Luan van thac si cua hien by Nhan

MỤC LỤC MỞ ĐẦU..........................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN...............................................................................3 1.1 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật.........................................................................3 1.1.1 Định nghĩa.............................................................................................................3 1.1.2. Phân loại [9].........................................................................................................3 1.1.3. Tác hại của hóa chất bảo vệ thực vật [9]..............................................................4 1.1.4. Tình hình tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật trong rau quả.....................................5 1.1.5. Tình hình ngộ độc hóa chất bảo vệ thực vật........................................................6 1.2. Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật nhóm carbamat..............................................7 1.2.1. Giới thiệu chung...................................................................................................7 1.2.2. Carbofuran [13]....................................................................................................8 1.2.3. Carbaryl [20]........................................................................................................9 1.2.4. Fenobucarb [21]...................................................................................................9 1.2.5. Propoxur [22].....................................................................................................10 1.2.6. Giới hạn cho phép .............................................................................................11 1.3. Các phương pháp xác định .......................................................................................11 1.3.1. Phương pháp cực phổ.........................................................................................11 1.3.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử...........................................................12 1.3.3. Phương pháp phân tích dòng chảy (flow injection analysis – FIA)...................13 1.3.4. Phương pháp điện di mao quản..........................................................................15 1.3.5. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao............................................................16 1.3.6. Phương pháp sắc ký khí.....................................................................................17 1.3.7. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ....................................................................18

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............20 2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu ...........................................................20 2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu.....................................................................20 2.1.2. Nội dung nghiên cứu..........................................................................................20 2.1.2.1 Xây dựng phương pháp................................................................................20 2.1.2.2. Ứng dụng phương pháp...............................................................................21 2.2. Phương pháp nghiên cứu...........................................................................................21 2.2.1. Phương pháp tách chiết mẫu..............................................................................21 2.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ....................................................................21 2.2.2.1. Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC..................................................21 2.2.2.2. Pha tĩnh trong HPLC...................................................................................22 2.2.2.3. Pha động trong HPLC.................................................................................23 2.2.2.4. Detector trong HPLC..................................................................................24 2.2.2.5 Detector khối phổ (Mass Spectrometry)......................................................24 2.3. Phương tiện nghiên cứu.............................................................................................29 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ.................................................................................................29 2.3.1.1. Thiết bị........................................................................................................29 2.3.1.2. Dụng cụ.......................................................................................................29 2.3.3. Dung môi, hóa chất............................................................................................30

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................32 3.1. Tối ưu các điều kiện xác định carbamat bằng LC/MS/MS.......................................32

3.1.1. Chọn các điều kiện chạy của detector khối phổ.................................................32 3.1.1.1. Khảo sát điều kiện bắn phá đối với ion mẹ.................................................32 3.1.1.2. Khảo sát điều kiện bắn phá ion con ............................................................34 3.1.2. Chọn pha tĩnh.....................................................................................................36 3.1.3. Chọn pha động...................................................................................................36 3.2. Đánh giá phương pháp phân tích..............................................................................39 3.2.1. Khảo sát lập đường chuẩn..................................................................................39 3.2.2. Giới hạn phát hiện LOD [10].............................................................................43 3.2.3. Giới hạn định lượng LOQ [10]..........................................................................44 3.2.4. Độ chính xác của phép đo..................................................................................45 3.3. Khảo sát điều kiện xử lí mẫu.....................................................................................46 3.3.1. Khảo sát dung môi chiết.....................................................................................47 3.3.2. Khảo sát dung môi rửa giải................................................................................49 3.3.3. Khảo sát thể tích dung môi rửa giải...................................................................51 3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp.........................................................52 3.4. Phân tích mẫu thực tế................................................................................................54

Chương 4. KẾT LUẬN.................................................................................60 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................61 PHỤ LỤC.......................................................................................................66

MỞ ĐẦU Theo dự báo của Uỷ ban Dân số và Phát triển của Liên hợp quốc, vào giữa thế kỉ XXI dân số thế giới sẽ tăng thêm 03 tỉ người. Dân số ngày càng tăng nhanh đã tạo ra gánh nặng cho nền sản xuất nông nghiệp lương thực, vì cùng với một diện tích canh tác nhất định và đang có xu hướng bị thu hẹp lại phải cung cấp đủ số lượng lương thực cho số đầu người luôn gia tăng. Để tăng năng suất lao động, người ta đã sử dụng nhiều biện pháp đan xen như: thâm canh tăng vụ, cải tiến giống...; một trong những biện pháp không thể thiếu là sử dụng thuốc bảo vệ thực vật. [9] Thuốc bảo vệ thực vật được coi là một vũ khí có hiệu quả của con người trong việc phòng chống dịch hại, bảo vệ cây trồng. Bên cạnh ưu điểm là bảo vệ năng suất cây trồng, thuốc bảo vệ thực vật còn gây ra nhiều tác tác hại khác như làm ô nhiễm môi trường, gây độc cho người và gia súc, tăng chi phi sản xuất, và nhất là để lại tồn dư trong nông sản gây ảnh hưởng đến chất lượng nông sản và sức khỏe người tiêu dùng. Tác động tiêu cực của thuốc bảo vệ thực vật càng trở nên nghiêm trọng khi con người sử dụng không đúng cách và quá lạm dụng vào thuốc. Hóa chất bảo vệ thực vật có nhiều nhóm hóa chất khác nhau, trong đó có bốn nhóm chính là: lân hữu cơ, clo hữu cơ, carbamat và pyrethroid. Nhóm clo hữu cơ đã bị cấm sử dụng, nhóm pyrethroid vẫn đang được sử dụng nhưng độc tính thấp, ít có khả năng gây nhiễm độc cho người sử dụng. Còn lại 2 nhóm: lân hữu cơ và carbamat đang được dùng rộng rãi trong nông nghiệp , có độc tính cao và là nguyên nhân chính của phần lớn các vụ ngộ độc do ăn rau quả nhiễm hóa chất bảo vệ thực vật ở nước ta hiện nay. Với những lí do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Xác định hóa chất bảo vệ thực vật carbamat trong một số loại rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)”.

Mục tiêu thực hiện đề tài luận văn là: 1. Xây dựng phương pháp xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật carbamat trong rau quả, bao gồm:  Khảo sát các điều kiện tách chiết mẫu và phân tích  Thẩm định phương pháp đã xây dựng 2. Áp dụng phương pháp xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật carbamate để khảo sát một số mẫu rau quả trên địa bàn Hà Nội.

Chương 1. TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật 1.1.1 Định nghĩa Hóa chất bảo vệ thực vật là những hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp hóa học được dùng để phòng và trừ sinh vật gây hại cây trồng và nông sản. Hóa chất bảo vệ thực vật gồm nhiều nhóm khác nhau, gọi theo tên nhóm sinh vật gây hại, như thuốc trừ sâu dùng để trừ sâu hại, thuốc trừ bệnh dùng để trừ bệnh cây… 1.1.2. Phân loại [9] Các loại hóa chất bảo vệ thực vật gồm nhiều loại, chủ yếu gồm 4 nhóm chính: - Nhóm Clo hữu cơ (organnochlorine) là các dẫn xuất clo của một số hợp chất hữu cơ như diphenyletan, cyclodien, benzen, hexan. Nhóm này bao gồm những hợp chất hữu cơ rất bền vững trong môi trường tự nhiên và thời gian bán phân huỷ dài (ví dụ như DDT có thời gian bán phân huỷ là 20 năm, chúng ít bị đào thải và tích luỹ vào cơ thể sinh vật qua chuỗi thức ăn). Đại diện của nhóm này là Aldrin, Dieldrin, DDT, Heptachlo, Lindan, Methoxychlor - Nhóm lân hữu cơ (organophosphorus) đều là các este, là các dẫn xuất hữu cơ của acid photphoric. Nhóm này có thời gian bán phân huỷ ngắn hơn so với nhóm Clo hữu cơ và được sử dụng rộng rãi hơn. Nhóm này tác động vào thần kinh của côn trùng bằng cách ngăn cản sự tạo thành men Cholinestaza làm cho thần kinh hoạt động kém, làm yếu cơ, gây choáng váng và chết. Nhóm này bao gồm một số hợp chất như parathion, malathion, diclovos, clopyrifos… - Nhóm Carbamat là các dẫn xuất hữu cơ của acid cacbamic, gồm những hoá chất ít bền vững hơn trong môi trường tự nhiên, song cũng có độc tính cao đối với người và động vật. Khi sử dụng, chúng tác động trực tiếp vào men Cholinestraza của hệ thần kinh và có cơ chế gây độc giống như nhóm lân hữu cơ. Đại diện cho nhóm này như: carbofuran, carbaryl, carbosulfan, isoprocarb, methomyl…

- Nhóm Pyrethroid là những thuốc trừ sâu có nguồn gốc tự nhiên, là hỗn hợp của các este khác nhau với cấu trúc phức tạp được tách ra từ hoa của những giống cúc nào đó. Đại diện của nhóm này gồm cypermethrin, permethrin, fenvalarate, deltamethrin,… Ngoài ra, còn có một số nhóm khác như: các chất trừ sâu vô cơ (nhóm asen), nhóm thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm, virus (thuốc trừ nấm, trừ vi khuẩn…), nhóm các hợp chất vô cơ (hợp chất của đồng, thủy ngân, …). 1.1.3. Tác hại của hóa chất bảo vệ thực vật [9] Hầu hết hóa chất bảo vệ thực vật đều độc với con người và động vật máu nóng ở các mức độ khác nhau. Theo đặc tính hóa chất bảo vệ thực vật được chia làm hai loại: chất độc cấp tính và chất độc mãn tính. •

Chất độc cấp tính: Mức độ gây độc phụ thuộc vào lượng thuốc xâm

nhập vào cơ thể. Ở dưới liều gây chết, chúng không đủ khả năng gây tử vong, dần dần bị phân giải và bài tiết ra ngoài. Loại này bao gồm các hợp chất Pyrethroid, những hợp chất Phốt pho hữu cơ, Carbamat, thuốc có nguồn gốc sinh vật. •

Chất độc mãn tính: Có khả năng tích luỹ lâu dài trong cơ thể vì chúng

rất bền, khó bị phân giải và bài tiết ra ngoài. Thuốc loại này gồm nhiều hợp chất chứa Clo hữu cơ, chứa Thạch tín (Asen), Chì, Thuỷ ngân; đây là những loại rất nguy hiểm cho sức khoẻ. Hóa chất bảo vệ thực vật có thể thâm nhập vào cơ thể con người và động vật qua nhiều con đường khác nhau; thông thường qua 03 đường chính: hô hấp, tiêu hoá và tiếp xúc trực tiếp. Khi tiếp xúc với hóa chất bảo vệ thực vật, con người có thể bị nhiễm độc cấp tính hoặc mãn tính, tùy thuộc vào phạm vi ảnh hưởng của thuốc. Nhiễm độc cấp tính: Là nhiễm độc tức thời khi một lượng đủ lớn hoá chất bảo vệ thực vật thâm nhập vào cơ thể. Những triệu chứng nhiễm độc tăng tỉ lệ với

việc tiếp xúc và trong một số trường hợp nặng có thể dẫn tới tử vong. Biểu hiện bệnh lý của nhiễm độc cấp tính: mệt mỏi, ngứa da, đau đầu, lợm giọng, buồn nôn, hoa mắt chóng mặt, khô họng, mất ngủ, tăng tiết nước bọt, yếu cơ, chảy nước mắt, sảy thai, nếu nặng có thể gây tử vong. Nhiễm độc mãn tính: Là nhiễm độc gây ra do tích luỹ dần dần trong cơ thể. Thông thường, không có triệu chứng nào xuất hiện ngay trong mỗi lần nhiễm. Sau một thời gian dài, một lượng chất độc lớn tích tụ trong cơ thể sẽ gây ra các triệu chứng lâm sàng. Biểu hiện bệnh lý của nhiễm độc mãn tính: kích thích các tế bào ung thư phát triển, gây đẻ quái thai, dị dạng, suy giảm trí nhớ và khả năng tập trung, suy nhược nghiêm trọng, ảnh hưởng đến hệ thần kinh, gây tổn hại cho gan, thận và não. 1.1.4. Tình hình tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật trong rau quả Theo báo cáo của Cục Bảo vệ thực vật, có 23% số hộ nông dân vi phạm quy định về sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, dẫn đến tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật trên nông sản. Một số loại thuốc trừ sâu độc hại đã bị cấm sử dụng nhưng hiện vẫn có nhiều người tìm cách đưa về nông thôn. Số mẫu rau, quả tươi có dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật chiếm từ 30-60%, trong đó số mẫu rau, quả có dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật vượt quá giới hạn cho phép chiếm từ 4-16%, một số hóa chất bảo vệ thực vật bị cấm sử dụng như Methamidophos vẫn còn dư lượng trong rau. [7] Trong năm 2006, Chi cục bảo vệ thực vật TP Hồ Chí Minh đã kiểm tra 790 mẫu của 52 đơn vị kinh doanh rau an toàn trên địa bàn thành phố, phát hiện 26 mẫu có dư lượng thuốc trừ sâu, chiếm tỷ lệ 3,29%.

Nấm rơm Trà Vinh,

cần tây, cải thìa, xà lách xong, bồ ngót, bông cải xanh (súp lơ), rau dền, cần... là những loại rau ăn lá có tỷ lệ dư lượng thuốc trừ sâu cao (3,94%). Đặc biệt là tình trạng vượt nhiễm thuốc trừ sâu đối với các loại rau củ quả, trái cây nhập khẩu từ Trung Quốc. Kết quả kiểm tra của Chi cục bảo vệ thực vật TP.HCM cho thấy, có 5 trong tổng số 26 mẫu hàng Trung Quốc được kiểm tra có kết quả lượng thuốc trừ sâu tồn dư cao, chiếm tỷ lệ đến 19,23%. [3]

Đầu năm 2009, Cục Bảo vệ thực vật đã lấy 25 mẫu rau và năm mẫu quả tại các tỉnh phía Bắc (TP Hà Nội và tỉnh Vĩnh Phúc) để kiểm định. Kết quả có 11 mẫu rau có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật ở mức độ khác nhau. Ở các tỉnh phía Nam, trên 35 mẫu rau và 5 mẫu quả lấy ở TP Hồ Chí Minh, Bình Dương, Tiền Giang, kết quả trên 50% mẫu có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật ở mức độ khác nhau. [11] Tại TP Hồ Chí Minh, trong sáu tháng đầu năm 2009, qua kiểm nghiệm hơn 2.200 mẫu rau, quả tại ba chợ đầu mối (Bình Điền, Hóc Môn, Thủ Đức), phát hiện 50 mẫu dương tính (tỷ lệ 2,4%), cao hơn so với cùng kỳ năm 2008 là 1,3%. Còn tại Bình Dương, phân tích gần 310 mẫu rau lấy ở các chợ, vùng sản xuất, bếp ăn tập thể trong tám tháng đầu năm 2009 có gần 80 mẫu có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật. [11] Trên thế giới, tại Ấn Độ, Cuộc điều tra được Bộ Nông nghiệp Ấn Độ tiến hành trong một năm từ tháng 11 năm 2007 đến tháng 10 năm 2008 trên toàn đất nước Ấn Độ. Kết quả là 18% rau và 12% hoa quả nội địa và nhập khẩu của Ấn Độ đều có dư lượng thuốc trừ sâu, kể cả những loại thuốc trừ sâu bị cấm, trong đó 4% lượng rau và 2% lượng hoa quả có dư lượng thuốc trừ sâu cao hơn mức cho phép. Khoảng 18% (664 mẫu) trong tổng số 3.648 mẫu rau như mướp tây, cà chua, bắp cải và súp lơ đều có dư lượng thuốc trừ sâu. Các loại rau như bắp cải, súp lơ và cà chua có dư lượng thuốc trừ sâu lớn nhất. Các loại thuốc trừ sâu tìm thấy trong các loại quả chủ yếu là chlorpyriphos, monocrotophos, profenophos và cypermethrin.[1] 1.1.5. Tình hình ngộ độc hóa chất bảo vệ thực vật Theo thống kê của Tổ chức Lao động Quốc tế ILO, trên thế giới, hàng năm có trên 40.000 người chết vì ngộ độc rau trên tổng số 2 triệu người ngộ độc. Tại Việt Nam, con số người bị ngộ độc cũng không nhỏ. Từ năm 1993 - 1998, hàng chục ngàn người bị nhiễm độc do ăn phải rau quả còn dư lượng thuốc trừ sâu. Nặng nhất ở Đồng bằng sông Cửu Long, năm 1995 có 13.000 người nhiễm độc, trong đó có 354 người chết. [8]

