ng nghÖ Ho¸ sinh DNA còng cÇn ph¶i ®îc ¸p dông víi çc ®éng vËt trong çc trang tr¹i v× nã còng ®em l¹i nh÷ng läi Ých kh«ng nhá . Tuy nhiªn, khi lµm viÖc víi çc vËt nu«i lín th× khã kh¨n h¬n v× nh÷ng ®éng vËt nµy kh«ng ®Î nhiÒu nh çc ®éng vËt nhá h¬n ë trong phßng thÝ nghiÖm . H¬n n÷a viÖc thao 92

t¸c cÊy ghÐp ph«i víi çc “bµ mÑ mang thai hé” còng khã kh¨n h¬n bëi v× kÝch cì cña nh÷ng ®éng vËt nµy lín h¬n . Trøng cña nhiÒu ®éng vËt nu«i l¹i cã tÕ bµo chÊt mê ®ôc , do ®ã kh«ng thÓ nh×n thÊy nh©n cña chóng nÕu nh kh«ng cã çc kü thu¹t ®Æc biÖt trî gióp , ch¼ng h¹n nh cÇn ph¶i cã mét giai ®o¹n ly t©m ng¾n ®Ó t¸ch tÕ bµo chÊt khái nh©n tÕ bµo . Tuy vËy, bÊt kú mét protein nµo ®îc t¹o ra bëi con ngêi th× còng thùc hiÖn ®îc trong nh÷ng ®éng vËt kh¸c miÔn lµ çc gen cña ®éng vËt ®· ®îc ch¬ng tr×nh ho¸ dï nã dµi ®Õn mÊy. TiÒm n¨ng nµy lµm cho ®éng vËt cã kh¶ n¨ng trë thµnh mét nhµ m¸y s¶n xuÊt çc chÊt ph¶n øng sinh häc. Thùc chÊt lµ ®éng vËt sÏ trë thµnh mét nhµ m¸y s¶n xuÊt thó«c nh çc b¸o thêng ghi lµ“Pharm animal (®éng vËt dîc phÈm) . Qu¸ tr×nh t¹o ra mét ®éng vËt chuyÓn gen b¾t ®Çu b»ng viÖc ghÐp nèi 2 gen tõ 2 dßng t¸ch biÖt . Mét gen m· cho çc protein theo mong muèn cßn gen kia th× ph¶n chiÕu l¹i çc tæ chøc hay çc tuyÕn cña ®éng vËt n¬i mµ protein®îc t¹o ra .Ch¼ng h¹n nh nÕu mét protein ®îc t¸ch ra tõ s÷a th× tuyÕn vó lµ n¬i s¶n sinh ra çc s¶n phÈm nµy . H¬n n÷a gen thø hai nµy l¹i ®ãng vai trß “kÕ to¸n” sinh ho¸ kh¸c ®èi v¬Ý çc s¶n phÈm protein . C«ng viÖc tiÕp theo lµ vi tiªm DNA lai vµo çc tÕ bµo trøng ®· thô tinh hoÆc vµo trong çc ph«i.Ngêi ta thÊy kho¶ng 5%-10% çc trêng hîp DNA ®îc cµi mét çch ngÉu nhiªn trong bé gen cña ph«i. Sau ®ã tÊt c¶ çc trøng ®îc chuyÓn tíi çc con mÑ vµ råi çc con vËt con sÏ ®îc sinh ra , chóng sÏ ®îc kiÓm tra xem ®· cã çc gen lai cha.Trong trêng hîp cña çc protein t¹o s÷a th× muèn ghÐp thµnh c«ng çc gen cÇn ph¶i thêi gian l©u h¬n bëi v× cßn ph¶i test l¹i thËt chÝnh x¸c v× b¶n th©n con çi lµ nßi mµ tríc ®©y nã ®· s¶n xuÊt ®îc s÷a , vÊn ®Ò ë ®©y lµ ph¶i x¸c ®Þnh vµ so s¸nh vÒ chÊt lîng còng nh sè lîng cña s÷a t¹o ra .Vµ nÕu con ch¸u cña chóng lµ con ®ùc th× qu¸ tr×nh nµy l¹i cµng ph¶i l©u h¬n n÷a . Tuy nhiªn, ngêi ta ®· x¸c ®Þnh ®îc “®éng vËt nÒn t¶ng” (founder animal), nã cã thÓ ®îc dïng ®Ó x©y dùng mét ®µn mµ kh«ng cÇn ph¶i dïng tíi ph¬ng ph¸p vi tiªm . Çc thÕ hÖ con ch¸u cña nã ho¹t ®énh nh lµ çc chÊt ph¶n øng sinh häc ®i tõ ®éng vËt . 5.5.3.5.Hemoglobin ngêi tõ lîn Mét vÝ dô vÒ Bioreactor lµ lîn chuûªn gen , nã tæng hîp ®îc hemoglobin ngêi .§éng vËt nµy lµ mét cét mèc vÒ hiÖu qu¶ trong viÖc t×m kiÕm çc chÊt thay thÕ m¸u . Nã ®îc dïng thay thÕ cho tÊt c¶ çc nhãm m¸u vµ gi÷ ®îc nhiÒu th¸ng (çc lo¹i m¸u cña ngêi cho chØ gi÷ ®îc vµi tuÇn ). H¬n n÷a chÊt thay thÕ m¸u cã thÓ kh«ng cã çc t¸c nh©n g©y bÖnh . N¨m 1991, çc nhµ nghiªn cøu ë c«ng ty C«ng nghÖ sinh häc New Jersy ®· th«ng b¸o ph¸t triÓn ®îc 3 con lîn chuyÓn gen. Hä ®· tiªm 2 gen m· ho¸ Hemoglobin vµo nh÷ng ph«i ®· giµ sau ®ã cÊy vµo lîn mÑ ®Î thÕ . Trong thÝ nghiÖm nµy chØ cã kho¶ng 5% sè ph«i ®îc tiªm lµ th¾ng lîi vµ chØ cã 3 con lîn cßn sèng ®îc cho tíi khi ®Î. Çc nhµ nghien cøu ph¸t hiÖn r»ng cã kho¶ng 15% hång cÇu lîn cã chøa Hemoglobin ngêi (85% cã hemoglobin lîn b×nh thêng). §Ó t¸ch chiÕt ®îc hemoglobin ngêi tinh khiÕt , çc nhµ nghiªn cøu ®· thu thËp m¸u lîn vµ ®a nã qua hÖ thèng t¸ch chiÕt vµ lµm tinh khiÕt råi ph©n biÖt ®©u lµ hemoglobin ngêi vµ ®©u lµ hemoglobin lîn dùa trªn sù kh¸c nhau vÒ ®é tÝch ®iÖn cña çc ph©n tö . Hemoglobin ngêi sau ®ã ®îc t¸ch chiÕt b»ng çch cho hÊp phô vµo mét chÊt liÖu tæng hîp ®Æc biÖt . Sau ®ã l¹i ®îc lÊy ra khái chÊt tæng hîp nµy vµ ®îc lµm tinh khiÕt . Kh¶ n¨ng cña çc hemoglobin c«ng nghÖ gen cã thÓ g¾n vµ vËn chuyÓn oxy t¬ng tù nh hemoglobin thùc thô cña ngêi . Khi ë d¹ng tù do trong m¸u , hemoglobin lîn sÏ bÞ ph¸ vì trong vßng vµi giê ®Õn vµi ngµy , ®iÒu ®ã cßn phô thuéc nhiÒu yÕu tè .Tuy nhiªn, hemoglobin nµy cã thÓ ®îc æn ®Þnh do çc liªn kÕt chÐo gi÷a çc protein ph©n tö vµ hemoglobin trÇn nµy cã thÓ thùc hiÖn ®îc nhiÖm vô gièng nh hemoblobin g¾n kÕt trong hång cÇu .

Hemoglobin trÇn cã lÏ kh«ng ®îc dïng trong trêng hîp bÞ mÊt nhiÒu m¸u qu¸ , cßn khi chØ mÊt 5-6 ®¬n vÞ m¸u th× vÉn dïng ®îc (khi phÉu thuËt réng). Hemoglobin nµy cã thÓ gióp cho bÖnh nh©n vît qua thêi kú nguy kÞch . Lîi thÕ chÝnh cña hemoglobin ®i tõ ®éng vËt lµ nã kh«ng cã çc yÕu tè g©y bÖnh cho ngêi .VÊn ®Ò lo¹i th¶i çc chÊt nhiÔm bÈn nãng lªn tõ nh÷ng n¨m 1980 do sù xuÊt hiÖn cña HIV trong çc ng©n hµng m¸u.Chóng ta cßn nhí sù kiÖn n¨m 1985 khi ph¸t hiÖn nhiÒu ngêi truyÒn m¸u ®· bÞ nhiÔm virut vµ ngay c¶ nh÷ng n¨m gÇn ®©y vµo ®Çu nh÷ng n¨m 1990 çc mÉu m¸u ®îc truyÒn ph¸t hiÖn thÊy virut viªm gan C (virut viªm gan B bÞ gi¶m thiÓu v× ®· cã çc test sµng läc ë çc phßng thÝ nghiÖm tõ vµi n¨m tríc) .Tuy nhiªn , sö dông hemoglobin trÇn cã thÓ cÇn thiÕt cho viÖc x¸c ®Þnh çc type m¸u cña ngêi nhËn vµ ngêi cho bëi v× nã kh«ng cã kh¸ng nguyªn bÒ mÆt cña hång cÇu . §iÓm bÊt lîi lµ nã cã thÓ cã chøa çc chÊt g©y bÈn g©y ra bëi virut ®éng vËt hay çc m¶nh vì cña tÕ bµo . Nh÷ng thø nµy cã thÓ g©y c¶m øng çc ph¶n øng dÞ øng . 5.5.3.6.Çc s¶n phÈm kh¸c cña ®éng vËt chuyÓn gen. Sù ph¸t trÓn thµnh c«ng vÒ lîn chuyÓn gen lµm ngêi ta cµng chê ®îi vÒ nh÷ng çi ®îc t¹o ra khi ®a mét gen vµo c¬ thÓ ®éng vËt . Mét ®éng vËt kh¸c ®îc nghiªn cøu ®ã lµ bß s¶n xuÊt ®îc lactoferrin ngêi trong s÷a cña nã. Lactoferrin lµ mét protein g¾n s¾t chÝnh cña s÷a gi÷ chøc n¨ng lµm cho trÎ th«ng minh .Protein nµy còng cã ®Æc tÝnh kh¸ng khuÈn m¹nh bëi v× nã lo¹i mÊt s¾t trong m«i trêng ( vi khuÈn l¹i sö dông s¾t nµy ®Ó sinh trëng) .V× lactoferrin lµm t¨ng sù g¾n kÕt s¾t trong c¬ thÓ nªn nã còng ®îc dïng ®Ó gi¶i to¶ sù thiÕu m¸u do thiÕu s¾t . N¨m 1993, mét c«ng ty c«ng nghÖ sinh häc cña Hµ lan (gäi chÝnh x¸c lµ Gen Pharm International) ®· t¹o ®îc mét sè bß s÷a chuyÓn gen (transgenic dairy calves) cã gen lactoferrin , çc nhµ nghiªn cøu nµy còng cã nh÷ng bíc tiÕn vÒ c«ng nghÖ ®Ó c¶i tiÕn çch chiÕt suÊt vµ tinh chÕ protein . V× mçi con bß cã thÓ s¶n xuÊt hµng ngµn lit s÷a mçi n¨m – nhiÒu h¬n rÊt nhiÒu dª vµ cõu nªn nã lµ ®éng vËt s¶n xuÊt lactoferrin ®¸ng ®îc chó ý . Mét s¶n phÈm kh¸c ë mét trang tr¹i Scotland lµ cõu chuyÓn gen , nã s¶n xuÊt ®îc protein alpha -1-antitrypsin. §©y lµ mét protein gi÷ cho sù ®µn håi cña mµng tÕ bµo vµ v× thÕ mµ thóc ®Èy mµng cho çc chÊt bay h¬i (ga) , çc chÊt dinh dìng vµ c¶ nh÷ng chÊt th¶i ®i qua mµng . Çc nhµ nghiªn cøu Scotland b¸o ço n¨m 1992 lµ cõu chuyÓn gen cã thÓ tiÕt ®îc 35 gam alpha-1-antitrypsin trong mét lit s÷a, cao h¬n 5 lÇn liÒu lîng cÇn ®iÒu trÞ cho mét bÖnh nh©n mét n¨m. Víi môc ®Ých ®Ó ®iÒu trÞ bÖnh x¬ nang , mét c«ng ty c«ng nghÖ sinh häc Massachusett ®· sö dông nh÷ng con dª chuyÓn gen ®Ó s¶n xuÊt ra mét protein ®iÒu hoµ ®é dÉn ®iÖn vËn chuyÓn mµng cña nang (cystic transmembrane conductance Regulator protein) (CTCR) . Protein CTCR lµ mét chÊt cÇn thiÕt cho mµng tÕ bµo ®Ó vËn chuyÓn çc ion. Nh÷ng bÖnh nh©n bÞ x¬ nang thiÕu protein nµy . LiÒu lîng sö dông protein nµy còng dÔ hiÓu ®ã lµ lîng cÇn sù thay thÕ çc CTCR ®· bÞ mÊt vµ gióp gi¶i quyÕt çc triÖu chøng vÒ x¬ nang . ChÊt ho¹t ho¸ plasminogen cña m«(Tissue plasminogen acitvator-TPA) hiÖn nay ®îc s¶n xuÊt mét çch c«ng nghiÖp víi çc vi khuÈn biÕn ®æi gen (H11.8). TPA lµ mét enzym rÊt quan träng nã lµm tan çc côc m¸u ®«ng , dïng ®Ó lamg gi¶m nhÑ bÖnh nhåi m¸u c¬ tim . N¨m 1991, çc nhµ nghiªn cøu Massachusett ®· ®a çc gen TPA vµo gi÷a çc gen ®i tõ çc tÕ bµo tuyÕn s÷a cña dª vµ vi tiªm vµo çc trøng ®· thô tinh çc gen ®· ®îc ghÐp nèi . Trong sè 29 hËu thÕ tõ 200 trøng th× cã 2 con cã gen TPA vµ khi 1 trong sè 2 hËu thÕ cã gen nµy chÝn th× nã ®Î con vµ 1 trong 5 hËu thÕ cña nã di truyÒn ®îc gen TPA . Cho tíi n¨m 1994 cã Ýt nhÊt 2 c«ng ty ¢u ch©u ®· thiÕt lËp çc trang tr¹i çc ®éng vËt lín ®Ó s¶n xuÊt çc protein dÉn xuÊt ®éng vËt . Nh÷ng “nhµ m¸y dîc phÈm” chuyÓn gen n¨m ®ã ®· tíi Hoa kú khi mét c«ng ty c«ng nghÖ sinh häc th«ng b¸o kÕ ho¹ch më réng 94

hµng ngµn con dª biÕn ®æi gen trªn mét trang tr¹i ë Massachusett. Nh÷ng con dª nµy s¶n xuÊt ra çc protein trong s÷a cña chóng ®Ó ®iÒu trÞ vµ chÈn ®o¸n bÖnh cho con ngêi . Çc s¶n phÈm nµy ®· trë thµnh th¬ng phÈm tõ nhiÒu n¨m nay. 5.5.4.Çc chÊt thay thÕ m«i trêng. ViÖc ph¸ vì çc chu kú sinh bÖnh trong tù nhiªn vÉn ®îc çc nhµ c«ng nghÖ DNA xem xÐt tØ mØ .Ch¼ng h¹n nh mét con èc sªn chuyÓn gen tÇm thêng còng cã thÓ ng¾t ®îc chu kú sèng cña çc kÝ sinh trïng g©y bÖnh s¸n m¸ng (schistosomiasis) .Çc nhµ nghiªn cøu Ph¸p ngµy nay cã ý ®Þnh ph¸t triÓn mét lo¹i èc sªn chuyÓn gen ®Ó kh¸ng l¹i sù x©m nhËp vµ ph¸t triÓn cña çc Schistosoma . Khi th¶ vµo m«i trêng nh÷ng con èc sªn chuyÓn gen nµy nã cã thÓ bao quanh çc con èc sªn tù nhiªn vµ v× thÕ mµ ph¸ vì ®îc chu kú cña giun ký sinh nµy . Mçi n¨m íc chõng kho¶ng 100 triÖu ngêi trªn toµn ThÕ giíi m¾c çc bÖnh sèt, c¶m l¹nh, viªm ®êng ruét vµ tiªu ch¶y g©y ra bëi Schistosomiasis . Mét kÞch b¶n t¬ng tù ®îc ¸p dông cho muçi chuyÓn gen , ®Æc biÖt lµ gièng Anopheles. Chóng truyÒn ký sinh trïng protozoa g©y bÖnh sèt rÐt . Çc nhµ nghiªn cøu ®· x¸c ®Þnh ®îc mét gen cã n¨ng lùc vec t¬ (vec t¬ competence gene) , gen nµy lµm cho muçi anopheles cã kh¶ n¨ng ®Ëu l¹i vµ truyÒn kÝ sinh trïng sèt rÐt. Cã lÏ nªn biÕn ®æi nh÷ng gen ®ã ®Ó cã thÓ t¹o ®îc çc c«n trïng ®ét biÕn th¶ vµo víi mét sèlîng lín , nh÷ng con muçi nµy cã thÓ lµm lo·ng bít hoÆc ch«n vïi quÇn thÓ muçi tù nhiªn vµ còng nh èc sªn , nã ph¸ huû c¶ mét chuçi truyÒn bÖnh .

H×nh 5.19. Muçi Anopheles truyÒn plasmodium g©y bÖnh sèt rÐt . Nh÷ng con muçi biÕn ®æi gen víi c¸c vec t¬ thiÓu n¨ng sÏ ®îc thay thÕ c¸c muçi tù nhiªn ®Ó ph¸ vì chu kú sèng cña ký sinh trïng sèt rÐt .

Trung t©m cña sù quan t©m trong c«ng nghÖ sÞnh häc c«n trïng lµ hiÓu ®îc nguyªn lý cña vec t¬ thiÓu n¨ng (incompetence vec t¬) , ®iÒu ®ã cã nghÜa lµ t¹i sao mét vec t¬ kh¸ng l¹i ®îc mét ký sinh trïng vµ lµm thÕ nµo mµ vec t¬ nµy cã thÓ lµm cho c¬ thÓ 96

sinh vËt kh«ng m¾c bÖnh ? §iÒu ®ã cã thÓ lµ do yÕu tè g©y bÖnh ®ã kh«ng tù thiÕt lËp ®îc trong çc m« cña c«n trïng v× víng c¬ chÕ miÔn dÞch ho¹t ®éng ë trong ruét c«n trïng .Mét kh¶ n¨ng kh¸c lµ ký sinh trïng kh«ng ph¸t triÓn ®óng møc bëi v× dinh dìng cña m«i trêng kh«ng tèt .Còng cßn kh¶ n¨ng kh¸c n÷a lµ ký sinh trïng kh«ng di chuyÓn ®îc tíi tuyÕn níc bät cña c«n trïng ®Ó råi ph¸t t¸n ®i. Çc nhµ nghiªn cøu ë Notre Dame ph¸t hiÖn r»ng muçi cã vec t¬ thiÓu n¨ng cã nh÷ng lç nhá trong tuyÕn níc bät cña chóng v× thÕ nã ®· sµng läc virut ra mét çch hiÖu qu¶ tríc khi muèi chÝch níc bät cña nã vµo vËt chñ lµ ngêi .VËy sù kh¸c biÖt nµy do 1 gen hay 2 gen? V× vËy cÇn ph¶i t×m hiÓu c¬ chÕ cña viÖc t¹o ra muçi chuyÓn gen ®èi kh¸ng .(H11,10) èc sªn chuyÓn gen vµ muçi chuyÓn gen lµ ®¹i diÖn cho sù tiÕp cËn ®óng ®¾n trong viÖc can thiÖp vµo bÖnh tËt . M« h×nh truyÒn thèng ®îc ®Ò cËp lµ cøu ch÷a ngêi bÖnh, lµm vac xin phßng bÖnh, çc chÊt diÖt c«n trïng vµ sù thay ®æi m«i trêng ®Ó ng¨n ngõa sù truyÒn bÖnh. Nh chóng ta ®· thÊy, sù tiÕp cËn cña di truyÒn ®èi víi viÖc phßng ngõa bÖnh lµ thuËt ng÷ “sù thay thÕ” (replacement) mµ trong lÞch sö y häc hiÕm khi cã sù tiÕp cËn nh thÕ .

