1. Pr.Oudar - Introduction à la biologie cellulaire

INTRODUCTION A LA BIOLOGIE CELLULAIRE QUELQUES DATES IMPORTANTES. 

1750 : Notion de « cellule » par Hooke.

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1830 : Schleiden et Schwann « la cellule est l’unité structurale et fonctionnelle des plantes et des animaux » tout être vivant a au moins 1 cellule.

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1855 : Urchan (Virchow) « omni cellula e cellula » : une cellule ne peut provenir que de la division d’une cellule préexistante.

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1886 : Zeiss améliore les lentilles optique et permet le développement de la microscopie.

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Fin XIXe : Golgi et Cajal utilisent des techniques de coloration pour mettre en évidence l’appareil de golgi et les différents neurones.

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1930 : Microscopie a contraste de phase.

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1931 : invention du MET.

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1941 : Coons développe les techniques d’immunofluorescence (réaction antigène anticorps).

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1945 : Publications sur le MET.

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1988 : Microscopie confocale. « Pour comprendre les résultats, il faut connaître les possibilités et les limites des outils. »

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II. ORDRE DE GRANDEUR (ENVIRON). 

Neurone avec axone : quelques dizaines de centimètres (jusqu'à 1 m).

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Cellules musculaires : une dizaine de cm.

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Ovocyte humain : entre 100 et 140 m (0,1 mm).

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Adipocyte : jusqu'à 80 m

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Cellules somatique : quelques dizaines de m (entre 7 et 80 m)

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Eléments intracellulaires : quelques m

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Noyau : entre 1 et 5 m

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Mitochondrie : 3 m

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Ribosome : 30 nm.

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Membrane plasmique : quelques nm (entre 5 et 10 nm)

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Grosses molécules : inferieur a 1nm.

Les plus important à retenir sont :  Les ribosomes  30 nm.  Le noyau  5 m.  Les ovocytes  140 m.

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 La membrane plasmique  7,5 nm.

III. LES CELLULES. Il existe deux catégories de cellules, les eucaryotes et les procaryotes.

A. Les Procaryotes.

Caractéristiques : 

Molécules d’ADN circulaire non entouré d’une membrane (c'est-à-dire sans noyau) et libre dans la cellule.



Métabolisme et production d’énergie quasi-autonome.



Pas de système endomembranaire.



Peuvent avoir une seconde paroi rigide autour de leur MP.

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B. Les Eucaryotes 

Dispose d’une « machinerie interne » : système endomembranaire.



MP : limite la cellule de l’environnement, permet endo/exocytose, contient des récepteurs, permet l’adhésion.



Noyau : entouré d’une double membrane complexe avec des pores permettant les échanges.

Possède un nucléoplasme et un nucléole.

Son ADN pendant la mitose est sous forme de chromosome, et pendant l’interphase sous forme de chromatine. 

Les organites baignent dans le cytosol (composé d’eau, de glucides, et de lipides), sorte de gel qui diffère en fonction des cellules.

1. Nucléole 2. Noyau 3. Ribosome 4. Vésicule 5. RER 6. Appareil de golgi 7.

Microtubule

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8. REL 9.

Mitochondries 10. Vacuoles 11.

Cytoplasme 12. Lysosome 13. Centrioles

IV. LES COMPARTIMENTS ENDOMEMBRANAIRE. Il y en a 2, RE Et Golgi qui sont en contact soit : 

Directement par leurs membrane.



Indirectement par le biais de vésicules.

L’appareil de Golgi a pour fonction : 

La maturation et l’empaquetage des protéines.



Il est aussi a l’origine du système lysosomal (digestion de la cellule).

Les mitochondries ont pour fonction :  De fournir de l’énergie a la cellule en déphosphorilant l’ATP en ADP+Pi. Le cytosquelette a pour fonction :  Maintenir de la forme de la cellule et déplacement cellulaires.

VI. INTERACTIONS. Les cellules présentent des interactions Intracellulaires, intercellulaires, et extracellulaire.

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VII. TECHNIQUES D’OBSERVATION MORPHOLOGIQUE. A. Le pouvoir de résolution.

Cela correspond à la plus petites distance visible entre deux points.

Sa formule est :

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 est la longueur d’onde.

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α est l’angle du faisceau lumineux.

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N est l’indice de réfraction du milieu (1 pour l’eau, 1,5 pour l’huile).

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B. Techniques d’observation morphologiques.

1. Microscope Optique.

2. Microscope électronique a transmission (MET).

3. Microscope électronique a balayage (MEB).

4. Microscope a fluorescence.

5. Microscope confocale.

6. Microscope quantitatif.

1. Microscope optique. 

L’objectif, l’oculaire et le condenseur sont des lentilles de verre.