Năm 1990, một thống kê quý của Tổ chức y tế thế giới (WHO) cho thấy có khoảng 25 triệu lao động trong ngành nông nghiệp bị nhiễm độc hóa chất bảo vệ thực vật mỗi năm. Cho đến nay, chúng ta vẫn chưa có những con số ước tính trên phạm vi toàn cầu, nhưng hiện có đến 1,3 tỷ lao động trong ngành nông nghiệp và có thể hàng triệu ca nhiễm độc hóa chất bảo vệ thực vật vẫn đang xảy ra hàng năm. [2] Năm 2000, Bộ y tế Braxin ước tính trong một năm nước này có 300.000 ca nhiễm độc và 5.000 ca tử vong do hóa chất bảo vệ thực vật. Trong một nghiên cứu ở Inđônêxia, 21% trong số các ca liên quan đến hóa chất bảo vệ thực vật có những dấu hiệu hay triệu chứng về tâm thần, hô hấp và tiêu hoá. Trong một cuộc khảo sát của Liên hợp quốc, 88% nông dân Campuchia sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật đã từng có triệu chứng nhiễm độc. [2] 1.2. Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật nhóm carbamat 1.2.1. Giới thiệu chung Thuốc trừ sâu carbamat là các dẫn xuất của acid cacbamic có tính độc trừ sâu. Các thuốc carbamat thường không có tính độc vạn năng như thuốc lân hữu cơ. Nhiều hợp chất trong nhóm tuy có hiệu lực cao với sâu hại nhưng không có tác dụng trừ nhện hoặc chỉ có tác dụng trừ một số thuộc nhóm này mà không trừ được nhóm sâu khác. Một số thuốc trong nhóm còn có cả tác dụng trừ tuyến trùng. Về cơ chế tác động của thuốc trừ sâu carbamat tương tự như các thuốc trừ sâu lân hữu cơ. Các thuốc carbamat kìm hãm men cholinesteraza bằng cách cacbaryl hóa các vị trí hoạt động của toàn men. Quá trình cacbaryl hóa cũng là quá trình thuận nghịch. Nhưng sự liên kết giữa các thuốc carbamat với cholinesteraza thường không bền, nên có trường hợp sâu hại phục hồi được. Các thuốc lân hữu cơ chỉ kết hợp với các gốc hoạt động của men, nên các thuốc lân hữu cơ có độ thủy phân càng mạnh, càng dễ gây độc cho côn trùng ; ngược lại các thuốc carbamat chỉ ức chế được men cholinesteraza khi toàn bộ phân tử của chúng gắn được lên bề mặt của men. Các chất carbamat càng bền, càng ức chế men cholinesteraza mạnh. Cả lân hữu cơ và carbamat đều kìm hãm vị trí men tác động, dẫn đến hệ thần kinh

không kiểm soát được, làm mất khả năng phối hợp giữa các cơ quan, giải phóng quá mức hormon, sinh vật mất nước và chết. Các thuốc carbamat an toàn với cây, ít độc đối với cá hơn các thuốc lân hữu cơ; không tồn lưu quá lâu trên nông sản và môi trường sống. Độ độc của thuốc đối với động vật máu nóng rất khác nhau, tùy thuộc vào loại thuốc. Các chất chủ yếu thuộc nhóm bao gồm: carbaryl, methiocarb, pirimicarb, oxamyl, carbendazim, propoxur, aminocarb, aldicarb… 1.2.2. Carbofuran [13] Carbofuran là một trong những thuốc trừ sâu nhóm carbamat độc nhất, có tên là 2,3-dihydro-2,2-dimethyl-7-benzofuranyl methylcarbamate, tên thương mại là Furadan, Curater.

Công thức phân tử: C12H15NO3. M = 221,25g/mol. tnc = 151°C. d = 1,18g/cm3. Carbofuran là một trong những thuốc trừ sâu có độc tính cao đối với con người. Nó có thể xâm nhập vào cơ thể qua hô hấp, qua miệng và qua da. Triệu chứng khi bị ngộ độc carbofuran: buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy, giảm tầm nhìn… Ở liều cao có thể gây tử vong. Chỉ cần uống 1ml carbofuran cũng có thể dẫn tới tử vong. Theo WHO, mức hấp thụ hàng ngày cho phép (ADI) của carbofuran là 0,01mg/kg trọng lượng cơ thể. Liều gây chết trung bình đối với chuột qua miệng là LD50 = 5mg/kg.

1.2.3. Carbaryl [20] Carbaryl có tên là 1-naphthyl methylcarbamate, tên thương mại là Sevin, là một loại thuốc trừ sâu nhóm carbamat. Carbayl là tinh thể màu trắng, tan kém trong nước nhưng tan nhiều trong dung môi phân cực như đimethyl sulfoxide và đimethyl formaldehyde.

Công thức phân tử C12H11NO2. M = 201,2g/mol. ts = 145°C. d = 1,232g/cm3. Carbaryl là một chất ức chế men cholinesteraza và có độc với con người. Nó được xếp vào loại chất gây ung thư đối với con người. Carbaryl là một chất rắn, có màu trắng hoặc xám tùy thuộc vào độ tinh khiết của nó, tinh thể không mùi. Carbaryl là một thuốc trừ sâu có độc tính trung bình. Khi tiếp xúc với carbaryl có thể gây ra ngộ độc cấp và mãn tính với các triệu chứng như: buồn nôn, chuột rút dạ dày, tiêu chảy. Các triệu chứng khác ở liều lượng cao bao gồm đổ mồ hôi, làm mờ của tầm nhìn, và co giật, ảnh hưởng đến phổi, thận và gan. Mức hấp thụ hàng ngày tối đa cho phép ADI của carbaryl là 0,1mg/kg trọng lượng cơ thể. Đối với chuột, liều gây chết trung bình qua miệng LD 50 = 250 – 850mg/kg, liều gây chết trung bình qua hô hấp LC50 = 0,005 – 0,023mg/kg. 1.2.4. Fenobucarb [21] Fenobucarb có tên là 2-(1-Methylpropyl)phenol methylcarbamate, là một loại thuốc trừ sâu nhóm carbamat.

Công thức phân tử: C12H 17NO2 M = 207,3g/mol ts = 32°C d = 1,035g/cm3 Fenobucarb tan kém trong nước, tan tốt trong các dung môi Acetone, Benzene, Toluene, xylene. Fenobucarb được sử dụng làm thuốc trừ sâu trên lúa và bông, rất độc hại đối với con người, nó ảnh hưởng đến hệ thần kinh, bộ phận sinh sản, gây ung thư và ngộ độc cấp tính. Liều gây chết trung bình qua miệng đối với chuột là 410mg/kg. 1.2.5. Propoxur [22] Propoxur có tên theo IUPAC là 2-isopropoxyphenyl methylcarbamate, là một dẫn xuất của carbamat và được sử dụng làm thuốc trừ sâu.

Công thức phân tử: C11H15NO3 M = 209,2g/mol ts = 91°C

Propoxur có độc tính cao đối với ruồi, muỗi, gián và bọ chét. Nó là chất có độc tính cao với con người, nó có thể xâm nhập vào cơ thể qua hô hấp, qua đường miệng và qua da. Triệu chứng ngộ độc propoxur: buồn nôn, đau bụng, ra mồ hôi, tăng huyết áp, mắt mờ, mệt mỏi, khó thở. Propoxur nhiễm độc mãn tính đối với con người gây ung thư, ảnh hưởng đến cơ quan sinh sản và hệ thần kinh trung ương.

Đối với chuột, liều gây chết trung bình qua miệng là 90 – 128mg/kg, qua da là 800 – 1000mg/kg. Theo WHO, mức hấp thụ hàng ngày tối đa cho phép ADI của propoxur là 0,02mg/kg trọng lượng cơ thể 1.2.6. Giới hạn cho phép Dư lượng là phần còn lại của hoạt chất, các sản phẩm chuyển hóa và các thành phần khác có trong thuốc, tồn tại trên cây trồng, nông sản, đất, nước sau một thời gian dưới tác động của hệ sống và điều kiện ngoại cảnh. Dư lượng của thuốc được tính bằng mg thuốc có trong 1kg nông sản, đất hay nước. Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) là giới hạn dư lượng của một loại thuốc, được phép tồn tại về mặt pháp lí hoặc xem như có thể chấp nhận được ở trong hay trên nông sản, thức ăn gia súc mà không gây hại cho người sử dụng và vật nuôi khi ăn các nông sản đó. Bảng 1. Mức dư lượng tối đa cho phép sử dụng thuốc trừ sâu carbamat ở một số quốc gia. [6]

Quốc gia Nhật Bản Việt Nam

Đối tượng

Carbofuran Carbayl Propoxur Fenobucarb (mg/kg)

(mg/kg)

0,3

3,0

1,0

0,3

5,0

3,0

Xoài Táo, nho, lê

(Quyết định 46/2007/QĐ-

Cà chua, cà rôt

0,1

Trái cây

0,1

0,05

BYT) EU

1.3. Các phương pháp xác định 1.3.1. Phương pháp cực phổ

0,05

Trong phương pháp này, người ta phân cực điện cực giọt thủy ngân bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với thời gian để nghiên cứu các quá trình khử cực của chất phân tích trên điện cực đó. Vì vậy, thiết bị cực phổ gồm hai phần chính là máy cực phổ và hệ điện cực bao gồm điện cực giọt thuỷ ngân và điện cực so sánh. Đường cực phổ biểu diễn sự phụ thuộc của chiều cao cường độ dòng với nồng độ chất phân tích. Để xác định các lượng nhỏ chất thường dùng cực phổ cổ điển (10-3 – n.10-5). Để xác định các lượng chất cực nhỏ thường dùng các phương pháp cực phổ hiện đại như cực phổ sóng vuông, cực phổ xung vi phân. [5] A. Guiberteau , T. Galeano Diáz, F. Salinas và J.M. Ortiz [12] đã xác định carbaryl và carbofuran bằng phương pháp cực phổ xung vi phân. Phương pháp được ứng dụng xác định các mẫu nước sông. Các mẫu nước sau khi xử lí sẽ được xác định bằng phương pháp cực phổ xung vi phân với các điều kiện sau: tốc độ quét 20mV/s (bước nhảy thế: 5mV, khoảng thời gian 0,25s), biên độ xung 50mV trong khoảng từ + 0,4V đến + 0,8V. Khoảng tuyến tính của carbaryl từ 5.10 -7

10-4M và

của carbofuran từ 5.10-7 – 5.10-5M với độ lệch chuẩn tương đối tương ứng là 1,62 và 1,86%. 1.3.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử Các tác giả Urmila Tamrakar, Vinay K. Gupta và Ajai K. Pillai [32] đã xác định đồng thời 3 loại thuốc trừ sâu nhóm carbamat bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp dựa trên sự tạo mầu của carbamat với thuốc thử paminoacetanlide. Khoảng nồng độ tuân theo định luật Lambert - Beer của carbaryl, propoxur và carbosulfan tương ứng là 0,04 – 0,36µg/ml, 0,032 – 0,32µg/ml và 0,08 – 0,64µg/ml. Phương pháp đã được áp dụng để phân tích thuốc trừ sâu nhóm carbamat trên các mẫu rau, đất, thức ăn, nước … với hiệu suất thu hồi khoảng 95%. Tác giả L. Alvarez-Rodriguez [26] đã xác định thuốc trừ sâu carbamat như carbaryl, bendiocarb, carbofuran, methiocarb, promecarb và propoxur bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử tại bước sóng 510nm. Các thuốc trừ sâu được thủy phân trong môi trường kiềm nhẹ tạo thành 1-naphtol hoặc phenolate, sau đó nó sẽ

tạo mầu với diazo trimethylanilin có chứa mixen natri dodecyl sunfat. Giới hạn phát hiện của phương pháp trong khoảng 0,2 – 2mg/ml. Phương pháp xác định carbosulfan bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử đã được các tác giả Y.Koteswara Rao, K. Lokanath Swaroop, P.Chiranjeevi, B. Rangamannar [35] đề cập. Carbosulfan được thủy phân trong môi trường kiềm tạo thành hợp chất phenolic và tạo cặp với 2, 4-dimethoxy aniline trong môi trường có chứa chất oxi hóa K2Cr2O7 để tạo thành một hợp chất mang màu cyanogen. Chất cyanogen này được chiết vào chloroform tại pH=3,5 và đo phổ tại bước sóng 430nm. Khoảng nồng độ tuân theo định luật Lambert - Beer của carbosulfan là 0,1 – 1,0ppm. Độ thu hồi của phương pháp trên các mẫu nước uống, gạo và lúa mì đều trên 93%. Tác giả O. Bhargavi và cộng sự [31] đã phát triển một kĩ thuật quang phổ hấp thụ phân tử đơn giản và nhạy xác định carbofuran trong các mẫu nước và mẫu hạt. Carbofuran được thủy phân trong môi trường kiềm và tương tác với muối diazo 4, 4-azo-bis-3, 3’, 5, 5’-tetrabromo aniline tạo thành chất mầu đỏ và xác định tại bước sóng 470nm. Khoảng tuân theo định luật Lambert - Beer của carbofuran là 0,1 – 16,0µg/ml . Các phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử chỉ phân tích được một loại carbamat nào đó hoặc phân tích đồng thời một số carbamat. Hơn nữa, phương pháp có độ nhạy kém. Do đó, hiện nay phương pháp này rất ít được ứng dụng để phân tích carbamat. 1.3.3. Phương pháp phân tích dòng chảy (flow injection analysis – FIA) Phân tích dòng chảy là một kĩ thuật phân tích động, trong đó mẫu phân tích ở dạng lỏng được bơm vào dòng chất mang chuyển động liên tục. Sau đó trong vòng phản ứng chất phân tích sẽ phản ứng với thuốc thử có trong dòng chất mang, hay được bơm trực tiếp vào đầu vòng phản ứng, để tạo ra một sản phẩm có thể phát hiện được theo một tính chất hóa lí nào đó nhờ một loại detector phù hợp. Các tính chất hóa lí đó thường là: sự hấp thụ quang phân tử UV-VIS và nguyên tử, tính chất phát

xạ của nguyên tử, tính chất huỳnh quang, sự thay đổi chiết suất, tính chất điện hóa. Ứng với mỗi tính chất người ta có một loại detector. [4] Tác giả Ana M. García-Campana và cộng sự [23] đã phát triển phương pháp mới để xác định carbaryl trong thực phẩm thực vật và nước tự nhiên bằng kĩ thuật phân tích dòng chảy. Đối với mẫu nước, lọc qua màng lọc 0,45µm rồi tiến hành phân tích. Đối với mẫu quả, tiến hành chiết mẫu bằng etylacetat và làm sạch qua các loại cột chiết pha rắn như nhôm oxit, SAX, C18, silica. Hiệu suất chiết tốt nhất khi sử dụng cột nhôm oxit. Carbayl chỉ phát huỳnh quang khi có của chất oxi hóa KMnO4 trong môi trường kiềm nhẹ. Hệ thống phân tích dòng chảy để xác định carbaryl gồm 3 kênh chứa 3 dung dịch khác nhau: NaOH, luminol và KMnO 4. Tại các điều kiện tối ưu, khoảng tuyến tính carbaryl từ 5 – 100ng/ml và giới hạn phát hiện là 4,9ng/ml. Đây là một phương pháp đơn giản, nhanh và dễ dàng kết hợp với phương pháp sắc ký lỏng để xác định đồng thời một số carbamat. Một phương pháp xác định carbaryl bằng kĩ thuật phân tích dòng chảy sử dụng detector UV – Vis đã được các tác giả Karim D. Khalaf, A. Morales-Rubio và M. de la Guardia [25] nghiên cứu. Mẫu được chiết với xylen và bơm vào hệ thống phân tích dòng chảy. Tại đây, carbaryl sẽ phản ứng với naphtholate và dung dịch paminophenol 50pg/ml trong sự có mặt của dung dịch KIO4 0,004M để tạo thành hợp chất mang màu iodophenol. Chất này được xác định bằng detector UV – Vis tại bước sóng 596nm. Hệ thống phân tích dòng chảy gồm 4 kênh: p-aminophenol, IO 4-, H2O và NaOH. Phương pháp có giới hạn phát hiện 26,5ng/ml với tần suất bơm mẫu 110 lần/giờ. Độ thu hồi carbaryl trên các nền mẫu khác nhau khá cao từ 95 – 102%. Một phương pháp phân tích dòng chảy sử dụng detector huỳnh quang để xác định carbofuran đã được đề cập. Phương pháp dựa trên phản ứng của carbofuran với KMnO4 và luminol trong môi trường kiềm nhẹ sẽ tạ thành hợp chất màu. Carbofuran bị oxi hóa tạo thành anion 3-aminophthalate – dạng kích thích bền và được xác định bằng detector huỳnh quang. Khoảng tuyến tính của carbofuran từ

0,06 – 0,5µg/ml, giới hạn phát hiện 0,02µg/ml. Phương pháp đã ứng dụng thành công xác định dư lượng carbofuran trong mẫu rau diếp.[24] Phương pháp phân tích dòng chảy có ưu điểm là nhanh, thiết bị phân tích dễ kiếm và rẻ tiền. Tuy nhiên, phương pháp không thể xác định đồng thời các chất carbamat. Do vậy, phương pháp cũng ít được ứng dụng để phân tích carbamat. 1.3.4. Phương pháp điện di mao quản Ling Wang và cộng sự [34] đã tách và xác định dư lượng thuốc trừ sâu carbamat bằng phương pháp điện di mao quản đẳng áp. Cột mao quản có đường kính 75µm được nhồi hạt ODS 3µm. Pha động bao gồm 30% acetonitril và 70% dung dịch đệm