Ch¬ng VI Dù ¸n bé gen ngêi -§Ønh cao cña Di truyÒn häc hiÖn ®¹i 6.1.ý nghi y sinh häc . Nh÷ng th«ng tin vÒ viÖc x¸c ®Þnh çc tr×nh tù bé gen ngêi vµ çc tæ chøc kh¸c sÏ lµm thay ®æi lín trong sinh häc vµ y häc . Ch¼ng h¹n nh víi viÖc ®èi chiÕu víi bé gen ngêi , ®ang bïng næ nh÷ng th«ng tin míi vÒ nguån gèc sù sèng cña chóng ta , vÒ çc gen g©y bÖnh hay viÖc chÈn ®o¸n vµ nh÷ng kh¶ n¨ng tiÕn tíi trÞ liÖu . Nh÷ng tiÕn bé ®¹t ®îc trong çc lÜnh vùc nh hÖ gen , Proteomics (hÖ protein) , tin sinh häc (bioinformatics) , hÖ gen çc chÕ phÈm thuèc (pharmacogenomics) còng t¨ng lªn rÊt nhanh . 97

Trong ch¬ng nµy chóng t«i giíi thiÖu mét çch v¾n t¾t nh÷ng ph¸t hiÖn chÝnh cña dù ¸n bé gen ngêi ( The Human genome Project) (HGP) vµ nh÷ng mèi liªn quan cña chóng víi sinh , y häc . 6.2.Dù ¸n bé gen ngêi cã nhiÒu môc ®Ých . Dù ¸n bé gen ngêi b¾t ®Çu tõ n¨m 1990 , ®ã lµ mét nç lùc quèc tÕ mµ môc tiªu chÝnh lµ x¸c ®Þnh tr×nh tù toµn bé bé gen ngêi vµ bé gen cña mét vµi tæ chøc kh¸c ®· cã çc c¬ së vÒ nghiªn cøu di truyÒn ( nh Escherichia Coli , nÊm men (Sacharomyces cerevisae) , ruåi dÊm (Drosophila melanogaster) , giun ®òa (Caenorhabditis elegans) vµ mét lo¹i chuét nhµ thêng gÆp (Mus Musculus). Cho tíi nay nh÷ng môc tiªu chÝnh cña dù ¸n ®· ®îc hoµn tÊt . T¹i hoa kú , trung t©m quèc gia nghiªn cøu bé gen ngêi (the National Center for Human Genome Rearch) (NCHGR) ®· ®îc thµnh lËp n¨m 1989, khëi ®Çu ®îc híng dÉn bëi Jame D. Watson vµ sau nµy lµ Francis Collins . NCHGR gi÷ vai trß hµng ®Çu trong viÖc ®Þnh híng çc nç lùc quèc gia ®èi víi dù ¸n bé gen ngêi . N¨m 1997 c¬ quan nµy trë thµnh viÖn nghiªn cøu quèc gia bé gen ngêi (the National Human Genome Rearch Institute –NHGRI ), trong ®ã cã sù céng t¸c quèc tÕ cña çc nhãm tõ Hoa kú , Anh , NhËt b¶n , Ph¸p , §øc vµ Trung quèc vµ nã trë thµnh mét tËp ®oµn quèc tÕ x¸c ®Þnh tr×nh tù bé gen ngêi (The International Human Genome Sequencing Consortium) –(IHGSC ) . Lóc ®Çu c¬ quan nµy chØ ®Æt ra mét sè môc tiªu ng¾n h¹n nh t¹o ra b¶n ®å bé gen ngêi víi çc dÊu chuÈn (marker ) 2-5 x¨ng ti morgan (cM) riªng rÏ råi x©y dùng nªn mét b¶n ®å vËt lý cña tÊt c¶ 24 NST (22 nhiÔm s¾c thÓ thêng v¸ 2 NST giíi tÝnh lµ X vµ Y ) víi çc dÊu chuÈn cã kho¶ng 100.000 cÆp baz¬ (bp) . ( H×nh .1 ) Tãm t¾t nh÷ng ®iÓm kh¸c biÖt gi÷a b¶n ®å di truyÒn , b¶n ®å di truyÒn tÕ bµo vµ b¶n ®å vËt lý cña mét NST . Nh÷ng môc tiªu nµy vµ nh÷ng môc tiªu ban ®Çu ®· thu ®îc thµnh qu¶ vît tréi vµo nh÷ng n¨m gi÷a 1990 . N¨m 1998 mét môc tiªu míi cña HGP quèc gia ®· ®îc th«ng b¸o . §ã lµ viÖc mong muèn hoµn tÊt toµn bé tr×nh tù vµo cuèi 2003 hoÆc sím h¬n . Nh÷ng môc tiªu ®Æc biÖt kh¸c cã liªn quan tíi c«ng nghÖ x¸c ®Þnh tr×nh tù , so s¸nh çc hÖ gen , tin sinh häc , çc vÊn ®Ò liªn quan tíi lu©n lý vµ çc vÊn ®Ò kh¸c .

H×nh 6.1 Çc ph¬ng ph¸p chÝnh ®Ó x¸c ®Þnh vµ ph©n lËp çc gen b×nh thêng vµ gen g©y bÖnh .Víi b¶n ®å di truyÒn , vÞ trÝ cña mét vµi dÊu chuÈn di truyÒn (marker) gi¶ thuyÕt ®· ®ùoc chØ râ cïng víi çc kho¶ng çch di truyÒn tÝnh b»ng x¨ng ti morgan . Vßng trßn chØ vÞ trÝ cña t©m ®éng (centromere) . Víi b¶n ®å di truyÒn tÕ bµo nh÷ng vÞ trÝ gÇn chÝnh x¸c cña çc dÊu chuÈn ®· ®îc chØ râ cïng víi çc kho¶ng çch vËt lý t¬ng ®èi tÝnh b»ng cÆp megabaz¬ . Nh÷ng vÝ dô vÒ b¶n ®å giíi h¹n , ®iÓm tiÕp cËn (contig) vµ b¶n ®å STS còng ®Òu ®îc chØ râ . Mïa thu 1998 , ®· cã kho¶ng 6 % tr×nh tù bé gen ngêi ®· ®îc hoµn tÊt vµ sÏ ®Æt ra c¬ së cho nh÷ng c«ng viÖc t¬ng lai . Mét tiÕn triÓn n÷a lµ cã mét nhãm thø 2 , ®ã lµ mét c«ng ty t nh©n Celera Genomics ®øng ®Çu lµ Craig Venter th«ng b¸o sÏ nhËn tr¸ch nhiÖm x¸c ®Þnh tr×nh tù bé gen ngêi . N¨m 1995 Venter vµ ®ång nghiÖp ®· xuÊt b¶n c«ng tr×nh vÒ tr×nh tù toµn bé bé gen cña Haemophilus influenza vµ Mycoplasma genitalium , ®ã lµ çc mÉu ®Çu tiªn ®· ®îc x¸c ®Þnh tr×nh tù gen .Mét yÕu tè quan träng mang l¹i th¾ng lîi cho nh÷ng ngêi lµm c«ng viÖc 98

nµy lµ sö dông mét lo¹i sóng ®Ó b¾n tøc lµ sonicating DNA , x¸c ®Þnh tr×nh tù çc ®o¹n vµ nèi çc tr×nh tù trªn c¬ së gèi lªn nhau . §èi víi viÖc so s¸nh th× cã rÊt nhiÒu çch tiÕp cËn ®îc sö dông ë nh÷ng thêi ®iÓm kh¸c nhau khi nghiªn cøu çc gen b×nh thêng vÇ çc gen g©y bÖnh (®îc ghi trong b¶ng 6.1) B¶ng 6.1 Nh÷ng ph¬ng ph¸p chÝnh dïng ®Ó x¸c ®Þnh vµ ph©n lËp çc gen b×nh thêng vµ gen g©y bÖ nh . Quy tr×nh Ph¸t hiÖn çc bÖnh liªn quan tíi di truyÒn tÕ bµo ®Æc biÖt .

Ghi chó Nh trêng hîp ®øt nhá ë b¨ng Xp 21.2 cã liªn quan ®Õn gen g©y bÖnh ®au c¬ Deuchenne.

Nh÷ng nghiªn cøu tæng qu¸t vÒ NST .

X¸c ®Þnh nßi gièng cña çc gia ®×nh lín .Çc gen tréi dÔ nhËn d¹ng h¬n çc gen liÖt .

Dïng ®Çu dß ®Ó x¸c ®Þnh c¸c locus dÊu chuÈn

§Çu dß cã thÓ x¸c ®Þnh ®îc hµng ngµn STS , RFLP , SNP kh¾p trªn NST . Nã th¨m dß c¶ 2 phÝa vµ ph¸c ho¹ râ rµng . Hiªn nay lµ ph¬ng ph¸p nhanh nhÊt ®Þnh vÞ mét gen hay mét ®o¹n DNA ®Ó ph©n miÒn NST ngêi vµ x©y dùng b¶n ®å vËt lý. Cho phÐp chuyÓn mét gen tíi mét NST ®Æc hiÖu nhng kh«ng tíi c¸c ph©n miÒn .

LËp b¶n ®å lai bøc x¹ (radiation hybrid mapping) Sö dông c¸c tÕ bµo lai sinh dìng cña ngêi hay loµi gËm nhÊm. Huúnh quang trong lai situ.

Cho phÐp ®Þnh vÞ mét gen cña mét b¨ng NST .

Dïng ®iÖn di gel xung ®iÖn (PFGE) ®Ó t¸ch chiÕt c¸c ®o¹n DNA lín.

Cho phÐp ph©n lËp c¸c ®o¹n DNA dµi thu nhËn tõ viÖc sö dông Endonucleaza giíi h¹n ®Ó c¾t rÊt h¹n chÕ DNA.

NST ®i d¹o

Ph©n dßng çc ®o¹n lÆp DNA ; ®ã lµ quy tr×nh trong phßng thÝ nghiÖm thêng chØ kho¶ng 100-200 kb. C¾t DNA thµnh nh÷ng m¶nh t¬ng ®èi lín vµ quay vßng , nã cã thÓ ®îc lo¹i ®i nhanh chãng h¬n vµ víi çc ®o¹n DNA dµi h¬n so víi NST ®i d¹o . Cho phÐp ph©n lËp çc ®o¹n cã chiÒu dµi thay ®æi .

NST nh¶y Ph©n dßng qua YAC, BAC, Cosmid , Phage, vµ plasmid . Ph¸t hiÖn sù biÓu hiÖn cña mRNA trong c¸c m« bëi c¸ch thÊm Northern khi dïng mét hay nhiÒu ®o¹n cña gen nh lµ mét ®Çu dß .

mRNA cã thÓ biÎu hiÖn trong c¸c m« bÞ t¸c ®éng .

PCR

Sö dông ®Ó khuÕch ®¹i c¸c ®o¹n gen vµ c¸c øng dông kh¸c

X¸c ®Þnh tr×nh tù DNA.

ThiÕt lËp b¶n ®å vËt lý gi¶i ph¸p cao nhÊt . X¸c ®Þnh khung ®äc më .T¹o thuËn lîi cho c¸c ph¬ng tiÖn ®Ó cã thÓ x¸c ®Þnh ®îc hµng triÖu cÆp baz¬ mçi ngµy . So s¸nh DNA vµ c¸c tr×nh tù protein thu nhËn tõ gen cha biÕt víi tr×nh tù ®· biÕt trong d÷ liÖu cã thÓ lµm dÔ dµng viÖc ®Þnh lo¹i .

C¬ së d÷ liÖu

Ghi chó: STS : Sequence tagged site . RFLP : Restriction fragment linked polymorphism . SNP : Single nucleotite polymorphism. YAC : Yeast artifical chromosome . BAC : Bacterial artificial chromosome .

PCR : polymerase chain Reaction . 6.3.Tr×nh tù ph¸c th¶o cña Bé gen ngêi ® ®îc th«ng b¸o th¸ng 6 n¨m 2000 Th¸ng 6 -2000 , ngêi ®øng ®Çu IHGSC vµ c«ng ty t nh©n Celera Genomics th«ng b¸o ®· hoµn tÊt b¶n th¶o tr×nh tù bé gen ngêi víi kho¶ng 90 % tæng sè . Nh÷ng ph¸t hiÖn chÝnh cña 2 nhãm ®îc xuÊt b¶n t¸ch biÖt ë 2 tê b¸o vµo th¸ng 1-2001 , IHGSC ë b¸o Nature vµ Celera th× ë Science . B¶n th¶o ®îc tËp ®oµn nµy xuÊt b¶n lµ s¶n phÈm nghiªn cøu Ýt nhÊt lµ 10 n¨m cña 20 trung t©m t¹i 6 quèc gia . XuÊt b¶n phÈm cña Celera vµ çc trung t©m hîp t¸c kh¸c lµ s¶n phÈm cña mét c«ng tr×nh nghiªn cøu víi thêi gian Ýt nhÊt lµ 3 n¨m hoÆc ng¾n h¬n ®«i chót . Cßn mét phÇn d÷ liÖu lµ cña IHGSC . Thµnh tùu cña sù kÕt hîp nµy ®· thu hót sù chó ý cña c«ng chóng vµ nã ®· cung cÊp cho chóng ta mét th viÖn vÒ sù sèng , mét b¶ng liÖt kª çc thêi kú cña sù sèng , cßn Holy Grail th× cung cÊp cho chóng ta nh÷ng ph¸t hiÖn vÒ di truyÒn con ngêi . 6.4.Hai nhãm sö dông çc ph¬ng ph¸p kh¸c nhau . Díi ®©y lµ tãm t¾t nh÷ng ph¸t hiÖn lín ®îc ghi trong 2 b¶n th¶o vµ nh÷ng ghi chó vÒ çc øng dông cña chóng . Nh÷ng sù kh¸c biÖt kh«ng ®îc nªu ra ë ®©y bëi v× nh÷ng phÇn thèng nhÊt chiÕm tû lÖ qu¸ lín . Tuy nhiªn còng cÇn ph¶i tãm t¾t nh÷ng ph¬ng ph¸p kh¸c nhau mµ 2 nhãm ®· sö dông .VÒ c¬ b¶n th× IHGSC tríc hÕt dïng b¶n ®å sau ®ã råi míi ®Õn tr×nh tù . Së dÜ nh vËy mét phÇn lµ do viÖc x¸c ®Þnh tr×nh tù lµ mét qu¸ tr×nh tiÕn hµnh chËm ch¹p khi mµ dù ¸n chung ®· b¾t ®Çu .V× thÕ chiÕn lîc cña cña tËp ®oµn lµ ph¶i vît thêi gian bëi ®· ®¹t ®îc nh÷ng tiÕn bé trong viÖc x¸c ®Þnh tr×nh tù vµ çc kü thuËt kh¸c . Çch tiÕp cËn tæng thÓ lµ ®èi chiÕu trong khi x¸c ®Þnh tr×nh tù çc m¶nh nhá(shotgun) cã thø bËc (hierarchical shotgun sequencing) , bao hµm viÖc ph¸ vì ra tõng m¶nh toµn bé bé gen thµnh nh÷ng ®o¹n xÊp xØ 100200 kb vµ cµi chóng vµo NST nh©n t¹o cña vi khuÈn (BAC) . Nh÷ng BAC nµy sau ®ã ®îc ®Þnh vÞ trªn NST ngêi b»ng çch t×m çc tr×nh tù dÊu chuÈn nh lµ çc vÞ trÝ bÝt ®Çu çc tr×nh tù (sequence –tagged sites -STS ) , nh÷ng vÞ trÝ nµy th× ®· ®îc x¸c ®Þnh . Çc STS ®Òu ng¾n (thêng nhá h¬n 500 bp) , ®ã lµ locus hÖ gen ®éc quyÒn cho çc thö nghiÖm PCR . Çc dßng BAC sau ®ã ®îc lµm vì thµnh nh÷ng m¶nh nhá (shotgunting) . Sau ®ã mçi m¶nh nhá ®Òu ®îc x¸c ®Þnh tr×nh tù vµ sö dông nh÷ng gi¶i thuËt m¸y tÝnh ®Ó nhËn d¹ng çc th«ng tin tr×nh tù thÝch øng tõ çc ®o¹n gèi nhau thµnh nh÷ng m¶nh cã çc tr×nh tù ®Çy ®ñ . Celera th× sö dông ph¬ng ph¸p Whole genome shotgun (b¾n toµn bé bé gen) . Çc ®o¹n shotgun ®îc g¾n víi nhau bëi nh÷ng gi¶i thuËt thµnh nh÷ng bé khung lín vµ dïng STS ®Ó söa ch÷a çc vÞ trÝ trªn khung nµy trong bé gen . Mét khung bao gåm mét dÉy çc contig n»m ë phÝa bªn ph¶i nhng kh«ng cÇn thiÕt ph¶i nèi vµo çc tr×nh tù liªn tiÕp . Contig lµ çc tr×nh tù kÒ nhau cña DNA t¹o bëi sù ghÐp l¹i çc ®o¹n tr×nh tù gèi nhau cña mét NST tù nhiªn hay mét BAC . Cã thÓ t×m kiÕm ®îc m¸y x¸c ®Þnh tr×nh tù víi sè lîng lín (high-throughput sequenator ), çc ch¬ng tr×nh m¸y tÝnh m¹nh (powerful computer programs) , yÕu tè c¹nh tranh vµ çc yÕu tè kh¸c ®· ®îc tÝnh to¸n ®Ó lµm nhanh çc tiÕn bé TÊt c¶ ®· ®îc çc nhãm thùc hiÖn tõ 1998 trë vÒ tríc . 6.5.ViÖc x¸c ®Þnh tr×nh tù bé gen ngêi ® ®em l¹i Ých lîi cho çc ph¸t hiÖn míi . Chóng ta h·y trÝch dÉn mét vµi ph¸t hiÖn chÝnh trong dù ¸n bé gen ngíi ë b¶ng díi ®©y : B¶ng 6.2. Nh÷ng ph¸t hiÖn chÝnh trong b¶n th¶o th« vÒ bé gen ngêi . *Trªn 90 % Bé gen ®· ®îc x¸c ®Þnh tr×nh tù , cßn nh÷ng chç trèng lín vµ nhá vÉn ph¶i tiÕp tôc bæ sung lµm ®Çy . *X¸c ®Þnh ®îc sè gen m· cho protein lµ 30.000 ®Õn 40.000 . *ChØ cã 1,1 ®Õn 1,5 % bé gen lµ m· cho çc protein . *Cã nh÷ng thay ®æi lín vÒ h×nh ¶nh NST ngêi (tøc lµ sè gen theo tõng Mb , mËt ®é SNP , lîng GC , sè yÕu tè cã thÓ ®îc vËn chuyÓn vµ çc ®¶o CpG , tèc ®é t¸i tæ hîp . *Çc gen cña ngêi thùc hiÖn nhiÒu c«ng viÖc h¬n lµ gen cña giun ®òa hay ruåi dÊm . *HÖ protein (proteome)) ngêi phøc t¹p h¬n so víi çc ®éng vËt cã x¬ng sèng kh¸c . *Çc tr×nh tù lÆp chiÕm kho¶ng 50% bé gen . *Kho¶ng 100 vïng m· ho¸ ®· ®îc sao chÐp vµ ®ù¬c lo¹i ®i b»ng nh÷ng h¹t vËn chuyÓn cã c¬ së lµ RNA . *Kho¶ng 200 gen cã thÓ truyÒn tõ vi khuÈn sang. *Trªn 3 tiÖu SNP ®· ®îc x¸c ®Þnh .