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La source lumineuse est a la base du microscope.

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Ce type de microscopie nécessite une fixation, une coloration et une coupe de 5 m au microtome.

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Grossissement de 400 à 1000 X. D= 0,2 m

2. Microscopes électroniques. a. MET. 

Nécessite un canon à électrons : Cathode (filament de Tungstène) Et une Anode (40 à 100 KV) pour attirer les électrons.

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Nécessite un écran fluo ou une plaque photographique qui frappé par les électrons donnera l’image.

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Nécessite un tube sous vide.

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Nécessite une fixation et une coupe de 50 nm à l’ultra microtome.

3000 à 10000X D = 2 nm

b. MEB. Tous droits réservés 2009-2010 © www.objectif-p1.com

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Nécessite un canon à électrons : Cathode (filament de Tungstène) Et une Anode (40 à 100 KV) pour attirer les électrons.



La préparation doit être recouverte de métaux lourds (or, platine).



Il permet l’observation de la surface de l’objet, il ne nécessite donc pas de coupe.

Nécessite un tube sous vide.



Les électrons frappent le métal qui émet a son tour des électrons qui vont être captés par un système de capture relié a un tube cathodique.



Il permet l’observation de petit insectes entiers.

D= 10 nm

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3. La fixation.

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4. La microscopie à contraste de phase.

Les microscopies optiques et électroniques ne permettent que l’observation de cellules mortes.  La microscopie à contraste de phase permet de garder les cellules vivantes.

La lumière est émise sous forme d'ondes : Les différentes structures des cellules font déviées les ondes de manière différente en fonction de leur phase 

Si les ondes sont déviées de la même façon, alors la brillance augmente : les structures sont dans la même phase ( la phase étant considérée comme le plan).



Si les ondes sont déviées de façon différente, alors la brillance diminue : les structures sont dans des phases différentes.

C'est la différence de brillance qui donne l'image.

Ce microscope couplé à un système de capture vidéo donne des informations sur le déplacement des organites dans la cellule, la division, la migration cellulaire etc.

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5. La microscopie à fluorescence.

La microscopie à fluorescence permet de détecter les molécules fluorescentes.

Elle nécessite une lampe à ultraviolet.

Le filtre d'excitation ne laisse passer que la longueur d'onde d'excitation : 1 Les molécules fluos absorbent la lumière à une certaine longueur d'onde et la restitue à une longueur d'onde supérieure : 2 Le filtre d'arrêt stoppe la longueur d'onde excitation 1 et ne laisses passer que la longueur d'onde supérieure 2 émise par les molécules fluorescentes.

Molécules fluorescentes utilisées : 

Fluorescéine : excitées par du bleu, elles restituent du violet.

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Rhodamine : excitées par du bleu, elles restituent du rouge.

Au final on ne voit que les molécules fluos, ce microscope est donc très utile pour faire de la détection.

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6. Microscope confocale.

Ce microscope fonctionne selon le même principe que le microscope à fluorescence, mais la lampe à ultraviolet est remplacée par un laser.

Il permet l'observation de molécules fluo dans des tissus plus épais (supérieur à 100 µm).  Le laser effectue un balayage de l'objet sur un seul plan et réalise des coupes optiques plan par plan.  Par ordinateur ces coupes permettent de reconstruire une image en 3D. C’est donc la même chose que la microscopie à fluorescence, mais en plus nette et en 3D.  Cela permet de savoir si la molécule est à la surface dans la profondeur de la cellule.

Grâces aux ordinateurs ont peut supprimer le bruit de fond et améliorer la netteté.

On peut aussi utiliser de l'or à la place des molécules fluo.

7. Histoenzymologie.

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Cela permet de localiser une enzyme grâce à son activité : le produit se colore grâces à l'enzyme.

C'est une technique utilisable en microscopie optique ou en microscopie électronique.

8. Immunohistochimie : immunofluorescence.

Cela permet de localiser des macromolécules grâce à des interactions antigènes / anticorps qui permettent de détecter un antigène spécifique de l'anticorps utilisé.

Les anticorps sont marqués avec des molécules fluorescentes ou avec une enzyme, et donc si l’antigène est présent, l'anticorps vient se fixer et émet un signal lumineux.

Pour les antigènes peu représenter, afin d'amplifier le signal, on peut utiliser une technique d'immunofluorescence indirecte qui permet de repérer les anticorps précédemment évoqués (non marqué : primaires), à l'aide d'un second anticorps anti-anticorps primaire couplé à une molécule fluo.

On peut aussi utiliser des billes d’or.