CH3COONH4 5mM (pH=6,5) chứa 1mM SDS và 0,01%

trietylamine (TEA). Tại các điều kiện tối ưu, 10 carbamat đã được tách nhanh trong vòng 20 phút. Các mẫu rau được làm sạch qua SPE. Phương pháp có giới hạn phát hiện từ 0,05 – 1,6mg/kg và hiệu suất thu hồi từ 51,3 – 109,2% với độ lệch chuẩn RSD < 11,4%. Phương pháp đã được áp dụng để xác định 10 loại carbamat trong một số loại rau. Xác định dư lượng fenoxycarb trong lúa mì bằng phương pháp điện di mao quản khô và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Các mẫu bột mì được chiết với aceton rồi được làm sạch bằng cách chiết lỏng-lỏng với diclometan. Phương pháp HPLC sử dụng detector UV tại bước sóng λ = 199nm, cột C18 và pha động là MeOH : H2O = 6 : 4 (theo thể tích). Phương pháp điện di sử dụng mao quản đường kính 50µm x 48,5cm x 48cm chiều dài hiệu dụng, thế giữa hai đầu là 30kV, dung dịch đêm CH3COONH4 20mM (pH=9) trong 95% MeOH. Cả hai phương pháp đều có giới han phát hiện thấp 0,008mg/kg đối với HPLC và 0,024mg/kg đối với điện di mao quản khô và hiệu suất thu hồi cao trên 85%. Hai phương pháp đã được ứng dụng để xác định fenoxycarb trong các mẫu lúa mì.[28] Phương pháp sắc ký mao quản điện động học mixen đã xác định đồng thời aldicarb, carbofuran và một số dạng chuyển hóa của nó trong nước bề mặt. Các mẫu được được làm sạch qua cột chiết pha rắn có chứa 500mg than hoạt tính. Các chất

được tách bằng hệ thống sắc ký mao quản điện động học mixen sử dụng cột mao quản có đường kính 75µm, chiều dài hiệu dụng của cột 50cm. Các chất được tách trong môi trường đệm natri borat/acid clohidric (20mM, pH=8) và sử dụng natri dodecyl sunfat 140mM làm chất hoạt động bề mặt để tạo ra các mixen. Các điều kiện chạy máy: điện thế tách 23kV, thời gian bơm mẫu 12s, nhiệt độ cột tách 25 °C và detector UV tại bước sóng 210nm. Phương pháp có giới hạn phát hiện từ 2 – 7,4µg/l, độ thu hồi cao từ 77 – 97% với độ lệch chuẩn tương đối 2 – 7%.[15] Kĩ thuật điện di mao quản là một kĩ thuật mới được phát triển khoảng hơn 10 năm trở lại đây. Đây là một kĩ thuật có thời gian phân tích nhanh, tốn ít dung môi và hóa chất. Việc xác định các hóa chất bảo vệ thực vật bằng thiết bị này vẫn đang được nghiên cứu và chưa có nhiều loại thuốc trừ sâu được xác định bằng phương pháp này. 1.3.5. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Tác giả Elvira Grou và cộng sự [16] đã xác định thuốc bảo vệ thực vật carbamat trong đất và nước bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV ở bước sóng 254nm. Các mẫu nước được chiết lỏng lỏng với diclometan, các mẫu đất được làm sạch bằng cột florisil. Dịch chiết được đem cô quay đến cạn, hòa cặn bằng 1ml metanol và đem đo. Giới hạn phát hiện của phương pháp đối với mẫu nước từ 0,005 – 0,01µg/g, đối với mẫu đất từ 0,05 – 0,1µg/g. Tác giả Feng Tang và cộng sự [17] đã xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm carbamat trong sau bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC tại 2 bước sóng λ = 243nm và λ = 207nm. Phương pháp có hiệu suất thu hồi từ 70,13 – 103,7% tại nồng độ 1 – 5mg/kg Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detetor huỳnh quang xác định đồng thời các chất carbamat như aldicarb, propoxur, carbofuran, carbaryl và methiocarb trong mật. Mẫu được chiết bằng methanol và cho qua cột florisil để làm sạch. Sử dụng dung môi diclometan:hexan = 1:1 rửa giải các chất carbamat ra khỏi cột. Dịch rửa giải đem cô quay ở 40°C đến cạn và hòa cặn bằng 1ml acetonitril. Các

chất carbamat được tách và xác định đồng thời bằng hệ thống sắc ký lỏng với detector huỳnh quang ghép nối với tiền cột. Phương pháp có giới hạn phát hiện thấp từ 4 – 5ng/g và độ thu hồi tương đối cao từ 72,02 – 92,02% ứng với nồng độ từ 50 – 200ng/g.[18] Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp thông dụng để xác định các hợp chất hữu cơ. Phương pháp này đã được ứng dụng để xác định đồng thời các chất carbamat. Tuy nhiên, phương pháp có độ nhạy kém khi sử dụng detector UV, còn khi sử dụng detector huỳnh quang, phương pháp có độ nhạy tốt hơn nhưng chỉ có thể nhận biết chất phân tích thông qua thời gian lưu. Đối với những nền mẫu phức tạp, các chất phân tích rất dễ bị ảnh hưởng bởi nền mẫu, nếu chỉ dựa vào thời gian lưu sẽ rất khó để có thể khẳng định chất cần phân tích. 1.3.6. Phương pháp sắc ký khí Xác định ethylcarbamat trong đồ uống bằng phương pháp sắc ký khí với detector bắt điện tử và sắc ký khí khối phổ. Các mẫu được pha loãng bằng ethanol 10% rồi được chiết bằng diclometan. Dịch chiết được đem cô đến gần cạn và đem đo. Phương pháp này đã được đánh giá ở 5 phòng thí nghiệm với 4 phòng sử dụng detector ECD và 1 phòng sử dụng detector MS. Giới hạn phát hiện của phương pháp thấp, khoảng 5µg/kg đối với detector ECD và 0,5µg/kg đối với detector MS. [14] Xác định thuốc trừ sâu carbamat và nhóm nito hữu cơ trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ. Phương pháp đã xác định đồng thời 29 loại thuốc trừ sâu trong một số thực phẩm như táo, khoai tây, gạo, chuối… Mẫu được chiết bằng aceton và được làm sạch bằng 3 loại cột chiết pha rắn khác nhau: cột diatomaceous, cột diatomit kết hợp với cột C18, cột florisil. Hiệu suất chiết các mẫu thực phẩm bằng 3 loại cột đều trên 80%. Sau đó, mẫu được xác định bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ. Chương trình chạy khối phổ được chia làm 7 cửa sổ thời gian lưu và mỗi cửa sổ có từ 10 – 15 mảnh ion con. Giới hạn phát hiện của phương pháp thấp từ 0,01 – 0,1µg/ml. [27]

Xác định đa dư lượng thuốc trừ sâu trong nước táo bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ. Mẫu nước táo được chiết bằng phương pháp khuếch tán trên nền pha rắn diatomaceous (tảo cát) và rửa giải bằng dung môi hexan:diclometan = 1:1 tốc độ 5ml/phút. Phương pháp có độ thu hồi 70 – 110% và hệ số biến thiên từ 1,62 – 18,3% với khoảng nồng độ 0,01 – 0,2mg/kg. [33] Phương pháp sắc ký khí đã được ứng dụng rộng rãi để xác định các hóa chất bảo vệ thực vật như các chất clo hữu cơ, lân hữu cơ, pyrethroid và carbamat. Tuy nhiên phương pháp chỉ phân tích được những chất dễ bay hơi, còn các chất khó bay hơi thì phải tạo dẫn xuất nên tốn thời gian và hóa chất. Hơn nữa, để phân tích được đồng thời các chất thì cần thời gian phân tích dài. Do vậy, phương pháp ít được ứng dụng để phân tích carbamat. 1.3.7. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Gianni Sagratini và cộng sự [19] đã xác định dư lượng thuốc trừ sâu carbamat và phenylure trong một số loại quả bằng phương pháp vi chiết pha rắn và sắc ký lỏng khối phổ. Điều kiện chiết mẫu tối ưu ở nhiệt độ 20°C, thời gian hấp phụ mẫu là 90 phút và thể tích mẫu 1ml. Các sợi silica được phủ 3 loại chất hấp phụ: cacbowax 50µm, polydimetylsiloxan/divinylbenzen (PDMS/DVB) 60µm và polyacrylat 85µm. Giới hạn định lượng của phương pháp từ 0,005 – 0,05µg/ml, tùy thuộc từng chất. Phương pháp đã được ứng dụng để xác định thuốc trừ sâu trong các mẫu quả. Xác định đồng thời hóa chất bảo vệ thực vật nhóm carbamat và lân hữu cơ trong rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Mẫu được chiết bằng acetonitril, sau đó được tách bằng cách chiết pha rắn khuếch tán (dispersive – SPE) với chất hấp phụ là primary secondary amine (amin bậc một hai). Hiệu suất thu hồi cao, từ 70 – 110% với RSD < 8%. Giới hạn phát hiện thấp 0,5 – 10ng/ml, túy thuộc từng chất. Phương pháp đã được ứng dụng để xác định thuốc trừ sâu trong rau quả. Trong 25 mẫu rau quả được lấy từ các chợ, gần 70% mẫu chứa một hoặc vài

loại thuốc trừ sâu, trên 30% mẫu còn lại chứa nhiều loại thuốc trừ sâu. Tuy nhiên, tất cả các nồng độ thuốc trừ sâu tìm thấy đếu thấp hơn giới hạn cho phép.[29] Xác định dư lượng carbamat trong rau quả bằng phương pháp khuếch tán trên nền pha rắn và sắc ký lỏng khối phổ. Mẫu được chiết trên nền các pha rắn khác nhau: C8, C18, NH2, CN và phenyl. Hiệu suất chiết tốt nhất trên nền pha rắn C 8 đạt từ 64 – 106% với RSD 5 – 15%. Giới hạn phát hiện của phương pháp từ 0,001 – 0,01mg/kg, thấp hơn giới hạn cho phép của châu Âu từ 10 – 100 lần. Phương pháp được ứng dụng để xác định carbamat trong các mẫu rau quả tại các chợ ở Valencian.[30] Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ là một kĩ thuật mới được phát triển trong những năm gần đây. Về cơ bản, nó là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ. Phương pháp này tuy mới ra đời nhưng nó được ứng dụng rộng rãi để phân tích đồng thời các thuốc trừ sâu đặc biệt là nhóm carbamat. Phương pháp có thể phân tích đồng thời từ hàng chục đến hàng trăm các loại thuốc trừ sâu khác nhau. Phương pháp có nhiều ưu điểm như độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp sắc kí lỏng thường không làm được. Với những ưu điểm trên, chúng tôi đã chọn phương pháp sắc kí lỏng khối phổ để nghiên cứu xác định đồng thời các chất carbamat.

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu Hiện nay, nhiều người nông dân đã lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật làm cho dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong nhiều mẫu rau vượt giới hạn cho phép hàng chục lần; nhất là các loại rau ăn lá như cải ngọt, mồng tơi, cải bẹ xanh, cải bắp, cải thảo, rau muống, dưa leo…Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong các loại rau quả quá cao đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường và sức khỏe con người, là nguyên nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm. Do đó, đối tượng nghiên cứu là một số loại rau như rau cải, rau thơm, rau rền, bắp cải, và một số loại quả như cam, lê, táo, quýt… Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời các chất carbamat trong rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối-phổ khối phổ LC/MS/MS. 2.1.2. Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu đề ra, cần nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề sau: 2.1.2.1 Xây dựng phương pháp  Khảo sát phương pháp bao gồm:  Điều kiện tách chiết mẫu  Điều kiện chạy máy  Thẩm định phương pháp:  Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ  Khoảng tuyến tính  Độ chụm (độ lặp lại)  Độ đúng (độ chệch, độ thu hồi)

2.1.2.2. Ứng dụng phương pháp Áp dụng phương pháp mới xây dựng để xác định tồn dư thuốc bảo vệ thực vật họ carbamat trong một số loại rau và quả trên địa bàn Hà Nội. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp tách chiết mẫu Đối tượng mẫu phân tích trong luận văn này là các loại rau củ, có nền mẫu phức tạp. Do đó cần có phương pháp tách chiết mẫu thích hợp để giảm ảnh hưởng của nền mẫu, tránh làm bẩn detector, tăng khả năng phát hiện. Trong bản luận văn này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp chiết lỏng lỏng để tách chiết và làm giàu mẫu. Thông thường, phương pháp này sử dụng hai pha lỏng không trộn lẫn. Tuy nhiên, chúng tôi sử dụng một loại hạt nhồi là kieselguhr như chất mang trong sắc ký phân bố lỏng – lỏng. Kieselguhr hay còn gọi là diatomaecous earth (đất diatomit) hay Celite, có màu trắng ngà, có khoảng pH làm việc rộng từ 1 – 13. Nó được sử dụng để chiết lỏng – lỏng các mẫu thực phẩm mà không cần dùng đến phễu chiết. Mẫu sau khi chiết bằng dung môi phân cực ở dạng lỏng được đưa qua cột đã nhồi hạt kieselguhr và được giữ lại ở trên cột. Sau đó chất phân tích được rửa giải bằng dung môi không phân cực. Sử dụng cột nhồi hạt kieselguhr có ưu điểm hơn so với chiết lỏng – lỏng thông thường như thời gian chiết nhanh hơn, không cần phải mất thời gian để tách lớp, lượng dung môi sử dụng rửa giải ít hơn nhiều, có độ thu hồi và độ lặp lại cao. 2.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 2.2.2.1. Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc

phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. Sơ đồ cấu tạo thiết bị HPLC được chỉ ra ở hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có tính đặc thù riêng, đó là sắc ký lỏng pha liên kết, sắc ký phân bố lỏng – lỏng và sắc ký trao đổi lỏng – rắn, sắc ký hấp phụ lỏng – rắn… 2.2.2.2. Pha tĩnh trong HPLC Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7mm. Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha ngược (RP-HPLC) • Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN...), pha động là các dung môi hữu

cơ không phân cực như: n-hexan, toluene....Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực. • Sắc ký pha ngược: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C 18H37, còn pha động phân cực: nước, methanol, axetonitril....Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế. Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực . 2.2.2.3. Pha động trong HPLC Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt nhưng nhìn chung phải đáp ứng được các điều kiện sau: • Pha động phải trơ với pha tĩnh. • Pha động phải hòa tan tốt mẫu phân tích, phải bền vững và không bị phân hủy trong quá trình chạy sắc ký. • Pha động phải có độ tinh khiết cao. • Pha động phải nhanh đạt được các cân bằng trong quá trình sắc ký, như cân bằng hấp phụ, phân bố, trao đổi ion tuỳ theo bản chất của từng loại sắc ký. • Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích. • Pha động phải không quá đắt. Có thể chia pha động làm hai loại:  Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực như MeOH, ACN. Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha liên kết ngược.

 Pha động có độ phân cực thấp: bao gồm các dung môi ít phân cực như xyclopentan,

n-pentan,

n-heptan,

n-hexan,

2-chloropropan,

cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, CCl4, toluene....Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ. 2.2.2.4. Detector trong HPLC Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Tuỳ thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp.  Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS).  Detector huỳnh quang RF: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang. Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần phải dẫn xuất hoá chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.  Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: các ion kim loại chuyển tiếp.... Hiện nay, các detector hiện đại ngày càng được cải tiến như diot-aray, mass spectrometry, nó giúp người phân tích xác định chính xác chất phân tích. Ngoài ra do kĩ thuật tin học phát triển, người phân tích có thể thực hiện phép tách theo chương trình định sẵn, có thể thực hiện các phép tách tự động nhiều mẫu phân tích. 2.2.2.5 Detector khối phổ (Mass Spectrometry) Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng

và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa,... Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất. Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và detector. Trước hết, các mẫu được ion hóa trong nguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ. 2.2.2.5.1. Nguồn ion Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử. Một số kĩ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric-pressure chemical ionization – APCI), ion hóa bắn phá nguyên tử nhanh (fast-atom bombardment – FAB). Dưới đây là hai phương pháp ion hóa được sử dụng trên thiết bị Finnigan LCQDUO: a) Ion hóa phun điện tử – ESI Kĩ thuật này chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí. Dung dịch mẫu được dẫn vào vùng có trường điện từ mạnh được duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV. Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và được hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân tích khối phổ. Các giọt nhỏ trước khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ được kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi. Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm.

Hình 2.2. Kĩ thuật ESI bắn phá với chế độ ion dương Đây là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao. Kĩ thuật này ứng dụng phân tích các chất không phân cực như: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit, polyetilen glycocol,... và các chất phân cực có khối lượng phân tử nhỏ. b) Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển – APCI Đây cũng là một kĩ thuật ion hóa mềm. APCI được sử dụng để phân tích các chất có khối lượng phân tử trung bình. Kĩ thuật này có thể bắn phá ở 2 chế độ: ion âm và ion dương.

Hình 2.3. Kĩ thuật APCI bắn phá với chế độ ion dương

Chất phân tích và dung môi ở dạng lỏng được chuyển thành các giọt nhỏ rồi hóa hơi ở nhiệt độ cao khoảng 500°C. Một điện thế cao từ 3 – 5kV tạo ra các electrron và ion hóa chất phân tích. Đối với kĩ thuật APCI bắn phá với chế độ ion dương, sự ion hóa mẫu được thực hiện qua 3 giai đoạn:  Giai đoạn thứ nhất: e − + N 2 → N 2+. + 2e −

 Giai đoạn thứ hai: N 2+. + H 2O → N 2 + H 2O +. H 2O +. + H 2O → H 3O + + HO .