100

6.6.HÇu hÕt bé gen ngêi ® ®ùoc x¸c ®Þnh tr×nh tù . Trªn 90 % bé gen ngêi ®· ®îc x¸c ®Þnh tr×nh tù vµo th¸ng 7 -2000 , bá xa bé gen lín nhÊt ®· ®îc x¸c ®Þnh tr×nh tù víi kÝch cì kho¶ng 3,2 gigabaz¬ (Gb) .Díi bé gen ngêi th× bé gen cña ruåi dÊm lµ lín nhÊt (kho¶ng 180 Mb) . VÉn cßn nh÷ng chç trèng lín vµ nhá vµ chÊt lîng cña mét sè d÷ liÖu vÒ tr×nh tù sÏ ph¶i sö lý l¹i v× mét sè ph¸t hiÖn cã lÏ lµ cha ®îc thËt sù chÝnh x¸c . 6.7.§ x¸c ®Þnh ®îc r»ng bé gen ngêi m cho kho¶ng 30.000 -40.000 protein. §iÒu ng¹c nhiªn nhÊt lµ so víi nh÷ng kÕt qu¶ thu ®îc tõ tríc th× râ rµng lµ sè gen m· cho protein lµ thÊp , chØ n»m gi÷a kho¶ng 30.000 ®Õn 40.000 .Theo nh÷ng sè liÖu míi th× th× con sè nµy cao h¬n gÊp kho¶ng 2 lÇn ®èi víi giun ®òa (19.099) vµ gÊp 3 lÇn ®èi víi ruåi dÊm (13.061) . Nh÷ng h×nh ¶nh nµy gîi ý r»ng ph¶i cã nh÷ng gi¶i thÝch kh¸c chÝnh x¸c h¬n vÒ sè gen cña ngßi v× ngêi cã tæ chøc phøc t¹p h¬n so víi 2 tæ chøc ®¬n gi¶n h¬n . 6.8.ChØ cã 1,1 ®Õn 1,5 % bé gen ngêi dïng ®Ó m cho protein . Ph©n tÝch çc sè liÖu thÊy r»ng chØ cã 1,1 -1,5 % bé gen lµ çc exon . Kho¶ng 24 % lµ çc intron vµ kho¶ng 75% çc tr×nh tù n»m trung gian (gen trung gian –intergenic) . So s¸nh çc sè liÖu trªn giun ®òa vµ ruåi dÊm cho thÊy kÝch thíc cña exon ë c¶ 3 mÉu t¬ng ®èi h»ng ®Þnh (®èi víi ngêi lµ 145 bp) . Tuy nhiªn , kÝch thíc cña intron ngßi cã thÓ biÕn ®æi nhiÒu h¬n ( kho¶ng trªn 3300bp) . KÕt qu¶ cho thÊy cã sù thay ®æi lín trong kÝch thíc cña gen . 6.9.CÊu tróc cña çc nhiÔm s¾c thÓ ngêi thay ®æi rÊt lín . Cã nhiÒu ®Æc tÝnh kh¸c nhau gi÷a çc NST cña ngêi , ch¼ng h¹n nh sè megabaz¬ , mËt ®é cña çc ®a h×nh nucleotit ®¬n (SNP) , lîng GC , sè çc yÕu tè vËn chuyÓn vµ çc ®¶o CpG vµ tèc ®é t¸i tæ hîp . Ta h·y lÊy mét vÝ dô : NST sè 19 chøa sè gen nhiÒu nhÊt (23 gen/ megabaz¬ ) , trong khi ®ã NST sè 13 vµ nhiÔm s¾c thÓ Y th× chØ tha thít (5 gen/ megabaz¬) . Tíi thêi ®iÓm nµy vÉn cha gi¶i thÝch ®îc nh÷ng sù thay ®æi nµy . 6.10.Çc gen cña ngêi ho¹t ®éng nhiÒu h¬n çc gen cña çc tæ chøc ®¬n gi¶n h¬n . Sù nèi thay thÕ lµ kh¸ phæ biÕn ë ngêi , chiÕm Ýt nhÊt lµ 35% çc gen cña chóng . Çc sè liÖu chØ ra r»ng con sè trung b×nh cña çc b¶n sao kh¸c biÖt /gen cña NST sè 22 vµ 19 lµ 2,6 vµ 3,2 . Nh÷ng ®Æc tÝnh nµy lµ cao h¬n giun trßn , nã chØ cã 12,2% gen lµ cã nèi thay thÕ vµ chØ cã 1,34 thay ®æi nèi /gen . 6.11.HÖ Protein (Proteome ) ngêi phøc t¹p h¬n ®éng vËt cã x¬ng sèng . Cã t¬ng ®èi Ýt çc Domain protein míi xuÊt hiÖn ë çc ®éng vËt cã x¬ng sèng .Tuy nhiªn , ë ngêi sè cÊu tróc Domain ph©n biÖt (kho¶ng 1800) cña protein gÊp 1,8 lÇn giun ®òa vµ ruåi dÊm . Kho¶ng 90 hä protein ®Æc biÖt cña ®éng vËt cã x¬ng sèng cã nhiÒu trong hÖ miÔn dÞch vµ hÖ thÇn kinh . Nh÷ng kÕt qu¶ trong 2 b¶n th¶o rÊt giÇu th«ng tin vÒ çc hä vµ líp protein . VÝ dô trong b¶ng 54-3 ®· liÖt kª çc líp chÝnh cña protein ®îc m· bëi çc gen cña ngêi . Vµ líp lín nhÊt lµ líp “cha râ –unknown” . ViÖc x¸c ®Þnh çc protein cha râ nµy lµ mét tiªu ®iÓm lín cña nhiÒu phßng thÝ nghiÖm . B¶ng 6.3. Nh÷ng líp chÝnh cña protein ®îc m· bëi çc gen cña ngêi . Líp protein Cha râ Enzym axit nucleic Çc yÕu tè phiªn m· Çc Receptor Hydrolaza Çc ph©n tö ®iÒu hoµ chän läc (tøc lµ protein G, çc chÊt ®iÒu hoµ chu kú tÕ bµo . Çc tiÒn gen g©y ung th Çc ptrotein cÊu tróc bé khung tÕ bµo Kinaza

Sè % 12.809 (41 %) 2.308 (7,5 %) 1.850 (6%) 1.534 (5%) 1.227 (4,0 %) 988 (3,2 %) 902 (2,8%) 876 (2,8%) 868 (2,8%)

6.12.C¸c tr×nh tù lÆp chiÕm trªn 50% bé gen ngêi . C¸c tr×nh tù lÆp l¹i tÝnh ®îc Ýt nhÊt lµ chiÕm mét nöa bé gen .Chóng r¬i vµ 5 líp sau ®©y : 101

1.Çc lÆp r¶i r¸c (transposon derived repeats) (interspersed repeats) . 2. Xö lý çc gen gi¶. 3.LÆp çc tr×nh tù ®¬n . 4.Sao chÐp tõng ®o¹n , t¹o nªn çc b¶n sao 10-300kb tõ mét vïng cña bé gen thµnh mét vïng kh¸c . 5.Çc khèi tr×nh tù lÆp nèi tiÕp nhau cã ë ®o¹n gi÷a (centromere ) vµ ®o¹n cuèi (telomere) vµ çc vïng kh¸c cña NST . Nh÷ng th«ng tin chÝnh vÒ tr×nh tù cña hÇu hÕt çc líp trªn cã gi¸ trÞ trong viÖc t×m hiÓu kiÕn tróc vµ sù ph¸t triÓn cña bé gen ngêi . Cã 2 ®iÓm cÇn quan t©m lµ nguyªn tè nh«m ®îc coi lµ thµnh viªn næi bËt nhÊt (chiÕm kho¶ng 10% tæng sè bé gen) cña çc yÕu tè r¶i r¸c ng¾n (short interspersed elements –SINE) , cã thÓ cã çc vïng giÇu GC . Sù trïng ®«i çc ®o¹n ë ngêi thÊy phæ biÕn h¬n giun ®òa vµ ruåi dÊm . §iÒu ®ã cã thÓ lµ nh÷ng cÊu tróc nµy cã liªn quan tíi sù tr¸o exon vµ lµm t¨ng sù biÕn ®æi protein ë ngêi . 6.13.Nh÷ng ph¸t hiÖn kh¸c ®¸ng quan t©m . Ba ®iÓm chÝnh trong b¶ng 54-2 ®· tãm t¾t çc vÊn ®Ò nµy . §¹i ®Ó gåm çc néi dung sau : Cã kho¶ng 100 vïng m· ho¸ ®îc x¸c ®Þnh lµ cã sù sao chÐp vµ ®îc lo¹i ®i bëi çc h¹t chuyÓn cã c¬ së lµ RNA (retrotransposons ). §iÒu ®ã cã thÓ lµ mét sè gen cã thÓ chÊp nhËn nh÷ng vai trß míi theo tiÕn tr×nh cña thêi gian . Mét ph¸t hiÖn ®¸ng ng¹c nhiªn lµ trªn 200 gen cã thÓ cã nguån gèc tõ vi khuÈn truyÒn tíi . Kh«ng thÊy çc gen nµy ë çc tÕ bµo nh©n chuÈn mµ l¹i kh«ng ph¶i lµ ®éng vËt cã vó . Trªn 3 triÖu SNP ®· ®îc x¸c ®Þnh . §iÒu nµy chøng minh vÒ sù v« gi¸ cña çc khÝa c¹nh b¶n ®å gen . Còng cÇn ph¶i nhÊn m¹nh r»ng nh÷ng ph¸t hiÖn ®îc liÖt kª ë ®©y chØ lµ mét sè nhá trong néi dung cã trong çc b¶n th¶o . B¹n ®äc cã thÓ bµn luËn çc vÊn ®Ò mét çch ®Çy ®ñ trªn çc b¶n gèc cña çc b¸o ço (phÇn ®èi chiÕu) . 6.14. LËp kÕ ho¹ch cho nh÷ng c«ng viÖc tiÕp theo vÒ bé gen ngêi vµ çc tæ chøc kh¸c . IHGSC ®· chØ râ r»ng sÏ x¸c ®Þnh ®Çy ®ñ çc tr×nh tù vµo n¨m 2003 . NhiÖm vô nµy cã liªn quan tíi viÖc lÊp ®Çy chç trèng vµ x¸c ®Þnh çc gen míi còng nh vÞ trÝ vµ chøc n¨ng cña chóng . SÏ ph¶i x¸c ®Þnh çc vïng ®iÒu hoµ vµ çc tr×nh tù cña çc bé gen lín kh¸c ( nh chuét nhµ Rattus norvegicus , mét lo¹i chuét cña Na uy ; Danio rerio –mét lo¹i ç v»n ; Fugu rubripes –mét lo¹i ç nãc hæ (the tiger puffer fish) vµ mét hay nhiÒu ®éng vËt linh chëng ) . Thùc vËy , b¶n th¶o bé gen ç nãc hæ ®· ®îc xuÊt b¶n n¨m 2002 . Çc SNP sÏ ®îc x¸c ®Þnh bæ sung ; mét Catalog ®Çy ®ñ cña çc ph¬ng ¸n hy väng sÏ cã gi¸ trÞ trong viÖc lËp b¶n ®å gen víi çc chñng phøc t¹p vµ cho çc øng dông kh¸c . Cïng víi çc vÊn ®Ò trªn , çc c¬ së d÷ liÖu sÏ ®îc thªm dÇn çc th«ng tin míi vµ nh÷ng c¬ së d÷ liÖu míi sÏ ®îc thiÕt lËp ®Ó phôc vô cho çc môc ®Ých ®Æc biÖt . SÏ tiÕn hµnh nh÷ng nghiªn cøu vÒ hÖ gen chøc n¨ng (functional genomics) (tøc lµ nghiªn cøu bé gen ®Ó x¸c ®Þnh chøc n¨ng cña tÊt c¶ çc gen vµ çc s¶n phÈm cña chóng ). 6.15.Nh÷ng liªn quan tíi hÖ protein , c«ng nghÖ Sinh häc vµ tin sinh häc . NhiÒu lÜnh vùc sÏ bÞ ¶nh hëng bëi nh÷ng hiÓu biÕt vÒ bé gen ngêi . Sau ®©y chØ nªu mét vµi vÝ dô ng¾n gän : Proteomics (HÖ protein) theo nghÜa réng lµ nghiªn cøu tÊt c¶ çc protein ®· ®îc m· trong mét c¬ thÓ (tøc lµ Proteome), bao gåm cÊu tróc , chøc n¨ng , sù t¬ng t¸c , vµ nh÷ng thay ®æi cña chóng . Cßn theo nghÜa hÑp tøc lµ sù ®Þnh lo¹i vµ sù nghiªn cøu çc protein g¾n víi cÊc ho¹t ®éng cña tÕ bµo , nhng kh«ng cÇn thiÕt ph¶i lµ toµn bé Proteome . §èi víi con ngêi th× nhiÒu protein ç thÓ sÏ ®îc x¸c ®Þnh cïng çc ®Æc tÝnh cña chóng . Sù t¬ng t¸c vµ hµm lîng cña chóng sÏ ®îc x¸c ®Þnh ë c¶ 2 tr¹ng th¸i : Sinh lý vµ bÖnh lý . Çc th«ng tin thu ®îc sÏ ®îc ®a vµo çc d÷ liÖu c¬ së thÝch hîp . Çc kü thuËt nh ®iÖn di 2 chiÒu , khèi phæ vµ çc kh¸ng thÓ sÏ lµ trung t©m ®Ó më réng lÜnh vùc ®ang ph¸t triÓn nhanh chãng nµy . Trªn hÕt lµ hÖ protein sÏ t¹o thô©n lîi lín cho chóng ta hiÓu c¬ b¶n vÒ protein còng nh nu«i dìng C«ng nghÖ sinh häc khi çc protein míi ®îc dïng ®Ó chÈn ®o¸n , trÞ liÖu vµ çc øng dông kh¸c còng nh çc biÖn ph¸p nh»m ph¸t triÓn s¶n xuÊt kinh tÕ . Còng ®ßi hái çc chuyªn gia trong lÜnh vùc Tin sinh häc , bëi v× nã sÏ sè ho¸ rÊt nhanh cho c«ng viÖc qu¶n lý vµ sö dông mét sè khæng lå çc d÷ liÖu tõ çc nghiªn cøu vÒ hÖ gen vµ hÖ protein . 6.16.Nh÷ng liªn quan tíi Y häc . Trªn thùc tÕ lµ mçi lÜnh vùc cña y häc ®Òu chÞu t¸c ®éng bëi çc th«ng tin vÒ bé gen ngêi , ®Æc biÖt viÖc theo dâi çc gen g©y bÖnh sÏ ®îc thuËn lîi rÊt nhiÒu . Nh ®· ®Ò cËp ë trªn , b¶n ®å SNP sÏ gióp Ých rÊt nhiÒu trong viÖc x¸c ®Þnh çc gen liªn quan tíi çc bÖnh phøc t¹p . §Çu dß cho bÊt kú mét gen nµo còng sÏ ®îc ¸p dông nÕu cÇn thiÕt , tríc tiªn lµ viÖc c¶i tiÕn çc test

102

chÈn ®o¸n çc bÖnh cã liªn quan tíi gen vµ çc gen liªn quan trùc tiÕp ®Õn c¨n nguyªn cña çc bÖnh ®Æc biÖt . Trong lÜnh vùc Dîc phÈm (pharmacogenomics) còng ®ang ®îc më réng vµ cã kh¶ n¨ng trong t¬ng lai thuèc sÏ ®îc bµo chÕ ®Ó ®iÒu tiÕt nh÷ng biÕn ®æi trong çc enzym vµ çc protein kh¸c cã liªn quan tíi ho¹t ®éng vµ chuyÓn ho¸ cña thuèc trong çc c¬ thÓ . Nghiªn cøu vÒ gen cßn liªn quan tíi çc hµnh vi ®Ó cã thÓ hiÓu biÕt s©u sa h¬n n÷a vÒ çc c¨n nguyªn vµ kh¶ n¨ng ®iÒu trÞ çc bÖnh t©m thÇn . NhiÒu vÊn ®Ò thuéc lu©n lý , sù riªng t vµ viÖc sö dông th«ng tin hÖ gen víi môc ®Ých th¬ng m¹i còng ph¶i ®îc ®Ò cËp . Mét ®iÓm n÷a còng quan träng lµ mang nh÷ng lîi Ých vÒ y häc vµ kinh tÕ cho nh÷ng ngêi thuéc ThÕ giíi thø ba trong çc lÜnh vùc dÞch vô y tÕ , chÈn ®o¸n vµ ®iÒu trÞ bÖnh .

gi¶i thÝch mét sè tõ chuyªn m«n . A activator protein Mét protein ph¶n øng víi vÞ trÝ ®iÒu hoµ trªn ph©n tö DNA vµ khÝch lªn sù biÓu hiÖn gen . adenosine mét nucleotit cã chøa riboza hoÆc deoxyriboza, phot phat vµ adenin . adenovirus mét virut th«ng thêng bao gåm mét bé gen DNA vµ mét capsid icosahedral ; sö dông nh mét vec t¬ trong gen trÞ liÖu . agarose mét chÊt liÖu gelatin dïng trong kü thuËt ®iÖn di . AIDS mét bÖnh do virut cã ®Æc tÝnh lµ lµm mÊt çc tÕ bµo Lympho –T cña hÖ miÔn dÞch vµ thêng ®i kÌm víi çc bÖnh do vi sinh vËt g©y nªn çc nhiÔm trïng c¬ héi g©y tö vong . amino acid mét hîp chÊt ho¸ häc cã chøa Ýt nhÊt mét nhãm amin vµ mét nhãm axit h÷u c¬ ; nã lµ çc ®¬n vÞ cÊu thµnh cña protein . anticodon mét tr×nh tù gåm 3 baz¬ cña ph©n tö RNA bæ cøu m· trªn ph©n tö mRNA . antisene molecule ph©n tö mRNA ph¶n øng vµ lµm trung hoµ ph©n tö mRNA dïng ®Ó tæng hîp mét protein ®Æc biÖt ; ph©n tö antisene cã t¸c dông lµm ngõng sù s¶n xuÊt protein . autosome 44 nhiÔm s¨c thÓ cña bé gen ngêi kh«ng liªn quan tíi viÖc x¸c ®Þnh giíi tÝnh ( nhiÔm s¾c thÓ thêng ). B Bacillus thuringiensis vi khuÈn h×nh que mµ çc tinh thÓ ®éc tè cña nã t¸c ®éng nh mét chÊt diÖt c«n trïng dïng ®Ó chèng l¹i mét sè loµi thuéc ch©n khíp ; nguån gen ®Ó c¶m øng kh¸ng l¹i loµi ch©n khíp trong thùc vËt . bacterriophage mét virut sao chÐp bªn trong vi khuÈn hoÆc hîp nhÊt víi çc chÊt liÖu di truyÒn cña nã víi NST cña vi khuÈn ; sö dông nh mét vec t¬ trong c«ng nghÖ DNA . beta-galactosidase mét enzym tiªu ho¸ ®îc m· bëi mét operon cã trong tÕ bµo vi khuÈn . biolistic mét xy lanh cã mét èng b»ng ny lon mang çc h¹t h×nh cÇu dïng ®Ó b¾n gen vµo çc tÕ bµo thùc vËt . biotechnology nguyªn lý sinh häc trong ®ã çc qu¸ tr×nh dùa trªn c¬ së Ho¸ sinh nh c«ng nghÖ DNA ®îc dïng cho çc môc ®Ých thùc tiÔn . bovine growth hormone (BGH) mét hormon ®îc s¶n xuÊt b»ng c«ng nghÖ di truyÒn ; BGH kÝch thÝch t¨ng s¶n xuÊt s÷a cña tr©u bß s÷a ; còng ®îc gäi lµ somatotropin . C “cape” mét nucleotit chøa 7-metyl guanozin ®îc thªm vµo ®Çu dÉn cña ph©n tö mRNA trong khi tæng hîp ph©n tö nµy . cDNA ph©n tö DNA ®îc tæng hîp bëi enzym phiªn m· ngîc (transcriptaza) trªn RNA ; tr×nh tù baz¬ ni t¬ trong DNA bæ cøu víi tr×nh tù baz¬ trong RNA . cDNA library mét khèi tÕ bµo ®îc ®a vµo çc plasmid cña chóng mét bé gen ®Æc biÖt , b»ng çch ®ã cã thÓ thu nhËn gen t¬ng ®èi dÔ dµng . centiMorgan (cM) mét ®¬n vÞ cña di truyÒn häc ph©n tö t¬ng ®¬ng víi mét triÖu cÆp baz¬ trong mét ph©n tö DNA . chimera mét plasmid hay mét vec t¬ kh¸c cã chøa DNA kh«ng thêng thÊy trong plasmid .