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9. Autoradiographie. c'est la localisation de molécules radioactives préalablement introduites dans la cellule par le biais de précurseurs (les précurseurs sont utilisés par la cellule pour créer des protéines).

Après coupe, on trempe les tissus dans une émulsion photographique.

L'élément radioactif réduit les ions argents contenues dans l'émulsion ce qui permet l'observation.

C’est une technique utilisée pour détecter les protéines ou des nucléotides grâce à l'utilisation de précurseurs spécifiques à la protéine que l'on veut détecter.

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10. Hybridation in situ.

Permet la détection d'ADN, d'ARN, d'oligonucléotides.

On utilise des sondes marquées qui viennent s’hybrider par complémentarité sur la séquence d'ADN que l'on veut localiser.

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Ces sondes sont marquées par des molécules radioactives, ou par des molécules fluorescentes.

Ceci permet de mettre en évidence dans un tissu de l'ARN viral, de l'ADN bactérien etc…

11. Microscopie quantitative.

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En utilisant les nouvelles technologies, elle permet de quantifier les informations notamment en permettant de compter les noyaux, les vaisseaux, de mesurer les surfaces etc.

Une caméra numérise des images de cellule marquée et effectue un codage numérique de la luminance de chaque pixel composant l’image numérisées.

Elle les numérise a partir du MO ou du MET. Avant ce codage et en niveaux de gris, depuis quelques années il est en couleurs grâce à un nouveau type de caméra. À la fin on traite l'image pixel par pixel à l'aide d'un algorithme mathématique ce qui permet le comptage, la mesure etc.

Récapitulatif :  Le microscope optique (D = 0,2 m) permet l’observation de cellules. Necessite fixation et coupe (5m).  Le MET (D = 2nm) permet l’observation des cellules. Nécessite fixation et coupe (50 nm).  Le MEB (D = 10 nm) permet l’observation de la surface des cellules. Nécessite métalisation.  Le MCP permet l’observation de cellules vivantes. La difference de brillance permet de connaître la phase.  Le MF permet de detecter des molécules fluorescentes (ex : technique de FRAP).  Le MC permet de réalisé des coupes optiques pour reconstituer l’image en 3D grâce au laser.

Cela permet de localiser les molécules puisqu’on peut savoir si elles sont en surface ou en profondeur.  L’histoenzymologie permet de localiser une enzyme.  L’immunohistochimie permet de localiser des macromolécules grâce aux anticorps marqués.  L’autoradiographie permet de localiser des molécules radioactives introduite par des précurseurs.  L’hybridation in situ permet de localiser et detecter des nucléotide grâce a l’établissement de liaisons H. Tous droits réservés 2009-2010 © www.objectif-p1.com

 La microscopie quantitative permet de quantifier les informations grâce a un codage de la luminance.

C. Techniques non morphologiques.

1. Cytométrie de flux.

Des molécules fluo sont associées à des anticorps capables de reconnaître et de se fixer à un antigène qui lui est spécifique.

Les cellules sont aspirées une à une par un tube et passe dans une chambre d'observation. À chaque passage d'une cellule marquée, un appareil compte.

Cela permet la quantification des antigènes à la surface de la cellule.

Couplés à un trieur on peut séparer les cellules marquées et non marquées.

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2. Chromatographie.

C'est la migration dans une colonne poreuse de substances, surtout des protéines, pour les séparer.

On place le mélange en haut de la plaque et on l'entraîne avec un éluant, il se forme alors une phase fixe et une phase mobile.

Il y a différents types de chromatographie : 

Avec des gels : les pores de la colonne retiennent les substances.



Avec des billes d'anticorps : elles bloquent les molécules qui ont l'antigène spécifique. On appelle cela la chromatographie d'affinités.

On purifie la molécule avec un solvant : les grosses molécules restent en haut car elles descendent moins vite que les petites molécules.

En fonction du gel utilisé ont peu à voir l'effet inverse.

Cela permet de récupérer les différentes molécules.

Chromatographie sur gel

Chromatographie a bille

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3. L’électrophorèse.

Cela permet de séparer les macromolécules grâce à leur charge électrique.

Elle se pratique sur différents types de gel. Cela permet d'observer des protéines ou des acides nucléiques.

On dénature les protéines avec un détergent : le SDS qui va charger les molécules négativement et couper les ponts disulfure.

On applique alors un courant continu sur le gel, et les protéines chargées négativement vont migrer après fracture des ponts disulfure vers le pôle positif.

On colore les protéines avec du bleu de Cromatie et en observe : les protéines migrent en fonction de leur poids, et on peut comparer leur poids grâce à des bandes représentant le poids de protéines dont on connaît la taille.

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