 Giai đoạn thứ ba: H 3O + + M → ( M + H ) + + H 2 O

APCI là một kĩ thuật ion hóa mạnh, nó không bị ảnh hưởng khi thay đổi đệm chạy và nồng độ đệm. Nó được sử dụng để ion hóa các chất có khối lượng phân tử nhỏ (có khối lượng phân tử < 2000u). 2.2.2.5.2. Bộ phận phân tích khối lượng a) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser) Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua. Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực được đóng vai trò như một bộ lọc khối. Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trường RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ lọc này. b) Bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser) Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dưới. Trái với

lại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đường cong ổn định được bẫy lại cho đến khi một điện áp RF được đặt trên điện cực vòng. Các ion khác nhau m/z sau đó trở nên không ổn định và sẽ có hướng đi về phía detector. Do điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu được một phổ khối lượng đầy đủ. Các ion tồn tại trong bẫy có thể được chọn riêng và phân tích theo sự khác nhau về m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu được các mảnh ion con, từ đó thực hiện phân tích theo m/z của ion con (khối phổ 2 lần). Về nguyên tắc các ion có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu có thể thực hiện đến MS n lần, tuy nhiên trong thực tế thường chỉ có khả năng thực hiện đến khối phổ 3 lần. c) Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser) Phân tích thời gian bay dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năng lượng. Do các ion có cùng năng lượng nhưng lại khác nhau về khối lượng nên thời gian đi tới detector sẽ khác nhau. Các ion nhỏ hơn sẽ đi tới detector nhanh hơn do có vận tốc lớn hơn còn các ion lớn hơn sẽ đi chậm hơn, do vậy, thiết bị này được gọi là thiết bị phân tích thời gian bay do tỉ số m/z được xác định bởi thời gian bay của các ion. Thời gian bay của một ion tới detector phụ thuộc vào khối lượng, điện tích và năng lượng động học của các ion. Độ phân giải của bộ phân tích thời gian bay thấp nhưng nó có ưu điểm là khối lượng ion có thể phân tích không bị hạn chế. 2.2.2.5.3. Bộ phận phát hiện Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang. Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron. Các electron

thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron. Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng các electron. Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phôtpho và giải phóng ra các photon. Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron. Ưu điểm của phương pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn. 2.3. Phương tiện nghiên cứu 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ 2.3.1.1. Thiết bị  Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS của Thermo bao gồm: bộ phận bơm dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt và detector MS.  Cột sắc ký C18 của Water (150mm × 4,6mm × 5μm).  Máy lắc vortex.  Máy đồng nhất mẫu.  Máy li tâm MIKRO 22R.  Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg).  Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g).  Máy cất quay chân không Eyela. 2.3.1.2. Dụng cụ • Pipet: 1, 2, 5, 10, 20ml. • Bình định mức: 5, 10, 50, 100ml. • Ống li tâm 50ml

• Cột nhồi kieselguhr. • Bình cô quay 100ml • Vial loại 1,8ml. • Pipet pasteur. • Ống đong, phễu, giấy lọc. • Pietman loại 200µl và đầu côn. 2.3.3. Dung môi, hóa chất Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết. o Chuẩn carbamat gồm: carbofuran, propoxur, carbaryl, fenobucarb. o Methanol. o n-hexan. o Diclometan. o Amoniacetat CH3COONH4. o NaCl. o Nước cất 2 lần. * Chuẩn bị dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn gốc 1000mg/l: Cân chính xác 0,1g chất chuẩn lần lượt của từng carbamat, hoà tan cho vào từng bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol. Chuẩn gốc được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 – 5°C. - Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 10mg/l: lấy chính xác 1ml dung dịch chuẩn gốc của mỗi carbamat 1000 mg/l cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 200µg/l: lấy chính xác 0,2ml dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 10mg/l cho vào bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng methanol. * Chuẩn bị dung môi pha động - Kênh A: dung dịch acid focmic 0,1% trong nước: lấy chính xác 1ml acid focmic vào bình định mức 1000ml và định mức đến vạch bằng nước cất. - Kênh B: methanol.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tối ưu các điều kiện xác định carbamat bằng LC/MS/MS 3.1.1. Chọn các điều kiện chạy của detector khối phổ 3.1.1.1. Khảo sát điều kiện bắn phá đối với ion mẹ Các chất carbamat có khối lượng phân tử nhỏ và kém phân cực. Qua tham khảo một số bài báo, chúng tôi khảo sát tiến hành xác định carbamat bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn ion dương. Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ, dùng xyranh 500µl bơm từng chuẩn carbamat 1000ppb vào detector để khảo sát. Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất carbamat, tối ưu hóa từng ion mẹ, ta được điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI Tốc độ khí phun = 80 (arb) Tốc độ khí bổ trợ = 10 (arb) Thế phun điện tử = 4kV Nhiệt độ mao quản = 270 °C Trong kĩ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn ion dương, các ion mẹ thường ở dạng (M+1). Tiến hành khảo sát bắn phá các ion mẹ, kết quả như sau: Bảng 3.2. Kết quả bắn phá các ion mẹ Carbamat

Khối lượng phân tử M

Ion mẹ

Carbofuran

221,3

221,98

Propoxur

209,3

210

Carbaryl

201,2

201,84

Fenobucarb

207,3

208,00

ks carbaryl #900 RT: 11.92 AV: 1 T: + c ESI Full ms [ 110.00-210.00]

NL: 4.60E6 201.84

100

Phổ khối ion carbaryl

Relative Abundance

90 80 70 60 50 40 30

114.95

20 145.22

202.90

168.07 124.88

0 110

120

146.13

136.24 130

140

154.95

150

173.15

167.18

160 m/z

170

179.22

196.18

190.07

180

190

203.83

200

210

Hình 3.1. Phổ khối ion mẹ của carbaryl ks carbofuran #761 RT: 10.17 AV: 1 F: + c ESI Full ms [ 150.00-230.00]

NL: 2.98E7 221.98

100 Phổ khối ion carbofuran

Relative Abundance

90 80 70 60 50 40 30 20 222.97

10 0 150

154.97

165.26 162.00 160

168.23 173.32 170

185.14

190.06

180

196.44 199.35

190 m/z

210.51

200

223.94

220.56

213.99

210

220

230

Hình 3.2. Phổ khối ion mẹ của carbofuran ks fenobucarb #665 RT: 10.86 AV: 1 T: + c ESI Full ms [ 110.00-220.00]

NL: 3.42E6 208.00

100 Phổ khối ion fenobucarb

Relative Abundance

90 80 70 60 50 40 30 20 10

209.07 114.24

0 110

118.98 120

130.39 130

144.39 140

152.12 150

168.22

158.23 160

170

175.26 180

185.22

196.42 190

m/z

Hình 3.3. Phổ khối ion mẹ của fenobucarb

205.01

200

210.00 210

220

ks propoxur #473 RT: 9.18 AV: 1 T: + c ESI Full ms [ 110.00-230.00]

NL: 3.26E7 209.90

100 Phổ khối ion propoxur

Relative Abundance

90 80 70 60 50 40 30 20

226.57

210.92

10 111.16 0 110

125.09 120

130.58

130

144.18 140

168.17

153.15 150

160

170 m/z

180.28

185.31

180

190

196.23 200

208.36

211.93

210

220

230

Hình 3.4. Phổ khối ion mẹ của propoxur 3.1.1.2. Khảo sát điều kiện bắn phá ion con Detector được sử dụng trong nghiên cứu này là khối phổ hai lần, do đó để phát hiện đúng chất phân tích thì việc chọn được ion con là rất quan trọng. Ion con phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ. Để thu được mảnh ion con có tín hiệu cao thì cần phải chọn được mức năng lượng bắn phá thích hợp. Dùng xyranh 500µl bơm từng chuẩn vào detector và để máy tự động tối ưu hóa mức năng lượng bắn phá ion mẹ để tạo các ion con. Kết quả thu được ở bảng 3.2. Bảng 3.3. Năng lượng bắn phá và các ion con của carbamat Năng lượng bắn phá

Carbamat

Ion mẹ

Carbofuran

222

165

Propoxur

210

168, 153

Carbaryl

202

145

Fenobucarb

208

152

Collision Energy (%)

Ion con

Carbofuran #954 RT: 13.85 AV: 1 NL: 4.38E5 F: + c ESI Full ms2 222.00@48.00 [ 60.00-230.00] 164.90

100

Phổ khối ion con của Carbofuran

Relative Abundance

90 80 70 60 50 40 30 20 10 70.69

84.38

0 60

98.52

113.06

100

123.21

133.29

120

149.33

140

182.94 191.31 200.32 210.77

161.09 160

180

200

226.40

220

m/z

Hình 3.5. Phổ khối ion con của Carbofuran sau khi bắn phá Fenobucarb #857 RT: 14.57 AV: 1 NL: 1.39E5 F: + c ESI Full ms2 208.00@37.00 [ 55.00-230.00] 100

151.84

Phổ khối ion con của Fenobucarb

Relative Abundance

80 70 60 50 40 30 20 10 60.38 72.81

85.61 81.85

150.67

94.94

148.35 105.24

119.13 130.65

164.29

172.07

192.40

204.72 216.41

229.31

0 60

100

120

140 m/z

160

180

200

220

Hình 3.6. Phổ khối ion con của Fenobucarb sau khi bắn phá Propoxur #689 RT: 13.75 AV: 1 NL: 4.85E4 F: + c ESI Full ms2 210.00@45.00 [ 55.00-230.00] 167.84

100 Phổ khối ion con của Propoxur

Relative Abundance

90 80 70 60 152.78

50 40 30 20

69.75

123.42

84.37

74.65

99.91

110.84

150.89

196.64

154.66 164.70

177.28

192.63

204.25 219.16

0 60

100

120

140 m/z

160

180

200

Hình 3.7. Phổ khối ion con của Propoxur sau khi bắn phá

220

228.11

Carbaryl #1002 RT: 14.24 AV: 1 NL: 5.87E4 F: + c ESI Full ms2 202.00@45.00 [ 55.00-230.00] 144.95

100

Phổ khối ion con của Carbaryl

Relative Abundance

90 80 70 60 50 40 30 20 57.90 10

102.44 66.05

76.00

92.05

189.65 118.97

140.14

151.43

166.56

176.10

198.68

218.86

0 60

100

120

140 m/z

160

180

200

220

Hình 3.8. Phổ khối ion con của Carbaryl sau khi bắn phá 3.1.2. Chọn pha tĩnh Cột tách là trái tim của hệ sắc ký, nó đóng góp một phần quan trọng trong việc quyết định quá trình tách. Các chất nhóm carbamat là các chất kém phân cực, do đó cột tách được sử dụng là cột pha đảo. Hơn nữa, chất nhồi pha đảo sử dụng hệ dung môi phân cực có tính kinh tế cao, phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn cột pha đảo C18 để tách các chất carbamat. Để bảo vệ cột, chúng tôi sử dụng thêm tiền cột. Thông số cột tách và tiền cột:  Cột Symestry Shield C18 của Water (150mm x 4,6mm x 5mm).  Tiền cột Symestry C18 của Water (20 mm x 3,9 mm x 5mm). 3.1.3. Chọn pha động Trong phương pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hưởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hưởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion dương, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất như acid acetic, acid focmic. Dùng dung dịch chuẩn hỗn hợp carbamat 1000ppb để khảo sát thành phần pha động khi có thêm chất trên, các điều kiện chạy máy được cố định như sau: -

Cột Symestry Shield Water C18 và tiền cột.

Detector: khối phổ.

Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.

Pha động: kênh B là methanol, kênh A lần lượt là acid focmic 0,1%, acid acetic 0,1%, CH3COONH4 0,1% trong nước. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thành phần pha động

Diện tích pic St Carbamat Acid focmic 0,1%

Acid acetic 0,1%

CH3COONH4 0,1%

Carbofuran

88164531

62596017

52548096

Propoxur

8023138

7095289

5289116

Carbaryl

8972544

4205380

3950325

Fenobucarb

5076448

2191283

2239988

Nhận xét: Sử dụng pha động là acid focmic 0,1% cho diện tích pic cao nhất, tăng độ nhạy của phương pháp. Do đó, chúng tôi chọn pha động là methanol và dung dịch acid focmic 0,1% trong nước cho các khảo sát tiếp theo. Trong phương pháp nghiên cứu, pha tĩnh sử dụng là cột C18, ít phân cực nên pha động phải là hệ dung môi phân cực. Chất tan ít phân cực sẽ bị lưu giữ trong cột lâu hơn chất tan phân cực. Do tính chất kém phân cực của các chất nhóm carbamat nên chúng tôi chọn pha động trên 2 kênh: o Kênh A: dung dịch acid focmic 0,1% trong nước. o Kênh B: dung môi methanol.

Chọn dung dịch chuẩn hỗn hợp 4 chất nhóm carbamat 1000ppb để khảo sát tỉ lệ dung môi, cố định các điều kiện: -

Cột Symestry Shield Water C18 (150mm x 4,6mm x 5mm).

Cột bảo vệ: Symestry Water C18 (20 mm x 3,9 mm x 5mm).

Detector: MS/MS.

Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.

Thời gian chạy: 30 phút.

Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi pha động được chỉ ra ở bảng dưới đây. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi pha động tới thời gian lưu. Tỉ lệ pha động

Thời gian lưu (phút)

Carbofuran

Propoxur

Carbaryl

Fenobucarb

3,83

3,78

4,12

4,34

4,36

4,30

4,91

5,52

5,29

5,23

6,43

8,29

7,19

7,27

9,78

15,53

11,48

11,49

17,82

Không thấy

Nhận xét: Từ bảng kết quả trên ta thấy, khi để thành phần pha động chạy với chế độ đẳng dòng isocractic, tỉ lệ methanol càng cao, thời gian lưu càng giảm, các chất không tách ra khỏi nhau. Hơn nữa, khi chất phân tích ra quá sớm, rất dễ bị ảnh hưởng bởi các tạp chất. Ngược lại, khi lượng methanol càng giảm thì thời gian lưu tăng, các chất tách ra khỏi nhau nhưng thời gian chết giữa các chất cũng tăng theo, làm tăng thời gian phân tích và tốn dung môi. Do đó, để có thể vừa tách được các chất, vừa tiết kiệm được thời gian phân tích và dung môi, chúng tôi tiến hành chạy pha động với chế độ gradient.

Bảng 3.6. Chương trình chạy gradient rửa giải các chất carbamat Thời gian (phút)

Tốc độ dòng (ml/phút)

HCOOH 0,1 %

MeOH

0,5

1,0

0,5

6,0

0,5

12,0

0,5

100

13,0

0,5

100

15,0

0,5

18,0

0,5

Tóm lại, các thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký như sau:  Cột Symestry C18 của Water (150mm x 4,6mm x 5mm).  Tiền cột Symestry C18 của Water (20 mm x 3,9 mm x 5mm).  Thành phần pha động: Kênh A là dung dịch acid focmic 0,1% trong nước, kênh B là dung môi MeOH.  Chương trình chạy gradient ở bảng 3.6.  Tốc độ dòng 0,5ml/phút.  Detector MS/MS với các thông số ở bảng 3.1 và 3.3. 3.2. Đánh giá phương pháp phân tích 3.2.1. Khảo sát lập đường chuẩn Lập đường chuẩn là một trong những yêu cầu đầu tiên của phương pháp phân tích. Từ đường chuẩn ta có thể biết được khoảng tuyến tính của chất phân tích, từ đó đưa nồng độ mẫu thực nằm trong khoảng tuyến tính. Chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn như sau: pha một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 20ppb

đến 1500ppb từ dung dịch chuẩn gốc 100ppm và chuẩn trung gian 10ppm. Các dung dịch chuẩn được pha trong methanol. Sau đó đem đo ở các điều kiện như đã tối ưu ở trên, kết quả thu được ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ carbamat Nồng độ

Diện tích píc

C (ppb)

Carbofuran

Propoxur

Carbaryl

Fenobucarb

1818855

4323952

390301

385265

212190

100

8848970

742948

643172

393640

200

17287122

1577384

1181737

814165

500

38708909

3668940

3127832

1923068

1000

75531554

7089406

6399387

4013364

1500

95077738

8595550

8192473

5140543

Đường chuẩn Fenobucarb

4000000

5000000

3500000 3000000

4000000

Diện tích

y = 3990x - 5018.5 R2 = 0.9994

4500000

6000000

3000000 2000000 1000000

2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0

0 0

500

1000

1500

2000

500

Nồng độ (ppb)

1000

1500

Nồng độ (ppb)

Hình 3.9. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Fenobucarb và đường chuẩn của Fenobucarb

Đường chuẩn Carbaryl 7000000

9000000 8000000

6000000

7000000

5000000 Diện tích

Diện tích

6000000 5000000 4000000

y = 6376x - 11658 R2 = 0.9993

4000000 3000000

3000000

2000000

1000000

500

1000

1500

2000

200

400

600

800

1000

1200

Nồng độ (ppb)

Hình 3.10. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Carbaryl và đường chuẩn của Carbaryl

10000000 9000000 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0

8000000

y = 7038.3x + 89642

7000000

R = 0.9995

6000000 Diện tích

Diện tích

Đường chuẩn Propoxur

5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0

500

1000

1500

2000

200

400

600

800

1000

1200

Nồng độ (ppb)

Hình 3.11. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Propoxur và đường chuẩn của Propoxur

Đường chuẩn Carbofuran

100000000

70000000

80000000 60000000

Diện tích

y = 74735x + 1E+06 R2 = 0.9993

80000000

40000000

60000000 50000000 40000000 30000000 20000000 10000000

20000000 0

0 0

500

1000

1500

2000

Nồng độ (ppb)

500

1000

1500

Nồng độ (ppb)

Hình 3.12. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Carbofuran và đường chuẩn của Carbofuran

RT: 0.00 - 18.04

Relative Abundance

NL: 2.60E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS mix 500ppb

RT: 8.87 MA: 38708909

100 50 1.07

2.82

4.23

100

9.57 6.15 6.68 7.29 RT: 8.88 MA: 3668940

10.97 11.85 13.43

16.67 17.72 NL: 2.57E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS mix 500ppb

50 0.73

2.31 3.01

4.41 5.02

7.13

9.23

7.92

12.03 13.35

16.15

16.77 NL: 2.15E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS mix 500ppb

RT: 9.86 MA: 3127832

100 50 0.83 1.88 3.02 4.25

5.04

7.40 7.93 9.15

100

12.75 10.82 RT: 10.93 AA: 1923068

13.97

16.25

16.95 NL: 1.36E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS ICIS mix 500ppb

50 0 0

8 10 Time (min)

Hình 3.13. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp carbamat 500ng/g Từ các đồ thị trên ta thấy, từ nồng độ trên 1000ppb thì mối quan hệ giữa diện tích pic và nông độ các chất carbamat không còn tuyến tính nữa. Như vậy, giới hạn tuyến tính của cacbofuran, propoxur, carbaryl và fenobucarb là 1000ppb. 3.2.2. Giới hạn phát hiện LOD [10] Giới hạn phát hiện LOD được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Để xác định giới hạn phát hiện, chúng tôi dùng chuẩn hỗn hợp 50ppb rồi tiến hành pha loãng cho tới khi thu được chiều cao chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền. Kết quả thu được như sau: giới hạn phát hiện của carbofuran là 5ng/ml; giới hạn phát hiện của carbaryl, propoxur và fenobucarb là 15ng/ml.