103

chimeric plasmid mét plasmid ®· ®îc c«ng nghÖ ho¸ ®Ó cã mang mét hay nhiÒu gen ngo¹i lai . Chromosome NhiÔm s¾c thÓ . chromosome walking mét ph¬ng ph¸p x¸c ®Þnh tr×nh tù baz¬ trong ®ã mét NST ®îc ph©n tÝch b»ng çch tr¶i dµi ra råi chän lÊy mét mÈu ë mét thêi ®iÓm vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù baz¬ cña mÈu ®ã. clone nhãm cña çc tæ chøc , hay tÕ bµo , ph©n tö hay çc ®èi tîng kh¸c - tÊt c¶ ®Òu ®i tõ mét ç thÓ ®¬n ; ®ång nghÜa víi tËp ®oµn hay khuÈn l¹c . codon mét tr×nh tù gåm 3 baz¬ trªn ph©n tö mRNA, ho¹t ®éng cïng víi anticodon trªn ph©n tö tRNA ®Ó ®Þnh râ n¬i mét amino axit ®îc ®Æt vµo trong mét protein . complementary thµnh phÇn ®èi nghÞch cña mét cÆp baz¬ ®· ®îc nhËn d¹ng (bæ trî , bæ sung) ; ®Æc biÖt lµ Adenin bæ cøu víi thymin , Xytosin bæ cøu víi Guanin. Conjugation qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp trong ®ã mét vi khuÈn sèng nhËn ®îc çc ®o¹n DNA tõ mét vi khuÈn sèng kh¸c vµ biÓu lé protein ®îc m· bëi DNA nhËn ®îc . contig map b¶n ®å NST trong ®ã çc ®o¹n DNA nèi víi nhau t¹o nªn mét ph©n tö DNA kÒ nhau (kÕ tiÕp nhau) . cosmid mét ®o¹n th¼ng DNA mµ phÇn ®u«i cña nã cã thÓ ®an vµo nhau t¹o nªn mét vßng ; cosmid cã thÓ sö dông nh mét vec t¬ trong c«ng nghÖ sinh häc . cytogenetic map b¶n ®å NST trong ®ã çc gen ho¹t tÝnh ®¸p øng víi mét thuèc nhuém hãa häc vµ biÓu lé nh çc b¨ng trªn NST . D di®eoxynucleotide mét nucleotit thiÕu 2 nguyªn tö oxy trong phÇn cacbohydrat . DNA axit deoxyribonucleic –mét hîp chÊt h÷u c¬ cña gen. DNA fingeprinting mét kü thuËt t¬ng hîp DNA trong ®ã çc tr×nh tù nhÊt ®Þnh trong DNA cña mét mÉu tÕ bµo ®î x¸c ®Þnh vµ so s¸nh víi tr×nh tù baz¬ DNA cña mét mÉu tÕ bµo thø hai ®Ó xem chóng ®· ®ång nhÊt ë møc thiÕt lËp tin tëng cha . DNA ligase mét enzym nèi çc ®o¹n DNA víi nhau b»ng liªn kÕt gi÷a nhãm phot phat cña mét nucleotit víi ph©n tö deoxyriboza cña mét nucleotit tiÕp theo . DNA probe mét ph©n tö DNA tæng hîp chuçi ®¬n , nhá g¾n víi chuçi DNA bæ cøu ®Ých trong mét hçn hîp çc chÊt sinh häc . double helix ph©n tö chuçi kÐp bÞ nøt ra ®Ó h×nh thµnh mét xo¾n ; d¹ng DNA trong NST . Drosophila melanogaster tªn khoa häc cña mét lo¹i ruåi ®îc sö dông trong c«ng nghÖ sinh häc . E EcolRI mét enzym giíi h¹n tõ mét chñng R cña vi khuÈn Escherichia Coli. electrophoresis mét kü thuËt Ho¸ sinh trong ®ã çc ph©n tö ®îc dÞch chuyÓn theo kÝch thíc vµ çc ®Æc tÝnh ho¸ häc cña chóng trong Trêng ®iÖn tõ . endonuclease mét enzym tÕ bµo ph©n c¾t ph©n tö DNA . enzyme mét protein xóc t¸c mét ph¶n øng ho¸ häc cña sù chuyÓn ho¸ mµ nã vÉn cßn gi÷ nguyªn sau ph¶n øng . eschrichia Coli mét chñng vi khuÈn thêng thÊy trong ®êng tiªu ho¸ cña ngêi ®îc dïng trong c«ng nghÖ DNA nh mét tæ chøc nhËn tr×nh tù gen . eucaryote mét tæ chøc mµ çc tÕ bµo cña nã cã nh©n chuÈn (nh nÊm , protozoa , thùc vËt , ®éng vËt ). eucaryotic thuéc vÒ mét tæ chøc phøc t¹p mµ çc tÕ bµo cña nã cã nh©n vµ çc c¬ quan tö , nh©n lªn b»ng gi¸n ph©n (mitose) vµ cã çc ®Æc tÝnh ph©n biÖt víi çc Õ bµo procaryote ®¬n gØan h¬n . Çc tÕ bµo thùc vËt , ®éng vËt vµ ngêi lµ nh©n chuÈn exon phÇn mRNA ®Æc hiÖu cho mét tr×nh tù cña mét amino axit ; exon vÉn ®îc gi÷ l¹i trong ph©n tö mRNA cuèi cïng vµ biÓu hiÖn tr×nh tù amino axit cña protein . F forensic

lµm theo luËt ph¸p .

G gene mét ®o¹n DNA cung cÊp th«ng tin ho¸ häc cho viÖc tæng hîp protein trong tÕ bµo ; tËp hîp çc gen vµ xen vµo çc tr×nh tù DNA hîp thµnh mét NST . gene bank n¬i chøa çc kho tÕ bµo cña c¬ thÓ ®Ó sau nµy cã thÓ tiÕn hµnh ph©n tÝch di truyÒn . gene library mét dÉy çc tÕ bµo hoÆc çc c¬ thÓ ®¬n bµo thêng chøa çc gen tõ çc tÕ bµo ngo¹i lai ; çc gen lÊy tõ çc tÕ bµo cña th viÖn gen ®îc dïng trong çc thÝ nghiÖm c«ng nghÖ DNA .

104

gene linkage map b¶n ®å NST trong ®ã çc gen ho¹t ®éng ®îc ®Þnh vÞ b»ng çch ®Þnh vÞ kÕt hîp chÆt chÏ víi çc gen dÊu chuÈn . gene probe ph©n tö DNA hoÆc RNA kÕt hîp víi ®o¹n DNA hoÆc RNA bæ cøu khi ®a vµo mét khèi lín çc ph©n tö axit nucleic . genetic code tr×nh tù baz¬ ni t¬ trong ph©n tö DNA chuyªn ho¸ cho mét tr×nh tù cña mét amino axit trong mét protein . genome toµn bé çc thµnh phÇn DNA nh©n cña tÊt c¶ çc gen cña mét tÕ bµo hay mét c¬ thÓ ®¬n bµo genomic library mét tËp hîp cña çc tÕ bµo ®· hîp nhÊt trong çc plasmid cña nã tÊt c¶ çc gen cña mét tÕ bµo kh¸c . B»ng çh nµy , viÖc thu nhËn gen t¬ng ®èi dÔ dµng . glycoprotein mét protein cã chøa mét hoÆc nhiÒu ph©n tö cacbohydrat g¾n víi mét hoÆc nhiÒu amino axit trong mét protein . glycosylation qu¸ tr×nh sinh ho¸ häc trong ®ã çc ph©n tö cacbohydrat ®îc g¾n vµo amino axit cña mét protein ë nh÷ng ®iÓm kh¸c nhau . Golgi apparatus mét dÉy çc mµng d¸t máng trong tÕ bµo nh©n chuÈn cïng víi nh÷ng thø ®Ó xö lý protein tríc khi sù tæng hîp hoµn tÊt ; còng cßn gäi lµ thÓ Golgi . gp 120 mét glycæptein ®Þnh vÞ ë líp vá cña virut HIV ; mét chÊt cÇn thiÕt ®Ó g¾n HIV vµo tÕ bµo chñ trong qu¸ tr×nh sao chÐp ; cã thÓ tæng hîp ®îc b»ng c«ng nghÖ DNA ®Ó sö dông trong viÖc s¶n xuÊt vac xin . H helix gièng nh mét cuén d©y nèi víi m¸y ®iÖn tho¹i (xo¾n) , d¹ng DNA trong NST . hemophilia B mét d¹ng a ch¶y m¸u trong ®ã bÖnh nhan kh«ng t¹o ®îc côc m¸u ®«ng do thiÕu mét yÕu tè cÇn thiÕt cho sù ®«ng m¸u , yÕu tè ®«ng m¸u tæng hîp cã thÓ lµm nhÑ bít triÖu chøng nµy . hepatitis B mét bÖnh viªm gan do virut truyÒn qua m¸u ; vac xin hepatitis B ®· ®îc s¶n xuÊt b»ng c«ng nghÖ DNA . human genome chøa kho¶ng 100.000 gen trong mét tÕ bµo ngêi . “human mouse” chuét ®îc thay ®æi vÒ gi¶i phÉu ®Ó cã chøa çc tÕ bµo chøc n¨ng cña hÖ miÔn dÞch . Huntington’s diseases mét bÖnh di truyÒn ®Æc trng bëi sù h háng tiÕn triÓn hÖ thÇn kinh cïng víi sù ®Ëp ph¸ . hypercholesterolemia mét bÖnh di truyÒn ®i kÌm víi viÖc t¨ng møc cholesterol trong m¸u v× v¾ng mÆt receptor cholesterol . I ice –minus bacterium mét vi khuÈn biÕn ®æi gen t¹o ra çc protein c¶m øng sù h×nh thµnh çc tinh thÓ ®¸ ë nhiÖt ®é thÊp h¬n b×nh thêng . insulin hormon tuyÕn tuþ bao gåm 51 amino axit , 2 chuçi nèi víi nhau . Insulin lµm thuËn lîi cho viÖc chuyÓn glucoza vµo m¸u . Insulin còng ®îc s¶n xuÊt b»ng vi khuÈn biÕn ®æi gen . interferon çc protein ®îc ®îc s¶n xuÊt bëi çc tÕ bµo cña ngêi trong ®¸p øng víi virut . Interferon kÝch thÝch sù tæng hîp çc chÊt nh»m chèng l¹i sù thÊm nhËp cña virut vµo trong tÕ bµo ; nã còng ®îc tæng hîp b»ng çc tÕ bµo vi khuÈn biÕn ®æi gen . intron phÇn xen vµo ph©n tö mRNA ®Çu tiªn , sau ®ã nã ®îc lo¹i ®i tríc khi t¹o thµnh ph©n tö mRNA cuèi cïng . K kilobase mét ®¬n vÞ gåm 1000 baz¬ ni t¬ trong mét ph©n tö DNA hay RNA . ‘knockout mouse” chuét biÕn ®æi di truyÒn ®Ó lµm thiÕu çc gen cho c¶ c¬ quan hay c¶ hÖ thèng c¬ quan .

L lactoferrin mét protein cã trong s÷a cã kh¶ n¨ng g¾n çc ph©n tö s¨t ; lactoferrin ®îc s¶n xuÊt b»ng çc tÕ bµo ®éng vËt chuyÓn gen . M mammalian §éng vËt cã x¬ng sèng , m¸u nãng cã tuyÕn vó , cã l«ng tãc ,ch¼ng h¹n nh loµi gËm nhÊm , ®éng vËt nu«i , ®éng vËt bËc cao vµ ngêi . mega YAC mét lo¹i nÊm men lín Ýt gÆp cã NST nh©n t¹o . messenger RNA (mRNA) ph©n tö RNA ®îc tæng hîp víi çc baz¬ ni t¬ m· bæ cøu víi DNA ; mRNA mang çc th«ng ®iÖp tíi tÕ bµo chÊt cña tÕ bµo ®Ó tæng hîp protein .

105

microinjection mét kü thuËt Ho¸ sinh trong ®ã mét xy lanh nhá ®îc sö dông ®Ó th©m nhËp vµo trong tÕ bµo vµ ®Èy çc ®o¹n DNA vµo nh©n cña tÕ bµo . mus musculus mét lo¹i chuét thêng dïng trong c«ng nghÖ DNA . mutation thay ®æi ®Æc tÝnh cña mét tæ chøc do thay ®æi çc gen trong tæ chøc ®ã . N nanometer §¬n vÞ ®o lêng t¬ng ®¬ng víi mét phÇn tû met . nucleic acid mét hîp chÊt h÷u c¬ cÊu thµnh tõ çc nucleotit nèi víi nhau bëi çc liªn kÕt phot phat . nucleotide mét ®¬n vÞ cÊu thµnh cña axit nucleic . O oligonucleotide çc ®o¹n tæng hîp nhá cña RNA hoÆc DNA ; mét d¹ng cña gen tæng hîp ; còng ®îc gäi lµ oligo ; còng lµ çc ®o¹n nhá DNA ho¹t ®éng nh çc ph©n tö antisene. ongogenes gen g©y khèi u hay ung th . “oncomouse” chuét biÕn ®æi gen cã kh¶ n¨ng bÞ ung th vó cao . operator mét dÉy çc baz¬ ni t¬ trong DNA cña mét operon ë ®ã protein øc chÕ hay ho¹t ho¸ cã thÓ ®iÒu chØnh sù biÓu hiÖn cña gen . operon phøc hîp çc gen cÊu tróc vµ gen ®iÒu hoµ trong NST . origin of replication mét tr×nh tù baz¬ ni t¬ trªn ph©n tö DNA lµm tÝn hiÖu cho ®iÓm b¾t ®Çu cña sù sao chÐp cña ph©n tö DNA . P peptide mét protein nhá . phage viÕt t¾t cña bacteriophage ; mét virut sao chÐp trong vi khuÈn hoÆc hîp nhÊt axit nucleic cña nã víi bé gen vi khuÈn ; ®îc dïng nh mét vec t¬ . “pharm” animal ®éng vËt chuyÓn gen ®Ó s¶n xuÊt ra mét s¶n phÈm thuèc x¸c ®Þnh . phosphate group mét ph©n tö gåm phot pho , oxy , vµ nguyªn tö hydro ®i tõ axit phot pho ric nã cã mÆt c¶ trong RNA vµ DNA . phosphodiester bond liªn kÕt ho¸ häc h×nh thµnh gi÷a 5’ phot phat tù do cña mét nucleotit vµ deoxyriboza cña nucleotit thø hai . physical map b¶n ®å NST trong ®ã vÞ trÝ cña gen ho¹t ®éng ®îc x¸c ®Þnh vµ ®· biÕt sè baz¬ gi÷a çc gen ho¹t ho¸ . plasmid mét vßng ®ãng chÆt cña DNA chøa kho¶ng trªn mêi gen vµ çc b¶n sao nh©n lªn trong tÕbµo chÊt cña vi khuÈn ; nã cã thÓ lµ mét vec t¬ cña gen trong c«ng nghÖ DNA . poly –A tail mét tr×nh tù cña nucleotit chøa adenin ë cuèi ph©n tö mRNA kh«ng râ vÒ chøc n¨ng nhng cã thÓ ®îc dïng trong c«ng nghÖ DNA ®Ó x¸c ®Þnh ph©n tö mRNA . polygalacturonate mét enzym cã trong thùc vËt cã thÓ tiªu ho¸ ®îc pectin . polymer mét ph©n tö ho¸ häc bao gåm çc ®¬n vÞ lÆp ®i lÆp l¹i cña mét chÊt ®Æc biÖt . polymerase chain reaction mét qu¸ tr×nh sinh ho¸ trong ®ã mét ®o¹n DNA ®îc nh©n lªn hµng triÖu lÇn nhê sù ho¹t ®éng cña enzym polymeraza . primer DNA mét ®o¹n DNA ®Ó khëi ®Çu tæng hîp DNA , ch¼ng h¹n nh trong ph¶n øng chuçi PCR . procaryote mét tæ chøc mµ çc tÕ bµo cña nã cã nh©n r¶i r¸c (ch¼ng h¹n nh vi khuÈn ) . prokaryotic thuéc vÒ mét tæ chøc ®¬n gi¶n mµ çc tÕ bµo cña nã thiÕu nh©n hoÆc çc bµo quan , nh©n lªn b»ng çch sinh s¶n ®¬n gi¶n , nã cã çc ®Æc ®iÓm kh¸c biÖt h¼n so víi çc tÕ bµo nh©n chuÈn . Çc tÕ bµo vi khuÈn lµ nh©n r¶i r¸c . promoter site mét tr×nh tù cña nucleotit khëi ®Çu cho sù phiªn m· cña mét m· di truyÒn trong DNA thµnh mRNA . protease mét enzym tiªu ho¸ protein ; ë vi khuÈn , proteaza thêng tiªu ho¸ çc protein ngo¹i lai . pseudomonas syringae mét protein ë ®Çu méy vi khuÈn g©y c¶m øng h×nh thµnh çc tinh thÓ ®¸ mét çc tù nhiªn . vi khuÈn cã thÓ ®îc biÕn ®æi gen ®Ó c¶m øng h×nh thµnh çc tinh thÓ ë nhiÖt ®é thÊp h¬n . purine mét baz¬ ni t¬ . VÝdô nh adenin vµ guanin . Q Q-beta replicase mét enzym xóc t¸c tæng hîp RNA sö dông RNA nh mét çi khu«n ; dïng ®Ó khuÕch ®¹i tÝn hiÖu trong PCR . R RAC Uû ban cè vÊn t¸i tæ hîp DNA ; mét nhãm chuyªn viªn trong viÖn y häc quèc gia Hoa kú NIH . Nhãm nµy cã quyÒn phª chuÈn hoÆc b·i miÔn çc dù kiÕn thùc nghiÖm cã liªn qua tíi gen trÞ liÖu . 106

radioactive cã thÓ ph¸t ra bøc x¹ n¨ng lîng cã thÓ ph¸t hiÖn ®îc . recognition sequence mét tr×nh tù baz¬ trªn DNA ®îc nhËn d¹ng ho¸ häc b»ng mét enzym giíi h¹n . regulatory site mét tr×nh tù baz¬ trªn ph©n tö DNA ë ®ã sù biÓu hiÖn gen cã thÓ ®îc kiÓm so¸t b»ng ph¶n øng víi çc protein kiÒm chÕ hoÆc ho¹t ho¸ . repressor protein mét protein ph¶n øng víi vÞ trÝ ®iÒu hoµ trªn ph©n tö DNA vµ kiÒm chÕ sù biÓu hiÖn cña gen b»ng çch øc chÕ sù phiªn m· . resolution gi¶i ph¸p . restriction enzyme mét enzym cã thÓ c¾t DNA ë mét vÞ trÝ giíi h¹n . restriction fragment length polymorphism (RFLP) ®a h×nh ®é dµi çc ®o¹n giíi h¹n . retrovirus mét virut thÊm nhËp vµo çc tÕ bµo chñ vµ sö dông enzym phiªn m· ngîc ®Ó m· cho ph©n tö DNA bæ cøu cho RNA retrovirut ; nã ®îc dïng nh mét vec t¬ DNA . reverse transcriptase mét enzym sö dông çc tr×nh tù baz¬ trong ph©n tö DNA nh mét m« h×nh ®Ó tæng hîp mét ph©n tö DNA bæ cøu . RFLP (restriction fragment length polymorphism) mét ®o¹n DNA ph©n lËp bëi çc enzym giíi h¹n vµ cã chiÒu dµi rÊt thay ®æi ; RFLP ®îc dïng trong chÈn ®o¸n vµ in dÊu DNA nhng cha râ chøc n¨ng cña chóng . ribose ph©n tö 5 cac bon vµ lµ mét trong çc thµnh phÇn cña RNA ; còng t¬ng tù nh deoxyriboza chØ kh¸c lµ cã thªm vµo mét nguyªn tö oxy . ribosome binding site mét dÉy çc baz¬ ni t¬ trong DNA cña mét operon ë ®ã m· baz¬ trong mRNA lµ ®Æc hiÖu cho phÐp mRNA g¾n vµo riboxom . RNA polymerase mét enzym cã chøc n¨ng trong phiªn m· vµ tæng hîp ph©n tö RNA víi çc baz¬ bæ cøu víi nã trong DNA . S sequence map b¶n ®å NST trong ®ã b¶n chÊt vµ vÞ trÝ cña mçi baz¬ nit¬ ®· râ sequence tag site (STS) mét ®o¹n DNA ®îc g¾n vµo mét vÞ trÝ chän läc trªn ph©n tö DNA ®Ó ®¸nh dÊu vÞ trÝ u tiªn ®Ó ph©n tÝch . signal peptide mét protein nhá t¹o thuËn lîi cho viÖc vËn chuyÓn mét protein ®· ®îc s¶n xuÊt ra khái tÕ bµo ®Ó ®i vµo m«i Trêng ngoµi tÕ bµo . Southern blotting mét kü thuËt trong phßng thÝ nghiÖm trong ®ã çc ph©n tö ®· ®îc t¸ch chiÕt b»ng ®iÖn di sau ®ã thÊm khái gel ®Ó ®Þnh lo¹i . “sticky end” mét chuçi ®¬n nucleotit níi réng ë phÇn ®u«i cña mét ®o¹n DNA (®Çu dÝnh). structural genes mét nhãm gen trong operon m· cho mét protein vµ sù biÓu hiÖn cña nã ®îc kiÓm so¸t bëi mét sè gen ®iÒu hoµ . subunits çc ph©n tö vi khuÈn hoÆc çc ®o¹n virut cã thÓ sö dông lµm vac xin ; nã ®îc s¶n xuÊt b»ng c«ng nghÖ DNA . T tag polymerase mét enzym chÞu nhiÖt ®i tõ vi khuÈn Thermus aquaticus ; enzym nµy lµ mét DNA polymerza ®îc sö dông trong PCR . telomere mét ®o¹n DNA ë ®Çu NST cña nÊm men ®Ó b¶o vÖ NST khái bÞ ph©n gi¶i bëi enzym nucleaza . termination site mét dÉy çc nucleotit lµm tÝn hiÖu kÕt thóc sù phiªn m· tõ DNA thµnh mRNA . thymidine mét nucleotit cã chøa deoxyriboza , phot phat vµ thymin . thymidine kinase (TK) mét enzym cã chøc n¨ng trong tæng hîp DNA b»ng çch gi¶i phãng thymin tõ DNA sö dông tríc ®Ó tæng hîp DNA míi ; nã ®îc sö dông nh mét dÊu chuÈn ®Ó x¸c ®Þnh ch¾c ch¾n cho viÖc cµi gen . tissue plasminogen activator (TPA) mét protein t¸c ®éng nh mét proteaza vµ ph©n gi¶i çc côc m¸u ®«ng . TPA còng cã thÓ s¶n xuÊt b»ng c«ng nghÖ DNA . transcription mét qu¸ tr×nh mµ enzym tæng hîp ph©n tö RNA khi sö dông mét chuçi DNA nh mét çi khu«n ; çc baz¬ RNA bæ cøu víi çc baz¬ DNA . transduction qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp gen trong ®ã virut cña vi khuÈn nhËn ®îc çc çc ®o¹n DNA cña vi khuÈn khi sao chÐp virut vµ chuyÓn nh÷ng ®o¹n DNA nµy vµo mét vi khuÈn sèng kh¸c ë ®ã DNA ®îc biÓu hiÖn . transfer RNA (tRNA) mét ph©n tö RNA g¾n vµo mét amino axit ®Æc hiÖu vµ vËn chuyÓn chóng tíi riboxom , ë ®ã x¶y ra sù tæng hîp protein ; cã nhiÒu tRNA cho mét amino axit . transformation qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp gen trong ®ã vi khuÈn nhËn ®îc çc ®o¹n DNA tõ m«i Trêng bªn ngoµi vµ biÓu hiÖn çc protein ®îc m· bëi çc gen cã trong çc ®o¹n ®ã . translation mét qu¸ tr×nh sinh ho¸ cã liªn quan tíi çc enzym, riboxom, vµ çc thµnh phÇn kh¸c trong ®ã ph©n tö mRNA cung cÊp mét baz¬ ni t¬ m· cho sù thay thÕ cña çc amino axit trong sù tæng hîp protein . 107

tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) çc tÕ bµo lympho cña hÖ miÔn dÞch tÊn c«ng vµ ph©n huû çc tÕ bµo khèi u . tumor necrosis factor (TNF) mét protein ®îc t¹o ra bëi ®¹i thùc bµo cña ngêi nã kÝch thÝch sù ph¸ vì çc tÕ bµo khèi u ; TNF cã thÓ ®îc t¹o ra b»ng c«ng nghÖ DNA . U ultramicroscopic

díi kh¶ n¨ng quan s¸t cña hiÓn vi quang häc .

V variable –number tandem repeat ( xem VNTR) = ®o¹n lÆp dµi . vector thùc chÊt cña viÖc vËn chuyÓn DNA ngo¹i lai vµo trong mét tÕ bµo cña mét tæ chøc, ë ®ã DNA ®îc biÓu hiÖn .; mét plasmid , cosmid hay mét virut cã thÓ nh lµ mét vec t¬ . vector incompetence khi mét tæ chøc kh«ng cã kh¶ n¨ng tù thiÕt lËp trong vËt chñ (bÊt lùc ). virus mét ®o¹n axit nucleic ®îc bao quanh bëi mét líp protein bao ngoµi , trong mét sè Trêng hîp cã c¶ mét líp vá ; cã kh¶ n¨ng sao chÐp trong çc tÕ bµo vËt chñ vµ g©y bÖnh trong mét sè Trêng hîp ; mÆt kh¸c , axit nucleic cña virut cã thÓ hîp nhÊt víi NST cña tÕ bµo ; virut thêng ®îc sö dông nh çc vec t¬ . VNTR (variable –number tandem repeat) mét ®o¹n DNA cã chøa mét sè ®Æc biÖt çc tr×nh tù baz¬ ni t¬ lËp ®i lËp l¹i . VNTR ®îc dïng trong kü thuËt in v©n tay DNA .(§o¹n lÆp dµi) Y yeast artificial chromosome (YAC) mét ®o¹n DNA tõ mét tÕ bµo nÊm men vµ ®îc dïng nh ph©n tö c¬ së ®Ó g¾n vµo çc ®o¹n DNA kh¸c .

PHô LôC Tin sinh häc : kh¸i niÖm vµ øng dông . 108

Nh÷ng kh¸i niÖm c¬ b¶n vÒ tin sinh häc (bioinformatics) . Tin sinh häc (bioinrmatics) lµ sù héi tô cña ba lÜnh vùc c«ng nghÖ hµng ®Çu ®ã lµ tin häc – c«ng nghÖ th«ng tin vµ c«ng nghÖ sinh häc .Tin sinh häc lµ mét c«ng cô míi ®Èy nhanh tèc ®é nghiªn cøu vµ øng dông cña c«ng nghÖ sinh häc . Tin sinh häc lµ khoa häc bao gåm viÖc x©y dùng , qu¶n lý vµ lu gi÷ nguån d÷ liÖu th«ng tin toµn cÇu , trªn c¬ së ®ã x©y dùng vµ hoµn thiÖn çc ch¬ng tr×nh xö lý d÷ liÖu øng dông lµm c«ng cô hç trî hiÖu qu¶ cho viÖc nghiªn cøu kh¸m ph¸ b¶n chÊt sinh häc cña giíi tù nhiªn ®Ó phôc vô nh÷ng lîi Ých cña con ngêi . NhiÖm vô chÝnh cña tin sinh häc bao gåm : * X©y dùng , bæ sung , tæ chøc vµ khai th¸c c¬ së d÷ liÖu ®a d¹ng vµ toµn diÖn trªn quy m« toµn cÇu liªn quan ®Õn sinh häc vµ çc ngµnh khoa häc kh¸c . * X©y dùng vµ ph¸t triÓn çc ch¬ng tr×nh xö lý d÷ liÖu øng dông díi d¹ng çc ch¬ng tr×nh xö lý d÷ liÖu ®éc lËp ®îc tÝch hîp trong çc thiÕt bÞ ph©n tÝch hiÖn ®¹i nh»m cung cÊp cho çc nhµ sinh häc ph¬ng tiÖn x©y dùng ph¬ng ¸n nghiªn cøu hay ph©n tÝch xö lý kÕt qu¶ víi sù tham gia t vÊn cña çc chuyªn gia trªn toµn cÇu . *§µo t¹o vµ cËp nhËt thêng xuyªn cho çc nhµ sinh häc kü n¨ng t duy vµ n¨ng lùc khai th¸c hai néi dung trªn vµo ho¹t ®éng khoa häc vµ c«ng nghÖ nh»m t¹o bíc chuyÓn biÕn ®ét ph¸ trong çch tiÕp cËn vµ nghiªn cøu thÕ giíi sèng ,t¹o ra mét cuéc çch m¹ng thùc sù trong ho¹t ®éng s¸ng t¹o cña con ngêi . Cã thÓ nãi r»ng , ngµy nay çc nhµ khoa häc ë bÊt kú mét quèc gia nµo còng ®Òu cã c¬ héi hoµ nhËp mét çch b×nh ®¼ng trong nghiªn cøu sinh häc ®Ó mang l¹i nh÷ng lîi Ých cho c¶ nh©n lo¹i . §iÒu nµy cã nghÜa lµ mét níc nghÌo , víi trang thiÕt bÞ th«ng thêng còng cã thÓ thùc hiÖn ®îc nh÷ng ch¬ng tr×nh nghiªn cøu phøc t¹p thËm chÝ cùc kú phøc t¹p nhê sù hç trî quèc tÕ trªn m¹ng internet . C¬ së d÷ liÖu c«ng nghÖ sinh häc . §Æc ®iÓm cña d÷ liÖu c«ng nghÖ sinh häc . Nguån c¬ së d÷ liÖu sinh häc ®îc truyÒn t¶i trªn m¹ng rÊt ®a d¹ng vµ phong phó vÒ chñng lo¹i còng nh khèi lîng th«ng tin , víi tèc ®é ngµy cµng gia t¨ng theo thêi gian . VÒ néi dung , c¬ së d÷ liÖu tr¶i réng trªn tÊt c¶ çc mÆt tõ çc th«ng tin chung vÒ tiÒm lùc khoa häc vµ c«ng nghÖ cña çc c¬ quan ®Õn çc th«ng tin vÒ çc c«ng tr×nh khoa häc ®· c«ng bè , çc t¹p chÝ chuyªn ngµnh v.v..§Æc ®iÓm chung nhÊt cña çc d÷ liÖu nµy lµ ®îc biÓu diÔn díi d¹ng sè hay ký tù trong çc tÖp d÷ liÖu ®¬n lÎ hay díi d¹ng çc ch¬ng tr×nh thuËt to¸n hoµn chØnh rÊt thuËn lîi ®Î cÊt gi÷ hay trao ®æi .Nguån tin nµy cã thÓ chia thµnh 2 m¶ng lín lµ d÷ liÖu s¬ bé vµ d÷ liÖu thø cÊp . *D÷ liÖu s¬ cÊp bao gåm çc d÷ liÖu thu ®îc qua ph©n tÝch trùc tiÕp b»ng çc ph¬ng tiÖn t¬ng øng (c¬ së d÷ liÖu ph©n tÝch cÊu tróc DNA , cÊu tróc enzym , amino axit vµ çc chÊt kh¸c ) *D÷ liÖu thø cÊp gåm çc d÷ liÖu vµ çc th«ng tin thu ®îc trªn c¬ së ph©n tÝch , kh¸i qu¸tho¸ , hÖ thèng ho¸ hay th«ng tin m« pháng cho tõng ®èi tîng hay nhãm ®èi tîng sinh häc trong thÕ giíi tù nhiªn . M¶ng d÷ liÖu nµy bao gåm c¶ m¶ng th«ng tin mµ qua ®ã nhµ sinh häc cã thÓ khai th¸c cho viÖc ®Þnh híng , ho¹ch ®Þnh kÕ ho¹ch vµ tæ chøc thùc nghiÖm khoa häc tiÕp theo sao cho hiÖu qu¶ h¬n . HoÆc trªn c¬ së ph¸t triÓn n¾m b¾t ®îc quy luËt vËn ®éng cña tù nhiªn kÕt hîp víi nÒn t¶ng logic cña thÕ gi¬Ý sèng cã thÓ “thiÕt kÕ”nhøng¶n phÈm hoµn toµn míi , thËm chÝ cha tõng xuÊt hiÖn trong tù nhiªn . Mét sè c¬ së d÷ liÖu sinh häc lín trªn ThÕ giíi . A.D÷ liÖu th«ng tin th«ng thêng (s¸ch ,t¹p chÝ ,tµi liÖu th«ng tind¹ng sè ho¸ ) : -Çc c«ng tr×nh khoa häc ®· c«ng bè : PUBMED -). -Çc d÷ liÖu vÒ Y –Dîc (http://www.embase.com). -C¬ së d÷ liÖu n«ng nghiÖp (http://www.nalusda.gov/general info/agricola/agricola.html) . -C¬ së d÷ liÖu vÒ cæ sinh häc vµ ®éng vËt hoang d· (http://www.biosis/org). -C¬ së d÷ liÖu vÒ bÖnh häc trong n«ng nghiÖp (http://www.cabi.org). B . D÷ liÖu vÒ ph©n lo¹i häc (http:ww.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy). C. D÷ liÖu vÒ cÊu tróc vµ ®Æc tÝnh cña nucleotit vµ bé gen (genome) .Cã thÓ truy cËp vµo mét trong 3 ®Þa chØ sau : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html. 109

http://www.ebi,ac .uk/embl/databases. vµ http://www.ddbj.nig.ac.jp. D . D÷ liÖu bé gen ngêi cã thÓ truy cËp vµo c¸c ®Þa chØ sau :OMIM: http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim. GDB: http://www.gdb.org. C¬ së d÷ liÖu vÒ vi khuÈn E.Coli : http;//www.susi.bio.unigiessen.de/ecdc/ecdc.html.

http://cgsc.biology.yale.edu/top.html

C¬ së d÷ liÖu vÒ nÊm men :http://www.mips.biochem.mpg.de/proj/yeast vµ http://genomewww.stanford.edu/Saccharomyces. E. D÷ liÖu vÒ cÊu tróc vµ ®Æc tÝnh chuçi amino axit vµ protein : -Protein Information Resourse PIR (http://www.nbrf.georetow.edu) -SWISS-PROT (http:// expasy.ch) hoÆc (http://www.ebi.ac.uk/swissprot). -trEMBL (http://www.ebi.ac.uk/trEMBL) -PROSITE (http://www.expasy.ch/prosite). -PRINT (http://www.bioinf.man.ac.uk/bsm/dbbrowser/PRINTS/PRÝNT.html). F.D÷ liÖu vÒ proteomic (http://www.genom.ad.jp/kegg) hoÆc (http://wit.mcs.ant.gov/WIT2) hoÆc (http://www..ncbi.nlm.nih.gov/COG). G.D÷ liÖu vÒ c¸c enzym vµ c¸c con ®êng trao ®æi chÊt : ENZYM databases (http://www.expasy.ch/enzyme). -§Æc tÝnh enzym BRENDA (http://www..brenda.uni-koeln.de/brenda). -Enzym vµ ph¶n øng enzym (http://www.genome.ad.jp/dbget/ligand.html). Giíi thiÖu mét vµi trung t©m d÷ liÖu lín nhÊt ThÕ giíi : TRUNG T¢M TH¤NG TIN QUèC GIA VÒ C¤NG NGHÖ SINH HäC HOA Kú

PubMed

All Databases

Search SITE MAP Alphabetical List Resource Guide About NCBI An introduction to NCBI GenBank Sequence submission support and software

BLAST

OMIM

Books

TaxBrowser

Structure

for Hot Spots What does NCBI do? Assembly Established in 1988 as a national resource for molecular biology information, NCBI creates Archive public databases, conducts research in computational biology, develops software tools for Clusters of analyzing genome data, and disseminates orthologous biomedical information - all for the better understanding of molecular processes affecting groups human health and disease. More... Coffee Break, Genes & Disease, NCBI Handbook

Literature databases PubMed, OMIM, Books, and PubMed

Electronic PCR Entrez Home Entrez Tools 110

vµ

Central

Entrez Tools

Molecular databases Sequences, structures, and taxonomy

Gene expression omnibus (GEO)

Genomic biology The human genome, whole genomes, and related resources

Malaria genetics & genomics

Tools Data

Human genome resources

Map Viewer

mining

dbMHC

Research at NCBI People, projects, and seminars

Mouse genome resources My NCBI

Software engineering Tools, R&D, and databases Education Teaching resources and on-line tutorials

ORF finder

May

2005

News

available

online

Rat genome resources Reference sequence project

FTP site Download data and software

Retrovirus resources

Contact information How to reach us

SAGEmap SKY/CGH database Trace archive VecScreen NCI-CGAP National Center for Biotechnology Information U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894 Copyright, Disclaimer, Privacy, Accessibility