RT: 0.00 - 18.04 NL: 3.24E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS mix 15ppb

8.87

100

Relative Abundance

50 2.82 4.40 5.62

1.16

0 100

6.76 7.46 8.60

9.48

11.67 12.37 13.86 14.47 16.66

RT: 8.96 8.79

50 1.08 2.57 3.53

6.42 6.69

4.32

7.91

11.50

9.49

12.73

10.28

0 100

13.26 15.01 16.15 16.32

NL: 2.98E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS mix 15ppb

RT: 9.85

50 7.05

3.89 5.65 6.08

1.70 2.58

8.80

11.60 12.65

0 100

14.23

17.12 17.47 NL: 1.39E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS mix 15ppb

RT: 10.92 7.24

50 0.85

7.59

5.67 6.37

4.00

2.25

NL: 2.04E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS mix 15ppb

12.33

RT: 8.82

13.47 15.22

15.57

0 0

8 10 Time (min)

Hình 3.14. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp carbamat 15ng/ml

RT: 0.00 - 18.04

5.54 50 Relative Abundance

NL: 3.62E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS mix 5ppb

RT: 8.87

100

1.33 0 100

6.50

7.20

10.10

4.31 5.28

2.12

5.46 0.82

2.57

10.37

5.20

2.75 3.54

0 100

5.47 4.51 1.71 1.27

2.49

0 100 0.50

12.12 11.42

17.28

15.27

13.96

NL: 1.15E4 16.85 17.90 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS mix 5ppb

14.84

6.00 6.88

9.85

7.84 9.59 8.45

4.25 4.09 4.88

8.97

6.51 6.78

11.94 12.99

5.85 2.25 2.78

6.81 7.42

10.38

13.36 12.40 13.62

8.30 8.74

14.70

10.05

13.29

11.10

15.90

NL: 1.07E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 17.48 144.50-145.50] MS mix 5ppb

NL: 7.56E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 17.15 17.59 151.50-152.50] MS mix 5ppb

0 0

8 10 Time (min)

Hình 3.15. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp carbamat 5ng/ml 3.2.3. Giới hạn định lượng LOQ [10] Giới hạn định lượng LOQ được xem là nồng độ thấp nhất mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Theo lí thuyết thống kê trong hóa phân tích thì LOQ = 3,33 LOD. Do đó, giới hạn định lượng của carbofuran là 20ng/ml còn giới hạn định lượng của carbaryl, fenobucarb và propoxur là 50ng/ml.

3.2.4. Độ chính xác của phép đo Theo ISO, độ chính xác của phép đo được đánh giá qua độ đúng và độ chụm. Độ chụm là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực. Độ đúng được biểu diễn dưới dạng sai số tuyệt đối hoặc sai số tương đối. Sai số được tính theo công thức: %X =

Si − St × 100% St n

% X tb =

∑ %X i =1

Trong đó: %X : Sai số phần trăm tương đối. Si : giá trị diện tích pic đo được. St : giá trị diện tích pic tìm được theo đường chuẩn. n : số lần đo. Độ lặp lại của phép đo được xác định theo các đại lượng S2 và CV. S

( S −S =∑ i

)

CV =

n −1

S ⋅100 S tb

Trong đó: Stb : Diện tích pic trung bình. n

: số lần đo.

S : độ lệch chuẩn. CV : hệ số biến động của phép đo. Để đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo ta dựng đường chuẩn, pha 3 mẫu có nồng độ ở điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến tính. Thực hiện đo mỗi mẫu 4 lần. Các kết quả được chỉ ra ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau

Nồng (ppb)

CV (%)

Carbofuran

4462544

4479553

4710802

5088066

4864153

6,0

6,2

Propoxur

407756

401130

413389

465694

441555

7,2

7,0

Carbaryl

312599

317887

306848

273725

292517

6,7

6,6

Fenobucarb

213922

185829

207264

212625

194482

7,6

6,4

3911632

3958007

1,6

1,3

39847129

3870890 9

Propoxur

3617105

3727622

3748831

3681568

3668940

1,4

1,6

Carbaryl

3098305

3230757

3206597

3173917

3127832

2,1

1,8

Fenobucarb

1957011

1908327

1961337

1943537

1923068

1,4

1,2

7636070

7443025

1,4

1,6

Carbofuran 76364091 1000

pic St

%Xtb

Lần đo

Carbofuran 38651499 500

Diện tích

Diện tích pic Si

độ

74136751

7553155 4

Propoxur

7054760

6944509

6924225

7523589

7089406

2,7

3,9

Carbaryl

6683924

6255124

6552468

6959715

6399389

4,5

4,4

Fenobucarb

4266145

4099357

3972133

4202736

4013364

3,5

3,1

Nhận xét: Phần trăm sai số và hệ số biến thiên CV của phép đo tại 3 mức nồng độ 50ppb, 500ppb và 1000ppb có giá trị từ 1,2 – 7,6% đều nằm trong giới hạn cho phép của AOAC. 3.3. Khảo sát điều kiện xử lí mẫu Các chất carbamat đều có độ phân cực kém, tan nhiều trong dung môi ít phân cực. Do đó, chúng tôi tiến hành tách chiết carbamat theo nguyên tắc sau: các chất carbamat được tách ra khỏi nền mẫu bằng dung môi methanol, sau đó được làm sạch qua cột kieselguhr và định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ. Qui trình dự kiến chiết carbamat:

Mẫu /ống li tâm 50ml + thêm chuẩn hỗn hợp 4 carbamat + MeOH Đồng nhất

Lắc vortex

Li tâm 6000 v/ph, 5 phút

Lọc / bình định mức 50ml + định mức bằng NaCl bão hòa Cho 20ml qua cột Kieselguhr Rửa giải Cô quay /40°C đến cạn Hòa cặn bằng 1ml MeOH LC/MS/MS

3.3.1. Khảo sát dung môi chiết Để tách chiết các chất carbamat khỏi nền mẫu, chúng tôi sử dụng dung môi Methanol : H2O với các tỉ lệ khác nhau. Hút chính xác 0,5ml dung dịch chuẩn hỗn hợp carbamat 1000ppb cho vào các bình định mức 50ml. Thêm vào các bình 40ml dung môi methanol : H2O với các tỉ lệ khác nhau và định mức bằng dung dịch NaCl bão hòa rồi lắc đều. Hút chính xác 20ml dung dịch trên cho qua cột kieselguhr. Mẫu

được rửa giải, đem cô quay đến cạn và hòa cặn bằng 1ml methanol rồi đem đo LC/MS/MS. Kết quả thu được như sau: Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi chiết đối với các chất carbamat MeOH:H2O mlt (ng)

Carbofura

Propoxur

Carbaryl

Fenobucarb

4483543

665262

240667

310632

Spic

52,5

72,5

41,2

68,9

mtt(ng)

26,3

37,7

20,6

34,5

R (%)

15655765

1690891

1039212

817610

Spic

183,4

191,9

177,8

181,4

mtt(ng)

91,7

95,9

88,9

90,7

R (%)

16414779

1628490

1010188

839404

Spic

192,3

184,8

172,8

186,3

mtt(ng)

96,1

92,4

86,4

93,1

R (%)

13946052

1174001

969756

496001

Spic

163,4

133,2

165,9

110,1

mtt(ng)

81,7

66,6

83,0

55,0

R (%)

n 1:1

200

2:1

200

3:1

200

4:1

200

100

R (%)

80 Carbofuran

Propoxur

Fenobucarb

Carbaryl

20 Me OH:H2O 0 1:1

2:1

3:1

4:1

Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất chiết carbamat vào tỉ lệ dung môi chiết Nhận xét: Tại tỉ lệ dung môi MeOH:H 2O = 2:1 và 3:1 thì hiệu suất chiết là tốt nhất. Do đó, chúng tôi chọn tỉ lệ MeOH:H 2O = 2:1 để tiết kiệm dung môi MeOH cho các lần khảo sát sau. 3.3.2. Khảo sát dung môi rửa giải Đối tượng nghiên cứu là các mẫu rau quả có nền mẫu phức tạp. Do đó, cần phải có quá trình làm sạch mẫu trước khi bơm vào máy. Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng cột kieselguhr để làm sạch mẫu. Carbamat được chiết theo quy trình như ở trên và được rửa giải bằng các dung môi khác nhau: hexan, diclometan và etylacetat. Kết quả thu được ở bảng dưới. Bảng 3.10. Kết quả khảo sát loại dung môi rửa giải đối với các chất carbamat Dung môi

Hexan

Diclometan

Etylacetat

mlt (ng)

400

Carbofuran

Propoxur

Carbaryl

Fenobucarb

7014554

869221

933158

1371602

Spic

90,8

112,9

178,8

385,1

mtt(ng)

22,7

28,2

44,7

96,3

R (%)

27420193

2582414

1853667

1054473

Spic

354,8

335,3

355,1

296,0

mtt(ng)

88,7

83,8

88,8

74,0

R (%)

400

Không hòa tan được

Nhận xét: Từ kết quả trên ta thấy, khi rửa giải carbamat bằng 3 loại dung môi khác nhau, hiệu suất thu hồi đối với diclometan là tốt nhất, với hexan thì thấp hơn còn etylacetat sau khi cô quay xuất hiện nhiều kết tủa bám lên thành bình. Có thể do dung môi etylacetat rửa giải được nhiều chất hơn diclometan và hexan. Độ thu hồi của carbofuran, carbaryl và propoxur tương đối cao khi dùng diclometan còn

fenobucarb thì độ thu hồi tốt hơn khi dùng hexan. Do đó, chúng tôi đã sử dụng cả 2 dung môi trên để rửa giải carbamat. Để có được độ thu hồi tốt nhất, chúng tôi tiến hành khảo sát tỉ lệ dung môi rửa giải hexan : diclometan như sau: carbamat được chiết như quy trình ở trên và rửa giải bằng dung môi hexan:diclometan ở các tỉ lệ khác nhau. Kết quả thu được ở bảng dưới. Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi rửa giải đối với các chất carbamat Diclometan:hexan mlt (ng)

1:2

1:1

2:1

3:1

200

Carbofura

Propoxur

Carbaryl Fenobucarb

15265216

1715528

1034817

603147

Spic

187,4

191,8

151,0

158,1

mtt(ng)

93,7

95,9

75,5

79,1

R (%)

15528417

1621848

1257159

718201

Spic

190,7

181,3

183,5

188,3

mtt(ng)

95,3

90,7

91,7

94,1

R (%)

15023256

1592201

992548

493364

Spic

184,5

178,0

144,9

129,3

mtt(ng)

92,2

89,0

72,4

64,7

R (%)

14922541

1430625

1072136

551947

Spic

183,2

160,0

156,5

14,7

mtt(ng)

91,6

80,0

78,2

72,3

R (%)

R (%) 100 80

Carbofuran Propoxur Carbaryl Fenobucarb

60 40 20 CH2Cl2:hexan

0 1:2

1:1

2:1

3:1

Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất chiết carbamat vào tỉ lệ dung môi rửa giải Nhận xét: từ đồ thị trên ta thấy, độ thu hồi các chất carbamat là tốt nhất tại tỉ lệ diclometan:hexan =1:1. Do đó, chúng tôi chọn tỉ lệ dung môi rửa giải diclometan:hexan =1:1 cho các lần khảo sát sau. 3.3.3. Khảo sát thể tích dung môi rửa giải Các chất carbamat được chiết theo quy trình như ở trên và được rửa giải bằng hỗn hợp dung môi diclometan:hexan =1:1 tại các thể tích khác nhau. Kết quả thu được ở bảng 3.10. Bảng 3.12. Kết quả khảo sát thể tích dung môi dung môi rửa giải đối với các chất carbamat V (ml)

mlt (ng)

200

Carbofuran

Propoxur

Carbaryl

Fenobucarb

9642540

814612

484553

248305

Spic

118,4

91,1

70,7

65,1

mtt(ng)

59,2

45,5

35,4

32,5

R (%)

14462593

1433329

946380

720286

Spic

177,6

160,3

138,1

188,8

mtt(ng)

88,8

80,1

69,1

94,4

R (%)

15174514

1582214

1214988

722391

Spic

186,3

176,9

177,3

189,4

mtt(ng)

93,2

88,4

88,7

94,7

R (%)

15294587

1691354

1164021

636247

Spic

187,8

189,1

169,9

166,8

mtt(ng)

93,9

94,6

84,9

83,4

R (%)

200

R (%)

100 80

Carbofuran Propoxur Carbaryl Fenobucarb

60 40 20 V (ml) 0 0

Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi carbamat vào thể tích dung môi rửa giải Nhận xét: Từ đồ thị trên ta thấy, độ thu hồi carbamat tương đối cao bắt đầu từ thể tích rửa giải bằng 50ml. Do đó, để vừa được hiệu suất thu hồi cao vừa đỡ tốn dung môi, chúng tôi chọn thể tích rửa giải là 50ml cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp Một phương pháp phân tích tốt phải có độ lặp lại và hệ số thu hồi cao. Để đánh giá hai yếu tố trên, chúng tôi tiến hành khảo sát trên nền mẫu thực. Sử dụng

mẫu trắng, thêm chuẩn tại 3 mức nồng độ 100ppb, 500ppb và 1000ppb. Mỗi mức tiến hành làm lặp lại 4 lần. Độ lặp lại và độ thu hồi được xác định như sau: Độ lặp lại của phương pháp được xác định theo các đại lượng S2 và CV. S

( S −S =∑ i

)

CV =

n −1

S ⋅100 S tb

Trong đó: Stb : Diện tích pic trung bình. n

: số lần đo.