Revised: June 15, 2005. 111

National Center for Biotechnology Informatics (NCBI) ®îc thµnh lËp n¨m 1988 lµ mét trong çc c¬ së d÷ liÖu sinh häc lín nhÊt ThÕ giíi . NCBI qu¶n lý kho¶ng 25.106 nhãm d÷ liÖu kh¸c nhau bao gåm çc th«ng tin vÒ çc c«ng tr×nh ®· c«ng bè ®Õn cÊu tróc DNA , amino axit còng nh cÊu tróc gen cña çc loµi v.v.. Mét sè m¶ng d÷ liÖu lín cña trung t©m nµy lµ : PubMed : C«ng bè çc kÕt qu¶ nghiªn cøu cña tÊt c¶ çc t¸c gi¶ . GÇn ®©y NCBI cßn cã PubMed Central ®Ó cung cÊp thªm c¶ nh÷ng c«ng tr×nh khoa häc ®· n»m trong kÕ ho¹ch s¾p ph¸t hµnh ®Î giíi thiÖu tríc . GenBank lµ m¶ng c¬ së d÷ liÖu vÒ cÊu tróc DNA vµ amino axit . C¬ së d÷ liÖu GenBank còng lµ s¶n phÈm quèc tÕ gia 3 trung t©m d÷ liÖu gen lín nhÊt ThÕ giíi lµ GenBank cña NBCI (Hoa kú) , DNA Data Bank (cña NhËt b¶n) vµ European Molecular Biology Laboratory nucleotide database (EMBL). entrez System nh»m kÕt nèi çc lien th«ng gi÷a çc m¶ng d÷ liÖu gióp cho viÖc truy cËp nhanh vµ ®Çy ®ñ çc th«ng tin t×m kiÕm . Tøc lµ Entrez kh«ng ph¶i lµ mét c¬ së d÷ liÖu mµ lµ chØ lµ c«ng cô gióp cho ngêi khai th¸c dÔ dµng tiÕp cËn çc th«ng tin liªn quan tõ nhiÒu m¶ng d÷ liÖu kh¸c nhau . c¬ së d÷ liÖu embl. Phßng thÝ nghiÖm Sinh häc ph©n tö Ch©u ¢u (European Molecular Laboratory – EMBL) ®îc thµnh lËp tõ n¨m 1974 , lµ hÖ thèng liªn kÕt çc phßng thÝ nghiÖm sinh häc cña 17 níc Ch©u ¢u vµ Israel . Trong ®ã tËp trung vµo 5 trung t©m lín ë Heidelberg vµ Hambur (§øc) , Grenoble(Ph¸p) , Hinston (Anh) vµ Monterotondo (Italia) . ViÖn tin Sinh häc ¢u ch©u (European Bioinformatics Institute , trùc thuéc EMBL ) ®îc thµnh lËp vµo n¨m 1994 ®· trë thµnh mét trong 3 ng©n hµng d÷ liÑu sinh häc lín nhÊt ThÕ giíi . EMBL Outstation - The European Bioinformatics Institute EMBL Nucleotide Sequence Database Release Notes Release 64 Sep 2000 EMBL Outstation European Bioinformatics Institute Wellcome Trust Genome Campus Hinxton Cambridge CB10 1SD United Kingdom Telephone: +44-1223-494400 Telefax : +44-1223-494468 Electronic mail: datalib@ebi.ac.uk URL: http://www.ebi.ac.uk

CONTENTS * 1 RELEASE 64 o 1.1 Nine Billion Nucleotides o 1.2 Draft Human Genome 112

o 1.2.1 Base Quality Values o 1.2.2 ENSEMBL automatic annotation o 1.3 Genomes Web Server o 1.4 Cross-Reference Information o 1.5 Database Files o 1.5.1 EST Database Files o 1.5.2 GSS Database Files o 1.5.3 HUM Database Files o 1.5.4 HTG Database Files o 1.6 Sequence Retrieval System (SRS6) o 1.7 EMBL Database FAQ o 1.8 Disclaimer * 2 FORTHCOMING CHANGES o 2.1 Genome Representation o 2.2 New HTC (High Throughput cDNA) division o 2.3 EMBL Cumulative Update File o 2.4 Splitting HTG and GSS division files o 2.5 Next version of SRS indices * 3 SEQUENCE SUBMISSION SYSTEMS o 3.1 Checking Sequence Data For Vector Contamination o 3.2 WebIn - WWW Sequence Submission System o 3.3 Bulk Submissions o 3.4 SEQUIN - Stand-alone Submission Program o 3.5 Sequence Alignment Submissions o 3.6 Further Submission Information o 3.6.1 Annotation Guides * 4 CITING THE EMBL NUCLEOTIDE SEQUENCE DATABASE * 5 EBI NETWORK SERVICES o 5.1 Electronic Mail Server o 5.2 Anonymous FTP Server o 5.3 World Wide Web (WWW) Server o 5.4 Sequence Similarity Search Servers * 6 DISTRIBUTION FILES o 6.1 Release 64 Files o 6.2 SRS Indices * APPENDIX A DATABASE GROWTH TABLE 1 RELEASE 64 The EMBL Nucleotide Sequence Database was frozen to make Release 64 on 02-Sep-2000. The release contains 8,344,436 sequence entries comprising 9,650,223,037 nucleotides. This represents an increase of about 16% over Release 63. A breakdown of Release 64 by division is shown below: Division Entries Nucleotides ----------------- ------------ --------------ESTs 5,565,880 2,194,418,599 Fungi 41,017 75,333,934 GSSs 1,717,212 950,099,606 HTG 77,671 4,263,600,014 Human 119,154 965,113,287 Invertebrates 54,900 329,846,226 Other Mammals 27,021 25,376,675 Organelles 72,962 61,665,029 Patents 207,677 67,411,887 Bacteriophage 1,595 4,385,850 113

Plants 68,956 221,131,770 Prokaryotes 86,977 218,928,626 Rodents 55,263 92,528,729 STSs 116,671 51,039,988 Synthetic 3,838 9,763,762 Unclassified 1,174 1,869,994 Viruses 102,523 90,011,114 Other Vertebrates 23,945 27,697,947 ------------ --------------Total 8,344,436 9,650,223,037 1.1 Nine Billion Nucleotides On 07-JUL-2000 the number of nucleotides in the EMBL Database has passed the 9,000,000,000 mark. Over the last 12 months (compare Oct 1, 1999: 3.6 Gigabases) the database size has increased by more than 160%. EMBL database statistics are available at URL: http://www3.ebi.ac.uk/Services/DBStats/ 1.2 Draft Human Genome and HTG division The completion of the human draft genome sequence has been announced on 26-June-2000. The draft sequence data is available from the EMBL Database HTG and HUM divisions. The total size of the euchromatic portion of the genome is estimated to be 3.2 Gbases. The fact that the total score (FIN + UNFIN) exceeds the size of the genome is due to redundancy, the general assumption is that about 30% - 40% of the bases are redundant. Below are the database statistics for finished and unfinished human sequence in EMBL database from September 19, 2000. YEAR FIN_TOTAL UNFIN_TOTAL FIN + UNFIN ------ --------- ----------- ----------9/2000 910 Mb 3505 Mb 4415 Mb See also the Genome Monitoring Table for further detailed information available from the EBI at URL http://www.ebi.ac.uk/Databases/Genome_MOT/genome_mot.html 1.2.1 Base quality values Quality scores from draft HTG data are available on the EBI FTP server. The gzip'ed files in the directory contain base quality values for unfinished human sequences from Japanese, US and European sequencing centres. The FastAtype headers contain the EMBL accession number/version of the corresponding database entries. Example: >AL009030.9 Phrap Quality (Length:229022, Min: 3, Max: 99) In order to keep the size of the files within reasonable limits for handling purposes, files which in uncompressed form are bigger than 1 Gb, are split into smaller files.

114

Directory: ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/embl/quality_scores Current Files: /htg_sanger1.qscore.gz - /htg_sanger3.qscore.gz /htg_genoscope1.qscore.gz /htg_mpimg1.qscore.gz /htg_gbf1.qscore.gz /htg_japan1.qscore.gz /htg_us1.qscore.gz - /htg_us9.qscore.gz Quality score files are updated on a daily basis. 1.2.2 Ensembl automatic annotation Ensembl provides automatic annotation to the human draft genome data including information on confirmed peptides, confirmed cDNAs and also predicted peptides. Additionally, repeat prediction along with integration of map information and SNPs are available. Updated human genome resources spanning the entire working draft are now available. Ensembl has released its automatic annotation for a June 15th "frozen" data set at http://freeze.ensembl.org. This URL will now be the stable location for all subsequent "frozen" dataset updates. The Ensembl web site is available at URL http://www.ensembl.org/ Ensembl is a joint project between the Sanger Centre and EMBL-EBI. 1.3 Genome WEB Server Access to completed genomes The first completed genomes from viruses, phages and organelles were deposited into the EMBL Database in the early 1980's. Since then, molecular biology's shift to obtain the complete sequences of as many genomes as possible combined with major developments in sequencing technology resulted in hundreds of complete genome sequences being added to the database, including Archaea, Eubacteria and Eukaryota. Recent additions include Buchnera sp. APS (acc# BA000003) and Pseudomonas aeruginosa (acc# AE004091). EBI's Genome Web Server provides easy access to completed genome sequences and is available at URL: http://www.ebi.ac.uk/genomes/ Genome Monitoring Table The Genome MOT presents the status of a number of large eukaryotic genome sequencing projects. The tables are updated daily and also provide access to EMBL database entries. The Genome MOTis available at URL: http://www.ebi.ac.uk/Databases/Genome_MOT/genome_mot.html 1.4 Cross-Reference Information Links to a growing list of external databases have been expanded allowing integration with specialised data collections, such as protein databases, species-specific databases, taxonomy databases etc. The WWW-based sequence retrieval system (SRS) enable users to easily navigate between cross-referenced database entries. EMBL links to other databases: Database Nr of links ---------- ----------RZPD 2002574 TrEMBL 338688 115

Demeter 175252 SWISS-PROT 143124 MaizeDB 65929 FLYBASE 40968 IMGT/LIGM 37286 MENDEL 21033 GDB 8430 MGD 7998 TRANSFAC 6620 SGD 6029 EPD 3094 IMGT/HLA 2628 ---------------------Total 2859653 A list of URLs which conform with current DR line references is available: Demeter http://ars-genome.cornell.edu EPD http://www.epd.isb-sib.ch FLYBASE http://www.fruitfly.org GDB http://www.gdb.org IMGT/HLA http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla IMGT/LIGM http://imgt.cines.fr:8104 MGD http://www.informatics.jax.org MaizeDB http://www.agron.missouri.edu MENDEL http://mbclserver.rutgers.edu/CPGN RZPD http://www.rzpd.de SGD http://genome-www.stanford.edu SWISS-PROT http://www.expasy.ch TRANSFAC http://transfac.gbf.de/TRANSFAC TrEMBL http://www.ebi.ac.uk/swissprot/Information/information.html 1.5 Database Files In order to keep the size of the data files within reasonable limits for handling purposes, additional division files will be added in subsequent releases as appropriate. 1.5.1 EST Database Files EST files are now split according to taxonomic subdivisions following the model of the taxonomic split of all other EMBL database divisions, e.g. Release 64 includes files est_fun.dat Fungi ESTs est_hum1.dat - est_hum23.dat Human ESTs est_inv1.dat - est_inv4.dat Invertebrate ESTs est_mam1.dat - est_mam2.dat Mammal ESTs est_pln1.dat - est_pln8.dat Plant ESTs est_pro.dat Prokaryote ESTs est_rod1.dat - est_rod19.dat Rodent ESTs est_vrt1.dat - est_vrt2.dat Vertebrate ESTs This should reduce significantly the volume of data users have to parse in order to extract ESTs for specific groups of organisms. 1.5.2 GSS Database Files The GSS division has been split into 18 files (gss1.dat-gss18.dat).

116

1.5.3 HUM Database Files The HUM division has been split into 6 files (hum1.dat-hum6.dat). 1.5.4 HTG Database Files The HTG division has been split into 11 files (htgo.dat and htg1.dat-htg10.dat). htgo.dat includes all HTGS_PHASE0 entries. These typically consist of one-tofew pass reads of a single clone, have not been assembled into contigs and are unoriented, unordered, unannotated and contain gaps with runs of 'N's separating the reads. Low-pass sequence sampling is useful for identifying clones that may be gene-rich. Phase0 sequences are used to check whether another center is already sequencing this clone. If not, it will be sequenced through phase 1 and phase 2. When records are updated, the accession numbers will be preserved. Files htg1-htg10 include all other HTG entries (HTGS_PHASE1 HTGS_PHASE2) 1.6 Sequence Retrieval System (SRS6) As announced earlier EBI's SRS6 server is available at URL http://srs.ebi.ac.uk/ now maps to http://srs6.ebi.ac.uk/. All external services are available from the Tools button on EBI's Web pages. If you have any comments and/or suggestions please send these to: support@ebi.ac.uk 1.7 EMBL Database FAQ An EMBL Database FAQ has been created and is available from the EBI at URL http://www.ebi.ac.uk/embl/Documentation/FAQ/ This document includes information on: General questions about EMBL and other databases Submission procedure Updating database entries WEBIN-specific questions Navigation guide 1.8 Disclaimer No guarantee is given as to the completeness and accuracy of the database entries, in particular the conformity of sequence data in the database with the journal publication where the sequence is also disclosed. 2 FORTHCOMING CHANGES 2.1 Genome Representation At the May 2000 Collaborative Meeting it was confirmed by the sequence database 117

collaboration DDBJ/EMBL/GenBank to go ahead to transform the currently existing experimental FTP directory representing genome data into a database division CON (Constructed Sequences) to represent complete genomes and other long sequences constructed from segment entries. The CON division entries will contain construct information (accession numbers and sequence locations) involved in building the genomes. CON entries and according information will be included into the daily data exchange mechanism between the collaborating databases. The CON entry file includes construct information and all accession numbers relevant to the genome. Additionally, the complete entry in EMBL format (DNA and features) plus the complete DNA sequence in Fasta format is provided. These entries will be linked, searchable and retrievable through SRS and available for BLAST and FASTA homology searching. For an example representation, see the bacterial genome of Pseudomonas aeruginosa (AE004091) in ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/embl/genomes/Bacteria/paeruginosa/ AE004091.con AE004091.embl AE004091.embl.Z AE004091.fasta AE004091.fasta.Z 2.2 New HTC (High Throughput cDNA) division At the May 2000 collaborative meeting DDBJ/EMBL/GenBank agreed to create a new database division HTC to represent unfinished High Throughput cDNA sequences. HTC sequences may include 5'UTR and 3'UTR regions and (part of a) codin region. Upon finishing of these sequences, they will be moved to the corresponding taxonomic division. HTC sequence entries will include the keyword 'HTC'. The keyword will be removed once the entry has been included in the taxonomic division. 2.3 EMBL cumulative update file We intend to discontinue the provision of the single cumulative update file. Several sites have reported problems handling our EMBL cumulative update file when it grows beyond 2GB (uncompressed), because of file systems that do not support files > 2Gb. Instead of the cumulative.dat.gz file, we will continue to make available on our FTP server a set of smaller data files, that contain together the same data as the full cumulative update file, named cum_*.dat.gz For further details please check the README file in directory ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/embl/new/ 2.4 Splitting HTG and GSS division files We plan to split HTG and GSS division files according to taxonomic subdivisions following the model of the taxonomic split of all other EMBL database divisions. This should reduce significantly the volume of data users have to parse in order to extract HTGs and GSSs for specific groups of organisms. Files will be named 118

accordingly e.g. HTGS_PHASE0 sequences will be included in files htgo_hum.dat, htgo_inv.dat htgo_rod.dat etc, while htgo.dat will include all remaining HTGS_PHASE0 entries. HTGS_PHASE1 - HTGS_PHASE2 sequences will be included in files htg_hum.dat, htg_inv.dat, htg_rod.dat etc while htg.dat will include all remaining HTG entries. GSS sequences will be included in files gss_fun.dat, gss_hum.dat etc, while gss.dat will include all remaining GSS entries. 2.5 Next version of SRS indices Please note that the next version of SRS indices will be for version 607x and not 606. 3 SEQUENCE SUBMISSION SYSTEMS 3.1 Checking Sequence Data For Vector Contamination We urge submitters to remove vector contamination from sequence data before submitting to the database. To assist submitters the EBI is providing a Vector Screening Service using the latest implementation of the BLAST algorithm and a special sequence databank known as EMVEC. EMVEC is an extraction of sequences from the SYNthetic division of EMBL containing more than 2000 sequences commonly used in cloning and sequencing experiments. EMVEC is by no means a complete vector databank but EBI believes it is representative of the kind of material used in modern sequencing and should be useful to submitters. The databank will be updated with each release of EMBL and made publicly available on the EBI's ftp server for those who wish to have it. The interactive WWW service can be found at: http://www.ebi.ac.uk/embl/Submission/webin.html http://www.ebi.ac.uk/blastall/vectors.html The results will list sequences producing significant alignments and associated information like vector name, score, alignment etc 3.2 WebIn - WWW Sequence Submission System WebIn is the preferred WWW Sequence Submission System for submitting nucleotide sequence data and associated biological information to the EMBL Nucleotide Sequence Database at the European Bioinformatics Institute(EBI). To access WebIn at the EBI please use the following URL: http://www.ebi.ac.uk/embl/Submission/webin.html Database entries submitted to the EMBL Nucleotide Sequence Database at the EBI will be exchanged and shared among the International Collaboration of Nucleotide Sequence Databases (DDBJ/EMBL/GenBank). WebIn guides the user through a sequence of WWW forms allowing the submission of sequence data and descriptive information in an interactive and easy way. 119

All the information required to create a database entry will be collected during this process: 1 Submitter Information 2 Release Date Information 3 Sequence Data, Description and Source Information 4 Reference Citation Information 5 Feature Information (e.g. coding regions, regulators, signals etc.) EBI staff will process data submissions within 2 working days and send the database accession number(s) assigned to your data to your e-mail address. 3.3 Bulk Submissions With the aim to make bulk sequence submission less time consuming for the submitters, a new web-based submission system can now be accessed from the WebIn page. Authors planning to submit a large number of similar sequences (i.e.,>25) are presented with an option for "Bulk WebIn Submission". When choosing thebulk path, submitters carry on the usual WebIn submission procedure untilhaving finished a first and single representative sequence. During the submission process database staff will interactively assist in making the submission of this specific data as convenient as possible, thus saving the author the time and effort required to complete numerous submission events individually. Alternatively, authors planning to submit very large numbers of similar sequences should contact the database before submitting the data. Database staff will create series of templates and communicate these to the author for completion with just the information unique to each sequence required. Please contact database staff if you require further information. e-mail: datasubs@ebi.ac.uk Tel: +44-1223-494499 Fax: +44-1223-494472 3.4 SEQUIN - Stand-alone Submission Program Sequin is the multi-platform (Mac/PC/Unix) stand-alone software tool developed by the NCBI for submitting entries to the EMBL, GenBank, or DDBJ sequence databases. The Sequin program, along with detailed downloading and installation instructions plus general information are available from the EBI via WWW and anonymous FTP. http://www3.ebi.ac.uk/Services/Sequin/ ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/sequin/ 3.5 Sequence Alignment Submissions The EBI accepts submissions of alignment data (e.g. from phylogenetic and population analysis etc) of both nucleotide or amino-acid sequences, database staff assigns an alignment number (e.g. ds38200), which is then communicated to the submitter. We suggest that this number is quoted in the resulting publication. Alignment data and associated information are made available via EBI's network servers (see below). 120

ALIGNMENT FORMATS: As well as your alignment data we require information describing your alignment (see table below) Please provide information for all fields. Description Field TITLE: SUBMITTER:

Information required Title of alignment Name, Affiliation, Phone, Fax, Email

RELEASE DATE: Public Immediately / if Confidential please provide hold date CITATION:

If known please provide complete Author list, Title, Journal, Year of publication, Page numbers

ALIGNMENT METHOD: Method of alignment and format submitted, parameters of alignment sequences used (if appropriate) DESCRIPTION OF SYMBOLS:

e.g. Gaps indicated by a dash '-'

DESCRIPTION OF Describe sequences aligned, including accession ALIGNMENT: numbers (if known) and abbreviation of clones or taxon used in alignment file. If your alignment contains sequences derived from multiple taxoonomic sources, please provide the full name of each organism FILE FORMAT: We suggest submission in STANDARD ALIGNMENT FORMATS eg. (NEXUS, PHYLIP, CLUSTALW etc) or Sequin output. A sample alignment in NEXUS format can be viewed at ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/embl/align/ds32096.dat NOTE 1: Alignments can be created within Sequin or imported into Sequin from files in a standard alignment format like NEXUS or PHYLIP. NOTE 2: If reporting new primary sequence data, we suggest that you submit the complete individual sequence files (e.g. via Sequin or WebIn), in order to include the sequence data as individual entries in the EMBL database. If gaps have been introduced for the alignment, please leave them out when sending the individual sequence files. SENDING ALIGNMENT DATA to the EMBL Nucleotide Sequence Database Sequence alignment data can be sent to the Nucleotide Sequence Database by Electronic mail to datasubs@ebi.ac.uk ACCESSING ALIGNMENT DATA Alignment data and additional information are available via the EBI servers: EBI WWW server: http://www.ebi.ac.uk/embl/Submission/alignment.html 121

ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/embl/align/ EBI FTP server: by anonymous FTP from FTP.EBI.AC.UK in directory pub/databases/embl/align EBI File server: by sending an e-mail message to netserv@ebi.ac.uk including the line HELP ALIGN or GET ALIGN:DS8200.DAT

3.6 Further Submission Information 3.6.1 Annotation Guides To help and guide submitters in annotating their sequences, two online guides are available via hyperlinks from within WebIn: EMBL Annotation Examples (http://www3.ebi.ac.uk/Services/Standards/web/) and EMBL Features and Qualifiers (http://www3.ebi.ac.uk/Services/WebFeat/). The annotation examples consist of a list of EMBL approved feature table annotations for common biological sequences. The EMBL Features and Qualifiers is a complete list of feature table key and qualifier definitions providing detailed descriptions, mandatory and optional qualifiers and usage examples. For further information on submission of sequence data to the EMBL Nucleotide Sequence Database please access: http://www.ebi.ac.uk/embl/Submission/ or contact database staff at: EMBL Nucleotide Sequence Submissions e-mail: datasubs@ebi.ac.uk telephone: +44-1223-494499 telefax: +44-1223-494472 4 CITING THE EMBL NUCLEOTIDE SEQUENCE DATABASE We encourage authors to include a reference to the EMBL Database in publications related to their research. When citing data in the EMBL Database, we suggest to give the according primary accession and the publication in which the sequence first appeared. For unpublished data, we suggest to contact the original submitters for recent publication information or revisions of the data. We suggest to also provide a reference for the EMBL Database itself. Our recent publication describing the EMBL database should be cited: Baker W., van den Broek, A., Camon E., Hingamp P., Sterk P., Stoesser G., and Tuli M.A.. 'The EMBL Nucleotide Sequence Database', Nucl. Acids Res., 28 (1), 19-23 (2000). Example: The numbers in parentheses refer to the REFERENCE in the EMBL database entry, and to the EMBL citation above. "Sequence entry X56734 (1) has been retrieved from the EMBL Database (2) and showed significant sequence similarity to ..." (1) Oxtoby, E., et al., Plant Mol. Biol. 17:209-219(1991). (2) Baker, W., et al., Nucl. Acids Res. 28:19-23(2000) 122

5 EBI NETWORK SERVICES 5.1 Electronic Mail Server Computer users with access to Internet (directly or via a gateway) can obtain copies of database entries, documentation or the data submission form, by sending commands to a file server running at EBI. New and updated EMBL nucleotide sequence entries are made available on the server on a daily basis. To use this facility, send file server commands (as electronic mail) to the address netserv@ebi.ac.uk. Each line of the mail message should consist of a single file server request. The most important file server request, to get started, is: HELP If the file server receives this command, it will return a helpfile to the sender, explaining in some detail how to use the facility. For example, to request a copy of the nucleotide sequence with accession number X55652, use the command: GET NUC:X55652 The file server offers various other services, (eg., access to nucleotide and protein sequence data, protein structure data, software), details of which are provided in the HELP file. 5.2 Anonymous FTP Server An alternative method of accessing the EBI archives is to use the Internet File transfer protocol (ftp). Researchers with direct access to the Internet can use the FTP program on their local machine to connect to the host FTP.EBI.AC.UK and enter the username "anonymous" and their email address as password. The directory pub/help contains detailed information about the data available from the EBI anonymous FTP server which includes the complete EMBL Nucleotide Sequence Database releases as well as daily and weekly updates and a cumulative update file (in UNIX-compressed format)in the following directories: EMBL quarterly release: pub/databases/embl/release EMBL updates: pub/databases/embl/new 5.3 World Wide Web (WWW) Server The EBI operates a WWW server with URL http://www.ebi.ac.uk/ which gives access to information about the EBI and it's products and services. Nucleotide sequences can be retrieved by a simple query by accession number, or more complex queries can be contructed using an SRS WWW databank browser. Nucleotide sequences can also be submitted to the database using the interactive submission system WebIn at URL: http://www.ebi.ac.uk/embl/Submission/webin.html

123

5.4 Sequence Similarity Search Servers The EBI offers two network servers for sequence similarity searches via electronic mail or interactive WWW forms: FASTA based on W. Pearson's FASTA algorithm. Allows local similarity searches of protein and nucleotide sequence databases. Send "help" to Fasta@EBI.AC.UK or use URL http://www.ebi.ac.uk/fasta3/ BLAST based on the NCBI and WU-Blast software Send "help" to Blast@EBI.AC.UK or use URL http://www.ebi.ac.uk/blast2/ BLITZ allows very fast searches of protein sequence databases for local similarities using an exhaustive Smith-Waterman matching algorithm. Compugen's BIC_SW software is running on a Biocellerator (BIC-2) Send "help" to Blitz@EBI.AC.UK or use URL http://www.ebi.ac.uk/bic_sw/ 6 DISTRIBUTION FILES 6.1 Release 64 Files The release contains the files shown below, in the order listed. File sizes are given as numbers of records. File Number File Name 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

Description

Number of Records

DELETEAC.TXT Deleted accession numbers 44649 FTABLE.TXT Feature Table Documentation 465 RELNOTES.TXT Release Notes (this document) 915 SUBFORM.TXT Data Submission Form 418 SUBINFO.TXT Data Submission Documentation 333 UPDATE.TXT Data Update Form 107 USRMAN.TXT User Manual 1469 ACNUMBER.NDX Accession Number Index 8372365 CITATION.NDX Citation Index 1872434 DIVISION.NDX Division Index 23 KEYWORD.NDX Keyword Index 3109242 SHORTDIR.NDX Short Directory Index 21428207 SPECIES.NDX Species Index 2888410 EST_FUN.DAT EST Sequences 3491596 EST_HUM1.DAT EST Sequences 7242162 EST_HUM2.DAT EST Sequences 7383411 EST_HUM3.DAT EST Sequences 7092087 EST_HUM4.DAT EST Sequences 6958043 EST_HUM5.DAT EST Sequences 7086795 EST_HUM6.DAT EST Sequences 7098043 EST_HUM7.DAT EST Sequences 7136249 EST_HUM8.DAT EST Sequences 7031857 EST_HUM9.DAT EST Sequences 7156374 EST_HUM10.DAT EST Sequences 6859020 EST_HUM11.DAT EST Sequences 6661083 EST_HUM12.DAT EST Sequences 6431484 EST_HUM13.DAT EST Sequences 6811351 EST_HUM14.DAT EST Sequences 6856402 EST_HUM15.DAT EST Sequences 7036586 EST_HUM16.DAT EST Sequences 7306475 EST_HUM17.DAT EST Sequences 7263236 EST_HUM18.DAT EST Sequences 7357458 EST_HUM19.DAT EST Sequences 7444208 EST_HUM20.DAT EST Sequences 7476190 124

35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98

EST_HUM21.DAT EST Sequences 6699624 EST_HUM22.DAT EST Sequences 6963358 EST_HUM23.DAT EST Sequences 4588499 EST_INV1.DAT EST Sequences 6431773 EST_INV2.DAT EST Sequences 6042873 EST_INV3.DAT EST Sequences 6293598 EST_INV4.DAT EST Sequences 4046341 EST_MAM1.DAT EST Sequences 6114230 EST_MAM2.DAT EST Sequences 2356039 EST_PLN1.DAT EST Sequences 6750911 EST_PLN2.DAT EST Sequences 6219344 EST_PLN3.DAT EST Sequences 5830564 EST_PLN4.DAT EST Sequences 7215994 EST_PLN5.DAT EST Sequences 7046836 EST_PLN6.DAT EST Sequences 6762278 EST_PLN7.DAT EST Sequences 6720107 EST_PLN8.DAT EST Sequences 6029205 EST_PRO.DAT EST Sequences 38548 EST_ROD1.DAT EST Sequences 7331559 EST_ROD2.DAT EST Sequences 7567611 EST_ROD3.DAT EST Sequences 7220551 EST_ROD4.DAT EST Sequences 7549688 EST_ROD5.DAT EST Sequences 6811012 EST_ROD6.DAT EST Sequences 7086810 EST_ROD7.DAT EST Sequences 9771985 EST_ROD8.DAT EST Sequences 9130283 EST_ROD9.DAT EST Sequences 7665029 EST_ROD10.DAT EST Sequences 9177208 EST_ROD11.DAT EST Sequences 9743196 EST_ROD12.DAT EST Sequences 9700691 EST_ROD13.DAT EST Sequences 9653685 EST_ROD14.DAT EST Sequences 9473210 EST_ROD15.DAT EST Sequences 9015774 EST_ROD16.DAT EST Sequences 6666497 EST_ROD17.DAT EST Sequences 7649778 EST_ROD18.DAT EST Sequences 7420422 EST_ROD19.DAT EST Sequences 738690 EST_VRT1.DAT EST Sequences 7641169 EST_VRT2.DAT EST Sequences 2254064 FUN.DAT Fungi Sequences 3736027 GSS1.DAT Genome Survey Sequences 6116578 GSS2.DAT Genome Survey Sequences 6118824 GSS3.DAT Genome Survey Sequences 6268149 GSS4.DAT Genome Survey Sequences 6628318 GSS5.DAT Genome Survey Sequences 6554451 GSS6.DAT Genome Survey Sequences 6616068 GSS7.DAT Genome Survey Sequences 6639716 GSS8.DAT Genome Survey Sequences 6644800 GSS9.DAT Genome Survey Sequences 6958158 GSS10.DAT Genome Survey Sequences 6788195 GSS11.DAT Genome Survey Sequences 7155659 GSS12.DAT Genome Survey Sequences 6988978 GSS13.DAT Genome Survey Sequences 6978243 GSS14.DAT Genome Survey Sequences 6402203 GSS15.DAT Genome Survey Sequences 6646868 GSS16.DAT Genome Survey Sequences 7448747 GSS17.DAT Genome Survey Sequences 6669805 GSS18.DAT Genome Survey Sequences 1027489 HTG1.DAT High Throughput Genome Sequences 7854248 HTG2.DAT High Throughput Genome Sequences 5995734 HTG3.DAT High Throughput Genome Sequences 4210260 HTG4.DAT High Throughput Genome Sequences 4724917 HTG5.DAT High Throughput Genome Sequences 8718298 HTG6.DAT High Throughput Genome Sequences 8721834 125

99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123

HTG7.DAT High Throughput Genome Sequences 8979368 HTG8.DAT High Throughput Genome Sequences 8137472 HTG9.DAT High Throughput Genome Sequences 7846179 HTG10.DAT High Throughput Genome Sequences 4273070 HTGO. DAT High Throughput Genome Sequences 8701440 HUM1.DAT Human Sequences 9494007 HUM2.DAT Human Sequences 5320579 HUM3.DAT Human Sequences 3561983 HUM4.DAT Human Sequences 2858503 HUM5.DAT Human Sequences 2298449 HUM6.DAT Human Sequences 1644433 INV.DAT Invertebrate Sequences 9495348 MAM.DAT Other Mammal Sequences 1908267 ORG.DAT Organelle Sequences 5140625 PATENT.DAT Patent Sequences 8110279 PHG.DAT Bacteriophage Sequences 217840 PLN.DAT Plant Sequences 8269953 PRO1.DAT Prokaryote Sequences 6104496 PRO2.DAT Prokaryote Sequences 4233076 ROD.DAT Rodent Sequences 4755562 STS.DAT STS Sequences 7970081 SYN.DAT Synthetic Sequences 394629 UNC.DAT Unclassified Sequences 106371 VRL.DAT Viral Sequences 7545287 VRT.DAT Other Vertebrate Sequences 1787491

6.2 SRS Indices SRS indices can be found on the FTP server in the srs directory ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/embl/release/srs/. See README file for details. Please note that the next version of SRS indices will be for version 607x and not 606. APPENDIX A DATABASE GROWTH TABLE The following table shows the growth of the EMBL Nucleotide Sequence Database at each release. Release Month

Entries

Nucleotides

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

568 811 1481 1698 2378 4835 5789 6395 7630 8817 11621 12706 14397 15344 17961 19592 20695 22938

585433 1114447 1654863 2147205 2874493 4567592 5622638 6353040 7813214 9766948 12189783 13638061 16023478 17272160 20318442 22625941 24211054 27249830

06/1982 04/1983 12/1983 08/1984 04/1985 08/1985 12/1985 04/1986 09/1986 12/1986 04/1987 07/1987 10/1987 01/1988 05/1988 08/1988 11/1988 02/1989

126

19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64

05/1989 08/1989 11/1989 02/1990 05/1990 08/1990 11/1990 02/1991 05/1991 09/1991 12/1991 03/1992 06/1992 09/1992 12/1992 03/1993 06/1993 09/1993 12/1993 03/1994 06/1994 09/1994 12/1994 03/1995 06/1995 09/1995 12/1995 03/1996 06/1996 09/1996 12/1996 03/1997 06/1997 10/1997 12/1997 03/1998 06/1998 09/1998 12/1998 03/1999 06/1999 09/1999 12/1999 03/2000 06/2000 09/2000

24365 26223 28679 31508 34902 37784 41580 43745 46871 54558 57655 63378 72481 79377 89100 99591 108973 127933 146576 167777 182615 209352 230950 303206 420111 506190 622566 701246 827174 928067 1047263 1187455 1432941 1787004 1917868 2125225 2330040 2689618 3046471 3272064 3952878 4719266 5303436 5865742 6760113 8344436

29066676 31240948 34748087 38165786 42923803 47354438 52900354 55859549 59915244 70448052 75400487 83574342 94390065 101292310 111413979 121420828 131880111 145401156 158171400 177550115 192195819 211017104 226259607 262559786 315840053 363273777 427620278 473691480 550739395 608931850 696183789 789755858 931351601 1181167498 1281391651 1427634373 1607673907 1904091473 2164718256 2355200790 2924568545 3543553093 4508169737 6120908677 8255674441 9650223037.

C¬ së d÷ liÖu CIB-ddBJ . center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan (CIB-DDBJ) lµ c¬ së d÷ liÖu cña trung t©m th«ng tin Sinh häc , viÖn Di truyÒn Quèc gia NhËt b¶n .

127

CIB –DDBJ lµ c¬ së d÷ liÖu c«ng nghÖ Sinh häc quan träng vµ lµ c¬ së d÷ liÖu DNA duy nhÊt ë NhËt b¶n . Bªn c¹nh CIB-DDBJ , viÖn Di truyÒn Quèc gia NhËt b¶n cßn qu¶n lý nhiÒu m¶ng d÷ liÖu kh¸c còng rÊt quan träng nh World Data Center for microorganisms (www.wdcm.nig.ac.jp) , Genetic Resources Database SHIGEN (www.shigen.nig.ac.jp). C¬ së d÷ liÖu vÒ Dù ¸n bé gen ngêi vµ Gen trÞ liÖu . §©y lµ c¬ së d÷ liÖu ®Çy ®ñ nhÊt liªn quan tíi Dù ¸n bé gen ngêi vµ Gen trÞ liÖu . Chóng ta cã thÓ tham kh¶o vµ lµm viÖc víi bÊt kú mét bé phËn nµo ë bÊt kú quèc gia nµo th«ng qua c¸c trang Web cña hä . §©y lµ mét ph¬ng ph¸p tiÕt kiÖm nhÊt , ®ång thêi còng lµ hiÖu qu¶ nhÊt , ®Æc biÖt víi c¸c níc mµ trang thiÕt bÞ thÝ nghiÖm cßn bÞ h¹n chÕ bëi sù eo hÑp vÒ tµi chÝnh . Human Genome Project Information Genomics:GTL Microbial Genome Program home skip navigation

Gene Therapy Subject

Index Quick Links to this page

Send the url of this page to a friend News What's New Meetings Calendar Media Guide

•

What is gene therapy?

•

How does gene therapy work?

•

What is the current status of gene therapy research?

•

What factors have kept gene therapy from becoming an effective treatment for genetic

128

Basic Information FAQs Glossary Acronyms Links Genetics 101 Publications About the Project What is it? Goals Progress History Ethical Issues Benefits Genetics 101

disease? •

What are some recent developments in gene therapy research?

•

What are some of the ethical considerations for using gene therapy?

•

Gene therapy links

What is gene therapy? Genes, which are carried on chromosomes, are the basic physical and functional units of heredity. Genes are specific sequences of bases that encode instructions on how to make proteins. Although genes get a lot of attention, it’s the proteins that perform most life functions and even make up the majority of cellular structures. When genes are altered so that the encoded proteins are unable to carry out their normal functions, genetic disorders can result.

Gene therapy is a technique for correcting defective genes Medicine & responsible for disease development. Researchers may use the New Genetics one of several approaches for correcting faulty genes: Home • A normal gene may be inserted into a nonspecific Gene Testing location within the genome to replace a nonfunctional gene. This approach is most Gene Therapy common. Pharmacogenomics • An abnormal gene could be swapped for a normal Disease gene through homologous recombination. Information Genetic • The abnormal gene could be repaired through Counseling selective reverse mutation, which returns the gene Ethical, Legal, to its normal function. Social Issues Home • The regulation (the degree to which a gene is turned on or off) of a particular gene could be Privacy altered. Legislation Gene Testing How does gene therapy work? Patenting Forensics In most gene therapy studies, a "normal" gene is inserted into the genome to replace an "abnormal," disease-causing Genetically Modified Food gene. A carrier molecule called a vector must be used to deliver the therapeutic gene to the patient's target cells. Behavioral Currently, the most common vector is a virus that has Genetics been genetically altered to carry normal human DNA. Minorities, Race, Viruses have evolved a way of encapsulating and delivering their genes to human cells in a pathogenic Genetics manner. Scientists have tried to take advantage of this Genetics in capability and manipulate the virus genome to remove Courtroom disease-causing genes and insert therapeutic genes. Education Teachers Careers

Target cells such as the patient's liver or lung cells are infected with the viral vector. The vector then unloads its genetic material containing the therapeutic human gene into the target cell. The generation of a functional protein

129

Students Webcasts Audio/Video Images Videos Chromosome Poster Presentations Genetics 101 Genética Websites en Español Research Home Sequencing Instrumentation Mapping Bioinformatics Functional Genomics ELSI Research Recent Abstracts US,Intl. Research Sites Funding Publications Human Genome News Chromosome Poster Primer Molecular Genetics To Know Ourselves Your Genes, Your Choices List of All Publications

product from the therapeutic gene restores the target cell to a normal state. See a diagram depicting this process. Some of the different types of viruses used as gene therapy vectors: •

Retroviruses - A class of viruses that can create double-stranded DNA copies of their RNA genomes. These copies of its genome can be integrated into the chromosomes of host cells. Human immunodeficiency virus (HIV) is a retrovirus.

•

Adenoviruses - A class of viruses with doublestranded DNA genomes that cause respiratory, intestinal, and eye infections in humans. The virus that causes the common cold is an adenovirus.

•

Adeno-associated viruses - A class of small, single-stranded DNA viruses that can insert their genetic material at a specific site on chromosome 19.