S : độ lệch chuẩn. CV : hệ số biến động của phép đo. Độ thu hồi của phương pháp theo các công thức sau : C =

C '.V m

(Cm + c − Cm ) × m × 100 mc

Trong đó: C: nồng độ carbamat xác định được (ng/g) C': nồng độ carbamat tính từ đường chuẩn (ng/ml) V: thể tích hòa cặn (V=1ml) m: khối lượng mẫu (g) Cm+c : nồng độ carbamat xác định được trong mẫu thêm chuẩn (ng/g) Cm: nồng độ carbamat có trong mẫu (ng/g) mc: lượng carbamat thêm vào (ng) R: độ thu hồi (%) Bảng 3.13. Kết quả độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp

mc (ng)

100

CV (%)

4979720

4767493

4689607

5336250

5533186

89,3

5,9

Propoxur

551149

483616

523328

506348

574177

90,0

5,5

Carbaryl

446472

424858

489584

485875

506095

91,2

6,8

Fenobucarb

262141

257556

276491

286139

307509

88,0

4,9

2374753

2353585

92,2

2,7

24981490

2621918 6

Propoxur

2494321

2503822

2324398

2494461

2720697

90,2

3,5

Carbaryl

2185965

2190473

2108417

2285938

2373695

92,4

3,3

Fenobucarb

1212958

1290565

1219670

1237636

1397789

88,7

2,8

4591357

4844647

90,8

2,4

Carbofuran 46861702 1000

pic St

%Rtb

Carbofuran

Carbofuran 24427430 500

Diện tích

Diện tích pic Si

47829695

5207668 6

Propoxur

5024113

4669544

4872670

5022337

5403847

90,6

3,4

Carbaryl

4419905

4084287

4226059

4592391

4708195

92,0

5,1

Fenobucarb

2395286

2416886

2328485

2340531

2760639

85,9

1,8

Nhận xét: Độ thu hồi của phương pháp tại 3 mức nồng độ 100ppb, 500ppb và 1000ppb đều trên 80% và nằm trong giới hạn cho phép của AOAC. Theo AOAC, độ lặp lại của phương pháp CV (%) tại nồng độ 100 – 1000ppb cho phép từ 11 – 15%. Độ lặp lại của các carbamat tại nồng độ 100ppb cao nhất trong 3 mức nồng độ, tuy nhiên vẫn nằm trong giới hạn cho phép của AOAC. Như vậy, phương pháp có độ thu hồi trên 80% và độ lặp lại cao, có thể áp dụng phương pháp để phân tích dư lượng thuốc trừ sâu carbamat trong rau quả. 3.4. Phân tích mẫu thực tế Sau khi nghiên cứu các điều kiện tách chiết carbamat, chúng tôi tiến hành phân tích một số mẫu thực. Đối tượng mẫu là một số loại rau quả sau: quả lê, quả cam, quả quýt, rau dền, rau thơm, rau cải xanh… Các mẫu rau và quả trước khi đem

phân tích cần phải xử lí sơ bộ. Các mẫu được nghiền nhỏ và đồng nhất, sau đó được đem cân và tiến hành phân tích như qui trình ở trên. Mỗi mẫu được làm lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình của 3 lần.

Mẫu (∼10g)/ống li tâm 50ml + thêm chuẩn hỗn hợp 4 carbamat + 20ml MeOH Đồng nhất

Lắc vortex 5 phút QUI TRÌNH CHIẾT CARBAMAT TRONG RAU QUẢ Li tâm 6000 v/ph, 5 phút

Lọc / bình định mức 50ml + định mức bằng NaCl bão hòa Hút 20ml dung dịch cho qua cột Kieselguhr Để yên 15 phút Rửa giải bằng 50 ml hexan:diclometan = 1:1 Cô quay /40°C đến cạn

Hòa cặn bằng 1ml MeOH

LC/MS/MS

Bảng 3.14. Kết quả phân tích các mẫu quả STT

Mẫu

Carbamat

Lượng thêm

Lượng tìm

Độ thu

vào (ng)

thấy (ng)

hồi R%

KPH

250

202,7±5,9

81,1

KPH

250

203,0±6,9

81,2

KPH

250

213,5±4,5

85,4

KPH

250

206,6±8,7

82,7

KPH

250

211,0±6,7

84,4

KPH

250

207,7±7,3

83,1

KPH

Carbofuran

Propoxur 1

Cam Carbaryl

Fenobucarb 2

Táo

Carbofuran

Propoxur

Carbaryl

Fenobucarb

Carbofuran

Propoxur 3

Quýt

Carbaryl

Fenobucarb

Carbofuran

Propoxur 4

Nho xanh

Carbaryl

Fenobucarb

Lê

Carbofuran

Propoxur

250

205,5±8,4

82,2

KPH

250

215,4±5,0

86,2

KPH

100

83,3±3,8

83,3

KPH

100

80,6±3,1

83,1

KPH

100

80,3±2,8

80,3

KPH

100

80,3±2,6

80,3

KPH

200

162,9±5,4

81,5

KPH

200

160,1±5,4

80,0

KPH

200

168,9±4,7

84,5

KPH

200

164,4±4,9

82,2

KPH

200

167,3±5,9

83,6

KPH

Carbaryl

Fenobucarb

200

161,3±6,4

80,6

KPH

200

162,7±4,4

81,4

KPH

200

166,2±5,2

83,1

Bảng 3.15. Kết quả phân tích các mẫu rau STT

Mẫu

Carbamat

Lượng thêm

Lượng tìm

Độ thu

vào (ng)

thấy (ng)

hồi R%

KPH

250

207,2±8,7

82,9

KPH

250

220,4±8,2

88,2

KPH

250

205,9±6,0

83,4

KPH

250

212,9±7,7

85,2

KPH

500

427,5±10,3

85,5

KPH

500

418,5±8,8

83,7

KPH

500

434,7±13,9

86,9

KPH

Carbofuran

Propoxur 1

Bắp cải Carbaryl

Fenobucarb 2

Cải xanh

Carbofuran

Propoxur

Carbaryl

Fenobucarb

500

408,2±7,8

81,6

KPH

500

416,4±10,4

83,3

KPH

500

406,4±10,6

81,3

KPH

500

414,8±7,5

83,0

KPH

500

414,9±8,7

83,0

Carbofuran

26,6±1,4

Carbaryl

KPH

Propoxur

KPH

Fenobucarb

KPH

Carbofuran

8,5±0,5

Rau mồng

Carbaryl

KPH

tơi

Propoxur

KPH

Fenobucarb

KPH

Carbofuran

Propoxur 3

Rau rền

Carbaryl

Fenobucarb

Rau cần tây

Nhận xét: Kiểm tra phân tích trên 30 mẫu rau quả các loại, phát hiện 2 mẫu rau có chứa dư lượng carbofuran nhưng đều ở mức thấp, chưa phát hiện được mẫu nào có chứa carbaryl, propoxur và fenobucarb. Hiệu suất thu hồi các mẫu thêm chuẩn đều đạt trên 80%.

Chương 4. KẾT LUẬN Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm đã nghiên cứu để xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật nhóm carbamat trong một số loại rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, chúng tôi đã thu được các kết quả sau: 1. Nghiên cứu và tối ưu hóa được các điều kiện chạy sắc ký lỏng khối phổ như: pha động, cột sắc ký, detector. 2. Nghiên cứu và đánh giá được khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các carbamat, độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp. 3. Nghiên cứu và đưa ra điều kiện để tách chiết các chất carbamat trong một số loại rau quả.

4. Đưa ra quy trình phân tích xác định đồng thời dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật nhóm carbamat trong một số loại rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. 5. Tiến hành phân tích trên 30 mẫu rau quả trên địa bàn Hà Nội và phát hiện 2 mẫu rau có chứa dư lượng carbofuran. Từ các kết quả thu được chúng tôi nhận thấy có thể áp dụng phân tích dư lượng thuốc trừ sâu carbamat trong các loại rau quả với độ tin cậy cao. Đây là một phương pháp có nhiều ưu điểm trong phân tích các chất nhóm carbamat mặc dù chi phí cho phân tích còn khá cao. Nếu có thể, tôi mong tiếp tục nghiên cứu xác định đồng thời các chất khác thuộc carbamat.

TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TIẾNG VIỆT 1. Cổng thông tin điện tử Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn [2009], Dư lượng thuốc trừ sâu ở rau quả Ấn Độ tăng cao.

2. Con người và thiên nhiên (2007), Hóa chất bảo vệ thực vật và sức khoẻ con người (Kỳ I). 3. Việt báo (2006), Rau an toàn thừa thuốc trừ sâu. 4. Phạm Luận (1988), Cơ sở lý thuyết Kĩ thuật phân tích FIA, ĐHTH Hà Nội 5. Phạm Luận, Trần Chương Huyến, Từ Vọng Nghi (1990), Một số phương pháp phân tích điện hóa hiện đại, ĐHTH Hà Nội.

6. QĐ 46/2007/QĐ-BYT, Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hoá học trong thực phẩm. 7. Rau Hoa Quả Việt Nam (2006), Vệ sinh an toàn thực phẩm: Những con số đáng ngại. 8. Sở khoa học và công nghệ tỉnh An Giang (2007), Dư lượng thuốc trừ sâu trong một số loại rau xanh ngắn ngày tại TP. Long Xuyên. 9. Sở Tài nguyên và Môi trường tỉnh Vĩnh Phúc ( 2008 ), Thuốc bảo vệ thực vật và những tác động của chúng. 10.

Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hoá phân

tích. 11.

Công An Ninh Thuận ( 2009), Hơn hai triệu người ăn rau bẩn.

B. TIẾNG ANH 12.

A. Guiberteau , T. Galeano Diáz, F. Salinas, J.M. Ortiz (1995),

“Indirect voltammetric determination of carbaryl and carbofuran using partial least squares calibration”, Analytyca Chimica Acta, 305, pp. 219 – 226. 13.

Carbofuran, http://en.wikipedia.org/wiki/Carbofuran

14.

Conacher HB, Page BD, Lau BP, Lawrence JF, Bailey R, Calway P,

Hanchay JP, Mori B (1987), “Capillary column gas chromatographic determination of ethyl carbamate in alcoholic beverages with confirmation by gas chromatography/mass spectrometry”, Journal-Assocoation of Official Analytical Chemist. 15.

David Arráez-Román, Antonio Segura-Carretero, Carmen Cruces-

Blanco, Alberto Fernández-Gutiérrez (2004), “Determination of aldicarb, carbofuran and some their main metabolites n groundwater by application of micellar electrokinetic capillary chromatography with diode-array

detection and solid-phase extraction”, Pest Management Science, 60, pp. 675-679. 16.

Elvira Grou, Valeria Rădulescu (1983), “Direct determination of some

carbamat pesticides in water and soil by high-performance liquid chromatography”, Journal of Chromatography, 260, pp. 502-506. 17.

Feng Tang, Shimei Ge, Yongde Yue, Rimao Hua, Rong Zhang

(2005), “High-performance thin-layer chromatographic determination of carbamate residues in vegetables”, Journal of Planar Chromatography, Volume 18, Number 101, pp. 28-33. 18.

Feride Koc, Yusuf Yigit, Yavuz Kursad Das, Yasemin Gurel, Cevdet

Yarali (2008), “Determanation of aldicarb, propoxur, carbofuran, carbaryl and methiocarb residues in honey by HPLC with post-column derivatization and fluorescence detection after elution from a florisil column”, Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 16, No. 3, pp. 39-45. 19.

Gianni Sagratini, Jordi Manes, Dario Giardiná, Pietro Damiani,

Yolanda Picó (2007), “Analysis of carbamate and phenylure pesticide residues in fruit juices by solid-phase microextraction and liquid chromatography-mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, 1147, pp. 135-143. 20.

Jinno Laboratory (2001), Carbaryl, School of Materials Science,

Toyohashi University of Technology, Japan. 21.

Jinno Laboratory (2001), Fenobucarb, School of Materials Science,

Toyohashi University of Technology, Japan. 22.

Jinno Laboratory (2001), Propoxur, School of Materials Science,

Toyohashi University of Technology, Japan. 23.

José Fernando Huertas-Pérez, Ana M. García Campana, Laura

Gámiz-Gracia, Antonio González-Casado, Monsalud del Olmo Iruela

(2004), “Sensitive determination of carbaryl in vegetal food and natural waters

flow-injection

analysis

based

the

luminol

chemiluminescence reaction”, Analytica Chimica Acta, 524, pp. 161-166. 24.

José Fernando Huertas-Pérez, Laura Gámiz-Gracia, Ana M. García

Campana, Antonio González-Casado, José L. Martínez Vidal (2005), “Chemiluminescence determination of carbofuran at trace levels on lettuce and waters by flow-injection analysis”, Talanta, 65, pp. 980-985. 25.

Karim D. Khalaf, A. Morales-Rubio, M. de la Duardia, “Simple and

rapid flow-injection spectrophotometric determination of carbaryl after liquid-liquid extraction”, Analytica Chimica Acta, 208, pp. 231-238. 26.

L. Alvarez-Rodrıguez, Ll. Monferrer-Pons, J. S. Esteve-Romero, M.

C.Garcıa-Alvarez-Coque, G. Ramis-Ramos (1997), “Spectrophotometric Determination of Carbamate Pesticides With Diazotized Trimethylaniline in a Micellar Medium of Sodium Dodecyl Sulfate”, Analyst, Vol 122, pp.459-463. 27.

Masuru Kawasaki, Tsuyoshi Inoue, Katsuharu Fukuhara, Sadao

Uchiyama (1999), “Study on GC/MS (SIM) for determination of carbamate and organonitrogen pesticides in foods with simple clean-up by SPE method”, J. Japan, Vol 4, No. 5. 28.

Mian Liu, Hui Yang, Hongxia Liu, Po Han, Xie Wang, Shusheng

Zhang, Yangjie Wu (2007), “Development of high-performance liquid chromatography and non-aqueous capillary electrophoresis methods for the determination of fenoxycarb residues in wheat samples”, Journal of the Science of Food and Agriculture, Volume 88, Issue 1, pp. 62-67. 29.

Min Liu, Yuki Hashi, Yuanyuan Song, Jin-Ming Lin (2005),

“Simultaneous determination of carbamate and organophosphorus pesticides in fruits and vegetables by liquid chromatography-mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, 1097, pp. 183-187.

30.

M. Fernández, Y. Picó, J. Manes (2000), “Determination of carbamate

residues in fruits and vegetables by matrix solid-phase dispersion and liquid chromatography-mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, 871, pp. 43-56. 31.

O. Bhargavi, K. Kiran, K. Suvardhan, D. Rekha, K. Janardhanam, P.

Chiranjeevi (2006), “A sensitive determination of carbofuran by spectrophotometer

using

4-azo-bis-3,3’5,5’-tetrabromoaniline

various environmental samples”, E-Journal of Chemistry, vol. 3, pp. 68 – 77. 32.

Urmila Tamrakar, Vinay K. Gupta, Ajai K. Pillai (2009),

“Spectrophotometric analysis of carbamate pesticides after thermal gradient separation”, Journal of Planar Chromatography, Volume 22, Number 2, pp. 77-82. 33.

Xiaozhong Hu, Yu Jianxin, Yan Zhigang, Ni Lansun, Lin Yanfei,

Wang Peng, Li Jing, Huang Xin, Chu Xiaogang, Zhang Yibin (2004), “Determination of Multiclass Pesticide Residues in Apple Juice by Gas Chromatography-Mass Selective Detection after Extraction by Matrix Solid-Phase Dispersion”, Journal of AOAC INTERNATIONAL, Volume 87, Issue 4, pp. 972-985. 34.

Xiaoping Wu, Ling Wang, Zenghong Xie, Professor, Jieshan Lu,

Chao Yan, Pengyuan Yang, Guonan Chen (2006), “Rapid separation and determination of carbamate insecticides using isocratic elution pressurized capillary electrochromatography”, Electrophoresis, Vol. 27, pp 768-777. 35.

Koteswara,

Lokanath

Swaroop,

Chiranjeevi,

Rangamannar, “Spectrophotometric determination of carbosulfan in various environments using novel oxidative coupling”, Proceedings of the Third International Conference on Environment and Health, Chennai, India (2003), pp. 400 – 403.