•

Herpes simplex viruses - A class of doublestranded DNA viruses that infect a particular cell type, neurons. Herpes simplex virus type 1 is a common human pathogen that causes cold sores.

Besides virus-mediated gene-delivery systems, there are several nonviral options for gene delivery. The simplest method is the direct introduction of therapeutic DNA into target cells. This approach is limited in its application because it can be used only with certain tissues and requires large amounts of DNA. Another nonviral approach involves the creation of an artificial lipid sphere with an aqueous core. This liposome, which carries the therapeutic DNA, is capable of passing the DNA through the target cell's membrane. Therapeutic DNA also can get inside target cells by chemically linking the DNA to a molecule that will bind to special cell receptors. Once bound to these receptors, the therapeutic DNA constructs are engulfed by the cell membrane and passed into the interior of the target cell. This delivery system tends to be less effective than other options.

Researchers also are experimenting with introducing a 47th (artificial human) chromosome into target cells. This chromosome would exist autonomously alongside the standard 46 --not affecting their workings or causing any Search This mutations. It would be a large vector capable of carrying Site substantial amounts of genetic code, and scientists anticipate that, because of its construction and autonomy, the body's immune systems would not attack it. A problem with this potential method is the difficulty in delivering such a large molecule to the nucleus of a target cell. Contact Us Privacy Statement What is the current status of gene therapy research?

130

Site Stats Credits

and The Food and Drug Administration (FDA) has not yet approved any human gene therapy product for sale. Current gene therapy is experimental and has not proven very successful in clinical trials. Little progress has been made since the first gene therapy clinical trial began in 1990. In 1999, gene therapy suffered a major setback with the death of 18-year-old Jesse Gelsinger. Jesse was participating in a gene therapy trial for ornithine transcarboxylase deficiency (OTCD). He died from multiple organ failures 4 days after starting the treatment. His death is believed to have been triggered by a severe immune response to the adenovirus carrier. Another major blow came in January 2003, when the FDA placed a temporary halt on all gene therapy trials using retroviral vectors in blood stem cells. FDA took this action after it learned that a second child treated in a French gene therapy trial had developed a leukemia-like condition. Both this child and another who had developed a similar condition in August 2002 had been successfully treated by gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency disease (X-SCID), also known as "bubble baby syndrome." FDA's Biological Response Modifiers Advisory Committee (BRMAC) met at the end of February 2003 to discuss possible measures that could allow a number of retroviral gene therapy trials for treatment of lifethreatening diseases to proceed with appropriate safeguards. FDA has yet to make a decision based on the discussions and advice of the BRMAC meeting. What factors have kept gene therapy from becoming an effective treatment for genetic disease? â&#x20AC;˘

Short-lived nature of gene therapy - Before gene therapy can become a permanent cure for any condition, the therapeutic DNA introduced into target cells must remain functional and the cells containing the therapeutic DNA must be longlived and stable. Problems with integrating therapeutic DNA into the genome and the rapidly dividing nature of many cells prevent gene therapy from achieving any long-term benefits. Patients will have to undergo multiple rounds of gene therapy.

â&#x20AC;˘

Immune response - Anytime a foreign object is introduced into human tissues, the immune system is designed to attack the invader. The risk of stimulating the immune system in a way that reduces gene therapy effectiveness is always a potential risk. Furthermore, the immune system's enhanced response to invaders it has seen before makes it difficult for gene therapy to be repeated in patients.

â&#x20AC;˘

Problems with viral vectors - Viruses, while the carrier of choice in most gene therapy studies, present a variety of potential problems to the patient --toxicity, immune and inflammatory

131

responses, and gene control and targeting issues. In addition, there is always the fear that the viral vector, once inside the patient, may recover its ability to cause disease. •

Multigene disorders - Conditions or disorders that arise from mutations in a single gene are the best candidates for gene therapy. Unfortunately, some the most commonly occurring disorders, such as heart disease, high blood pressure, Alzheimer's disease, arthritis, and diabetes, are caused by the combined effects of variations in many genes. Multigene or multifactorial disorders such as these would be especially difficult to treat effectively using gene therapy. For more information on different types of genetic disease, see Genetic Disease Information.

What are some recent developments in gene therapy research? •

University of California, Los Angeles, research team gets genes into the brain using liposomes coated in a polymer call polyethylene glycol (PEG). The transfer of genes into the brain is a significant achievement because viral vectors are too big to get across the "blood-brain barrier." This method has potential for treating Parkinson's disease. See Undercover genes slip into the brain at NewScientist.com (March 20, 2003).

•

RNA interference or gene silencing may be a new way to treat Huntington's. Short pieces of doublestranded RNA (short, interfering RNAs or siRNAs) are used by cells to degrade RNA of a particular sequence. If a siRNA is designed to match the RNA copied from a faulty gene, then the abnormal protein product of that gene will not be produced. See Gene therapy may switch off Huntington's at NewScientist.com (March 13, 2003).

•

New gene therapy approach repairs errors in messenger RNA derived from defective genes. Technique has potential to treat the blood disorder thalassaemia, cystic fibrosis, and some cancers. See Subtle gene therapy tackles blood disorder at NewScientist.com (October 11, 2002).

•

Gene therapy for treating children with X-SCID (sever combined immunodeficiency) or the "bubble boy" disease is stopped in France when the treatment causes leukemia in one of the patients. See 'Miracle' gene therapy trial halted at NewScientist.com (October 3, 2002).

•

Researchers at Case Western Reserve University and Copernicus Therapeutics are able to create tiny liposomes 25 nanometers across that can carry

132

therapeutic DNA through pores in the nuclear membrane. See DNA nanoballs boost gene therapy at NewScientist.com (May 12, 2002). •

Sickle cell is successfully treated in mice. See Murine Gene Therapy Corrects Symptoms of Sickle Cell Disease from March 18, 2002, issue of The Scientist.

What are some of the ethical considerations for using gene therapy? --Some Questions to Consider... •

What is normal and what is a disability or disorder, and who decides?

•

Are disabilities diseases? Do they need to be cured or prevented?

•

Does searching for a cure demean the lives of individuals presently affected by disabilities?

•

Is somatic gene therapy (which is done in the adult cells of persons known to have the disease) more or less ethical than germline gene therapy (which is done in egg and sperm cells and prevents the trait from being passed on to further generations)? In cases of somatic gene therapy, the procedure may have to be repeated in future generations.

•

Preliminary attempts at gene therapy are exorbitantly expensive. Who will have access to these therapies? Who will pay for their use?

Gene Therapy Links General Information •

MEDLINEplus: Genes and Gene Therapy - Access news, information from the National Institutes of Health, clinical trials information, research, and more.

•

Recombinant DNA and Gene Transfer - National Institutes of Health Guidelines

•

Questions and Answers about Gene Therapy - A fact sheet from the National Cancer Institute.

•

Introduction to Gene Therapy - An overview by Access Excellence.

•

A Gene Therapy Primer - Introduction to gene therapy from the bio.com.

•

Gene Therapy and Your Child - From KidsHealth for Parents.

133

•

Pioneering gene treatment gives frail toddler a new lease of life

•

Gene Transfer - An overview of gene therapy science issues, ethical concerns, and regulation and policy from the Genetics & Public Policy Center.

•

Cures - An introduction to gene therapy provided by discoveryhealth.com.

•

Delivering the Goods - An article describing the different types of gene therapy approaches. From October 2, 2000, issue of The Scientist.

•

How to Turn on a Gene - An article from Wired Magazine.

•

How Viruses Are Used in Gene Therapy - From The DNA Files, a series of radio programs from SoundVision Productions.

•

Human Gene Therapy: Present and Future - A Human Genome News article.

•

Gene Therapy - A NewsHour with Jim Lehrer transcript covering the death of gene therapy patient, Jesse Gelsinger (February 2, 2000).

•

Animations from the Tokyo Medical University Department of Paediatrics Genetics Study Group o

Animations of Induction of Genes (Gene Therapy)

Animations of Problems in Gene Therapy

FDA Information •

FDA Advisory Committee Discusses Steps for Potentially Continuing Certain Gene Therapy Trials That Were Recently Placed on Hold 2/28/2003

•

FDA Places Temporary Halt On Gene Therapy Trials Using Retroviral Vectors In Blood Stem Cells - 1/14/2003

•

New Initiatives to Protect Participants in Gene Therapy Trials - 3/7/2000

•

Human Gene Therapy and The Role of the Food and Drug Administration - An overview from the Center for Biologics Evaluations and Research of the U.S. Food and Drug Administration.

•

Human Gene Therapy Harsh Lessons, High Hopes - An article published in the September-October 2000 issue of FDA Consumer magazine.

•

The Last Word: Researchers React to Gene Therapy's Pitfalls and Promises - An article published in the September-October 2000 issue of

134

FDA Consumer magazine. •

Fundamentals of Gene Therapy - Diagrams and basic description of gene therapy from the FDA.

Gene Therapy Ethics •

Ethical Issues in Human Gene Therapy - A Human Genome News article.

•

Special Report: Ethics of Genetics - From Guardian Unlimited.

•

Ethical Issues in Human Gene Therapy - A Human Genome News article.

Gene Therapy Clinical Trials •

University of Pittsburgh Molecular Medicine Institute - Contains information about ongoing and completed clinical trials.

•

Gene therapy studies in ClinicalTrials.gov - The U.S. National Institutes of Health resource for public access to information on clinical research studies.

•

Gene Therapy Clinical Trials - Access to a worldwide database of gene therapy clinical trials at this Web site from the publishers of The Journal of Gene Medicine. To search the database, click on "Interactive Database" at the top of the page. Access to charts, statistics, and abstracts from clinical trials results also provided.

Professional Associations •

American Society of Gene Therapy

•

Australasian Gene Therapy Society (AGTS)

•

European Society of Gene Therapy (ESGT)

Gene Therapy Journals (Scientific, peer-reviewed publications targeted to clinicians and researchers. Access to full-text articles in these journals typically requires a subscription.) •

Cancer Gene Therapy - From the publishers of Nature.

•

Current Gene Therapy - From Bentham Science Publishers.

•

Gene Therapy - From the publishers of Nature.

•

Human Gene Therapy - Journal published by Mary Anne Liebert, Inc.

•

The Journal of Gene Medicine - Official journal of the European Society of Gene Therapy (ESGT), Japan Society of Gene Therapy (JSGT), and the Australasian Gene Therapy Society (AGTS).

•

Molecular Therapy - A monthly journal published 135

by the American Society of Gene Therapy (ASGT). Other Publications •

Vector - Magazine of the Gene Therapy Center at the University of Alabama at Birmingham. Issues available for download as PDF.

Send the url of this page to a friend To read pdf files, download the free Acrobat Reader software. Last modified: Tuesday, October 19, 2004 Home * Contacts * Disclaimer Base URL: www.ornl.gov/hgmis Site sponsored by the U.S. Department of Energy Office of Science, Office of Biological and Environmental Research, Human Genome Program

MÉu dß (§ÇU Dß) axit nucleic Lai ph©n tö axit nucleic ®îc dïng ®Ó chÈn ®o¸n çc trêng hîp nhiÔm khuÈn mµ nh÷ng ph¬ng ph¸p kinh ®iÓn kh«ng thÓ ph¸t hiÖn ®îc gen g©y bÖnh . §Ó chÈn ®o¸n sù nhiÔm khuÈn vµ nhiÒu øng dông kh¸c n÷a , ngêi ta ®· sö dông mét thiÕt bÞ míi , ®ã lµ ®Çu dß axit nucleic . Cã 3 lo¹i mÉu dß DNA : (1) cDNA (2) DNA hÖ gen vµ (3) çc nucleotit . Còng cã thÓ dïng çc mÉu dß RNA , nÕu cã sù phï hîp . Møc ®é hiÖu qu¶ phô thuéc vµo sù hiÓu biÕt cña chóng ta vÒ tr×nh tù gen ®Ých . NÕu cDNA ®· ®îc x¸c ®Þnh th× cDNA cã thÓ sö dông ®Ó sµng läc th viÖn gen vµ t¸ch chÝnh ®o¹n tr×nh tù gen .Tøc lµ cDNA cã thÓ t¹o ra tõ quÇn thÓ vµ ®em sö dông , kh«ng cÇn t¸ch dßng çc cDNA . Kü thuËt nµy thêng ®îc dïng díi tªn ph¬ng ph¸p sµng läc céng/trõ” . NÕu dßng quan t©m cã chøa mét ®o¹n chØ biÓu hiÖn trong nh÷ng ®iÒu kiÖn x¸c ®Þnh th× mÉu dß ®ã cã thÓ t¹o ra tõ çc quÇn thÓ mRNA cña çc tÕ bµo biÓu hiÖn gen nµy (mÉu dß céng) vµ tõ çc tÕ bµo kh«ng biÓu hiÖngen nµy (mÉu dß trõ) . B»ng çch lai ghÐp çc dßng cã thÓ ®îc x¸c ®Þnh th«ng qua çc kiÓu lai cña chóng víi çc mÉu dß céng vµ trõ . Çc mÉu dß DNA hÖ gen thêng lµ çc ®o¹n cña çc tr×nh tù ®· t¸ch dßng ®îc sö dông nh çc mÉu dã dÞ t¬ng ®ång hoÆc ®Ó x¸c ®Þnh çc dßng kh¸c cã chøa çc phÇn bæ sung cña gen nghiªn cøu . Trong kü thuËt nµy Chromosome walking (NST ®i bé) vµ Chromosome jumping (NST nh¶y) gióp cho viÖc x¸c ®Þnh çc ®o¹n tr×nh tù gèi lªn nhau vµ sau ®ã nÕu nèi çc mÉu l¹i sÏ cã çc m¹ch DNA dµi ®îc x¸c ®Þnh .

136

Cã thÓ dïng çc mÉu dß oligonucleotit khi biÕt tr×nh tù cña mét sè axit amin trong ph©n tö protein ®îc m· bëi gen ®Ých . Dïng m· di truyÒn ®Ó x¸c ®Þnh tr×nh tù gen t¬ng øng vµ t¹o ra oligonucleotit. ¦u ®iÓm næi bËt cña mÉu dß nucleotit lµ chØ cÇn mét ®o¹n tr×nh tù ng¾n lµ mÉu dß ®· rÊt h÷u hiÖu v× vËy çc gen cha t¸ch dßng vÉn cã thÓ x¸c ®Þnh tr×nh tù th«ng qua tr×nh tù cña çc ®o¹n peptit vµ cã thÓ thiÕt kÕ ®îc çc mÉu dß t¬ng øng . Tuy nhiªn do b¶n chÊt tho¸i ho¸ cña m· di truyÒn nªn ta kh«ng thÓ tiªn ®o¸n mét çch hoµn toµn chÝnh x¸c tr×nh tù gen. Nhng ®ã kh«ng ph¶i lµ khã kh¨n lín v× ta cã thÓ sö dông çc mÉu dß hçn hîp bao gåm tÊt c¶ çc tr×nh tù cã thÓ cã . MÉu dß axit nucleic ®ang trë thµnh mét c«ng cô h÷u hiÖu trong nhiÒu lÜnh vùc nghiªn cøu vµ øng dông c«ng nghÖ sinh häc . Mét øng dông thiÕt thùc lµ cho phÐp chÈn ®o¸n çc trêng hîp nhiÔm khuÈn mµ kh«ng ph¸t hiÖn ®îc kh¸ng nguyªn . VÝ dô , ®èi víi çc axit nucleic cña gen g©y bÖnh n»m ngoµi NST hoÆc lo¹i hoµ nhËp , kh«ng ®îc biÓu hiÖn râ qua kiÓu h×nh th× ph¬ng ph¸p lai ph©n tö vÉn cho phÐp chÈn ®o¸n ®îc . MÉu dß ®· vµ ®ang lµ c«ng cô ®¾c lùc trong c«ng nghÖ sinh häc nãi chung vµ trong y sinh häc nãi riªng .

nh÷ng tµi liÖu tham kh¶o chÝnh 1. NguyÔn V¨n C¸ch . Tin-Sinh häc . Nxb . KHKT, HN ,2005. 2. Lª §×nh L¬ng . Nguyªn lý kü thuËt Di truyÒn . Nxb . KHKT, HN , 2001. 3. Phan Cù Nh©n .Di truyÒn häc §éng vËt .Nxb. KHKT, HN, 2001. 4. KhuÊt H÷u Thanh . LiÖu ph¸p gen . Nxb. KHKT , HN , 2005 . 5. Bruce A . Chabner (Editor) ; Dan L . Longo (Editor) . Cancer Chemotherapy and Biotherapy : Principles and Practice . Lippincott Williams Wilkins Publisher , 1996. 6. I.Edward Alcamo . DNA Technology the awasome skill . Wm. C. Brown Publisher. Dubuque , IA Bogota Boston Buenos Aires Caracas Chicago Guilford , CT London Madrid Mexico City Sedney Toronto , 1996. 7. Jackque B. Wallach . Interpretation of Diagnostic Test 7th Edition . Lippincott Williams & Wilkin Publisher , 2000. 8. J. Caroline . Suicide gene therapy . Springer , 2004. *David C. Dale (Editor) . Infectious Diseases : The Clinican’s Guide to Diagnosis , Treatment and Prevention . Webmd Scientific American Medicine by WebMD Professional Publishing , 2003. 9. K Fran , Md . Austen (Editor) ; michael M., Md . frank (Editor) ; Havey I., Md .Canter (Editor) ; John P.,Md . Atkinson (Editor) ; Max Samter (Editor) . Samter’s Immunologic Diseases 6th Edition . Lippincott Williams & Wilkins Publishers , 2001. 10. Robert K . Murray ; Daryl K. Granner ; Peter A. Mayer ; Victor W. Rodwell . Harper’s Illustracted Biochemistry . 137

Lange Medical Book / Mc Graw –Hill . Medical Publisher Division New York Chicago San Francisco London Madrid San Juan Singapore Sedney Toronto , 2003.

Mexico City

Milan New Delhi

11. Gerhard Krauss . Biochemistry of Signal Transduction and Regulation . Second Edition . Wiley –VCH Verlag GmbH, 2001. 12. Robert L. Souhan (Editor) ; Ian Tannock (Editor) ; Petter Hohenberen (Editor) ; JeanClaude Horiot (Editor) . Oxford Textbook of Oncology . Oxford Press , 2002. 13. Lehninger . Principle of Biochemistry . Fourth Edition . 2005. Acrobat_60. 14. Mathews , Van holde , Ahern . Biochemistry. Third Editon . Web site , 2004. 15.Robert M. Watcher (Editor) ; lee Golman (Editor) ; Harry Hollander (Editor) . Hospital Medicine . Lippincott Williams & Wilkin , 2000. 16. Bernard N. Fields ; David M. Knipe ; Teter M. Howley . Fundamental Virology . Lippincott Williams & Wilkin . Philadelphia – Baltimore – New York –London – Boenos Aires – Hong kong – Sydney – Tokyo , 1996. 17. Voet Pratt . Biochemistry . Web site , 2005. 18. Walter R. Wilson ; W. Laurence ; MD Drew ; Nancy K., Phd hery ; Merle A., MD Sande ; David A., Md Relman ; James M.., MD Steckelberg ; Julie Louise ; MD Gerberding . Current Diagnosis & Treatment Infectious Diseases 1th Editon . Mc Graw-hill/ Appleton & Lange , 2001. 19. Prein Seth . Adenovirus : Basic Biology to Gene Therapy . R . G . Lands Company , Austin , Texas USA , 1999 . Mét sè trang Web http://www.nature.com/gt/journal/v12/n14/3302503a.html. http://www.medicalnewstoday.com/medicalnews.php?newid=27707. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. www.ebi.ac.uk/databases. www.nig.ac.jp/section/service.html. www.expassy.org. www.atcc.org. www.dsmz.de

138

139