PHỤ LỤC 1. Khảo sát thành phần pha động chế độ isocractic (HCOOH 0,1% : MeOH)

RT: 0.00 - 5.86 NL: 5.03E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@45.00 [ 164.50-165.50] MS mix 1000ppb-90%MeOH

3.83

100

Relative Abundance

50 0 100

0.14

0.80 1.07

4.23 4.62

2.78 3.11

1.79 1.99 2.32

5.15 5.48 NL: 4.91E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS mix 1000ppb-90%MeOH

3.78

50 0.35 0.62

1.28 1.54

1.93

3.12

2.46

3.65

4.17 4.57 5.03

0 100

5.55 NL: 4.44E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS mix 1000ppb-90%MeOH

4.12

50 0.50 0.76 1.09

4.45

2.27 1.48 2.08

2.87

3.26

3.79

0 100

4.78

5.63 5.24 NL: 9.23E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS mix 1000ppb-90%MeOH

4.34

50 0 0.0

0.52 0.85 1.18 0.5

1.0

1.37 1.5

2.23 2.0

2.63 2.5

4.67 5.00

3.28 3.48

3.0 Time (min)

3.5

4.0

4.5

5.0

5.59 5.5

Thành phần pha động 10 : 90

RT: 0.00 - 7.68 NL: 7.29E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@45.00 [ 164.50-165.50] MS mix 1000ppb-80%MeOH

4.36

100

Relative Abundance

50 0.28

0 100

1.72 2.19

1.00

2.38

4.75 4.89

3.63

5.41 6.14

7.06 NL: 7.29E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS mix 1000ppb-80%MeOH

4.30

50 0.68 1.14 1.54 2.00

4.63 4.90

3.32 3.78

2.72

0 100

7.27 6.34 7.00

5.49

NL: 1.07E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS mix 1000ppb-80%MeOH

4.91

5.10

50 0.96 1.29 1.68 1.94 2.60 3.06 3.52

0 100

5.24 5.57 6.29

4.51

7.08 NL: 9.78E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS mix 1000ppb-80%MeOH

5.52

50 0.52 0.85

0 0

2.76

1.70 1.97

3.28 3

3.88 4.27

4.93

4 Time (min)

7.37

6.38 6.90

Thành phần pha động 20 : 80 RT: 0.00 - 9.61

NL: 8.38E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@45.00 [ 164.50-165.50] MS mix 1000ppb-70%MeOH

5.29

100

Relative Abundance

50 2.32

0.94 1.27

0 100

3.05 3.51

4.69

5.94 6.60 7.39 7.85

8.97 NL: 6.95E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS mix 1000ppb-70%MeOH

5.23

50 2.60

0.95 1.08 1.35

3.26 3.78

7.27

4.57

6.22 6.61

0 100

8.33 8.72 NL: 8.92E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS mix 1000ppb-70%MeOH

6.43

50 0.37

0 100

1.16

1.88

3.00 3.66 4.06

6.10

4.78

6.89 7.22 8.20 8.93 9.32 NL: 9.49E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS mix 1000ppb-70%MeOH

8.29 8.49

50 0.33

1.25

0 0

2.04 2.50 2

3.68 4.08 4.21 3

5 Time (min)

9.02

6.58 7.04 7.90

5.40 6

Thành phần pha động 30 : 70

RT: 0.00 - 18.10

NL: 8.30E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@45.00 [ 164.50-165.50] MS mix 1000ppb-60%MeOH

7.19

100

Relative Abundance

50 1.53

0 100

2.85

4.23

7.85 9.24 10.68

6.08

13.65 14.37

16.35 NL: 8.47E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS mix 1000ppb-60%MeOH

7.27

50 1.28 1.81

0 100

7.47 8.00

6.81

3.32 3.98

13.07 14.32 14.51 16.55

10.56

NL: 7.75E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS mix 1000ppb-60%MeOH

9.78 9.65

50 2.94 3.73

0.96

0 100

5.77

9.46 9.06

7.15

10.51 11.23 13.14

15.38 16.83 15.40 15.53 15.73 15.21

50 1.71

0 0

3.55

7.50 8.42 9.08 11.91

5.33 6

8 10 Time (min)

12.44 12

NL: 8.34E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS mix 1000ppb-60%MeOH

15.86 16.19

14.81 14.61 14

Thành phần pha động 40 : 60

RT: 0.00 - 30.02

NL: 7.32E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@45.00 [ 164.50-165.50] MS mix 1000ppb-50%MeOH

11.48

100

Relative Abundance

50 1.34 2.92

0 100

5.95 7.39 10.62

12.13 13.85

19.18 21.02 23.39 26.03 28.07 NL: 7.69E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS mix 1000ppb-50%MeOH

11.49 11.36 11.62

50 11.82 13.13

6.81 8.72 10.83

1.61 3.52 0 100

18.60 20.64 17.82

50 1.69 3.07 2.50

0 100 50

2.24

4.01

15.51

6.36 7.75 10.38 12.88

7.17 7.44 6.65 6.12

11.06

13.56

NL: 7.79E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS mix 1000ppb-50%MeOH

19.79 22.63 25.85 27.56 NL: 8.10E3 TIC F: + c ESI SRM ms2

17.31

12.31

27.03

18.08

18.21 18.48

17.49

23.67

21.33 20.61

26.00

29.82 208.00@37.00 [ 151.50-152.50]

22.25

MS mix 1000ppb-50%MeOH

0 0

15 Time (min)

Thành phần pha động 50 : 50 2. Khảo sát thành phần pha động sử dụng chất cải biến nền

RT: 0.00 - 18.03 NL: 2.74E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS mix 1000ppb-acetic

RT: 8.83 MA: 62596017

100 50 0.24

Relative Abundance

2.23 3.00

9.60 10.98 12.28 RT: 8.84 MA: 7095289

5.15 6.22 6.83

100

14.58

16.73 NL: 2.89E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS mix 1000ppb-acetic

50 0.94 2.01

3.93 4.47

6.16

9.61 10.53 12.37 13.21 RT: 9.85 MA: 4205380

8.07

100

15.44

17.20 NL: 1.68E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS mix 1000ppb-acetic

50 2.33

0.26

3.86 4.79

6.17 7.24

10.31 12.15

8.62

14.45

16.37 NL: 9.55E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS ICIS mix 1000ppb-acetic

RT: 10.87 AA: 2191283

100 50 1.74 0 0

4.19 5.04 5.96

7.57 8.11

10.41

11.18

8 10 Time (min)

13.86 14.01 14

17.24 16

Dung dịch acid acetic 0,1% trong nước RT: 0.00 - 18.03 NL: 2.02E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS mix 1000ppb-NH4Ac

RT: 8.91 MA: 52548096

100 50 0.47 1.62 2.69

Relative Abundance

9.60 11.44 12.74 13.51 14.74 6.68 7.22 RT: 8.92 MA: 5289116

4.30 5.22

100

17.89 NL: 2.26E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS mix 1000ppb-NH4Ac

50 1.55 2.32 3.24

6.92

5.16

8.61

9.46 10.84

12.76

16.75 17.90

13.22

NL: 2.00E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS ICIS mix 1000ppb-NH4Ac

RT: 9.85 AA: 3950325

100 50 1.26 2.02 3.33 4.25

9.54 6.63 7.40 8.47

100

11.16 11.92 13.76 RT: 10.95 MA: 2239988

15.45 16.68 NL: 1.41E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS mix 1000ppb-NH4Ac

50 0.59

0 0

5.35 6.04

2.35 3.04 2

6.42 8.41

10.56

11.41 12.10 14.09

8 10 Time (min)

16.55 16

Dung dịch amoni acetat 0,1% trong nước

RT: 0.00 - 18.03 NL: 3.92E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS mix 1000ppb-NH4OH

RT: 8.75 MA: 88164531

100 50 0.24

Relative Abundance

9.52 10.67 12.51 13.28 14.51 16.04 6.45 7.22 RT: 8.84 MA: 8026138

2.39 3.46 4.23

100

NL: 3.68E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS mix 1000ppb-NH4OH

50 2.78

0.79

10.91 12.14

6.39 7.23

4.78

12.60

15.52 16.74 NL: 4.78E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS mix 1000ppb-NH4OH

RT: 9.77 MA: 8972544

100 50 1.26 1.80

10.31 12.54 RT: 10.87 MA: 5076448

9.16

6.55 7.09

3.33 4.10

100

14.91

17.60 NL: 2.68E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS mix 1000ppb-NH4OH

50 0

0.36 1.59

3.81

6.57 7.65

6.42 6

12.17 13.25

10.33

8 10 Time (min)

15.40 16.55

Dung dịch acid focmic 0,1% trong nước 3. Khảo sát tỉ lệ dung môi chiết RT: 0.00 - 18.05 NL: 3.62E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS MeOH-H2O-1-1

RT: 8.87 MA: 4416725

100

Relative Abundance

50 0.37

1.86

9.22 6.68 7.73 RT: 8.88 MA: 654621

3.87 4.49

100

9.92 11.85

14.04 14.82 15.96

50 0.73

1.96 2.48 4.06 4.67 6.25 7.30

100 7.31 50

1.53

3.28

6.35 4.16

9.14

NL: 1.48E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS MeOH-H2O-1-1

RT: 9.77 MA: 238176 9.94 11.87 12.92

8.89

5.03

14.75 15.45 17.64

9.67 12.82 13.17

14.06

15.64

17.39 NL: 1.96E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS MeOH-H2O-1-1

RT: 10.84 MA: 295354

100 50 0.59 0.85

3.74 4.71 5.58

7.33

15.13

11.36 12.68

8.12 8.91

NL: 4.65E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS MeOH-H2O-1-1

16.97

0 0

8 10 Time (min)

MeOH:H2O = 1:1

RT: 0.00 - 18.05 NL: 3.62E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS MeOH-H2O-1-1

RT: 8.87 MA: 4416725

100

Relative Abundance

50 1.86

0.37

9.22 6.68 7.73 RT: 8.88 MA: 654621

3.87 4.49

100

9.92 11.85

14.04 14.82 15.96

50 9.14

1.96 2.48 4.06 4.67 6.25 7.30

0.73

7.31 1.53

3.28

6.35 4.16

NL: 1.48E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS MeOH-H2O-1-1

RT: 9.77 MA: 238176 9.94

100 50

14.75 15.45 17.64

9.67 12.82 13.17

11.87 12.92

8.89

5.03

14.06

17.39

15.64

NL: 1.96E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS MeOH-H2O-1-1

RT: 10.84 MA: 295354

100 50 0.59 0.85

3.74

4.71 5.58

7.33

15.13

11.36 12.68

8.12 8.91

NL: 4.65E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS MeOH-H2O-1-1

16.97

0 0

8 10 Time (min)

MeOH:H2O = 2:1 RT: 0.00 - 18.04 NL: 1.07E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS MeOH-H2O-3-1

RT: 8.86 MA: 16042383

100

Relative Abundance

50 1.50 2.47

3.78

5.01

100

9.65 6.50 7.37 RT: 8.87 MA: 1605778

12.54 13.16 14.38

16.84

50 0.73

3.44 3.79 4.41

5.90 6.77 7.82

9.14 9.66

12.55 13.34 14.04 16.32 17.29

NL: 6.74E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS MeOH-H2O-3-1

RT: 9.76 MA: 970162

100 50 1.61

3.89 4.59 6.26 6.70

8.18

10.29 10.64

13.35 14.32

15.90 17.12 NL: 8.37E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS MeOH-H2O-3-1

RT: 10.84 MA: 877065

100 50 1.55

0 0

3.30 3.83 4.35 6.02 4

12.06 14.08 14.69

7.59 8.73 10.40 8 10 Time (min)

MeOH:H2O = 3:1

NL: 8.83E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS MeOH-H2O-3-1

16.18 16

RT: 0.00 - 18.04 NL: 9.18E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS MeOH-H2O-4-1

RT: 8.86 MA: 13760894

100 50 1.42

Relative Abundance

9.48 11.05 12.02 13.51 5.27 6.41 7.46 RT: 8.88 MA: 1094608

2.91 4.05

100 50 0.64

2.39

3.97 4.76

6.16

8.35

16.14 17.19

12.03 13.43 14.39

9.58

NL: 6.36E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS MeOH-H2O-4-1

16.59

NL: 6.95E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS MeOH-H2O-4-1

RT: 9.85 MA: 935970

100 50 1.00

2.67 3.28

10.29 11.25

6.78 7.48 9.59

4.86

13.62

15.11

17.56 NL: 3.26E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS MeOH-H2O-4-1

RT: 11.01 MA: 434899

100 50

1.02

2.25 2.86

4.62

11.45 12.33 14.34

8.82 10.66

6.54 6.89

16.79

0 0

8 10 Time (min)

MeOH:H2O = 4:1 4. Khảo sát dung môi rửa giải

RT: 0.00 - 18.04 NL: 1.78E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS chiet bang diclometan

RT: 9.04 MA: 27949229

100

Relative Abundance

50 0.80 1.68

9.57 11.32 5.18 6.50 7.55 RT: 9.05 AA: 2633800

3.26

100

13.25 14.56

16.31 NL: 1.57E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS ICIS chiet bang diclometan

50 0

NL: 1.37E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS ICIS chiet bang diclometan

RT: 10.03 AA: 1843101

100 50 0

NL: 8.79E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS ICIS chiet bang diclometan

RT: 11.10 AA: 980813

100 50 0.85

0 0

2.43 2

4.18 4

7.07 7.95 6

9.79

8 10 Time (min)

11.45 12.68 14.52 12

17.93 16

Rửa giải carbamat bằng dung môi diclometan

RT: 0.00 - 18.04 NL: 5.29E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS chiet bang n-hexan

RT: 8.95 MA: 7225108

100

Relative Abundance

50 10.18 11.14 1.24 2.03 3.43 4.57 6.32 6.59 8.34 RT: 8.96 AA: 853691

0 100

13.33 14.21

16.75 NL: 7.26E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS ICIS chiet bang n-hexan

50 0

NL: 6.91E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS ICIS chiet bang n-hexan

RT: 9.85 AA: 916035

100 50 0.65 1.70

4.15 4.50 5.64 6.70

10.29

8.36

14.32

12.39

16.68 17.56 NL: 8.83E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS chiet bang n-hexan

RT: 11.01 MA: 1380078

100 50

7.24 7.86

3.21 4.26 4.70

1.72

12.85

9.08

8 10 Time (min)

15.04 16.09 16.44 14

Rửa giải carbamat bằng dung môi n-hexan 5. Khảo sát tỉ lệ dung môi rửa giải RT: 0.00 - 18.02 NL: 1.05E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS ICIS mix 200ppb

RT: 8.90 AA: 16288884

100

Relative Abundance

50 1.15

3.00 3.69

5.22 6.37

100

9.44 8.14 RT: 8.91 MA: 1788709

11.20 11.90 13.51

16.11 17.80 NL: 1.09E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS mix 200ppb

50 1.01

2.47 3.24

6.69

5.08

10.68 10.91

8.53

13.52

15.97 16.74 NL: 7.57E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS mix 200ppb

RT: 9.92 MA: 1370381

100 50 0.33 1.87 2.86

6.93 8.16 9.54

4.78 5.47

12.84

10.77

14.37 15.45

100

17.59 NL: 5.20E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS ICIS mix 200ppb

RT: 10.94 AA: 762900

50 0 0

8 10 Time (min)

Sắc đồ chuẩn carbamat 200ng/ml

RT: 0.00 - 18.02

NL: 9.76E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS CH2Cl2-hexan-1-2

RT: 8.83 MA: 15323127

100

Relative Abundance

50 1.39 2.15 3.61

9.29 10.90 6.76 7.98 RT: 8.84 MA: 1743626

5.38

100

12.89 13.81 15.20

17.42 NL: 1.01E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS CH2Cl2-hexan-1-2

50 6.92 7.23

2.70 3.47 3.70

0.17

9.84

11.29 12.21 13.60

16.05 17.74 NL: 6.34E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS CH2Cl2-hexan-1-2

RT: 9.77 MA: 990046

100 50 1.10

2.48

5.32 7.55

4.09

10.15

7.78 9.39

14.45 14.76 16.52

12.53

NL: 5.12E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS CH2Cl2-hexan-1-2

RT: 10.87 MA: 581813

100 50 1.35 2.43

3.66

6.65

0 0

9.72

11.25

8 10 Time (min)

6.80 7.80

13.94 14.78 14

17.16

Rửa giải carbamat bằng dung môi diclometan/hexan (1:2)

RT: 0.00 - 18.03 NL: 1.01E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS CH2Cl2-hexan-1-1

RT: 8.91 MA: 16221063

100 50 0.78 2.16 3.00

Relative Abundance

10.29 6.38 7.30 7.99 RT: 8.84 MA: 1619068

4.30

100

12.05 13.13 14.59 15.35 16.66 NL: 9.91E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS CH2Cl2-hexan-1-1

50 1.09 1.86 3.17

4.93

6.31

11.91 12.60 13.60

10.15

8.00

16.36 NL: 9.48E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS CH2Cl2-hexan-1-1

RT: 9.85 MA: 1273289

100 50 2.26

2.49

5.17

5.48

6.86 7.86 8.93

100

11.00 12.23 RT: 10.95 MA: 725971

14.22 15.22

17.60 NL: 5.54E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS CH2Cl2-hexan-1-1

50 1.74 1.97

0 0

3.50 4

5.19 6.88 7.11 6

8.88 10.72

11.56 12.10

8 10 Time (min)

16.85

14.86 14

Rửa giải carbamat bằng dung môi diclometan/hexan (1:1)

RT: 0.00 - 18.03 NL: 9.71E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS CH2Cl2-hexan-2-1

RT: 8.91 MA: 15246098

100 50 0.16 2.08 2.77

Relative Abundance

0 100

9.45 10.90 11.90 13.66 14.74 4.46 5.46 6.53 7.30 RT: 8.92 MA: 1570343

17.35 NL: 1.11E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS CH2Cl2-hexan-2-1

50 2.01 3.09 5.39

0.10

5.77 6.77

8.61

100

10.68 11.30 RT: 9.85 AA: 1025568

13.06

15.44

17.59 NL: 6.71E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS ICIS CH2Cl2-hexan-2-1

50 0.72 1.87 3.02

4.79

6.47

9.54

8.85

12.15 12.77 13.76 14.91

17.22 NL: 3.19E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS CH2Cl2-hexan-2-1

RT: 10.95 MA: 445020

100 50

1.05 2.66 2.89

4.35 5.65 6.80 7.65

11.79

8.95 9.34

13.86

17.77

15.63

0 0

8 10 Time (min)

Rửa giải carbamat bằng dung môi diclometan/hexan (2:1)

RT: 0.00 - 18.02 NL: 1.03E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS CH2Cl2-hexan-3-1

RT: 8.98 MA: 15646460

100

Relative Abundance

50 0.54 1.69

0 100

9.52 10.90 3.22 4.37 5.91 6.52 7.67 RT: 8.91 MA: 1413457

13.43 14.81 16.50 17.57 NL: 9.69E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS CH2Cl2-hexan-3-1

50 1.62 2.47 3.39

5.46 7.68

8.61

10.29 11.37

13.29

15.28

16.74 NL: 7.33E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS CH2Cl2-hexan-3-1

RT: 9.92 MA: 1042118

100 50 2.33

0.64

6.85 8.08 9.31

4.55 5.09

14.52 15.44

10.76 11.69

17.82 NL: 3.89E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS CH2Cl2-hexan-3-1

RT: 11.02 MA: 533507

100

10.86

1.04

3.34

3.50 4.04 6.03 6.64

8.33

9.94

11.86

13.39

16.92

14.85

0 0

8 10 Time (min)

Rửa giải carbamat bằng dung môi diclometan/hexan (3:1) 6. Khảo sát thể tích dung môi rửa giải

RT: 0.00 - 18.03 NL: 6.20E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS the tich rua giai 20ml

RT: 8.98 MA: 9661932

100 50

Relative Abundance

8.68

9.52 RT: 8.92 MA: 810528

2.77 3.61 5.69 6.22

0.93

0 100 50

0.40 2.55 2.86

4.47

11.75 13.13 14.20 15.12

NL: 5.93E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS the tich rua giai 20ml

9.15 9.46 9.92 11.60 13.37 13.75

6.62 7.61

17.42

16.28 NL: 3.00E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS ICIS the tich rua giai 20ml

RT: 9.93 AA: 483706

100 50 0.34 1.95

5.78 6.40 7.09

3.41

12.00 12.46

8.93

15.37

16.45 NL: 1.51E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS ICIS the tich rua giai 20ml

RT: 10.95 AA: 250995

100 50 0.44

2.05

8.95

6.11 6.50

4.73

3.43

10.56

11.79 13.40

15.09 16.32

0 0

8 10 Time (min)

Thể tích dung môi rửa giải 20ml RT: 0.00 - 18.02 NL: 8.61E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS the tich rua giai 40ml

RT: 8.98 MA: 14658407

100 50 1.00 1.84

Relative Abundance

6.45 7.14

3.76 4.61

9.75 RT: 8.99 MA: 1414805

100

11.36 12.28

14.27

15.88 16.57 NL: 1.13E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS the tich rua giai 40ml

50 1.55 2.55

4.08

8.61

5.84 6.69

9.99 10.83 12.14 13.29

16.36 NL: 6.43E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS the tich rua giai 40ml

RT: 9.85 MA: 935027

100 50 0.33 1.41

4.94

3.63

9.00

6.55 7.31

10.61

13.37

15.91 16.06 NL: 6.02E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS the tich rua giai 40ml

RT: 10.94 MA: 722695

100

11.10

50 0.81

2.73

0 0

4.50 5.65 6.72 4

8.10

10.63

11.56

8 10 Time (min)

14.47 15.93 17.31 14

Thể tích dung môi rửa giải 40ml

RT: 0.00 - 18.05 NL: 1.12E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS the tich rua giai 50ml

RT: 8.96 MA: 15748852

100 50 0.28

Relative Abundance

2.38 3.61

9.66 10.53 12.55 13.69 6.77 7.64 RT: 8.97 MA: 1662739

4.93

100

16.31 17.45 NL: 1.22E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS the tich rua giai 50ml

50 4.41 4.94 5.46 7.30 8.70

0.91 1.87

0 100

9.40 11.77 12.38 12.91 14.75 RT: 9.94 AA: 1147846

16.76 NL: 6.87E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS ICIS the tich rua giai 50ml

50 2.76 3.81 4.86 5.74

0.30

10.90 12.04 RT: 11.01 AA: 720851

6.52

100 50 1.64

4.27

4.62

0 0

6.55 7.42 8.21 6

14.06 15.29 16.60 NL: 5.54E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS ICIS the tich rua giai 50ml

11.98 13.29

10.58

8 10 Time (min)

17.85

13.91

Thể tích dung môi rửa giải 50ml

RT: 0.00 - 18.02 NL: 1.07E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS the tich rua giai 60ml

RT: 8.90 MA: 15587186

100 50 0.39

Relative Abundance

2.69

6.37

4.53

100

9.29 10.44 8.37 RT: 8.84 MA: 1719752

12.89 14.12

16.34 NL: 1.09E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS the tich rua giai 60ml

50 0.40 1.93 4.00

4.23

5.54

7.23

10.22 11.68 12.37

15.05 15.74 NL: 7.02E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS the tich rua giai 60ml

RT: 9.92 MA: 1159284

100 50 0.26 1.18

3.40

6.09 6.39

8.23 9.62

11.46 12.84

14.37

16.60 17.21 NL: 3.90E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS the tich rua giai 60ml

RT: 10.94 MA: 627767

100 50

4.65

2.58 2.73

6.65 7.34

8.79 9.25

11.71 13.17

0 0

8 10 Time (min)

13.63 15.31 16.47

Thể tích dung môi rửa giải 60ml 7. Sắc đồ phân tích một số mẫu thực

RT: 0.00 - 18.00 100

8.39

1.51

7.65

3.40 4.49 5.41

0.68

NL: 5.67E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS cam

13.65 13.82 15.79

11.06

12.68

15.49

17.11

5.89

Relative Abundance

9.27

0 100

NL: 1.19E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS cam

12.26 3.06

0.43

5.21 4.24

1.04

0 100

5.29

6.83

3.78 5.10

2.25

6.37

6.72

0 100

9.34

3.24 4.60

0.05 1.54

10.00 10.96 11.71

10.03 10.17 9.33

7.36 8.19

10.81

6.50

3.12 0.89

6.91 7.75

15.06 16.29 12.39 14.45

6.71 5.00 6.31

14.56

12.89

17.56 17.45

15.87

NL: 1.10E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS cam

12.75

10.78

13.01 14.33 15.47

NL: 8.72E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS cam

17.70

0 0

8 10 Time (min)

Mẫu cam không thêm chuẩn RT: 0.00 - 18.00 9.49

100

Relative Abundance

8.62

2.96 2.40 3.40 4.72 5.33

0.60

50 0 100

2.06 0.79

12.95

10.98

14.57 15.84

7.70

5.03 2.80 4.64 5.91 3.37

NL: 9.58E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 17.95 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS rau cai

12.12

9.75

8.45 9.46

7.40

10.77

13.75 14.06 11.82

15.90

17.78 NL: 8.17E3

16.25

TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS rau cai

6.48

0 100

17.67 NL: 1.40E4

4.49 0.19

1.16 2.52

6.85 6.02

4.05

8.08

7.12

0 100

8.39 9.39 11.32

9.56 1.28 0.45

2.94

3.91 5.40

6.40 6.23

6.80 7.94

11.89

14.47 15.26 16.58

13.02

11.05

14.99

12.93

8.37

13.19

16.43

0 0

8 10 Time (min)

Mẫu rau cải xanh không thêm chuẩn

TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS rau cai

NL: 1.26E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 17.40 164.50-165.50] MS rau cai

RT: 0.00 - 17.99 100 50

0.64

1.47 2.48 3.62 4.58

NL: 1.13E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS rau thom

14.04

9.09 10.10 6.81 7.86 5.24 10.67 5.54

12.73 14.35

Relative Abundance

16.23 0 100

3.76

1.61

3.06

6.52 6.43 4.28 5.73

8.53

9.41 9.63 10.24

13.92

12.78

16.81 16.55

14.05

0 100 0.10

2.90

3.25

5.22 4.92 4.26

NL: 1.55E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 17.93 167.50-168.50] MS rau 16.13 thom

11.53

8.47 9.04

7.77 6.98

12.76

9.87

13.07 14.73

0 100

0.97

6.44 7.67 5.91 6.66 5.43 2.45 3.02 3.72 3.90

9.20

10.65

10.86 11.87

NL: 8.76E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS rau thom

13.40 13.93 14.54 15.46

17.43

NL: 1.01E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS rau thom

0 0

8 10 Time (min)

Mẫu rau thơm không thêm chuẩn RT: 0.00 - 17.99 8.00

100 4.76 0.60 1.48 2.57

Relative Abundance

4.15

6.73 5.07

0 100

9.05 9.71

6.99

11.07 12.69

14.00

7.58

13.84

6.39 9.02

2.41 0.74 2.28 2.63

10.77

4.90

15.84 16.24

13.65

13.23 12.00

14.45 16.07 16.95

0 100

16.58

1.46 2.21

3.65

5.10

6.41 7.03

0 100

6.49 6.36

1.37 1.89 3.69 5.13

6.10 5.31

9.31

10.40 11.36

13.73 12.98 14.91

9.73

11.00 12.36

8 10 Time (min)

NL: 1.66E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS rau den

13.63 14.38 15.30

Mẫu rau rền không thêm chuẩn

NL: 1.54E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS rau den

16.27

0 0

NL: 8.06E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS rau den

17.10 210.00@45.00 [

8.68 7.32

NL: 9.37E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS rau den

17.40

RT: 0.00 - 17.99 NL: 1.48E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS rau den-tc 500ng

RT: 8.85 MA: 30438356

100 50 0.88 1.89 2.68

Relative Abundance

6.27

4.52

8.46

9.29 9.82 11.83 12.97

15.21

17.44 NL: 1.72E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS rau den-tc 500ng

RT: 8.87 MA: 3096701

100

9.00

50 4.97 5.97 7.03

1.33 1.90 2.73

8.47

9.65 10.49

13.25 14.21 15.22

17.58 NL: 9.44E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS rau den-tc 500ng

RT: 10.06 MA: 1570040 10.15

100 50 0.51

2.39

6.25 6.42

3.88

10.37

8.96 9.67

11.11 13.56

15.18

17.51 NL: 6.43E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS rau den-tc 500ng

RT: 11.78 MA: 1102168 11.91

100 50 1.66 2.23 3.89 5.12 6.04

0 0

7.92

11.56

9.24

8 10 Time (min)

12.04 12.26 13.44 12

15.55 15.98 16

Mẫu rau rền thêm chuẩn 500ng/ml RT: 0.00 - 17.99 NL: 1.38E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS rau thom-tc 500ng

RT: 8.76 MA: 30634148

100 50 0.27 1.58 2.85 3.95

Relative Abundance

6.22 7.36

8.37

9.20 9.73 11.52 13.10

15.33 16.39 NL: 1.56E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS rau thom-tc 500ng

RT: 8.77 MA: 2753331

100

8.95

50 0.50

1.85 2.77 4.09

8.47 6.58 6.89

9.08

9.78

12.59

14.60 15.39

17.80 NL: 9.02E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS rau thom-tc 500ng

RT: 10.01 MA: 1520063

100

10.14

50 1.38

3.22

6.73

5.37

8.87

9.75

10.54 12.03 12.60

15.01 15.93 NL: 7.28E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS rau thom-tc 500ng

RT: 11.78 MA: 1162608

100

11.99

50 0.26 1.88

0 0

11.51 5.29 6.12 7.18 8.10 9.15 9.76

3.32 4

8 10 Time (min)

12.43 14.10 12

15.76 16

Mẫu rau thơm thêm chuẩn 500ng/ml

17.82

RT: 0.00 - 17.99 NL: 1.47E6 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS rau cai-tc 500ng

RT: 8.77 MA: 31082281

100 50 0.58

Relative Abundance

9.20 9.73 5.53 6.71 8.07 RT: 8.78 MA: 3153493

2.46 3.60

100

11.04 13.32

15.73 17.00 NL: 1.61E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS rau cai-tc 500ng

8.69 8.60

50 0.11

3.52

0.76

6.89

5.36

8.95

8.52

9.30 10.40 12.15

14.65

16.84 NL: 1.13E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS rau cai-tc 500ng

RT: 10.02 MA: 1660425

100 50 3.97 4.58

0.86 1.61

10.15

9.62

8.35

7.65

11.59

13.83

16.23 NL: 7.32E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS rau cai-tc 500ng

RT: 11.65 MA: 1082094

100

11.82

50 1.31 2.19

0 0

9.24

3.98 4.07 6.17 7.27

11.25

8 10 Time (min)

11.95 12.87 12

15.98 17.17 16

Mẫu rau cải xanh thêm chuẩn 500ng/ml RT: 0.00 - 18.02 NL: 8.97E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS cam-tc 250ng

RT: 8.98 MA: 14023139

100 50 1.39

Relative Abundance

2.84

4.22

5.61 6.60

100 50 2.62

2.16

3.93 5.08

6.46

10.06 8.44 RT: 8.92 MA: 1460845

8.69

9.53

12.05 13.05 14.43 15.73

17.42 NL: 9.86E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS cam-tc 250ng

11.37 12.90 13.98

17.12 17.28 NL: 6.20E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS cam-tc 250ng

RT: 9.85 MA: 811777

100 50 0.56

5.17 5.70

2.25 3.10

8.31

10.31

12.53

16.91

14.37

NL: 4.03E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS cam-tc 250ng

RT: 11.02 MA: 585526

100 50 0.97

2.96

4.35

6.95 7.41

13.01

8.87 10.64

14.55 14.93

0 0

8 10 Time (min)

Mẫu cam thêm chuẩn 250ng/ml

17.77 18

RT: 0.00 - 18.02 NL: 9.95E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS bap cai-tc 250ng

RT: 8.90 MA: 14786230

100 50

Relative Abundance

9.44 6.29 6.91 8.37 RT: 8.91 MA: 1598760

1.23 2.31 3.30 4.61

0 100

12.05

13.89

16.34 17.42 NL: 1.29E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 167.50-168.50] MS bap cai-tc 250ng

50 6.38 7.46

1.55 2.32 3.16 4.85

9.68 10.99

11.29

14.74 15.74 17.81 NL: 5.42E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS bap cai-tc 250ng

RT: 9.85 MA: 786793

100 50 2.48

0.26

10.08 10.61

9.46 5.40 6.47 8.08 8.77

3.94

11.61 13.53

14.99

17.13 NL: 5.65E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS bap cai-tc 250ng

RT: 10.94 MA: 615061

100 50 2.81

0.43

0 0

4.27

5.49

7.03 7.87 9.64 6

10.64

11.25

8 10 Time (min)

14.78 15.16 15.85

Mẫu bắp cải thêm chuẩn 250ng/ml

RT: 0.00 - 18.00 100

6.05 0.83

Relative Abundance

2.41 1.75

6.79 8.54 7.67

8.98

10.87 10.56 11.79

13.58 14.15

10.26 0.85

3.52 3.65

1.24

5.49 6.67

50 0 100

0 100

7.25 3.88

0.37

5.06

5.41

5.16

2.05

0.60 1.66

6.28

2.14 2.66

4.72

6.08

11.31

8.99 9.56

14.78

10.07 10.81 9.54

12.38

13.87 15.22

16.67

8.23

12.56

8 10 Time (min)

Mẫu rau ngót không thêm chuẩn

NL: 1.22E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS rau cai ngot

NL: 8.25E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS rau cai 14.27 16.55 17.86 ngot

14.01 12.48

0 0

NL: 1.46E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 17.67 167.50-168.50] MS rau cai ngot

11.50

8.43 9.66 10.27

7.18

11.84 13.11 14.25

8.30

2.52 1.47 2.08 2.78

12.31

4.65 5.39

0 100

NL: 1.53E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS rau cai 17.61 ngot

RT: 0.00 - 17.98 100 50 Relative Abundance

NL: 3.63E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS can tay

RT: 9.03 MA: 7157181

2.81 3.68

1.18

0 100

RT: 3.78 AA: 142037

8.81 8.72 7.32 8.41 9.33 11.22 12.31 13.41 14.63 5.35 17.52 NL: 1.47E4 RT: 8.86 RT: 10.44 TIC F: + c ESI SRM ms2 AA: 197083 RT: 7.63 RT: 15.26 AA: 144010 210.00@45.00 [ AA: 62987 AA: 160150 152.50-153.50,

167.50-168.50] MS ICIS can tay

50 0 100

RT: 17.81 NL: 7.58E3 AA: 30437 TIC F: + c ESI SRM ms2

RT: 11.54 RT: 13.30 RT: 9.66 AA: 43206 AA: 62916 AA: 32743

RT: 6.51 RT: 1.51 RT: 3.66 AA: 22677 AA: 32696 AA: 20863

202.00@45.00 [ 144.50-145.50] MS ICIS can tay

50 0 RT: 7.09 AA: 85774

100 RT: 1.57 AA: 30051

RT: 11.07 RT: 12.87 AA: 93405 AA: 60167

RT: 4.50 AA: 33664

NL: 1.05E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS ICIS can tay

RT: 16.02 AA: 56238

0 0

8 10 Time (min)

Mẫu rau cần tây không thêm chuẩn RT: 0.00 - 18.00 100

8.77

50 5.70 6.31

1.32 2.15 3.47

0 Relative Abundance

NL: 1.12E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 222.00@48.00 [ 164.50-165.50] MS mung toi

RT: 8.94 MA: 2006583

100

0.94 2.47 1.20

7.37 8.68

5.58

2.82 3.57

9.34

7.33 8.95 7.68

5.10

11.83

9.04 13.29 11.06

13.32 13.67

16.61 17.70 16.36

13.51

14.04 14.96

9.65

0 100 1.34

2.04

2.79

4.06

6.51 5.33

8.75 8.66

9.05 10.28

11.24 12.03 12.47

14.66

15.76

NL: 1.28E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 210.00@45.00 [ 152.50-153.50, 17.58 167.50-168.50] MS mung toi

NL: 9.45E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 202.00@45.00 [ 17.86 144.50-145.50] MS mung toi

NL: 1.41E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 208.00@37.00 [ 151.50-152.50] MS mung toi

10.86

100 1.22

2.67

6.13 6.30 7.14 8.19 4.68

9.55

11.30 11.69

14.54 13.62

17.91

14.76

0 0

8 10 Time (min)

Mẫu rau mồng tơi không thêm chuẩn